UNIVERSITATEA DE ŞTIINŢE AGRICOLE ŞI MEDICINĂ VETERINARĂ CLUJ-NAPOCA

ŞCOALA DOCTORALĂ FACULTATEA DE HORTICULTURĂ

Ing. Pop Iulia Francesca Utilizarea tehnicilor de analiză moleculară la

genurile Prunus, Corylus, Juglans şi Castanea în

vederea conservării în bănci de gene

(REZUMAT AL TEZEI DE DOCTORAT) Conducător ştiinţific:

Prof. univ. dr. Doru Pamfil

Cluj-Napoca

2009

CUPRINS teza rezumat INTRODUCERE ....................................................................................................1 1 CAPITOLUL I ........................................................................................................5 2

1.1. IMPORTANŢA CONSERVĂRII RESURSELOR GENETICE PENTRU MENŢINEREA BIODIVERSITĂŢII .................................................5 2

1.1.1. Definiţia biodiversităţii ..........................................................................5 1.1.2. Tipuri de biodiversitate ..........................................................................8 1.1.3. Conceptul de biodiversitate....................................................................9 1.1.4. Protecţia şi obiectul conservării biodiversităţii ....................................11 1.1.5. Strategia conservării biodiversităţii......................................................12 1.1.6. Istoricul conservării biodiversităţii ......................................................13

1.2. BĂNCILE DE GENE .................................................................................15 2 1.2.1. Generalităţi despre băncile de gene.......................................................15 1.2.2. Categorii de bănci de gene ....................................................................18 1.2.3. Modalităţi de conservare în băncile de gene .........................................18

1.3. CADRUL LEGISLATIV AL PROTECŢIEI NOILOR SOIURI DE PLANTE ............................................................................................................22 2

1.3.1. Legislaţia românească în domeniul protecţiei noilor soiuri de plante...22 1.3.2. Uniunea Europeană ...............................................................................23 1.3.3. Statele Unite ale Americii .....................................................................23 1.3.4. UPOV ....................................................................................................24 1.3.5. Tratatul Internaţional asupra Resurselor Genetice Vegetale (ITPGRFA)......................................................................................................26 1.3.6. Alte tratate internaţionale ......................................................................26 1.3.7. Patentarea genetică ................................................................................27

1.4. IMPORTANŢA CONSERVĂRII RESURSELOR GENETICE ALE GENURILOR PRUNUS, CORYLUS, JUGLANS ŞI CASTANEA ................28 3

1.4.1. Importanţa culturii genului Prunus .......................................................28 1.4.2. Importanţa culturii genului Corylus ......................................................37 1.4.3. Importanţa culturii genului Juglans ......................................................40 1.4.4. Importanţa culturii genului Castanea....................................................54

I.5. METODE DE AMPRENTARE GENETICĂ .............................................56 4 1.5.1. Generalităţi privind markerii moleculari...............................................56 1.5.2. Clasificarea markerilor moleculari........................................................57 1.5.3. Alegerea tehnicilor moleculare folosite în experiment .........................65 1.5.4. Compararea diferitelor tehnici de marcare moleculară .........................66 1.5.5. Metode utilizate pentru interpretarea statistico-matematică a rezultatelor amprentării genetice la genurile Prunus, Corylus, Juglans şi Castanea ..........................................................................................................69 1.5.6. Software pc utilizate pentru interpretarea datelor rezultate în urma analizelor moleculare ......................................................................................73

CAPITOLUL II. OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA78 5 2.1. SCOPUL CERCETĂRILOR ......................................................................78

2.1.1. Obiectivele urmărite în cercetările aferente tezei de doctorat...............79 2.2. MATERIALUL BIOLOGIC.......................................................................79 5

2.2.1. Materialul biologic utilizat în experienţele de diferenţiere a accesiunilor cu ajutorul markerilor moleculari ...............................................79

2.2.1.1. Descrierea accesiunilor din genul Prunus luate în studiu ...........80 2.2.1.2. Descrierea accesiunilor din genul Corylus luate în studiu ..........93 2.2.1.3. Descrierea accesiunilor din genul Juglans luate în studiu ..........97 2.2.1.4. Descrierea accesiunilor din genul Castanea luate în studiu......108 2.2.1.6. Amorsele SSR utilizate în amplificarea ADN-ului......................113

2.3. METODE DE LUCRU .............................................................................119 6 2.3.1. Extracţia şi cuantificarea ADN-ului în vederea executării analizelor RAPD şi SSR.................................................................................................119

2.3.1.1.Protocolul extracţiei de ADN ......................................................119 2.3.1.2. Cuantificarea ADN-ului..............................................................121

2.3.2. Metode de lucru aplicate în experienţele de amplificare cu amorsele RAPD ............................................................................................................122

2.3.2.1. Protocolul de amplificare RAPD................................................124 2.3.2.2. Electroforeza în gel de agaroză..................................................127

2.3.2.2.1. Prepararea gelurilor de agaroză .......................................128 2.3.2.2.2. Migrarea elecroforetică şi pregătirea probelor de ADN...129

2.3.2.3. Preluarea imaginilor ..................................................................130 2.3.2.4. Analizarea imaginilor.................................................................130

2.3.3. Metode de lucru aplicate în experienţele de amplificare cu amorsele SSR... ............................................................................................................131 6

2.3.3.1. Protocol de amplificare SSR.......................................................132 2.3.3.2. Electroforeza capilară ................................................................133 2.3.3.3. Analiza datelor............................................................................136

2.3.4. Metode statistice de calcul si interpretare a rezultatelor amplificărilor cu amorsele RAPD şi SSR .....................................................136

CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUŢII .................................................141 7 3.1. REZULTATE PRIVIND EXTRACŢIA PROBELOR DE ADN .......141 7

3.1.1. Rezultate privind extracţia probelor de ADN la genul Prunus ...........142 3.1.2. Rezultate privind extracţia probelor de ADN la genul Corylus ..........144 3.1.3. Rezultate privind extracţia probelor de ADN la genul Juglans ..........145 3.1.4. Rezultate privind extracţia probelor de ADN la genul Castanea .......147

3.2. REZULTATE PRIVIND AMPLIFICAREA ŞI ELECTROFOREZA PRODUŞILOR DE REACŢIE RAPD ....................148 7

3.2.1. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Prunus ..................................................................................153 7 3.2.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Corylus .................................................................................156 8 3.2.3. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Juglans .................................................................................157 8 3.2.4. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Castanea ..............................................................................159 8

3.3. REZULTATE PRIVIND ANALIZA IMAGINILOR ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE CU AMORSELE RAPD........161 8

3.3.1. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele

III

IV

RAPD la genul Prunus ..................................................................................161 8 3.3.2. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Corylus .................................................................................164 10 3.3.3. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Juglans .................................................................................167 12 3.3.4. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Castanea ..............................................................................170 14

3.4. REZULTATE PRIVIND ANALIZA ŞI INTERPRETAREA DATELOR OBŢINUTE CU AMORSELE SSR.............................................174 16

3.4.1. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Prunus.........................................................................................................174 16 3.4.2. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Corylus........................................................................................................179 19 3.4.3. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Juglans........................................................................................................188 21 3.4.4. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Castanea .....................................................................................................197 24

CAPITOLUL IV. CONCLUZII .........................................................................205 27 Bibliografie .........................................................................................................210 31 ANEXA 1............................................................................................................230 ANEXA 2............................................................................................................234 ANEXA 3............................................................................................................244 ANEXA 4............................................................................................................252 ANEXA 5............................................................................................................262 ANEXA 6............................................................................................................265 ANEXA 7............................................................................................................268 ANEXA 8............................................................................................................269 ANEXA 9............................................................................................................272 ANEXA 10..........................................................................................................273 ANEXA 11..........................................................................................................275 ANEXA 12..........................................................................................................280 ANEXA 13..........................................................................................................283 ANEXA 14..........................................................................................................288 LISTĂ DE ABREVIERI ŞI ACRONIME..........................................................291

INTRODUCERE

Cercetările efectuate în cadrul prezentei teze şi-au propus caracterizarea moleculară a unor accesiuni din genurile Prunus, Corylus, Juglans şi Castanea de la SCDP Vâlcea, în vederea menţinerii lor în banca de gene şi totodată, pentru evaluarea variabilităţii genetice din cadrul colecţiei de germoplasmă.

Colecţiile naţionale de prun, alun, castan şi nuc de la SCDP Vâlcea au reprezentat materialul biologic studiat, datorită importanţei lor în ceea ce priveşte biodiversitatea şi, totodată, asigurarea unei diete variate.

Biodiversitatea este tratată în prezent ca una din problemele protecţiei mediului terestru, de o mare importanţă pentru dezvoltarea viitoare a societăţii umane, prin asigurarea stabilităţii şi evoluţiei tuturor tipurilor de ecosisteme.

Protecţia biodiversităţii reprezintă activităţile complexe desfăşurate de om pentru a salva de la pieire genofondul. La nivel internaţional, prin „protecţia” biodiversităţii se înţelege „conservarea” sau „păstrarea” biodiversităţii.

România este recunoscută pe plan mondial ca o ţară cu o biodiversitate deosebită, iar suprafaţa ariilor protejate cuprinde peste 4,8 % din teritoriul ţării. O atenţie deosebită s-a acordat creării unor condiţii favorabile pentru conservarea resurselor genetice vegetale şi animale „ex situ”, în colecţii sau bănci de gene.

România dispune de colecţii pomologice remarcabile pe plan mondial, organizate în reţeaua Staţiunilor de Cercetare şi Dezvoltare Pomicolă, aparţinând Institutului de Cercetare şi Dezvoltare pentru Pomicultură de la Piteşti – Mărăcineni (Ghidra şi colab., 2004).

În clipa de faţă, Banca de Gene din Suceava, ICDP Piteşti şi SCDP Vâlcea au programe specializate de cercetare privind conservarea resurselor genetice, programe de realizare a băncilor de date, la nivel european şi naţional.

Pentru conservarea eficientă a resurselor genetice vegetale este necesară stabilirea cât mai exactă a variabilităţii genetice a acestora, ce poate fi determinată la două niveluri, fenotipic şi genotipic. Analiza variabilităţii fenotipice se bazează pe studiul morfologiei plantelor, iar cea a variabilităţii genetice, în primul rând pe markerii moleculari.

Evaluarea genotipurilor prin metode specifice biologiei moleculare, pentru conservarea resurselor genetice vegetale, reprezintă un studiu inedit în ţara noastră. Tehnica RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) completată cu tehnica SSR (Simple Sequence Repeats) constituie un instrument de înaltă analiză. Principalele obiective urmărite în prezentul studiu au fost :

• Identificarea amorselor RAPD capabile de a genera polimorfisme la nivel molecular între accesiunile studiate • Alegerea amorselor SSR capabile de a discrimina accesiunile analizate • Realizarea unui screening cu markerii RAPD la nivelul accesiunilor pentru a stabili eventualele dubluri • Caracterizarea moleculară a accesiunilor luate în studiu cu ajutorul markerilor SSR

Pentru conservarea speciilor în condiţii optime, sunt necesare cunoştinţele furnizate de ameliorarea plantelor, respectiv de biotehnologii moderne. Implicarea ameliorării şi a biotehnologiilor continuă şi ulterior conservării, moment în care din resursele genetice conservate urmează să fie obţinute noi cultivare pentru diverse zone şi pentru diferite

1

scopuri. Valoarea materialului genetic conservat sporeşte odată cu utilizarea metodelor moderne de transformare a genotipurilor (manipularea ADN).

Realizarea băncilor de gene la Prunus, Juglans, Corylus şi Castanea vor servi programelor de ameliorare genetică din ţară şi străinătate, unele genotipuri vor intra în producţie, dar prioritar este faptul că aceste resurse de gene vor servi umanităţii în generaţiile viitoare.

CAPITOLUL I

1.1. IMPORTANŢA CONSERVĂRII RESURSELOR GENETICE PENTRU MENŢINEREA BIODIVERSITĂŢII

În anul 1992, cu ocazia Conferinţei Naţiunilor Unite pentru Mediu şi Dezvoltare (UNCED), care a avut loc la Rio de Janeiro, s-a definit termenul de biodiversitate ca reprezentând „variabilitatea organismelor vii, de orice origine, inclusiv, între altele, ecosistemele terestre, marine şi alte ecosisteme acvatice şi complexele ecologice din care fac ele parte, diversitatea în sânul speciilor şi între specii, la fel ca şi pe cea a ecosistemelor” (art. 2 al Convenţiei, citat după Cristea, 2001). 1.2. BĂNCILE DE GENE

Plantele cultivate şi animalele domestice se deosebesc net de cele sălbatice din care provin, sub toate aspectele (morfologic, biochimic, genetic, etc.). În literatura de specialitate se întâlneşte termenul de „cultivar” (la noi întâlnim şi „soi”), pentru definirea unor populaţii de plante cultivate care au caracteristici comune. Importanţa şi valoarea genetică a fondului de germoplasmă constituit din totalitatea cultivarurilor este foarte mare. Acestora li se acordă o deosebită atenţie, deoarece multe din ele sunt extrem de vulnerabile. Această vulnerabilitate se datorează condiţiilor create atunci când culturile pe suprafeţe mari sunt uniforme din punct de vedere genetic şi sunt foarte sensibile la boli, dăunători sau la condiţiile climaterice momentane, ca rezultat al constituţiei genetice a cultivarurilor şi interacţiunii acestora cu mediul (National Research Council, SUA 1972, citat de Ghidra şi colab.(2004)).

Înlocuirea diverselor cultivaruri sau rase cu o bază ereditară heterozigotă cu unele noi, omogene din punct de vedere genetic, reprezintă una din cele mai importante cauze ale vulnerabilităţii genetice. Eroziunea genetică reprezintă fenomenul de pierdere a diferitelor diversităţi genetice în cadrul unei populaţii, inclusiv pierderea strictă a unor gene sau combinaţii de gene aflate în organisme adapate de fapt la anumite habitate zonale. Eroziunea genetică este asociată cu sărăcirea bazei genetice, pierderea de gene sau alele, iar în sens larg, cu pierderea unor soiuri (Ghidra şi colab., 2004).

Înfiinţarea Băncilor de Gene a înlesnit conservarea resurselor genetice vegetale, fiind cea mai nouă şi modernă formă de păstrare a germoplasmei (Ghidra şi colab., 2004).

Banca de gene reprezintă o instituţie în care se realizează depozitarea, păstrarea şi reproducerea germoplasmei. Băncile de gene asigură atât securitatea pe termen lung, cât şi punerea la dispoziţia solicitanţilor (fermieri, amelioratori, cercetători) a speciilor cu importanţă economică şi alimentară şi a celor înrudite cu acestea (http://www.bioversityinternational.org/Themes/Genebanks/index.a sp). 1.3. CADRUL LEGISLATIV AL PROTECŢIEI NOILOR SOIURI DE PLANTE

Proprietatea intelectuală şi industrială reprezintă un domeniu important, în care după 1989, România a făcut o serie de progrese atât din punct de vedere legislativ, cât şi

2

instituţional. Din domeniul protecţiei drepturilor de proprietate industrială face parte şi protejarea noilor soiuri de plante. Legea nr.255/1998 privind protecţia noilor soiuri de plante stabileşte criteriile şi cadrul în care noile soiuri de plante sunt definite, omologate şi protejate.

Drepturile cultivatorilor sunt recunoscute de legea românească printr-un brevet acordat de Oficiul Naţional pentru Invenţii şi Mărci (OSIM).

UPOV (International Union for the Protection of New Varieties of Plants – Uniunea Internaţională Pentru Protecţia Noilor Varietăţi de Plante) este o organizaţie interguvernamentală cu sediul la Geneva (Elveţia), creată special pentru protecţia noilor soiuri de plante. UPOV a fost înfiinţată în cadrul Convenţiei Internaţionale Pentru Protecţia Noilor Varietăţi de Plante (International Convention for the Protection of New Varieties of Plants), adoptată la Paris în 1961 şi revizuită în 1972, 1978 şi 1991 (http://www.upov.int/index_en.htm).

Convenţia UPOV caută să armonizeze în rândurile membrilor săi, principiile pe baza cărora se face examinarea DUS (distinctivitate, uniformitate, stabilitate). Această armonizare este importantă pentru cooperarea în aceste examinări, dar ajută la furnizarea unei protecţii clare cu ajutorul unor descriptori recunoscuţi internaţional pentru soiuri protejate. 1.4. IMPORTANŢA CONSERVĂRII RESURSELOR GENETICE ALE GENURILOR PRUNUS, CORYLUS, JUGLANS ŞI CASTANEA

În pomicultura României, prunul (Prunus domestica L.) deţine un rol de bază de o importanţă deosebită, datorită aprecierii de care se bucură pe de o parte, iar pe de altă parte, datorită avantajelor care rezultă din cultivarea lui. Este răspândit în toată ţara, datorită rusticităţii speciei, respectiv cerinţele reduse faţă de climă, faţă de factorii edafici şi tehnologici.

Prunul a fost cultivat din cele mai vechi timpuri pentru fructele lui, consumate la nivel familial, apoi ca materie primă în industria alimentară, iar lemnul de prun este utilizat în industria mobilei şi în artizanat.

Genul Prunus a fost clasificat de către Ingram (1948) în mai multe subgenuri: Prunophora Focke, Amygdalus (L)Focke, Lithocerasus Ingram, Cerasus Pers. , Padus (Moench) Koehne şi Laurocerasus Koehne. Amintim speciile: P. cerasifera, P. musoniana, P. domestica L., P. insititia L., P. simonii Carr., P. spinosa L., P. americana Marsh, P. nigra Ait., P. japonica Thunb., P. besseyi Bailey şi P. tomentosa Thunb.

În anumite perioade, în România, prunul a fost specia pomicolă dominantă, proporţia fiind foarte mare faţă de celelalte specii pomicole (în 1905 prunul avea o pondere de 87,9% din totalul de 48 milioane de pomi, iar în 1927 deţinea un procent de 80 %, cu peste 63 milioane de pomi din totalul de 80,7 milioane) (Cociu şi colab., 1997).

Alunul (Corylus avellana) creşte spontan în zona colinară şi premontană din toate regiunile ţării şi nu este cultivat prea mult ca specie pomicolă. Este o specie rustică, bună pentru prevenirea eroziunilor şi pentru perdele de protecţie. Alunele sunt apreciate pentru conţinutul lor bogat în substanţe grase, proteine, vitamine, săruri minerale, fiind utilizate în cofetărie sau patiserie. De asemenea se folosesc mult în industria dulciurilor.

Genul Corylus cuprinde nouă specii, recunoscute de majoritatea specialiştilor: C. avellana, C. americana, C. colurna, C. cornuta, C. ferox, C. heteroplylla, C. maxima, C. sieboldiana şi C. tibetica.

La noi în ţară plantaţiile de alun sunt foarte restrânse ca număr, alunul fiind cultivat

3

numai în spaţiul familial. Nucul (Juglans regia) este una din plantele foarte importante, prin numeroasele

întrebuinţări ale lui în domeniul alimentaţiei, în industria lemnului şi mobilei, în industria farmaceutică şi nu în ultimul rând ca plantă decorativă.

Genul Juglans cuprinde aproximativ 40 de specii, dintre care amintim: J. regia, J. duclouxiana, J. kanaonia, J. fallax, J. sinensis, J. sigillata, J. poilanei, J. sieboldiana, J. cordiformis, J. cathayensis, J. mandshurica, J. hindsii, J. californica, J. rupestris, J. nigra, J. cinerea, J. honorei şi J. boliviana.

Pe teritoriul României, nucul a fost foarte răspândit, ţara noastră fiind considerată una dintre cele mai mari producătoare de nuci. Bazele cercetării moderne a culturii nucului în România s-au pus în 1975. Au fost omologate 18 soiuri de nuc şi doi portaltoi (Tg Jiu, Secular R-M). În cultura lor s-au abordat tehnologii noi, elaborându-se materialul săditor altoi, cu scopul de a intensiviza culturile de nuci în România (Cociu şi colab., 2007). Între anii 1990-2001, s-a constatat o creştere a producţiei mondiale de nuci cu 127% faţă de perioada 1980-1990. Cea mai mare producătoare de nuci este China (330 mii tone) în 2001, România fiind pe locul 6 cu o producţie de 25 mii tone.

În România se desfăşoară programe genetice de ameliorare a portaltoiurilor de nuc prin hibridări interspecifice, cu toleranţă CLRV (Cherry Leaf Roll Virus – Virusul răsucirii frunzelor de cireş), rezistenţă la boli ale sistemului radicular, compatibilitate cu soiuri de perspectivă (Cociu şi colab., 2007).

Castanul (Castanea sativa), în ţara noastră, creşte spontan în masive şi pâlcuri, pe versanţii sudici ai dealurilor din depresiunea subcarpatică a Olteniei, Gureni, Polovraci, Hobiţa, Horezu Tismana în Maramureş şi în zona Satu Mare. Pomi izolaţi mai avem în Caransebeş, Lugoj, Lipova, Arad, Oradea, Şimleul Silvaniei, Jibou, Bistriţa.

Castanul comestibil se cultivă pentru fructe şi lemn. Fructele se consumă prăjite, fierte, crude, confiate, glasate, în ciocolată, îngheţată, în diferite aperitive şi băuturi răcoritoare. Din făina de castane se prepară pâine, lipii, sosuri, supe, alcool. Lemnul de castan, superior stejarului, se foloseşte în industria navală, parchet pentru locuinţe, mobilier, etc.. Scoarţa tulpinii, cupele fructelor şi frunzele conţin tanin care se utilizează în industria tăbăcăriei, la vopsitul lânii şi mătăsii, cărora le imprimă o culoare brună negricioasă cu luciu atrăgător. Unele varietăţi (Argentea, Aurea maculata) sunt folosite ca plante ornamentale.

Genul Castanea cuprinde nouă specii, unele prestând interes pentru pomicultură, exemple sunt: Castanea sativa, Castanea crenata (castanul japonez), Castanea Mollisima (castanul chinezesc), Castanea dentata (castanul american).

În ţara noastră se cultivă hibrizi inter-specifici obţinuţi la SCPP Baia Mare, cu pomi de vigoare mică, precoci şi productivi, cu fructe mari, rezistenţi la pătarea frunzelor. I.5. METODE DE AMPRENTARE GENETICĂ

Markerii genetici sunt reprezentaţi de orice diferenţă genetică sau fenotipică care este specifică individului şi se transmite la descendenţi, putând fi urmărită de-a lungul generaţiilor. (Staub şi colab., 1996b)

Markerii genetici sunt de trei tipuri: markeri morfologici, markeri proteici şi markeri moleculari sau ADN. (de Vicente şi colab., 2004)

Markerii ADN evidenţiază polimorfismul la nivelul ADN-ului nuclear şi citoplasmatic. Markerii moleculari nu sunt influenţaţi de condiţiile de mediu, fiind o măsură obiectivă a variabilităţii, există în număr nelimitat, acoperind întregul genom, dar

4

necesită echipamente complexe de analiză. Markerii ideali ar fi caracterizaţi de următoarele proprietăţi: polimorfism ridicat,

reproductibilitate mare, codominanţă, distribuţie uniformă în genom, distinctivitate (să evidenţieze diferenţele între indivizi înrudiţi), neinfluenţaţi de condiţiile de mediu, neutri (alela prezentă la locusul markerului să fie independentă, fără efect asupra presiunii de selecţie aplicată individului), necostisitori, uşor de utilizat (de Vicente şi colab, 2004).

Markerii RAPD (Random amplified polymorphic DNA - polimorfisme de ADN amplificate aleator) sunt rezultaţi prin amplificarea PCR a unor segmente necunoscute de ADN genomic cu ajutorul unei amorse decamere aleatoare (Williams şi colab., 1990). Produşii de amplificare sunt migraţi într-un gel de agaroză şi vizualizaţi prin impregnare cu bromură de etidiu (fluorescentă în lumină ultravioletă) sau azotat de argint. Diversitatea genetică şi relaţiile de înrudire dintre indivizi se evaluează pe baza prezenţei sau absenţei benzilor, rezultând o amprentă genetică specifică. În urma amplificării cu amorsa decameră aleatoare rezultă un număr mare de fragmente de dimensiuni variabile (300-2000 pb), însă acestea pot prezenta problema co-migrării (fragmentele cu aceeaşi greutate moleculară pot avea structuri diferite, astfel presupunerea lipsei polimorfismului pentru banda respectivă fiind eronată). Fiind o metodă simplă, necostisitoare şi care nu necesită cunoaşterea secvenţei de ADN ţintă, RAPD se utilizează şi astăzi în analizele genetice, deşi markerii sunt dominanţi iar reproductibilitatea între laboratoare e scăzută. (Karp şi colab, 1997a) Aplicaţiile tehnicii RAPD includ: studiul diversităţii genetice, caracterizarea germoplasmei, determinarea structurii genetice a populaţiilor, a variabilităţii somaclonale, identificarea cultivarelor şi a purităţii hibrizilor. Dezvoltarea ulterioară a tehnicii RAPD a determinat formarea altor markeri bazaţi pe PCR (de exemplu markerii SCAR şi ASAP).

Microsateliţii (ADN înalt repetitiv) reprezintă secvenţe scurte (1-10 pb, de obicei 2-3 pb) de nucleotide ce se repetă în tandem, găsindu-se în proporţie mai mare la nivelul centromerului şi telomerilor (ADN non-informaţional) (Gupta şi colab, 1996). Pentru a putea fi utilizaţi ca markeri trebuie cunoscută localizarea lor în genom. Majoritatea markerilor microsateliţi sunt constituiţi din repetiţii dinucleotidice [(AC)n, (AG)n şi (AT)n]. Polimorfismul apare datorită variaţiei în număr a repetiţiilor în tandem în urma amplificării PCR cu amorse complementare secvenţelor ce flanchează ADN-ul microsatelit (secvenţe conservate în cadrul speciei, uneori şi a genului). Avantajele markerilor SSR sunt date de: distribuţia lor uniformă în genom, polimorfism ridicat, posibilitatea de automatizare a analizelor, interpretarea simplă a rezultatelor, reproductibilitate mare şi codominanţă. Markerii SSR îşi găsesc aplicabilitate în genotipizarea indivizilor, evaluarea germoplasmei, a diversităţii genetice, cartarea genomului, amprentarea genetică, studii de filogenie şi de evoluţionism.

CAPITOLUL II. OBIECTIVELE CERCETĂRII, MATERIALUL ŞI METODA

2.2. MATERIALUL BIOLOGIC

Materialul biologic utilizat a fost reprezentat de 195 accesiuni menţinute la Staţiunea de Cercetare Dezvoltare Pomicolă Râmnicu Vâlcea. Dintre acestea, 61 au aparţinut genului Prunus, 54 genului Corylus, 27 genului Castanea şi 53 genului Juglans.

Toate analizele au fost efectuate în cadrul laboratorului de Biotehnologii din cadrul USAMV Cluj-Napoca.

5

Pentru analize, de la toate genurile menţionate mai sus, s-au recoltat frunze tinere care au fost păstrate, până la prelucrare, în congelator la o temperatură de –800C. Amorsele RAPD utilizate în amplificarea ADN-ului

Amplificarea probelor de ADN s-a realizat cu ajutorul a 43 de amorse decanucleotidice, toate provenind de la Microsynth. Amorsele SSR utilizate în amplificarea ADN-ului

Costul elaborării markerilor SSR atât prin metodele clasice, cât şi prin cele moderne, este relativ ridicat şi implică deţinerea experienţei în ceea ce priveşte realizarea şi screeningul bibliotecilor de gene. Pe de altă parte, mai mulţi autori (Wünsch şi Hormaza, 2002, Cipriani şi colab., 1999, Huang şi colab., 1998a, Downey şi Iezzoni, 2000, Yamamoto şi colab., 2001 şi Mnejja şi colab., 2005) au relevat transferabilitatea markerilor SSR în cadrul speciilor aparţinând aceluiaşi gen.

Având în vedere costul elaborării unor noi markeri SSR, datele privind transferabilitatea acestora interspecifică şi faptul că la speciile Prunus Juglans, Corylus şi Castanea deja existau date în literatură cu privire la realizarea şi testarea unor markeri SSR, nu s-a justificat crearea de către noi a unor noi markeri microsateliţi.

Amorsele SSR utilizate (Microsynth) au fost selecţionate din articole de specialitate (Boccacci şi colab., 2006 – genul Corylus; Marinoni şi colab., 2003 – genul Castanea; Dangl şi colab., 2005 – genul Juglans; Bianchi şi colab., 2003, Cipriani şi colab., 1999, Aranzana şi colab., 2002 – genul Prunus). 2.3. METODE DE LUCRU

Izolarea ADN-ului s-a făcut după protocolul lui Lodhi şi colab., (1994) îmbunătăţit de Rodica Pop şi colab. (2003).

Pentru aprecierea purităţii ADN-ului s-a utilizat metoda spectrofotometrică. Amplificarea PCR

Amplificarea a fost realizată cu ajutorul unui termocycler, PalmCycler (Corbett Research).

Produşii reacţiilor de amplificare cu amorse RAPD au fost separaţi într-un gel de agaroză de concentraţie 1,4% şi vizualizaţi cu ajutorul bromurii de etidiu în lumină ultravioletă.

În urma comparării cu ADN-ul standard s-a reuşit stabilirea mărimii fiecărui fragment amplificat. Prezenţa benzii cu aceeaşi mărime a fost notată cu 1, iar absenţa ei din accesiunile analizate, s-a notat cu 0. Analiza gelurilor s-a făcut cu ajutorul programului Total Lab TL 120, obţinându-se matricea binară.

Matricea binară s-a utilizat apoi pentru calcularea distanţelor genetice. Pentru calcularea distanţelor genetice şi realizarea dendrogramei s-a utilizat programul FreeTree 0.9.1.50, utilizând coeficientul Nei Li/Dice pentru distanţele genetice, respectiv metoda UPGMA pentru dendrogramă. 2.3.3. Metode de lucru aplicate în experienţele de amplificare cu amorse SSR

Atât sinteza amorselor, cât şi amplificarea PCR şi electroforeza capilară au fost realizate cu în laboratoarele Microsynth (Microsynth AG, 9436 Balgach, Elveţia).

ADN-ul matriţă folosit a fost diluat în soluţie Tris HCl la o concentraţie de 50ng/μl volum de reacţie.

Secvenţele amorselor au fost preluate din articole de specialitate, la fel şi condiţile de reacţie PCR, care au fost ulterior optimizate în laboratoarele Microsynth.

Produşii reacţiilor de amplificare cu amorse SSR au fost separaţi prin migrare

6

electroforetică capilară într-un secvenţiator ABI Prism 3730.

CAPITOLUL III. REZULTATE ŞI DISCUŢII

3.1. Rezultate privind extracţia probelor de ADN În urma extracţiei de ADN de la cele 61 de accesiuni din genul Prunus s-au obţinut

concentraţii între 94,62 şi 4340,2 ng/µl şi purităţi între 1,78 şi 1,99. În urma extracţiei de ADN de la cele 59 de accesiuni din genul Corylus, s-au obţinut

concentraţii între 119,84 şi 779,33 ng/µl şi purităţi între 1,60 şi 1,98. În urma extracţiei de ADN de la cele 53 de accesiuni din genul Juglans s-au obţinut

concentraţii între 161,88 şi 3331,91 ng/µl şi purităţi între 1,68 şi 1,99. A avut loc extracţia de ADN din 27 de accesiuni din genul Castanea. ADN-ul

obţinut a prezentat o concentraţie care a variat între 386,71 şi 2616,73 ng/µl şi o puritate între 1,72 şi 1,97.

ADN-ul extras a fost ulterior diluat cu apă ultrapură la o concentraţie finală a soluţiei de lucru de 50 ng/µl. 3.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD

Pentru testarea amorse cu câte 8 accesiuni din fiecare gen, trei repetiţii au fost realizate pentru fiecare amplificare, luându-se în calcul doar benzile vizibile prezente în toate cele 3 repetiţii. Amorsele care nu au dat rezultate reproductibile au fost eliminate de la analizele ulterioare. Reacţiile de amplificare cu amorsele RAPD la toate accesiunile din fiecare gen nu au fost repetate, deoarece scopul lor a fost unul de screening al accesiunilor.

Din cele 43 de amorse RAPD testate, au fost utilizate mai departe pentru evaluarea diversităţii genetice a tuturor accesiunilor un număr de 28 la genurile Prunus şi Castanea, 23 la genul Corylus şi respectiv 25 la genul Juglans. Acestea au fost alese în funcţie de numărul de benzi polimorfice date şi repetabilitatea amplificărilor. S-a observat lipsa produşilor de amplificare în cazul amorselor OPD 20 şi OPF 04 la toate accesiunile. Acest fapt se poate datora incompatibilităţii amorselor cu ADN-ul de amplificat. De asemenea, unele amorse (OPP 18, GY 169) au generat produşi de reacţie sub formă de dâră (smear), acestea neputând fi utilizate pentru analizarea tuturor accesiunilor.

Rezultatele obţinute de noi sunt un concordanţă cu cele publicate în literatura de specialitate (Nicese şi colab., 1998; Huang şi colab., 1998b), care indică faptul că tehnica RAPD poate fi folosită cu succes în programele de ameliorare la specii din genurile Prunus, Corylus, Juglans şi Castanea pentru caracterizarea genetică a unor accesiuni valoroase sau pentru evidenţierea similarităţii sau diferenţelor genetice între diferite genotipuri folosite ca forme parentale pentru obţinerea unor noi combinaţii genetice, valoroase. 3.2.1. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Prunus

Din cele 28 de amorse decamere utilizate, cele mai multe benzi polimorfice au fost obţinute cu amorsa OPC 04, (16), iar cele mai puţine cu amorsa OPF 13 (3). S-a obţinut un număr total de 240 de benzi polimorfice la cele 61 accesiuni din genul Prunus studiate, media fiind de 8,6 benzi polimorfice/amorsă.

7

3.2.2. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Corylus

La genul Corylus, din cele 23 de amorse RAPD folosite, cele mai multe benzi polimorfice au fost obţinute cu amorsa OPO 14 (15), iar cele mai puţine cu amorsa OPB 08 (5). Numărul total de benzi polimorfice obţinute la cele 54 accesiuni a fost de 216, media fiind de 9,4 benzi polimorfice/ amorsă. 3.2.3. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Juglans

Din cele 25 de amorse decamere utilizate, amorsele OPC 15, OPF 02, OPE 14 şi OPFI0 au dat cele mai multe benzi polimorfice, respectiv 16, iar amorsa OPA 01 cele mai puţine, respectiv 8. S-a obţinut un număr total de 311 benzi polimorfice la cele 49 de accesiuni din genul Juglans studiate, media fiind de 12,4 benzi polimorfice/ amorsă. 3.2.4. Rezultate privind amplificarea şi electroforeza produşilor de reacţie RAPD la genul Castanea

Din totalul de 28 de amorse decanucleotidice folosite la genul Castanea, cele mai multe benzi polimorfice au fost obţinute cu amorsa OPA 04 (16), iar cele mai puţine cu amorsa OPC 14 (4). În total au fost observate la cele 27 accesiuni un număr de 265 de benzi polimorfice, media fiind de 9,5 benzi polimorfice/ amorsă.

Din rezultatele prezentate anterior, se observă o diferenţă între numărul mediu de benzi polimorfice/ amorsă obţinute la cele patru genuri, cele mai multe fiind obţinute la genul Juglans. Acest fapt se poate datora heterogenităţii probelor studiate, sau faptului că au fost incluse în analiză trei specii diferite (Juglans regia, Juglans nigra şi Juglans cinerea), multe accesiuni reprezentând soiuri de origine diferită (Franţa, Caucaz, SUA), precum şi soiuri româneşti omologate sau în curs de omologare, hibrizi şi selecţii din populaţii locale. 3.3. Rezultate privind analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD 3.3.1. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Prunus

Analiza distanţelor genetice dintre accesiuni, calculate pe baza coeficientului Nei-Li/Dice, a evidenţiat faptul că cele mai apropiate accesiuni din punct de vedere genetic sunt perechile Andreea 2 şi Andreea 3, Stanley 1 şi 2, Tita şi Tita 1, Centenar 1 şi 2, Oteşani 1 şi 2, şi respectiv Mirobolan 1 şi 2, acestea fiind de fapt identice, distanţa genetică între ele fiind 0. Cea mai mare distanţă genetică, 0,6, s-a înregistrat între accesiunile Prunus tomentosa şi Prunus simonii, lucru ce se poate observa şi din dendrograma din figura 1. Distanţa medie a fost de 0,3. Dendrograma din figura 1 reprezintă relaţiile dintre accesiuni, aşa cum reies în urma analizelor cu amorsele RAPD. Se poate observa că grupul alcătuit din cele 2 accesiuni aparţinând speciei Prunus tomentosa s-a delimitat ca grup de referinţă (outgroup), nemaifiind nevoie de utilizarea unui grup de referinţă sintetic. Aceste accesiuni sunt cele mai îndepărtate genetic de restul accesiunilor, fiind de origine din China.

Din dendrogramă reiese faptul că accesiunile Andreea 2 şi Andreea 3 sunt identice, la fel Stanley 1 şi 2, Tita şi Tita 1, Centenar 1 şi 2, Oteşani 1 şi 2, Mirobolan 1 şi 2. Drept urmare, dintre acestea vor fi analizate mai departe cu amorse SSR, doar câte una.

8

0.1

P. Simonii Andreea Vanat RomanescAnna SpathFlora 64TitaTita 1100

30

Alutus aAlutus al100

13

AgenAgen 254

9

Stanley 4Stanley 1Stanley 2100

99

Andreea 2Andreea 3100

46

11

Rosior VaraticPescarusTuleu TimpuriuTuleu GrasCentenar 1Centenar 2100

3823

32

RivalTroianu 42

12

8

15

Minerva 1Tuleu Gras 145

22

Pixy Scoldus32

24

BuburuzOtesani 3Otesani 1Otesani 291

10068

19

46

Silvia Valcean 67

31

Renclod Althan Gras Ameliorat 3P 2000 CarpatinMinerva 4PorumbeleTuleu de Sinesti P236

2011

Verzisoare de OlteanVoinesti 47

13

1211

59

10

Prunus CerasiferaMiroval Prunus Japonica Mirobolan 1Mirobolan 2100

8038

18

8

14

Presenta Helena Tegera 61

78

3

Prunus Nigra Prunus Spinosa34

9

15

Blackamber Burbank 1Eldorado 52

28

68

Prunus BesseyiPrunus Besseyi a87

92

Prunus Tomentosa Prunus Tomentosa 250

100

Fig. 1. Dendrograma, generată de programul TreeView (Page, 1996), alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din genul Prunus, după metoda UPGMA,

utilizând coeficientul Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab., 2001)

9

Specia care prezintă cea mai mare variabilitate în genul Prunus este Prunus domestica (Bianchi şi colab., 2003). Studiile întreprinse de Gregor şi colaboratorii (1994), Ortiz şi colaboratorii (1997), Bellini şi colaboratorii (1998) şi Shimada şi colaboratorii (1999) au demonstrat că tehnica RAPD produce suficient polimorfism pentru amprentarea cultivarelor de prun.

Valorile prezentate în dreptul nodurilor dendrogramei reprezintă rezultatul analizei bootstrap asupra arborelui, executată în 1000 de repetiţii. Se poate observa că separarea între grupul alcătuit din cele 2 accesiuni de Prunus tomentosa şi grupul alcătuit din restul accesiunilor este sprijinită de o valoare foarte mare de bootstrap, respectiv 100. De asemenea, o valoare mare de bootstrap, de 92, susţine şi separarea grupului alcătuit din accesiunile Burbank, Blackamber şi Eldorado, aceste accesiuni fiind de origine asiatică şi aparţinând speciei Prunus salicina. Accesiunile de Prunus besseyi x Prunus americana formează de asemena un grup separat. Un alt grup este alcătuit din Prunus spinosa şi Prunus nigra, dar separarea lui de celelelate grupuri este susţinută de o valoare mică de bootstrap – 9. Accesiunile ce reprezintă soiuri de Prunus domestica obţinute la Hohenheim, respectiv Helena, Presenta şi Tegera se separă într-un grup aparte. Accesiunile de Mirobolan se grupează cu corcoduşul ornamental „Red castle”, cu Miroval (toate fac parte din specia Prunus cerasifera) şi Prunus japonica. Accesiunile ce provin din speciile Prunus domestica şi Prunus insititia sunt grupate împreună, dat fiind faptul că încă sunt discuţii cu privire la taxonomia speciei Prunus insititia, care este considerată de unii autori ca subspecie a speciei Prunus domestica (Cociu şi colab., 1997). Acest tip de grupare în dendrogramă a celor 2 specii este întâlnit şi la alţi autori (Casas şi colab., 1999).

Accesiunea P2000 P4, este de origine incertă, fiind rezultatul încrucişării libere dintre Prunus cerasifera şi altă accesiune. Având în vedere faptul că pe dendrogramă s-a grupat împreună cu accesiuni din speciile Prunus domestica şi Prunus insititia, se poate concluziona că celălat părinte aparţine uneia din aceste specii.

Studii anterioare au relevat eficienţa amorselor RAPD în ceea ce priveşte determinarea variabilităţii genetice la genul Prunus. Amprentarea genetică cu markeri RAPD la genuri care prezintă mare variabilitate genetică a fost realizată de Mulcahy şi colaboratorii (1993), Casas şi colaboratorii (1999), Monte-Corvo şi colaboratorii (2000).

Rezultatele obţinute sunt conforme cu cele prezente în literatură, amorsele RAPD reuşind să separe clar speciile de prun studiate, deşi a avut loc o singură amplificare cu fiecare amorsă, scopul analizei RAPD fiind unul de screening. Cu toate acestea, accesiunile identice au fost identificate şi o grupare pe specii a avut loc în cadrul dendrogramei. 3.3.2. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Corylus

Cea mai mică distanţă genetică este 0, între accesiunile care s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, iar cea mai mare distanţă genetică, 0,43, este între accesiunile Pauetet şi Cozia, media fiind de 0,24.

Amorsele RAPD utilizate, deşi au generat un nivel înalt de polimorfism, nu au grupat accesiunile de alun după origine sau pedigree. Aceasta se poate datora şi lipsei repetării analizelor, scopul lor de screening fiind atins odată cu identificarea accesiunilor identice.

10

0.1

outgroupRomaiFertile de Coutard 1Fertile de Coutard 3100

Okrogloplodna L 1Okrogloplodna L 2100

73

Tonda gentile R 1Tonda gentile R 3100

59

Tonda di Giffoni 1Tonda di Giffoni 3100

91

Closca Molla 1Closca Molla 2100

H 149-6-87 1H 149-6-87 2100

39

26

16

VL 22 1VL 22 3VL 22 526100

Romavel 1Romavel 2100

38

Ennis 1 Ennis 2 100

51

Extra Giaghli 1Extra Giaghli 2100

Morell 1Morell 2100

34

21

6

Sant Pere 3Red Lambert 3Red Lambert 5100

Red Lambert 4Red Lambert 6100

99

54

Pauetet 1Pauetet 2100

57

5

Riccia de TalanicoCorylus avellana 1Corylus avellana 2100

46

12

Uriase de Valcea 1Butler 1Butler 2100

Jamtegaard 1Jamtegaard 2100

67

31

90

Clarck 2Corabel 3

99

89

Cozia 1Cozia 2100

100

100

Fig. 2. Dendrograma, generată de programul TreeView (Page, 1996), alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din genul Corylus, după metoda UPGMA, utilizând coeficientul Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab.,

2001)

11

Din punct de vedere genetic, accesiunile din genul Corylus de la SCDP Vâlcea nu sunt foarte îndepărtate, valoarea maximă a distanţei genetice de 0,43 arătând acest fapt. Media distanţelor genetice este mai scăzută şi datorită prezenţei în mare masură a accesiunilor identice, între care distanţa genetică este 0.

Pentru alcătuirea dendrogramei din figura 2 s-a utilizat un grup de referinţă artificial. S-a verificat aranjarea arborelui prin analiza de tip bootstrap efectuată de 1000 de ori. Valorile prezente pe ramurile dendrogramei reprezintă rezultatele acesteia. Din figura 2 se poate observa că grupul format din accesiunile Cozia 1 şi 2 se diferenţiază de grupul format din restul accesiunilor, acestă grupare fiind susţinută de o valoare de bootstrap egală cu 100. Valoarea maximă de bootstrap o prezintă şi grupurile alcătuite din accesiuni identice.

Accesiunile cu aceeaşi denumire, doar cu cifre diferite (de ex.: Cozia 1 şi 2) s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, aceasta şi datorită faptului că unele au fost înmulţite vegetativ. Accesiunile Red Lambert fac excepţie de la această regulă, fiind împărţite în două grupuri distincte, fiecare formate din câte două accesiuni identice (3 cu 5 şi respectiv 4 cu 6). Cu toate acestea, ele sunt foarte similare din punct de vedere genetic, distanţa dintre grupe fiind de 0,087.

Autori care au utilizat markeri RAPD la genul Corylus au studiat cu ajutorul acestora probleme cum ar fi auto-incompatibilitatea (Pomper şi colab., 1998; Bassil şi Azarenko, 2001), caracterizarea genetică şi relaţii filogenetice (Radicati şi colab., 1997; Galderisi şi colab., 1999; Miaja şi colab., 2001). Datele obţinute de noi se armonizează cu cele din literatură, markerii RAPD putând diferenţia accesiunile studiate şi totodată putând evidenţia accesiunile identice din punct de vedere genetic.

Analiza RAPD reliefează faptul că următoarele accesiuni sunt identice din punct de vedere molecular: Fertile de Coutard 1 şi 3, Okrogloplodna Leska 1 şi 2, Tonda Gentile Romana 1 şi 3, Tonda di Giffoni 1 şi 3, Closca Molla 1 şi 2, H 149-6-87 1 şi 2, Extra Giaghli 1 şi 2, Red Lambert 3 şi 5 repectiv 4 şi 6, Pauetet 1 şi 2, C. Avellana 1 şi 2, Jamtegaard 1 şi 2 şi Cozia 1 şi 2. 3.3.3. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Juglans

Media distanţelor genetice între accesiunile din genul Juglans este 0,2, cea mai mică distanţă genetică este 0, între accesiunile care s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, iar cea mai mare distanţă genetică, 0,5, este între accesiunea Juglans cinerea şi accesiunea Supergiant.

Dendrograma UPGMA a fost realizată pe baza distanţelor genetice calculate cu programul FreeTree (Hampl şi colab., 2001) utilizând indicele Nei Li/Dice şi vizualizată cu programul TreeView (Page, 1996). S-a utilizat un grup de referinţă sintetic pentru înrădăcinarea arborelui, iar pentru verificarea acestuia s-a efectuat analiza bootstrap, repetată de 1000 de ori.

Nodurile arborelui sunt susţinute de valori de bootstrap relativ bune, după cum se observă în figura 3, dar gruparea rezultată în urma screening-ului cu markerii RAPD nu reflectă întocmai originea accesiunilor. Pentru o mai mare acurateţe repetarea analizelor ar fi fost necesară, dar având în vedere scopul propus, o singură reacţie a fost suficientă pentru identificarea accesiunilor identice. De altfel, amorsele RAPD utilizate au reuşit să deceleze accesiunile analizate, determinând o amprentă genetică specifică fiecărei accesiuni. Apariţia benzilor non-parentale între accesiuni a fost descrisă în studii

12

0.1

outgroupJuglans cinerea 1Argesan 1Argesan 1.1100

Muscelean 1Muscelean 3100

55

Mihaela 1Mihaela 2100

48

Germisara 5Germisara 5.1100

Hartley 1Lara 193

70

Velnita 2Velnita 8100

23

7

Valcor 1Valcor 2100

Valrex 3Valrex 4100

87

10

J.r.pendulaVL 202 338

Leopold 1Leopold 2100

16

O2Supergiant82

11

VL-1P3VL-1P430

38

J.r.purpurea 1J.r.purpurea 2P2100

1

Jupinesti 1Jupinesti 2100

Roxana 1Roxana 2100

19

Fernette 1Fernor 1VL 44 291

49

5

7

VL 202.1VL 202.2100

Valmit 2Valmit 3100

61

FranquetteFranquette 1100

21

19

Vina 1FerjeanVL 52 BVL 54 B 168

3334

46

Secular 1 Secular 2100

100

VL 102 H P1SerrVL-1P594

100

100

J.n.laciniata 1J.n.laciniata 2100

60

100

100

Fig. 3. Dendrograma, generată de programul TreeView (Page, 1996), alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din genul Juglans, după metoda UPGMA, utilizând coeficientul Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab.,

2001)

13

anterioare utilizând markerii RAPD (Hunt şi Page, 1992; Riedy şi colab., 1992; Aruna şi colab., 1993; Ayliffe şi colab., 1994; Pooler şi Scorza, 1995). Cauza acestui fenomen s-a încercat a fi explicată prin mai multe moduri: formarea moleculelor heteroduplex între alele, mutaţii sau recombinări la nivelul locusurilor de ataşare a amorsei sau în interiorul fragmentelor de amplificat, competiţia pentru locusurile de ataşare a amorsei sau rearanjări somatice în plantele perene (Nicese şi colab., 1998).

În literatură, soiurile Fernor şi Ferjean apar ca înrudite, ambele fiind împreună cu accesiunea Serr, aceasta arătând o posibilă înrudire între ele. Această alăturare de accesiuni este susţinută de o valoare foarte mare de bootstrap. Accesiunile Argeşan, Muscelean şi Mihaela s-au grupat împreună, în acelaşi segment din dendrogramă cu accesiunile Germisara, Hartley, Lara şi Velniţa. Unele accesiuni s-au dovedit a fi identice (Argeşan 1 cu Argeşan1.1, Muscelean 1 cu 3, Mihaela 1 cu 2, Germisara 5 cu 5.1, Velniţa 2 cu 8, Valcor 1 cu 2, Valrex 3 cu 4, Leopold 1 cu 2, Jupîneşti 1 cu 2, Roxana 1 cu 2, VL 202.1 cu VL 202.2, Valmit 2 cu 3, Franquette cu Franquette 1 şi Secular 1 cu 2).

Studii cu markerii RAPD pentru evidenţierea relaţiilor genetice dintre cultivaruri de nuc au fost executate de Nicese şi colaboratorii (1998). Acesta a utilizat 18 amorse RAPD pentru a diferenţia 19 genotipuri de nuc. Amorsele au produs o amprentă specifică pentru fiecare genotip inclus în studiu. Rezultatele obţinute de noi corespund cu cele prezentate de Nicese şi colab.(1998), în ceea ce priveşte capacitatea amorselor RAPD de a distinge genotipurile studiate, însă gruparea accesiunilor în cadrul dendrogramei diferă, repetarea analizelor cu amorsele RAPD putând duce la o nouă grupare, dar având în vedere scopul propus – de screening al accesiunilor – nu s-a considerat necesară repetarea analizelor. 3.3.4. Analiza imaginilor şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele RAPD la genul Castanea

Media distanţelor genetice între accesiunile din genul Castanea este 0,31, cea mai mică distanţă genetică este 0, între accesiunile care s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, iar cea mai mare distanţă genetică, 0,42, este între accesiunea VL 504 HZ şi grupul format din accesiunile Marissard (P1, P12, CA 122 P1 şi CA 122 P4). Dendrograma UPGMA din figura 4 a fost realizată pe baza distanţelor genetice calculate cu programul FreeTree (Hampl şi colab., 2001) utilizând indicele Nei Li/Dice şi vizualizată cu programul TreeView (Page, 1996). S-a utilizat un grup de referinţă sintetic pentru înrădăcinarea arborelui, iar pentru verificarea acestuia s-a efectuat analiza bootstrap, repetată de 1000 de ori.

Amorsele RAPD utilizate au reuşit să grupeze accesiunile în funcţie de specie, astfel că avem un grup format din accesiuni aparţinând speciei Castanea sativa şi un grup format din accesiuni rezultate în urma încrucişării Castanea sativa x Castanea crenata, respectiv Castanea crenata x Castanea sativa. Astfel, în figura 4, se observă cele două grupe.

Accesiunile VL 503 HZ P1, VL 503 HZ P2, VL 503 HZ P3 rând 2, VL 530 B P1, VL 530 B P2, Bouche rouge, VL 504 HZ, Marron Comballe CA 106 1, Marron Comballe CA 106 2, Castan precoce 2, Castan precoce 3 şi Castan precoce 4 fac parte din specia Castanea sativa şi se grupează separat de accesiunile Marsol CA 07 P1, Bournette P1 rând 1, Bournette CA 112, Bournette P1 rând 2, Precoce migoule (CA 48) P1, Precoce migoule (CA 48) P4, Marigoule CA 15 P1, Marigoule CA 15 P6, Maraval (CA 74) P11 rând 2, Maraval (CA 74) P1 şi Marissard P1, Marissard P12, Marissard CA 122 P1,

14

Marissard CA 122 P4, care sunt rezultate în urma încrucişării Castanea sativa x Castanea crenata, respectiv Castanea crenata x Castanea sativa. Această separare a celor 2 grupuri este susţinută de o valoare maximă de bootstrap, 100.

0.1

outgroup

Marsol CA 07 1

Bournette 1

Bournette 2

Bournette CA 11241

100

Precoce migoule 1

Precoce migoule 4100

70

Marigoule CA 1

Marigoule CA 6100

41

45

Marissard CA 4

Marissard CA 122 1

Marissard 12

Marissard 113

24

100

Maraval CA 74 1

Maraval CA 74 11100

86

54

VL 503 HZ 3

VL 503 HZ 1

VL 503 HZ 234

100

VL 530 1

VL 530 2100

47

Marron Comballe CA 1

Marron Comballe CA 2100

29

Castan precoce 4

Castan precoce 2

Castan precoce 333

100

63

Bouche rouge

VL 504 HZ97

75

100

100

Fig. 4. Dendrograma, generată de programul TreeView (Page, 1996), alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din genul Castanea, după metoda UPGMA, utilizând coeficientul Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree (Hampl şi colab.,

2001)

15

Accesiunile Castan precoce 2, 3 şi 4 reprezintă selecţii realizate la SCDP Vâlcea din populaţii locale de castani. Din punct de vedere fenologic se pot încadra în specia Castanea sativa, iar analizele moleculare efectuate susţin această încadrare (figura 4).

Multe accesiuni s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, respectiv:VL 503 HZ P1 cu VL 503 HZ P2 şi cu VL 503 HZ P3 rând 2; VL 530 B P1 cu VL 530 B P2; Marron Comballe CA 106 1 cu Marron Comballe CA 106 2; Castan precoce 2 cu Castan precoce 3 şi cu Castan precoce 4; Bournette P1 rând 1 cu Bournette CA 112 şi cu Bournette P1 rând 2; Precoce migoule (CA 48) P1 cu Precoce migoule (CA 48) P4; Marigoule CA 15 P1 cu Marigoule CA 15 P6; Maraval (CA 74) P11 rând 2 cu Maraval (CA 74) P1 şi Marissard P1 cu Marissard P12, cu Marissard CA 122 P1 şi cu Marissard CA 122 P4. Pentru analizele cu markeri microsateliţi în vederea caracterizării moleculare se va utiliza numai câte o accesiune dintre cele identice.

Valorile de boostrap pentru dendrograma generată la nivelul accesiunilor din genul Castanea sunt foarte bune şi bune, 8 din 12 noduri fiind susţinute de valori peste 50% (media de 81), celelalte 4 noduri fiind susţinute de valori cu media de 41.

Rezultatele obţinute de noi cu markerii RAPD la accesiunile din genul Castanea sunt similare celor prezente în literatură (Huang şi colaboratorii, 1998b, Morimoto şi colaboratorii, 1987) 3.4. Rezultate privind analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR

Toate cele 36 de amorse SSR utilizate au identificat produşi de amplificare la accesiunile studiate. Numărul de alele identificate de fiecare amorsă este cuprins între trei (amorsa WGA332 la genul Juglans) şi 26 (amorsa UDP98-410 la genul Prunus).

Accesiunile studiate au fost selecţionate în urma analizei de screening efectuată cu amorsele RAPD. Astfel, din grupurile de accesiuni care s-au dovedit a fi identice, câte o singură accesiune a fost analizată cu amorse SSR. De asemenea, au fost preferate pentru analiză accesiunile reprezentând soiuri româneşti omologate sau în curs de omologare. 3.4.1. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Prunus

Genul Prunus cuprinde specii cu grade diferite de ploidie. Din amorsele utilizate, amorsa UDP98-414 a identificat câte două alele/individ, restul identificând între trei şi nouă alele/individ. Datorită naturii poliploide a unor indivizi studiaţi, datele obţinute cu amorsele SSR pentru aceştia nu pot fi prelucrate cu programele specifice (în acest caz Genepop, deoarece acesta este conceput numai pentru organisme diploide (Raymond şi Rousset, 1995)), astfel s-au adoptat metode specifice datelor furnizate de markerii dominanţi, respectiv alcătuirea unei matrici de prezenţă/absenţă a alelelor (Rodzen şi colab., 2004, Hormaza, 2002). Genotipurile care prezintă numai un produs de reacţie au fost considerate ca homozigote la acel locus, deoarece pentru a se certifica prezenţa alelelor nule este necesară o analiză de segregare (Callen, 1993).

Cele mai multe alele/locus au fost identificate de amorsa UDP98-410, şi anume 26, iar cele mai puţine, patru alele, de amorsa UDP98-405. Mărimea alelelor a fost cuprinsă între 75 – 143 pb pentru amorsa UDP97-403, 97 – 103 pb pentru amorsa UDP98-405, 47 – 117 pb pb pentru amorsa UDP98-406, 87 – 133 pb pentru amorsa UDP98-412, 120 – 190 pb pentru amorsa UDP98-414, 162 – 254 pb pentru amorsa UDP98-407, 122– 186 pb pentru amorsa UDP98-410, 91 – 133 pb pentru amorsa UDP96-001 şi 118 – 301 pb pentru amorsa UDP96-008, date comparabile cu cele prezentate în literatura de specialitate (Hormaza, 2002, Wunsch şi Hormaza, 2002, Aranzana şi colab., 2002, Sosinski şi colab., 2000, Testolin şi colab., 2000). În total au fost obţinute 143 de alele,

16

numărul mediu de alele generate de amorsele SSR folosite (15,9) a fost superior celor menţionate în literatură, fapt ce se poate datora structurii materialului biologic studiat, care a aparţinut speciilor Prunus domestica, Prunus insititia şi Prunus salicina.

Cea mai mare variabilitate genetică în cadrul genului Prunus a fost identificată la nivelul speciei Prunus domestica (Bianchi şi colab., 2003), iar o mare parte din accesiunile luate în studiu din această specie au fost hexaploide.

Fiecare amorsă SSR utilizată a identificat atât alele rare (prezente la un număr redus de indivizi), cât şi alele unice (prezente la un singur individ din toţi ce studiaţi). Acest fapt se poate datora atât eşantionului relativ redus de probe, 23, cât şi marii heterogenităţi a acestora.

Cea mai mică valoare a distanţei genetice (0,093) s-a înregistrat între accesiunile Tuleu de Sineşti şi Tuleu gras, fapt confirmat şi în dendrograma din figura 5. Din punctul de vedere al distanţei genetice, considerăm că cele mai îndepărtate accesiuni analizate sunt Anna Spath P1 şi Blackamber R1P2, valoarea distanţei genetice dintre ele fiind de 0.958. Acest fapt poate fi datorat atât originii geografice îndepărtate a acestor accesiuni, dar mai ales apartenenţei lor la specii diferite (Prunus domestica, respectiv Prunus salicina).

Distanţa genetică medie între accesiuni, de 0,59, este influenţată de faptul că multe dintre accesiunile studiate reprezintă soiuri înrudite, respectiv atît descendenţi ai aceloraşi genitori, cât şi genitorii (Tuleu timpuriu este rezultatul încrucişării dintre Tuleu gras x Peche, Centenar este rezultatul încrucişării dintre Tuleu gras x Early Rivers, Carpatin este rezultatul încrucişării dintre Tuleu gras x Early Rivers, etc.).

Cu ajutorul programului FreeTree s-a realizat o dendrogramă UPGMA folosind coeficientul de similaritate genetică Nei-Li/Dice, care apoi a fost vizualizată cu ajutorul programului TreeView (Page, 1996) (figura 5). Consecvenţa arborelui a fost verificată prin analiza de tip bootstrap, cu 1000 de repetiţii, valorile caracteristice fiecărui nod fiind reprezentate pe dendrogramă. Pentru înrădăcinarea arborelui s-a utilizat un grup de referinţă sintetic (outgroup).

Din dendrogramă se poate observa că accesiunile analizate s-au grupat în funcţie de originea geografică sau de specia de provenienţă. Astfel, un grup aparte, respectiv cel mai îndepărtat, este format din accesiunile Blackamber R1P2 şi Burbank R4P1, care aparţin speciei Prunus salicina şi sunt de origine chino - japoneză.

Accesiunea Pixy R1P1, reprezentând un soi cu originea în Marea Britanie, de asemenea s-a separat de restul accesiunilor, la fel şi accesiunea Tita, care reprezintă un soi obţinut prin mutageneza artificială efectuată asupra soiului Tuleu gras. Astfel, accesiunea Pixy R1P1 a prezentat alele unice la amplificarea cu amorsele UDP97-403, UDP98-406, UDP98-414, UDP98-407 şi UDP98-410.

Accesiunea Troianu 10 P1, deşi este încadrată în specia Prunus insititia, din punct de vedere molecular aparţine speciei Prunus domestica, prezentând un număr mare de alele comune accesiunilor din această specie, care nu se regăsesc la accesiunile din specia Prunus insititia. Explicaţia acestor rezultate poate rezida în faptul că accesiunea Troianu 10 P1 fie este încadrată greşit din punct de vedere taxonomic, fie etichetarea din colecţia de germoplasmă este necorespunzătoare.

17

0.1

outgroup

Pixy R1P1

Tita

Vanat Romanesc P1

Troianu 10 P1

Tuleu Gras P4

Tuleu de Sinesti P2100

48

30

Carpatin R3 P1

Pescarus P132

8

Centenar P1

Minerva P145

Silvia P1

Valcean P248

23

4

Andreea P2

Anna Spath P129

4

Agen P1

Stanley P136

4

Rosior Varatic P1

Voinesti B2P1

Buburuz P1

Scoldus P141

16

12

Porumbele

Verzisoare de Oltean27

6

21

45

99

Blackamber R1P2

Burbank R4P199

100

100

Fig. 5. Dendrograma alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din

genul Prunus în urma analizei cu markeri SSR

18

3.4.2. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Corylus Markerii SSR au fost dezvoltaţi pentru genul Corylus de către Bassil şi Boccacci

(Bassil şi colab., 2004, Bassil şi colab., 2005, Boccacci şi colab., 2005) şi au fost utilizaţi pentru identificarea erorilor prezente în colecţiile de alun (Botta şi colab., 2004; Gokirmak şi colab., 2004) şi caracterizarea genetică a varietăţilor de alun iraniene (Ghanbari şi colab., 2004). Boccacci şi colaboratorii (2006) au caracterizat molecular 78 de cultivaruri de alun cu ajutorul a 16 amorse SSR.

Amorsa CaT-B107 a identificat cele mai multe alele/locus, zece, iar cele mai puţine alele/locus au fost identificate de amorsa CaT-B509, patru. Amorsa CaT-B107 a identificat la probele 40, 43 şi 45 (Romavel clona 1 P1, Morell P1 şi Extra Giaghli P1) câte trei alele/individ, deşi toate accesiunile din genul Corylus sunt diploide. De asemenea, amorsa CaT-B512 a identificat trei alele la proba 45, accesiunea Extra Giaghli. Explicaţia acestui fenomen rezidă în faptul că, deşi specifice, amorsele SSR pot amplifica mai multe regiuni din genom datorită prezenţei unor duplicaţii, astfel apărând mai mult de două alele/individ (Hormaza, 2002). În analizele genotipurilor cu ajutorul programelor Genepop sau Populations, aceste amorse nu pot fi luate în calcul, însă dacă se doreşte o abordare dominantă a acestor amorse prin alcătuirea unei matrici de prezenţă/absenţă a alelelor, amorsele care generează mai mult de două alele/individ nu prezintă nici o problemă (Hormaza, 2002).

Amorsele au identificat alele de diferite dimensiuni, cuprinse între 111 şi 141 pb – amorsa CaT-B107, 157 şi 183 pb – amorsa CaT-B504, 151 şi 165 pb – amorsa CaT-B508, 106 şi 114 pb – amorsa CaT-B509, 153 şi 173 pb – amorsa CaT-C001, 116 şi 134 pb – amorsa CaT-B501, 117 şi 131 pb – amorsa CaT-B503, 139 şi 153 pb – amorsa CaT-B511şi 136 şi 148 pb – amorsa CaT-B512.

Dimensiunile alelelor sunt comparabile cu cele prezentate în literatura de specialitate (Boccacci, 2005, Boccacci, 2006), cu menţiunea că datorită lipsei unui standard pot exista diferenţe de câteva perechi de baze între alelele studiate şi cele citate în literatură, generate de aparatura diferită utilizată (Wünsch şi Hormaza, 2002).

Au fost identificate alele unice cu amorsele CaT-B107, CaT-B504, CaT-B508, CaT-C001, CaT-B501, CaT-B511, CaT-B503 şi CaT-B512.

Prezenţa acestora poate fi datorată marii heterogenităţi a probelor. Amorsa CaT-B508 a identificat o alelă fixă, cu mărimea de 155 pb, prezentă la toţi indivizii studiaţi (Viruel şi colab., 2005, Escribano şi colab., 2004).

Cu amorsele SSR alese, s-a obţinut un număr total de 61 de alele, între patru şi 10 alele/amorsă, numărul mediu de alele obţinute/amorsă fiind de 6,8, comparabil cu datele din literatură (Boccacci şi colab., 2006).

Datele obţinute cu amorsele SSR au fost prelucrate într-o matrice binară, pe baza căreia au fost calculate distanţele genetice între accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetică Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree.

Distanţa genetică medie între accesiuni este de 0,58, iar cea mai mică valoare a distanţei genetice (0,273) s-a înregistrat între accesiunile Sant Pere P3 şi Negret P2, rezultat reprezentat şi în dendrograma din figura 6. Considerăm că cele mai îndepărtate accesiuni analizate sunt Corylus avellana T1 şi VL 22 c3, valoarea distanţei genetice între acestea fiind maximă (0,818).

19

0.1

outgroup

Okrogloplodna Leska

Negret P2

Sant Pere P3

65

Tonda di Giffoni P1

Tondagentile Romana

26

35

35

Corylus avellana T1

Riccia de Talanico

68

15

Butler c1 P1

Uriase de Valcea P1

80

16

Extra Giaghli P1

Romavel c1 P1

VL 22 c3

38

25

100

100

Fig. 6. Dendrograma alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din

genul Corylus în urma analizei cu markeri SSR

20

Cu ajutorul programului FreeTree s-a generat o dendrogramă UPGMA, folosind coeficientul de similaritate genetică Nei-Li/Dice, care apoi a fost vizualizată cu ajutorul programului TreeView (figura 6). Consecvenţa arborelui a fost verificată prin analiza de tip bootstrap, cu 1000 de repetiţii, valorile caracteristice fiecărui nod fiind reprezentate pe dendrogramă. Pentru înrădăcinarea arborelui s-a utilizat un grup de referinţă sintetic (outgroup).

Din figura 6 se poate observa că accesiunile studiate au format patru grupuri. Un grup este format din accesiunile VL 22 c3, Romavel c1 P1 şi Extra giaghli, un alt grup din accesiunile Butler c1 P1 şi Uriaşe de Vâlcea, al treilea grup din Riccia de Talanico şi Corylus avellana T1, iar ultimul grup cuprinde accesiunile Okrogloplodna Leska, Negret P2, Sant Pere P3, Tonda di Giffoni P1 şi Tondagentile Romana.

Accesiunile din genul Corylus de la SCDP Vâlcea, luate în studiu, au fost tratate ca o populaţie, calculând indici cum ar fi heterozigoţia şi homozigoţia aşteptate şi observate. Din analiza datelor au fost excluşi Amorsele SSR utilizate în studiul de faţă au reuşit să deceleze toate cele 12 accesiuni din genul Corylus analizate.

Studii recente (Boccacci şi colab., 2006) au demonstrat existenţa sinonimelor (Barcelona (SUA) – Fertile de Coutard (Franţa), Gironell (Spania) – Grossal (Spania)). De asemenea pentru mai multe cultivaruri siciliene, autorii cred că pot fi anumite erori în colecţii. Accesiunile din genul Corylus de la SCDP Vâlcea, luate în studiu, au fost tratate ca o populaţie, calculând indici cum ar fi heterozigoţia şi amorsele CaT-B107 şi CaT-B512 datorită prezenţei a mai mult de 2 alele/individ, această situaţie nefiind compatibilă cu programul utilizat.

Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,692 şi 0,889, cu o medie de 0,767. Valorile heterozigoţiei observate au prezentat un minim de 0,500 şi un maxim de 1,000, cu o medie de 0,810. Cea mai mare diferenţă între valoarea heterozigoţiei aşteptate şi cea observată (0,225) s-a înregistrat în cazul locusului CaT-B508.

Genotipurile actuale sunt rezultatul procesului de domesticire al alunului, realizat încă din antichitate. Deşi informaţia legată de originea cultivarelor actuale este foarte puţină, se presupune că au avut loc schimburi de germoplasmă ca urmare a migrării populaţiilor umane (Boccacci şi colab., 2006).

În populaţia formată din accesiunile de aluni de la SCDP Vâlcea, frecvenţele alelelor date de amorsele SSR pentru fiecare locus au variat între 0,042 şi 0,542, cu o medie de 0,16. Variabilitatea genetică la nivelul colecţiei de accesiuni din genul Corylus de la SCDP Vâlcea este mare, fapt datorat provenienţei diferite a acestora. 3.4.3. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Juglans

Din totalul de nouă amorse SSR utilizate pentru amplificarea ADN-ului provenit de la cele 23 de accesiuni din genul Juglans, toate au identificat alele, cele mai multe (22), fiind obţinute cu amorsa WGA349, iar cele mai puţine, 3, cu amorsa WGA332. Mărimile alelelor generate de diferitele amorse SSR se înscriu în limitele celor citate în literatură (Robichaud şi colab., 2006, Victory şi colab., 2006, Dangl şi colab., 2005, Foroni şi colab., 2006), astfel că amorsa WGA276 a identificat alele cu lungimi cuprinse între 152 şi 188 pb, amorsa WGA1* alele cuprinse între 174 şi 190 pb, amorsa WGA69 alele cuprinse între 158 şi 178 pb, amorsa WGA89 alele cuprinse între 210 şi 220 pb, amorsa WGA118 alele cuprinse între 182 şi 198 pb, amorsa WGA202 alele cuprinse între 246 şi 296 pb, amorsa WGA349 alele cuprinse între 241 şi 321 pb, amorsa WGA376 alele

21

cuprinse între 229 şi 255 pb şi amorsa WGA332 alele cuprinse între 213 şi 222 pb. Amorsele WGA202 şi WGA349 au amplificat mai mult decât o singură regiune din genom, rezultând mai mult de două alele/individ şi au fost eliminate de la interpretarea rezulatelor cu programul Genepop, deoarece acesta este special conceput pentru organisme diploide, fiind imposibilă prelucrarea datelor indivizilor ce prezintă mai mult de două alele la un locus (Raymond şi Rousset, 1995). Astfel, pentru determinarea distanţelor genetice între accesiunile studiate, s-au adoptat metode specifice datelor furnizate de markerii dominanţi, respectiv alcătuirea unei matrici de prezenţă/absenţă a alelelor (Rodzen şi colab., 2004, Hormaza, 2002). Genotipurile care prezintă numai un produs de reacţie au fost considerate ca homozigote la acel locus, deoarece pentru a se certifica prezenţa alelelor nule este necesară o analiză de segregare (Callen, 1993).

Toate amorsele utilizate, mai puţin WGA69 şi WGA332, au generat alele unice, fapt care se poate explica prin numărul relativ mic de probe analizate (25) şi prin marea lor heterogenitate, specifică unei colecţii naţionale.

Amorsele SSR alese au generat un număr total de 82 de alele, între trei şi 22 alele/amorsă, numărul mediu de alele obţinute/amorsă fiind de 9,1, comparabil cu datele din literatură (Robichaud şi colab., 2006).

Datele obţinute cu amorsele SSR au fost prelucrate într-o matrice binară, pe baza căreia au fost calculate distanţele genetice între accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetică Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree.

Cea mai mică valoare a distanţei genetice (0,256) s-a înregistrat între accesiunile VL 52 B şi VL 54 B P1, rezultat reprezentat şi în dendrograma din figura 7. Din puntul de vedere al distanţei genetice considerăm că cele mai îndepărtate accesiuni analizate sunt Velnita c8, şi O2, valoarea distanţei genetice între acestea fiind de 0,95. Distanţa genetică medie înregistrată între accesiuni este de 0,59.

Cu ajutorul programului FreeTree s-a generat o dendrogramă UPGMA, folosind coeficientul de similaritate genetică Nei-Li/Dice, care apoi a fost vizualizată cu ajutorul programului TreeView (figura 7).

Consistenţa arborelui a fost verificată prin analiza de tip bootstrap, cu 1000 de repetiţii, valorile caracteristice fiecărui nod fiind reprezentate pe dendrogramă. Pentru înrădăcinarea arborelui s-a utilizat un grup de referinţă sintetic (outgroup).

Din figura 7 se poate observa că accesiunile studiate au format două grupuri. Astfel, accesiunile care reprezintă soiuri autohtone sau selecţii din populaţii locale formează un grup, împărţit la rândul lui în două subgrupuri, iar accesiunile care reprezintă soiuri de provenineţă străină formează un alt grup. Deşi s-a utilizat un grup de referinţă sintetic, accesiunea O2 se detaşează de celelalte, putând fi utilizată ca outgroup. Această detaşare este în concordanţă cu originea îndepărtată a acestei accesiuni, respectiv Caucaz.

De asemenea, accesiunile Supergiant (de origine americană) şi Velniţa c8, care reprezintă un soi românesc obţinut în urma selecţiei populaţiilor locale din zona Deleni, Iaşi, s-au grupat separat de restul accesiunilor. Aceste accesiuni prezintă o alelă specifică cu amorsa WGA 276, care nu este întâlnită la restul accesiunilor, care poate fi rezultatul evoluţiei convergente, şi, de asemenea, nu prezintă alele specifice celorlalte accesiuni

În grupul format din accesiunile ce reprezintă soiuri sau selecţii din populaţii locale, accesiunea VL 202 PO c3 se detaşeză de toate celelalte, deşi provine dintr-o selecţie din populaţiile locale din zona Păuşeşti – Otăsău, la fel ca accesiunea VL 202 PO P1, care este grupată împreună cu accesiunile ce reprezintă soiuri sau selecţii din populaţii din

22

zona Vâlcea. Această grupare este susţinută de o valoare mică de bootstrap, respectiv patru, fiind necesare analize mai detaliate pentru stabilirea exactă a poziţiei acestei accesiuni pe dendrogramă.

0.1

outgroup

O2

VL 202 PO c3

VL 44 B P2

VL 202 PO P1

Valmit c3

VL 52 B

VL 54 B P1100

43

26

Valcor c1

Valrex c458

9

8

Jupinesti P1

Muscelean c3

Argesan c1

Roxana P135

22

16

Germisara c5

Secular c1 16

1

2

4

Serr

Ferjean

Hartley c1

Franquette

Fernor P1

Lara c 154

42

29

10

32

11

Supergiant

Velnita c849

74

100

100

Fig. 7. Dendrograma alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din

genul Juglans în urma analizei cu markeri SSR

23

După cum se poate observa din dendrogramă, accesiunile Jupâneşti P1, Muscelean c3, Argeşan c1, Roxana P1, Germisara c5 şi Secular c1 formează un subgrup în cadrul grupului ce conţine accesiuni autohtone. Aceste accesiuni reprezintă soiuri obţinute în zona Piteşti (Jupâneşti), Argeş (Roxana, Muscelean, Argeşan) sau Hunedoara (Germisara). Accesiunile care formează al doilea subgrup (VL 44B P2, VL 202 PO P1, Valmit c3, VL 52 B, VL 54 B P1, Valcor c1 şi Valrex c4) din cadrul grupului ce conţine accesiuni autohtone, au fost toate obţinute la SCDP Vâlcea în urma selecţiei din populaţii locale.

Grupul format din accesiunile care reprezintă soiuri de origine străină (Franţa, SUA), cuprinde următoarele: Ferjean, Serr, Franquette, Fernor P1, Lara c1 şi Hartley c1. Accesiunea Fernor se situează pe dendrogramă între accesiunile Franquette şi Lara, soiul Fernor fiind obţinut în urma încrucişării dintre soiurile Franquette şi Lara.

Amorsele SSR utilizate în studiul de faţă, au reuşit să deceleze toate cele 23 de accesiuni analizate. Deşi accesiunile VL 202 PO c3 şi VL 202 PO P1 reprezintă selecţii din populaţii locale din zona Păuşeşti – Otăsău, din punct de vedere genetic sunt îndepărtate, acest fapt putând reprezenta marea variabilitate a fondului genetic iniţial.

Accesiunile din genul Juglans de la SCDP Vâlcea, luate în studiu, au fost tratate ca o populaţie, calculând indici cum ar fi heterozigoţia şi homozigoţia aşteptate şi observate. Din analiza datelor au fost excluse amorsele WGA349 şi WGA202, datorită generării a mai mult de 2 alele/individ, această situaţie nefiind compatibilă cu programul utilizat.

Heterozigoţia (Het) şi homozigoţia (Hom) aşteptate au fost calculate cu coeficientul de corecţie al lui Levene, cu ajutorul programului Genepop (Raymond şi Rousset, 1995). Datele indică faptul că populaţia de nuci luată în studiu, respectiv accesiunile de la SCDP Vâlcea, nu se găseşte în echilibru Hardy-Weinberg, heterozigoţia observată (HetObs) fiind mult mai mare decât homozigoţia observată (HomObs).

Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0, 595 şi 0,879, cu o medie de 0,716. Valorile heterozigoţiei observate au prezentat un minim de 0,565 şi un maxim de 0,783, cu o medie de 0,665. Cea mai mare diferenţă între valoarea heterozigoţiei aşteptate şi cea observate (0,175) s-a înregistrat în cazul locusului WGA69.

În populaţia formată din accesiunile de nuci de la SCDP Vâlcea, frecvenţele alelelor date de amorsele SSR pentru fiecare locus au variat între 0,022 şi 0,565, cu o medie de 0,15.

Datele privind heterozigoţia observată, heterozigoţia aşteptată şi frecvenţele alelelor obţinute cu cele nouă amorse SSR sunt asemănătoare celor prezentate în literatură (Robichaud şi colab., 2006, Foroni şi colab., 2006, Dangl şi colab., 2005).

Variabilitatea genetică la nivelul colecţiei de accesiuni din genul Juglans de la SCDP Vâlcea este mare, fapt datorat provenienţei diferite a acestora. 3.4.4. Analiza şi interpretarea datelor obţinute cu amorsele SSR la genul Castanea

Colecţia de castani comestibili de la SCDP Vâlcea cuprinde atât soiuri franceze, rezultate a încrucişărilor dintre Castanea sativa x Castanea crenata, cât şi soiuri româneşti în omologare, selecţii din populaţii locale, aparţinând speciei Castanea sativa.

Toate cele nouă amorse utilizate la genul Castanea au identificat alele cu mărimi cuprinse între 76 şi 266 pb. Cel mai mare număr de alele a fost obţinut în cazul amorsei CsCAT2 (21), iar cele mai puţine alele (5) s-au obţinut cu amorsa EMCs17.

Datele obţinute sunt comparabile cu cele din literatură (Buck şi colaboratorii, 2003, Marinoni şi colaboratorii, 2003), cu menţiunea că amorsele EMCs38, CsCAT2, CsCAT4,

24

EMCs32 şi EMCs22 au amplificat un număr mai mare de două alele/individ, găsind mai multe zone complementare în genomurile accesiunilor studiate, probabil datorită apariţiei duplicaţiilor. Cu toate că acest fapt nu prezintă probleme pentru alcătuirea unei matrici bazată pe prezenţa/absenţa alelelor de la un locus, pentru interpretarea cu programul Genepop amorsele respective au fost înlăturate.

Toate amorsele SSR utilizate au identificat alele unice (prezente la un singur individ din toţi ce studiaţi). Acest fapt se poate datora atât eşantionului relativ redus de probe, 12, cât şi marii heterogenităţi a acestora.

Datele obţinute cu amorsele SSR au fost prelucrate într-o matrice binară, pe baza căreia au fost calculate distanţele genetice între accesiuni pe baza coeficientului de similaritate genetică Nei-Li/Dice cu ajutorul programului FreeTree.

Cea mai mică valoare a distanţei genetice (0,25) s-a înregistrat între accesiunile VL 503 HZP1 şi VL 504 HZ. Cea mai mare valoare a distanţei genetice (0,89) s-a înregistrat între accesiunile Precoce migoule 48P1 şi Bouche rouge. Acest fapt poate fi datorat apartenenţei lor la specii diferite (hibrid interspecific Castanea crenata x Castanea sativa, respectiv Castanea sativa). Distanţa genetică medie între accesiuni, de 0,69, este relativ mare şi poate fi datorată atât apartenenţei acestora la două specii diferite, cât şi originii îndepărtate a cultivarurilor reprezentate (România, Franţa).

Apropierea genetică între cele 12 accesiuni din genul Castanea analizate, stabilită pe baza matricei distanţelor genetice şi a algoritmului UPGMA, este prezentată în figura 8 sub forma unei dendrograme.

Cu ajutorul programului FreeTree s-a generat o dendrogramă UPGMA folosind coeficientul de similaritate genetică Nei-Li/Dice, care apoi a fost vizualizată cu ajutorul programului TreeView (figura 8). Consecvenţa arborelui a fost verificată prin analiza de tip bootstrap, cu 1000 de repetiţii, valorile caracteristice fiecărui nod fiind reprezentate pe dendrogramă. Pentru înrădăcinarea arborelui s-a utilizat un grup de referinţă sintetic (outgroup).

Din figura 8 se poate observa că accesiunile au format două grupuri, în funcţie de specia la care aparţin. Astfel, accesiunile Bouche Rouge, Castan precoce c2, Marron Comballe 106, VL 530 BP1, VL 503 HZP1 şi VL 504 HZ formează un grup, ele aparţinând speciei Castanea sativa, iar accesiunile Precoce Migoule 48 P1, Bournette P1r2, Maraval 74P1, Marsol 07P1, Marigoule 15P1 şi Marissard P1formează un alt grup, ele fiind hibrizi interspecifici Castanea crenata x Castanea sativa. Ş

Apartenenţa accesiunii Castan precoce c2 la specia Castanea sativa era incertă, dar rezultatele noastre indică faptul că este corectă. Acesata reiese din numărul mare de alele comune cu cele care apar la Castanea sativa după cum se desprinde si din analiza dendrogramei.

Accesiunile VL 530 BP1, VL 503 HZP1 şi VL 504 HZ formează un subgrup, toate reprezentând soiuri în curs de omologare, selecţii din populaţii locale din zona Vâlcea. Accesiunea Castan precoce c2, deşi reprezintă tot o selecţie din populaţiile locale din zona Vâlcea, s-a grupat cu două accesiuni ce reprezintă soiuri franceze, prezentând un număr mare de alele comune cu acestea.

Amorsele SSR utilizate în studiul de faţă, au reuşit să deceleze toate accesiunile din genul Castanea analizate şi între acestea nu au fost evidenţiate accesiuni identice.

25

0.1

outgroup

Bouche rouge

Castan precoce c2

Marron Comballe 106

39

32

VL 530 BP1

VL 503 HZP1

VL 504 HZ

92

94

53

Precoce migoule 48P1

Bournette P1r 2

Maraval 74P1

66

50

Marsol 07P1

Marigoule 15P1

Marissard P1

83

52

70

100

100

Fig. 8. Dendrograma alcătuită pe baza distribuţiei genetice dintre unele accesiuni din

genul Castanea în urma analizei cu markeri SSR

26

Accesiunile din genul Castanea de la SCDP Vâlcea, luate în studiu, au fost tratate ca o populaţie, calculând indici cum ar fi heterozigoţia aşteptate şi observate. Din analiza datelor au fost excluse amorsele CsCAT4, CsCAT2, EMCs32, EMCs38 şi EMCs22 datorită generării a mai mult de 2 alele/individ, această situaţie nefiind compatibilă cu programul utilizat (Genepop).

Heterozigoţia aşteptată (HetExp) şi observată (HetObs) şi, respectiv, homozigoţia aşteptată (HomExp) şi observată (HomObs) au fost calculate cu coeficientul de corecţie al lui Levene, cu ajutorul programului Genepop (Raymond şi Rousset, 1995). Datele indică faptul că populaţia de castani luată în studiu, respectiv accesiunile de la SCDP Vâlcea, nu se găseşte în echilibru Hardy-Weinberg, heterozigoţia observată fiind mult mai mare decât homozigoţia observată.

Valorile heterozigoţiei aşteptate au variat între 0,714 şi 0,848, cu o medie de 0,807. De asemenea, valorile heterozigoţiei observate au prezentat un minim de 0,667 şi un maxim de 0,917, cu o medie de 0,792. Cea mai mare diferenţă între valoarea heterozigoţiei aşteptate şi cea observate (-0,203) s-a înregistrat în cazul locusului EMCs17.

În populaţia formată din accesiunile de castani de la SCDP Vâlcea, frecvenţele alelelor date de amorsele SSR pentru fiecare locus au variat între 0,042 şi 0,458, cu o medie de 0,15.

Rezultatele obţinute se armonizează cu cele prezentate în literatură (Tanaka şi colaboratorii (2005), Lang şi colaboratorii (2006a), Barreneche şi colaboratorii (2003), Buck şi colaboratorii (2003) şi Marinoni şi colaboratorii (2003)).

CAPITOLUL IV. CONCLUZII

Concluziile desprinse în urma analizelor efectuate la genul Prunus sunt următoarele:

• La genul Prunus, în urma screeningului efectuat prin metoda RAPD, accesiunile s-au grupat în funcţie de specie, fiind prezente şi accesiuni identice, a căror păstrare în banca de gene se poate realiza sub denumirea de „clone”.

• Accesiunile din speciile Prunus domestica şi Prunus insititia s-au grupat împreună, acest fapt susţinând teoriile cu privire la taxonomia speciei Prunus insititia, conform cărora aceasta este considerată o subspecie a speciei Prunus domestica (Cociu şi colab., 1997).

• Accesiunea P2000 P4, de origine incertă, fiind rezultată în urma încrucişării libere dintre Prunus cerasifera şi altă accesiune, pe dendrogramă s-a grupat împreună cu accesiuni din speciile Prunus domestica şi Prunus insititia, astfel se poate concluziona că celălat părinte aparţine unuia din acesti taxoni.

• Rezultatele obţinute sunt conforme cu cele prezente în literatură, amorsele RAPD reuşind să separe clar speciile de prun studiate, deşi a avut loc o singură amplificare cu fiecare amorsă, scopul analizei RAPD fiind unul de screening.

• În urma analizelor SSR la accesiunile din genul Prunus de la SCDP Vâlcea, a fost obţinut un număr total de 143 de alele şi un număr mediu de 15,9 alele/amorsă, superior datelor prezentate în literatură, fapt datorat tipului de probe studiate, care au aparţinut unor specii diferite şi au prezentat grade de ploidie diferite (Prunus domestica – accesiuni hexaploide, Prunus insititia – accesiuni hexaploide şi Prunus salicina – accesiuni diploide).

27

• Au fost identificate între accesiunile analizate cu amorsele SSR atât alele rare, cât şi unice, fapt datorat eşantionului relativ redus de probe, 23, şi marii heterogenităţi a acestora.

• În urma prelucrării datelor obţinute cu amorsele SSR, s-a obţinut o dendrogramă care reflectă distanţele genetice dintre accesiunile studiate. Astfel, accesiunile analizate s-au grupat în funcţie de originea geografică şi de specia de provenienţă. Concluziile desprinse în urma analizelor efectuate la genul Corylus sunt următoarele:

• Analizele RAPD au arătat că accesiunile din genul Corylus de la SCDP Vâlcea nu sunt foarte îndepărtate din punct de vedere genetic, media distanţelor genetice fiind mai scăzută şi datorită prezenţei în mare masură a accesiunilor identice, între care distanţa genetică este egală cu zero.

• Accesiunile din genul Corylus a căror denumire diferă doar prin numerotarea lor (de ex.: Cozia 1 şi 2) s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic, aceasta şi datorită faptului că unele au fost înmulţite vegetativ. Accesiunile Red Lambert fac excepţie de la această regulă, fiind împărţite în două grupuri distincte, fiecare formate din câte două accesiuni identice (3 cu 5 şi respectiv 4 cu 6). Cu toate acestea, ele sunt foarte similare din punct de vedere genetic, distanţa dintre grupe fiind de 0,087.

• Amorsele SSR au generat la accesiunile studiate din genul Corylus un număr de 61 de alele, cu o medie de 6,8 alele/amorsă, date comparabile cu cele din literatură.

• Atît dendrograma generată în urma prelucrării datelor obţinute prin analizele SSR, cât şi indicii de heterozigoţie şi homozigoţie aşteptată şi, respectiv, observată, indică faptul că variabilitatea genetică la nivelul colecţiei de accesiuni din genul Corylus de la SCDP Vâlcea este mare, fapt datorat provenienţei diferite a acestora.

• Genotipurile actuale sunt rezultatul procesului de domesticire al alunului, realizat încă din antichitate. Deşi informaţia legată de originea cultivarelor actuale este foarte redusă, se poate presupune că au avut loc schimburi de germoplasmă ca urmare a migrării populaţiilor umane, fapt consemnat şi de către Boccacci şi colab. (2006). Concluziile desprinse în urma analizelor RAPD la genul Juglans sunt următoarele:

• Amorsele RAPD utilizate pentru amplificarea ADN–ului izolat din accesiunile aparţinând genului Juglans au reuşit să identifice accesiunile identice din colecţia de la SCDP Vâlcea.

• Distanţa genetică medie dintre accesiuni nu s-a dovedit a fi foarte mare, deşi au fost analizate probe aparţinând unor specii diferite, rezultat influenţat de prezenţa accesiunilor identice, între care distanţa genetică este egală cu zero.

• Amorsele SSR utilizate pentru analizarea accesiunilor din genul Juglans au generat în total un număr de 82 de alele, cu o medie de 9,1 alele/amorsă, date comparabile cu cele din literatură.

• În urma prelucrării datelor obţinute cu markerii SSR, accesiunile studiate s-au grupat în funcţie de originea lor geografică. Astfel, toate accesiunile provenind de la SCDP Vâlcea au format un grup separat de accesiunile de origine străină. Excepţie de la această grupare face accesiunea Velniţa c8, care s-a grupat cu accesiunea Supergiant. Aceste accesiuni prezintă o alelă specifică cu amorsa WGA 276, care nu este întâlnită la restul accesiunilor, care poate fi rezultatul evoluţiei convergente, şi, de asemenea, nu

28

prezintă alele specifice celorlalte accesiuni. • Accesiunile VL 202 PO c3 şi VL 202 PO P1, deşi reprezintă selecţii din

populaţii locale din zona Păuşeşti – Otăsău, din punct de vedere genetic sunt îndepărtate, acest fapt putând reprezenta marea variabilitate a fondului genetic iniţial. Concluziile desprinse în urma analizelor RAPD la genul Castanea sunt următoarele:

• În urma analizelor cu markerii RAPD, accesiunile din genul Castanea de la SCDP Vâlcea au fost grupate în funcţie de specie, astfel că a rezultat un grup format din accesiuni aparţinând speciei Castanea sativa şi un grup format din accesiuni rezultate în urma încrucişării Castanea sativa x Castanea crenata, respectiv Castanea crenata x Castanea sativa.

• În cazul accesiunilor Castan precoce 2, 3 şi 4, care reprezintă selecţii realizate la SCDP Vâlcea din populaţii locale de castani şi a căror apartenenţă la specia Castanea sativa era demonstată doar din punct de vedere fenologic, se poate afirma că analizele moleculare efectuate susţin această încadrare.

• Multe accesiuni s-au dovedit a fi identice din punct de vedere genetic în urma analizelor cu markerii RAPD, astfel se recomandă menţinerea lor în colecţie sub denumirea de „clonă”.

• În urma analizelor SSR la accesiunile din genul Castanea de la SCDP Vâlcea, a fost obţinut un număr total de 83 de alele şi un număr mediu de 9,2 alele/amorsă, comparabil cu datele regăsite în literatură, de asemenea nu au fost identificate alele fixe.

• Prelucrarea datelor obţinute cu markerii SSR a dus la gruparea accesiunilor analizate în funcţie de specie.

• De asemenea, s-a stabilit apartenenţa accesiunii Castan precoce c2 la specia Castanea sativa.

• Distanţa genetică medie între accesiuni s-a dovedit a fi relativ mare şi poate fi datorată atât apartenenţei acestora la două specii diferite, cât şi originii îndepărtate a cultivarelor analizate (România, respectiv Franţa). RECOMANDĂRI

• Datele obţinute în studiul de faţă se recomandă a fi integrate cu datele morfologice, fenologice şi biometrice pentru a identifica cu acurateţe cultivarele existente în colecţiile de germoplasmă. De asemenea se recomandă utilizarea lor pentru protecţia legală a cultivarelor.

• Datorită lipsei informaţiilor cu privire la pedigree sau paşaport, lucruri frecvent întâlnite pentru multe din speciile pomicole (Warburton şi Bliss, 1996), dar şi având în vedere distanţa dintre generaţii, respectiv durata procesului de ameliorare, se recomandă alegerea genitorilor în programele de ameliorare şi în funcţie de datele oferite de markerii SSR.

• Prin studiul de faţă s-a demonstrat o caracteristică importantă a markerilor SSR, şi anume, transferabilitatea acestora în cadrul speciilor aparţinând aceluiaşi gen, evidenţiată şi de alte studii realizate în domeniu (Wunsch şi Hormaza, 2002, Cipriani şi colab., 1999, Huang şi colab., 1998, Downey şi colab., 2000, Yamamoto şi colab., 2001, Mnejja şi colab., 2005 şi Rohrer şi colab., 2004). Astfel, se recomandă utilizarea markerilor SSR pentru analize interspecifice ale speciilor aparţinând aceluiaşi gen.

29

30

• Se recomandă prelucrarea datelor generate de markerii SSR (codominanţi) printr-o manieră specifică markerilor dominanţi (realizarea unor matrici de prezenţă/absenţă a alelelor), pentru analizarea indivizilor hexaploizi, care prezintă un număr mai mare de două alele/amorsă/individ, această situaţie nefiind compatibilă cu programele specifice de prelucrare a datelor provenite de la markerii codominanţi.

• Se recomandă continuarea cercetărilor în ceea ce priveşte caracterizarea moleculară a accesiunilor şi a soiurilor autohtone, pentru a creşte valoarea informaţiilor din băncile de gene.

Bibliografie selectivă 1. ARANZANA, M.J., GARCIA-MAS, J., CARBO, J., ARUS, P., 2002, Development and variability analysis of microsatellite markers in peach, Plant Breeding 121: 87–92. 2. ARUNA, M., OZIASAKINS, P. şi AUSTIN, M.E., 1993, Genetic relatedness among rabbiteye blueberry (Vaccinium ashei) cultivars determined by DNA amplification using single primers of arbitrary sequence, Genome 36: 971–977. 3. AYLIFFE, M.A., LAWRENCE, G.J., ELLIS, J.G. şi PRYOR, A.J., 1994, Heteroduplex molecules formed between allelic sequences cause nonparetnal RAPD bands, Nucl Acids Res 22(9): 1632–1636. 4. BARRENECHE, T., CASASOLI, M., RUSSELL, K., AKKAK, A., VILLANI, F. şi KREMER, A., 2002, Comparative genetic mapping between Quercus robur L. and Castanea sativa Mill, Plant Animal & Microbe Genomes X January: 12–16. 5. BASSIL, N.V., BOTTA, R. şi MEHLENBACHER, S.A., 2005, Microsatellites markers in the hazelnut: isolation, characterization and cross-species amplification in Corylus, J. Am. Soc. Hortic. Sci.130: 543-549. 6. BASSIL, N.V., BOTTA, R., şi MEHLENBACHER, S.A., 2004, Additional microsatellites of the European hazelnut, Acta Hort. 686: 105-110. 7. BASSIL, N.V., şi AZARENKO, A.N., 2001, RAPD markers for selfincompatibility in Corylus avellana L., Acta Hort. 556: 537–543. 8. BELLINI, E., GIORDANI, E., NENECETTI, V., PAFFETTI, D., 1998, Genetic relationships in japanese plum cultivars by molecular markers, ACTA HORT. 478: 53-59. 9. BIANCHI, J.V., FACHINELLO, J.C., WULFF, S.M., 2003, RAPDs na caracterização genético-molecular e no estudo da variabilidade genética de cultivares de ameixeira, Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 25, n. 2, p. 272-274. 10. BIANCHI, J.V., FACHINELLO, J.C., WULFF, S.M., 2003, RAPDs na caracterização genético-molecular e no estudo da variabilidade genética de cultivares de ameixeira, Rev. Bras. Frutic., Jaboticabal - SP, v. 25, n. 2, p. 272-274. 11. BOCCACCI, P., AKKAK, A., BASSIL, N.V., MEHLENBACHER, S.A. şi BOTTA, R., 2005, Characterization and evaluation of microsatellite loci in European hazelnut (Corylus avellana L.) and their transferability to other Corylus species, Mol. Ecol. Notes 5: 934-937. 12. BOCCACCI, P., AKKAK, A., BOTTA, R., 2006, DNA typing and genetic relations among European hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars using microsatellite markers, Genome 49, pp. 598-611. 13. BOTTA, R., AKKAK, A. şi BOCCACCI, P., 2004, DNA-typing of hazelnut: a universal methodology for describing cultivars and evaluating genetic relatedness, Acta Hort. 686: 117-124. 14. BOWERS, J. E., DANGL, G. S., VIGNANI, R. şi MEREDITH, C. P., 1996, Isolation and characterization of new polymorphic simple sequence repeat loci in grape (Vitis vinifera L.), Genome, 39:628-633. 15. BUCK, E.J., HADONOU, M., JAMES C.J., BLAKESLEY, D. şi RUSSELL, K., 2003, Isolation and characterization of polymorphicmicrosatellites in European chestnut (Castanea sativa Mill.), Molecular Ecology Notes 3: 239–241.

16. CALLEN, D.F., THOMPSON, A.D., SHEN, Y., PHILLIPS, H.A., RICHARDS, R.I., MULLEY, J.C., SUTHERLAND, G.R.,1993, Incidence and origin of “null” alleles in the (AC)n microsatellite markers, Am J Hum Genet 52:922–927. 17. CASAS, A.M.,. IGARTUA, E., BALAGUER, G. şi MORENO, M.A., 1999, Genetic diversity of Prunus rootstocks analyzed by RAPD markers, Euphytica 110: 139–149. 18. CIPRIANI, G., LOT, G., HUANG, W.-G., MARRAZZO, M. T., PETERLUNGER, E., TESTOLIN, R., 1999, AC/GT and AG/CT microsatellite repeats in peach [Prunus persica (L) Batsch]: isolation, characterisation and cross-species amplification in Prunus, Theor Appl Genet : 99: 65-72. 19. COCIU V., BOTU., I., MINOIU, N., PASC, I., MODORAN,. I., 1997, Prunul, Ed. Conphys, Vâlcea. 20. COCIU, V., BOTU, I., BOTU, M., PREDA, SILVIA, ACHIM, G. şi IANCU, M., 2007, Nucul, alunul, castanul şi alte nucifere, Editura Conphys, Piteşti, 2007. 21. DANGL, G.S., WOESTE, K., ARADHYA MALLIKARJUNA, K., KOEHMSTEDT, ANNE, SIMON, C., POTTER, D., LESLIE, C.A. şi MCGRANAHAN, GALE, 2005, Characterization of 14 microsatellite markers for genetic analysis and cultivar identification of walnut, J. Amer. Soc. Hort. Sci. 130:348-354. 22. DE VICENTE, M.C., LÓPEZ, C. şi FULTON, T. (eds.), 2004, Genetic Diversity Analysis with Molecular Marker Data: Learning Module. International Plant Genetic Resources Institute (IPGRI), Rome, Italy. 23. DOWNEY, S.L., IEZZONI, A.F., 2000, Polymorphic DNA markers in black cherry (Prunus serotina) are identified using sequences from sweet cherry, peach, and sour cherry, J Am Soc Hort Sci 125:76–80. 24. ESCRIBANO, P., VIRUEL, M.A. şi HORMAZA, J.I., 2004, Characterization and cross-species amplification of microsatellite markers in cherimoya (Annona cherimola Mill., Annonaceae), Molecular Ecology Notes 4, 746–748. 25. FORONI, I., WOESTE, K., MONTI, L. M. şi RAO, R., 2006, Identification of ‘Sorrento’ walnut using simple sequence repeats (SSRs), Genet Resour Crop Evol, DOI 10.1007/s10722-006-0034-0. 26. GALDERISI, U., CIPOLLARO, M., DI BERNARDO, G., DE MASI, L., GALANO, G., şi CASCINO, A..,1999, Identification of Hazelnut (Corylus avellana) cultivars by RAPD analysis, Plant Cell. Rep. 18: 652-655. 27. GHANBARI, A., AKKAK, A., BOCCACCI, P., TALAIE, A., VEZVAIE, A. şi BOTTA, R., 2004, Characterization of Iranian hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars using microsatellite markers, Acta Hort. 686: 111-115. 28. GHIDRA, V., BOTU, M., SESTRAŞ, R., BOTU, I., 2004, Biodiversitate şi bioconservare, Editura AcademicPres - Universitatea de Ştiinţe Agricole şi Medicină Veterinară Cluj Napoca. 29. GOKIRMAK, T., MEHLENBACHER, S.A., BASSIL, N.V., 2004, Investigation of genetic diversity among european hazelnut (Corylus avellana L.) cultivars using ssr markers, Acta Hort. 686: 141-147. 30. GREGOR, D., HARTMANN, W. şi STÖSSER, R , 1994, Cultivar identification in Prunus domestica using random amplified polymorphic DNA-markers, Acta Horticulturae 359: 33-40. 31. GUPTA, P.K., BALYAN, H.S., SHARMA, P.C., RAMESH, B., 1996, Microsatellites in plants: a new `class of molecular markers, Curr Sci 70:45–54.

32

32. HAMPL, V., PAVLÍCEK, A., FLEGR, J., 2001, Construction and bootstrap analysis of DNA fingerprinting-based phylogenetic trees with a freeware program FreeTree: Application to trichomonad parasites, International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 51: 731-735. 33. HORMAZA, J.I., 2002, Molecular characterization and similarity relationships among apricot (Prunus armeniaca L.) genotypes using simple sequence repeats, Theor Appl Genet 104:321–328. 34. HUANG, H., DANE, F. şi KUBISIAK, T.L., 1998b, Allozyme and RAPD analysis of the genetic diversity and geographic variation in wild populations of the American chestnut (Fagaceae), Am. J. Bot. 85: 1013–1021. 35. HUANG, W.-G., CIPRIANI, G., MORGANTE, M., TESTOLIN, R., 1998a, Microsatellite DNA in Actinidia chinensis: isolation, characterisation, and homology in related species, Theor Appl Genet 97: 1269–1278. 36. HUNT, G.J. şi PAGE, R.E., 1992, Patterns of inheritance with RAPD molecular markers reveal novel types of polymorphism in the honey bee, Theor Appl Genet 85(1): 15–20. 37. KARP, A., EDWARDS, K.J., BRUFORD, M., FUNK, S., VOSMAN, B., MORGANTE, M., SEBERG, O., KREMER, A., BOURSOT, P., ARCTANDER, P., TAUTZ, D. şi HEWITT, G.M., 1997a, Molecular technologies for biodiversity evaluation: opportunities and challenges, Nature Biotechology 15:625–628. 38. LANG P., DANE F. şi KUBISIAK, T.L., 2006a, Phylogeny of Castanea (Fagaceae) based on chloroplast trnT-L-F sequence data, Tree Genetics & Genomes 3: 132-139. 39. LANG, P., DANE F., KUBISIAK, T.L, HUANG, H., 2006b, Molecular evidence for an Asian origin and a unique westward migration of species in the genus Castanea via Europe to North America, Mol Phylogenet Evol. Aug 26: 17098448 (P,S,G,E,B,D). 40. LODHI, M.A., GUANG-NING Z., WEEDEN, F.N.F., REISCH, B.I., 1994, A simple and efficient method for DNA extraction from grapevine cultivars, Vitis species and Ampelopsis, Plant Molecular Biology Reporter 12(1), pag. 6-13. 41. MARINONI, DANIELA, AKKAK, A., BOUNOUS, G., EDWARDS, K.J. şi BOTTA R., 2003, Development and characterization of microsatellite markers in Castanea sativa (Mill.), Molecular Breeding 11: 127–136. 42. MIAJA, M.L., VALLANIA, R., ME, C., AKKAK, A., NASSI, O. şi LEPORI, G., 2001, Varietal characterization in hazelnut by RAPD markers, Acta Hort. 556: 247-250. 43. MNEJJA, M., GARCIA-MAS, J., HOWAD, W. şi ARÚS, P., 2005, Development and transportability across Prunus species of 42 polymorphic almond microsatellites, Molecular Ecology Notes, 5: 531–535. 44. MONTE-CORVO, L., CABRITA, L., OLIVEIRA, C., LEITAO, J., 2000, Assessment of genetic relationships among Pyrus species and cultivars using AFLP and RAPD markers, Genetic Resources and Crop Evolution 47: 257-265. 45. MORIMOTO, Y., SHIMADA, T., OZAKI, T., NOMURA, K. ARAKI, H. şi YOSHIDA, M., 1997, Identification and relationship of Japanese chestnut varieties by RAPD and southern blot analysis, Sci. Rept. Fac. Agr. Kobe Univ. 22: 63–69. 46. MULCAHY, D.L., CRESTI, M., SANSAVINI, S., DOUGLAS, G.C., LINSKENS, H.F., MULCAHY, G.B., VIGNANI, R., PANCALDI, M., 1993, The use of Random Amplified Polymorphic DNAs to fingerprint apple genotypes, Sci Hortic 54:89-96.

33

47. NICESE, F.P., HORMAZA, J.I. şi MCGRANAHAN, G.H., 1998, Molecular characterization and genetic relatedness among walnut (Juglans regia L.) genotypes based on RAPD markers, Euphytica 101: 199–206. 48. ORTIZ, A., RENAUD, R., CALZADA, I., RITTER, R. , 1997, Analysis of plum cultivars with RAPD markers, J. Hortic. Sci. 72: 1-9. 49. PAGE, R.D.M., 1996, TREEVIEW: An application to display phylogenetic trees on personal computers, Computer Applications in the Biosciences 12: 357-358. 50. POMPER, K.W., AZARENKO, A.N., BASSIL, N.V., DAVIS, J.W., and MEHLENBACHER, S.A., 1998, Identification of random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers for self-incompatibility alleles in Corylus avellana L., Theor. Appl. Genet. 97: 479-487. 51. POOLER, M.R. şi SCORZA, R., 1995, Aberrant transmission of RAPD markers in haploids, doubled haploids, and F1 hybrids of peach: observations and speculations on causes, Scientia Horticulturae 64: 233–241. 52. POP, RODICA, 2008, Studiul variabilităţii somaclonale la viţa de vie cu ajutorul markerilor moleculari, teză de doctorat, USAMV Cluj. 53. RADICATI, L., BOTTA, R., VERGANO, G. şi AKKAK, A., 1997, DNA Characterization of Corylus seedlings and their evaluation as rootstock for hazelnut, Acta Hort. 445: 423-431. 54. RAYMOND, M., şi ROUSSET, F., 1995, GENEPOP (version 1.2): A population genetics software for exact tests and ecumenicism, J. Heredity, 86:248-249. 55. RIEDY, M.F., HAMILTON, W.J. şi AQUADRO, C.F., 1992, Excess of Nonparental bands in offspring from known primate pedigress assayed using RAPD PCR, Nucl Acids Res 20(4): 918. 56. ROBICHAUD, R.L., GLAUBITZ, J.C., RHODES, O.E. JR. şi WOESTE, K., 2006, A robust set of black walnut microsatellites for parentage and clonal identification. New Forests. 32:179–196 57. RODZEN, J.A., FAMULA, T.R., MAY, B., 2004, Estimation of the parentage and relatedness in the polyploid white sturgeon (Acipenser transmontanus) using a dominant marker approach for duplicated microsatellite loci, Aquaculture 232: 165-182. 58. ROHRER, J.R., AHMAD, R., SOUTHWICK, S.M., şi POTTER, D., 2004, Microsatellite analysis of relationships among North American plums (Prunus sect. Prunocerasus, Rosaceae), Plant Syst. Evol. 244: 69–75. 59. Secretariat of the Convention on Biological Diversity, 2000, Protocol on Biosafety to the Convention on Biological Diversity: text and annexes, Montreal: Secretariat of the Convention on Biological Diversity, http://www.cbd.int/doc/legal/cartagena-protocol-en.pdf. 60. SHIMADA, T., HAYAMA, H., HAJI, T., YAMAGUCHI, M., YOSHIDA, M., 1999, Genetic diversity of plums characterized by random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis, Euphytica 109: 143-147. 61. SOSINSKI, B., GANNAVARAPU, M., HAGER, L.D., BECK, L.E., KING, G.J., RYDER, C.D., RAJAPAKSE, S., BAIRD, W.V., BALLARD, R.E., ABBOTT, A.G., 2000, Characterisation of microsatellite markers in peach [Prunus persica (L.) Batsch]. Theor Appl Genet 101: 421–428. 62. STAUB, J.E., SERQUEN, F.C. şi GUPTA, M., 1996, Genetic markers, map construction, and their application in plant breeding, HortScience 31:729–741.

34

63. STRĂJERU, SILVIA, CONSTANTINOVICI, DANA, IBĂNESCU, MANUELA, 2002, Conservarea resurselor genetice vegetale pentru alimentaţie şi agricultură, în România – conservarea „ex situ”, Sănătatea plantelor, nr. 9. 64. TANAKA, K., TSUMURA, Y. şi NAKAMURA, T., 1999, Development and polymorphism of microsatellite markers for Fagus crenata and the closely related species, F. Japonica, Theor. Appl. Genet. 99: 11–15. 65. TESTOLIN, R., MARRAZO, M.T., CIPRIANI, G., QUARTA, R., VERDE, I., DETTORI, M.T., PANCALDI, M., SANSAVINI, S., 2000, Microsatellite DNA in peach [Prunus persica (L.) Batsch] and its use in fingerprinting and testing the genetic origin of cultivars, Genome 43: 512–520. 66. UNEP, 1992, Convention on Biological Diversity, UNEP, Nairobi, Kenya. 67. VICTORY, E.R., GLAUBITZ, J.C, RHODES, O.E. JR, şi WOESTE, K.E., 2006, Genetic homogeneity in Juglans nigra (Juglandaceae) at nuclear microsatellites, American Journal of Botany 93: 118–126. 68. VIRUEL, M.A., ESCRIBANO, P., BARBIERI, M., FERRI, M. şi HORMAZA, J.I. , 2005, Fingerprinting, embryo type and geographic differentiation in mango (Mangifera indica L., Anacardiaceae) with microsatellites, Molecular Breeding 15: 383–393. 69. WARBURTON, M.L. şi BLISS, F.A., 1996, Genetic diversity in peach (Prunus persica L. Batch) revealed by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and compared to inbreeding coefficients, J Am Soc Hort Sci 121(6): 1012–1019. 70. WILLIAMS, J., KUBELIK, A., LIVAK, K., RAFALSKI, J., TINGEY, S., 1990, DNA Polymorphisms Amplified by Arbitrary Primers are Useful as Genetic Markers, Nucleic Acids Research, 18 (22) 6531-6535. 71. WÜNSCH, A. şi HORMAZA, J.I., 2002, Molecular characterisation of sweet cherry (Prunus avium L.) genotypes using peach [Prunus persica (L.) Batsch] SSR sequences, Heredity: 89, 56–63. 72. YAMAMOTO, T., KIMURA, T., SAWAMURA, Y., KOTOBUKI, K., BAN, Y., HAYASHI, T., MATSUTA, N., 2001, SSRs isolated from apple can identify polymorphism and genetic diversity in pear, Theor Appl Genet 102: 865–870. 73. http://www.bioversityinternational.org/Themes/Genebanks/index.asp 74. http://www.upov.int/index_en.htm

35

UNIVERSITY OF AGRICULTURAL SCIENCES AND VETERINARY MEDICINE CLUJ-NAPOCA

DOCTORAL SCHOOL FACULTY OF HORTICULTURE

Eng. Pop Iulia Francesca

The Use of Molecular Analysis Techniques in

Prunus, Corylus, Juglans and Castanea Genera for

Their Conservation in Genebanks

(SUMMMARY OF THE Ph.D. THESIS)

Scientific coordinator:

Prof. Univ. Dr. Doru Pamfil

36Cluj-Napoca

2009

TABLE OF CONTENTS thesis summary

INTRODUCTION ..................................................................................................1 40 CHAPTER I ............................................................................................................5

1.1. THE IMPORTANCE OF THE GENETIC RESOURCES CONSERVATION FOR THE PRESERVATION OF BIODIVERSITY...........5

1.1.1. The definition of biodiversity.................................................................5 1.1.2. Biodiversity types...................................................................................8 1.1.3. The concept of biodiversity....................................................................9 1.1.4. The protection and the object of biodiversity conservation.................11 1.1.5. The strategy of biodiversity preservation.............................................12 1.1.6. The history of biodiversity preservation ..............................................13

1.2. GENE BANKS............................................................................................15 1.2.1. Generalities about gene banks...............................................................15 1.2.2. Gene banks categories ...........................................................................18 1.2.3. Conservation methods in gene banks ....................................................18

1.3. LEGISLATION FRAME OF NEW PLANT VARIETIES PROTECTION...................................................................................................22

1.3.1. Romanian legislation regarding new plant varieties protection............22 1.3.2. European Union.....................................................................................23 1.3.3. United States of America ......................................................................23 1.3.4. UPOV ....................................................................................................24 1.3.5. International Treaty on Plant Genetic Resources (ITPGRFA) .............26 1.3.6. Other relevant international treaties ......................................................26 1.3.7. Genetic patenting...................................................................................27

1.4. THE IMPORTANCE OF PRUNUS, CORYLUS, JUGLANS AND CASTANEA GENERA GENETIC RESOURCES CONSERVATION...........28

1.4.1. The importance of Prunus genus breeding ...........................................28 1.4.2. The importance of Corylus genus breeding ..........................................37 1.4.3. The importance of Juglans genus breeding...........................................40 1.4.4. The importance of Castanea genus breeding........................................54

I.5. METHODS OF GENETIC FINGERPRINTING........................................56 1.5.1. Generalities regarding molecular markers ............................................56 1.5.2. Classification of molecular markers......................................................57 1.5.3. The selection of the molecular methods used in the experiment ..........65 1.5.4. Comparison of the different molecular marking techniques.................66 1.5.5. Methods used for the statistical and mathematical interpretation of genetic fingerprinting results obtained in Prunus, Corylus, Castanea and

37

Juglans genera.................................................................................................69 1.5.6. Pc software used for molecular data interpretation...............................73

CHAPTER II. RESEARCH OBJECTIVES, MATERIAL AND METHODS.................................78 2.1. RESEARCH PURPOSE .............................................................................78 41

2.1.1. Aimed objectives in the PhD thesis research ........................................79 2.2. BIOLOGICAL MATERIAL.......................................................................79

2.2.1. Biological material used in the molecular marker analysis of the accessions ........................................................................................................79

2.2.1.1. Description of the studied Prunus genus accessions.......................80 2.2.1.2. Description of the studied Corylus genus accessions .....................93 2.2.1.3. Description of the studied Juglans genus accessions......................97 2.2.1.4. Description of the studied Castanea genus accessions .................108 2.2.1.5. RAPD primers used for DNA amplification ..................................112 2.2.1.6. SSR primers used for DNA amplification......................................113

2.3. WORKING PROTOCOLS.......................................................................119 2.3.1. DNA extraction and quantification for RAPD and SSR analysis .......119

2.3.1.1. DNA extraction protocol................................................................119 2.3.1.2. DNA quantification........................................................................121

2.3.2. Working protocols used for RAPD analysis .......................................122 2.3.2.1. RAPD amplification protocol ........................................................124 2.3.2.2. Agarose gel electrophoresi............................................................127

2.3.2.2.1. Agarose gels preparation......................................................128 2.3.2.2.2. Electrophoretic migration and DNA samples preparation...129

2.3.2.3. Image capture ................................................................................130 2.3.2.4. Image analysis ...............................................................................130

2.3.3. Working protocols for SSR analysis ...................................................131 2.3.3.1. SSR amplification protocol............................................................132 2.3.3.2. Capillary electrophoresis ..............................................................133 2.3.3.3. Data analysis .................................................................................136

2.3.4. Statistical and calculation methods for RAPD and SSR analysis data ............................................................................................................136

CHAPTER III.RESULTS AND DISCUSSION.................................................141 3.1. RESULTS REGARDING DNA EXTRACTION...............................141

3.1.1. Results regarding DNA extraction in Prunus genus ...........................142 3.1.2. Results regarding DNA extraction in Corylus genus..........................144 3.1.3. Results regarding DNA extraction in Juglans genus ..........................145 3.1.4. Results regarding DNA extraction in Castanea genus .......................147

3.2. RESULTS REGARDING RAPD PRODUCTS AMPLIFICATION

38

AND ELECTROPHORESIS......................................................................148 3.2.1. Results regarding RAPD products amplification and electrophoresis in Prunus genus .............................................................................................153 3.2.2. Results regarding RAPD products amplification and electrophoresis in Corylus genus............................................................................................156 3.2.3. Results regarding RAPD products amplification and electrophoresis in Juglans genus ............................................................................................157 3.2.4. Results regarding RAPD products amplification and electrophoresis in Castanea genus .........................................................................................159

3.3. RESULTS REGARDING IMAGE ANALYSIS AND DATA INTERPRETATION OBTAINED WITH RAPD PRIMERS.........................161

3.3.1. Image analysis and RAPD data interpretation in Prunus genus .........161 3.3.2. Image analysis and RAPD data interpretation in Corylus genus ........164 3.3.3. Image analysis and RAPD data interpretation in Juglans genus ........167 3.3.4. mage analysis and RAPD data interpretation in Castanea genus .......170

3.4. RESULTS REGARDING SSR DATA ANALYSIS AND INTERPRETATION........................................................................................174

3.4.1. Analysis and interpretation of SSR data in Prunus genus................174 3.4.2. Analysis and interpretation of SSR data in Corylus genus ..............179 3.4.3. Analysis and interpretation of SSR data in Juglans genus...............188 3.4.4. Analysis and interpretation of SSR data in Castanea genus ............197

CHAPTER IV. CONCLUSIONS.......................................................................205 BIBLIOGRAPHY...............................................................................................210 ANNEX 1............................................................................................................230 ANNEX 2............................................................................................................234 ANNEX 3............................................................................................................244 ANNEX 4............................................................................................................252 ANNEX 5............................................................................................................262 ANNEX 6............................................................................................................265 ANNEX 7............................................................................................................268 ANNEX 8............................................................................................................269 ANNEX 9............................................................................................................272 ANNEX 10..........................................................................................................273 ANNEX 11..........................................................................................................275 ANNEX 12..........................................................................................................280 ANNEX 13..........................................................................................................283 ANNEX 14..........................................................................................................288 ABBREVIATIONS AND ACRONYMS LIST .................................................291

39

SUMMARY Introduction The conservation of genetic resources represents a priority worldwide, which in

case of stone fruit species it is done almost exclusively by ex situ conservation, which is an efficient method for preserving endangered genotypes.

Romania is among the European countries with a rich gene pool of stone fruit species (over 6000 accessions), but lately it shows a decrease of the valuable accessions number for some species (Botu et al., 1994). In this context, the scientific interest for identification, evaluation and long time conservation in the national collections of valuable accessions for these species is growing.

Genetic erosion is more intense in some species and it creates the possibility of losing some valuable genes. This is the reason why the molecular evaluation followed by vegetative regeneration of the gene pool of Prunus, Corylus, Juglans and Castanea genera from S.C.D.P. Vâlcea constitutes an objective necessity in Romania.

In this situation, proper identification of Prunus, Corylus, Juglans and Castanea accessions is needed to ensure that the product is sufficiently genetically pure to meet the expectations of growers and distributors. Accurate accession identification is also important in protecting the legal rights of breeders.

Prunus cultivars hold an important role in Romanian fruit breeding due to their robustness and low requirements for climate and technological factors.

The plum tree has been cultivated in Romania since early times for its fruit, especially for home consumption. Plums became later staple foods for the industry and plum wood was used in furniture industry and handicraft.

Prunus genus was classified by Ingram (1948) in several subgenera: Prunophora Focke, Amygdalus (L) Focke, Lithocerasus Ingram, Cerasus Pers., Padus (Moench) Koehne and Laurocerasus Koehne. We mention also the following species: P. cerasifera, P. musoniana, P. domestica L., P. insititia L., P. simonii Carr., P. spinosa L., P. americana Marsh, P. nigra Ait., P. japonica Thunb., P. besseyi Bailey and P. tomentosa Thunb.

In Romania, in certain times, the plum tree was the dominant fruit tree, holding 87,9% from the total of 48 million fruit trees in 1905 and, respectively, 80%, represented by over 63 million trees from the total of 80,7 million trees, in 1927 (Cociu et al., 1997).

The hazelnut tree (Corylus avellana) grows spontaneously in the hillock and pre-mountain region all around the country, althought it is rarely cultivated as a fruit tree species. It is a rustic species, suitable for erosion prevention and for protection curtains. Hazelnuts are appreciated for their high content in fat substances, proteins, vitamines, minerals, being used in confectionery and pastry and also in the sweets industry.

Corylus genus includes nine species, acknowledged by most researchers: C. avellana, C. americana, C. colurna, C. cornuta, C. ferox, C. heteroplylla, C. maxima, C. sieboldiana and C. tibetica.

In Romania, hazelnut tree plantations are very limited, hazelnut trees being cultivated only at home based level.

Walnut tree (Juglans regia) is a very important plant, due to its numerous uses in food, wood, furniture and pharmaceutical industries and also as a decorative plant.

Juglans genus includes approximatively 40 species, among which we mention J. regia, J. duclouxiana, J. kanaonia, J. fallax, J. sinensis, J. sigillata, J. poilanei, J.

40

sieboldiana, J. cordiformis, J. cathayensis, J. mandshurica, J. hindsii, J. californica, J. rupestris, J. nigra, J. cinerea, J. honorei and J. boliviana.

In Romania, the walnut tree was prevalent, our country being considered one of the greatest walnut producers. The foundations of the modern Romanian walnut breeding research were set in 1975. Eighteen walnut varieties and 2 parent stocks were homologated (Tg Jiu, Secular R-M). New culture technologies and new grafts were used in order to intensify walnut tree cultures in Romania (Cociu et al., 2007). A 127% growth of the global walnut production was seen between 1990-2001, compared to the 1980-1990 period. The largest walnut producer is China (330 thousand tons) in 2001, Romania occupying the sixth place with a production of 25 thousand tons.

Genetic programs for walnut parent stocks improvement by the means of interspecific hybridization with CLRV (Cherry Leaf Roll Virus) and diseases of the root system resistant cultivars and also compatible with important varieties are carried out in the present (Cociu et al., 2007).

The sweet chestnut tree (Castanea sativa), in Romania, grows spontaneously in groups on the southern slopes of the hills situated in the Subcarpathian depression of Oltenia, and also in Gureni, Polovraci, Hobiţa, Horezu Tismana in Maramureş and in Satu Mare region. Isolated trees are also found in Caransebeş, Lugoj, Lipova, Arad, Oradea, Şimleul Silvaniei, Jibou, Bistriţa.

The sweet chestnut tree is cultivated for its fruit and wood. Chestnuts are consumed roasted, boiled or raw. The cooked nuts can be used by confectioners for puddings, desserts and cakes. They are used for flour, bread making, a cereal substitute, coffee substitute, a thickener in soups and other cookery uses, as well as for fattening stock. The wood, with superior quality to that of oak tree, is used to make furniture, in naval industry and for parquet flooring. The stem bark, the seed husks and the leaves contain tannin, which is used in tannery industry and wool and silk dyeing. Some varieties (Argentea, Aurea maculata) are used as ornamental plants.

Castanea genus includes nine species, some of which being of interest for fruit tree growing. Some examples are presented next: Castanea sativa, Castanea crenata (Japanese chestnut), Castanea Mollisima (Chinese chestnut), Castanea dentata (American chestnut).

Sweet chestnut interspecific hybrids, presenting low vigour, high precocity and yield capacity, bearing big fruit and resistant to leaf spot, obtained at SCPP Baia Mare, are cultivated in Romania.

Research objectives The purpose of our research consisted in the evaluation of some Prunus, Corylus,

Juglans and Castanea accessions held at SCDP Vâlcea using molecular markers, with the aim of conserving them in the genebank and also assessing the genetic variability of the germplasm collection.

The main objectives of our study consisted of: • Identification of RAPD primers capable of identifying polymorphisms at

molecular level between the studied accessions • Choosing the appropriate SSR primers to discriminate the analyzed

accessions • Screening the accessions with RAPD markers in order to identify the

duplicates

41

• Molecular characterization of the studied accessions using SSR markers The information retrieved from plant breeding and modern biotechnology is

necessary in order to preserve the species in optimal conditions. The Prunus, Corylus, Juglans and Castanea genebanks will serve the Romanian and

foreign genetic amelioration programs, some genotypes will be used in production, but the most important fact is that these genetic resources will serve the humanity in the next generations.

Genetic erosion is a process whereby an already limited gene pool of an endangered species diminishes even more when individuals from the surviving population die off. It is associated with the loss of genes or alleles and widely speaking, species (Ghidra et al., 2004).

The foundation of genebanks has helped the conservation of the plant genetic resources, being the newest and the most modern way of germplasm preservation (Ghidra et al., 2004).

Genebanks are institutions which provide germplasm storage, preservation and breeding. They ensure long term conservation an also make the genetic resources useful to farmers, breeders and researchers (http://www.bioversityinternational.org/Themes/Gen ebanks/index.a sp).

Genetic markers consist of any genetic or phenotypical difference, specific to the individual, which is transmitted to the descendants and can be traced along the generations (Staub et al., 1996b).

There are three types of genetic markers: morphological, protein and molecular or DNA (de Vicente et al., 2004).

DNA markers point out the polymorphisms present at nuclear and cytoplasmic DNA level. Molecular markers are not influenced by the environment, so they measure the variability in an objective way. There are an unlimited number of molecular markers, covering the entire genome, but their use requires complex analysis equipment.

Ideal markers should possess the following characteristics: high polymorphism, high reproducibility, codominance, even genomic distribution and distinctiveness (to point out the differences between related individuals). They also should not be influenced by the environment and should be neutral (the allele situated at the marker locus should be independent, with no effect on the selection pressure applied to the individual), cheap and easy to use (de Vicente et al., 2004).

RAPD markers (Random amplified polymorphic DNA) are obtained by PCR amplification of unknown genomic DNA fragments using a random decamer primer (Williams et al., 1990). Amplification products undergo agarose gel electrophoresis and Ethidium bromide staining (fluoresces in UV light) or silver staining for subsequent visualization. The genetic diversity and individual relations are evaluated upon presence/absence of bands, resulting a specific genetic fingerprint.

A great number of fragments of variable dimension (300-2000 bp) results following the PCR amplification using the random decamer primer. Some disadvantages of RAPD technique include: there may be uncertainty in assigning markers to specific loci (in the absence of pedigree analysis, the identity of individual bands is not known); the presence of a band of apparently identical molecular weight in different individuals is not evidence that the two individuals share the same homologous fragment and single bands can sometimes be comprised of several comigrating amplification products. Also, the

42

reproducibility of RAPD results between laboratories is low and RAPD markers are dominant. In spite of these disadvantages, RAPD markers are used currently for genetic studies due to the simplicity and low cost of the technique (Karp et al., 1997a). The uses of RAPD technique comprise: genetic diversity studies; germplasm characterization; genetic structure of populations, hybrid purity and genetic variability assessment and cultivar identification.

Microsatellites (highly repetitive DNA, SSR) consist of short tandem repeating units (of 1-10 bp, usually 2-3 bp in length) found mostly in telomeres and the centromere (non-coding DNA) (Gupta et al., 1996). Their genome localization must be known in order to be used as markers. Most of the SSR markers are made of repetitions of two nucleotides [(AC)n, (AG)n and (AT)n]. The polymorphism appears as a result of the variation of the number of repeats, following PCR amplification using specific primers, complementary to the microsatellites flanking sequences (these sequences can be conserved among the species and sometimes even among the genus). The advantages of using SSR markers consist of: their uniform genome distribution, high polymorphism, the possibility of automation, simple assessment of the results, high reproducibility and codominance. SSR markers can be used for genotyping, germplasm and genetic diversity assessment, genome mapping, genetic fingerprinting, phylogenetics and evolution.

The national Prunus, Corylus, Juglans and Castanea collections held at SCDP Vâlcea represented the studied biological material, due to their importance for biodiversity preservation and conferring a varied diet.

Some of the Prunus, Corylus, Juglans and Castanea accessions held at S.C.D.P. Valcea come from local populations of natural origin and the genetic relations between them are unknown. In this context, in order to preserve the most valuable specimens, a molecular study has been carried out in 61 Prunus accessions, 54 Corylus accessions, 53 Juglans accessions and 27 Castanea accessions.

The use of RAPD and SSR techniques for molecular characterization of valuable genotypes represents a new approach in Romania. Until recently, accession identification has relied primarily on phenotypic traits. However, it is often difficult or even impossible to distinguish between many cultivars because they are morphologically similar. To complicate matters, morphological changes frequently occur within a single cultivar depending on environmental factors. For this reason, molecular marker techniques have been developed to ensure accurate identification. Even cultivars which are phenotypically extremely similar can be easily distinguished based on differences in their genomes. Furthermore, molecular identification techniques can be used at any stage of plant development and they are not affected by environmental factors.

DNA extraction from frozen leaves was carried out as described by Lodhi et al. (1994), modified by Rodica Pop et al. (2003).

We tested 43 decamer primers on 8 accessions belonging to each genus, most of which yielded scorable amplification patterns. These primers generated polymorphic bands among the studied genotypes. Some of the primers produced no amplification or unreadable gel smears. We chose the primers that yielded the most polymorphic bands and reproducible amplification patterns for further use in accessions’ assessment (28 primers for Prunus and Castanea accessions, 23 for Corylus accessions and 25 for Juglans accessions).

PCR amplification reactions were carried out as described by Williams et al. (1990).

43

Reaction mixtures (25 µL total volume) consisted of 250 ng DNA, 9,3 μL distilled H20 for PCR reactions, 2 μL PVP (poly vinyl pyrrolidone), 5 μL GoTaq Flexi green buffer (Promega Corp., Madison, WI, USA), 2,5 μL MgCl2 (Promega Corp., Madison, WI, USA), 0,5 μL dNTP mix (Promega Corp., Madison, WI, USA), 0,5 μL RAPD primer (Microsynth, Balgach, Switzerland), 0,2 μL GoTaq polymerase (Promega Corp., Madison, WI, USA). DNA amplification was carried out in a 96 Well Gradient Palm-Cycler CG1-96 (Corbett Research, Sydney, Australia) programmed for 1 cycle of 3 min at 95ºC, followed by 45 cycles of 1 min at 93ºC, 1 min at 34ºC and 1 min at 72ºC. After a final incubation for 10 min at 72ºC the samples were stored at 4ºC prior to analysis. The PCR amplified products were size fractionated by migration on a 1,4% agarose (Sigma-Aldrich) gel in 1X TAE Buffer (242 g Tris Base (MW=121.1), 57.1 mL Glacial Acetic Acid, 100 mL 0.5 M EDTA) at 0,29 V/cm2 for 2 hours. The molecular marker used was 100bp DNA Step Ladder (Promega Corp., Madison, WI, USA). Gels were visualized on a UV light Biospectrum AC Imaging System (UVP BioImaging Systems, Upland, CA) after staining with 0,5 μg/μl Ethidium Bromide for 25 min.

Gel images were analyzed using TL120 software (Nonlinear Dynamics, Newcastle upon Tyne, UK).

The presence of the different patterns generated by RAPD primers showed variance between the accesions from the genetic point of view. This difference was further analyzed using SSR markers in order to obtain a more precise molecular characterization of the studied genotypes.

The used SSR primers (Mycrosinth) were selected from the following papers: Boccacci et al., 2006 –Corylus genus; Marinoni et al., 2003 –Castanea genus; Dangl et al., 2005 – Juglans genus; Bianchi et al., 2003, Cipriani et al., 1999, Aranzana et al., 2002 –Prunus genus). PCR reactions were carried out at Mycrosinth.

Dendrograms were built using UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic mean) analysis of Dice/Nei Li’s coefficient of similarity.

The accessions clustered into multiple groups and the values of genetic distances between analyzed data showed that there were some genetic differences. In order to certify these differences further studies using SSR markers took place. RAPD was therefore a reliable technique for distinguishing among Prunus, Corylus, Juglans and Castanea accessions cultivated at S.C.D.P. Vâlcea, assessing the genetic similarity among different genotypes useful in fruit breeding selection programs and also for understanding the genetic diversity of germplasm collections.

All the 36 used SSR markers yielded amplification products in all the studied accessions. The accessions clustered into multiple groups and the values of genetic distances between analyzed data showed the degree of kinship between them.

The used SSR primers could discriminate all the studied accessions, generating a specific fingerprint. The obtained data can be used for cultivar assessment in the germplasm collection maintained at SCDP Vâlcea.

44

45