Polytech UEF1
Outils moléculaires
pour l’analyse des génomes
BONCOMPAGNI ÉricMCU - Univ. Nice Sophia Antipolis
Site WEB : sites.unice.fr/EB
Pourquoi la génétique moléculaire?
• La génétique formelle renseigne sur:
Le nombre de loci et d’allèles relatifs à un caractère
héréditaire
Sur le caractère dominant/récessif d’une mutation
• Information manquante: SEQUENCE
Pour quoi code le gène? (nature du gène, fonction)
Nature des mutations?
Quel est son environnement génétique (autres gènes
similaires?)
Quel est son profil d’expression ?
Connaissance de la fonctionApplications : génie génétique
Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes
• Les RNA polymérases:
-RNA Pol I : transcrit les gènes codant pour les ARN ribosomiaux 28, 18 et 5,8S
-RNA Pol II : transcrit les gènes codant pour des protéines en ARNm
-RNA Pol III : transcrit les gènes codant pour les ARNr 5S et les ARNt
• Structure d’un gène eucaryote (Pol II)
promoter
Promoteur: séquences nécessaires à la régulation de la transcription du gène
Upstream enhancers: régions régulatrices activatrices de transcription
5’ et 3’UTR: régions transcrites mais non traduites (stabilité ARNm & régulation traduction)
Introns: zones (dans régions codantes ou UTR) excisées après la transcription
Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes
• Expression d’un gène Eucaryote (Pol II)
Rappels structure et expression des gènes Eucaryotes
promoter
épissage
traduction
maturation
ww
w-c
las
s.u
nl.e
du
/bio
ch
em
/gp
2/m
_b
iolo
gy
/an
ima
tion
/ge
ne
/ge
ne
_a2
.htm
l
Protéine fonctionnelle
Protéine native
Rappels structure de l’ADN
• Polymère orienté (5’ vers 3’ ) de 4 nucléotides
(phosphates-désoxyribose-bases, A, T, G, C)
• S’associe en double hélice via la complémentarité des bases
Adénine-Thymine (2 liaisons H) , Guanine-Cytosine (3 liaisons H)
• Présence de liaisons hydrogènes
possibilité de séparer les deux brins sous l’effet de la chaleur
= DENATURATION
Tm: t° à laquelle les deux brins se séparent (composition en bases)
Phénomène REVERSIBLE http://www.johnkyrk.com/DNAanatomy.html
Rappels structure de l’ADN
DENATURATION / RENATURATION
•Des molécules d’ADN dénaturées peuvent se réapparier
- Si la température est permissive
- Si le principe de complémentarité des bases est respecté
- toujours brins orientés en sens inverse
• Des brins ayant une complémentarité des bases imparfaite peuvent
s’apparier au delà d’une certaine homologie (> 80%)
•Propriété utilisée pour détecter des séquences complémentaires à
une séquences d’intérêt (PCR/ Southern blot / northern blot)
La PCR : but et principe
But:
Amplifier une séquence d’ADN cible pour:
1- La visualiser sur gel d’agarose
2- Détenir une quantité importante d’une séquence d’intérêt
3- Utiliser la séquence pour des clonages
Principe:
Utiliser une ADN polymérase qui grâce à l’utilisation d’amorces spécifiques et à une
succession de cycles de polymérisation va amplifier un fragment d’ADN recherché
http://www.snv.jussieu.fr/bmedia/PCR/images/PCR1.swfhttp://www.ens-lyon.fr/RELIE/PCR/principe/anim/presentation.htm
Voir animation:
Détecter un gène: sa présence dans un génome
La PCR : éléments de départ
- La séquence des extrémités est connue
Mélange réactionnel:
-ADN matrice
-Amorces complémentaires des deux
brins (5’ vers3 ’)
-dNTP: désoxyribonucléotides, unités
élémentaires de l’ADN
-Taq DNA polymérase (polymérase
résistant aux hautes températures)
-Tampon réactionnel
Détecter un gène: sa présence dans un génome
La PCR : Le premier cycle
Détecter un gène: sa présence dans un génome
La PCR : Le deuxième cycle
Détecter un gène: sa présence dans un génome
La PCR : Le troisième cycleDétecter un gène: sa présence dans un génome
La PCR : 25 à 40 cycles consécutifs
Séquence recherchée Séquence recherchée
Amplification de la séquence cible d’un facteur 2n (avec n= nombre de cycles).
Exemple : Après 30 cycles, la séquence cible est 230, soit 109 x plus
représentée
Cycle n Cycle n + 1
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Le Southern Blot: but et principe
Détecter un gène: sa présence dans un génome
But:
Détecter la présence d’une séquence d’intérêt dans l’ADN génomique extrait d’un
organisme
Afin de :
- Rechercher la présence d’une séquence (d’un gène) dans un génome
- Visualiser des différences entre individus/espèces
Principe:
Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d’intérêt repérable
Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l’ADN
Séparer les fragments d’ADN issus de l’organisme étudié sur gel d’agarose afin de les
visualiser
Edward M. Southern en 1975
Le Southern Blot: prérequis
•ADN génomique Eucaryote est sous forme de chromosomes = fragments de très
grande taille
•Afin d’individualiser des régions du génome pour les distinguer, il faut fragmenter l’ADN
•Puis, séparer les fragments les uns des autres pour les repérer
Utilisation des ENZYMES DE RESTRICTION (UH1)
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Le Southern Blot: digestion enzymatique de l’ADN
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Diapo Issue du cours de S. Chauvet
Le Southern Blot: digestion enzymatique de l’ADN
Détecter un gène: sa présence dans un génome
5’sortant 3’sortant
Diapo Issue du cours de S. Chauvet
Le Southern Blot: digestion enzymatique de l’ADN
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Diapo Issue du cours de S. Chauvet
Le Southern Blot: digestion enzymatique de l’ADN
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Electrophorèse d’ADN après digestion
ADN génomique
LeSBlot: Marquage du fragment d’intérêt = SONDE
Deux types de marquages :
- radioactif (dCTP*), détection par autoradiographie- non radioactif (digoxygénine), détection par anticorps couplés à une enzyme
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Le Southern Blot: Étapes
1- Extraction d’ADN génomique
2- Digestion enzymatique de l’ADN
3- Séparation des fragments sur gel d’agarose
4- Transfert sur membrane de nylon
5- Marquage du fragment d’ADN étudié (sonde)
6- Hybridation de la sonde sur la membrane
7- Détection du fragment marqué
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Animation: http://www.dnalc.org/ddnalc/resources/shockwave/southan.html
Le Southern Blot: Interprétations
Détecter un gène: sa présence dans un génome
• L’enzyme de restriction utilisée ne coupe pas dans la zone de la sonde
1 bande si le gène est en une seule copie
2 bandes si le gène est en deux copies,…. Etc….
A AA
A A
A A
A A
ADN g
Sonde
Frgt étudié1 copie
2 copies séparées
2 copies en tandem
1 2 3
1
2
3
•L’enzyme de restriction utilisée coupe dans la zone de la sonde
2 bandes si le gène est en une seule copie
4 bandes si le gène est en deux copies à des loci différents
mais 3 bandes si les gène est en deux copies au même locus !!!!
Le Southern Blot: Interprétations
Détecter un gène: sa présence dans un génome
A A
1 copie
2 copies séparées
2 copies en tandem
A
A AA
A AA
AA A A
1 2 3
1
2
3
Détecter un gène: sa présence dans un génome
Comparaison PCR / Southern blot
Les deux permettent de détecter la présence d’une fragment d’ADN dans un génome
MAIS
- La PCR ne donne pas le nombre de copies du fragment (gène)
- La PCR ne donne pas d’information sur l’organisation dans le génome
PAR CONTRE
- La PCR est plus rapide (quelques heures contre 48H pour un Southern blot)
- La PCR peut être effectuée en haut débit
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
northern blot: But et Principe
But:
Détecter la présence d’un ARN messager d’intérêt dans l’ARN total issu d’un tissus
Afin de :
- déterminer le profil d’expression d’un gène
- visualiser des différences entre individus/espèces
Principe:
Utiliser des nucléotides marqués pour rendre le fragment d’intérêt repérable
Utiliser les propriétés de dénaturation et de renaturation de l’ADN/ARN
Et la capacité de l’ADN de s’hybrider avec l’ARN pour former un duplex stable
Séparer les ARNm issus de l’organisme étudié sur gel d’agarose afin de les visualiser
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
northern blot: Les étapes
Photo gel agarose
coloré au BET
Autoradiographie
1- Extraction de l’ARN total
2- Séparation des ARNm sur gel d’agarose
4- Transfert sur membrane de nylon
5- Marquage du fragment d’ADN étudié (sonde)
6- Hybridation de la sonde sur la membrane
7- Détection du fragment marqué
1 2 3 4
1 2 3 4
Contamination ADNg
ARNr 28s
ARNr 18s
ARNr 5,8s
Contamination ADNg
Signal
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR: But et Principe
But:
Détecter la présence d’un ARN messager d’intérêt dans l’ARN total issu d’un tissus
Afin de :
- déterminer le profil d’expression d’un gène
- visualiser des différences entre individus/espèces
Principe:
Utiliser une ADN polymérase ARN dépendante (réverse transcriptase) pour synthétiser le
brin complémentaire des ARNm
Puis amplifier le fragment obtenu par PCR
Si un gène est exprimé dans le tissus testé : bande visible après migration
Si le gène n’est pas exprimé: pas de bande
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR: Les étapes
1- Reverse transcription
à partir d’ARN totaux extraits du tissus analysé
à l’aide d’oligo dT
Synthétise le brin ADN complémentaire
2- Amplification spécifique du gène étudié
À l’aide d’amorces spécifique
Par PCR
3- Migration sur gel d’agarose pour visualisation
PCR
Migration sur gel d’agarose
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
1- Reverse transcription
à partir d’ARN totaux extraits du tissus analysé
à l’aide d’oligo dT
Synthétise le brin ADN complémentaire
2- Amplification spécifique du gène étudié
À l’aide d’amorces spécifique
Par PCR
Utilisation d’un agent intercalant (SYBR Green I)
fluorescent
3- Quantification par mesure de la fluorescence
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
Il faut environ 1010 copies d’un fragment de PCR (de taille classique entre 100 et 1000 b) pour atteindre le seuil de détection :En partant de :- 1 000 000 copies initiales, le seuil de 1010 est atteint au bout de 14 cycles- 1 000 copies initiales, le même seuil de 1010 est atteint au bout de 25 cycles- 1 copie initiale, le même seuil de 1010 est atteint au bout de 33 cycles
Quantification dans chaque échantillon évaluée par rapport au Ct (cycle threshold)Plus il y a de copies du fragment cible au début et moins il faudra de cycles pour atteindre le Ct
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
Quantification absolue: on compare le Ct obtenu avec une
Courbe standard issue d’amplification d’échantillons
contenant une quantité connue de cible.
Quantification relative: On compare le niveau d’expression
à celui d’un ou plusieurs gènes de référence considérés
comme exprimés de façon stable dans les différentes
conditions biologiques.Le résultat est exprimé comme un ratio.
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
Ratio d’expression dans une condition: 2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt)
= simple CT
http://www.americanbiotechnologist.com/blog/real-time-quantitative-pcr-data-analysis-tutorial/
http://www.americanbiotechnologist.com/blog/real-time-quantitative-pcr-data-analysis-tutorial/
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
Ratio d’expression comparé à une condition contrôle:
2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition étudiée2 (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition contrôle= Ct (double delta Ct)
2(15.9-12)
R= = 5.32(16.5-15)
Ratio Tumor/control :
Détecter un gène: son expression spatio-temporelle
RT-PCR quantitative
NB: cette formule est applicable dans le cas ou l’efficacité d’amplification des deux couples d’amorces est proche de ou est égale à 100%.
Sinon on doit tenir compte des différences d’efficacité d’amplificationet utiliser:
X (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition étudiéeX (Ct gène de référence-Ct gène d’intérêt) condition contrôle
OU X est calculée grâce à la pente de la courbe de Ct obtenue pour des dilution croissantes de matrice pour chaque couple d’amorce.
X= 1+E= 10(-1/pente de la courbe)
Le clonage d’une séquence
But : Disposer à volonté et en quantité d’une séquence d’ADN d’intérêt
En la multipliant dans un système bactérien (Escherichia coli)
Cloner des séquences d’intérêt
Exemple de vecteur de clonage
Nécessite un vecteur de clonage qui comporte:
1- Une origine de réplication
2- Un gène de sélection
4- Un site multiple de clonage
MCS du pBluescript SK-
Cloner des séquences d’intérêt
1- Digérer l’ADN à cloner par une enzyme de
restriction adéquate
2- Digérer le vecteur par la même enzyme
4- Mettre en présence le vecteur et fragment
à cloner: appariement par
complémentarité des bases
5- Ajouter une DNA ligase (referme la
molécule d’ADN)
6- Transformer une souche d’E. coli
7- Sélectionner les bactéries transformées
et les isoler
Fragment d’ADN obtenufacilement par extraction d’ADNplasmidique à partir des bactériestransformée
Le clonage d’une séquence: Les étapes
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Issue des connaissances acquises sur le processus d’intégration du phage
Lambda dans le chromosome d’E. coli
Cloner des séquences d’intérêt
Cloner des séquences d’intérêt
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Cloner des séquences d’intérêt
Permet de s’affranchit :
1- des enzymes de restriction
2- des faibles efficacités de clonage
3- élimine les problèmes de site internes d’enzymes
4- contre sélection des clones vides : ccdB
5- multiples vecteurs de destination
Inconvénients :
1- Les sites Att de recombinaison s’intercalent entre les fragments
clones: acides aminés supplémentaires en cas de fusions
traductionnelles
2- Technologie brevetée: chère
Le clonage d’une séquence: la technologie GATEWAY
Cloner des séquences d’intérêt