אביב-אוניברסיטת תל

הפקולטה לרפואה על שם סאקלר

החוג לביוכימיה קלינית

על Insulin-like Growth Factor-I Receptor -מנגנון בקרת הגן ל

BRCA1ידי

חיבור לשם קבלת התואר

"דוקטור לפילוסופיה"

מאת שירלי אברמוביץ

אביב-הוגש לסאנט של אוניברסיטת תל

2003טובר אוק

TEL AVIV UNIVERSITY

SACKER SCHOOL OF MEDICINE

DEPARTMENT OF

CLINICAL BIOCHEMISTRY

Regulation of Insulin-like Growth Factor-I Receptor

Gene Expression by BRCA1

THESIS SUBMITTED FOR THE DEGREE OF “DOCTOR OF PHILOSOPHY”

BY SHIRLEY ABRAMOVITCH

SUBMITTED TO THE SENATE OF TEL-AVIV UNIVERSITY

October 2003

:עבודה זו נעשתה בהדרכת

פרופ' חיים ורנר

This work was carried out under the supervision of: Prof. Haim Werner

....תודה

על תמיכתו ועל יחסו , חיים ורנר על הנחייתו המדעית והמקצועית' לפרופ

.תודה מיוחדת על עידוד העצמאות במחקר ומתן האמון. האישי והאנושי

איתי , לימור שהרבני גרגיר, סנר'מיכל שליטא צוהנספחים לחברי המעבדה

ירב גפן מ, נעמה רייזנר, עירית נהור, מורן רובינשטיין, שרון מאור, בנטוב

חברותם , ובמיוחד גילה אידלמן על עבודת צוות נעימה ופוריהטרייביש

.ותמיכתם המקצועית

.טובה גלזר על רעיונותיה המדעיים' לדר

. לאורך כל הדרךהתמיכעל הו, האהבעל ה, האמון על להורי היקרים

השקעתם ותמיכתם , על סבלנותם, על העזרה הרבה, האהובים לאשר ושני

. בולותללא ג

רשימת פרסומים

Abramovitch, S., and Werner H. (2003). ). "Functional and physical interactions

between BRCA1 and p53 in transcriptional regulation of the IGF-IR gene." Hormone and

Metabolic Research, 35: 758-762 (2003).

Abramovitch, S., Glaser, T., Ouchi, T., and Werner, H. (2003). "BRCA1-Sp1

interactions in transcriptional regulation of the IGF-IR gene." FEBS Lett. 541:

149-154.

Maor, S. B., Abramovitch, S., Erdos, M.R., Brody, L.C., and Werner, H. (2000).

"BRCA1 suppresses insulin-like growth factor-I receptor promoter activity:

potential interaction between BRCA1 and Sp1." Mol. Genet. Metab. 69: 130-

136.

Werner, H., Shalita-Chesner, M., Abramovitch, S., Idelman, G., Shaharabani-Gargir, L.,

and Glaser, T. (2000). "Regulation of the insulin-like growth factor-I receptor

gene by oncogenes and antioncogenes: implications in human cancer." Mol Genet

Metab. 71: 315-320.

תוכן עניינים

I רשימת איורים

II רשימת קיצורים

VI תקציר

1 מבוא.1

Insulin like Growth Factor (IGF) 1-מערכת ה. 1.1

IGF 1-מרכיבי מערכת ה. 1.1.1

1 הליגנדים. 1.1.2

1.1.3 .IGF-I 2

1.1.4 .IGF-II 2

3 הרצפטורים. 1.1.5

4 חלבוני קישור. 1.1.6

1.2 .Insulin like growth factor I receptor 5

7 והעברת האותותIGF-IR-מנגנון הפעלת ה. 1.3

1.4 .IGF-I Receptor 7 ומחזור התא

1.5 .IGF-I Receptor8 ואפופטוזיס

1.6 .IGF-I Receptor9 וטרנספורמציה

IGF-IR 10-פרומוטר הגן ל. 1.7

IGF-IR promoter 11- גורמים המשפיעים על ה1.7.1

IGF 14-הקשר שבין סרטן השד ומערכת ה. 1.8

1.9 .BRCA1 ,16 גן המקנה רגישות לסרטן השד והשחלה

1.10 BRCA1 , 18 תורשתי ודיכוי גידולסרטן

1.11 .BRCA119 וסרטן שד ספורדי

20 ותפקידוBRCA1-מבנה ה. 1.12

1.12.1 .BRCA1 ומנגנוני תיקון נזקי DNA 22

1.12.2 .BRCA124 והבקרה על מחזור התא

1.12.3 .BRCA125 כפקטור שעתוק

1.12.4 .BRCA126 הכרומוזומים והפרדת

27 מטרות המחקר. 2

27 מטרות ספציפיות. 2.1

27 חשיבות העבודה. 2.2

28 חומרים ושיטות. 3

28 תרביות תאים. 3.1

28 שורות תאים3.1.1

28 מצעי גידול ותנאי הגידול. 3.1.2

29 פלסמידיםהפקת. 3.2

30 פלסמידים וטרנספקציות. 3.3

3.3.1 .Transient Transfection31 בשורות תאי סרטן השד

3.3.2 .Transient Transfection בתאי Saos-2 32

3.3.3 .Transient Transfection בתאי Drosophila Schneider 33

3.3.4 .Transient Transfection בתאיHCT 116 33

34 בדיקת פעילות לוציפרז. 3.3.5

34 נירמול תוצאות הטרנספקציה . 3.3.6

35 חישובים סטטיטסטים לתוצאות הטרנספקציה. 3.3.7

3.4 .Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) 35

transcription/translation 35 בעזרת ערכת BRCA1הפקת חלבון . 3.4.1

36 הכנת האוליגונוקלאוטיד הדו גדילי. 3.4.2

initiator 37-הכנת מקטע גנומי הממוקם באזור ה. 3.4.3

IGF-IR 38- מהפרומוטר ל-115+/40פוספורילציה של מקטע -דה. 3.4.4

38 סימון הגלאי. 3.4.5

EMSA 39ביצוע . 3.4.6

Western Blotting 40-שיקועים אימונים ו. 3.5

40 הכנת הדגימות. 3.5.1

41 קביעת תכולת החלבון בתאים. 3.5.2

העברה לממברנת ניטרוצלולוז, SDS-PAGEל 'הרצת החלבונים על גבי ג. 3.5.3

41 וזיהוי חלבונים

43 הנוגדנים. 3.5.4

GST-pulldown 43שיטת . 3.6

GST-BRCA1 43הפקת פרגמנטי . 3.6.1

SDS-PAGE 45ל 'הרצת הפרגמנטים על גבי ג. 3.6.2

Glutathione sepharose 45- לGST-BRCA1קשירת פרגמנטי . 3.6.3

3.6.4 .Transient Transfection בתאי Drosophila Schneider 46

Sp1 46 לחלבון BRCA1בדיקת קשר בין פרגמנטי . 3.6.5

47 הנוגדנים. 3.6.6

48 תוצאות. 4

BRCA1 48 על ידי IGF-IR-וויסות הפרומוטר ל. 4.1

BRCA1 54- האחראי על פעילות הIGF-IR-מיקום האזור בפרומוטר ל. 4.2

IGF-IR 57- בוויסות הפרומוטר לSp1- וBRCA1ונים בדיקת קשר פונקציונלי בין החלב. 4.3

IGF-IR 58- בוויסות הפרומוטר לSp1- וBRCA1בדיקת הקשר בין . 4.4

Sp1 63- וBRCA1חיפוש אחר קשר פיסי בין החלבונים . 4.5

Sp1 65 האחראי על קישור לחלבון BRCA1חיפוש אחר האזור בחלבון . 4.6

IGF-IR 67- על פעילות הפרומוטר לBRCA1 ∆ 11פעת החלבון בדיקת הש. 4.7

IGF-IR 68- בוויסות הפרומוטר לp53- וBRCA1בדיקת קשר פונקציונלי בין החלבונים . 4.8

BRCA1 69 על דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי p53השפעת סטטוס . 4.9

Sp1 71-ו p53 ,BRCA1 חיפוש אחר קשר פיסי בין החלבונים 4.10

73 דיון. 5

80 רשימת ספרות. 6

רשימת איורים

עמוד איור IGF. 5- תיאור סכמתי של מרכיבי מערכת ה- 1איור

IGF-IR. 6- תיאור סכמתי של הפרקורסור ל- 2איור

11 . מחולדהpromoter IGF-IRאיור סכמתי של - 3 איור

BRCA1. 21החלבון איור סכמתי של - 4 איור

במספר שורות תאי BRCA1 על ידי IGF-IR-ל ה בקרת פעילות הפרומוטר ש- 5איור

49 . סרטן השד

51 . השוואת פעילות הפרומוטר לפי כמות משקל מולקולרי כנגד כמות מולרית- 6איור

52 . תקיןBRCA1 מוטנטי לרצף BRCA1 השוואת רצף - 7איור

53 . מוטנטיBRCA1 לעומת wild type BRCA1 בנוכחות IGF-IR- פעילות הפרומוטר ל- 8איור

Saos-2. 54 בשורת תאי BRCA1 על ידי IGF-IR- וויסות הפרומוטר ל- 9איור

של flanking region‘5 - על מקטעים בעלי חסרים שונים באזור הBRCA1 השפעת - 10איור

IGF-IR. 56-ל הפרומוטר

IGF-IR. 58- בבקרה על פעילות הפרומוטר לSp1- וBRCA1 קשר פונקציונלי בין - 11איור

IGF-IR . 60- עם הפרומוטר לBRCA1-Sp1 לבדיקת קשרי EMSA ניסויי - 12איור

61 . 115+ ועד לנוקלאוטיד בעמדה -40 הכנת המקטע הגנומי המתמשך מנוקלאוטיד בעמדה - 13איור

IGF-IR . 62- עם הפרומוטר לBRCA1-Sp1 לבדיקת קשרי EMSA שימוש בניסויי - 14איור

Sp1. 64- וBRCA1 בין החלבונים in vivo קישור - 15איור

GST. 65 המאוחים לחלבון BRCA1 הפקת מקטעי - 16איור

Sp1 . 66 אשר אחראים על הקישור עם החלבון BRCA1- איתור אחר האזורים השונים ב- 17איור

חסר BRCA1 לעומת wild type BRCA1 השוואת פעילות הפרומוטר בנוכחות - 18איור

67 .11 אקסון

IGF-IR. 69- בבקרת הפרומוטר לp53- וBRCA1 קשר פונקציונלי בין - 19איור

BRCA1. 70 על דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי p53 השפעת סטטוס - 20איור

p53. 71- וBRCA1 דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי - 21איור

p53. 72- וBRCA1 דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי - 22איור

I

רשימת קיצורים

Abbreviation Full name

Acc# Accession number

ATP Adenosine 5'-Triphosphate (ATP)

β-ME β-Mercaptoethanol

BAD Bcl-2 antagonist of cell death

BARD1 BRCA1-associated RING domain protein

BASC BRCA1-associated genome surveillance complex

Bcl-2 B-cell CLL/lymphoma 2; Oncogene B-cell leukemia

BP Binding protein

bp base pair

BRCA1 Breast cancer 1

BSA Bovine serum albumin

CIP Calf intestinal phosphatase

CMV Cytomegalovirus

DDW Double distilled water

DMEM Dulbecco’s modified Eagle’s medium DNA Deoxyribonucleic acid

DSB Double strand breaks

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethylenediamine-tetraacetic acid (disodium salt)

EGTA Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N,N-tetraacetic acid

EGF Epidermal growth factor

II

EGFR Epidermal growth factor receptor

EMSA Electrophoretic mobility shift assay

FBS Fetal bovine serum

FGF Fibroblast growth factor

F.P.U. Footprinting unit

GH Growth Hormone

GST Gluthatione S transferase

HCT Human colorectal carcinoma

HEPES 4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazine ethane sulfonic acid

HR Homologous recombination

HRP Horseradish peroxidase

IGF-BP Insulin -like growth factor binding protein

IGF-I Insulin -like growth factor I

IGF-II Insulin -like growth factor II

IGF-IR Insulin -like growth factor I receptor

I.P. Immunoprecipitation

IPTG Isopropyl beta-D-thiogalactose

IR Insulin receptor

IRS-I Insulin receptor substrate-I

LUC Luciferase

MAPK Mitogen-activated protein kinase

MDM2 Mouse double minute 2

Mut Mutant

III

NHEJ Nonhomologous end-joining

NP-40 Nonidet® P 40 Substitute

OD Optical density

PBS Phosphate buffered saline

PCR Polymerase chain reaction

PDGF Platelet-derived growth factor

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

PML Promyelocytic leukemia protein

PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PKB Protein kinase B

Poly dIdC Poly deoxyinozide deoxycytidine

RB Retinoblastoma

RNA Ribonucleic acid

SAOS-2 Osteosarcoma cell line

SAP Shrimp alkaline phosphatase

SCID severe combined immunodeficient

SDS Sodium dodecyl sulfate

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis

SV40 Simian virus 40

TBP TATA box binding protein

TEMED N-tetramethyl ethylenediamine

UTR Untranslated region

UV Ultra Violet

IV

VEGF Vascular endothelial growth factor

VHL Von-Hippel Lindau

WT1 Wilm’s Tumor 1

V

תקציר

הינו רצפטור המבוטא ברוב הרקמות וממלא Insulin like Growth Factor-I Receptor (IGF-IR) -ה

בגדילה IGF-IRהדרישה המוחלטת לפעילותו של . גדילה ובהתפתחות נורמלית ביונקיםתפקיד מרכזי ב

עברו טרום לידתית שהתקבלה בעכברים שתמותההודגמה באופן ברור על ידי עיכוב גדילה חמור ו והתפתחות

“knock-out”הומוזיגוטי ב -IGF-IR .הרצפטור ל-IGF-Iהוא בעל פעילות ו מעורב גם בתהליכים ממאירים

.in vitro וגם in vivoאנטי אפופטוטית חזקה גם

TATA או CAAT וחסר מוטיבים C- וG עשיר בנוקלאוטידים IGF-IR-אזור הבקרה של הגן ל

box ,נמצא כי באזור . לת שעתוק יעיל ברוב הגנים האאוקריוטיםשני אזורי בקרה הדרושים לרוב להתח

. IGF-IR- אשר מכוון את נקודת תחילת השעתוק לגן ל”Initiator“הפרומוטר קיים אתר ייחודי המכונה

אזור התחלת . זה מופיע במספר פרומוטרים של גנים המווסתים התמיינות והתפתחות initiatorמוטיב

על כן אזור , (ATG)תרגום לאזור התחלת הupstream 1 Kb ממוקם IGF-IR-השעתוק של הגן ההומני ל

מכיל מספר אתרי קישור פוטנציאלים הפרומוטר אזור . ארוך במיוחד ’untranslated region 5 (UTR) -ה

. את פעילות הפרומוטרצורה ניכרתחלבון בעל אצבעות אבץ המגרה ב, Sp1לגורם שעתוק

הם בעלי תפקיד חשוב הן IGF-IR-הפועלים על ידי קישורם אל ה, IGF-II- וIGF-I, הליגנדים

רוב גידולי סרטן השד ושורות התאים . בהתפתחות וגדילה של בלוטות החלב והן בהתמרה סרטנית של השד

בעזרת IGF-IR-בעוד שדיכוי ה, ושל חלבוןIGF-IR mRNAהנגזרות מהם מבטאים רמות גבוהות של

מונעים את שגשוג התאים המשופעל על ידי הרצפטור antisense oligomersנוגדנים ספציפיים או בעזרת

.ועל כן מרמזים שקיימת דרישה בסיסית לפעילות הרצפטור בהתפתחות גידולי שד

ה יינט אשר מוטציה בו נמצאה בהתאמה לkDa 220 מקודד לפקטור שעתוק במשקל BRCA1-הגן ל

משתתף במספר מסלולים ביולוגים BRCA1-חלבון ה. עירהופעת גידולי סרטן שד ושחלה בגיל צמוקדמת לה

.גידול תאים ואפופטוזיס, ושמירה על יציבות גנומיתDNAתיקון נזקי , הכוללים שעתוק גנים

כמדכא גידול התקבלו ממחקרים אשר הראו כי החדרת BRCA1-עובדות התומכות בפעילות ה

BRCA1יתרה מזאת. שד ושחלה לתאים הובילה לעצירת גדילה של שורות תאי סרטן,antisense

VI

oligomers כנגד BRCA1 mRNA האיצה את גדילת התאים הנורמלים ותאים סרטניים ואף עודדה התמרה

.NIH3T3של תאי

גבוהות מאד בגידולי IGF-IR- בעל פעילות של מדכא גידול ומאחר ורמות ביטוי הBRCA1-מאחר ו

מטרתנו היתה לבחון את , על כן. BRCA1- מהווה גן מטרה לפעילות הIGF-IR-הנחנו כי הגן ל, סרטן השד

.IGF-IR- על ביטוי הגן לBRCA1יכולת הבקרה הפוטנציאלית של

transientוג התבצעו טרנספקציות מס,IGF-IR- על הפרומוטר לBRCA1על מנת להעריך את השפעת

תמשנו בפלסמיד המכיל נוקלאוטידים השותבטרנספקצי. שונות ובמספר שורות תאיםת וי שימוש בשיט"ע

ווקטור יחד עם , luciferase reporter gene- לupstream המשובט IGF-IR- של הפרומוטר ל-640+/476

הוכנס , לשם נירמול התוצאות על פי יעילות הטרנספקציה. BRCA1 (pcBRCA1-385)- להמקודדביטוי

. pcDNA3הריק פלסמיד בורת שלילית השתמשנו כביק .β-galactosidase-לתאים בנוסף ווקטור המקודד ל

, יתר על כן. במספר שורות תאי סרטן השד42-45%~התוצאות הראו כי הדיכוי שהתקבל היה בשיעור של

BRCA1דיכא את פעילות הפרומוטר ל -IGF-IRבשורת תאי אוסטאוסרקומה ,Saos-2 . דיכוי זה נמצא

אלו נתמכו גם בתוצאות הניסויים אשר הראו כי ממצאים . שהוחדרה לתאיםBRCA1-בתלות לכמות ה

הובילה לירידה ביכולת דיכוי (185delAG) מוטנטי BRCA1החדרת ווקטור המקודד לחלבון קטום של

.IGF-IR-הפעילות הפרומוטר ל

IGF-IR על הפרומוטר לגן של BRCA1מאחר ומצאנו כי האזור אשר אחראי לפעילות הדיכוי של

, Sp1 ומאחר שאזור זה מכיל מספר אזורי קישור לחלבון השעתוק -188 לבין -476ם משתרע בין נוקלאוטידי

מגביר את פעילות הפרומטור של ה Sp1 גורם השעתוק בין לBRCA1 בדקנו את הקשר הפונקצינלי בין

IGF-IR . לצורך זה השתמשנו בתאיSchneider ממקור דרוזופילה אשר אינם מבטאים Sp1אנדוגני .

45%- בSp1 הנגרמת על ידי IGF-IR- מדכא את פעילות השפעול של הפרומוטר לBRCA1הראנו כי

IGF-IR מדכא את פעילות השפעול של BRCA1הממצא כי . Drosophila Schneiderבשורת תאי

לדכא BRCA1הובילה לחשיבה כי קיימים שני מנגנונים אפשריים באמצעותם מצליח , Sp1הנגרמת על ידי

ועל ידי כך מונע IGF-IR נקשר אל רצף הפרומוטר של BRCA1, האחד. Sp1על ידי את פעילות השפעול

VII

נקשר BRCA1החלבון , להיקשר אל אתרי הקשירה השמורים שלו ולשפעל את הפרומוטר והשניSp1-מ

בכדי . להיקשר לאתרי הקשירה השמורים שלוSp1-חלבון ובעקבות זאת לא מאפשר ל- בקשר חלבוןSp1-ל

Electrophoretic mobility shift- החלטנו להשתמש בשיטת הBRCA1ו מהמנגנונים פועל לבדוק לפי אל

assay (EMSA) עם חלבון BRCA1 , שהופק על ידי שעתוק ותרגוםin vitro . מצאנו כיBRCA1 ,בעצמו ,

לאתרי הקישור שלו הממוקמים Sp1אך מנע את יכולת הקישור של , DNA-לא הציג יכולת קישור ל

שימוש בשיטת השיקוע . שהוספהBRCA1-כתלות בכמות ה, ”initiator“- ולאזור הIGF-IR- לבפרומוטר

שימוש , בנוסף. Sp1 נבעה מקישור ספציפי לחלבון BRCA1האימוני הראה כי פעילות הדיכוי של

איפשר לנו למקם BRCA1 הכוללים את כל רצף החלבון GST המאוחים לחלבון BRCA1בפרגמנטים של

חיזוק נוסף לממצאים התקבל בניסויי טרנספקציה . 260-802 בין החומצות האמיניות Sp1ושר את האתר הק

תקין מדכא את פעילות הפרומוטר בעוד שווקטור BRCA1 בהם החדרת ווקטור המבטא MCF7בתאי

. החסר חומצות אמינו אלו לא הצליח לדכא את פעילות הפרומוטרBRCA1המבטא

. p53 מבוקר בצורה שלילית על ידי מדכא הגידול IGF-IR-וק הגן למחקרים קודמים הראו כי שעת

. IGF-IR- בבקרת הגן לp53 לבין BRCA1החלטנו לבדוק את הקשר התפקודי הפוטנציאלי בין , על כן

להם החדרנו את הגן המדווח המכיל MCF7טרנספקציה בשורת תאי סרטן השד -בצענו ניסויי קו, למטרה זו

. מוטנטיp53- ולwild type p53-ל, BRCA1- בשילוב עם ווקטורים המקודדים לIGF-IR-את הפרומוטר ל

ואת , p53המבטאים את הגן לחלבון , +/+ HCT 116ניסויים דומים התבצעו גם בשורת תאי סרטן המעי

.p53אשר אינם מבטאים , -/- HCT, התאים הנגזרים מהם

. p53 הן בנוכחות והן בהעדר IGF-IR- הצליח לדכא את פעילות הפרומוטר לBRCA1מצאנו כי

הראנו , כמו כן. מוטנטיp53 לא היה השפעה על פעילות הפרומוטר בתאים המבטאים BRCA1לחלבון , אולם

.p53- וBRCA1כי קיים קשר פיסי בין

דיכוי שעתוק . BRCA1- מהווה גן מטרה לפעילות הIGF-IR-ממצאנו מרמזים כי הגן ל, לסיכום

אינו מסוגל להקשר אל Sp1בעקבות כך . Sp1 מערב קישור לחלבון BRCA1על ידי IGF-IR-הפרומוטר ל

דיכוי הפעילות , יתרה מזאת. IGF-IR- ולעורר את ביטוי הגן לIGF-IR-האתרים השמורים שלו בפרומוטר ל

VIII

p53-הופעת מוטציה בגן ל, אך יחד עם זאת. p53 יכול להתקיים הן בנוכחות והן בהעדר BRCA1בידי

חוסר היכולת של מדכאי גידול מוטנטים לדכא את . BRCA1למנוע את פעילות הדיכוי הנגרמת על ידי עלולה

המתבטאות על פני התא ולקישור ליגנדים IGF-IR- עלולה לגרום לעליה ברמות הIGF-IR-ביטוי הגן ל

ברה בחלוקת הג, קישור זה עלול להוביל לירידה באפופטוזיס. הקיימים במחזור הדם או המיוצרים מקומית

.התאים וההישרדות של תאים ממאירים

IX

מבוא .1

IGF(Insulin like Growth Factor(-מערכת ה .1.1

גדילה נורמלית והתמיינות הינם תוצאה של תוכנית גנטית אשר מעורבים בה פקטורים תוך וחוץ תאיים

. הפועלים יחדיו באיזון עדין בין שני תהליכים מנוגדים של שגשוג תאי ומוות תאי

תפקיד חשוב בגדילה ובהתפתחות נורמלית ממלאתInsulin like Growth Factor (IGF)-מערכת ה

Receptor--Insulin like Growth Factor-Iהדרישה המוחלטת לפעילות הביולוגית של ה. ביונקים

(IGF-IR) ,טרום לדתית שהתקבלה בעכברים שעברו תמותההודגמה באופן ברור על ידי עיכוב גדילה חמור ו

“knock-out”הומוזיגוטי בגן ל -IGF-IR) Liu et al., 1993 & Baker et al., 1993.(

IGF-מרכיבי מערכת ה .1.1.1

אשר מהווים פקטורי IGF-I, IGF-IIהליגנדים : מורכבת ממספר רב של משתתפיםIGF-מערכת ה

עד IGFBP-1(ששה חלבוני קישור , )IGF-IR, IGF-IIR(רצפטורים המתבטאים על פני התאים , גדילה

IGFBP-6 (שר מווסתים את פעילות הוחלבונים נוספים א-IGFBPs כגון פרוטאזות ועוד )Moschos &

Mantzoros, 2002.(

הליגנדים .1.1.2

בנויים משרשרת יחידה בעלת , ומכאן שמם, הדומים מבנית לאינסולין, IGF-II- והIGF-I-חלבוני ה

לו בנויים הפרקורסורים לליגנדים א. (Moschos & Mantzoros, 2002) לפרואינסולין62%הומולוגיה של

מכיל גם , אשר בדומה למבנה של הפרואינסולין) D- וA,B,C( אזורים 4-משרשרת פוליפפטידית המורכבת מ

C-בו חל חיתוך של אזור ה, לאינסולין בניגוד לתהליך עיבוד הפרואינסולין. Dמלבד אזור , הוא אזורים אלה

, )Chan et al., 1992(סולפידים -די נשארות קשורות יחדיו באמצעות קשרים B- וAועל ידי כך יחידות

1

ועל כן הליגנדים נשארים כשרשרת C אינם כוללים חיתוך אזור IGFs-תהליכי הבשלת הפרקורסורים ל

.(Werner & LeRoith, 1996a)פוליפפטידית אחת

1.1.3. I-IGF

5 - אקסונים ו6 -ומורכב מ, 12 המקודד על ידי הגן ההומני ממוקם על כרומוזום IGF-Iהליגנד

חומצות 70 ומקודדים לחלבון בעל kb (Rotwein et al., 1986) 80 -ינטרונים המשתרעים לאורך של כא

רמות . אך למעשה כמעט כל רקמות הגוף מסוגלות ליצרו, מתרחשת בעיקר בכבדIGF-I-יצירת ה. אמינו

בד ומהרקמות מהכIGF-Iאך עיקר בקרת היצור וההפרשה של , בסרום מושפעות מפקטורים רביםIGF-I-ה

,.GH) (Schwander et al., 1983; Roberts et al(האקסטרהפטיות מתבצעת על ידי הורמון הגדילה

המופרשות GH- מפעיל משוב שלילי על בלוטת ההיפופיזה ועל ידי כך משפיע על רמות הIGF-I-ה ).1986

חות העוברית אך חשוב נמוך בשלבי ההתפתIGF-I-ביטוי ה). Tannenbaum et al., 1983(מבלוטת זו

הוא הורמון הכרחי בהתפתחות אברים IGF-Iכמו כן נמצא כי . מאד לגדילה והתפתחות לאחר הלידה

(organogenesis)כפי שנצפה בעכברים בהם חלה פגיעה מכוונת בגן ל -IGF-I) Powell-Braxton et al.,

הראו שיעור הישרדות של Cre/Loxp שנוצרו בעזרת שימוש בשיטת IGF-I-nullבדיקת עכברי ). 1993

בנוסף עכברים אלה אינם מגיעים לבגרות . ואיחור בהתבגרות35%עיכוב גדילה של , לאחר לידה42%

אך אלה לא , בסרוםGH הוביל להופעת כמויות גבוהות של IGF-Iכמו כן המחקר הראה כי העדר . מלאה

GH מבקר שלילית את הפרשת IGF-Iכי ממצאים אלו מחזקים את ההנחה . הצליחו לעורר את גדילת הגוף

(Liu & LeRoith, 1999).

1.1.4. II-IGF

ומקודד kb30 אקסונים המשתרעים לאורך 9מכיל , 11 מופה לכרומוזום IGF-IIהגן ההומני של

הינו בעל מאפיינים שונים IGF-II-שעתוק הגן ל). Tricoli et al., 1984( חומצות אמינו 67לחלבון בעל

2

ברוב הרקמות , לאמור. (genomic imprinting) והוא בעל מנגנון של החתמה גנומית IGF-I-מאלה של ה

.(DeChiara et al., 1991) מבוטא מהאלל האבהי בעוד ששעתוק האלל האימהי מושתק IGF-IIהנורמליות

זאת מאחר ששני , ישנה פעילות פרוליפרטיבית ואנטיאפופטוטיתIGF-II-גם ל, IGF-I-בדומה ל

ניתן לציין כי מידע חשוב שהתקבל ). IGF-IR)O'Dell & Day, 1998 -הללו פועלים דרך ההליגנדים

, )כל אחד לחוד או בשילוב (IGF-IR- ולIGF-II, IGF-I- לKnockoutממודל של עכברים אשר עברו

בעוד שחשיבותו פוחתת לאחר , משחק תפקיד חשוב בהתפתחות ובגדילה העובריתIGF-II-הראה כי ה

). Baker et al., 1993(חשוב במיוחד בשלבים שלאחר הלידה , לעומתו, IGF-I-ה. הלידה

הרצפטורים .1.1.5

יש עדויות המוכיחות כי , למרות שכל אחד מהליגנדים הינו בעל אפיניות גבוהה ביותר לרצפטור שלו

ומה שהינו רצפטור טרנסממברנלי הד, IGF-IR- מתווכות באמצעות הIGFs-רוב הפעילויות הביולוגיות של ה

חוץ תאיות הקושרות את הליגנד αהרצפטור מורכב משתי שרשראות . במבנהו לזה של הרצפטור לאינסולין

). 1,2איורים (שבחלקן הציטופלסמטי הן בעלות פעילות טירוזין קינז , חוצות ממברנהβושתי שרשראות

ממלא IGF-I-ר להרצפטו. (LeRoith et al., 1991)השרשראות קשורות זו לזו בקשרים דיסולפידים

מעודד שגשוג ואף תורם , הוא בעל פעילות אנטיאפופטוטית, משמע. תפקיד חשוב בהישרדות התאים

.כמו כן מאפשר גם העברת אותות להתמיינות התאים. לטרנספורמציה של התאים

והוא חסר , חוץ תאית ברובה, בנוי משרשרת פוליפפטידית אחתII (IGF-IIR)הרצפטור מטיפוס

האחראי למיחזור mannose 6 phosphate (Man-6-P)-רצפטור זה זהה לרצפטור ל. טירוזין קינזפעילות

והגן שלו , בא לידי ביטוי ברוב רקמות ותאי היונקיםIGF-II/Man-6-P-Receptor. אנזימים ליזוזומלים

. שמור במינים שונים

טורים היברידים הנוצרים ישנן עדויות המצביעות על קיומם של רצפ, בנוסף לרצפטורים שהוזכרו

). IGF-I -הרצפטור לאינסולין והרצפטור ל( מכל רצפטור β- וαכהטרוטטרמרים משתי תת היחידות

וכיום ידוע כי רצפטורים היברידים פזורים ברקמות רבות , רצפטורים אלה אופיינו לראשונה בשורות תאים

3

IGF-I) Federici etלק חשוב בקשירת הם אחראים לח, כמו הלב ושריר שלד, במספר רקמות. של יונקים

al., 1997; Bailyes et al., 1997.(

חלבוני הקישור .1.1.6

. IGF Binding protein (IGFBP) - נישאים בזרם הדם על ידי משפחת הIGFs, בניגוד לאינסולין

נלי טרמיN-במיוחד במתחמי ה, חולקים דמיון במבנה ראשוני, הכוללים כששה חלבוני קישור, חברי המשפחה

, )בפרופפטיד16-20 (אחד ממאפייניהם החשובים הוא הימצאות מספר ציסטאינים שמורים . טרמינליC-וה

פעילותם של הליגנדים מושפעת ממשפחה. (Shimasaki & Ling, 1991)המסודרים כקבצים באזורים אלו

הארכת זמן : קישור כוללתפקיד חלבוני ה. המצויים במחזור הדם ובנוזלים החוץ תאיים, זו של חלבוני קישור

,.Rajah et al(מניעת גירוי יתר לגדילת התאים או אפופטוזיס מופרז , בסרוםIGFs-מחצית החיים של ה

,.Zapf et al(אל כלי הדם ובקרה על קישור הליגנדים אל הרצפטורים /בקרה על מעבר הליגנדים מ, )1999

שלילית על פעילות הליגנדים על ידי שליטה חלבונים אלה יכולים להשפיע בצורה חיובית או ). 1995

(IGFBP proteases)פעילות חלבוני הקישור מווסתת בעזרת פרוטאזות . בזמינותם של ליגנדים חופשים

IGFs-בעקבות חיתוך זה רמות ה. ים בעלי אפיניות נמוכה יותר לליגנדיםמקטע לIGFBP-החותכות את ה

רמת ). LeRoith & Werner, 2001( ולשפעלו IGF-IR-ר לומאפשרים לליגנדים להיקש, החופשיים עולות

. תלויה ברמת הורמון הגדילה, IGFs-שהוא חלבון הגדול ביותר ממשפחה זו והמשמש מאגר ל, IGFBP-3-ה

4

IGF-תיאור סכמתי של מרכיבי מערכת ה -1איור

וחלבוני ) IR- וIGF-IR ,IGF-IIR(הרצפטורים לליגנדים אלה , ואינסוליןIGF-I ,IGF-II: כוללת את הליגנדיםIGF-משפחת ה

. דומה במבנהו לרצפטור לאינסוליןIGF-IRניתן להבחין כי . IGFsהקישור של

: הנמצא בכתובתIGF Societyאיור זה מבוסס על סכמה המופיעה באתר האינטרנט של *

html.overview/h/org.society-igf.www://http

1.2. Insulin like growth factor I receptor

הינו תוצר של גן יחיד המשתרע על פני , חומצות אמינו 1367בעל, אנושיIGF-IRהפרקורסור של

הגן . (Ullrich et al., 1986) 15וממוקם בקצה הדיסטלי של כרומוזום , גנומיDNA של kb 100-למעלה מ

untranslated region-’5- המקודדים ל1-3אקסונים : אקסונים המחולקים על פי החלוקה הבאה21מכיל

(5' UTR) ,signal peptideולמתחם ה -N טרמינלי של תת יחידה α , מקודדים להמשך תת 4-10ואקסונים

ר פרוטאוליזה באתר בשלות נוצרות בצורה ליניארית מהפרקורסור העובβ - וαשרשראות . αהיחידה

אזור חוצה , הכוללת אזור חוץ תאי, βתת היחידה . 11הממוקם באקסון , ארגינין- ארגינין- ליזין-ארגינין

תהליך ). 2Aאיור ( 21- 12מקודדת באמצעות אקסונים, ממברנה ואזור תוך תאי בעל פעילות טירוזין קינז

נוצרים קשרים דיסולפידים , בהמשך. signal peptide-עיבוד הפרקורסור כולל גליקוזילציה וסילוק ה

5

. בשלותβ - וαמתרחשות גליקוזילציות נוספות וחיתוך פרוטאוליטי שמניב תת יחידות , בפרורצפטור

). 2Bאיור (α-β-β-αההטרוטטרמר הבשל מסודר בקונפורמציה

2A.

NH2 COOH

קבוצה αתת קבוצה βתת

Signal Peptide

Cysteine rich

Proteolytic cleavage

Transmembrane Tyrosine kinase

2B.

IR-IGF- תיאור סכמתי של הפרקורסור ל-2איור

. IGF-IR-נה הפרקורסור ל מב-2Aאיור

.α-β-β-α מבנה ההטרוטטרמרי של הרצפטור אשר מסודר בקונפורמציה -2Bאיור

ובכמה רקמות מופיע פס נוסף אשר גודלו בערך kb 11-ברקמות הומניות הוא כmRNA IGF-IRגודלו של

7 kb . במכרסמים מופיעmRNA 11 רק בגודל kb.

המאופיין בפעילות , מופיעות בשלב עובריmRNA IGF-IRבדרך כלל רמות ביטוי גבוהות של

רמות אלו יורדות לאחר הלידה ומגיעות לערך נמוך בתא בוגר אשר סיים את תהליך . חלוקה נמרצת

. כמעט אינה ניתנת לזיהויIGF-IR mRNA-רמת ה, נמצא כי בכבד. (Werner et al., 1989)ההתמיינות

6

ההסבר לכך נעוץ ככל הנראה בויסות . הגבוהה ביותר שהתגלתה בכבד היאIGF-Iרמת הביטוי של , מאידך

. על ידי ייצור מקומי של הליגנדIGF-IR של (down regulation)שלילי

גבוהה יותר IGF-I-זיקתו ל, )IGF-I, IGF-II( מסוגל לקשור את שני הליגנדים IGF-IR -על אף שה

). Sepp-Lorenzino, 1998(פיניות פחותה בהרבה וכן התברר כי הרצפטור אף יכול לקשור אינסולין אך בא

והעברת האותותIR-IGF-מנגנון הפעלת ה .1.3

חלה העברת α אל תת יחידה IGFs-לאחר קשירת ה. הינו בעל פעילות אלוסטריתIGF-I-הרצפטור ל

הגורמת לשינוי קונפורמציה וזירחון עצמי של אזור , βסיגנל דרך ממברנת התא המובילה אל תת יחידה

גם כן תורמת לזירחון עצמי , יצירת צברים של הרצפטור המתרחשים בעקבות קישור הליגנד. הטירוזין קינז

בשלב הבא מתרחש זירחון של אזורים אחרים בתת יחידה . (Sepp-Lorenzino, 1998)באזור הטירוזין קינז

βהעברת האותות המובילים לקישור וזירחון של סובסטרטים שונים בתא אשר משפעלים את מנגנוני

;PI3K-PKB/AKT) LeRoith et al, 1995- והRas-Raf-MAPK-במסלולים שונים כגון מסלול ה

Dupont & LeRoith, 2001 .(

ישנן מספר מחקרים המצביעים כי הפעלת הרצפטור בעזרת הליגנד שלו יכולה להוביל להפעלת מנגנונים

התמיינות ואף , הפעלת מסלול אנטיאפופטי, עשויה לגרום לחלוקת התאיםIGF-IRהפעלת . שונים בתא

קובעים , או זמינותם של סובסטרטים שונים\עבודות אלו הראו כיצד אזורים שונים ברצפטור ו. טרנספורמציה

.(Baserga & Morrione, 1999; Baserga, 2000; Valentinis & Baserga, 2001)את גורל התא

1.4. I Receptor-IGFומחזור התא

. (Baserga & Rubin, 1993) במשך שנים רבות כהכרחי להתקדמות במחזור התא הוכרIGF-I-ה

נדרשת להם , G1 יכנסו אל מחזור התא לשלב G0מחקרים שונים הראו כי בכדי שתאים הנמצאים בשלב

FGF (fibroblast growth factor)- שונים כ(competence factors) מאפשריםנוכחותם של פקטורים

, על מנת שהתאים יוכלו להמשיך להתקדם במחזור התא. PDGF (platelet-derived growth factor)-וכ

7

progression(מקדמים יש צורך לספק להם פקטורים , "מתחלקים"ל" מתחלקים-לא"כלומר לעבור מתאים

factors(כגון ה -IGF-Iוה -EGF (epidermal growth factor)) Hernandez-Sanchez et al., 1997;

Baserga & Rubin, 1993; Rubin & Baserga, 1995; Baserga et al., 1997 .( התברר כיFGFו -

PDGFמעוררים את ביטוי ה -IGF-Iוה -IGF-IRאספקת , וכאשר התא הופך קומפטנטיIGF-I בלבד דיה

.על מנת להשלים את מחזור התא

תאים : למתחלקים על פני ממברנת התאים מהווה גורם קריטי להפיכת התאים IGF-IR-מספר ה

, יגדלו במדיום גידול בתוספת סרום, רצפטורים על פני התאים15,000-פיברובלסטים המבטאים פחות מ

מסוגלים לגדול במדיום חסר סרום ובתוספת של IGF-I- אתרי קשירה ל22,000-בעוד שתאים המבטאים כ

IGF-I .עובדה . ם שגשוג גם באגר רךאף עוברי, רצפטורים30,000-תאים אשר מבטאים מעל ל, יתרה מכך

זו מרמזת כי ביטוי הרצפטורים עלולה לתרום לא רק לחלוקה נורמלית אלא גם ליכולת טרנספורמציית התאים

(Rubini et al. 1997).

1.5. I Receptor-IGFואפופטוזיס

לא רק בזכות תפקידו המיטוגני אלא גם עקב היותו בעל , הינו מתווך הישרדות רב עוצמהIGF-IR-ה

מתפקדים כגורמים אנטיאפופטוטים , בפרטIGF-IR- בכלל והIGF-מערכת ה. פעילות אנטיאפופטוטית חזקה

או IGF-Iמתן , בשורת תאי מעי הומנית שהושרה בה אפופטוזיס, למשל. in vitro - וin vivoבמערכות

וגדנים כנגד העובדה שנ. DNA-מנע את עיכוב גידול התאים ואת פרגמנטצית ה, ריכוז אינסולין גבוה

מתווכת , או אינסוליןIGF-Iמרמזת על כך שהגנה מפני מוות תאי על ידי , חסמו מצב זהIGF-I-הרצפטור ל

או EGFאך לא , PDGFובמידה פחותה יותר (IGF-I, כמו כן. IGF-IR (Wu et al., 1995)באמצעות

FGF ( הגן מפני אפופטוזיס שהושרה על ידי הרעבת תאים פיברובלסטים)אשר בטאו ) ב אי אספקת סרוםעק

etoposideבניסויים בהם השרו אפופטוזיס על ידי. c-Myc (Harrington et al., 1994)באופן מתמיד

מנע את IGF-ΙR-אולם הרס מכוון של הגן ל, מנע מעט מוות תאי topoisomerase I, IGF-I)מעכב של (

שבהן השתמשו באנטיסנס in vivoבמערכות . (Sell et al., 1995)לעצור את האפופטוזיס , IGF-I-יכולת ה

8

ראו שקיימת התאמה בין רמת הרצפטורים המתבטאים על פני התאים לבין חיות , IGF-IR mRNA-כנגד ה

,.Resnicoff et al(ירד מספר הרצפטורים והיקף האפופטוזיס גדל , כשריכוז האנטיסנס עלה. התאים

1995a; 1995b .(הפעלת ה-IGF-IRנעשת במספר מסלולים , להגנה מפני אפופטוזיס, ין היתרב, המובילה

מסלולים . Raf/14.3.3- וPI3K ,MAPK: העברת האותות יכולה לזרום במסלולים שונים כגון . חלופיים

אשר במצבו המזורחן אינו מסוגל לקשור חלבונים , BADאלו מתנקזים לבסוף לזירחון החלבון

Peruzzi et( ועל כן הופך ללא פעיל בעידוד מוות תאי ,Bcl-XLכגון, Bcl2-אנטיאפופטוטים ממשפחת ה

al., 1991.(

1.6. I Receptor-IGFהתמרה סרטנית ו

את IGF-IR-מעניקים ל, תפקיד הרצפטור כפקטור אנטיאפופטוטי בשילוב עם פעילותו כפקטור מיטוגני

IGF-IR-את תרומתו של ה. (Baserga, 1994)היכולת הפוטנציאלית לגרום לטרנספורמציה

שבהם , לטרנספורמציה ניתן לראות בניסוים שנעשו בשורת תאים פיברובלסטים שמקורם מעוברי עכברים

סרטנית על ידי שימוש ותמרו הלאתאים אלו . על ידי רקומבינציה הומולוגיתIGF-I- הרצפטור לנפגע ביטוי

SV40 large T antigen,bovine papillomavirus E5 protein, מופעלras: באונקוגנים שונים הכוללים

, אולם החדרת הרצפטור הפונקציונלי לתאים הללו). Sell et al., 1993; Morrione et al, 1995(ועוד

יש לציין כי קיימים , מאידך. השיבה את יכולתם לעבור התמרה סרטנית בעזרת האונקוגנים המוזכרים מעלה

E7- וE6לדוגמא החדרה של חלבוני . IGF-IR-ת באונקוגנים המסוגלים לעודד טרנספורמציה גם ללא תלו

human papillomavirus-16 יחדיו עודדה יצירת מושבות בתאים חסרי IGF-IR . יש לציין כי החדרת

IGF-IRביטוי יתר של , בנוסף. (Steller et al., 1996) בנפרד לא השפיעה על התאיםE7- וE6חלבוני

,.Kaleko et al) סרטני אשר כלל יצירת גידולים בעכברי גרם לפנוטיפ, NIH3T3בפיברובלסטים מסוג

1990) nude.

מחקרים וניסוים קליניים אשר בוצעו במהלך העשרים שנה האחרונות רמזו כי תאים מותמרים מציגים

גידולים אלו . IGF-IR mRNA על פני התאים ואף רמות גבוהות יותר של IGF-IRמספר רב יותר של

9

מערכת ההמטופויטית וכליות , רבדומיוסרקומה, מעי, ערמונית, שחלה, גידולי שד,בין היתר, כוללים

(Werner & LeRoith, 1996) . עליה בביטוי הרצפטור בסרטן משקפת חזרה של התאים לשלב נמוך יותר

.בהתמיינות ובאונטוגנזה פרימיטיבית יותר

IGF-IR שימוש באנטיסנס כנגד אוIGF-IR- החוסמים את הαIR3שימוש בנוגדנים ספציפיים כגון

mRNA ,סרטן השד : מעכבת שגשוג של גידולי סרטן שונים כדוגמת(Neuenschwander et al., 1995) ,

מלנומה , (El-Badry et al., 1989) גידולי נוירובלסטומה (McCubrey et al., 1991)גידולים המטופויטים

(Furlanetto et al., 1993). נוסףפותח נוגדן, לאחרונה ,EM164 , החוסם את פעילות הרצפטור על ידי

בשורות תאי סרטן הומני in vitroובעקבות כך גרם לעיכוב גדילה , הוספת ליגנדים או הפעלה על ידי סרום

כאשר טיפול עם , in vivoהשפעת עיכוב הגדילה אף הוכחה . ערמונית ועוד, שחלה, מעי, ריאות, הכוללות שד

. SCID (Maloney et al., 2003)י גדילה של סרטן הערמונית אשרו הושתל בעכברי הנוגדן זה הוביל לדיכו

, IGF-IR טרמנלי של C- בקצה ה1245-1310ידוע כי נוכחות המקטע הממוקם בין שיירים , יתרה מזאת

).Baserga, 2000(הכרחי בכדי שרצפטור זה יהיה מעורב בטרנספורמציה

IR-IGF-פרומוטר הגן ל .1.7

הכרחי בכדי להבין את המנגנונים המולקולרים המבקרים את IGF-IR -הפרומוטר של הגן לאיפיון אזור

או TATA box אך חסר מוטיבי C - וG עשיר בנוקליאוטידים IGF-IR-הפרומוטר ל. ביטויו של הרצפטור

CAAT ,הדרושים בדרך כלל להתחלת שעתוק יעיל ברוב הגנים , שהם שני אזורי בקרה חשובים

המכוון את נקודת תחילת ”Initiator“יחד עם זאת קיים באזור הפרומוטר אתר ייחודי המכונה . םהאאוקריוטי

& Werner et al., 1990; Cooke et al., 1991; Mamula) (3איור (IGF-IR-השעתוק לגן ל

Goldfine, 1992; Werner et al., 1992 .(שבדומה ל, מוטיב זה מופיע בפרומוטרים של גנים- IGF-IR,

. מווסתים התמיינות והתפתחות

bp (upstream 940, בחולדה(~ kb 1 ממוקם IGF-ΙR -נקודת התחלת השעתוק של הגן ההומני ל

. זה הוא מהארוכים שתוארו עד היום בגנים אאוקריוטיםUTR-’5אזור . (ATG)לנקודת התחלת התרגום

10

מעורב ביצירת מבנים שניוניים כמו מוטיב אם כי קיימים רמזים שהוא , תפקידו של מתחם זה אינו ברור דיו

hairpin (Cooke et al., 1991) . מבניhairpinפקטורי : מדווחים לרוב בגנים המבקרים שגשוג תאי כגון

.הרצפטורים שלהם ואונקוגנים שונים, גדילה

מחולדהpromoter IR-IGFאיור סכמתי של - 3איור

אתר תחילת ). לבן (flanking region ’5וכן ) מנוקד (UTR-’5, )שחור(ודד לחלבון האזור המק: באיור מתוארים שלושה אזורים

החצים השחורים מציינים אתרי קישור , EGR/WT1-החץ השחור עם הנקודה מציין אתר קישור מוסכם ל. INR-השעתוק מסומן ב

.SP1 - והחצים הלבנים הם אתרי קישור לEGR/WT1-פוטנציאלים ל

promoter IR-IGF-ל הגורמים המשפיעים ע .1.7.1

נקבעת על פי מאזן בין חלבוני , ובכל שלב התפתחותי, בכל רקמהIGF-IR-רמת הביטוי של הגן ל

מכיל IGF-IR-מאחר והפרומוטר ל. מעכבים את ביטויו, ומאידך, המגרים מחד את שעתוק הגן, ויסות שונים

Early growth- ומשפחת הSp1-ה: הוא מהווה אתר קישור למספר גורמי שעתוק כגון, רביםGCרצפי

response genes (EGR) .

Sp1המשפעל שעתוק מפרומוטרים התלויים ב, הינו חלבון גרעיני נפוץ-RNA polymerase II ,

בעיקר לרצף השמור (GC נקשר לרצפים עשירים בנוקלאוטידים Sp1-ה. CAAT- וTATAשברובם חסרי

5'-GGGCGG-3' .(קשירת החלבון ל-DNAבעוד שהפעלת השעתוק , ת בזכות שלוש אצבעות אבץ מתבצע

11

חיוני להשגת רמות שעתוק משמעותיות Sp1-ה. מתאפשרת באמצעות אזור בחלבון העשיר בגלוטמין

,.Blake et al(על אף שאינו קובע את אתר תחילת השעתוק המדויק , CAAT - וTATAמפרומוטרים חסרי

. ביטויו מבוקר כתלות במידת התמיינות התאים, מיוחד הינו בעל תפוצה רחבה בSp1-למרות ש). 1990

בעוד שרמת ביטויו פוחתת בתאים אשר סיימו את , בתאים המתחלקים במהירות הינו רבSp1-ביטוי ה, כלומר

היחסים הפיסיים והתפקודיים בין גורם שעתוק זה והפרומוטר של . (Saffer et al., 1991)התמיינותם

אנדוגני Sp1שורת תאים זו חסרת . Drosophila Schneiderר בשורת תאי נבדקו בעבIGF-I-הרצפטור ל

(Werner et al., 1992; Beitner-Johnson et al., 1995) . פעילות הפרומוטר הבזלית בתאים אלו הייתה

. אקסוגניSp1 לערך באמצעות החדרתו של 500והוגברה פי , בהשוואה לפעילות תאי יונקים, נמוכה מאוד

DNase I footprinting -ו, Electrophoretic mobility shift assay (EMSA)יזות בעזרת אנל

).3איור (IGF-IR בפרומוטר של Sp1זוהו מספר אתרי קשירה של

הנקשרים ומפעילים פרומוטרים , אצבעות אבץ3-4 כוללת חלבונים גרעיניים בעלי EGR-משפחת ה

קיימים מספר אונקוגנים אשר מנגנון פעולתם , ה מזאתיתר. המכילים רצפים שמורים המתאימים לקשירתם

IGF-IR- משפעל את הפרומוטר לc-mybכך למשל נמצא כי הפרוטואונקוגן . IGF-IR-כולל שפעול הגן ל

(Reiss et al., 1991; Travali et al., 1991) . כמו כן תוצר הגן שלhepatitis virus B מסוגל לעלות את

פקטורי גדילה נוספים הידועים בהפעלת הפרומוטר . IGF-IR mRNA (Kim et al., 1996)-רמת ה

).FGF) Hernández-Sánchez et al., 1997- והPDGF (Rubini et al., 1994)- הם הIGF-IR-ל

, ואף יכול לגרום לטרנספורמציה, אנטיאפופטוטית, הוא בעל פעילות מיטוגניתIGF-IR-היות ו

אשר (נשאלת השאלה כיצד תא בוגר , מספר הרצפטורים למידת שגשוג התאיםומאחר וקיים קשר ישיר בין

מנגנון . וכתוצאה מכך להישאר במצב מנוחהIGF-IR-מצליח לדכא את ביטוי הגן ל) עבר התמיינות מלאה

נמוכות מעורב במשפחה של פקטורים המכונים מדכאי IGF-IR-אפשרי אחד האחראי על שמירת רמות ה

ההגיון העומד מאחורי מנגנון זה הינו העובדה כי במקרי סרטן הומניים . (Tumor Suppressors)גידול

(Werner & Roberts, 2003)ניתן למצוא מדכאי גידול מוטנטים , IGF-IR-בהם יש ביטוי יתר של ה, רבים

12

או Wilm's Tumor (WT1) כוללים חלבונים שונים כדוגמת החלבון IGF-IR-פקטורים המדכאים את ה .

.p53לבון הח

מסוגל לשפעל או לדכא , אשר נמצא מוטנטי בחלק גדול של גידולי הסרטן ההומנים, p53החלבון

לרצפי קשירה שמורים בפרומוטרי p53 מערב קישור p53שפעול גנים על ידי . פעילות של מספר גנים

, p53-רה ספציפי לשבפרומוטר שלו אין אתר קשי, p53דיכוי פעילות גן מסוים בעזרת , לעומת זאת. המטרה

במקרה של . TATA box binding protein (TBP) (Seto et al., 1992)מתבצע על ידי קשירה לחלבון

IGF-IR הוכח כי p53החדרת הפרומוטר של . מעכב את ביטוי הגן ברמת השעתוקIGF-IR עם כמויות

מסוגל לדכא את p53ה למעש. הראתה עיכוב בפעילות הפרומוטר כתלות בכמותו, לתאיםp53עולות של

מוטנטי לתאים הובילה לעליה בפעילות p53הוספת , מאידך. 90%-פעילות הפרומוטר לרצפטור עד לכ

, IGF-I- הנגרם על ידי קישור הIRS-1- מסוגל לדכא את זירחון הרצפטור והp53, יתר על כן. הפרומוטר

הצביעו על כך EMSAתוצאות אנליזת . (Ohlsson et al., 1998) מוטנטי מגביר את זירחונם p53-בעוד ש

אינו נקשר ישירות אל אזור p53-ה, IGF-IRגם במקרה של , p53שבדומה לגנים אחרים המעוכבים על ידי

ועל IGF-IR בפרומוטר של initiator- מסוגל להקשר אל אזור הTBP .TBPהפרומוטר אלא נקשר לחלבון

חוסם את הפעלת השעתוק הנגרמת על ידי , ככל הנראה,קישור בין שני החלבונים הללו. ידי כך להפעילו

TBP (Werner et al., 1996).

הינו WT1. המכיל ארבע אצבעות אבץkDa 52-54 הינו חלבון גרעיני במשקל של WT1החלבון

Wilm’s או מוטציה בו מעורבים באתיולוגיה של שלואשר חסר, גורם שעתוק הספציפי לסוגי תאים מסוימים

Tumor) (וכן של נפרופתיות דומות ) ן כליות בילדיםסרטRauscher, 1993 .(WT1 אומנם שייך למשפחת

החלבון , כפי שמצוין מעלה, אך בניגוד לשאר חברי המשפחה אשר גורמים להפעלת הפרומוטר, EGR-ה

WT1עדות לכך התקבלה הודות לניסויים בהם נמצאה התאמה בין ירידה בשגשוג . מדכא את הפעלת הגן

ירידה ביכולת , ירידה בפעילות הפרומוטר, IGF-IR mRNA- לבין ירידה ברמות הWT1 המכילים תאים

,.Werner et al ( וגדילה שאינה תלויה בעיגון התאים למצע IGF-Iהתאים לעבור שגשוג עקב גירוי על ידי

(1993; Werner et al., 1995 .ממצאים אלו רמזו כי הפרומוטר ל-IGF-IR ל משמש אתר מטרה-WT1

13

DNaseI- וEMSAכגון שימוש באנליזות. `GCGGGGGCG-3-`5המזהה את הרצף השמור

footprinting סייעו למפות אתרי קשירה של WT1ביניהם , לפרומוטרים של גנים שוניםIGF-IR

(Werner et al., 1994) .

, נמוך ביותר בין היתרIGF-I-ביטוי הרצפטור ל, מיטוטי-שבתא הבוגר הפוסט, לסכם ולומר, אם כן, ניתן

אירוע (מעכבי גידול הנושאים מוטציות . שוניםמדכאי גידולכתוצאה מדיכוי הפרומוטר על ידי צורות בר של

כתוצאה מכך . -IGFפגומים ביכולתם לדכא את הפרומוטר לרצפטור ל) שמקושר בדרך כלל עם ממאירות

מיצור מקומי או IGFsיטוגנית גדלה על ידי ישנו ריכוז מוגבר של רצפטורים על פני התא והפעילות המ

באתיולוגיה IGF-IR-את מעורבותו של ה, לפחות בצורה חלקית, פרדיגמה זו יכולה להסביר. ממחזור הדם

שאלה חשובה שעדיין לא מצאה מענה הינה איזה גורמי שעתוק משתתפים בוויסות הגן . של גידולים שונים

. בסרטן שדIGF-IR-ל

IGF-טן השד ומערכת ההקשר שבין סר .1.8

אחראים על התפתחות השד , בשיתוף עם אסטרוגן, הורמון הגדילה המופרש מבלוטת ההיפופיזה

, בבלוטות השד IGF-I mRNA התברר כי הורמון הגדילה גורם ליצירת. ומורפוגנזה של צינוריות השד

באים לידי IGF- הלמעשה כל מרכיבי מערכת. (Kleinberg, 1998)המסייע בין היתר להתפתחות השד

:כפי שמפורט) Moschos & Mantzoros, 2002; Werner & LeRoith, 1997(ביטוי בגידולי סרטן השד

, הממוקמים בסמיכות לתאי סרטן השד(stroma)מופרש מתאי הסטרומה , המופיע בסרוםIGF-I-ה

. IGF-I mRNA-וכן בפיברובלסטים שנלקחו מביופסיות שאינן ממאירות שגם בהם ניתן להבחין ב

השפעת , ככל הנראה, לכן. הינם נדיריםIGF-Iשורות של תאי סרטן שד המבטאים ביתר , מאידך

ביר את יש את היכולת להג IGF-I-לכיום ברור כי . הינה פרקרינית ואנדוקריניתIGF-Iהליגנד

. המיטוגניות של גידולי סרטן שד

14

אך יחד עם זאת , ים הסמוכים למקום הגידול אותר גם בתאי סרטן השד וגם בפיברובלסטIGF-II-ה

. השפעה אנדוקרינית של ליגנד זה, עד כה, לא זוהתה

אשר מתבטאים על , IGF-I- מתווכת באמצעות הרצפטורים לIGFs-רוב הפעילות המיטוגנית של ה

מתבטא ברמות גבוהות יותר בתאי סרטן השד לעומת תאים IGF-IR-ה. פני תאי האפיתל המתחלקים

. ליםנורמ

תורמים למניעת IGFBP-5- וIGFBP-4, לדוגמא. חלבוני הקישור מעורבים גם בגידולי סרטן השד

מעכב את גדילת תאי הסרטן וזאת על ידי קישור IGFBP-3-לעומתם ה. אפופטוזיס של תאי הסרטן

IGF-Iיחד עם זאת נמצא כי רמות . וכן על ידי קישור ישיר לרצפטוריםIGFBP-3 נמוכות יותר

. חולות סרטן השדב

על ידי נוגדנים כנגדו עיכבה IGF-IR-בניסויים אשר נעשו בשורות תאי סרטן השד נמצא כי חסימת ה

ממצא זה מצביע . (Arteaga & Osborne, 1989; Arteaga et al., 1989)בצורה ניכרת את שגשוג התאים

.IGF-I-על כך שיכולת חלוקת תאי סרטן השד תלויה בתפקודו של הרצפטור ל

IGF-I-מחקרים אפידמיולוגים אשר התבצעו לפני מספר שנים מרמזים על קשר חיובי בין ריכוז ה

IGFBP-3- והIGF-I-נבדקו רמות ה, באחד המחקרים. במחזור הדם לבין עליה בסיכון לפתח סרטן השד

חודשים לפני 28הבדיקות נערכן בממוצע ( מקרי סרטן שד שאומתו 397שמתוכן נתגלו , נשים121,700-ב

בשליש העליון 4.6 היה פי 50הסיכון היחסי לסרטן שד בנשים לפני גיל הבלות ומתחת לגיל ). הדיאגנוזה

בחישובים עלה הסיכון IGFBP-3-כאשר שוקללו גם ערכי ה. ביחס לנשים בשליש התחתוןIGF-I-בערכי ה

על IGF-IR-ך שהגברה בהפעלת הנתונים אלה מצביעים על כ). Hankinson et al., 1998 (7.3-היחסי ל

ממצעים אלו רומזים כי , יתרה מזאת. עלול להיות שלב מכריע בהתפתחות סרטן שד, המצוי בסרוםIGF-Iידי

IGF-I/IGFBP-3עשויים לשמש פקטורים פוטנציאלים לניבוי סרטן שד .

אשר הניבו , כסמן אבחוני בסרטן שד נחקר על ידי מספר קבוצותIGF-IR-המשמעות של ביטוי ה

Happerfield et (93%-39%הערכת ביטוי הרצפטור בגידולי סרטן שד הומניים נע בין . תוצאות סותרות

(al., 1997 .לעומתם היו , מספר חוקרים טענו כי רמות ביטוי גבוהות מעידות על הישנות מוקדמת של המחלה

15

Surmacz, 2000; Turner et (גבוהות מצביעות על תחזית טובה יותר למחלהIGF-IR שסברו כי רמות

al., 1997; Yee, 1994; Lee et al., 1998; Papa et al., 1993; Peyrat et al., 1992; Lee et al.,

מבחירה שונה של חולים ושימוש בשיטות , ככל הנראה, השוני בתוצאות המחקרים הללו נובע). 1999

מתבטאים ברמות גבוהות IRS-I-וIGF-IR לאחרונה התפרסם מחקר אשר סבר כי . אנאליטיות שונות

בעוד שרמות ביטוי נמוכות של , ברקמות שד בריאות ובקרצינומות בדרגת התמיינות מתונה או מלאה

זאת בניגוד לרצפטור לאינסולין אשר לא הראה . קיימות בגידולי שד מתקדמיםIRS-I- וIGF-I-הרצפטור ל

ניתוח סטטיסטי של התוצאות הראה כי , תר על כןי. התאמה משמעותית לרמת ההתמיינות של הגידולים

עם התקדמות הגידול חזקה יותר מההתאמה הקיימת בין איבוד IRS-I-והIGF-IR -ההתאמה בין ירידת ה

IGF-IRעל כן המליצו החוקרים כי . ביטוי הרצפטור לאסטרוגן או עליה בחלוקה תאית עם התקדמות המחלה

.(Schnarr et al., 2000)לקביעת דרגת הגידול יכולים לשמש כסמנים חדשים IRS-I-ו

התקבל ממחקר שנעשה לאחרונה אשר רמז כי התפתחות , לסרטן שדIGF-IRעדות נוספת לקשר שבין

אשר משמש לטיפול כנגד HER2/NEU-נוגדן מונוקלונלי כנגד החלק החוץ תאי של ה(עמידות להרצפטין

.IGF-IR (Lu et al., 2001)והות של קשורה עם רמות גב) ERBB2סרטן שד המבטא ביתר

1.9. 1BRCA ,גן המקנה רגישות לסרטן השד והשחלה .

אחת מכל תשע נשים עלולה לפתח , לפי מחקרים אפידמיולוגים שונים נמצא כי במדינות העולם המערבי

מגידולי סרטן השד הם 90%. (Alberg & Helzlsouer,1997; Brody & Biesecker, 1998)סרטן שד

הנותרים הם 5% - 10%. (germline)ומאובחנים בנשים ללא מוטציות בתאי נבט ) ספורדים(ים אקראי

נשים . BRCA2- וBRCA1, הידועים כמדכאי גידול, לפחות, תורשתיים ונגרמים על ידי מוטציות בשני גנים

תח לפ, באופן משמעותי, הן בעלות סיכון גבוהBRCA2 או BRCA1אשר קבלו בתורשה גן מוטנטי של

סיכון 10%לעומת , 70 לפתח סרטן שד עד גיל 87%נשים אלו הן בעלות סיכון של . סרטן שד במהלך חייהן

מוטציות תורשתיות בגנים אלו מעלות את הסיכון של הנשים הנושאות , בנוסף על כך. באוכלוסייה הכללית

ולעיתים קרובות אף 50גיל לפתח סרטן שד לפני 59%עם סיכוי של , אותן לפתח סרטן שד לפני גיל הבלות

16

44%- ב70 מגבירות את הסיכון לפתח סרטן שחלה עד גיל BRCA1מוטציות בגן , כמו כן. 40לפני גיל

מעלה את BRCA1-נוכחות מוטציות בגן ל, יתרה מזאת. באוכלוסייה הכללית1%-לעומת סיכון של פחות מ

. (Tavtigian et al., 1996a)ערמונית בגברים וסרטן בלוטת ה, בשני המינים, הסיכון להתפתחות סרטן המעי

כלומר תורשה של אלל מוטנטי אחד , הם בעלי תורשה אוטוזומלית דומיננטיתBRCA2- וBRCA1הגנים

. מעלה את הסיכון של הפרט לפתח סרטן

, בהתאמה, חומצות אמינו3418- וכ1863- מכילים כBRCA2- וBRCA1החלבונים ההומניים של

בהתייחס לשוני הקיים ברצף . (Miki et al., 1994; Tavtigian et al., 1996b)צף ואינם דומים בר

~ 80Kb-שני הגנים גדולים ומשתרעים על כ: אזי ההקבלה הגנומית ביניהם מפתיעה, הראשוני בין שני הגנים

מהחלבון 50%-המקודדים למעלה מ, הגנומי ושניהם מכילים אקסונים אמצעים ארוכים במיוחדDNA-מה

(Welcsh et al., 2000).

Miki( ושובט ארבע שנים מאוחר יותר (Hall et al., 1990)1990 מופה בשנת BRCA1-הגן ל

et al.,1994 .(ממקרי סרטן שד ~ 90%-ממקרי סרטן שד תורשתיים ול~ 50%-מוטציות בגן זה גורמות ל

נמצא כי קיים קשר בין כמו כן, ;Paterson, 1996) (Alberg & Helzlsouer,1997ושחלה משפחתיים

. לבין סרטן החצוצרותBRCA1-מוטציות ב

מוטציות בגן זה גורמות למחצית . ושובט שנה מאוחר יותר1994 מופה בשנת BRCA2-הגן ל

;Wooster et al., 1994)הנוספת ממקרי סרטן שד תורשתיים בנשים ולמרבית מקרי סרטן שד בגברים

, בקיבה, וטציות בגן זה מקושרות עם סיכון גבוה יותר לפתח סרטן בלבלבכמו כן ישנם דיווחים כי מ. (1995

. במעי ובבלוטת הערמונית

לבין אלו הקשורים BRCA1-למעשה ישנם הבדלים בהתפתחות גידולי הסרטן הקשורים למוטציות בגן ל

ול והשפעת הגיל בו אובחן הגיד, סיכון התלוי במין החולה: ההבדלים הללו כוללים. BRCA2-למוטציות ב

נשאי מוטציות בגן , BRCA1-בהשוואה לנשאי מוטציות בגן ל. גורמים גנטיים על הסיכון לחלות בסרטן

בעלי חדירות נמוכה יותר אך בסיכון לפתח סוגים רבים יותר , לוקים במחלה בגיל מאוחר יותרBRCA2-ל

.(Moynahan, 2002)של גידולים בנשים ובגברים כאחד

17

1.10. 1BRCA ,רשתי ודיכוי גידול סרטן תו

תואמת לתאוריית " התנהגותו"מאחר ו) tumor suppressor( מוגדר כמדכא גידול BRCA1החלבון

two-hit hypothesis of carcinogenesis (Knudson,1996) אשר גורסת כי מוטציה באלל אחד של גן

כאשר האלל . הטרוזיגוטיתאלא יוצרת מצב של מוטציה , המוגדר מדכא גידול אינה גורמת להתפתחות סרטן

העלול להוביל להתפתחות גידול (loss of heterozygosity)קיים איבוד ההטרוזיגוטיות , השני נפגע או חסר

מצב של איבוד . זאת בניגוד לאונקוגן אשר מוטציה באלל אחד מספיקה בכדי לגרום להתפתחות גידול. סרטני

סביר שבלידה תאי החולה . ות בגידולי סרטן משפחתיים מתרחש לעיתים קרובBRCA1-ההטרוזיגוטיות בגן ל

. (in utero) הינו לתלי ברחם BRCA1הכילו אלל תקין ואלל מוטנטי וזאת כיוון שחסר הומוזיגוטי של הגן

איבוד האלל התקין יכול להתרחש בתאים שונים מאשר תאי . בעקבות איבוד האלל התקין התפתח גידול סרטני

הינו חלבון BRCA1. אך רק רקמות אלו רגישות להתפתחות סרטן במסלול זה,האפיתל של השד והשחלה

,Brody & Biesecker)בעל תפוצה רחבה ועל כן הסיבה לספציפיות של הגידולים הללו עדין לא ידועה

התמקד בחלוקה הנמרצת של תאים אלו , הסבר אחד שהוצע להתפתחות סרטן דווקא בתאי שד ושחלה. (1997

חוקרים אלו הציעו כי . (Welcsh & King, 2001)ורמון אסטרוגן במהלך גיל ההתבגרות עקב הפרשת הה

למרות שמנגנוני . תאי השד והשחלה מתחלקים במהירות, עקב עלייה בביטוי האסטרוגן, במהלך ההתבגרות

. BRCA1יתכן ומוטציה נוספת מתרחשת באלל התקין של , התיקון של הגדילים המסונתזים פועלים נמרצות

וכן רצפים חוזרניים Alu של רצפי 42%- מכיל כBRCA1-כיוון שהגן ל, הסבירות למצב זה אינה נמוכה

אינם BRCA1-רוב התאים אשר נפגעו בשני עותקי ה. על היווצרות מוטציה נוספת" מקלים"נוספים ה

יש BRCA1-ל, יחד עם זאת. ועל כן מתים במחזור התא הבאDNA-מצליחים לתקן את הנזק הקיים ב

- עלולים לגרום לפגיעות באזורים שונים בBRCA1-null ולכן היווצרות תאי DNAתפקיד בתיקון נזקי

DNAהתאים הללו עלולים להמשיך להתחלק . ביניהם פגיעה בגנים המקודדים לחלבוני בקרה במחזור התא

של (checkpoint)החומקים מנקודת הביקורת " לא מתוקנים"חלוקה מואצת ולאפשר המשך קיום של תאים

שהרי אם במהלך . הסבר זה נתמך גם בעובדה כי סרטן שד ושחלה תורשתיים חלים בגיל צעיר. מחזור התא

בזמן שקיימת מוטציה תורשתית ( BRCA1 חלה מוטציה באלל התקין של, חלוקה נמרצת של תאי שד ושחלה

18

סרטני עלול להתפתח בשלב מוקדם אזי גידול , חלה גם מוטציה נוספת בחלבון בקרהכןו) קריטית באלל השני

. בחיים

מבטאים רמות נמוכות של הרצפטור , BRCA1-ניתן לציין כי גידולים הנגרמים עקב מוטציות בגן ל

Loman et al., 1998; Lakhani et(לאסטרוגן מאשר בגידולים המתפתחים עקב גורמים תורשתיים אחרים

al., 2002 .(

כמדכא גידול התקבלו בניסוים אשר הראו כי החדרת BRCA1 של עדויות נוספות התומכות בתפקידו

BRCA1) אך , הובילה לעצירת גדילה של מספר שורות תאי סרטן שד ושחלה) על ידי שימוש ברטרווירוס

antisenseהחדרת , יתר על כן. (Holt et al., 1996)לא מנעה גדילה של שורות תאי סרטן המעי או הריאות

oligonucleotidesנגד כBRCA1 mRNA הובילה להאצת גדילה של תאי שד נורמלים וסרטנים ועודדה

כל הממצאים הללו תומכים בהשערה שהגן . NIH3T3 (Thompson et al., 1995)טרנספורמציה של תאי

, ואשר משתנה, הפעיל ברקמת האפיתל של שד ושחלה נורמליםtumor suppressor מהווה BRCA1-ל

. ידולי שד ושחלהמופחת או חסר במספר ג

1.11. 1ACBRוסרטן שד ספורדי

. (Khoo et al., 1999) הן נדירות ביותר בגידולי שד ספורדים BRCA1-מוטציות סומטיות בגן ל

, (Xu et al., 1997) לרוב נמוכות בעקבות שחבור חילופי שונה BRCA1בגידולים אלו רמות החלבון של

או פגם במיקום , (Rice et al., 1998; Bianco et al., 2000; Esteller et al., 2000)מתילציה משובשת

, כשלון בבקרת השעתוק על ידי הרצפטור לאסטרוגן. BRCA1 (Chen et al., 1995)-התאי של חלבון ה

. BRCA1 mRNA (Sourvinos & Spandidos, 1998)יכול גם כן להיות אחראי על רמות נמוכות של

ירידה בביטוי לרוב עקב נובעות, נמוכותBRCA1רמות , בסרטן ספורדי, תהא הסיבה אשר תהא

. הגן ולא כתוצאה מאיבוד פעילות של שני האללים

19

ותפקידו1BRCA-מבנה ה .1.12

80Kb DNA~ אקסונים הפזורים לאורך 24- ומורכב מ17q21 ממוקם בכרומוזום BRCA1הגן

ובעל שני אזורים , מצות אמינו חו1863 המכיל kDa 220מסגרת הקריאה מקודדת לחלבון במשקל . הגנומי

המורכב משבע שיירי ציסטאין (RINGאחד מהם ממוקם בקצה האמיני ומכיל מוטיב של ). 4איור (שמורים

. או חלבוןDNA, RNA: הידוע ביכולתו לקשור מולקולות כגון) ושיירי היסטידין הקושרות שני יוני אבץ

BRCT (BRCA1יירים חומציים ומכיל שני אתרי האזור השמור השני מופה לקצה הקרבוקסילי העשיר בש

C-terminal) המקנים פעילות של שפעול שעתוק (Chapman & Verma, 1996) . שני אזורים אלו מהווים

11מקודד על ידי אקסון ) 60%-כ (BRCA1-החלק העיקרי של ה). חומצות אמינו300(חלק קטן מהחלבון

תחילה נחשב מוטיב . אשר ממקמים את החלבון בגרעיןnuclear localization signalsהמכיל שלושה אתרי

עקב הדמיון המשמעותי למוטיב אצבעות האבץ DNA- לאתר קשירה פוטנציאלי לBRCA1- של הRING-ה

(zinc finger) ,הידועים כמוטיבים אשר מאפשרים קישור ל-DNA (Lovering et al., 1993) . בדיקות

מסוגל BRCA1לאחרונה התברר כי . (Meza et al., 1999)אינה נכונה ישירות נוספות גילו כי הנחה זו

כמו כן נמצא כי הוא יכול להקשר למבנה מסועף של . אך באופן בלתי ספציפי לרצף, DNA-להיקשר ל

DNA ולמולקולות DNA ארוכות (Paull et al., 2001).

. חלבון-ת ליצור קשרי חלבון הינה היכולRING-אפשרות נוספת שיוחסה לאזור ה, כפי שציינתי קודם

: מסוגל להיקשר לחלבונים נוספים כגוןBRCA1אפשרות זו נמצאה נכונה כיוון שנמצא כי החלבון

BARD1ו -BAP1 .BARD1 (BRCA1-associated RING domain protein)הינו חלבון אשר ,

BRCA1-ל ה טרמינלי ובעזרת אתר זה נקשר אN- בקצה הRINGמכיל אזור של , BRCA1-בדומה ל

הוא ככל הנראה להיקשר לפקטור הפוליאדנילציהBARD1תפקידו של החלבון ). ומכאן שמו של החלבון(

CstF-50 (cleavage stimulation factor) ועל ידי כך לעכב הוספת זנב של Poly A . יתכן כי הסיבה לכך

& DNA) Kleimanן באתר תיקו, RNA-במהלך תהליך עיבוד ה, לא תקיןRNAהיא למנוע היווצרות

Manley, 1999 .( תפקיד נוסף שיוחס לקישור ביןBRCA1 לבין BARD1 הינו הגברת פעילותו של

BRCA1 בהוספת מולקולות יוביקוויטין (ubiqutin)תהליך זה מוביל להוספת שרשרת של . עצמית

20

בניגוד להוספת (DNAקי התורמת לפעילויות שונות ביניהם מעורבות בתיקון נז63יוביקווטין לליזין בעמדה

,.Xia et al) ( שמובילה לפירוק החלבון על ידי מערכת הפרוטאוזום48שרשרת יוביקווטין לליזין בעמדה

חלבון זה . BRCA1 בחלבון RING- לאזור הBAP1קיימת עדות לקישור של החלבון , לעומת זאת) 2002

.(Jensen et al., 1998)מתפקד כהידרולאז של מולקולות יוביקוויטין

NH2

RING D Nuc als BRC T)omain lear Localization Sign A1 C-Terminal Domain (BRC

COOH

1BRCAאיור סכמתי של החלבון - 4איור

הסיגנל למיקום בגרעין אשר נמצא , טרמינלי של החלבוןN- הממוקם בקצה הRING-ה: כולל שלושה אזוריםBRCA1חלבון

.BRCA1 טרמינלי ותורם לשפעול שעתוק על ידי C- הממוקם בקצה הBRCT-בחלק המרכזי של החלבון וה

וא בעל תפקיד חשוב בהתפתחות והתמיינות של השד וביטויו מושרה בזמן הBRCA1חלבון

זאת בניגוד לתאי שריר או עצב אשר בהם חלבון זה מתבטא גם כן בכמויות , הבגרות המינית ובזמן הריון

ממצאים אלו עולים בקנה אחד עם העובדה . אך אינו הכרחי להתפתחותם והתמיינותם של רקמות אלו, גבוהות

Marquis et al., 1995; Kubista( גורמות להתפתחות גידולי סרטן שד ושחלה BRCA1-ות בגן לכי מוטצי

et al., 2002 .( מוטציות בגן זה נפוצות במיוחד במשפחות בהן יש מקרים רבים של הופעת סרטן שד בגילאים

רוב . BRCA1- מוטציות שונות בגן ל460-עד כה זוהו מעל ל. (Futreal et al., 1994)צעירים מאד

במסגרת הקריאה המוביל ליצירת frameshiftבסיס הגורם ליצירת המוטציות הם הוספה או השמטה של

תוארה כבעלת שכיחות של , 185delAG, מוטציה ייחודית אחת. (Sorlie et al., 1998)חלבונים קטומים

בעלת סיכון גבוה לפתח לפיכך אחת ממאה נשים יהודיות אשכנזיות היא. בנשים יהודיות אשכנזיות~ 0.9%

קיים בכמויות גדולות BRCA1 ישנם מחקרים שהראו כי . (Struewing et al., 1995)או שחלה /סרטן שד ו

. בעוד שבשורות תאים לא ממאירים החלבון ממוקם בגרעין, בעיקר בציטופלסמה בשורות תאי סרטן שד

21

מעורב בפתוגנזה של סרטני שד BRCA1תוצאות אלו מרמזות כי יתכן שהשינוי בתפוצה התוך תאית של

.(Chen et al., 1995)ספורדים או משפחתיים , רבים

ניסו חוקרים רבים לקבל רמזים בעזרת הסתכלות על , אינו ברורBRCA1מאחר ותפקידו של

:BRCA1להלן מספר תפקידים שיוחסו לחלבון . מבנהו והקשר בינו לחלבונים אחרים

1.12.1. 1BRCA ומנגנוני תיקון נזקי NAD

עלולים להוביל ליצירת שברים בשני DNAחשיפת תאים לקרינה מייננת או לחומרים גורמי נזקי

יש , כאשר לתא נגרם נזק מסוג זה. Double Strand Breaks (DSBs)שברים אלו מכונים . הגדילים

nonhomologous end-joining (NHEJ): ביכולתו להפעיל את שני מנגנוני תיקון הבאים

.homologous recombination (HR)-ו

במקרה של פגיעה . הינו תהליך מהיר ומדויק למדי במידה ולא חלה פגיעה בקצוות- NHEJ-מנגנון ה

תיקון כזה . יכולים תאי היונקים לאחות את השברים על חשבון יצירת חסרים קטנים, בבסיס או בנוקלאוטידים

מנגנון זה חשוב גם בתיקון ). לפני יצירת הנזקDNA-רצף ה(המקורי DNA-מועד לטעויות ביחס לרצף ה

. (Jasin, 2002) וביצירת נוגדניםT של הרצפטור בתאי V(D)Jשברים הנוצרים במהלך רקומבינציות

הינו תהליך מדויק מאד המבוסס על רקומבינציה הומולוגית בין כרומטידות אחיות – HR-מנגנון ה

.DNA-שקיימות רק בשכפול ה

אשר מוטציה בו (ATMמופעל החלבון , הגורם לשבירת שני הגדיליםDNA-חל נזק ב כאשר

BRCA1המתפקד כקינז ומזרחן את החלבון ) Ataxia telangiectasia-גורמת להתפתחות מחלת ה

(Cortez et al., 1999) .לאחר הזירחון נפרד ה-BRCA1 מהחלבון CtIPהקשור אליו .CtIP הינו חלבון

. (Li et al., 1999) שתפקידו דיכוי שעתוק CtBPאך הוא מצוי באסוציציה עם החלבון , קידו אינו ידועשתפ

כדוגמת , DNA לשפעל גנים אשר מסייעים בתיקון BRCA1- מאפשר לCtIP- מBRCA1יתכן כי שחרור

. BRCA1 אשר ביטויו עולה עקב ביטוי יתר של GADD45הגן

הוא יצירת קומפלקס יציב של החלבונים, BRCA1- התהליך נוסף המתרחש לאחר זירחון

BRCA1-RAD51-BRCA2 הפועלים יחדיו להפעלת מנגנון תיקון מסוג HR .למעשה ,BRCA1 לא רק

22

במחזור התא Sשמתבטא בפזת , אלא שניהם אף ממוקמים יחדיו במבנה תוך גרעיניRAD51נקשר לחלבון

קיים הומולוג RAD51לחלבון . DNA- באזור שעתוק ה,DNAאו המופיע לאחר טיפול בחומרים גורמי נזקי

,.DNA) Scully et al הפועל במסלולי רקומבינציה הומולוגית ותיקון נזקי (RecA)בשמרים ובחיידקים

1997a; 1997b; Chen et al., 1999 .(כאשר נוצר נזק ב-DNAכאשר , או לחילופין, אשר לא ניתן לתקנו

המוביל להפעלת מסלולי עצירת גידול התאים p53מופעל החלבון , פלקסחלה מוטציה באחד ממרכיבי הקומ

. (Brugarolas & Jacks, 1997)או אפופטוזיס

ומורכב MRN מסוגל אף להיקשר לקומפלקס חלבונים נוסף המכונה BRCA1התברר כי

HR- הן במנגנון הDNAקומפלקס חלבונים זה מעורב בתיקון נזקי . MRE11/RAD50/NBS1מהחלבונים

;Zhong et al., 1997( בעקבות רקומבינציה מיוטית DNA וכן פועל בתיקון נזקי NHEJ-והן במנגנון ה

Haber, 1998; Haber, 2000.(

יש תפקיד חשוב במנגנוני תיקון שברים BRCA1-על סמך הממצאים הללו התפתחה ההנחה כי ל

פגומים , BRCA1 knockout גזע של עכברי חיזוקים להנחה זו התגלו בניסויים אשר הראו כי תאי. DNA-ב

ביטוי , יתרה מזאת. (Moynahan et al., 1999) על ידי רקומבינציה הומולוגית DNAביכולתם לתקן שברי

, )הפגועים בחלקים שונים בחלבון( מוטנטים BRCA1אך לא של חלבוני , wild type BRCA1של חלבוני

,.DSBs) Scully et al-ולהעלות את יעילות התיקון של היכולים להוריד את הרגישות לקרינה מייננת

1999 .(

(MSH MSH2, MSH3- אף יכול להקשר לחלבונים ממשפחת הBRCA1נמצא כי , בנוסף

המתרחשים (mismatch) על בסיס אי התאמה DNA-חלבונים אלו מעורבים בתיקון נזקים ב. MSH6)-ו

.(Wang et al., 2000)וצרים במהלך תיקון שברים דו גדילים או נDNA-באופן ספונטני במהלך שכפול ה

בשילוב עם BRCA1קבוצת חוקרים זיהתה קומפלקס גדול של חלבונים המכיל את , זאת ועוד

בעלי תפקידים שונים כדוגמת מדכאי גידול וחלבונים המסייעים , קבוצה של חמישה עשר חלבונים לפחות

. BRCA1-Associated genome Surveillance Complex (BASC) אשר נקרא DNAבתיקון נזקי

ממצא זה מרמז כי . DNA או נזקי DNA-לכל מרכיבי הקומפלקס יש תפקיד בזיהוי מבנה לא תקין של ה

23

משמש כרכז של פעילויות BRCA1החוקרים הציעו כי . DNA מתפקדים כחיישנים לנזקי BASCחלבוני

DNA ובעל תפקיד מרכזי בתיקון DNA-הלך שכפול הרבות הנדרשות לשמירה על יציבות גנומית במ

Wang et al., 2000).(

בעקבות חשיפת תאים , BRCA1-במחקר שהתפרסם לאחרונה נמצא כי חל זירחון שונה ב, לבסוף

. וזאת כתלות בשלב בו נמצא התא במחזור התא ובמידת הנזק הנגרמת לו, UVלקרינה מייננת או לקרינת

. (Okada & Ouchi, 2003) מיקום החלבון ופעילותו השוני בזירחון משפיע על

1.12.2. 1BRCAוהבקרה על מחזור התא

: והבקרה על מחזור התא התבסס על מספר ממצאיםBRCA1הקשר בין

, CDC2-ה, E2F-ה: לחלבונים המעורבים במחזור התא כגוןBRCA1קיים קשר בין החלבון

.(Wang et al., 1999)והציקלינים

ועל כן G1/S המאוחרת ומגיעות לשיא לאחר המעבר בין G1 עולות בפזת BRCA1-רמות ביטוי ה

.G1/S (Vaughn at el., 1996) פעיל בנקודת הביקורת BRCA1יתכן כי

מזורחן -לעומת מצב היפו, S המאוחרת ופזת G1מזורחן במהלך פזת - הופך היפרBRCA1חלבון

.M (Ruffner & Verma, 1997)החל לאחר פזת

BRCA1ר ל נקש-p53 (Zhang et al., 1998; Ouchi et al., 1998; Chai et al., 1999) אשר

. לו חשיבות רבה בבקרה על מחזור התא

שביטאו מוטציית חסר הומוזיגוטית לאקסון , מחקרים שהתבצעו בתאי פיברובלסטים עובריים מעכבר

G1/S checkpoint אין פגיעה בפעילות γהראו כי בעקבות חשיפה לקרינת , BRCA1- בגן ל11

ממצאים אלו מרמזים כי . נפגמהG2/M checkpointוחלה עצירה בגדילת התאים בעוד שפעילות

מוטנטי יאפשר לתאים BRCA1 ועל כן ביטוי G2/M checkpoint- יש תפקיד בBRCA1לחלבון

תהליך כזה תורם להתפתחות אי . לא מתוקן לתאי הבתDNA ולהעביר Mמוטנטים להמשיך לפזת

BRCA1במחקר שהתפרסם לאחרונה נמצא כי ,יתרה מזאת .(Xu et al., 1999)ציבות גנומית י

24

בעקבות היווצרות נזקי G2/M קינז הגורם לעצירה בגדילת התאים בשלב Chk1מפעיל את החלבון

DNA (Yarden et al., 2002).

BRCA1מעורב בהפעלת שעתוק חלבונים כגון :p21) התלויה והבלתי תלויה ב-p53 ( המוביל

שיכול גם כן לגרום לעצירת גידול GADD45 או (Zhang et al., 1998)לעצירת גידול התאים

יכול לא רק לשפעל את שעתוק BRCA1יש לציין כי . (Fan et al., 2002)התאים או לאפופטוזיס

GADD45פעילות זו אפשרית עקב קישור . אלא גם לדכא את ביטויוBRCA1 לחלבון ZBRK1

(Zheng et al., 2000).

1.12.3. 1BRCAכפקטור שעתוק

ישנו רצף העשיר בשיירים חומציים בעלי יכולת לשפעל BRCA1 טרמינלי של החלבון C-בקצהו ה

C-עובדה ראשונה לכך התקבלה מניסויים בהם השתמשו בחלבון אשר מאחה בין הקצה ה. שעתוק גנים

לאחר . GAL4 של החלבון DNAר הקושר לבין האזו) 1528-1863חומצות אמינו (BRCA1טרמינלי של

. GAL-ראו כי אכן חל שעתוק של גנים אשר הפרומוטרים שלהם תלויים ב, ביטוי חלבון האיחוי בתאים

אכן מתפקד כפקטור שעתוק אשר מווסת את ביטויים של גנים בתא BRCA1תוצאה זו אישרה כי

(Chapman & Verma, 1996; Monteiro et al., 1996) .ספת התקבלה לאחר שנמצא כי עדות נו

BRCA1ה, נקשר אל מערכת השעתוק הבסיסית-RNA Polymerase II holoenzyme) Scully et al.,

1997; Schlegel et al., 2000 (ואף מסוגל להקשר גם ל-RNA helicase A Anderson et al., 1998) .(

. HDAC2- וHistone deacetylase ,HDAC1 לחלבוני BRCA1כמו כן ישנן ראיות לכך שחל קישור בין

כפקטור שעתוק או לחילופין תומכות בהיותו מבקר BRCA1לא ברור אם ראיות אלו תומכות בתפקיד של

HDAC1 מדכא שעתוק על ידי גיוס חלבוני BRCA1יתכן כי . (Yarden & Brody, 1999)על שעתוק

יתכן כי , בניגוד לכך. ש לפקטורי השעתוק לפחות נגיDNA- לפרומוטר מסוים ועל כן הופך את הHDAC2-ו

BRCA1 דווקא מסייע לשעתוק של גנים על ידי הרחקת הקומפלקס Histone deacetylaseמה-DNA

(Welcsh et al., 2000).

25

1.12.4. 1BRCAוהפרדת הכרומוזומים

במניעת הפרדה לא תקינה של הכרומוזומים בתא BRCA1ישנם ממצאים המצביעים על מעורבותו של

(chromosome segregation) . העדר פעילות שלBRCA1בתאים הומניים שמקורם בגידולים סרטניים ,

BRCA1תאים עובריים של עכבר בעלי , בנוסף. הציגו אנפלואידיות כרומוזומלית בתדירות יחסית גבוהה

שווה בעקבות זאת התקבל פנוטיפ של הפרדה לא. נפגמהG2/Mהראו כי נקודת הבקרה , 11מוטנטי באקסון

בתהליך הפרדת BRCA1תפקידו של . חלוקת גרעין בלתי נורמלית ואנפלואידיות, של הכרומוזומים

משמש כפקטור שעתוק של גנים מסוימים וכן מסייע BRCA1-יתכן כי מאחר ש. הכרומוזומים אינו ברור

ים אשר מבקרים הרי שאיבוד פעילותו עלולה לגרום העדר בקרה או יצירת מוטציות בגנ, DNAלתיקון נזקי

מוביל לביטוי פרוטואונקוגנים BRCA1כמו כן יתכן כי העדר . p53את תהליך חלוקת הכרומוזומים כדוגמת

אשר ביטוי יתר שלו מוביל לאי יציבות גנומית הכוללת c-Mycכגון ) אחראי על דיכוייםBRCA1אשר (

הינו , וקה לא מדוייקת של הכרומוזומיםרעיון נוסף שהועלה כסיבה לחל. (Wang et al., 2000)אנפלואידיות

). (Hsu & White 1998בעזרת קישור פיסי לצנטרוזום , בסיוע לשכפול הצנטרוזוםBRCA1מעורבות

2.

26

מטרות המחקר

ממלא תפקיד חשוב ביותר בתהליכים ממאירים וביטויו על פני התאים עולה IGF-I-מכיוון שהקולטן ל

מתפקד כמעכב גדילה שבמידה והוא נפגע חלה עליה בסיכוי לחלות BRCA1-ומכיוון ש, בגידולים סרטנים

מטרת המחקר . IGF-IR- יש תפקיד בוויסות הפרומוטר לBRCA1-הגיוני להניח כי ל, בסרטן שד ושחלה

כמודל אפשרי IGF-IR- והגן לBRCA1הנוכחי להבחין ולנתח את האינטראקציות התפקודיות והפיזיות בין

.בהתפתחות סרטן שד

דרך שילוב קשרי , בצורה שליליתIGF-I- מווסת את שעתוק הגן לרצפטור לBRCA1-רתנו היא שהשע

מוטנטי מאבד את יכולתו להקשר ולדכא את פעילות BRCA1על כן . DNA-או חלבון\חלבון ו-חלבון

. IGF-I- וכך גורם לעליה בביטוי הגן לרצפטור לIGF-IRהפרומוטר של

מטרות ספציפיות .2.1

. במספר שורות תאים שונות של סרטן השדBRCA1 על ידי IGF-IR-ות של הפרומוטר לגן לחקר הוויס. 1

.IGF-IR המגביר את פעילות הפרומטור של Sp1 לבין גורם השעתוק BRCA1בדיקת יחסי הגומלין בין . 2

.IGF-IR- בוויסות הפרומוטר לBRCA1של ) DNA-חלבון וחלבון-חלבון(ניתוח האינטראקציות . 3

. מוטנטיBRCA1 על ידי IGF-I- וויסות ביטוי הגן לרצפטור לחקר. 4

.IGF-IR- בוויסות הפרומוטר לp53- וBRCA1בדיקת קשר תפקודי ופיזי בין .5

חשיבות העבודה .2.2

בהתפתחות BRCA1 ושל IGF-I-המחקר המוצע חשוב במיוחד להבנת התפקיד של הרצפטור ל

והפרומטר של , אם ההשערה תבוסס. שלהם בסרטן שדוהתמיינות של בלוטת חלב נורמלית וחוסר התפקוד

נרוויח הבנה מעמיקה יותר של הביולוגיה , BRCA1 אכן מהווה מטרה מולקולרית לתוצר הגן IGF-IR-הגן ל

בעלת BRCA1 של הגן 185הממצאים שמוטציה בקודון , בנוסף. מעורבBRCA1של סרטן השד שבו הגן

.נזיות הופכת את הנושא לבעל חשיבות מיוחדתשכיחות גבוהה מאד בנשים יהודיות אשכ

27

חומרים ושיטות .3

תרביות תאים .3.1

שורות תאים .3.1.1

, MDA-MB-231: ושורות תאי סרטן השד ממקור הומני, Saos-2, שורת תאי אוסטיאוסרקומה

MCF7 ,T47D ,וכן שורת תאים עוברים ממקור דרוזופילה ,Drosophila Schneider , נרכשו

HCC-1937שורת תאי סרטן השד . American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA-מ

סופקו באדיבות BRCA1((Tomlinson et al., 1998)- בגן ל5382Cאשר ידועים כהומוזיגוטים למוטציה (

Dr. Lawrence C. Brody (National Center for Human Genome Research, Bethesda, MD) .

והתאים הנגזרים wild type p53- המבטאים את הגן ל +/+ human colorectal cancer ,HCT 116תאי

סופקו , עקב רקומבינציה הומולוגית מכוונת, p53-אשר אינם מבטאים את הגן ל, -/- HCT 116, מהם

,Dr. Bert Vogelstein (Johns Hopkins University School of Medicineבאדיבותו של

Baltimore, MD, USA (Bunz et al., 1998).

".תוצאות"בחירת שורות תאים אלה לעבודה נובעת משיקולים המובאים בפרק

מצעי גידול ותנאי הגידול .3.1.2

Dulbeco’s modified- גדלו בMDA-MB-231- וSaos-2 ,MCF7 ,T47Dשורות תאי

Eagle's medium containing 4.5 g/l D-Glucose (DMEM)(Gibco BRL®, Paisley, Scotland) .

ותאי McCoy`s 5A medium- גדלו בHCT 116תאי , RPMI-1640- גדלו בHCC-1937תאי

Drosophila Schneiderגדלו ב -Schneider`s Drosophila medium שנרכשו מחברת תעשיות

Fetal bovine serum % 10לכל סוג ממדיום הגידול הוסף. (Kibbutz Beit Haemek, Israel)ביולוגיות

(FBS) ,2 mM Glutamine50- ו µg/ml gentamicin sulfate אשר נרכשו מתעשיות ביולוגיות וכן

28

5.6 mg/l fungizone (Sigma, St. Louis, MO, USA) . לתאיDrosophila Schneider סופק רק

20 µg/ml gentamicin sulfate ולא הוסף fungizone .

מ " ס10שורות תאי סרטן השד גודלו בצלחות פטרי בקוטר תאי סרטן המעי ו, תאי האוסטאוסרקומה

Bio-Lab- אשר נרכש מ Trypsin-Versaneבעזרת, ופוצלו כפעמיים בשבוע בהתאם לצפיפותם

Laboratories Ltd. Israel . 37°גידול התאים נעשה באינקובטור בטמפרטורה שלCלחות 100% - ב

. כפעמיים בשבוע, גם כן, פוצלו Drosophila Schneiderתאי . אויר95% - וCO2 5%ובתערובת של

ציוד סטרילי מתכלה ). ~24°C( סגורים כהלכה ובטמפרטורה החדר cm2 75הגידול נעשה בבקבוקי תרבית

. Corning (N.Y ,USA) -נרכש מ

הפקת פלסמידים .3.2

גידול חיידקים

חומרים

כל התמיסות הוכנו במים . אנליטיתכל החומרים היו בדרגת נקיון של ביולוגיה מולקולרית או בדרגה

.סטריליים מזוקקים פעמיים

גדלו Promega Madison WI, USA- שנרכשו מE. Coli subcloning efficiencyחיידקים קומפטנטים

או על גבי צלחות אגר , µg/ml Ampicillin 100 המכילLB broth base (Gibco BRL®)במצע גידול

. אשר הוכנו במעבדתנו(w/v) 1.5% ואגר LB broth base ,100 µg/ml Ampicillinהמכילות מצע גידול

תמיסות

2 M Mg2+ Solution: MgCl2, MgSO4.

SOC medium: 2% Bacto®-Tryptone (w/v), 0.5% Bacto®-Yeast (w/v), 10 mM NaCl, 2.5

mM KCl, 20 mM Glucose, 20 mM Mg2+.

29

מהלך העבודה

חיידקים קומפטנטים , בקצרה. הפרוטוקול המצורף לחיידקים הקומפטנטיםטרנספורמציה בוצעה לפי

10הדגימות שהו בקרח למשך . DNA (~100 ng) חיידקים קומפטנטים הוסף µl100 -ל. הופשרו בקרח

אחר כך הוסף לכל דגימה מצע . דקות2 וצוננו בקרח למשך 42°C שניות בטמפרטורה של 45חוממו , דקות

. למשך שעה37°C ובטמפרטורה של rpm 225 והן טולטלו במהירות של SOC) (900 µlגידול מועשר

מושבה בודדת או , לביצוע הפקה . שעות18 למשך 37°Cהתאים נזרעו בצלחות אגר וגודלו בטמפרטורה של

באמבט מטלטל בטמפרטורה של , ml 100-150נפח חיידקים דומה אשר אוששו מהקפאה גדלו בנפח של

37°C והפקת הפלסמידים נעשתה על ידי שימוש בערכת למשך לילהHiSpeed maxi prep (Qiagen,

Hilden, Germany)על פי הוראות היצרן .

פלסמידים וטרנספקציות .3.3

גנומי DNA בוצעו על ידי שימוש בקונסטרקטים שונים המכילים פרגמנטי transientטרנספקציות מסוג

עד 476-, 640+ עד 2350- הכוללים נוקליאוטידים IGF-I-R (Werner et al., 1992)מהפרומוטר של

. p0Luc בפלסמיד Luciferase- לגן לupstreamמשובטים , 640+ עד 40-- ו640+ עד 188-,640+

בסיסים מאזור 640- וflanking-’5- בסיסים מאזור ה40 או 188, 476, 2350פלסמידים אלה כללו

,.Werner et al(ומוטר הבסיסית של פלסמיד זה דווחה במחקר קודם פעילות הפר. untranslated-’5-ה

או wild type BRCA1-המקודדים ל, expression vectors, הוחדרו לתאים וקטורי ביטוי, בנוסף). 1994

לתוך BRCA1 cDNA נוצר על ידי שיבוט BRCA1-הווקטור המקודד ל. BRCA1 del185AGלמוטנט

בעזרת שימוש באנזימי החיתוך , pcDNA3 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)ווקטור הביטוי

HindIII ו-NotI (Fan et al., 1999) .ה-BRCA1המוטנטי נוצר בעזרת יצירת שינויים ב -BRCA1

cDNAווקטורי הביטוי של . המשובט בווקטור הריקBRCA1סופקו באדיבות Dr. L.C. Brody,

National Center for Human Genome Research, National Institutes of Health, Bethesda,

Maryland, U.S.A. .בניסויים בהם החדרנו לתאים ווקטור המקודד ל-BRCA1 11 חסר אקסון

30

(BRCA1∆11) השתמשנו בווקטור אשר התקבל באדיבותו של Dr. Toru Ouchi, Mount Sinai School

of medicine, New-York, NY, USA .בווקטור המבטא את החלבון בנוסף השתמשנו Sp1 אשר שובט

כל ניסויי הטרנספקציה נורמלו לפי יעילות ). pPaco(בפלסמיד הכולל את הפרומוטר לגן לאקטין

שהתקבלו כתוצאה מהחדרת הפלסמיד β-galactosidaseהטרנספקציה על ידי חלוקת ערכי הלוציפרז בערכי

pCMVβ-galactosidase (Clontech, Palo Alto, CA, USA) . פלסמיד זה הוחדר לתאים בכמות

.הפחותה מכמותו של הווקטור המדווח

, כאשר היה צורך בפלסמיד אינרטי לשם השוואת כמויות מולריות של ווקטורים אשר הוחדרו לתאים

במספר ניסויים החדרנו לתאים את הווקטורים המקודדים . pG4Z (Promega)השתמשנו בווקטור

). 248שינוי חומצה אמינית ארגנין לחומצה האמינית טריפטופן בקודון ( מוטנטי p53או wild-type p53 -ל

,Dr. Edward Mercer ,Thomas Jefferson Universityווקטורים אלו סופקו באדיבותו של

Philadelphia, PA, USA.

3.3.1. Transient Transfectionבשורות תאי סרטן השד

בשילוב IGF-IR מהווקטור המדווח µg 0.5 התבצעה עם כמות של טרנספקציה של תאי סרטן השד

של µg 0.2 וכן pcDNA3 או של הווקטור הריק BRCA1 של הווקטור המבטא µg 1.3עם

β-galactosidase .

כיממה לפני ) תאים לבאר2x105 ( בארות 6 נזרעו בפלטות של MDA-MB-231 ותאי T47Dתאי

-Lipofectamineהחדרת הווקטורים השונים לתאים התאפשרה על ידי שימוש בראגנט . קציהביצוע הטרנספ

2000 (Life Technologies, Gaithersburg, MD, USA)על פי הוראות היצרן .

כיממה לפני ביצוע הטרנספקציה שהתאפשרה , בארות6 נזרעו בפלטות של HCC-1937תאי

, Fugene 6 reagent (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN, USA)-בעזרת שימוש ב

.2.5 : 1 היה DNA : Fugene 6 -יחס ה. על פי הוראות היצרן

31

החדרת . בארות כיממה לפני ביצוע הטרנספקציה6 נזרעו גם כן בפלטות של MCF7תאי

על פי הוראות JetPEITM reagent (Poly-Plus, Illkirch, France)-הפלסמידים התבצעה על ידי שימוש ב

. היצרן

פירוט הווקטורים שהוחדרו וכמויותיהם . התבצעו מספר ניסויי טרנספקציות שוניםMCF7בתאי

). 4פרק (מפורטים בסעיפים המתאימים בפרק התוצאות

3.3.2. Transient Transfection 2 בתאי-Saos

Saos-2אי נזרעו ת, המוחדרת לתאיםBRCA1-לבדיקת פעילות הפרומוטר כתלות בכמות ה

של הגן המדווח וכן ווקטור ביטוי µg 2.5 ימים הוחדרו לתאים 3 וכעבור cm 10בצלחות פטרי בקוטר

β-galactosidase - של הפלסמיד המקודד לµg 2.5 וכן (µg 1-10) בכמויות שונות BRCA1-המקודד ל

ה על ידי הוספת קבועDNA-בכל דגימה נשמרה הכמות הסופית של ה. לבאריתµl 500 בנפח סופי של

.Calcium Phosphateהטרנספקציות בסדרת ניסויים זו בוצעו בשיטת . ווקטור ביטוי ריק

בופרים ותמיסות

125 mM CaCl2.

DNA precipitation buffer: 25 mM Hepes pH 7.05, 6 mM Glucose, 5 mM KCl, 140 mM

NaCl, 0.75 mM Na2HPO4.

מהלך העבודה

1x106 תאי Saos-210רעו בצלחות פטרי בקוטר נז cm . ימים2-3הטרנספקציות בוצעו כעבור ,

החדרת הפלסמידים לתאים התבצעה על ידי שימוש בשיטת . 90-100%-כאשר צפיפות הפלטה הייתה כ

Calcium Phosphate . כשעתיים לפני ביצוע הטרנספקציה הוחלפה מדיית הגידול במדיה חדשה המכילה

2.5µgכל צלחת קיבלה . דקות בטמפרטורת החדר20 והבופר למשך CaCl2- עם ההפלסמידים הודגרו. סרום

, p0LUC המשובט בתוך הפלסמיד IGF-I-R [p(-476/+640)LUC] מווקטור המכיל את הגן המדווח

10µgמהווקטור המקודד ל -BRCA1 2.5 וכןµg מהווקטור המקודד לחלבון β-galactosidase , בנפח סופי

32

במדיה טרייה המכילה , CaPO4שעות לאחר תחילת הטרנספקציה הוחלפה המדיה המכילה ארבע . µl 500של

3.3.5 שעות לאחר הטרנספקציה ופעילות הלוציפראז נמדדה כמתואר בסעיף 48התאים נקצרו . סרום

(Werner et al. 1992) בעזרת מכשיר הלומינומטר (Berthhold Lumat LB 9507) שתוכנת להזריק

200µlכל המדידות נעשו בדופליקטים. לוציפרין בכל מדידה-טרט של הסובס .

3.3.3. Transient Transfection בתאי SchneiderDrosophila

כשעתיים לפני ) תאים לבאר 4x106( בארות 6 נזרעו בפלטות של Drosophila Schneiderתאי

Calcium phosphate-החדרת הפלסמידים לתאים התאפשרה על ידי שימוש ב. ביצוע הטרנספקציה

transfection system (Gibco BRL®, )לביצוע הטרנספקציות החדרנו את . על פי הוראות היצרן

או של הווקטור הריק BRCA1 של הווקטור המבטא µg 1 בשילוב עם µg 5הווקטור המדווח בכמות של

pcDNA3או ווקטור המבטא את החלבון \ וSp1 (pPacSp1) 300 בכמות של ngיק או הווקטור הר

(pPac0).

3.3.4. Transient Transfection 116 בתאיHCT

החדרת . בארות כיממה לפני ביצוע הטרנספקציה6 נזרעו גם כן בפלטות של HCT 116תאי

. על פי הוראות היצרן, Fugene 6 reagent (Roche)-הפלסמידים התבצעה על ידי שימוש ב

וט הווקטורים אשר הוחדרו לתאים וכמויותיהם מפורטים בסעיפים פיר. 2.5 : 1 היה DNA : Fugene 6יחס

). 4פרק (המתאימים בפרק התוצאות

33

בדיקת פעילות לוציפרז .3.3.5

חומרים

2 mM d-Luciferin (Sigma, St. Louis, MO, USA) מומס בבופר Glycylglycine.

בופרים ותמיסות

Lysis solution: 1% Triton x-100 (v/v), 25 mM glycylglycine pH 7.8, 15 mM MgSO4,

4 mM EGTA, 1 mM DTT.

Assay solution: 25 mM glycylglycine pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA, 15 mM

K2HPO4 pH 7.8, 1 mM DTT, 2 mM ATP.

Glycylglycine buffer: 25 mM glycylglycine pH 7.8, 15 mM MgSO4, 4 mM EGTA.

מהלך העבודה

lysis או באר מששת הבארות הוספה תמיסת cm 10 ולכל צלחת בקוטר PBS - נשטפו בהתאים

rpm 10,000במהירות של , דקות5תמציות התאים נאספו וסורכזו במשך ). בהתאמה, ml 0.4 או 0.5(

µl 360כל דגימה שהוכנה לקריאה הכילה . הנוזל העליון הועבר למבחנות חדשות. 4°Cובטמפרטורה של

במקום תמצית lysis תמיסת µl 100למדידת הרקע הכילו הדגימות . תמצית תאיםµl 100- וכassayת תמיס

. הדגימות נקראו בעזרת לומינומטר. תאים

נירמול תוצאות הטרנספקציה .3.3.6

חומרים

o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside (ONPG) 4 mg/mlמומס בבופר פוספט .

בופרים ותמיסות

Phosphate buffer: 0.1 M Na2HPO4 pH 7.3.

Magnesium buffer: 1 mM MgCl2, 50 mM 2-mercaptoethanol

34

מהלך העבודה

בוטאה פעילות , על מנת לנרמל את תוצאות פעילות הפרומוטר על פי יעילות הטרנספקציה

של ליזט לשם כך הודגרו נפחים שונים . β-galactosidaseהפרומוטר בערכי הלוציפרז מנורמלים לפעילות

בטמפרטורה של , בנוכחות הבופרים הרשומים מעלה למשך פרק זמן קצובONPG (66 µl)עם הסובסטרט

37°C500בסיום הריאקציה הוספו . עד לקבלת תוצר ריאקציה צהוב µl H2O והצפיפות האופטית של תוצר

יר הספקטרופוטומטר נקבעה במכש, הריאקציה הצהוב אשר נוצר בעקבות פירוק הסובסטרט על ידי האנזים

. nm 410באורך גל

נמדדה Drosophila Schneiderבכדי לנרמל את תוצאות הניסויים אשר התקבלו מהטרנספקציות בתאי

).3.5.2סעיף ( לקביעת חלבון Bradfordכמות החלבון הכללית בכל דגימה בעזרת שימוש בשיטת

חישובים סטטיסטים לתוצאות הטרנספקציה .3.3.7

.s T test’unpaired student-מובהקות התוצאות השתמשנו בבכדי לקבוע את

3.4. )EMSA(Electrophoretic mobility shift assays

האחד אוליגונוקלאוטיד סינטטי . IGF-IR-בניסויים אלו השתמשנו בשני מקטעים מהפרומוטר ל

γ-32P-ATP-סומנו במקטעים אלו ). initiator-אזור ה(והשני מקטע גנומי הממוקם באזור תחילת השעתוק

נקי Sp1בנוכחות או בהעדר חלבון ,תרגום/ אשר הופק בעזרת ערכת שעתוקBRCA1והודגרו עם החלבון

.Promegaאשר נרכש מחברת

35

translation/transcription בעזרת ערכת 1BRCAהפקת חלבון .3.4.1

חומרים

BRCA1ווקטור המקודד לחלבון

TNT®T7Quick-Coupled Transcription/Translation System (Promega).

מהלך העבודה

inהחלבון ובעקבותיו תרגוםT7 RNA polymerase התבצע על ידי in vitroשעתוק , בקצרה

vitro35- בנוכחות מתיונין מסומן בS (Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden) על ידי ליזט של

8%ל 'געל גבי , SDS-PAGEידי אלקטרופורזה בשיטת תוצרי התרגום הופרדו על . רטיקולוציטים מארנבת

לאחר שהתברר כי אכן סונתז החלבון . X-ray film (Kodak, Rochester, NY, USA)-וחשיפה ל

BRCA1 ,אך הפעם ללא סימון , חזרנו על תהליך הפקת החלבון, על פי הנדידה האלקטרופורטית שלו

.במתיונין חם

יהכנת האוליגונוקלאוטיד הדו גדיל .3.4.2

היה אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי בעל EMSA-האוליגונוקלאוטיד בו השתמשנו לניסויי ה

באזור 357-/380- וממוקם בין נוקלאוטידים AGCCCGCCCGCCCTGCCGCCGCCC, הרצף

). המסומנים בקו תחתי (Sp1 ומכיל שני אתרי קשירה חופפים לחלבון IGF-IR של flanking region’5-ה

GCATTGTTTTTTGGAGTCCTG, סויי תחרות הוכן רצף אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי נוסףלני

ואינו מכיל אתרי IGF-IR של flanking region’5-באזור ה, 305-/325-הממוקם בין הנוקלאוטידים

).MWG Biotec, Ebersberg, Germany(שני הרצפים המתוארים נרכשו מחברת . Sp1קשירה לחלבון

יםחומר

Sp1-אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי המכיל אתרי קשירה ל

5`-GCA GCC CGC CCG CCC TGC CGC CGC CCC CT-3`

3`-T CGG GCG GGC GGG ACG GCG GCG GGG GAA C-5`

36

Sp1-אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי אשר אינו מכיל אתרי קשירה ל

5`-GCA TTG TTT TTT GGA GTC CTG-3`

3`-T AAC AAA AAA CCT CAG GAC GC-5`

מהלך העבודה

למבחנה חדשה נלקחו . ועורבבוµg/µl 1 הומסו הנוקלאוטידים לריכוז של annealingבכדי לבצע

100 µl 100 של כל זוג נוקלאוטידים משלימים והללו עורבבו עם mM NaCl 1 והובאו לנפח סופי של ml

שמירת . במשך שתי דקות וצוננו לטמפרטורת חדר95°C-ממו בהתערובות חו. במים סטרילים

.-20°C-אוליגונוקלאוטידים הדו גדילים נעשתה ב

Initiator-הכנת מקטע גנומי הממוקם באזור ה .3.4.3

µl 35 המקטע הוכן על ידי חיתוך . IGF-IR-הפרומוטר ל מ115+/40-המקטע אשר בחרנו הינו

µl Xho1, 5 µl NEB2 buffer, 2 µl 2 והדגרתו עםSma1 fragment [(-331)-(+514)]מהווקטור

Pml1, 2 µl BSA .אנזימי החיתוך והבופר בהם השתמשנו נרכשו מחברתNew England Biolabs,

Hertfordshire, England . 37°ההדגרה נמשכה כשלוש שעות בטמפרטורה שלC .הדגימה , לאחר החיתוך

.ל אגרוז'הורצה על גבי ג

חומרים

Low mass ladder ((Invitrogen) 100 bp ladder (Fermentas, Vilnius, Lithania),

Agarose (Gibco BRL®, ), Ethidium bromide (EtBr) .

בופרים ותמיסות

Running buffer: (1x TBE): 90 mM Tris base, 90 mM boric acid, 2.5 mM EDTA.

6x Sample buffer: 0.25% Bromophenol blue (w/v), 30% Glycerol (v/v), 0.25% Xylene

cyanole (w/v).

37

מהלך העבודה

בריכוז של EtBr - וTBE - אגרוז מומס ב2%ל ' נעשתה על גבי גDNA -בדיקת דוגמאות ה

0.05 µg/ml .ל בנוכחות 'הדגימה הוטענה על גSample buffer . ההרצה בוצעה במכשיר אלקטרופורזה

לאחר שהתקבל המקטע בגודל . דקות30 - למשך כ80-100vתבצעה במתח של והTBEבנוכחות בופר

,QIAquick gel extraction kit (Qiagenל ואחר כך נוקתה בעזרת 'הורצה כל דגימה על הג, הצפוי

Hilden, Germany) .על מנת לקבוע את כמות ה, לבסוף-DNAהורצה דגימה של מקטע , אשר ברשותנו

. DNA mass ladder- במקביל ל2%וז ל אגר' על גבי גDNA-ה

IR-IGF- מהפרומוטר ל-40+/115פוספורילציה של מקטע -דה .3.4.4

מהלך העבודה

µl1 של המקטע עם ng 400 התבצע על ידי הדגרה של 115+/40-פוספורילציה של המקטע -דה

לאחר הדגרה . Calf intestinal phosphatase (CIP), (New England Biolabs)של האנזים

תהליך זה נעשה על ידי הוספת מחצית . היה צורך לשקע את המקטע, במשך שעה אחת37°Cטמפרטורה של ב

הפאזה המימית שמכילה . rpm 10,000 - דקות ב5נפחי פנול וכלורופורם והדגימה עורבבה והושקעה משך

, 5µg tRNA (Roche, Molecular Biochemicals) הועברה למבחנה נקיה ולה הוספו DNA -את ה

הדגימה . למשך לילה20°C-של ' נפחים של אתנול והיא הודגרה בטמפ2 - וNH4 acetateמחצית הנפח

ואחר כך Speed Vac ויובשה באמצעות 4°Cשל ' בטמפ13000gבמהירות , סורכזה משך מחצית השעה

.הומסה עם מים

סימון הגלאי .3.4.5

µg1של אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי סומן קצה ב -γ-32P-ATPבעזרת T4 polynucleotide

kinase (New England Biolabs) 37° במשך שלושים דקות בטמפרטורה שלC . הסימון הופסק על ידי

38

בכדי להרחיק נוקלאוטידים חופשים הוטען הגלאי על . דקות5 במשך 70°Cהדגרת הגלאי בטמפרטורה של

מידת הרדיואקטיביות נמדדה . Princeton Separation, Adelphia, NJ, USA) (Centri•spin-20קולונת

.β-בעזרת מונה

EMSAביצוע .3.4.6

חומרים

1µg/µl BSA, 1µg poly dI-dC(Amersham Biosciences), recombinant Sp1 protein [0.375

footprinting unit (f.p.u.)], in vitro translated BRCA1, 5% TBE- polyacrylamide gel

(Bio-Rad Laboratories Ltd. Hercules, CA, USA).

בופרים

5x Binding Buffer: 50 mM Tris-HCl pH 7.5, 250 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 25 mM

EDTA, 20% glycerol (v/v), 2.5 mM DTT.

Running buffer (0.5X TBE): 45 mM Tris base, 45 mM boric acid, 1.25 mM EDTA.

10x Loading Buffer: 250 mM Tris-HCl pH 7.5, 40% glycerol (v/v).

מהלך העבודה

BSA- וpoly dI-dC, הודגרו בנוכחות בופר קשירהBRCA1- וSp1כמויות שוות של החלבונים

דקות 20- והוגדר ל(dpm 30,000~)לאחר מכן הוסף גלאי רדיואקטיבי . 4°Cשל ' דקות בטמפ10למשך

ל פוליאקריל אמיד ' שנוצרו הורצו בגDNA-מידים חלבוןהתצ. µl 10נפח הסופי של הראקציה היה. נוספות

45לים במשך 'ל יובש במייבש ג'הג. דקות20 במשך V 170במתח קבוע של , 0.5X TBEבבופר , 5%

למשך לילה X-Ray film (Kodak)-ל היבש נחשף ל'הג. 80°Cבואקום ובטמפרטורה של , דקות

.בטמפרטורת החדר

39

BlottingWestern -ו שיקועים אימונים .3.5

הכנת הדגימות .3.5.1

בופרים ותמיסות

Lysis buffer for the Saos-2 cell line: 150 mM NaCl, 20 mM Hepes pH 7.5, 2 mM

EDTA, 1% Triton X-100 (v/v), 2 mM EGTA, 1 mM PMSF, 2 µg/ml aprotinin, 2 mM

leupeptin, 4 mM pyrophosphate, 1 mM ortovanadate , 2 µg/ml pepstatin, 1 mM DTT.

Lysis buffer for the MCF7 cell line:, 50 mM Tris-HCl pH 7.8, 4 mM pyrophosphate,

120 mM NaCl, 20 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml leupeptin, 0.5% NP-40 (v/v), 1 mM PMSF,

0.2 mM ortovanadate.

5x Sample Buffer: 5 mM EDTA, 40 mM DTT, 10% SDS (w/v), 0.3125 M Tris, 1%

bromophenol blue (w/v), 25% glycerol (v/v).

נוגדנים

Santa Cruz Biotechnologyהנוגדנים בהם נעשה שימוש לשיקוע אימוני של החלבונים נרכשו מחברת

(Santa Cruz, CA, USA).

חומרים

protein A-G Agarose (Santa Cruz Biotechnology)

מהלך העבודה

בעזרת וגירודםEDTA 5 mM המכיל PBSהתאים הוסרו מצלחות הגידול לאחר שתי שטיפות עם

scraper1100 דקות במהירות10במשך מהפלטות ואחר כך סירכוז rpm . פלטי התאים הודגרו בנוכחות

Lysis buffer 4°בטמפרטורה של , דקות30 למשךC . 4°- דקות ב20הדגימות סורכזו במשךC במהירות

, mg total protein 1-כמות החלבון הכללית נקבעה ולאחר מכן נלקחו דגימות המכילות כ. 13,000gשל

הוספו לכל דגימה נוגדנים כנגד , בכדי לבצע שיקוע אימוני. בופר ההמסה המתאיםml 0.5בנפח סופי של

ריכוז הנוגדנים הסופי היה . BRCA1של החלבון (C-20) או כנגד הקצה הקרבוקסילי (D-20)הקצה האמיני

40

2 µg/ml . שיקועSp1 נעשה בעזרת נוגדנים כנגד Sp1(Pep2) בריכוז µg/ml 0.5 . שיקועp53 נעשה

הדגרת הדגימות עם . כל אחדµg/ml 0.5 בריכוז p53 (DO-1 and Pab1801)בעזרת נוגדנים כנגד

לכל protein A-G Agarose שלµl 35למחרת הוסף . בטלטול4°C-בהנוגדנים נמשכה במשך לילה

עם 1:10 מהול lysis bufferפו הדגימות עם נשט, בטלטול, 4°C-לאחר הדגרה נוספת של שעתיים ב. דגימה

TTBS buffer 3000-כאשר כל שטיפה מלווה בסרכוז הדגימות ב( כארבע פעמים rpm והוצאת הנוזל

. 95°C - דקות ב10 ואחר כך הדגימות הורתחו 30µl sample buffer-לבסוף לכל דגימה הוסף כ). העליון

Normal או עם Normal rabbit serum (SC-2027) בצענו שיקועים אימונים עם, לביקורת שלילית

mouse serum (SC-2025).

כולת החלבון בתאיםת קביעת .3.5.2

נפחים זהים . Bradford (Bio-Rad Laboratories Ltd.)תכולת החלבון בדגימות נקבעה בשיטת

nm 630ל באורך גל שmicroplate reader - בארות והבליעה נקבעה ב96מכל דגימה הועברו לפלטה של

. כסטנדרטBSA-תוך שימוש ב

העברה , PAGE-SDSבשיטת ל'הרצת החלבונים על גבי ג .3.5.3

לממברנת ניטרוצלולוז וזיהוי החלבונים

חומרים

mini-gel (Bio-Rad Laboratories Ltd.)בעבודתנו השתמשנו במכשיר הרצה

Biotrace Nitrocellulose membrane (Pall Life Science, Ann Arbor, MI, USA)

SuperSignal West Pico® Chemiluminescent Substrate (Pierce, Rockford, IL, USA)

.(Sigma, St. Louis, MO, USA) במים סטריליים 1:20 מהולה (Ponceau S)תמיסת פונסו

Fuji super Rx, (Tokyo, Japan)או X-ray (Kodak)פילם

41

בופרים

8% Separating Gel : 8% acrylamide (acrylamide/bisacrylamide 37.5:1), 0.37 M Tris-

HCl, pH 8.9, 0.1% SDS, 0.035% Temed, 0.1 % Ammonium persulfate, ddH2O.

Stacking gel : 4% acrylamide (acrylamide/bisacrylamide 37.5:1), 0.19 M Tris- HCl, pH

6.8, 0.1 % SDS, ddH2O, 0.1% Temed, 0.66% Ammonium persulfate.

Sample buffer : 5 mM EDTA, 40 mM DTT, 10% SDS, 0,3125 M Tris, 1% bromophenol

blue, 25% glycerol

Running Buffer : 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 0,1 % SDS

Transfer Buffer : 25 mM Tris, 192 mM Glycine, 20% Methanol

TTBS buffer: 20 mM Tris-HCL pH 7.4, 135 mM NaCl, 0.1% Tween-20

Blocking buffer: 3% BSA in TTBS.

Washing buffer: 0.2% BSA in TTBS.

מהלך העבודה

. במשך שלושים דקותV 120-ההרצה חלה ב. הדגימות הופרדו בעזרת שימוש באלקטרופורזה

ות נחסמו על ידי הדגרה הממברנ. למשך לילהmA 100-העברת החלבונים לממברנת ניטרוצלולוז התבצעה ב

אחר כך הודגרו הממברנות עם . למשך שעתיים בטמפרטורת החדרBSA 3%עם בופר חסימה המכיל

בתום ההדגרה הממברנות נשטפו . במשך שעה בטמפרטורת החדרBSA 1%-הנוגדנים השונים המהולים ב

הודגרו עם נוגדן שניוניהממברנות , בשלב הבא. דקות10כל פעם במשך , עם בופר שטיפות כארבע פעמים

הממברנות נשטפו בשנית כפי . במשך שעה בטמפרטורת החדרHRP המצומדים לאנזים protein Aאו

®SuperSignal West Picoגילוי החלבונים הרצויים התבצע על ידי. שמתואר קודם לכן

Chemiluminescent Substrate.

42

הנוגדנים .3.5.4

. Santa Cruz Biotechnologyלים נרכשו מחברת'נים על גבי הגהנוגדנים בהם נעשה שימוש לזיהוי החלבו

Antibodies Dilution

- anti-BRCA1 [C-Terminal (C-20)] 1:1000

- anti-Sp1 (Pep2) 1:1000

- anti-p53 (DO-1 and Pab1801) 1:1000

הנוגדנים הראשונים המזהים כנגדHorseradish perxoidase (HRP)הנוגדנים השניוניים המצומד לאנזים

-Peroxidase-conjugated affiniPure Goat anti בהם השתמשנו הינם Sp1- וBRCA1את החלבונים

rabbit IgG (H+L) אשר נרכשו מחברת, 1:70,000 במיהול שלJackson Immonoresearch

Laboratories, West Grove, PA, USA).( גד בכדי לזהות את הנוגדנים הראשונים כנp53 השתמשנו

.HRP-conjugated Protein A (ICN Biomedicals, Aurora, OH)- ב1:10,000במיהול של

pulldown-GSTשיטת .3.6

1BRCA-GSTהפקת פרגמנטי .3.6.1

חומרים

E.Coli (BL21) (Amersham Biosciences)

LB broth base (Gibco BRL®)

100 mg/ml Ampicillin (Sigma)

0.1 mM Isopropyl beta-D-thiogalactose (IPTG) (Sigma)

Complete, mini EDTA free protease inhibitor cocktail (Roche Molecular Biochemicals).

לווקטור BRCA1 עוקבים וחופפים נוצרו על ידי החדרת מקטעי GST-BRCA1ששה פרגמנטים שונים של

pGEX-4T-1 (Amersham Biosciences)החלבון המכיל את GST .ווקטורים התקבלו באדיבותהDr.

David M. Livingston (Harvard Medical School, Boston, MA, USA)(Scully et al., 1997a).

43

:BRCA1 של ששת הפרגמנטים של חלבוני האיחוי מורכבים מהחומצות אמינו הבאות

1-324; 260-553; 502-802; 758-1064; 1005-1313; 1314-1863

בופרים

2 M Mg2+ Solution: MgCl2, MgSO4.

SOC medium: 2% Bacto®-Tryptone (w/v), 0.5% Bacto®-Yeast (w/v), 10 mM NaCl,

2.5 mM KCl, 20 mM Glucose, 20 mM Mg2+.

Lysis buffer: Ice-cold PBS, 50 mM EDTA, Protease Inhibitor Cocktail (1 tablet for 10

ml lysis buffer)

מהלך העבודה

קומפטנטים על ידי הווקטורים BL21ת חלבוני האיחוי נעשתה על ידי טרנספורמציה של חיידקי הפק

הדגימות . DNA (~100 ng) חיידקים הוסף µl100 -ל. חיידקים קומפטנטים הופשרו בקרח, בקצרה. השונים

חר כך א. דקות2 וצוננו בקרח למשך 42°C שניות בטמפרטורה של 45חוממו , דקות30שהו בקרח למשך

בטמפרטורה של rpm 225 והן טולטלו במהירות של SOC) (900 µlהוסף לכל דגימה מצע גידול מועשר

37°C37°התאים נזרעו בצלחות אגר וגודלו בטמפרטורה של . למשך שעהC לביצוע . שעות18 למשך

החיידקים .µg/ml Ampicillin 100 בתוספת broth base 5 ml LBמושבה בודדת נזרעה בנפח של, הפקה

מהחיידקים גודלו בנפח ml 1, אחר כך. שעות16 למשך 37°C בטמפרטורה של rpm 225טולטלו במהירות

. (nm 600) 0.6 עד צפיפות אופטית של µg/ml Ampicillin 100 בתוספת ml LB broth base 100של

3 למשך 37°C בטמפרטורה שלrpm 250 והחיידקים טולטלו במהירות mM IPTG 0.1בשלב הבא הוסף

הנוזל העליון הורחק ופלט התאים הורחף , דקות10 במשך rpm 4000-לאחר מכן החיידקים סורכזו ב. שעות

-Triton X 1% שניות בקרח ובשלב הבא הוסף 20סוניקציה התבצעה במשך . lysis buffer של ml 4-ב

. rpm 14,000- דקות ב5כזו תוך כדי טלטול ומאוחר יותר סור4°C- דקות ב30-הליזטים הודגרו כ. 100

. עד לשימוש-C70°-הנוזל העליון נשמר במבחנות אפנדורף והוקפא ב

44

PAGE-SDSל 'הרצת הפרגמנטים על גבי ג .3.6.2

חומרים

Bio-safeTM Coomassie (Bio-Rad Laboratories Ltd.)

בופרים

3X Sample buffer: 47.5 mM Tris- HCl, pH 6.8, 4% SDS, 25% glycerol, 0.5%

bromophenol blue, 3% β-Mercaptoethanol.

מהלך העבודה

ל על מנת לוודא כי אכן כל ששת הפרגמנטים 'הורצו הדגימות על גבי הג, לאחר הכנת הפרגמנטים

וזאת לאחר שלכל SDS-PAGE 10%ל 'הדגימות הורצו על גבי ג. 3.5.3כפי שמפורט בסעיף , מתבטאים

הופרדו בעזרת ו95°C- דקות ב5הדגימות הורתחו במשך . β-MEל בתוספת שsample bufferדגימה הוסף

Commassie-ל נצבע ב'הג, לבסוף. במשך שלושים דקותV 120-ההרצה חלה ב. שימוש באלקטרופורזה

blue ,על פי הוראות היצרן.

Glutathione sepharose - ל1BRCA-GSTקשירת פרגמנטי .3.6.3

חומרים

Glutathione sepharose 4 fast flow (Amersham Biosciences)

מהלך העבודה

בשלב . PBS ונשטפו שלוש פעמים עם µl Glutathione sepharose 120-לכל דגימה נלקחו כ

ויחדיו הם טולטלו בטמפרטורת GST-BRCA1הוסף לכל מבחנה דגימה המכילה פרגמנט שונה של , הבא

. PBSמים עם נשטף שלוש פעGlutathione sepharose -ה. החדר למשך שעה אחת

45

3.6.4. Transient Transfection בתאי SchneiderDrosophila

חומרים

Calcium phosphate transfection system (Gibco BRL®)

מהלך העבודה

כשעתיים לפני ) תאים לבאר4x106( בארות 6 נזרעו בפלטות של Drosophila Schneiderתאי

Calcium phosphate-אפשרה על ידי שימוש בהחדרת הפלסמידים לתאים הת. ביצוע הטרנספקציה

transfection system1.5-לביצוע הטרנספקציות השתמשנו ב. על פי הוראות היצרן µg מווקטור

pPacSp1 המבטא את החלבון Sp1 או מווקטור pPac0שעות כל 48לאחר . המשמש כפלסמיד הביקורת

. עד לשימוש70°C- והפלטים נשמרו בrpm 3000-סורכזו ב, הבארות אשר הכילו את אותו הווקטור אוחדו

1Sp לחלבון 1BRCAבדיקת קשר בין פרגמנטי .3.6.5

בתום . 4°C- למשך מחצית השעה בlysis bufferהודגרו הפלטים עם , בכדי להכין את המיצוי התאי

והנוזל העליון הועבר למבחנות 4°C- דקות ב20 במשך rpm 14,000ההדגרה התאים סורכזו במהירות

בדיקת קשר בין . 3.5.2 כפי שמוזכר בסעיף Bradfordכמו כן קביעת כמות החלבונים נעשתה בשיטת . ותנקי

אשר אליו , Glutathione sepharoseהתבצעה על ידי הדגרת , Sp1 לבין החלבון BRCA1פרגמנטי

אי לבין כמות שווה של חלבונים אשר הופקו ממיצוי ת, GST-BRCA1מחוברים הפרגמנטים השונים של

Drosophila Schneider . 4°-ב שעות 18ההדגרה נעשתה במשךCבתום ההדגרה נשטפו דגימות . ובטלטול

95°C- דקות ב10הורתח במשך sepharose -לבסוף ה. כשלוש פעמיםml PBS 1עם sepharose -ה

.3.5.3ל כפי שמצוין שסעיף 'ג8% הדגימות הורצו על גבי . β-ME המכיל sample bufferבנוכחות

46

הנוגדנים .3.6.6

.Santa Cruz Biotechnology-לים נרכשו מ'הנוגדנים בהם השתמשנו לזיהוי החלבונים על גבי הג

Antibodies Dilution

- anti-GST (B-14) 1:10,000

- anti-Sp1 (Pep2) 1:1000

- Donkey anti Mouse IgG היו GST-נוגדנים שניוניים כנגד הנוגדנים הראשונים המזהים את ה

HRP בעוד שנוגדנים שניוניים כנגד הנוגדנים הראשונים המזהים את החלבון , 1:40,000 במיהולSp1 היו

Peroxidase-conjugated affiniPure Goat anti-rabbit IgG (H+L) נוגדנים . 1:70,000 במיהול

).Jackson Immonoresearch Laboratories(שניוניים אלו נרכשו מחברת

47

תוצאות .4

1BRCA על ידי IR-IGF-וויסות הפרומוטר ל .4.1

רמות . (Surmacz, 2000) הינו סימן הכר אופייני של גידולי שד IGF-IR-ביטוי גבוה של הגן ל

והחלבון של הרצפטור גבוהות במידה ניכרת בגידולי קרצינומות בדרגת התמיינות גבוהה או mRNA-ה

הבקרה על רמות ביטוי הגן . (Schnarr et al., 2000)ל יצירת גרורות בינונית ויורדות בשלבים מתקדמים ש

מתפקד כמדכא BRCA1מאחר והחלבון . (Werner, 1999) מתבצעת בעיקר ברמת השעתוק IGF-IRל

מוטנטי אינו BRCA1בעוד שחלבון , גידולים ובעל יכולת להוביל לעצירת גדילה של שורות תאי סרטן שד

מהווה אתר מטרה לחלבון IGF-IR-החלטנו לבחון האם הגן ל, שוג של התאיםמסוגל למנוע פעילות שג

BRCA1 .הראנו כי , בעבודה קודמת אשר התבצעה במעבדתנוBRCA1 מסוגל לדכא את פעילות הפרומוטר

ובתאי סרטן שד (Saos-2)בתאי אוסטאוסרקומה , Chinese Hamster Ovary (CHO) בתאי IGF-IR-ל

MCF7 (Maor et al., 2000).

מתקיימת IGF-I- על פעילות הפרומוטר לרצפטור לBRCA1על מנת להעריך האם השפעת החלבון

, T47D: בשורות התאים הבאותtransientבצענו טרנספקציות מסוג , בטווח רחב של שורות תאי סרטן שד

MDA-MB-231ו -HCC-1937 . לכל אחת משורות התאים הללו החדרנו את הווקטור המדווח

p(-476/+640)LUC של הפרומוטר ל640+/476– המכיל נוקלאוטידים -IGF-IR המשובט במעלה הזרם

(upstream)ל -luciferase reporter gene) 5איורA .( כמו כן החדרנו לתאים ווקטור ביטוי המקודד

לשם . יליתאשר שימש כביקורת של, pcDNA3, או לחילופין החדרנו את הווקטור הריקBRCA1לחלבון

. β-galactosidase-הוכנס לתאים בנוסף ווקטור המקודד ל, נירמול התוצאות על פי יעילות הטרנספקציה

בכל שורות 42-45%~- מדכא את פעילות הפרומטור בBRCA1 מראות כי 5Bהתוצאות המוצגות באיור

. תאי הסרטן שנבחנו

48

5A.

UC L

5’ f on 5’ u onntranslated regilanking regi

INR +640-476

5B.

0

20

40

60

80

100

120

Prom

oter

Act

ivity

pcDNA3BRCA1

T47D MDA-MB-231 HCC -1937

* ****

. במספר שורות תאי סרטן השד1BRCA על ידי IR-IGF-בקרת פעילות הפרומוטר של ה - 5איור

5A-סכמה המתארת את מבנה הגן המדווח אשר מכיל מקטע מהפרומוטר של הגן ל -IGF-IR . 476פרומוטר זה מכילbp מאזור

החץ מסמן את ). מקטע בצבע צהוב (untranslated region'5 - מאזור ה640bpוכן ) מקטע בצבע סגול (flanking region' 5 -ה

.(LUC)הפרומוטר ממוקם במעלה הזרם לגן המקודד לאנזים לוציפרז . (INR)אתר תחילת השעתוק

5B-תאי סרטן השד :T47D, MDA-MB-231 ,HCC-19371.3טרנספקציה עם - עברו קוµg מהווקטור המבטא BRCA1 או

-β של 0.2µg וכן p0LUC בתוך IGF-IR [p(-476/+640)LUC] של 0.5µg בשילוב עם pcDNA3של הווקטור הריק

galactosidase . התאים נקצרו ונמדדו רמות פעילות של הלוציפרז ושל ה, שעות40לאחר-β-galactosidase . התוצאות מוצגות

ניסויים 6 עד 4 שגיאות תקן של +התוצאות מתארות ממוצע . β-galactosidase-כאחוז פעילות הפרומוטר לאחר נירמול בעזרת ה

. כנגד דגימת הביקורתP<0.005, . **כנגד דגימת הביקורתP<0.05 ,. *כאשר כל דגימה התבצעה בדופליקטים, בלתי תלויים

49

אנו , BRCA1כאשר מבצעים טרנספקציות עם ווקטור הביקורת בהשוואה לווקטור המכיל את

אינה משפיעה על יעילות , שלהםיוצאים מנקודת הנחה כי החדרת ווקטורים השונים מבחינת המסה

. יש צורך לבצע טרנספקציות עם כמות שווה מולרית של שני הווקטורים, בכדי לבחון הנחה זו. הטרנספקציה

הוא בגודל של pcDNA3-BRCA1 בעוד שהווקטור bp 5400 הוא בגודל של pcDNA3ווקטור הביקורת

11,110 bp .

µg of 1,000 bp DNA = 1.52 pmole 1: על ידי שימוש בנוסחת ההמרה הבאה

µg of 5,400 bp DNA = 0.28 pmole 1: הינה pcDNA3-ניתן לראות כי כמות ה

µg of 11,110 bp DNA = 0.14 pmole 1: הינה pcDNA3-BRCA1-וכן כמות ה

אנו , כאשר אנו מחשבים את כמות הווקטורים שאנו משתמשים לטרנספקציה לפי משקל מולקולרי, כלומר

. מחדירים למעשה לתאים מסה כפולה של ווקטור ריק

בצענו , IGF-IR-על מנת לבחון האם יש השפעה של מסת ווקטור הביקורת על פעילות הפרומוטר ל

השווה לזה של pcDNA3עם מסת HCC-1937 - וMDA-MB-231, T47Dטרנספקציה לתאי

pcDNA3-BRCA1 , כנגד הכמות המולרית שלpcDNA3של השווה לזה pcDNA3-BRCA1 . היות

מהכמות לפי 2 בכמות קטנה פי pcDNA3והחדרת כמות מולרית שווה בין שני הווקטורים מובילה להחדרת

בעזרת ווקטור אינרטי DNA- יש צורך להשלים את כמות הpcDNA3-BRCA1המשקל המולקולרי של

ניתן לראות כי אין הבדל 6 באיור מהתוצאות המוצגות. pG4Zהווקטור האינרטי בו השתמשנו הינו . כלשהו

בכמות שווה לזה של pcDNA3כאשר מחדירים לתאים את הווקטור , משמעותי בפעילות הפרומוטר

pcDNA3-BRCA1 , מבחינת משקל מולקולרי לעומת פעילות הפרומוטר המתקבלת כאשר מחדירים כמות

לבצע טרנספקציות לפי מסיבה זו המשכנו . pcDNA3-BRCA1 השווה לזו של pcDNA3מולרית של

.pcDNA3-BRCA1- וpcDNA3השוואה במשקל המולקולרי של

50

0

20

40

60

80

100

T47D MDA-MB-231

HCC -1937

Prom

oter

act

ivity

pcDNA3pcDNA3/2

השוואת פעילות הפרומוטר לפי כמות משקל מולקולרי כנגד כמות מולרית – 6איור

pcDNA3 של הווקטור הריק 1.3µgטרנספקציה עם - עברו קוHCC-1937,- וT47D, MDA-MB-231: תאי סרטן השד

pG4Z של הווקטור האינרטי µg 0.65 של הווקטור הריק בתוספת של µg 0.65לעומת טרנספקציה עם ) כלתעמודה בצבע ת(

0.2µg וכן p0LUC בתוך IGF-IR [p(-476/+640)LUC] של 0.5µgווקטורים אלו הוחדרו בשילוב עם ). עמודה בצבע כחול(

התוצאות . β-galactosidase-ות של הלוציפרז ושל ההתאים נקצרו ונמדדו רמות פעיל, שעות40לאחר . β-galactosidaseשל

כאשר כל דגימה , התוצאות מתארות ניסויי מייצג אחד. β-galactosidase-מוצגות כאחוז פעילות הפרומוטר לאחר נירמול בעזרת ה

.התבצעה בדופליקטים

יחס בIGF-IR- על פעילות הפרומוטר לBRCA1בנוסף היה ברצוננו לבדוק את יכולת הבקרה של

שהינה מוטציה ייחודית השכיחה 185delAGהשתמשנו בווקטור המבטא . מוטנטיBRCA1לווקטור המבטא

בשלב ראשון בצענו בדיקת רצף לווקטור . אשר גורמת ליצירת חלבון קטום, בנשים יהודיות אשכנזיות

, םמדעי החיי, ציוד בין מחלקתי-אשר התבצעה ביחידה לריצוף( המוטנטי BRCA1-המבטא את ה

המוטנטי השוונו BRCA1-לאחר קבלת הרצף של הווקטור המקודד את ה). 7Aאיור ) (אוניברסיטת תל אביב

BLAST- המופיע בתוכנת הBRCA1את תוצאות הרצף עם רצף הקידוד המלא של החלבון

(BRCA1 mRNA, complete cds, Acc# gi555931) . 7התוצאות המוצגות באיורB מראות כי בעמדה

.AGאכן חסרים הנוקלאוטידים , מוטנטיBRCA1 של רצף הווקטור המקודד 185

51

7A.

7B.

Query (BRCA1 complete cds) : 175 AGAAAATCTTAGAGTGTCCCATCTG 190

Subject (BRCA1 185delAG ) : 94 ANAAAATCTT - - AGTGTTCNATCTG 116

תקין1CABR מוטנטי לרצף 1BRCAהשוואת רצף – 7איור

7A -מקטע מריצוף הווקטור המקודד ל -BRCA1 185delAG בעזרת הפריימרים SP6ו -T7.

7B - השוואת רצף הקידוד המלא של החלבון BRCA1 (BRCA1 mRNA, complete cds, Acc# gi555931) המכונה

Query ,לרצף אשר התקבל מריצוף ווקטור הביטוי של ה-BRCA1 המוטנטי המכונה Subject . ההשוואה נעשתה בעזרת שימוש

בעוד , BRCA1 הינו הנוקלאוטיד הראשון הרצף המקודד לחלבון 1 הנוקלאוטיד בעמדה Query-ברצף ה. BLAST-בתוכנת ה

. נקבע לפי המיקום בו החלה פעולת הריצוף1 הנוקלאוטיד בעמדה Subject-שברצף ה

טרנספקציה -טנטי בצענו קו מוBRCA1-לאחר שהוכחנו כי אכן בידנו את הווקטור המקודד ל

p(-476/+640)LUCתאים אלו עברו טרנספקציה עם הווקטור המדווח . MCF7בשורת תאי סרטן השד

BRCA1- או לחילופין עם הווקטור המבטא את הBRCA1ביחד עם הווקטור המבטא את זן הבר של

פעילות הפרומוטר התקין דיכא אתBRCA1- מראות כי בעוד ה8התוצאות המוצגות באיור . המוטנטי

. המוטנטי דיכא במידה פחותה בהרבהBRCA1-הרי שה, 44%בשיעור של

52

0

20

40

60

80

100

120

prom

oter

act

ivity

pcDNA3WT BRCA1

MUT BRCA1

. מוטנטי1BRCA לעומת 1wild type BRCA בנוכחות IR-IGF-פעילות הפרומוטר ל - 8איור

המבטא הווקטור או עם (wild type) תקין BRCA1 הווקטור המבטא 0.65µgטרנספקציה עם - עברו קו MCF7תאי סרטן השד

BRCA1 מוטנטי או לחילופין עם הווקטור הריק pcDNA3 . 0.5כמו כן הוחדר לתאיםµg של IGF-IR [p(-476/+640)LUC]

התאים נקצרו ונמדדו רמות פעילות של הלוציפרז ושל , שעות40לאחר . β-galactosidase של 0.2µg- וp0LUCבתוך

תוצאות הניסוי . β-galactosidase-גות כאחוז פעילות הפרומוטר לאחר נירמול בעזרת ההתוצאות מוצ. β-galactosidase-ה

. חזרות6 שגיאות תקן של ניסוי אופייני אשר התבצע בדופליקטים ומייצג +מתארות ממוצע

מתרחשת רק , BRCA1 על ידי IGF-IR-על מנת לבדוק האם פעילות הדיכוי של הפרומוטר ל

יתכן והיא חלה גם בשורות תאים אחרות וכן כדי לבחון האם יש תלות בכמות בשורות תאי סרטן שד או

בצענו את הניסויים בשורת תאי אוסטאוסרקומה , המבוטא למידת דיכוי פעילות הפרומוטרBRCA1-ה

ווקטור ביטוי המקודד , IGF-IR [p(-476/+640)LUC]לתאים אלו הוחדר הגן המדווח . Saos-2הנקראים

התוצאות המוצגות . β-galactosidase-מויות שונות וכן ווקטור ביטוי של הפלסמיד המקודד ל בכBRCA1-ל

מדכא את פעילות BRCA1-ה, מראות כי גם בשורת תאים אשר אינה נמנת עם תאי סרטן השד9באיור

הגבוה ביותר וכן מידת דיכוי פעילות הפרומוטר תלויה בכמות BRCA1בריכוז ~ 60%-הפרומוטר ב

. אשר הוחדרה לתאיםBRCA1-ה

53

0

20

40

60

80

100

120

control 1

BRCA 1 Expression vecto

Prom

oter

Act

ivity

*

.Saos-2 בשורת תאי 1BRCAי

של µg 2.5 וכן (1-10µg) בכמויות שונות BRCA1- ביטוי המקודד ל

. קבועה על ידי הוספת ווקטור ביטוי ריקDNA-רה הכמות הסופית של ה

שגיאות תקן +התוצאות מתארות ממוצע . β-galactosidase- בעזרת ה

כנגד דגימת P<0.005, . **ביקורת כנגד דגימת הP<0.05, .*ופליקטים

1BRCA- האחראי על פעילות הIR-IGF- ל

בצענו סדרת BRCA1 על פעילות הדיכוי שנגרמת על ידי

מקטעים להם הוחדרו ווקטורים המכילים, MCF7ת תאי

בנוסף החדרנו לתאים את . ר מאוחים במורד הזרם לגן המדווח

: הווקטורים השונים, ביתר פירוט .pcDNA3הווקטור הריק

p(-40/+640)LUC, p(-188/+640)LUC, , 2350הכילו,

flanking re‘5נוקלאוטידים מאזור הלא מתורגם640- וכ ,

IG) 10איורA .( 10באיורB ניתן לראות כי עיקר פעילות

פעילות . חסרים-188ה לעמד-476אוטידים שבין עמדה

p(-40 ,אשר חסר בו את רוב אזור ה-flanking region‘5 ,

54

*

5

r (ug)

*

IGFעל יד

ווקטור, דווח

מה נשמל דגי

לאחר נירמול

ה התבצעה בד

פרומוטר

טר שאחראי

Saoובשור

IGF- ,אש

BR או את

p(-476/+6

gion-ור ה

F-IR-הגן ל

ה כשהנוקל

/+640)LU

*

*

10

-IR-וויסות הפרומוטר ל – 9איור

של הגן המµg 2.5 הוחדר Saos-2לתאי

בכ. β-galactosidase-הווקטור המקודד ל

התוצאות מוצגות כאחוז פעילות הפרומוטר

כל מדיד. ניסויים בלתי תלויים4 עד 2של

.הביקורת

ם האזור בומיק .4.2

בכדי לאתר את האזור בפרומו

s-2 בשורת תאי deletionניסויי

IR-באורכים שונים של הפרומוטר ל

CA1הווקטור המבטא את החלבון

p(-2350/+640)LUC ,40)LUC

נוקלאוטידים מאז40- ו476 ,188

של , untranslated region‘5-ה

נמוגBRCA1הדיכוי של החלבון

Cהפרומוטר הבזלית של הווקטור

חלה ירידה בפעילות , )10Cאיור (MCF7בתאי . BRCA1היתה נמוכה מאד ולא הושפעה כלל על ידי

אך יחד עם , p(-476/+640)LUCכאשר השתמשנו במקטע ) 41%דיכוי של (BRCA1הפרומוטר בהשפעת

כאשר החדרנו לתאים את הווקטור המכיל BRCA1 בנוכחות 21%חל דיכוי בשיעור של , זאת

p(-188/+640)LUC . התוצאות שהתקבלו מצביעות על כך שהשפעת הדיכוי שלBRCA1 על הפרומוטר

על פי . flanking region‘5 - של אזור ה-188- ו-476 ממוקמת בין נוקלאוטידים IGF-I-לרצפטור ל

.-40- ו-188 יתכן כי קיים אזור פוטנציאלי נוסף הממוקם בין MCF7התוצאות אשר התקבלו בתאי

מוסמך "תוצאות סעיף זה בוצעו במעבדתנו על ידי שרון מאור כחלק מעבודת הגמר לקבלת תואר *

".אוניברסיטה

55

10A.

.10C .10B

של flanking region‘5 - על מקטעים בעלי חסרים שונים באזור ה1BRCAהשפעת – 10איור

.IR-IGF-ל הפרומוטר

10A –המקטע בצבע סגול מסמל את אזור ה. סכמה המתארת את המקטעים השונים של הפרומוטר-flanking region‘5 , המקטע

+ 1נוקלאוטיד הממוקם בעמדה (החץ מסמן את אזור תחילת השעתוק . untranslated region‘5-בצבע וורוד מסמל את אזור ה

. מסמל את הגן המקודד לחלבון לוציפרזLUC). ברצף

10B/10C- לתאי Saos-2) 10B (ולתאיMCF7 ) 10C ( 10הוחדרו µgרומוטר של הווקטור המכיל המקטעים השונים של הפ

או מהווקטור BRCA1- מווקטור המקודד ל10A( ,2.5 µgהמקטעים מתוארים באיור ( לגן המדווח upstreamאשר שובטו

שעות לאחר הטרנספקציה התאים נקצרו ונמדדה מידת β-galactosidase .48- של הווקטור המקודד לµg 2.5הביקורת וכן

תוצאת הפעילות אשר התקבלה . β-galactosidaseצאות ראקציית צבע של התוצאות נורמלו על פי תו. הפעילות של הפרומוטר

שאר התוצאות חושבו ביחס לדגימה . 100% קיבלה ערך של BRCA1 לתאים בהעדר p(-476/+640)LUCעקב החדרת הווקטור

העמודות . מקטעהעמודות בצבע תכלת מייצגות את הפעילות הבזלית של כל אחד מהווקטורים המכיל מקטעים שונים של כל. זו

ניסויים בחזרות 6 עד 2התוצאות מוצגות כממוצע של . BRCA1בצבע כחול מייצגות את מידת הפעילות אשר התקבלה בנוכחות

. שגיאות תקן+כפולות

MCF 7

0

20

40

60

80

100

120

-2350/+640 -476/+640 -188/+640 -40/+640

Prom

ter a

ctiv

ity

pcDNA3 BRCA1

+640-40

LUC

LUC

LUC

LUC

p(-2350/+640)LUC

/+640)L

/+640)L

0/+640)L

+640-2350p(-476 UC

+640-476p(-188 UC

+640-188

p(-4 UC

Saos-2

0

20

40

60

80

100

120

-2350/+640 -476/+640 -188/+640 -40/+640

Prom

ter a

ctiv

ity

pcDNA3 BRCA1

56

בוויסות 1Sp- ו1BRCAבדיקת קשר פונקציונלי בין החלבונים .4.3

IR-IGF-הפרומוטר ל

השעתוק מתחיל מאתר . CAAT- וTATAר אלמנטי אופיין בעבר כפרומוטר חסIGF-IR-הפרומוטר ל

ומכיל GC הקרוב עשיר ברצפי flanking region‘5 -אזור ה. initiatorיחיד הממוקם בתוך מוטיב המכונה

שימוש בשיטת . Sp1 (Werner et al., 1990; Werner et al., 1992)מספר אתרי קישור לפקטור השעתוק

בעמדות Sp1- נקי אפשרה לזהות ארבעה אתרי קישור לSp1 בנוכחות DNase1 footprinting-ה

מידע זה הוביל . (Beitner-Johnson et al., 1995) -188-/193 וכן -369-/374, 373-/378- ,394-/399-

) -188- ו-476 בין נוקלאוטידים IGF-IR-הממוקמים בפרומוטר ל (Sp1האם אתרי הקישור לחלבון , לשאלה

? על פעילות הפרומוטרBRCA1 אחראים לתיווך ההשפעה של מסוגלים להיות

השתמשנו בשורת , BRCA1 לחלבון Sp1במטרה לבחון האם קיים קשר פונקציונלי בין החלבון , על כן

לתאים אלו . (Courey & Tjian, 1988) אנדוגני Sp1 הידועים כחסרי Drosophila Schneiderתאי

תחת הפרומוטר לאקטין Sp1-ווקטור ביטוי המקודד ל, IGF-IR [p(-476/+640)LUC]הוחדר הגן המדווח

5C (pPacSp1)או לחילופין ווקטור הביקורת (pPac0) ,בנוכחות או העדר ווקטור הביטוי ל-BRCA1.

טרנספקציה הצביעו על כך שהחדרת הווקטור המבטא את -תוצאות הקו, 11כפי שניתן לראות באיור

בפעילות הפרומוטר ביחס לפעילות הבזלית אשר התקבלה לאחר 5+175 י הובילה לעליה של פ1Spהחלבון

בנוסף BRCA1הוספת הווקטור המבטא את החלבון . pcDNA3- וpPac0החדרת ווקטורי הביקורת

.Sp1 מפעילות הפרומוטר אשר שופעלה על ידי 45% הובילה לירידה של Sp1לווקטור המבטא

57

0

50

100

150

200

control BRCA1 Sp1 Sp1Pr

omot

er A

ctiv

ity

Fol

d in

crea

se o

ver c

ontr

ol

BRC1- וSpבבקרה על פעילות הפרומוטר ל -IR-IGF.

בשילוב Drosophila Schneiderלתאי הוחדר, IGF-IR ,p(-476/+640)LUC- ל

Sהוחדר לתאים , בנוסף. או לחילופין עם ווקטור הביקורת µg 1הווקטור המקודד מ

רמות הלוציפרז נמדדו ונורמלו על ידי חלוקה לכמות החלבון הכללית אשר נמדדה

קיבלה את הערך BRCA1 ובהעדר Sp1 הלוציפרז הבסיסית אשר התקבלה בהעדר

ניסויים בלתי 3 שגיאות תקן של +התוצאות המוצגות הינן ממוצע . ו ביחס לדגימה זו

).3עמודה ( בלבד Sp1 כנגד התאים שעברו טרנספקציה עם P<0.05, . *ות

1BRCA1- וSpבוויסות הפרומוטר ל -IR-IGF

הנגרמת על ידי IGF-IR מדכא את פעילות השפעול של BRCA1י

לדכא את פעילות BRCA1ני מנגנונים אפשריים באמצעותם מצליח

BR נקשר אל רצף הפרומוטר של IGF-IRועל ידי כך מונע מ -Sp1

Sp1- נקשר לBRCA1החלבון , שלו ולשפעל את הפרומוטר והשני

בכדי לבדוק . להיקשר לאתרי הקשירה השמורים שלוSp1- מאפשר ל

Electrophoretic mobility shift assay-חלטנו להשתמש בשיטת ה

ראשית היה , זה בכדי לבצע ניסוי. DNAקישור בין חלבון מסוים לרצף

. Transcription/Translation System-שר נעשתה על ידי שימוש ב

מופיע במשקל מולקולרי S35- המסומן בBRCA1 לראות כי החלבון

לאחר . לא היה ביטוי חלבון כלל, pcDNA3,הכילה את הווקטור הריק

58

*

+BRCA1

1Aנלי בין קשר פונקציו – 11איור

5 µgמהווקטור המדווח המכיל את הפרומוטר

p1 של הווקטור המקודד לחלבון ng 300עם

. או ווקטור הביקורת שלוBRCA1לחלבון

רמת פעילות. בעזרת שימוש בשיטת ברדפורד

ת חושבשאר התוצאו). control-עמודת ה (1

תלויים אשר כל אחד מהם נעשה בחזרות כפול

בדיקת הקשר בין .4.4

כ, יף קודםמסקנת הניסויים בסע

Sp1 ,הובילה לחשיבה כי קיימים ש

CA1, האחד. Sp1השפעול על ידי

השמוריםלהיקשר אל אתרי הקשירה

חלבון ובעקבות זאת לא-בקשר חלבון

הBRCA1לפי אלו מהמנגנונים פועל

(EMSA) .אפשרת לבחון שיטה זו מ

אBRCA1צורך להפיק את החלבון

ניתן12Aמהתוצאות המוצגות באיור

בעוד שהדגימה אשר , 220kDaשל

. חזרנו על תהליך הפקת החלבון אך הפעם ללא סימון במתיונין חם, BRCA1שנמצא כי אכן סונתז החלבון

סינטטי אוליגונוקלאוטיד ועם נקי Sp1אשר הפקנו הודגר בנוכחות ובהעדר ) שאינו מסומן (BRCA1החלבון

-/380-אשר ממוקם בין נוקלאוטידים , AGCCCGCCCGCCCTGCCGCCGCCCדו גדילי בעל הרצף

. Sp1 וכן מכיל שני אתרי קשירה חופפים לחלבון IGF-IR של flanking region’5- באזור ה357

יעות מצב) 2עמודה (12Bהתוצאות המוצגות באיור . γ-32P-ATP-אוליגונוקלאוטיד דו גדילי זה סומן קצה ב

Transcription/Translation-הדגרת תוצר ה, יתר על כן. עצמו אינו נקשר לפרומוטרBRCA1-על כך ש

נקשר Sp1, לעומת זאת). 1עמודה (לא הראה קישור לפרומוטר , pcDNA3, שהופק עם ווקטור הביקורת

עמודה (Sp1-DNAלקס פס זה מייצג את יצירת קומפ. ל'לפרומוטר ועל ידי כך יוצר פס גבוה יותר בריצת הג

שהופק עם Transcription/Translation- עם תוצר ראקציית הSp1התוצאה אשר התקבלה מהדגרת ). 3

, מאידך). 4עמודה ( לאוליגונוקלאוטיד Sp1-הראתה כי אין שינוי בקישור ה, pcDNA3, ווקטור הביקורת

לאתר הקישור שלו Sp1- הובילה להפחתה משמעותית של קישור הBRCA1 בנוכחות Sp1-הדגרת ה

). 5עמודה (באוליגינוקלאוטיד

בצענו ניסוי תחרות עם , לאתרי הקשירה שלו נעשה בצורה ספציפיתSp1-בכדי לוודא כי אכן קישור ה

במונחים 40הוספת פרוב קר בעודף הגדול פי ). אוליגונוקלאוטיד זהה אשר אינו סומן רדיואקטיבית(פרוב קר

הוספת מתחרה בלתי ). 6עמודה (Sp1סומן הוביל להעלמות פס הקישור של מולריים מאשר הפרוב המ

-305-/325בין הנוקלאוטידים שממוקם , כדוגמת אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי, שאינו מסומן, ספציפי

לא הוביל להעלמות פס , Sp1 ואינו מכיל אתרי קשירה לחלבון IGF-IR של flanking region’5-באזור ה

).7עמודה (Sp1-DNAכלומר לא מנע את יצירת הקומפלקס , Sp1של הקישור

59

12A . 12B.

.IR-IGF- עם הפרומוטר ל1Sp-1BRCA לבדיקת קשרי EMSAניסויי – 12איור

12A- הפקת החלבון BRCA1 ה על ידי שימוש בערכת-Transcription/Translation System .µg 1 מהווקטורpcDNA3 או

בנוכחות מתיונין Transcription/Translation System- שועתקו ותורגמו בעזרת ערכת הBRCA1מהווקטור המקודד לחלבון

החלבון . SDS-PAGE 8% ל'הליזטים שהופקו מרטיקולוציטים של ארנבות הופרדו על ידי אלקטרופורזה על גבי ג. S35-המסומן ב

BRCA1 )220 מופיע במשקל מולקולרי של )חץ שחורמסומן בהkDa~ , בעוד שבדגימת הווקטור הריק,pcDNA3 , אין ביטוי

. חלבון כלל

12B – באזור ה357-/380-אשר ממוקם בין נוקלאוטידים ( אוליגונוקלאוטיד סינטטי דו גדילי -flanking region’5 של IGF-IR (

pcDNA3, שהופק עם ווקטור הביקורתTranscription/Translation- מתוצר הµg 1 והודגר עם γ-32P-ATP-ו בסומן בקצה

(f.p.u 0.375) נקי Sp1הוספת : 3עמודה ). 2עמודה ( שהופק בעזרת אותה ריאקציה ללא מתיונין חם BRCA1או עם ) 1עמודה (

, שהופק עם ווקטור הביקורתTranscription/Translation-עם תוצר ה Sp1הדגרת : 4עמודה . ל'יוצר פס גבוה יותר בריצת הג

pcDNA3 . הדגרת ה: 5עמודה-Sp1 בנוכחות BRCA1) ניסויי התחרות התבצעו על ידי הוספת פרוב קר בעודף ). 5עמודה :

Sp1 ((N.S.)-ישור לאשר אינו מכיל אתרי ק(הוספת מתחרה בלתי ספציפי קר בעודף ). 6עמודה ((SP)הוספת פרוב קר ספציפי

.Sp1-DNAל של הקומפלקס 'החץ מסמן את המיקום בג). 7עמודה (

אכן נקשר באופן ספציפי לאתרי הקשירה שלו הממוקמים בפרומוטר Sp1ניתן לסכם ולומר כי

מפריעה BRCA1הוספת החלבון , לא כל שכן. Sp1-DNA ועל ידי כך יוצר קומפלקס של IGF-IR-ל

. לפרומוטרSp1הקשר בין ומפרה את יצירת

60

המקטע הגנומי החל . גם עם מקטע גנומי של הפרומוטרEMSAבצענו ניסויים בשיטת , יתרה מזאת

אזור זה מכיל את האלמנט המכונה +. 115 ונמשך עד לנוקלאוטיד בעמדה -40בנוקלאוטיד בעמדה

, בה בכך שהובילה לרמת ביטוי גבוההנוכחות מקטע זה הוכחה בעבר כבעלת חשיבות ר". initiator"-ה

. (Werner et al., 1992)למרות שנוכחות מקטע זה בלבד אינה מאפשרת קבלת פעילות פרומוטר כלשהי

או כאלמנטים הממקומים במעלה הזרם TATA box - כin vivo יש פעילות initiator-מאחר ולאלמנט ה

לטנו לבדוק האם קיימת השפעה על יכולת הדיכוי הח, האחראים על התחלת שעתוק יעיל) Sp1הכוללים את (

בכדי לקבל . גם באזור זה של הפרומוטר, Sp1 הנגרמת על ידי IGF-IR- לפעילות הפרומוטר לBRCA1של

ל אגרוז 'לאחר הרצת המקטע בג. (restriction enzyme)מקטע גנומי זה נעזרנו בשימוש באנזימי חיתוך

). 13Bאיור (ל 'תקבל מקטע בגודל המתאים מיצנו את המקטע מהגולאחר שראינו כי אכן מ) 13Aאיור (

).13Cאיור (γ-32P-ATP-פוספורילציה למקטע בכדי שנוכל לסמנו ב-בשלב הבא בצענו דה

13A .13B .13C .

.+115 ועד לנוקלאוטיד בעמדה -40המקטע הגנומי המתמשך מנוקלאוטיד בעמדה הכנת – 13איור

13A- המקטע הוכן מחיתוך פלסמיד )]Sma1 fragment [(-331)-(+514על ידי שימוש באנזימי החיתוך Pml1 ו -Xho1 .M

ם במשקל מולקולרי בין ממוק) 1עמודה (המקטע הגנומי , כפי המצופה. (bp ladder 100)מייצג סמן למשקלים מולקולרים

100 bp200- ל bp.

13B-הורצה דגימה בכדי לוודא כי אכן בידנו מקטע נקי ועל מנת לקבוע את כמותו , ל' לאחר שמיצנו את המקטע הגנומי מהג

.DNA mass ladderבעזרת

13C - 100ולרי בין המקטע מופיע במשקל מולק. פוספורילציה- לאחר תהליך של דה-115+/40 המקטע הגנומי bp200- ל bp .

. שהוספנו בכדי לשקע את המקטעtRNA- הינו מולקולת ה1הפס התחתון המופיע בעמודה

61

פעם נוספת ניתן לראות כי . EMSA-לאחר קבלת המקטע הרצוי וסימונו השתמשנו במקטע בשיטת ה

BRCA1עצמו אינו מסוגל להיקשר אל הפרומוטר ל -IGF-IR) ה שמקטע זהלמרות העובד). 2עמודה ,

הוספת , )CCCGCCבעלי הרצף המקובל של (חסר אתרי קישור שמורים , GCשל בסיסי ~ 70%-המכיל כ

Sp1 הובילה ליצירת הקומפלקס Sp1-DNAהוספת ). 3עמודה (ל ' אשר הופיע כפס גבוה יותר בגBRCA1

).5-7עמודות (BRCA1-הפרה את יצירת הקומפלקס כתלות בכמות ה

.IR-IGF- עם הפרומוטר ל1Sp-1BRCA לבדיקת קשרי EMSAוש בניסויי שימ – 14איור

מתוצר µg 1 והודגר עם γ-32P-ATP-סומן בקצהו ב IGF-I- של הגן לרצפטור ל-115+/40מקטע הפרומוטר

אשר הופק בעזרת ערכת BRCA1או עם ) 1עמודה (pcDNA3, שהופק עם ווקטור הביקורתTranscription/Translation-ה

ל 'יצרה פס גבוה יותר בריצת הג) (f.p.u 0.375 נקי Sp1הוספת ). 2עמודה (ללא מתיונין חם Transcription/Translation -ה

שהופק עם ווקטור Transcription/Translation- עם תוצר הSp1הדגרת ). 3עמודה (Sp1-DNAהמייצג את הקומפלקס

בנוכחות כמויות עולות של Sp1-הדגרת ה). 4עמודה ( למקטע הפרומוטר Sp1-הראתה שינוי בקישור ה לא pcDNA3, הביקורת

BRCA1 , 2 µg 0.5 µg, 1 µgהראתה שינוי בקישור כתלות בכמות ה -BRCA1 החץ מסמן את ). 5-7עמודות ( אשר הוספה

.Sp1-DNAל של הקומפלקס 'המיקום בג

62

1Sp- ו1BRCAחיפוש אחר קשר פיסי בין החלבונים .4.5

, על פעילות הפרומוטר מתבצעתBRCA1 רמזו על כך שיכולת הדיכוי של EMSA-תוצאות ניסויי ה

BRCA1- אלא על ידי קישור הDNA- לרצף מסוים בBRCA1-לא על ידי קישורו של ה, ככל הנראה

. IGF-IR- הדרוש להפעלת הפרומוטר לגן לSp1-DNA ועל ידי כך מניעת היווצרות הקומפלקס Sp1-ל

זאת , Sp1 לחלבון BRCA1בין החלבון in vivoבכדי לאשש את הממצאים הללו בדקנו האם קיים קשר

. MCF7- וSaos-2שורות התאים בהם בצענו את הניסויים היו . בעזרת שימוש בשיטת השיקוע האימוני

BRCA1חלבונים ה, לאחר מיצוי התאים. באופן אנדוגניSp1- וBRCA1תאים אלו מבטאים את החלבונים

בשלב הבא החלבונים הורצו . Sp1 ועם נוגדנים כנגד BRCA1 עברו שיקוע אימוני עם נוגדנים כנגד Sp1-ו

. והועברו לממברנת ניטרוצלולוזSDS-PAGE 8%ל 'על גבי ג

.Sp1 וכנגד BRCA1זיהוי החלבונים התבצע בעזרת שימוש בנוגדנים כנגד

לשקע את החלבון , כצפוי, הצליחוBRCA1גדנים כנגד החלבון הראו כי נו, תוצאות זיהוי החלבונים

BRCA1 אך יחד עם זאת שיקעו את החלבון Sp1 .נוגדנים כנגד החלבון , במקבילSp1 הצליחו לשקע את

שיקוע הדדי זה מרמז כי שני . BRCA1 אשר נכחו במיצוי התאי אך בנוסף שיקעו את החלבון Sp1-חלבוני ה

איור (תוצאות הניסויים הללו חזרו בשתי שורות התאים . ים בקשר פיסי זה עם זההחלבונים הללו אכן נמצא

. עם אנטיסרום של ארנבתSaos-2- וMCF7לשם ביקורת בצענו שיקוע נוסף של מיצויי תאי של ). 15

לא שוקעו עקב קישור לא ספציפי של Sp1- והBRCA1-ביקורת זו התבצעה על מנת לוודא כי חלבוני ה

protein-או עקב קישור לא ספציפי ל) שמקורם מארנבת (Sp1- וBRCA1 הללו לנוגדנים כנגד החלבונים

A/G agarose . 15מהתוצאות המוצגות באיורC ניתן לראות כי החלבון Sp1 לא הופיע בשיקוע אשר

אשר שוקעו עם MCF7אך לעומת זאת הופיע במיצוי תאי , )2- ו1עמודות (התבצע עם אנטיסרום מארנבת

תוצאה זו אכן מאשרת כי שיקוע החלבונים נעשה עקב קישור ספציפי בין ). 3עמודה (Sp1וגדנים כנגד נ

BRCA1ו -Sp1 .ניסויים נוספים שהתבצעו הראו כי גם החלבוןBRCA1 הנתונים ( שוקע בצורה ספציפית

).אינם מוצגים

63

15A . 15B .

15C.

.1Sp- ו1BRCA בין החלבונים in vivoקישור – 15איור

כנגד נוגדנים (BRCA1 בעזרת נוגדנים כנגד (.I.P)עברו שיקוע אימוני ) 15B (MCF7ותאי ) Saos-2) 15Aמיצויים של תאי

. SDS-PAGE 8%החלבונים ששוקעו הופרדו על ידי הרצה על גבי . Sp1או בעזרת נוגדנים כנגד ) טרמינליC- או הN-הקצה ה

מיקום החלבונים . Sp1 או כנגד BRCA1לאחר העברתם לממברנת ניטרוצלולוז זוהו החלבונים בעזרת שימוש בנוגדנים כנגד

BRCA1) 220 kDa~ (ו-Sp1) 95 kDa106- ו kDa (מצויינים בחץ.

15C- מיצוי תאי Saos-2) 1 (ו-MCF7)2 ( עברו שיקוע אימוני בעזרת אנטיסרום של ארנבת(NRS= normal rabbit serum) .

זוהה החלבון , ל והעברה לניטרוצלולוז' ג8%לאחר הרצה על גבי ). Sp1) 3 שוקע בעזרת נוגדנים כנגד MCF7כמו כן מיצוי תאי

Sp1 כנגדו בעזרת נוגדנים.

64

1Sp האחראי על קישור לחלבון 1BRCAחיפוש אחר האזור בחלבון .4.6

היה , Sp1ם על הקישור עם החלבון / האחראיBRCA1ים בחלבון /ים המיוחד/בכדי לאתר את האזור

על כן השתמשנו בששה מקטעים עוקבים וחופפים . BRCA1עלינו להשתמש בפרגמנטים שונים של החלבון

קבלת החלבונים הללו ). 16Aאיור (GSTקטעים אלו היו מאוחים לחלבון מ. BRCA1-של כל חלבון ה

ומיצויים E.coli השונים לחיידקי BRCA1-התבצעה על ידי החדרת הווקטורים המכילים את מקטעי ה

המאוחים לחלבון BRCA1 מוצגים ששת הפרגמנטים השונים של 16Bבאיור . מהחיידקים לאחר ביטויים

GSTל וגילויים על ידי צביעת 'הפרדתם על גבי ג, קים לאחר הפקתם מהחיידCoomassie-blue.

16A.

GST 1314 - 1863

GST 1005-1313

GST 758 - 1064

GST 502 - 802

GST 260 - 553

Wild type BRCA1

GST-BRCA1-6 GST-BRCA1-5 GST-BRCA1-4

GST-BRCA1-3 GST-BRCA1-2

GST-BRCA1-1 GST 1- 324

16B.

.GST המאוחים לחלבון 1BRCAהפקת מקטעי – 16איור

16A - סכמה המתארת את המקטעים השונים של BRCA1 המאוחים לחלבון GST.

16B-ששת מקטעי ה -BRCA1 המאוחים לחלבון GSTידקי ה אשר הופקו מחי-E.coli , 8%הופרדו על גבי SDS-PAGE

.Coomassie blue-ונצבעו על ידי שימוש ב

65

שיקענו אותם ממיצוי החיידקים בעזרת השימוש , השוניםGST-BRCA1-לאחר קבלת חלבוני ה

השונים הקשורים אל GST-BRCA1-בשלב הבא הודגרו חלבוני ה. Glutathione Sepharose beads-ב

אשר עברו טרנספקציה עם ווקטור המכיל את הגן המקודד Drosophila Schneiderצוי תאי הספרוז עם מי

או לחילופין הודגרו עם מיצוי של אותם תאים אשר עברו טרנספקציה עם ווקטור Sp1 (pPacSp1)לחלבון

לאחר . SDS-PAGEבתום ההדגרה החלבונים שוחררו מהספרוז והופרדו בעזרת . (pPac0)הביקורת

).17איור ( בעזרת נוגדנים כנגדו Sp1 החלבונים לממברנת ניטרוצלולוז בצענו זיהוי לחלבון העברת

ומקטע ) 260-553חומצות אמיניות (GST-BRCA1-2התוצאות שהתקבלו הראו כי מקטע

GST-BRCA1-3) קשרו את החלבון ) 502-802חומצות אמינותSp1המקטע . באפיניות הגבוהה ביותר

GST-BRCA1-4) קשר את החלבון ) 785-1064חומצות אמיניותSp1יש לציין . באפיניות פחותה בהרבה

.כי בתאים אשר עברו טרנספקציה עם ווקטור הביקורת לא חל קישור כלל

.BRCA1- בגן ל11 מקודדים על ידי אקסון Sp1המקטעים אשר קשרו את החלבון

.1Spראים על הקישור עם החלבון אשר אח1BRCA-איתור אחר האזורים השונים ב - 17איור

שוקעו ממיצוי , )GSTוחלבון הביקורת (GST- המאוחים לBRCA1כמויות דומות של ששת המקטעים השונים של החלבון

אשר Drosophila Schneiderלאחר שטיפות הודגרו עם מיצוי של תאי . Glutathione Sepharose beadsהחיידקים בעזרת

או עם מיצוי של התאים אשר עברו טרנספקציה עם ווקטור Sp1 (pPacSp1)קטור המבטא את החלבון עברו טרנספקציה עם הוו

ושוקעו עם נוגדנים Sp1-דגימת ביקורת המכילה את התאים אשר עברו טרנספקציה עם ווקטור המוקדד ל, C. (pPac0)הביקורת

.Sp1כנגד

66

IR-GFI- על פעילות הפרומוטר לBRCA 1∆11 בדיקת השפעת החלבון .4.7

באזור המקודד על ידי אקסון , Sp1 נקשר אל החלבון BRCA1בכדי לאמת את התוצאות אשר הראו כי

ביחס IGF-IR- על פעילות הפרומוטר לBRCA1החלטנו לבדוק את יכולת הבקרה של , BRCA1- בגן ל11

ניסויי בצענו , למימוש מטרה זו. (BRCA1∆11) 11 מוטנטי החסר את אקסון BRCA1לווקטור המבטא

ביחד עם , p(-476/+640)LUC אשר להם החדרנו את הגן המדווח MCF7טרנספקציה בשורת תאי -קו

כלומר ( מוטנטי BRCA1- או לחילופין עם הווקטור המבטא את הBRCA1הווקטור המבטא את זן הבר של

,פרומוטר התקין דיכא את פעילות הBRCA1- מראות כי ה18התוצאות המוצגות באיור ). 11ללא אקסון

, המוטנטי הראו כי לא רק שלא חל דיכוי בפעילות הפרומוטרBRCA1-בעוד שהחדרת הווקטור המקודד ל

תוצאות אלו מחזקות את ממצאי הסעיף הקודם . התקיןBRCA1-אלא אף נראה שיפעול מועט לעומת ה

11 אקסון יש צורך בנוכחותIGF-IR- ידכא את פעילות הפרומוטר לBRCA1-ומדגישות כי על מנת ש

).Sp1אשר נקשר לחלבון (

0

20

40

60

80

100

120

Prom

oter

act

ivity

wild type 1 לעומתBRCA 11 חסר אקסון.

תקין כנגד כמות זהה מהווקטור המבטא BRCA1המבטא

[p(-476/+640)LUC0.2- ו µgמ -β-galactosidase .

התוצאות מוצגות כאחוז פעילות . β-galactosidase-ל ה

, ניסויים בלתי תלויים6 עד 4 שגיאות תקן של + ממוצע

*

ControlBRCA1BRCA1 11

BRCA 1השוואת פעילות הפרומוטר בנוכחות – 18איור

מהווקטור µg 0.65טרנספקציה עם -עברו קו, MCF7, תאי סרטן השד

BRCA1∆11 . 0.5ווקטורים אלו הוחדרו בשילוב עם µgמ -IGF-IR ]

התאים נקצרו ונמדדו רמות פעילות של הלוציפרז וש, שעות40לאחר

מתארותהתוצאות. β-galactosidase-הפרומוטר לאחר נירמול בעזרת ה

. כנגד דגימת הביקורתP<0.05, . *כאשר כל דגימה התבצעה בדופליקטים

67

בוויסות 53p- ו1BRCAבדיקת קשר פונקציונלי בין החלבונים .4.8

IR-IGF-הפרומוטר ל

ע בהגברת פעילות השעתוק ואף יכול לסייp53 נקשר לחלבון BRCA1על פי מחקרים קודמים ידוע כי

אשר , IGF-IR-כמו כן נמצא כי בקרת הגן ל. p53 (Zhang et al., 1998; Ouchi et al., 1998)של

;p53) Ohisson et al., 1998מושפעות ממעורבותו של , WT1- וSp1: מווסתת על ידי פקטורי בקרה כגון

Idelman et al., 2002 .(מאחר ו-BRCA1סף לפרומוטר ל מהווה פקטור בקרה נו-IGF-IR , החלטנו

לשם כך בצענו ניסוי . IGF-IR- בבקרת הגן לp53- וBRCA1לבדוק האם קיים קשר פונקציונלי בין

או את ווקטורי (p53- וBRCA1להם החדרנו את ווקטורי הביטוי של , MCF7טרנספקציה בתאי -קו

אשר p53מו כן בדקנו את השפעת החלבון כ. p(-476/+640)LUCבשילוב עם הווקטור המדווח ) הביקורת

wildהראו כי ביטוי , 18המוצגות באיור , התוצאות. (pC53-248W), 248עבר מוטציה נקודתית בקודון

type p53 או ביטוי p53ללא החדרת הווקטור המבטא את החלבון , מוטנטיBRCA1 ,) לא ) 1,2,3עמודות

מבטאים MCF7נעוצה בעובדה כי תאי , ככל הנראה, לכךהסיבה. IGF-IR-השפיעו על פעילות הפרומוטר ל

p53אנדוגני בכמות גבוהה ועל כן השפעת ווקטורי הביטוי ל -p53ביטוי . התקין או המוטנטי אינה מודגשת

BRCA1 ביטוי , יחד עם זאת). 4עמודה ( בתאים הובילה לדיכוי משמעותי של פעילות הפרומוטרBRCA1

בנוכחות BRCA1, מאידך). 5עמודה (א תרם לשינוי בפעילות הפרומוטר לwild type p53בשילוב עם

p53 6עמודה ( מוטנטי לא הצליח לדכא את פעילות הפרומוטר(.

68

0

20

40

60

80

100

120

140

160

Prom

oter

act

ivity

Controlw.t p53mut p53BRCA1BRCA1+w.t p53

.IR-IGF- בבקרת הפרומוטר ל

µg 0.5 בשילוב עם p(-476/+640)LUC מהווקטור המדווח 0.5

. (mut) 248 מוטנטי בקודון p53 או wild type (w.t) p53-דדים ל

לוציפרז ושלהתאים נקצרו ונמדדו רמות הפעילות של ה, שעות40

התוצאות מתארות . β-galactosidase-מוטר לאחר נירמול בעזרת ה

. כנגד דגימת הביקורתP<0.005, . *דגימה התבצעה בדופליקטים

1BRCAי פעילות הפרומוטר על ידי ו

שמעותי של פעילות הפרומוטר בתאים בהם מתבטא החלבון

M( , על כן החלטנו לבחון האם קיים הבדל בוויסות בקרת

טרנספקציה בשורת תאי -לשם כך בצענו ניסויי קו. p53ר

hum , כילים או אינם מ(+/+) המכילים)-/-(p53

כי כאשר הוחדרו לתאים כמויות נמוכות מהווקטור המקודד

, p53 אשר לא מבטאים HCT 116משמעותי יותר בתאי

לא נמצא הבדל משמעותי ברמת הדיכוי של פעילות , לכך

HCT 11 כאשר הוחדרה לתאים כמות גבוהה מהווקטור

על כן ניתן לסכם ולומר כי קיים הבדל ביכולת הדיכוי של

69

*

* BRCA1+ mut p53

53p- ו1BRCAקשר פונקציונלי בין – 19איור

µg עברו קו טרנספקציה עם , MCF7,תאי סרטן השד

מהווקטורים המקוµg 0.1 וכן BRCA1מהווקטור המבטא

לאחר. β-galactosidase של µg 0.2כמו כן הוסף לתאים

התוצאות מוצגות כאחוז פעילות הפרו. β-galactosidase-ה

כאשר כל , ניסויים בלתי תלויים5 שגיאות תקן של +ממוצע

על דיכ53pהשפעת סטטוס .4.9

לא מוביל לדיכוי מwild type p53ראינו כי

p53 כגון תאי ( בצורה אנדוגנית בכמות רבהCF7

בנוכחות או בהעדBRCA1 על ידי IGF-IR-הגן ל

an colorectal cancer (HCT 116), סרטן המעי

(Bunz et al., 1998) . התוצאות שהתקבלו הראו

חל דיכוי ) BRCA1) 0.3 µg; 0.65 µgלחלבון

בניגוד. p53 בהם מתבטא HCT 116לעומת תאי

(-/-) 6 ותאי (+/+) HCT 116הפרומוטר בתאי

). 20איור () BRCA1) 1.3 µgהמקודד לחלבון

BRCA1 ,אשר תלוי בסטטוס הביטוי של החלבון , המתבטא ברמות נמוכותp53 .בריכוזים נמוכים , לפיכך

.p53 חל דיכוי בפעילות הפרומוטר בצורה חזקה יותר בהעדר BRCA1של

0.00

20.00

40.00

60.00

80.00

100.00

120.00

pcDNA3 BRCA1 0.3 ug

BRCA10.65 ug

BRCA11.3ug

Prom

oter

Act

ivity

HCT 116 (+/+)HCT 116 (-/-)

.1BRCA על דיכוי פעילות הפרומוטר על ידי 53pת סטטוס השפע – 20איור

µg 0.5טרנספקציה עם -עברו קו) דגימות בצבע וורוד ((-/-) HCT 116ותאי ) דגימות בצבע כחול ((+/+) HCT 116תאי

, )pcDNA3או עם הווקטור הריק (BRCA1 ועם כמויות עולות מהווקטור המבטא p(-476/+640)LUCמהווקטור המדווח

התאים נקצרו ונמדדו רמות פעילות של הלוציפרז ושל , שעות40לאחר . β-galactosidase של µg 0.2ילוב עם בש

תוצאות הניסוי מתארות . β-galactosidaseהתוצאות מוצגות כאחוז פעילות הפרומוטר לאחר נירמול עם . β-galactosidase-ה

.כאשר כל דגימה התבצעה בדופליקטים, תי תלויים ניסויים בל4 שגיאות תקן של +ממוצע

אשר p53 בתאים חסרי IGF-IR- על פעילות הפרומוטר לBRCA1ניסינו לבדוק את ההשפעת , בשלב הבא

HCT 116טרנספקציה בשורת תאי -בצענו ניסויי קו, על כן. p53להם החדרנו ווקטור ביטוי המקודד לחלבון

מראות כי כאשר מבטאים את שני הווקטורים 21המוצגות באיור התוצאות . p53אשר אינם מכילים

חל דיכוי רב יותר בהשוואה לדיכוי אשר גרם כל אחד מפקטורי , יחדיוBRCA1- ולp53-המקודדים ל

.הבקרה בנפרד

70

0

20

40

60

80

100

120

Control p5

Prom

otet

act

ivity

-53p.

מהווקטור המבטא µg 0.5עם , p(-476/+640)LUCהמדווח

התאים , שעות40לאחר . β-galactosidase של µg 0.2אים

ת מוצגות כאחוז פעילות הפרומוטר לאחר נירמול עם התוצאו.

כאשר כל דגימה התבצעה , ניסויים בלתי תלויים7קן של

1Sp- ו1BRCA ,53pבונים

וכן רמזו כי Sp1- וBRCA1קשר פיסי ותפקודי בין

. בחנו קיום קשר פיסי בין שלושת החלבונים הללו

לו תאים א. MCF7ים בה בצענו את הניסויים היתה

Sp1- וp53החלבונים , לאחר מיצוי התאים. נדוגני

בשלב הבא . Sp1 ועם נוגדנים כנגד p53דנים כנגד

החלבונים התבצע זיהוי . רו לממברנת ניטרוצלולוז

p53בעזרת נוגדנים כנגד , )22איור (הוי החלבונים

כמו כן הנוגדנים Sp1- וp53 לשקע את החלבונים

p53 .נוגדנים כנגד החלבון , קבילבמSp1 הצליחו

*

3 BRC

ו1BRCAדי

0.5 µ מהווקטור

הוסף לת, ר על כן

β-galactosidas

שגיאות ת+צע

י בין החל

הראו כי קיים

p .בעקבות כך

שורת התא. וני

Sp1באופן א

BRC ,עם נוג

S 8%והועב

Sp .תוצאות זי

BRCהצליחו

ן את החלבון

71

*

A1 p53+B

רומוטר על י

gרנספקציה עם

ית. p53המבטא

e-לוציפרז ושל ה

וי מתארות ממו

.גימת הביקורת

ר קשר פיס

בצענו עד כה

BRCA53- ו

השיקוע האימ

p53 ,BRCו-

A1נים כנגד

DS-PAGEל

p53 1 וכנגד

A1ד החלבון

וכמובSp1ון

*

RCA1

דיכוי פעילות הפ - 21איור

ט-רו קו עב(-/-) HCT 116תאי

BRCA1 0.1 ועם µg מהווקטור

נקצרו ונמדדו רמות פעילות של ה

β-galactosidase .תוצאות הניס

כנגד דP<0.005, . *בדופליקטים

חיפוש אח .4.10

יים אשר תוצאות הניסו

1קיים גם קשר תפקודי בין

למטרה זו השתמשנו בשיטת

A1מבטאים את החלבונים

עברו שיקוע אימוני עם נוגד

'החלבונים הורצו על גבי ג

בעזרת שימוש בנוגדנים כנגד

הראו כי נוגדנים כנג, Sp1-ו

שיקעו את החלבp53כנגד

, יש לציין כי בדגימות הביקורת. p53 אשר נכחו במיצוי התאי ובנוסף שיקעו את Sp1-לשקע את חלבוני ה

אשר התבצע על ידי לקיחת דגימות ממיצוי התאים וביצוע שיקוע אימוני בעזרת נוגדנים מסרום של ארנבת

). התוצאות לא מוצגות (p53 או Sp1לא חל זיהוי של החלבונים , לוועכבר אשר לא חוסנו כנגד החלבונים הל

.שיקוע הדדי זה מרמז כי שלושת החלבונים הללו אכן נמצאים בקשר פיסי זה עם זה

.1Sp- ו1BRCA ,53p בין החלבונים in vivoקישור -22איור

, ) טרמינליC- או הN-נוגדנים כנגד הקצה ה (BRCA1 בעזרת נוגדנים כנגד (.I.P) עברו שיקוע אימוני MCF7מיצויים של תאי

הועברו לממברנת , SDS-PAGE 8%החלבונים ששוקעו הופרדו על ידי הרצה על גבי . p53או בעזרת , Sp1בעזרת נוגדנים כנגד

95 kDa (Sp1מיקום החלבונים של . p53 (20B)או כנגד) Sp1) 20Aניטרוצלולוז ואחר כך זוהו בעזרת הנוגדנים כנגד

.מצויינים בחץ) 53 kDa (p53ושל ) kDa 106-ו

72

דיון .5

דתאי אפיתל של השד ותאי סרטן ש הינו רצפטור המתווך את פעילותם המיטוגנית של IGF-IR-ה

.Werner & LeRoith, 1997; Surmacz, 2000)(מהווה מרכיב הכרחי בקרצינוגניות של השד ו

תיקון , שעתוק גנים: ב של מנגנונים ביולוגים כדוגמתמשתתף במספר רהינו חלבון ה BRCA1-ה

ישנם ממצאים , יחד עם זאת ).Wang et al., 2000(גדילת תאים ואפופטוזיס ,יציבות גנומית, DNAנזקי

הפעיל ברקמת האפיתל נורמלית , tumor suppressor, מהווה מדכא גידולBRCA1התומכים בהשערה כי

BRCA1- בהתאם לתפקידו של ה).Thompson et al., 1995; Holt et al., 1996(של השד ושל השחלה

מצאנו כי בשורות של . IGF-IR- על הפרומוטר לגן לBRCA1בדקנו את יכולת הדיכוי של , כמדכא גידול

42-45%קיים דיכוי משמעותי של , MDA-MB-231- וT47D, HCC-1937 :תאי סרטן השד כגון

בפעילות 44% גרם דיכוי של MCF7קין בשורת תאי סרטן השד תBRCA1ביטוי . בפעילות הפרומוטר

שדיכא את , אשר גורם ליצירת חלבון קטום185delAG, מוטנטיBRCA1הפרומוטר לעומת ביטוי

. הפרומוטר במידה פחותה בהרבה

אינה אופיינית רק בשורות תאי סרטן BRCA1 על ידי IGF-IR-פעילות הדיכוי של הפרומוטר ל

מצאנו כי מידת . Saos-2ה גם בשורת תאים ממקור אחר כגון שורת תאי אוסטאוסרקומה שד אלא היא חל

הגבוה ביותר BRCA1 אשר הוחדרה לתאים ובריכוזBRCA1-דיכוי פעילות הפרומוטר תלויה בכמות ה

. ~60%-פעילות הפרומוטר דוכאה ב

ד את עיקר פעילות בעלי אורכים שונים איפשרה לנו למקIGF-IR-שימוש במקטעי הפרומוטר של ה

של אזור -188 לעמדה -476 במקטע שבין הנוקלאוטידים בעמדה BRCA1הדיכוי של החלבון

יתכן כי קיים אזור פוטנציאלי נוסף הממוקם בין נוקלאוטידים בעמדה MCF7בתאי (flanking region‘5 -ה

מופעל על ידי IGF-IR-צא כי הפרומוטר לבמחקרים קודמים נמ). -40 לבין נוקלאוטידים בעמדה -188

נמצא כי בקרת , כמו כן. שהינו חבר במשפחה ענפה של פקטורי שעתוק בעלי אצבעות אבץ, Sp1החלבון

לרצפים שמורים העשירים בבסיסי Sp1-מתבצעת בעיקר על ידי קישור ה, Sp1 על ידי IGF-IR-ביטוי ה

GCוממוקמים באזור ה - flanking region‘5פרומוטר של ה(Beither-Jhonson et al., 1995) .

73

על פעילות הפרומוטר BRCA1 אחראים לתיווך ההשפעה של Sp1על כן בדקנו האם אתרי הקישור לחלבון

הובילה לעליה מהותית בפעילות הפרומוטר בעוד Sp1ראינו כי החדרת הווקטור המקודד לחלבון . לרצפטור

מפעילות הפרומוטר אשר שופעלה 45% הובילה לירידה של BRCA1שהוספת ווקטור המבטא את החלבון

לדכא את פעילות BRCA1תוצאה זו אפשרית על ידי שני מנגנונים שונים באמצעותם מצליח . Sp1על ידי

נקשר אל או בסמיכות לרצף בפרומוטר של BRCA1החלבון , מנגנון אפשרי ראשון. Sp1השפעול של

IGF-IR ועל ידי כך מונע מהחלבון Sp1להיקשר אל אתרי הקשירה השמורים שלו בפרומוטר ולשפעל אותו .

ובעקבות זאת ) קשר ישיר או עקיף(חלבון - בקשר חלבוןSp1- נקשר לBRCA1החלבון , מנגנון אפשרי שני

אשר התבצעו על ידי שימוש EMSA-ניסויי ה. להיקשר לאתרי הקשירה השמורים שלוSp1-לא מאפשר ל

initiator- או במקטע גנומי המכיל את אזור הSp1-פי המכיל את רצפי הקישור לבאוליגונוקלאוטיד ספצי

: אפשרו לנו להסיק מספר מסקנות, IGF-IR-של הפרומוטר ל

או לרצף הגנומי Sp1- המכיל את אתרי הקישור לDNA- אינו נקשר לרצף הBRCA1החלבון

לפקטור BRCA1חלבון בין -ןתוצאות אלו רמזו על אפשרות של קשר חלבו. initiator-באזור ה

DNA- לרצפי הBRCA1העובדה כי אין קשר בין . שעתוק אחר המסוגל להיקשר לפרומוטר

אך לא לרצף ספציפי , DNA- רקומביננטי מסוגל להיקשר לBRCA1טען כי נתמכת במאמר אשר

שלול אין אנו יכולים ל, יחד עם זאת. DNA (Paull et al., 2001)מסוים אלא למבנה מסועף של

, לדוגמא. נובעת מסיבות אחרותDNA- אל הBRCA1את האפשרות כי העדר קישורו של

המקטעים בהם השתמשנו אינם ארוכים דיו או אינם מאורגנים במבנה המסועף הדרוש לקישור בין

BRCA1ל -DNA .קיימת האפשרות כי ה, לחילופין-BRCA1 ,הופק בשיטת , בו השתמשנוin

vitro translation ידי רטיקולוציטים של ארנבות ועל כן הוא שונה מה על-BRCA1 שבוטא

.Paull (Paull et al., 2001) בהם השתמשו החוקרים מקבוצתו של E.coliבחיידקי

באופן ספציפי לאתרי הקשירה שלו הממוקמים בפרומוטר אכן נקשר Sp1 ניסויי התחרות הראו כי

. Sp1-DNA ויוצר קומפלקס של IGF-IR-ל

. לפרומוטרSp1 מפריע ומפר את יצירת הקשר בין BRCA1החלבון

74

מתאפשר על ידי קישור של IGF-IRתוצאות אלו מרמזות כי המנגנון לדיכוי פעילות הפרומוטר של

BRCA1 אל Sp1ועל ידי כך מונע מ -Sp1בעקבות כך . להיקשר לרצפים השמורים בפרומוטרBRCA1

תוצאות אלו חזרו גם כאשר השתמשנו במקטע הגנומי של . Sp1עת על ידי מונע את הפעלת הפרומוטר המתבצ

מקטע זה חסר אומנם . flanking region ’5- מאזור ה(40-) - (115+)הפרומוטר המשתרע בין נוקלאוטידים

. GCבסיסי ~ 70%-אך הוא מכיל כ, )CCCGCCבעלי הרצף המקובל של (Sp1-אתרי קישור שמורים ל

.BRCA1- כתלות בכמות הSp1-DNA הפרה את יצירת הקומפלקס BRCA1הוספת הראנו כי , כמו כן

, DNA- ומונע ממנו קישור לרצפי הSp1- אכן נקשר לBRCA1על מנת לאשש את ההשערה כי

שימוש בשיטת השיקוע האימוני הראתה . Sp1- וBRCA1חלבון בין -היה עלינו לבדוק האם קיים קשר חלבון

. ועל כן שני החלבונים הללו אכן נמצאים בקשר פיסי זה עם זהSp1- וBRCA1ן כי אכן קיים שיקוע הדדי בי

באזור BRCA1- נקשר לSp1 ספקו לנו את המידע כי BRCA1שימוש בפרגמנטים שונים של , זאת ועוד

אזור זה מהווה חלק ניכר מהחלבון ובעל יכולת לקשור חלבונים . BRCA1- בגן ל11המקודד על ידי אקסון

, STAT1 (Ouchi et al., 2000) ,p53 (Zhang et al., 1998) ,Rad51 (Scully et al., 1997b): כגון

Rad50 Zhong et al., 1999) (ביצוע טרנספקציה בתאי . ועודMCF7 עם ווקטור המקודד לחלבון

BRCA1 כנגד ווקטור המקודד לחלבון BRCA1 הראתה כי ה11 אשר חסר אקסון -BRCA1 התקין דיכא

המוטנטי לא רק שלא BRCA1-באופן משמעותי בעוד שהחדרת הווקטור המקודד ל ות הפרומוטראת פעיל

תוצאות אלו . IGF-IR-אלא אף גרם לשיפעול מועט בפעילות הפרומוטר ל, דיכא את פעילות הפרומוטר

יש IGF-IR- ידכא את פעילות הפרומוטר לBRCA1מחזקות את ממצאנו ומדגישות כי על מנת שהחלבון

.Sp1אשר אחראי על קישור לחלבון , 11 בנוכחות אקסון צורך

תלוי בנוכחות של פקטור השעתוק IGF-IR-סיכום התוצאות עד כה מצביע על כך ששעתוק הגן ל

Sp1 . מדכא הגידולBRCA1נקשר אל ה -Sp1 ועל ידי כך מונע את יכולת הקישור של Sp1 אל אלמנטי

בעקבות זאת חלה ירידה משמעותית בפעילות . IGF-IR-להקשירה הספציפיים שלו הממוקמים בפרומוטר

בספרות מופיעות עדויות למערכות אחרות . IGF-IR- אינו ייחודי לSp1מנגנון פעולה המערב את . הפרומוטר

הינו חלבון המדכא Promyelocytic leukemia protein (PML)החלבון, לדוגמא. המתנהגות בצורה דומה

75

נמצא כי החלבון . Epidermal growth factor receptor (EGFR)-ודד לשעתוק של הפרומוטר לגן המק

PMLמדכא את פעילות שעתוק הפרומוטר ל -EGFR המשופעלת על ידי Sp1 וזאת על ידי קישור ישיר של

PMLל -Sp1 . עקב כך מונעPML את קישורו של האחרון לאתרי הקשירה הספציפיים הממוקמים

הינו מדכא גידול Von-Hipple Lindau (VHL)החלבון . EGFR (Vallian et al., 1998)-בפרומוטר ל

Vascular endothelial growth- ובעקבות כך מונע את שפעול הפרומוטר לגן המקודד לSp1-הנקשר אל ה

factor (VEGF) , העשיר ברצפיGC ומופעל על ידי Sp1) Mukhopadhyay et al., 1997) .( בניסויים

מעכב את יכולתו של MDM2 ובעקבות כך MDM2- קשור לSp1צא כי החלבון נמNIH3T3שנעשו בתאי

Sp1להיקשר ל -DNA . הוספת החלבוןRetinoblastoma (RB), אשר נקשר אלMDM2 , מובילה

. (Johnson-Pais et al., 2001) שכעת יכול להקשר שוב אל רצפי הקישור הספציפיים שלו Sp1לשחרור

מדכא את הפרומוטר , תאים שמקורם בשרירים החלקים של אבי העורקיםהמתבטא ב, αהאסטרוגן רצפטור

להקשר אל אתרי הקישור השמורים בפרומוטר Sp1 בעזרת מנגנון המונע מהחלבון IGF-IR-ל

(Schiedegger et al., 2000) .התומך בפרדיגמה של חלבון , לאחרונה התפרסם מאמר נוסף, זאת ועוד

מאמר זה מציג את החלבון . לאתרי הקשירה הספצפיים שלו ומונע ממנו להיקשרSp1הנקשר אל

Huntingtin ,שהינו חלבון המעורב בהתפתחות מחלת ה-Huntington .כאשר בדקו רקמות מוח של חולים ,

להקשר אל רצפיו Sp1 מוטנטי עיכב את היכולת של Huntingtinמצאו כי ביטוי , בניתוח לאחר המוות

הובילה לשינוי בביטוי DNA- לSp1 על כך שאיבוד יכולת הקשירה של ממצא זה מרמז. DNA-השמורים ב

.(Dunah et al., 2002)מספר גנים התלויים בפעילות של פקטור שעתוק זה

המעורב באתיולוגיה של , WT1החלבון . BRCA1- אינו מוגבל רק לIGF-IR-דיכוי הפרומוטר לגן ל

Wilm’s Tumor ,לה ובמורד הזרם לאזור תחילת השעתוק בגן נקשר לרצפים שמורים הממוקמים במע

, כמו כן. (Werner et al., 1993; 1994) בעזרת אצבעות אבץ וגורם לדיכוי בפעילות הפרומוטר IGF-IR-ל

וכן IGF-IRהוביל לירידה ברמות אנדוגניות של , בתאים שאינם מבטאים חלבון זהWT1ביטוי יתר של

. IGF-I (Werner et al., 1995)הנגרמים עקב הוספת , ה מעוגנת במצעלירידה בשגשוג התאי ובגדילה שאינ

76

בדומה לחלבון . p53 (Werner et al., 1996) מבוקר גם על ידי מדכא הגידול IGF-IR-ביטוי הגן ל

BRCA1 , מנגנון הפעולה שלp53אינו מעורב בקישור ישיר ל -DNA . בניסויin vitro בהם השתמשו

בשני , p53- נקשר לBRCA1ונים וניתוח של תספיגים אימונים נמצא כי החלבון בשיטות של שיקועים אימ

p53לקצה הקרבוקסילי של ) 224-500חומצות אמיניות (11בין החלק האמיני של אקסון , הראשון. אתרים

) 1760-1863חומצות אמיניות (BRCA1והשני בין הקצה הקרבוקסילי של ) 300-393חומצות אמיניות (

כמו כן . p53 (Zhang et al., 1998; ouchi et al., 1998; Chai et al., 1999)ר האמצעי של לבין האזו

: עדויות לקישור פונקציונלי בין שני החלבונים הללו בבקרה משותפת על שגשוג תאים קיימות מספר

BRCA1משפעל פרומוטרים המכילים אלמנטים רגישים ל -p53 , ופעילות זו שלBRCA1

). p53) Ouchi et al., 1998ותו של תלויה בנוכח

יכולה להיות , פונקציונליBRCA1-לטליות מוקדמת של עוברי עכברים החסרים את הגן ל

עובדה זו מרמזת כי לטליות הנגרמת . p53-מעוכבת על ידי הופעה בו זמנית של מוטציה בגן ל

).p53) Ludwig et al., 1997 תלויה בפעילות של BRCA1-כתוצאה ממוטציה ב

עשויה להוביל לעצירה BRCA1בתאי סרטן שד הומנים ספורדים נמצא כי ירידה בביטוי

).p53 checkpoint) Sourvinos & Spandidos, 1998במחזור התא על ידי הפעלה של

p53 מבקר את ביטוי החלבון BRCA1 ,בתגובה לחומרים גורמי נזק ב, ברמת השעתוק-DNA

(Arizti et al., 2000) .

החלטנו לבחון האם קיים קשר פיסי ופונקציונלי בין p53- וBRCA1 ונצפה קשר בין החלבונים מאחר

BRCA1תחילה בדקנו האם קיים קשר פונקציונלי בין . IGF-IR-חלבונים אלו בבקרה על הגן המקודד ל

ת מצאנו כי החדר, אנדוגניp53המבטאים , MCF7בניסויים שנעשו בתאי . בבקרת הפרומוטרp53לבין

לבדם לא שינתה את פעילות 248 אשר עבר מוטציה נקודתית בקודון p53 התקין או p53-ווקטורי הביטוי ל

עם wild type p53בעוד ששילוב , דיכא באופן משמעותי את פעילות הפרומוטרBRCA1ביטוי . הפרומוטר

BRCA1מאידך. לא תרם לשינוי משמעותי בפעילות ,BRCA1 בנוכחות p53 הצליח לדכא את מוטנטי לא

יתכן ונובעת , מוטנטיp53 בנוכחות IGF-IR- לדכא את הגן לBRCA1 חוסר היכולת של .פעילות הפרומוטר

77

התקיןp53 מוטנטי מהווה פקטור תחרות לחלבון p53מיצירת קומפלקס לא יציב או יתכן כי ביטוי

(dominant-negative) ,ת של המשפיע על פעילות שונה בתא ומוביל להעדר פעילוBRCA1באופן עקיף .

מדכא את פעילות הפרומוטר WT1תוצאות דומות התקבלו בעבודה שהתפרסמה לאחרונה בה נמצא כי

מוטנטי p53אולם אינו מדכא את פעילות הפרומוטר בנוכחות , תקיןp53 בנוכחות ובהעדר IGF-IR-ל

(Idelman et al., 2003) .

החלטנו לבחון , לבון זה לא הובילה לשינוי בפעילות הפרומוטר לתאים המכילים חp53כיוון שהוספת

בתאים המבטאים או אינם מבטאים את החלבון , BRCA1 על ידי IGF-IR-האם קיים הבדל בוויסות הגן ל

p53 .תוצאות ניסויי הטרנספקציה בשורת תאי סרטן המעי ,human colorectal cancer (HCT 116) ,

הן IGF-IR- דיכא את שעתוק הגן לBRCA1 הראו כי p53)-/-(כילים או אינם מ(+/+) אשר מכילים

p53 היה רב יותר בתאים חסרי BRCA1אך דיכוי הפרומוטר ברמות נמוכות של . p53בהעדר והן בנוכחות

לתאים אינה BRCA1הסיבה להבדלים המתקבלים מהחדרת כמויות שונות של . p53לעומת תאים בעלי

גורם לירידה ברמות ביטוי wild type p53ינו הממצא כי ביטוי ואף שפעול הסבר אפשרי אחד ה. ברורה

קיים ביטוי נמוך יותר (+/+) HCT 116על כן יתכן כי בתאי , (Arizti et al., 2000) בתאיםBRCA1-ה

.IGF-IR- ולדכא את פעילות הפרומוטר לSp1 המסוגל לקשור BRCA1של

יחדיו BRCA1- וp53 הובילה לדיכוי רב יותר של (-/-) HCT 116 אקסוגני לתאי p53הוספת

BRCA1תוצאות אלו מרמזות כי ). 21איור (בהשוואה לדיכוי אשר גרם כל אחד מפקטורי הבקרה בנפרד

) 20איור (תוצאות אלו עומדות בניגוד לתוצאות הקודמות . IGF-IR- משתפים פעולה בבקרת הגן לp53-ו

לעומת תאים בעלי p53נמוכות גורמות לדיכוי רב יותר בתאים חסרי ברמות BRCA1אשר הראו כי החדרת

p53 .או תפוצה שונה של /יציבות ו, יתכן כי תוצאות סותרות אלו נובעות מפעילות שונהp53 אנדוגני ביחס

יתכן כי ניתן ליישב סתירה זו על ידי ההסבר כי ההבדלים נובעים משינוי היחס בין , כמו כן. אקסוגניp53-ל

ברמות גבוהות הוביל לדיכוי BRCA1שהרי ביטוי , בונים המתבטאים בתאים בעקבות הטרנספקציותהחל

).20איור (p53פעילות הפרומוטר ללא תלות בסטטוס

78

חוזרות על ממצאי מחקרים , p53- וBRCA1 ,Sp1המראות כי קיים קשר בין , תוצאות השיקוע האימוני

p53- וBRCA1וכן בין החלבונים ) Sp1) Ohlsson et al., 1997- וp53קודמים בהם נמצא קשר בין

(Zhang et al., 1998; Ouchi et al 1998) . הקישור ביןBRCA1ו -p53 אינו הכרחי לפעילות הבקרה

מפריע BRCA1 אשר הראו כי EMSA-הוכחה לכך התקבלה מניסוי ה. IGF-IR- על הגן לBRCA1של

מרמזת Sp1- וp53 לקשור BRCA1היכולת של . p53ות של לרצפיו השמורים ללא נוכחSp1לקישורו של

בתאי סרטן השד הינה מורכבת מאד ויתכן ומערבת יצירת מבנה מולטימרי IGF-IR-כי בקרת ביטוי הגן ל

. ואולי גם פקטורים נוספיםSp1- וp53, BRCA1הכולל את החלבונים

נמצאת תחת פעילות הדיכוי IGF-IR-בעבודה זו הצגנו הוכחות לכך שבקרת השעתוק של הגן ל, לסיכום

נקשר בעזרת האזור BRCA1החלבון : ניתוח התוצאות מרמז למנגנון הפעולה הבא. BRCA1של החלבון

להיקשר אל אתרי הקשירה הספציפיים Sp1-קישור זה מונע מ. Sp1 לחלבון 11המקודד על ידי אקסון

מוטציה בגן . Sp1 הפרומוטר הנגרמת על ידי חל דיכוי בפעילות, על כן. IGF-IR-הממוקמים בפרומוטר ל

כמו כן הראנו כי . גורמת להפעלה מוגברת בפעילות הפרומוטר, Sp1 המונעת את קשירת החלבון BRCA1-ל

יכול להתקיים הן בנוכחות והן BRCA1דיכוי הפעילות בידי . p53- וBRCA1 ,Sp1קיים קישור פיסי בין

עלולה למנוע את פעילות הדיכוי הנגרמת על ידי p53-וטציה בגן להופעת מ, אך יחד עם זאת. p53בהעדר

BRCA1 .תאים בוגרים , על כן ניתן לסכם ולומר כי כאשר החלבונים המדכאים גידול פועלים כשורה

מוטציות הגורמות לאיבוד הפעילות של . נורמלים נשארים תחת בקרת מחזור התא ואינם הופכים למיטוגנים

BRCA1או \ וp53הופעת מוטציות אלו מונעות את יכולת דיכוי . אירועים שכיחים בגידולי סרטן שד הינם

המופעלים על ידי , על פני התאים, חלה עליה ברמת הביטוי של הרצפטור, בעקבות זאת. IGF-IR-הגן ל

עלולה לגרום IGF-IR-הפעלה פתולוגית של ה. המיוצרים מקומית או הקיימים במחזור הדםIGFs-קישור ה

.או התפתחות סרטן/חלה ולהת

79

רשימת ספרות .6

Alberg, A.J., and Helzlsouer, K.J. (1997). "Epidemiology, prevention, and early

detection of breast cancer." Curr. Opin. Oncol. 9: 505-511.

Anderson, S.F., Schlegel, B.P., Nakajima, T., Wolpin, E.S.,and Parvin, J.D. (1998).

"BRCA1 protein is linked to the RNA polymerase II holoenzyme complex via

RNA helicase A." Nat. Genet. 19: 254-256.

Arizti, P., Fang, L., Park, I., Yin, Y., Solomon, E., Ouchi, T., Aaronson, S.A., and Lee,

S.W. (2000). "Tumor suppressor p53 is required to modulate BRCA1 expression."

Mol. Cell. Biol. 20: 7450-7459.

Arteaga, C.L., and Osborne, C.K. (1989). "Growth inhibition of human breast cancer

cells in vitro with antibody against the type I somatomedin receptor." Cancer Res.

49: 6237-6241.

Arteaga, C.L., Kitten, L.J., Coronado, E.B., Jacobs, S., Kull, F.C.Jr, Allred, D.C., and

Osborne, C.K. (1989). "Blockade of the type I somatomedin receptor inhibits

growth of human breast cancer cells in athymic mice." J. Clin. Invest. 84: 1418-

1423.

Bailyes, E.M., Nave, B.T., Soos, M.A., Orr, S.R., Hayward, A.C., and Siddle, K. (1997).

" Insulin receptor/IGF-I receptor hybrids are widely distributed in mammalian

tissues: quantification of individual receptor species by selective

immunoprecipitation and immunoblotting." Biochem. J. 327: 209-215.

Baker, J., Liu, J.-P., Robertson, E.J. and Efstratiadis, A. (1993). "Role of insulin-like

growth factor in embryonic and postnatal growh." Cell 75: 73-82.

Baserga, R., and Rubin, R. (1993). "Cell cycle and Growth control." Crit. Rev. Euk.

Gene. Exp. 3(47-61).

80

Baserga, R. (1994). "Oncogenes and the strategy of growth factors." Cell 79: 927-930.

Baserga, R., Hongo, A., Rubini, M., Prisco, M., and Valentinis, B. (1997). "The IGF-I

receptor in cell growth, transformation and apoptosis." Biochim. Biophys. Acta.

1332: F105-F106.

Baserga, R., and Morrione, A., (1999). "Differentiation and malignant transformation:

two roads diverged in a wood." J Cell Biochem. 32: 68-75.

Baserga, R. (2000). "The contradictions of insulin-like growth factor I receptor."

Oncogene 19: 5574-5581.

Beitner-Johnson, D., Werner, H., Roberts, C.T., Jr., and LeRoith, D. (1995). "

Regulation of insulin-like growth factor I receptor gene expression by Sp1:

physical and functional interactions of Sp1 at GC boxes and at a CT element."

Mol. Endocrinol. 9: 1147-1156.

Bianco, T., Chenevix-Trench, G., Walsh, D.C., Cooper, J.E., and Dobrovic, A. (2000).

"Tumor-specific distribution of BRCA1 promoter region methylation supports a

pathogenetic role in breast and ovarian cancer." Carcinogenesis 21: 147-151.

Blake, M.C., Jambou, R.C., Swick, A.G., Kahn, J.W., and Azizkhan, J.C. (1990).

"Transcriptional initiation is controlled by upstream GC-box interactions in a

TATAA-less promoter." Mol. Cell Biol. 10: 6632-6641.

Brody, L.C., and Biesecker, B.B. (1997). "Breast cancer: The high-risk mutation."

Hospital Prac. 21: 59-80.

Brody, L.C., and Biesecker, B.B. (1998). "Breast cancer susceptibility genes. BRCA1

and BRCA2." Medicine 77: 208-226.

81

Brugarolas, J., and Jacks, T. (1997). "Double indemnity : p53, BRCA and cancer." Nat.

Med. 3: 721-722.

Bunz, F., Dutriaux, A., Lengauer, C., Waldman, T., Zhou, S., Brown, J.P., Sedivy, J.M.,

Kinzler, K.W., and Vogelstein, B. (1998). "Requirement for p53 and p21 to

sustain G2 arrest after DNA damage." Science 282: 1497-1501.

Chai, Y.L., Cui, J., Shao, N., Shyam, E., Reddy, P., and Rao, V.N. (1999). "The second

BRCT domain of BRCA1 proteins interacts with p53 and stimulates transcription

from the p21WAF1/CIP1 promoter." Oncogene 18: 263-268.

Chan, S.J., Nagamatsu, S., Cao, Q.P., and Steiner, D.F. (1992). "Structure and

evolution of insulin and insulin-like growth factors in chordates." Prog. Brain

Res. 92: 15-24.

Chapman, M.S., and Verma, I.M. (1996). "Transcriptional activation by BRCA1."

Science 382: 678-679.

Chen, J.J., Sliver, D., Cantor, S., Livingston, D.M., and Scully, R. (1999). "BRCA1,

BRCA2 and RAD51 operate in a common DNA damage response pathway."

Cancer Res. 59: 1752s-1756s.

Chen, Y., Chen, C.F., Riley, D.J., Allred, D.C., Chen, P.L., Von Hoff, D., Osborne, C.K.,

and Lee, W.H. (1995). "Aberrant subcellular localization of BRCA1 in breast

cancer." Science 270: 789-791.

Cooke, D.W., Bankert, L.A., Roberts, C.T., Jr., LeRoith, D., and Casella, S.J. (1991).

"Analysis of the human type I insulin-like growth factor receptor promoter

region." Biochem. Biophys. Res. Commun. 177: 1113-1120.

Cortez, D., Wang, Y., Qin, J., and Elledge, S.J. (1999). "Requirement of ATM-dependent

82

phosphorylation of BRCA1 in the DNA damage response to double-strand

breaks." Science 286: 1162-1166.

Courey, A.J., and Tjian, R. (1988). "Analysis of Sp1 in vivo reveals multiple

transcriptional domains, including a noval glutamin-rich activation motif." Cell

55: 887-898.

DeChiara, T.M., Robertson, E.J., and Efstratiadis, A. (1991). "Parental imprinting of the

mouse insulin-like growth factor II gene." Cell 64: 849-859.

Dunah, A.W., Jeong, H., Griffin, A., Kim, Y.M., Standaert, D.G., Hersch, S.M.,

Mouradian, M.M., Young, A.B., Tanese, N., and Krainc, D. (2002). "Sp1 and

TAFII130 transcriptional activity disrupted in early Huntington's disease."

Science 296: 2238-2243.

Dupont, J., and LeRoith, D. (2001). "Insulin and insulin-like growth factor I receptors:

similarities and differences in signal transduction." Horm. Res. 55: 22-26.

El-Badry, O.M., Romanus, J.A., Helman, L.J., Cooper,M.J., Rechler, M.M., and Israel,

M.A. (1989). "Autonomous growth of human neuroblastoma cell line is mediated

by insulin-like growth factor II." J. Clin. Invest. 84: 829-839.

Esteller. M.,S., J.M., Dominguez, G., Bonilla, F., Matias-Guiu, X., Lerma. M.,

Bussaglia, E., Prat, J., Harkes,I.C., et al. (2000). "Promoter hypermethylation and

BRCA1 inactivation in sporadic breast and ovarian tumors." J. Natl. Cancer Inst.

92b: 564-569.

Fan, S., Wang, J.-A., Yuan, R., Ma, Y., Meng, Q., Erods, M.R., Pestell, R.G., Yuan, F.,

Auborn, K. J., Goldberg, I. D., and Rosen, E.M. (1999). "BRCA1 inhibition of

estrogen receptor signaling in transfected cells." Science 284: 1354-1356.

83

Fan, W., Jin, S., Tong, T., Zhao, F., Antinore, M.J., Rajasekaran, B., Wu, M., and Zhan,

Q. (2002). "BRCA1 regulates GADD45 through its interaction with the OCT-1

and CAAT motifs." J. Biol. Chem. 277: 8061-8067.

Federici M., Porzio O., Zucaro L., Fusco A., Borboni P., Lauro D. and Sesti G. (1997).

"Distribution of insulin/insulin-like growth factor-I hybrid receptors in human

tissues." Mol Cell Endocrinol. 129: 121-126.

Furlanetto, R.W., Harwell, S.E., and Bagges, R.B. (1993). "Effects of insulin like growth

factor receptor inhibition on human melanomas in culture and in athymic mice."

Cancer Res. 53: 2522-2526.

Futreal, P.A., Liu, O., Shattuck-Eidens, D. et al (27 authors). (1994). "BRCA1 mutations

in primary breast and ovarian carcinomas." Science 266: 120-122.

Haber, J.E. (1998). "The many interfaces of Mre11." Cell 95: 583-586.

Haber, J.E. (2000). "Recombination: a frank view of exchanges and vice versa." Curr.

Opin. Cell Biol. 12: 286-292.

Hall, J.M., Lee, M.K., Newman, B., Morrow, J.E., Anderson, L.A., Huey, B., and King,

M.C. (1990). "Linkage of early-onset familial breast cancer to chromosome

17q21." Science 250: 1684-1689.

Hankinson, S.E., Willett, W.C., Colditz, G.A., Hunter, D. J., Michaud, D.S., Deroo, B.,

Rosner, B., Speizer, F.E., and Pollak M. (1998). "Circulating concentrations of

insulin-like growth factor-I and risk of breast cancer." Lancet 351: 1393-1396.

Happerfield, L.C., Miles, D.W., Barnes, D.M., Thomsen, L.L., Smith, P., and Hanby,

A.M. (1997). "The localization of the insulin-like growth factor receptor I (IGFR-

I) in benign and malignant breast tissue." J. Pathol. 183: 412-417.

84

Harrington, E.A., Bennett, M.R., Fanidi, A., and Evan, G.I. (1994). "c-Myc-induced

apoptosis in fibroblasts is inhibited by specific cytokines." EMBO J. 13: 3286-

3295.

Hernandez-Sanchez, C., Werner, H., Roberts, C.T,Jr., Woo, E.J., Hun, D.W., Rosenthal,

S.M., and LeRoith, D. (1997). "Differential regulation of IGF-I receptor gene

expression by IGF-I and basic fibroblast growth factor." J. Biol. Chem. 272:

4663-4670.

Holt, J.T., Thompson, M.E., Szabo, C., Robison-Benion, C., Arteaga, C.L., King, M.C.,

and Jensen, R.A. (1996). "Growth retardation and tumour inhibition by BRCA1."

Nat. Genet. 12: 298-302.

Hsu, L.C., and White, R.L. (1998). "BRCA1 is associated with the centrosome during

mitosis." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 95: 12983-12988.

Idelman, G., Glaser, T., Roberts, C.T., Jr. and Werner, H. (2002). "WT1-p53 interactions

in insulin-like growth factor-I receptor gene regulation." J. Biol. Chem. 278:

3474-3482.

Jasin, M. (2002). "Homologous repair of DNA damage and tumorigenesis: the BRCA1

connection." Oncogene 21: 8981-8993.

Jensen, D.E., Proctor, M., Marquis, S.T., Gardner, H.P., Ha, S.I., Chodosh, L.A., Ishov,

A.M., Tommerup, N., Vissing, H., Sekido, Y., et al. (1998). "BAP1: a novel

ubiquitin hydrolase which binds to the BRCA1 RING finger and enhances

BRCA1-mediated cell growth suppression." Oncogene 16: 1097-1112.

Johnson-Pais, T., Degnin, C., and Thayer, M.J. (2001). "pRB induces Sp1 activity by

relieving inhibition mediated by MDM2." Proc .Natl. Acad. Sci. U S A. 98: 2211-

85

2216.

Kaleko, M., Rutter, W.J., and Miller, A.D. (1990). "Overexpression of the human

insulin-like growth factor I receptor promotes ligand-dependent neoplastic

transformation." Mol. Cell Biol. 10: 464-473.

Khoo, U.S., Ozcelik, H., Cheung, A.N., Chow, L.N., Ngan, H.Y., Done, S.J., Liang,

A.C., Chan, V.W., et al. (1999). "Somatic mutations in the BRCA1 gene in

Chinese sporadic breast cancer and ovarian cancer." Oncogene 18: 4643-4646.

Kim, S.O., Park, J.G.,and Lee, Y.I. (1996). "Increased expression of the insulin-like

growth factor I (IGF-I) receptor gene in hepatocellular carcinoma cell lines:

implications of IGF-I receptor gene activation by hepatitis B virus X gene

product." Cancer Res. 56: 3831-3868.

Kleiman, F.E., and Manley, J.L. (1999). "Functional interaction of BRCA1-associated

BARD1 with polyadenylation factor CstF-50." Science 285: 1576-1569.

Kleinberg, D.L. (1998). "Role of IGF-I in normal mammary development." Breast

Cancer Res. Treat. 47: 201-208.

Knudson, A.G. (1996). "Hereditary cancer: two hit revisited." J. Cancer Res. Clin.

Oncol. 122: 135-140.

Kubista, M., Rosner, M., Kubista, E., Bernaschek, G., and Hengstschlagr, M. (2002).

"Brca1 regulates in vitro differentiation of mammary epithelial cells." Oncogene

21: 4747-4756.

Lakhani, S.R., Van De Vijer, M.J., Jacquemier, J., Anderson, T.J., Osin, P.P., McGuffog,

L., and Easton, D.P. (2002). "The pathology of familial breast cancer: predictive

value of immunohistochemical markers estrogen receptor, progesterone receptor,

86

HER-2, and p53 in patients with mutation in BRCA1 and BRCA2." J. Clin.

Oncol. 20: 2310-2318.

Lee, A.V., Hilsenbeck, S.G., and Yee ,D. (1998). "IGF system components as prognostic

markers in breast cancer." Breast Cancer. Res. Treat. 47: 295-302.

Lee, A.V., Jackson, J.G., Gooch, J.L., Hilsenbeck, S.G., Coronado-Heinsohn, E.,

Osborne, C.K., and Yee, D. (1999). "Enhancement of insulin-like growth factor

signaling in human breast cancer: estrogen regulation of insulin receptor substrate

-I expression in vitro and in vivo." Mol. Endocrinol. 13: 787-796.

LeRoith, D., Adamo, M., Werner, H., and Roberts, C.T. Jr. (1991). "Insulin-like growth

factors and their receptors as growth regulators in normal physiology and

pathological states." Trends Endocrinol. Metab. 2: 134-139.

LeRoith, D., Werner, H., Beitner-Johnson, D., and Roberts, C.T. Jr. (1995). "Molecular

and cellular aspects of the insulin-like growth factor I receptor." Endocr. Rev. 16:

143-163.

LeRoith, D. and H. Werner (2001). "Insulin like growth factors." Encyclopedia of cancer,

ed. By Bertino J.R., Academic Press, San Diego, Second Edition: 487-492.

Li, S., Chen, P.L., Subramanian, T., Chinnadurai, G., Tomlinson, G., Osborne, C.K.,

Sharp, Z.D., and Lee, W.H. (1999). "Binding of CtIP to the BRCT repeats of

BRCA1 involved in the transcription regulation of p21 is disrupted upon DNA

damage." J. Biol. Chem 274: 11334-11338.

Liu, J.-L., and LeRoith, D. (1999). "Insulin-like growth factor I is essential for postnatal

growth in response to growth hormone." Endocrinology 140: 5178-5184.

Liu, J.-P., Baker, J., Perkins, A.S., Robertson, E.J. and Efstratiadis, A. (1993). "Mice

87

carrying null mutations of the genes encoding insulin-like growth factor I (IGF-I)

and type I IGF receptor (IGFIR)." Cell 75: 59-72.

Loman, N., Johannsson, O., Bendahl, P.-O., Borg, A., Ferno, M.,and Olsson, H. (1998).

"Steroid receptors in hereditary breast carcinomas associated with BRCA1 or

BRCA2 mutations or unknown susceptibility genes." Cancer 83: 310-319.

Lovering, R., Hanson, I.M., Borden, K.L., Martin, S., O'Reilly, N.J., Evan, G.I., Rahman,

D., Pappin, D.J., Trowsdale, J., and Freemont, P.S. (1993). "Identification and

preliminary characterization of a protein motif related to the zinc finger." Proc.

Natl. Acad. Sci. U S A. 90: 2112-2116.

Lu, Y., Zi, X., Zhao, Y., Mascarenhas, D., and Pollak, M. (2001). "Insulin-like growth

factor-I receptor signaling and resistance to Trastuzumab (Herceptin)." J. Natl.

Cancer Inst. 93: 1852-1857.

Ludwig, T., Chapman, D.L., Papaioannou, V.E., and Efstratiadis, A.T. (1997). "Targeted

mutation of breast cancer susceptibility gene homologs in mice : Lethal

phenotypes Brca1, Brca2, Brca1/Brca2, Brca1/p53, and Brca2/p53 nullizygous

embryos." Genes Dev. 11: 1226-1241.

Maloney, E.K., McLaughlin, J.L., Dagdigian, N.E., Garrett, L.M., Connors, K.M., Zhou,

X.M., Blattler, W.A., Chittenden, T., and Singh, R. (2003). "An anti-insulin-like

growth factor I receptor antibody that is a potent inhibitor of cancer cell

proliferation." Can. Res. 63: 5073-5083.

Mamula, P.W., and Goldfine, I.D. (1992). "Cloning and characterization of the human

insulin-like growth factor-I receptor gene 5'-flanking region." DNA Cell Biol. 11:

43-50.

Marquis, S.T., Rajan, J.V., Wynshaw-Boris, A., Xu, J., Yin, G.-Y., Abel, K.J.,Weber,

88

B.L. and Chodosh, L.A. (1995). "The developmental pattern of BRCA1

expression implies a role in differentiation of the breast and other tissues." Nat.

Genet. 11: 17-26.

McCubrey, J.A., Steelman, L. S., Mayo, M.W., Algate, P.A., Dellow, R.A., and Kaleko,

M. (1990). "Growth-promoting effects of insulin-like growth factor I (IGF-I) on

hematopoietic cells: Overexpression of introduced IGF-I receptor abrogates IL-3

dependency of murine factor-dependent cells by a ligand-dependent mechanism."

Blood 78: 921-929.

Meza, J.E., Brzovic, P.S., King, M.C., and Klevit, R.E. (1999). "Mapping the functional

domains of BRCA1. Interaction of the ring finger domains of BRCA1 and

BARD1." J. Biol. Chem 274: 5659-5665.

Miki, Y., Swensen, J., Shattuck-Eidens, D., Futreal, P.A., Harshman, K., Tavtigian, S.,

Liu, Q., Cochran, C., Bennett, L.W., and Ding W. et al. (1994). "A strong

candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1." Science

266: 66-71.

Monteiro, A.N., August, A., and Hanafusa, H. (1996). "Evidence for a transcriptional

activation function of BRCA1 C-terminal region." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.

93: 13595-13599.

Morrione, A., DeAngelis, T., and Baserga R. (1995). "Failure of the bovine

papillomavirus to transform mouse embyro fibroblasts with a targeted disruption

of the insulin-like growth factor I receptor gene." J. Virol. 69: 5300-5303.

Moschos, S.J., and Mantzoros, C.S. (2002). "The role of the IGF system in cancer: from

basic to clinical studies and clinical applications." Oncology 63: 317-332.

Moynahan, M.E., Chiu, J.W., Koller, B.H., and Jasin, M. (1999). "Brca1 controls

89

homology-directed DNA repair." Mol Cell 4: 511-518.

Moynahan, M.E. (2002). "The cancer connection:BRCA1 and BRCA2 tumor

suppression in mice and humans." Oncogene 21: 8994-9007.

Mukhopadhyay, D., Knebelmann, B., Cohen, H.T., Ananth, S., and Sukhatme, V.P.

(1997). "The von Hippel-Lindau tumor suppressor gene product interacts with

Sp1 to repress vascular endothelial growth factor promoter activity." Mol. Cell.

Biol. 17: 5629-5639.

Neuenschwander, S., Roberts, C.T. Jr., and LeRoith,D. (1995). "Growth inhibition of

MCF-7 breast cancer cells by stable expression of insulin-like growth factor I

receptor antisense ribonucleic acid." Endocrinology 136: 4298-4303.

O'Dell, S.D. and Day, I.N. (1998). "Insulin like growth factor II (IGF-II)." Int. J.

Biochem. Cell Biol. 30: 767-771.

Ohlsson, C., Kley, N., Werner, H., and LeRoith, D. (1998). "p53 regulates IGF-I receptor

expression and IGF-I induced tyrosine phosphorylation in an osteosarcoma cell

line: interaction between p53 and Sp1." Endocrinology 139: 1101-1107.

Okada, S., and Ouchi,T. (2003). "Cell cycle differences in DNA damage-induced BRCA1

phosphorylation affect its subcellular localization." J. Biol. Chem. 278: 2015-

2020.

Ouchi, T., Monteiro, A.N.A., August, A., Aaronson, S.A. and Hanafusa, H. (1998).

"BRCA1 regulates p53-dependent gene expression." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.

95: 2302-2306.

Ouchi, T., Lee, S., Ouchi, M., Aaronson, S.A.and Horvath, C.M. (2000). "Collaboration

of signal transducer and activator of transcription 1 (STAT1) and BRCA1 in

90

differential regulation of IFN-gamma target genes." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A.

97: 5208-5213.

Papa, V., Gliozzo, B., Clark, G.M., McGuire, W.L., Moore, D., Fujita-Yamaguchi, Y.,

Vigneri, R., Goldfine, I.D., and Pezzino, V. (1993). "Insulin-like growth factor-I

receptors are overexpressed and predict a low risk in human breast cancer." Can.

Res. 53: 3736-3740.

Paterson, J.W. (1998). "BRCA1: a review of structure and putative functions." Dis.

Markers 13: 261-274.

Paull, T. T., Cortez, D., Bowers, B., Elledge, S.J., and Gellert, M. (2001). "Direct DNA

binding by Brca1." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 98: 6086-6091.

Peruzzi, F., Prisco, M., Dews, M., Salomoni, P., Grassilli, E., Romano, G., Calabretta, B.,

and Baserga, R. (1999). "Multiple signaling pathways of the insulin-like growth

factor I receptor in protection from apoptpsis." Mol. Cell. Biol. 19: 7203-7215.

Peyrat, J. P., and Bonneterre, J. (1992). "Type I IGF receptor in human breast diseases."

Breast Cancer Res. treat. 22: 59-67.

Powell-Braxton, L., Hollingshead, P., Warburton, C., Dowd, M., Pitts-Meek, S., Dalton,

D., Gillett, N., and Stewart, T.A. (1993). " IGF-I is required for normal embryonic

growth in mice." Genes Dev. 7: 2609-2617.

Rajah, R., Khare, A., Lee P.D. and Cohen P. (1999). "Insulin-like growth factor-binding

protein 3 is partially responsible for high-serum-induced apoptosis in PC-3

prostate cancer cells." J. Endocrinol. 163: 487-494.

Rauscher, F.J., III (1993). "The WT1 Wilm's Tumor gene product :a developmentally

regulated transcription factor in the kidney that functions as a tumor suppressor."

91

FASEB J. 7: 896-903.

Reiss, K., Ferber, A., Travali, S., Porcu, P., Phillips, P.D., and Baserga, R. (1991). "The

protooncogene c-myb increases the expression of insulin-like growth factor I and

insulin-like growth factor I receptor messenger RNAs by a transcriptional

mechanism." Cancer Res. 51: 5997-6000.

Resnicoff, M., Burgaud, J.L., Rotman, H.L., Abraham, D., and Baserga, R. (1995a).

"Correlation between apoptosis, tumorigenesis, and levels of insulin-like growth

factor I receptors." Cancer Res. 55: 3739-3741.

Resnicoff, M., Abraham, D., Yutanawiboonchai, W., Rotman, H.L., Kajstura, J., Rubin,

R., Zoltick, P., and Baserga, R. (1995b). "The insulin-like growth factor I receptor

protects tumor cells from apoptosis in vivo." Cancer Res. 55: 2463-2469.

Rice, J.C., Massey-Brown, K.S., and Futscher, B.W. (1998). "Aberrant methylation of

the BRCA1 CpG island promoter is associated with decreased mRNA in sporadic

breast cancer cells." Oncogene 17: 1807-1812.

Roberts, C.T. Jr., Brown, A.L., Graham, D.E., Seeling S., Berry S., Gabbay K.H. and

Rechler M.M. (1986). "Growth hormone regulates the abundance of insulin-like

growth factor I RNA in adult rat liver." J. Biol. Chem. 261: 10025-10028.

Rotwein, P., Pollock, K. M., Didier, D.K., and Krivi, G.G. (1986). "Organization and

sequence of the human insulin-like growth factor I gene. Alternative RNA

processing produces two insulin-like growth factor I precursor peptides." J. Biol.

Chem. 261: 4828-4832.

Rubin, R., and Baserga, R (1995). " Insulin like growth factor-I receptor." Lab. Invest.

73: 311-331.

92

Rubini, M., Werner, H., Gandini, E., Roberts, C.T., Jr., LeRoith, D., and Baserga, R..

(1994). "Platelet-derived growth factor increases the activity of the promoter of

the insulin-like growth factor-1 (IGF-1) receptor gene." Exp. Cell Res. 211: 374-

379.

Rubini, M., Hongo, A., D'Ambrosio, C., and Baserga, R. (1997). "The IGF-I receptor in

mitogenesis and transformation of mouse embryo cells: role of receptor number."

Exp. Cell Res. 230: 284-292.

Ruffner, H., and Verma, I.M. (1997). "BRCA1 is a cell cycle-regulated nuclear

phosphoprotein." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94: 7138-7143.

Saffer, J.D., Jackson, S.P., and Annarella, M. B. (1991). "Developmental expression of

Sp1 in the mouse." Mol. Cell Biol. 11: 2189-2199.

Scheidegger, K.J., Cenni, B., Picard, D., and Delafontaine, P. (2000). "Estradiol

decreases IGF-1 and IGF-1 receptor expression in rat aortic smooth muscle cells."

j. Biol. Chem. 275: 38921-38928.

Schlegel, B.P., Green, V.J., Ladias, J.A A., and Parvin, J.D. (2000). "BRCA1 interaction

with RNA polymerase II reveals a role for hRPB2 and hRPB10alpha in activated

transcription." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 97: 3148-3153.

Schnarr, B., Strunz, K., Ohsam, J., Benner, A., Nacker, J., and Mayer, D. (2000). "Down

regulation of insulin like growth factor-I receptor and insulin receptor substrate-I

expression in advanced human breast cancer." Int. J. Cancer 89: 506-513.

Schwander, J.C., Hauri, C., Zapf, J. and Froesch, E.R. (1983). "Synthesis and secretion of

insulin-like growth factor and its binding protein by the perfused rat liver."

Endocrinology 113: 297-305.

93

Scully, R., Anderson, S.F., Chao, D.M., Wei, W., Ye, L., Young, R.A., Livingston, D.M.,

and Parvin, J.D. (1997). "BRCA1 is a component of the RNA polymerase II

holoenzyme." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 94: 5605-5610.

Scully, R., Chen,J., Plug, A., Xiao, Y., Weaver, D., Feunteun, J., Ashley, T., and

Livingston, D.M. (1997a). "Association of BRCA1 with Rad51 in mitotic and

meiotic cells." Cell 88: 265-275.

Scully, R., Chen, J., Ochs, R.L., Keegan, K., Hoekstra, M., Feunteun, J., and Livingston,

D.M. (1997b). "Dynamic changes of BRCA1 subnuclear location and

phosphorylation state are initiated by DNA damage." Cell 90: 425-436.

Scully, R., Ganesan, S., Viasakova, K., Chen, J.,Socolovsky, M., and Livingston, D.M.

(1999). "Genetic analysis of BRCA1 function in a defined tumor cell line." Mol.

Cell 4: 1093-1099.

Sell, C., Rubini, M., Rubin, R., Liu, J.P., Efstratiadis, A., and Baserga, R. (1993).

"Simian virus 40 large tumor antigen is unable to transform mouse embryonic

fibroblast lacking type I insulin-like growth factor receptor." Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 90: 11219-11221.

Sell, C., Baserga, R. and Rubin, R. (1995). "Insulin-like growth factor I (IGF-I) and the

IGF-I receptor prevent etoposide-induced apoptosis." Cancer Res. 55: 303-306.

Sepp-Lorenzino, L. (1998). "Structure and function of the insulin-like growth factor I

receptor." Cancer Res. Treatment 47: 235-253.

Seto, E., Usheva, A., Zambetti, G.P., Momand, J., Horkioshi, N., Weinmamm, R., Levine

,A.J., and Shenk, T. (1992). "Wild-type p53 binds to TATA-binding protein and

represses transcription." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 89: 12028-12032.

94

Shimasaki, S., and Ling, N. (1991). "Identification and molecular characterization of

insulin-like growth factor binding proteins (IGFBP-1, -2, -3, -4, -5 and -6)." Prog.

Growth Factor Res. 3: 243-266.

Sorlie, T., Andersen, T.I., Bukholm, I., and Borresen-Dale, A.L. (1998). "Mutation

screening of BRCA1 using PTT and LOH analysis at 17q21 in breast carcinomas

from familial and non-familial cases." Breast Cancer Res. Treat. 48: 259-264.

Sourvinos, G., and Spandidos, D.A. (1998). "Decreased BRCA1 expression levels may

arrest the cell cycle through activation of p53 checkpoint in human sporadic

breast tumors." Biochem. Biophys. Res. Comm. 245: 75-80.

Steller, M.A., Zou, Z., Schiller, J.T., and Beserga, R. (1996). "Transformation by human

papillomavirus-16 E6 and E7: role of the insulin-like growth factor I receptor."

Cancer Res. 56: 5087-5091.

Struewing, J.P., Abeliovich, D., Peretz, T., Avishai, N., Kaback, M.M., Collins, F.S. and

Brody, L.C. (1995). "The carrier frequency of the BRCA1 185delAG mutation is

approximately 1 percent in Ashkenazi Jewish individuals." Nat. Genet. 11: 198-

200.

Surmacz, E. (2000). "Function of the IGF-I receptor in breast cancer." J. Mammary

Gland Biol. Neoplasia 5: 95-105.

Tannenbaum, G.S., Guyda, H.J. and Posner, B.I. (1983). "Insulin like growth factors: A

role in growth hormone negative feedback and body weight regulation via brain."

Science 220: 77-79.

Tavtigian, S.V., Oliphant, A., Shattuck-Eidens, D., Bartel, P.L., Thomas, A., Frank, T.S.,

Pruss, D., and Scolnick, M.H. (1996a). "Genomic organization, functional

analysis, and mutation screening of BRCA1 and BRCA2." J. G. Fortner & P. A.

95

Sharp, eds, General Motors Cancer Research Foundation Accomplishments in

Cancer Research, Lippincott-Raven, New York and Philadelphia: 189-204.

Tavtigian, S.V., Simard, J., Rommens, J., Couch, F., Shattuck-Eidens, D., Neuhausen, S.,

Merajver, S., Thorlacius, S., Offit, K., et al. (1996b). "The complete BRCA2

gene and mutation in chromosome 13q-linked kindreds." Nat. Genet. 12: 333-337.

Thompson, M.E., Jensen, R.A., Obermiller, P.S., Page, D.L., and Holt, J.T (1995).

"Decreased expression of BRCA1 accelerates growth and is often present during

sporadic breast cancer progression." Nat. Genet. 9: 444-450.

Tomlinson, G.E., Chen, T.T., Stastny, V.A., Virmani, A.K., Spillman, M.A., Tonk, V.,

Blum, J.L., Schneider, N.R., Wistuba, I.I., Shay, J.W., Minna J.D., and Gazder,

A.P. (1998). "Characterization of a breast cancer cell line derived from a germ-

line BRCA1 mutation carrier." Cancer Res. 58: 3237-3242.

Travali, S., Reiss, K., Ferber, A., Petralia, S., Mercer, W.E., Calabretta, B., and Baserga,

R. (1991). "Constitutively expressed c-myb abrogates the requirement for insulin-

like growth factor I in 3T3 fibroblasts." Mol. Cell Biol. 11: 731-736.

Tricoli, J.V., Rall, L.B., Scott, J., Bell, G.I., and Shows, T.B. (1984). "Localization of

insulin-like growth factor genes to human chromosomes 11 and 12." Nature

(London) 310: 784-786.

Turner, B.C., Haffty, B.G., Narayanann, L., Yuan, J., Havre, P.A., Gumbs, A., Kaplan,

L., Burgaud, J.-L., Carter, D., Baserga, R., and Glazer, P.M. (1997). "Insulin like

growth factor I receptor overexpression mediates cellular radioresistance and

local breast cancer recurrence after lumpectomy and radiation." Cancer Res. 57:

3079-3083.

Ullrich, A., Gray, A., Tam, A.W., Yang-Feng, T., Tsubokawa, M., Collins,C., Henzel,

96

W., Le Bon, T., Kathuria, S., Chen, E. et al. (1986). "Insulin-like growth factor I

receptor primary structure: comparison with insulin receptor suggests structural

determinants that define functional specificity." EMBO J. 5: 2503-2512.

Valentinis, B., and Baserga, R. (2001). "IGF-I receptor signalling in transformation and

differentiation." Mol. Pathol. 54: 133-137.

Vallian, S., Chin, K.V., and Chang, K.S. (1998). "The promyelocytic leukemia protein

interacts with Sp1 and inhibits its transactivation of the epidermal growth factor

receptor promoter." Mol. Cell. Biol. 18: 7147-7156.

Vaughn, J.P., Davis, P.L., Jarboe, M.D., Huper, G., Evans, A.C., Wiseman, R.W.,

Berchuck, A., Iglehart, J.D., Futreal, P.A., and Marks, J.R. (1996). "BRCA1

expression is induced before DNA synthesis in both normal and tumor-derived

breast cells." Cell Growth Differ. 7: 711-715.

Wang, H., Shao, N., Ding, Q.M., Cui, J., Reddy, E.S., and Rao, V.N. (1997). "BRCA1

proteins are transported to the nucleus in the absence of serum and splice variants

BRCA1a, BRCA1b are tyrosine phosphoproteins that associate with E2F, cyclins

and cyclin dependent kinases." Oncogene 15: 143-157.

Wang, Q., Zhang, H., Fishel, R., and Greene, M.I. (2000). "BRCA1 and cell signaling."

Oncogene 19: 6152-6158.

Wang, Y., Cortez, D., Yazdi, P., Neff, N., Elledge, S.J., and Qin J. (2000). "BASC, a

super complex of BRCA1-associated proteins involved in the recognition and

repair of aberrant DNA structures." Genes Dev. 14: 927-939.

Welchs, P.L., Owens, K.N., and King, M.C. (2000). "Insights into the functions of

BRCA1 and BRCA2." Trends Genet. 16: 69-74.

97

Welchs, P.L., and King, M.C. (2001). "BRCA1 and BRCA2 and genetics of breast and

ovarian cancer." Human Mol. Genet. 10: 705-713.

Werner, H., Woloschak, M., Adamo, M., Shen-Orr, Z., Roberts, C.T., Jr., and LeRoith,

D. (1989). "Developmental regulation of the rat insulin-like growth factor I

receptor gene." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 86: 7451-7455.

Werner, H., Stannard, B., Bach, M.A., LeRoith, D., and Roberts, C.T., Jr. (1990).

"Cloning and characterization of the proximal promoter region of the rat insulin-

like growth factor I (IGF-I) receptor gene." Biochem. Biophys. Res. Commun.

169: 1021-1027.

Werner, H., Bach, M.A., Stannard, B., Roberts, C.T., Jr., and LeRoith, D. (1992).

"Structural and functional analysis of the insulin-like growth factor I receptor

gene promoter." Mol. Endocrinol. 6: 1545-1558.

Werner, H., Re, G. G., Drummond, I.A., Sukhatme, V.P., Rauscher, F.J., III, Sens, D.A.,

Garvin, A.J., LeRoith, D., and Roberts, C.T., Jr. (1993). "Increased expression of

the insulin-like growth factor I receptor gene, IGF1R, in Wilms tumor is

correlated with modulation of IGF1R promoter activity by the WT1 Wilms tumor

gene product." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 90: 5828-5832.

Werner, H., Rauscher, F.J., III, Sukhatme, V.P., Drummond, I.A., Roberts, C.T. Jr., and

LeRoith, D. (1994). "Transcriptional repression of the insulin-like growth factor I

receptor (IGF-I-R) gene by the tumor suppressor WT1 involves binding to

sequences both upstream and downstream of the IGF-I-R gene transcription start

site." J. Biol. Chem. 269: 12577-12582.

Werner, H., Shen-Orr, Z., Rauscher, F.J., III, Morris, J.F., Roberts, C.T., Jr., and LeRoith,

D. (1995). "Inhibition of cellular proliferation by the Wilms' tumor suppressor

WT1 is associated with suppression of insulin-like growth factor I receptor gene

98

expression." Mol. Cell Biol. 15: 3516-3522.

Werner, H., and LeRoith, D. (1996). " The role of the insulin-like growth factor system in

human cancer." Adv. Cancer Res. 68: 183-223.

Werner, H., Karnieli, E., Rauscher, F.J. III, and LeRoith, D. (1996). "Wild-type and

mutant p53 differentially regulate transcription of the insulin-like growth factor I

receptor gene." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 93: 8318-8323.

Werner, H., and LeRoith, D. (1997). "The insulin-like growth factor-I receptor signaling

pathways are important for tumorigenesis and inhibition of apoptosis." Crit. Rev.

Oncog. 8: 71-92.

Werner, H. (1999). "The IGF system: molecular biology, physiology and clinical

application." In: The IGF system. Rosenfeld, R. G., and Roberts, C.T., Jr, eds.

Humana Press, Totowa, New Jersey: 63-88.

Werner, H., and Roberts, C.T. Jr. (2003). "The IGFI receptor gene: A molecular target for

disrupted transcription factor." Genes Chromosomes Cancer 36: 113-120.

Wooster, R., Neuhausen, S.L., Mangion, J., Quirk, Y., Ford, D., Collins, N., Nguyen,K.,

Seal, S., Tran, T. et al. (1994). "Localization of breast cancer susceptibility gene,

BRCA2 to chromosome 13q12-13." Science 265: 2088-2090.

Wooster, R., Bignell, G., Lancaster, J., Swift, S., Seal ,S., Mangion, J., Collins, N.,

Gregory, S., Gumbs, C., Micklem, G., et al. (1995). "Identification of breast

cancer susceptibility gene BRCA2." Nature 378: 789-792.

Wu, X., Fan, Z., Masui, H., Rosen, N., and Mendelsohn, J. (1995). "Apoptosis induced

by an anti-epidermal growth factor receptor monoclonal antibody in a human

colorectal carcinoma cell line and its delay by insulin." J. Clin. Invest. 95: 1897-

99

1905.

Xia, Y., Pao, G.M., Chen, H., Verma, I.M., and Hunter, T. (2002). "Enhancement of

BRCA1 E3 ubiqutin ligase activity through direct interaction with the BARD1

protein." J. Biol. Chem 278: 5255-5263.

Xu, C.F., Chambers, J.A., Nicolai, H., Bown, M.A., Hujeirai, Y., Mohammed,

S.,Hodgson, S., Kelsell, D.P., Spurr ,N.K., Bishop, D.T., and Solomon, E. (1997).

"Mutations and alternative splicing of the BRCA1 gene in UK breast/ovarian

cancer families." Genes Chromosomes Cancer 18: 102-110.

Xu, X. Weaver, Z., Linke, S.P., Li, C., Gotay, J., Wang, X.W., Harris, C.C., Ried, T.,

Deng, C.X. (1999). "Centrosome amplification and a defective G2-M cell cycle

checkpoint induce genetic instability in BRCA1 exon 11 isoform-deficient cells."

Mol. Cell 3: 389-395.

Yarden, R. I., and Brody, L.C. (1999). "BRCA1 interacts with components of the histone

deacetylase complex." Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 96: 4983-4988.

Yarden, R.I., Pardo-Reoyo, S., Sgagias, M., Cowan, K.H., and Brody, L.C. (2002).

"BRCA1 regulates the G2/M checkpoint by activating Chk1 kinase upon DNA

damage." Nat. Genet. 30: 285-289.

Yee, D. (1994). "The insulin-like growth factor system as target in breast cancer." Breast

Cancer Res. Treat. 32: 85-95.

Zapf, J. (1995). " Physiological role of the insulin like growth factor binding proteins."

Eur. J. Endocrinol. 132: 645-654.

Zhang, H., Somasundaram, K., Peng, Y., Tian, H., Zhang, H., Bi, D., Weber, B.L. and El-

Deiry, W. (1998). "BRCA1 physically associates with p53 and stimulates its

100

transcripitional activity." Oncogene 16: 1713-1721.

Zhong, Q., Chen, C.F., Li, S., Chen, Y., Wang, C.C., Xiao, J., Chen, P.L., Sharp, Z.D.,

and Lee, W.H. (1999). "Association of BRCA1 with the hRad50-hMre11-p95

complex and the DNA damage response." Science 285: 747-750.

101

Table of content

Table of figures I

Table of abbreviations II

Abstract VI

1. Introduction 1

1.1. The Insulin like Growth Factor (IGF) system 1

1.1.1 The IGF system components 1

1.1.2. The ligands 1

1.1.3. IGF-I 2

1.1.4. IGF-II 2

1.1.5. IGF receptors 3

1.1.6. IGF binding proteins 4

1.2. Insulin like growth factor I receptor 5

1.3. IGF-IR activation mechanisms and signal transduction 7

1.4. IGF-I receptor and cell cycle 7

1.5. IGF-I receptor and apoptosis 8

1.6. IGF-I receptor and transformation 9

1.7. The IGF-I receptor gene promoter 10

1.7.1. Factors affecting the IGF-IR promoter 11

1.8. The connection between breast cancer and the IGF system 14

1.9. BRCA1, the breast and ovarian cancer susceptibility gene 16

1.10. BRCA1, hereditary cancer and tumor suppression 18

1.11. BRCA1 and sporadic breast cancer 19

1.12. BRCA1 structure and function 20

1.12.1. BRCA1 and DNA damage repair mechanisms 22

1.12.2. BRCA1 and regulation of cell cycle 24

1.12.3. BRCA1 as a transcription factor 25

1.12.4. BRCA1 and chromosome segregation 26

2. Research objectives 27

2.1. Specific goals 27

2.2. Research importance 27

3. Materials and methods 28

3.1. Tissue culture 28

3.1.1. Cell cultures 28

3.1.2. Mediums and conditions 28

3.2. Plasmids production 29

3.3. Plasmids and transfections 30

3.3.1. Transient transfection in breast cancer-derived cell lines 31

3.3.2. Transient transfection in the Saos-2 cell line 32

3.3.3. Transient transfection in the Drosophila Schneider cell line 33

3.3.4. Transient transfection in the HCT 116 cell line 33

3.3.5. Luciferase activation analysis 34

3.3.6. Normalization of the transfection results 34

3.3.7. Statistical analysis of transfection results 35

3.4. Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) 35

3.4.1. In vitro transcription/translation of BRCA1 protein 35

3.4.2. Preparation of a double stranded oligonucleotide 36

3.4.3. Preparation of a DNA fragment encompassing the initiator

element 37

3.4.4. De-phosphorylation of the –40/+115 fragment of the IGF-IR 38

3.4.5. Phosphorylation of the probe 38

3.4.6. EMSA experiments 39

3.5. Co-immunoprecipitation and Western blotting 40

3.5.1. Samples preparation 40

3.5.2. Total protein measurements 41

3.5.3. Proteins separation by SDS-PAGE, western blotting and

detection 41

3.5.4. Antibodies 43

3.6. GST-pulldown 43

3.6.1. GST-BRCA1 fragments production 43

3.6.2. Fragments separation by SDS-PAGE 45

3.6.3. Binding of the GST-BRCA1 fragments to Glutathione sepharose 45

3.6.4. Transient transfection in the Drosophila Schneider cell line 46

3.6.5. Association assays between BRCA1 fragments and Sp1 46

3.6.6. Antibodies 47

4. Results 48

4.1. IGF-IR promoter regulation by BRCA1 48

4.2. Deletion analysis of the IGF-IR promoter 54

4.3. Potential functional interactions between BRCA1 and Sp1 in regulation

of the IGF-IR gene 57

4.4. Detection of potential interactions between BRCA1 and Sp1 by EMSA

analysis 58

4.5. Detection of physical interaction between BRCA1 and Sp1 63

4.6. Identification of the Sp1-binding region of BRCA1 65

4.7. IGF-IR promoter regulation by BRCA1 ∆ 11 67

4.8. Functional interactions between BRCA1 and p53 in regulation of

IGF-IR promoter 68

4.9. The effect of p53 background on BRCA1 action 69

4.10. Physical interaction between BRCA1 and p53 71

5. Discussion 73

6. Bibliography 80

Abstract

The Insulin-like Growth Factor I Receptor (IGF-IR) is expressed in most tissues and

plays a critical role in normal growth and differentiation in mammals. The absolute

requirement for IGF-IR action in normal growth and development is graphically

illustrated by the severe growth retardation and perinatal lethality exhibited by

homozygous IGF-IR knockout mice.

The IGF-IR promoter is extremely G-C rich and lacks CAAT or TATA motifs,

two control elements that are usually required for efficient transcription initiation of most

eukaryotic genes. The transcription is initiated from a unique "initiator" motif, a defined

promoter element that directs specific transcription initiation in genes that regulate

differentiation and development. The transcription initiation site of the human IGF-IR

gene is located 1 Kb upstream of the translation start codon (ATG), therefore creating an

extremely long 5’untranslated region. The IGF-IR promoter contains multiple binding

sites for transcription factor Sp1, a zinc finger protein that strongly activates the IGF-IR

promoter.

IGFs, acting through the IGF-IR, have an important role in normal mammary

gland growth and morphogenesis, as well as in mammary tumorigenesis. Most breast

tumors and cancer-derived cell lines express very high levels of IGF-IR mRNA and

protein, while suppression of the IGF-IR by specific antibodies or antisense oligomers

blocked IGF-IR stimulated cellular proliferation, thus demonstrating that there is a basic

requirement for IGF-IR action in breast tumorigensis.

The BRCA1 gene encodes a 220-kDa phosphorylated transcription factor whose

mutation was correlated with the appearance of breast and ovarian cancer at very young

ages. The BRCA1 polypeptide participates in multiple biological pathways, including

gene transcription, DNA damage repair and genomic stability, cell growth and apoptosis.

Evidence in favor of a tumor suppressor role for BRCA1 was provided by studies

showing that transfer of BRCA1 arrested growth of breast and ovarian cancer cell lines.

Furthermore, antisense oligomers against BRCA1 mRNA accelerated the growth of

normal and malignant cells and induced transformation of NIH3T3 cells.

In view of the tumor suppressor activity of BRCA1 and because the IGF-IR is

highly overexpressed in most breast cancers, we postulated that the IGF-IR gene may

constitute a molecular target for BRCA1 action. Thus, our main goal was to investigate

the potential regulation of IGF-IR gene expression by BRCA1.

In order to assess the transcriptional effect of BRCA1 on IGF-IR promoter

activity, transient transfection methods were used in different cell lines. The

p(-476/+640)LUC IGF-IR promoter/luciferase reporter plasmid, containing 476 bp of

5'-flanking and 640 bp of 5'-untranslated regions of the IGF-IR gene, was used in

transfection assays together with an expression vector encoding BRCA1. For

normalization purposes, cells were cotransfected with a β-galactosidase expression

plasmid. As a negative control, we used the pcDNA3 empty vector.

The results obtained demonstrated that BRCA1 repressed the activity of co-

transfected IGF-IR promoter in a number of breast cancer-derived cell lines by ~42-45%.

Furthermore, BRCA1 repressed IGF-IR promoter activity in an osteosarcoma cell line,

Saos-2, in a dose-dependent manner. These findings were also supported by the results of

experiments demonstrating that co-transfection of MCF7 cells with a vector encoding a

truncated BRCA1 mutant (185delAG) had a reduced effect on IGF-IR promoter activity.

Since we found that the IGF-IR promoter region responsible for the BRCA1

repression activity was located between nucleotide -476 to nucleotide –188, and since

this region contains multiple binding sites for transcription factor Sp1, we investigated

the potential functional interactions between BRCA1 and Sp1 in transcriptional

regulation of the IGF-IR gene. We showed that BRCA1 suppressed 45% of the Sp1-

induced transactivation of the IGF-IR gene in Sp1-null Drosophila Schneider cells. The

finding that BRCA1 repressed the promoter activity induced by Sp1 lead to the

assumption that two alternative mechanisms may be responsible for these results. Either

BRCA1 protein interacts with the IGF-IR promoter sequence and interferes with Sp1

binding to the consensus sites located in the promoter or BRCA1 protein interacts with

Sp1 and therefore abolishes the interaction between Sp1 and the IGF-IR promoter. In

order to determine the mechanism, Electrophoretic mobility shift assays (EMSA) were

performed using the full-length in vitro translated BRCA1 protein. BRCA1, in itself, did

not exhibit any specific binding, although it prevented binding of Sp1 to IGF-IR promoter

GC boxes and to the "initiator" element in a dose-dependent manner.

Co-immunoprecipitation experiments demonstrated that the inhibitory action of

BRCA1 was associated with specific interaction with Sp1 protein. Furthermore, using a

series of GST-tagged BRCA1 fragments encompassing the entire BRCA1 sequence, we

were able to map the Sp1-binding domain to a segment located between aa 260-802.

These findings were also confirmed by the results of experiments demonstrating

that co-transfection of MCF7 cells with a vector encoding a mutant BRCA1 (BRCA1

∆11) had a reduced effect on IGF-IR promoter activity compared to the wild type

BRCA1 that significantly suppressed IGF-IR promoter activity.

Because the transcription of the IGF-IR gene has been previously shown to be

negatively regulated by tumor suppressor p53, we decided to assess the potential

functional interactions between BRCA1 and p53 in transcriptional control of the IGF-IR

gene. For this purpose, co-transfections were performed in MCF-7 breast cancer cells

using an IGF-IR promoter luciferase reporter construct together with expression vectors

encoding BRCA1 and wild-type and mutant p53. Similar experiments were performed in

the colorectal cancer cell line HCT116 +/+, which expresses a wild-type p53 gene, and its

HCT116 -/- derivative, lacking p53. BRCA1 was able to suppress IGF-IR promoter

activity both in the absence and presence of p53. However, BRCA1 had no effect in

mutant p53-expressing cells. Co-immunoprecipitation experiments showed that BRCA1

and p53 physically interact.

In summary, our data suggests that the IGF-IR gene is a novel downstream target

for BRCA1 action. Transcriptional suppression of the IGF-IR promoter by BRCA1

involves physical interaction with Sp1, thus preventing this potent transactivator from

binding to, and stimulating expression of, the IGF-IR gene. Moreover, the tumor

suppressor activity of BRCA1 depends on the cellular status of p53. Inability of mutant

tumor suppressors to repress IGF-IR gene expression may result in increased activation

of cell-surface receptor by circulating or locally produced IGFs leading to a reduction in

apoptosis and enhanced survival capacity of malignant cells.