Download ppt - Phan tich tetrecyline

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠOTRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM TETRACYCLINES TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP

KHỐI PHỔ (LG/MS/MS)

XÁC ĐỊNH HÀM LƯỢNG NHÓM TETRACYCLINES TRONG THỦY SẢN VÀ SẢN PHẨM THỦY SẢN BẰNG SẮC KÝ LỎNG GHÉP

KHỐI PHỔ (LG/MS/MS)

Đề tài:

CÁN BỘ HƯỚNG DẪNTS. Nguyễn Thị Thu Thủy

SINH VIÊN THỰC HIỆNDương Nhựt MSHV: M2014007Nguyễn Hữu Trứ MSHV: M2014010Bùi Thúy Vy MSHV: M2014011

BÁO CÁO SEMINAR

Xác định hàm lượng nhóm Tetracyclines trong thủy

sản và sản phẩm thủy sản tại Thành Phố Cần Thơ

Mục tiêu:

Nội dung báo cáoNội dung báo cáo

Giới thiệu

Phương Pháp Phân Tích

Đánh Giá Kết Quả Phân Tích

Tài Liệu Tham Khảo

1.1. Sơ lược về kháng sinh nhóm Tetracyclines

Tetracyclines là nhóm kháng sinh có phổ kháng khuẩn rộng, có khả năng kháng các loài vi khuẩn

gây bệnh trên thủy sản

Sử dụng trong thời gian lâu dài làm cho vi khuẩn lờn thuốc làm ảnh hưởng nghiêm trọng đến hệ

miễn dịch của thủy sản,

1. GIỚI THIỆU

Ảnh hưởng xấu đến sức khỏe người tiêu dùng gây ra nhiều bệnh về thận, dị tật bẩm sinh và các

bệnh về xương,...







Kháng sinh nhóm tetracyclin bao gồm 3 kháng sinh chính sau: tetracyclin (gọi tắt là TC), oxytetracyclin (gọi tắt là OTC) và clortetracyclin (gọi tắt là CTC).


1. GIỚI THIỆU

Tetracycline


1. GIỚI THIỆU

Oxytetracyclin


1. GIỚI THIỆU

Chlortetracyclin

1.2. Tác hại của Tetracyclines 1. GIỚI THIỆU

Ảnh Hưởng Tới Đường Tiêu Hóa:

+ Thường gặp như ăn mất ngon, buồn nôn, chứng nóng rát dạ dày.

+ Bội nhiễm nấm Candida albicans phải chữa trị với nystatin.

+ Viêm ruột do staphylocoque: thường nặng ở người già và trẻ em.


Ảnh Hưởng Tới Gan:

+ Hiếm gặp nhưng rất nặng là thoái hóa mỡ gan do dùng liều cao và theo đường tĩnh mạch.

+ Ở bệnh nhân có thai 3 tháng cuối hoặc sau khi sinh con.

+ Ở người suy thận.


Ảnh Hưởng tới thận:

+ Làm nặng thêm bệnh suy thận đã có từ trước.

+ Viêm gan - thận trong tình trạng thoái hóa mỡ của gan.

+ Gây tổn thương ống thận.


Ảnh Hưởng Tới Răng:

+ Làm hỏng men răng, hỏng chất xương của răng dẫn đến dễ bị sâu răng ở trẻ em

2. Phương Pháp Phân Tích

11 Phạm Vi Áp Dụng

22 Nguyên Tắc

33Quy Trình Phân Tích

44Thông Số Chạy Máy

2.1. Phạm vi áp dụng

Phương pháp này mô tả cách xác định hàm lượng nhóm tetracyclines (TCs) có trong thủy sản và sản phẩm thủy sản bằng sắc ký lỏng ghép phổ (LC/MS/MS). Giới hạn phát hiện của phương pháp là 10ppb.


2.2. Nguyên Tắc


TCs được chiết tách từ mẫu thủy sản bằng đệm McIlvaine-EDTA, dịch chiết được làm sạch bằng cách cho qua cột chiết pha rắn C18. Cô dịch chiết đến khô, cặn khô được hòa tan trong hỗn hợp MeOH:H2O (50:50). Hàm lượng TCs được xác định bằng máy LC/MS/MS với giới hạn phát hiện là 10ppb.

2.3. Quy Trình Phân Tích


Chuẩn bị mẫu:

Chuẩn bị mẫu thử

Chuẩn bị mẫu trắng

Chuẩn bị mẫu kiểm soát (QC)

Dựng đường chuẩn

+ Nghiền ít nhất 200g mẫu, đựng trong túi PE bảo quản trong tủ đông cho tới khi phân tích (đối với mẫu thủy sản khô dùng kéo cắt nhỏ và trộn đều).

+ Cân 2g ± 0.05g mẫu đã được nghiền vào ống ly tâm nhựa 15ml.

+ Cân 2g ± 0.05g mẫu thủy sản không chứa TCs vào ống ly tâm nhựa 15ml.

+ Tiến hành chiết mẫu trắng giống như mẫu thử.

+ Cân 2g ± 0.05g mẫu thủy sản không chứa TCs vào ống ly tâm 15ml thêm 40µl dung dịch chuẩn 1ppm.

+ Tiến hành giống như mẫu thử.

+ Cân 2g ± 0.05g mẫu trắng lần lượt vào các ống S1, S2, S3, S4, S5 đã được mã hóa trước.

+ Thêm lần lượt dung dịch chuẩn vào các ống theo thứ tự như bảng sau:

Số thứ tựThể tích (µl)

TCs 1ppmNồng độ TCs

trong mẫu (ppb)

S1 20 10

S2 40 20

S3 100 50

S4 160 80

S5 200 100

2.2. Quy Trình Phân Tích2. Phương Pháp Phân Tích

Nghiền mẫu Cân Mẫu Chiết

Giải Hấp (10 ml dd 10mM A.Oxalic trong MeOH)

Làm Sạch (Bằng cột Strata C18 500mg/6ml)

Thổi Khô (N2, 400C) Hòa Tan (1ml MeOH:H2O (50:50))

Lọc (BK 0.2µm)Vial – LC/MS/MS

Lần 1:

+ 8 ml đệm Mcllvaine-ADTA (PH = 4).

+ Vortex 1 phút, lắc 15 phút với tốc độ 450 vòng/phút.

+ Ly tâm mẫu 4000 vòng/phút trong 5 phút, ở 40C.

+ Hút lớp trên cho vào ống nghiệm nhựa 15ml khác.

Lần 2: Phần cặn được chiết lần hai với 7ml đệm McIlvaine-EDTA (pH=4) tương tự như lần một.

+ Hút lớp trên cho vào ống nghiệm nhựa 15ml trên.

+ Ly tâm dịch chiết 4000 vòng/phút trong 10 phút,40C.

HOẠT HÓA CỘT

+ 2 ml MeOH

+ 2ml H2O

Chú ý: không để cột bị khô+ Cho dịch chiết qua cột chiết pha rắn C18, tốc độ chảy khoảng 1ml/phút.

+ Sau khi mẫu chảy xuống hết rửa cột bằng 2ml nước HPLC.

Chú ý: Phải làm cho cột khô hết nước.

2.4. Thông số cài đặt trên LC/MS/MS


Cài đặt thông số cho LC:

Pha động A: ACN 0.3% FA.

Pha động B: H2O 0.3% FA.

Thể tích tiêm 10µl.

HPLC Agilent 1200.

Cột: ZORBAX Eclipse XDB, 4.6 x 150mm, 5µm.

Cột và tỉ lệ pha động thay đổi nếu cần.

Nhiệt độ cột: 350C.

Time Flow rate %A %B

Initial 0.2 10 90

0 0.2 10 90

4 0.2 50 50

8 0.2 80 20

8.5 0.2 30 70

12 0.2 10 90

20 0.2 10 90



Cài đặt thông số cho MS:

Agilent 6410 LC/MS/MS

Source ESI+

Gas temp (oC) 350

Gas flow (l/min) 9

Nebulizer (psi) 35

Capillary positive (V) 3500

Capillary negative (V 3500

MS1 Heater (oC) 100

MS2 Heater (oC) 100



Điều kiện phân mảnh MS/MS:

ComponentPrecursor ion (m/z)

Product ion (m/z)

Dwell time (s)

Fragmentor(V)

Collision energy (eV)

TC445445

428410

0.20.2

100100

1715

OTC461461

426444

0.20.2

100100

1825

CTC479479

461.8444

0.20.2

100100

1715



Thứ tự tiêm mẫu:

Mẫu chuẩn để xây dựng đường chuẩn

Mẫu trắng

Mẫu thử

Mẫu kiểm soát

Chất cần phân tích được khẳng định là hiện diện khi: Yêu cầu về thời gian lưu Mức dung sai cường độ ion tương đối,… (đáp ứng theo chỉ thị 2002/657/EC của cộng đồng Châu Âu.)

2. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ

2.1. Định Tính

Mức dung sai tối đa cho phép của các cường độ ion tương đối:

Cường độ tương đối (% của peak cơ sở) LC-MS, LC-MSn ( tương đối)

>50% ±20%

>20 đến 50% ±25%

>10 đến 20% ±30%

≤ 10% ±50%


2.2. Định Lượng

Hệ số hồi qui tuyến tính của đường chuẩn: R2≥0.99

Không có peak nhiễu ở thời gian lưu của nhóm TCs

Tỉ lệ tín hiệu/nhiễu của các ion thứ cấp trong mẫu phải ≥3:1

Độ thu hồi từ 60% đến 100%


2.3. Tính Toán Kết Quả

Tính tỉ số ion theo phương trình:

1

2

100%A

RA

Trong đó:R : tỉ số ion (%)A1: Diện tích của peak ion thứ cấp có cường độ

caoA2: Diện tích của peak ion thứ cấp có cường độ

thấpHệ số pha loãng n: v

mn

Trong đó: m: khối lượng mẫu v: thể tích cuối cùng

Tính hàm lượng chất cần phân tích trong mẫu kiểm dựa theo hệ số tín hiệu của từng mẫu phân tích và đường chuẩn, kết quả nhân với hệ số pha loãng tính theo đơn vị µg/Kg với 2 số thập phân.

4. TÀI LIỆU THAM KHẢO

1/ AOAC Official Method 995.09 2005

2/ Analysis of tetracyclines by HPLC of Agilent.

3/ 28TCVN 177:2002

4/ Rapid determination of residues of 4 Tetracyclines in meat by a Microbiological screening, HPLC and LC/MS/MS;

5/ High-throughput analysis of Tetracycline and Peniciclin antibiotics in animal tissues using electrospray tandem mass spectrometry with selectd reaction monitoring transition;

6/ Official Joural of the European Communities, Commission decision (2002/657/EC);

7/ Qualitative Identification of Tetracyclines, United States Department of Agriculture Food Safety and Inspection Service- Office of Public Health Science, 12/2007.

XIN CHÂN THÀNH CẢM ƠN

2.1. Quy Trình Phân Tích


Nghiền mẫu Cân Mẫu Chiết

Giải Hấp (10 ml dd 10mM A.Oxalic trong MeOH)

Làm Sạch (Bằng cột Strata C18 500mg/6ml)

Thổi Khô (N2, 400C) Hòa Tan (1ml MeOH:H2O (50:50))

Lọc (BK 0.2µm)Vial – LC/MS/MS