Aline LemesFernanda Aquino
Marília GomesViviane Pessin
Inflamação das glândulas mamárias Prejuízos econômicos:1. Queda na produção2. Queda na qualidade3. Perda de teto4. Descarte de animais5. custos com drogas, veterinário e mão de obra
Perda mundial 35 bilhões $/ano Atividade leiteira
Multifatorial1. Trauma2. Irritação química3. Infecção microbiana
Predomínio de Staphilococcus e Streptococcus
Tipos: sub clínica ou clínica
Clínica Sub clínica
IRRITAÇÃOPERSISTENTE
III
PERDA DO EPITÉLIO
SECRETOR
Patógenos contagiosos:1. Contaminam os quartos – ordenha2. S. agalacteae, S. aureus, Corynebacterium
bovis
Patógenos ambientais:1. Fezes, cama, solo, represas...2. E. coli, S. dysgalacteae, S. uberis
S. aureus, S. agalacteae, S. dysgalacteae, S. uberis90 – 95% dos casos
Etiológico é fundamental1. Rápido2. Barato3. Eficiente
Análise fenotípica:Expressão de fatores biológicos celulares – produção
de enzima, utilização de nutrientes, metabolismo, susceptibilidade aos agentes químicos
Análise genotípicaDetectam variações no DNA, normalmente estáveis e
pouco afetadas pelas condições ambientais – identifica espécie, virulência, transmissão e fonte de infecção
Bacteriológico1. Caro2. Ineficiente3. Baixa sensibilidade4. Cultura bacteriológica lenta5. Isolamento e identificação6. Técnicas bioquímicas
Vacas sub clinicamente infectadas podem eliminar intermitentemente o patógeno
Cultura negativa por resíduos de antibióticos
ETIOLÓGICOBacteriológico
Staphylococcus aureusStaphylococcus aureus resistente à
meticilinaStreptococcus
MOLECULAR PCR Multiplex PCR Ribotipagem Detecção de microrganismos no leite
Local: EV – DMP – UFMG
Doações da Embrapa Gado de Leite, Universidade Federal de Lavras e Hospital das Clínicas da UFMG
As amostras foram mantidas em caldo BHI (Brain Heart Infusion Broth Acumedia Manufacters) com 50% de glicerol a -20ºC até o momento do uso.
Plano de execução do experimento
PCR – Primer – amplifica segmentos específicos
Extração de DNA1. Preparação da amostra: retira cálcio, principal
inibidor da PCR no leite
2. Extração: retira o DNA
3. Purificação do DNA: retira proteínas e debris celulares através do protocolo de Fenol-Clorofórmio
Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura
Extração de DNA a partir de amostras de bactérias de referência em leite artificialmente contaminadas
Extração de DNA a partir de amostras de leite de tanque de expansão
Padronização das PCRs Individual
Multiplex
Ambas com DNA obtido a partir de amostras de bactérias de referência em cultura pura
PCR Multiplex para detecção de microrganismos a partir das amostras de leite de tanque de expansão
Avaliação da especificidade verificada:
Utilizando Streptococcus bovis, Staphylococcus intermedius e S. epidermidis, comumente encontradas no leite
Especificidade dos Primers
Bandas de DNA esperadas para cada microorganismo
Exceto, S.aureus em que se observou 3 bandas com predomínio de 900pb na maioria
Figura 1: Fragmentos de DNA amplificados por PCR a partir de culturas puras de S. aureus e Streptococcus spp.
Sensibilidade do PCR a partir de culturas puras
PCR Individual 10pg de DNA
PCR multiplex 500pg de DNA
S. uberis, S. agalactiae, S. dysgalactiae e S. aureus
MRSA 250pg de DNA
Sensibilidade da PCR a partir de amostras do leite
PCR individual 10²UFC/mL
PCR multiples 10³UFC/mL
Figura 2. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. agalactiae (270 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 3. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. dysgalactiae (264 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 4. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. uberis (330 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 5. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de S. aureus (900 pb, 420 pb, 200 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 6. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de concentrações seriadas de MRSA (533 pb), visualizados em gel de agarose 2%.
Testes em amostras de leite de tanque de expansão
Nas figuras e na tabela a seguir se encontram os resultados obtidos das 30 amostras de tanque de expansão.
Não foi observada interferência do azidiol presente na amostra.
Figura 7. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 8. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
Figura 9. Produtos de mPCR obtidos com DNA extraído a partir de leite de tanque de expansão, visualizados em gel de agarose 2%.
Tabela 1. Utilização da PCR multiplex para detecção de microrganismos em leite bovino com diferentes contagens bacterianas totais e contagens de células somáticas, diretamente do tanque de expansão.
Teste diagnóstico
Controlar e erradicar doenças
OBJETIVO
Para garantia de sucesso, temos como característica impressindível a Sensibilidade
Desenvolvimento de métodos rápidos e sensíveis para a diferenciação de microorganismos
Com isso, metódos genotípicos substituem métodos fenotípicos
Métodos fenotípicos Métodos genotípicos
Falso negativo Rápida e acurada identificação
Valores ambientais interferem
Não tem interferência do meio (genoma)
Baixa reprodutibilidade Vantagem da reprodutibilidade
Baseia em características instáveis dos microorganismos
Rapidez Sensibilidade Reprodutibilidade
A caseína é um dos principais inibidores presentes no leite, em associção com cálcio forma micelos
Adição de solução com alta concentração de EDTA quelam (eliminam os metais tóxicos) o cálcio dissolvendo os micelos de caseína
No experimento usou-se o tampão NET (alta [EDTA])
No trabalho realizado utilizou-se bactérias Gram-positivas
parece celular mais resistenteparece celular mais resistente
O método de extração para DNA dessas bactérias na amostra apresentada mostrou-se:
Eficiente Fácil realização Reagentes econômicos Equipamentos sofisticados não foram requeridos Pouca manipulação da amostra Tempo de análise de processo
aproximadamente 8 horas
Pré dipping e pós dipping
Terapia da vaca seca
Tratamento eficaz e eficiente
Descarte de animais crônicos
Manutenção regular da ordenhadeira mecânica
Marisa Araújo Silva. Utilização de PCR multiplex para o diagnóstico etiológico da mastite bovina. Dissertação de mestrado UFMG. 2008.