PITESTI - ROMANIA

PLAN SECTORIAL– ADER 2020Contractor:INSTITUTUL DE CERCETARE DEZVOLTARE PENTRU POMICULTURĂ PITEŞTI-MĂRĂCINENI

Obiectivul general: 2 STCPM

Numărul /codul proiectului 31/ADER 2.2.7.

Contract: 227/27. 10. 2011

Anul începerii: 01.11. 2011Anul finalizării: 10.12. 2014Durata: 37,5 luni

Denumirea proiectului:ADER 2.2.7- Tehnici de producere şi menţinere a materialului săditor

pomicol din categoriile biologice candidat, prebază şi bază

Persoana de contact:Dr. ing. ISAC VALENTINA

Date contact:Tel: 0040-248-278066; Fax: 0040-248-278477; v_isac2002@yahoo.com

31/ADER 2.2.7.Obiectivul general 2 STCPM:Perfecţionarea sistemelor şi tehnologiilor de cultura a

plantelor în vederea asigurării sustenabilităţii fermelorcomerciale în contextul creşterii performanţelor demediu

Obiectivul specific 2.2 ADERVerigi tehnologice/ tehnologii inovative de cultură a

plantelor care să asigure garantarea veniturilor fermelorcomerciale în condiţiile respectării criteriilor de mediu şieco - condiţionalitate

Proiectul 31/ADER 227 - finalObiectivele Proiectului1. Elaborare model experimental

2. Crearea condiţiilor impuse de reglementările în vigoare pentru menţinereaplantelor candidat (spaţii insect proof). Experimentarea şi introducereatehnicilor moderne privind diagnosticarea şi testarea virală

3. Evaluarea şi implementarea metodelor rapide (ELISA, PCR) pentrudeterminarea stării de sănătate virală a regeneranţilor după terapie.

4. Dezvoltarea procedeelor de termo- şi chimioterapie, cultură de meristemepentru eliminarea virusurilor la speciile pomicole şi menţinerea materialuluibiologic candidat.

5. Managementul producerii materialului săditor pomicol conform schemelor decertificare din legislaţia actuală prin folosirea unor elemente biotehnologice înînmulţirea plantelor sănătoase.

6. Realizarea unor verigi tehnologice privind obţinerea materialului biologic dincategorii biologice superioare

Proiectul 31/ADER 227 - finalRezultate scontate a se obţine

Metode noi, rapide, fiabile, economice şi cu o mare putere discriminatorie îndetectarea şi identificarea patogenilor virali.Tehnologii/verigi tehnologice eficiente privind testarea virală, eliberarea devirusuri şi menţinerea materialului biologic pomicol necesar producerii unorplante care să îndeplinească toate standardele impuse de certificare;Selecţionarea celor mai bune clone din punct de vedere al autenticităţii,calităţilor pomologice şi al productivităţii;Metode optimizate pentru devirozarea materialului infectat, obţinereaplantelor candidat;Tehnologii/secvenţe tehnologice de menţinerea şi înmulţire a materialuluisăditor pomicol prin metode clasice şi neconvenţionale (culturi de ţesuturi);Ghiduri de bune practici pentru producerea, menţinerea şi multiplicareamaterialului săditor pomicol;Metode şi proceduri care să conducă la îmbunătăţirea schemelor actuale decertificare a materialului săditor;Spaţii protejate pentru menţinerea plantelor candidat, prebază şi bază înconformitate cu normele în vigoare;Obţinerea materialului prebază şi conservarea în biodepozitar;Completarea bazei materiale necesare testărilor şi stabilirii tehnicilor şitehnologiilor de lucru; Producerea materialului săditor bază.

Proiectul 31/ADER 227 - finalRezultate obţinute

Cuantificarea gradului de infectare cu virusuri a speciilor şi soiurilor;Bază materială formată din 10 spaţii izolate care să asigure condiţii pentru evitarea reinfectării;1-2 protocoale de lucru optimizate pentru testare şi diagnosticare virală;35 - 45 clone selecţionate conforme privind caracteristicile de autenticitate şi stare fitosanitară şi testate de virusuri;Verigi tehnologice privind eliberarea de virusuri la 1 - 3 specii pomicole; Biotehnologii de înmulţire pentru obţinerea materialului prebază la 1-2 specii pomicole;Plante prebază şi bază din soiurile a 10 - 12 specii pomicole.

Proiectul 31/ADER 227 - finalRezultate obţinute

Selecţionarea celor mai bune clone din punct de vedere al autenticităţii, calităţilor pomologice şi al productivităţii - 76 soiuri:10 soiuri de măr: Jonathan, Idared, Florina, Goldspur, Golden Delicious, Prima, Generos, Romus, Starkrimson, Mutsu şi portaltoii M 106 şi M9;9 soiuri de păr: Williams, Cure, Tudor, Monica, Argessis, Carpica, Williams roşu, Euras,

Conference şi portaltoiul Gutui A;9 soiuri de prun: Agent, Ialomiţa, Gras ameliorat, Centenar, Silvia, Minerva, Diana, Andreea, Delia şi portaltoiul Mirobolan BN 4Kr;6 soiuri de cireş: Ponoare, Daria, Tentant, Superb, Stella, Germrsdorf şi portaltoiul IPC 5.6 soiuri de vişin: Mocăneşti 16, Ţarina, Rival, Stelar, Ilva, Schattenmorelle;7 soiuri de cais: Tudor, Goldrich, Traian, Sulmona, Sirena, Harcot, NJA 42;8 soiuri de piersic: Catherine sel. 1, Cora, Creola, Liana, Delta, Florin, Cardinal, Redhaven;6 soiuri de căpşun: Premial, Real, Red Gauntlet, Coral, Magic, Benton;3 soiuri de zmeur: Cayuga, Opal, Ruvi;4 soiuri de mur: Darrow, Thornfree, Dar 8, Dar 24;6 soiuri de coacăz: Abanos, Deea, Tsema; Jonkheer van Teets, Red Lake, Houghton Castle; 2 soiuri de agriş: Virens, Verda;

Studiu documentar referitor la sursele de material vegetal şi caracterizarea genotipurilor luate în studiu (18 pagini).

Fişă experimentală privind producerea materialului de înmulţire şi plantare fructifer certificat din punct de vedere virotic – 10 pagini

Crearea condiţiilor impuse de reglementările în vigoare pentru menţinereaplantelor CANDIDAT şi PREBAZĂ (spaţii insect proof)Crearea condiţiilor impuse de reglementările în vigoare pentru menţinereaplantelor CANDIDAT şi PREBAZĂ (spaţii insect proof)

ICDP PITEŞTI(toate speciile)ICDP PITEŞTI(toate speciile)

•Izolator de 180 mp, cu plante crescute în containere şi cu fertirigare

SCDP BISTRIŢA(specia prun)

SCDP BISTRIŢA(specia prun)

•Izolator de 52 mp, cu plante crescute în containere.•Izolator (300 mp), cu plante crescute în ghivece mari de 50 l, câte 6 ghivece pentru fiecare soi şi portaltoi de prun.

Reabilitarea a 10 izolatoare (2.200 mp), pentru menţinerea plantelor Iniţiale şi Prebază în

conformitate cu normele în vigoare şi asigurarea condiţiilor necesare evitării reinfectării cu virusuri.

TESTAREA VIROTICĂ A MATERIALULUI SELECTAT, RETESTAREA MATERIALULUI PREBAZĂ ŞI BAZĂIndexarea prin metode biologice, teste serologice şi moleculare (ELISA, PCR) pentru 68 boli virale, a arătat

că:Plantele candidat selecţionate sunt sănătoase (-) şi pot fi utilizate pentru obţinerea materialului PREBAZĂ

şi ulterior BAZĂ.Rezultatele testelor ELISA au arătat că soiurile de cireş Ponoare, Daria şi Superb sunt infectate cu virusuri(ArMV, CLRV, PNRSV) iar soiul de vişin Mocăneşti cu PPV.Retestarea DAS–ELISA la PREBAZA de prun – Bistriţa, efectuată pentru PPV, PDV, PNRSV, ACLSV, ApMV

şi MLRSV a fost negativă. De asemenea, rezultatele IC-RT-PCR au confirmat absenţa PPV.Testările serologice DAS–ELISA efectuate la soiurile de căpşun şi arbuştii fructiferi, la soiurile de măr şi păr(pentru virusurile: ACLSV, ApMV, ASGV, ASPV, AP) au arătat că plantele testate sunt sănătoase.La prun s-au dovedit a fi infectate cu virusul Plum pox trei soiuri: Diana, Silvia si Ialomiţa, deşi pomii erauasimptomatici. Detecţia virusului Plum pox a fost realizata şi molecular, prin IC-RT-PCR, iar rezultateleobţinute au confirmat rezultatele serologice, aceste soiuri fiind eliminate de la înmulţire.

Testare căpşun pe F. vesca UC – 04 Altoire de foliolă R. o.”Munger” - zmeur Altoire cu ramură detaşată - zmeur

PROTOCOALE DE LUCRU OPTIMIZATE PENTRU TESTARE ŞI DIAGNOSTICARE

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL VIRUSULUIPLUM POX

IC-RT-PCR foloseste kitul Qiagen One Step RT-PCRşi perechea de amorse polivalente P1/P2 careamplifică un fragment de 243 bp corespunzătorregiunii C-terminus a proteinei capsidale (Wetzelşi colab., 1991). Pentru imunocaptură seutilizeaza antiser produs de BIOREBA.

Ciclul termic utilizat pentru RT-PCR cuprinde:Reverstranscriere - 30 min la 50°C,denaturare/inactivarea reverstranscriptazei timpde 2 min la 94 °C urmată de 35 de cicluri:denaturare ADNc - 30 s la 94 °C, hibridarea cuamorsele - 45 s la 61 °C, elongaţia ADNc - 60 sla 72 °C.

După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.

Produşii de amplificare se separa prin electroforeză,în gel de agaroză (Sigma) 1,5%.

Vizualizarea produşilor de amplificare s-a realizat înlumină UV, imaginea gelurilor fiind achiziţionatăcu o cameră video DocPrint.

DIAGNOSTICUL MOLECULAR AL FITOPLASMEIEUROPEAN STONE FRUIT YELLOW (ESFY)

Nested-PCR, se realizează în două etape deamplificare

Pentru amplificare se utilizeaza ADN-ul total dinfloem şi nervurile frunzelor de prun, extras cuajutorul kit-ului de extracţie Dneasy Plant MiniKit (Qiagen).

Pentru prima amplificare se recomanda primeriiP1/P7 (Schneider si colab., 1995), iar pentrucea de-a doua amplificare setul de primeriR16(X)F1/R16(X)R1 (Lee si colab., 1995).

Ciclul termic utilizat pentru Nested-PCR în ambeleetape de amplificare este următorul:denaturare - 5 min la 94°C, urmată de 35 decicluri: denaturare ADNc - 20 s la 92°C,hibridarea cu amorsele - 20 s la 55 °C,elongaţia ADNc - 40 s la 72 °C.

După ultimul ciclu urmeaza elongaţia finală la 72 °Cpe durata a 10 min.

Migrarea si vizualizarea produşilor PCR se faceidentic cu procedura pentru IC-RT-PCR

Au fost experimentate şi pot fi implementate protocoale ELISA - kit + protocol Bioreba şi kit + protocol Sediag pentru detectarea a 17 virusuri şi phytoplasme.Tehnicile moleculare de diagnostic au un potenţial foarte ridicat de detecţie virală şi sunt foarte utile în procedura de certificare a materialului săditor.

Înmulţirea materialului selecţionat - devirozareA fost înmulţit fondul biologic plante Candidat (iniţiale) la speciile pomicolelemnoase şi la căpşun şi arbuştii fructiferi.În urma lucrărilor de altoire efectuate la ICDP au fost înmulţite 13 soiuri la specia măr(78 plante), câte 10 soiuri păr şi prun (50 de plante din fiecare specie), 3 soiuri lacireş (15 plante), iar la vişin s-au obţinut 25 de plante din 5 soiuri.La prun, Bistriţa a înmulţit prin altoire în vederea obţinerii plantelor Candidat 7 soiuri(64 plante) testate serologic şi molecular şi stabilite ca „Virus free”.Aplicarea înmulţirii prin butaşi a permis realizat nucleul de plante Candidat la 3 soiuride coacăz negru şi 3 soiuri de coacăz roşu totalizând un număr de 32 plante lacontainer menţinute în prezent în spaţii izolate.Pentru realizarea nucleelor de Plante iniţiale şi Prebază (material in vitro) au fostfolosite şi elemente biotehnologice:

- Au fost optimizate protocoale de lucru şi randamentele în fiecare fază aculturii in vitro.

- au fost create nucleele de plante iniţiale in vitro la 5 soiuri de căpşun, 4soiuri de zmeur, 3 soiuri de mur şi a portaltoilor M9 şi M106 (măr), Gutui A (păr), IPC5 (cireş, vişin), Mirobolan BN 4Kr (prun). Plantele obţinute sunt folosite laproducerea prin micropropagare a nucleelor de plante Prebază în funcţie denecesităţile activităţii de producere a materialului săditor pomicol.

În procesul de devirozare au fost introduse un numar de 3 soiuri de cireş şi un soi devişin. Metoda aplicată a fost prin culturi de meristeme. A fost stabilit mediul decultura LF cu 0,3 mg/l GA3 si 0,01 mg/l IBA cât şi protocolul de lucru pentruspeciile respective.

Proiectul 31/ADER 227 - finalRezultatele obţinute

Aplicarea culturilor in vitro a permis realizarea nucleelor de Plante iniţiale (material iniţial in vitro) la 5 soiuri de căpşun, 4 soiuri de zmeur, 3 soiuri de mur şi a portaltoilor M9 şi M106 (măr), Gutui A (păr), IPC 5 (cireş, vişin), Mirobolan BN 4Kr (prun). Au fost optimizate protocoale de lucru în cea ce priveşte înrădăcinarea in vitro la portaltoii de măr M9 şi M106 şi a portaltoiului de cireş/vişin IPC 5 cu obţinerea unor randamente de înrădăcinare bune: 82% la portaltoiul M106, 70 % la portaltoiul M9 şi 73,33 % la portaltoiul de cireş/vişin IPC 5.Rezultatele obţinute în urma studiilor desfăşurate cu soiurile de mur au permis realizarea unui protocol de lucru privind obţinerea plantelor din cultura de meristeme în numai trei etape prin eliminarea fazelor de înălţare şi înrădăcinare in vitrorezultând reducerea perioadei de înmulţire in vitro, reducerea pierderilor de material datorită unor eventuale contaminări în faza de înălţare şi înrădăcinare in vitro şiimplicit scăderea costurilor de producţie ca urmare a reducerii consumului de substanţe chimice, energie electrică şi forţă de muncă.

TESTAREA/RETESTAREA ŞI MENŢINEREA MATERIALULUI PREBAZĂ ŞI BAZĂ EXISTENT

P1 - În urma inspecţiei efectuate la SCDP Bistriţa, ITCSMS Cluj a eliberat documentele oficiale decertificare la categoria PREBAZA a şase soiuri de prun: Agent, Gras ameliorat, Centenar,Minerva, Andreea şi Delia. Rezultatele analizelor au reconfirmat statusul „virus-free” al plantelorBAZA menţinute în biodepozitarele de la SCDP Bistriţa.

P2 - A fost constituit nucleul de material Prebază format din 24 soiuri de piersic şi 23 soiuri la cais.Toate soiurile retestate au prezentat test negativ fără soiul Cardinal infectat cu PPV.

CP - A fost constituit un nucleu de plante Prebază pentruramuri altoi la speciile lemnoase pentru care a fost depusădocumentaţia la ITCSMS Argeş în vederea certificării caPrebază.

Retestarea virală a Prebazelor a identificat numai la prun,infecţie cu PPV la 3 plante din soiul Gras ameliorat şi 2 plantedin soiul Ialomiţa diagnostic confirmat atât prin metoda DAS-ELISA cât şi prin AGRISTRIP.

Materialul sănătos rămas în biodepozitarul ICDP Piteşti-Mărăcineni constituie materialul din care se vor înmulţiplantele BAZĂ, necesare înfiinţării plantaţiilor mamă ramurialtoi, de butaşi şi a marcotierelor.

Rezultatele retestărilor efectuate la soiurile de căpşun şiarbuştii fructiferi au arătat că plantele testate sunt sănătoase,starea lor sanitara fiind liber de virusuri.

Plante PREBAZĂ la container ICDP Piteşti

Specia Soiuri Nr. plante Specia Portaltoi Nr. plante

Măr 10 42 Măr M 106 250Păr 9 24 M 9 2Prun 9 12 Păr, gutui BN 70 2Cireș 6 22 Gutui A 2Vișin 6 12 Prun Mirobolan dwarf 3Cais 4 5 Mirobolan C5 2Piersic 2 6 Mirobolan BN

4Kr2

Nectarin 1 1 Cireș, vișin IPC 2 2Zmeur 6 365 IPC3 2Mur 4 550 IPC4 2Coacăz negru 3 3 IPC5 2Coacăz roșu 3 3 IPC 7 2Agriș 2 2 Piersic Adaptabil 2Afin 2 2 Cais Apricor 2Cătină 2 2Căpșun 5 10.000

PREBAZA – ICDP - 2013PREBAZA – ICDP - 2013

Materialul biologic certificat la categoria Prebază în 2013 SCDP Bistriţa – prun

Soi/portaltoi Cant. Lot nr. Etichete oficiale atribuite

Nr. total/serie/de la...pana la

Agent/Mirobolan29C 3 3BN0671-3BN01 3/BN/799840-799842Gras

ameliorat/Mirobolan29C

3 3BN0672-3BN01 3/BN/799843-799845

Centenar/Mirobolan29C 3 3BN0673-3BN01 3/BN/799846-799848Minerva/Mirobolan29C 3 3BN0674-3BN01 3/BN/799849-799851Andreea/Mirobolan29C 3 3BN0675-3BN01 3/BN/799852-799854Delia/Mirobolan29C 3 3BN0676-3BN01 3/BN/799855-799857Total 18

Aspecte din faza de fortificare la ghiveci a prebazelor de zmeur (A), căpşun(B), mur (C),

portaltoi (D)

A B

C D

Proiectul 31/ADER 227 - finalPRODUCEREA MATERIALULUI SĂDITOR BAZĂLa ICDP Piteşti Mărăcineni (CP), a fost demarat

procesul obţinerii plantelor Bază la speciile lemnoasecu obţinerea portaltoilor. A fost întocmită documentaţiaşi a fost iniţiat procesul de certificare a materialului decătre ITCSMS Argeş. Au fost obţinute la speciilelemnoase un număr de 1380 plante Bază, trecute prinprocesul de certificare reprezentate de: portaltoi demăr, păr/gutui, prun, piersic, cais, cireş/vişin. PortaltoiiBază obţinuţi vor fi utilizaţi la producerea de pomiBază din soiurile existente în plantaţia mamă Prebază.La căpşun şi arbuştii fructiferi au fost înmulţite şicertificate la categoria Bază de ITCSMS un număr de13 150 plante

Proiectul 31/ADER 227 - finalPRODUCEREA MATERIALULUI SĂDITOR BAZĂ

Implementarea la SCDP Bistriţa a standardelor OEPP şi a legislaţiei naţionale privind obţinerea şi menţinerea materialului de înmulţire din categoriile biologice superioare a permis, în perioada 2012-2013:Certificarea la categoria PREBAZĂ a 18 plante din soiurile de prun: Agent - 3 plante, Gras ameliorat - 3 plante, Centenar – 3 plante, Minerva - 3 plante, Andreea - 3 plante și Delia - 3 plante (certificat anexat).Certificarea la categoria BAZĂ a 95 plante din soiurile de prun: Agent - 20 plante, Gras ameliorat- 15 plante, Centenar - 20 plante, Minerva - 15 plante, Andreea - 15 plante și Delia - 10 plante (certificat anexat).Mentinerea prin retestări anuale a materialului biologic din categoriile PREBAZĂ și BAZĂ certificate anterior în biodepozitarul de la SCDP Bistrița.Soiurile ce vor constitui materialul Bază la SCDP Constanţa (P2)pentru speciile piersic şi nectarin sunt: Springtime, Flavorcrest, Red Haven, Springcrest, Springcrest, Springtime, Snow Queen, Fantasia, Flavortop, May Gold, Stark, Red Gold, şi portaltoi piersic GF 677.Soiurile ce vor constitui materialul Bază pentru specia cais sunt: Bergeron, Goldrich (Sungiant), Hargrand, Portici, San Castrese şi portaltoiul Mirobolan 29 C.

Proiectul 31/ADER 227 - finalDiseminare rezultate

A fost elaborat un GHID - Materialul de înmulţire pomicol- studiu de caz: căpşunul”.Au fost elaborate şi publicate 17 lucrări în ţară, 4 lucrări în străinătate.Membrii echipei au participat la 12 simpozioane şi seminarii în ţară şi străinătate.

Proiectul 31/ADER 227 - finalConcluzii, recomandări

♦Apreciem că activităţile planificate pentru derularea proiectului au fost realizate, rezultatele fiind cele scontate.

♦Validarea tehnicilor de diagnoză virală permit în continuare derularea activităţii în domeniul producerii de material săditor şi de asemenea tehnicile de înmulţire studiate, cu menţiunea necesităţii perfecţionării acestora.

♦Propunem dezvoltarea unor studii aprofundate în domeniu pentru eficientizarea producerii materialului de înmulţire categorii superioare de calitate.

♦Pentru creşterea competitivităţii sectorului de producere a materialului săditor din România, dar şi pentru a creşterea vizibilitatea şi credibilitatea ţării noastre pe plan internaţional în acest domeniu de interes pentru agricultură este necesară continuarea activităţii proiectului prezentat.