UNIVERSIDAD PRIVADA ANTONIO GUILLERMO URRELO.
FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD.
ESCUELA PROFESIONAL DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
TEMA
Antibióticos y su diseño por la tecnología del DNA recombinante
ASIGNATURA : BIOTECNOLOGIA
DOCENTE : MGs. Q.F. Jessica Bardales Valdivia
ALUMNOS : Colunche Burga Elizabeth
Abanto Medina Lily
Tanta Flores Margarita
Malca Gamarra Luis
Suarez Vallejos Leticia
Izquierdo Linares Omar
INTRODUCCION
Las enfermedades infecciosas hancausado la muerte de millones deseres humanos a lo largo dela historia de la humanidad. Con eldescubrimiento de los antibióticos,esta realidad comenzó a sermodificada y, en los años ochentadel siglo XX, podía hablarse de unavictoria prácticamente total frente a
las infecciones por microorganismos.
La tecnología del DNA recombinantedepende, en parte, de la capacidadde cortar y unir segmentos de DNApor secuencias específicas de bases.Utilizando esta metodología, sepueden transferir segmentosparticulares de DNA a virus o abacterias para amplificarlos, aislarlose identificarlos.
OBJETIVOS
GENERAL:
Conocer las diferentes funciones que cumplen los antibióticos ysu diseño por la tecnología del DNA recombinante.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:
Conocer los antibióticos y su diseño por la tecnología del DNArecombinante y sus técnicas empleadas para lograrlo como son lamutagénesis, las enzimas que participan en la síntesis del antibiótico y laingeniería genética.
Conocer el desarrollo de los aminoglucosidos y el origen deresistencia a los aminoglicosidos.
Los antibiótico en un principio involucraban productos delmetabolismo de hongos y bacterias, capaces de inhibir en pequeñasdosis los procesos vitales de ciertos microorganismos, destruyendoo impidiendo su desarrollo y reproducción.
ANTIBIOTICOS
El metabolismo secundario comienzacuando el microorganismo detiene sucrecimiento por alguna razón (porejemplo, por agotamiento de nutrientes),y los intermediarios metabólicos oproductos finales comienzan aacumularse dentro de la célula. Estosintermediarios y productos finalespueden resultar tóxicos, y por eso lacélula los convierte en productos menostóxicos, como los antibióticos.
Los antibióticos naturalesson productos delmetabolismo secundario deciertos microorganismosprovenientes del suelo,como los hongos del géneroPenicillium o las bacteriasdel género Streptomyces.
La producción y secreción de
las sustancias antibióticas no
afectan al microorganismo
productor, y le ofrecen una
ventaja desde el punto de vista
de la supervivencia ya que le
permiten colonizar ambientes
con más eficacia que sus
competidores.
La mayoría de las personas conoce acerca de la existencia de antibióticos, y su empleo es un hecho
frecuente en el mundo entero hace varios años.
LOS ANTIBIÓTICOS, UN HITO DE LA BIOTECNOLOGÍA
De hecho, la producción de antibióticos que se
inició a mediados del siglo XX, se considera la
primera aplicación de la biotecnología a la vida
cotidiana de las personas.
Para comprender mejor esta afirmación, se debe
recordar a qué se llama biotecnología y definir qué
es un antibiótico.
La biotecnología se define tradicionalmente como “el empleo de
organismos vivos para la obtención de un bien o servicio útil para el
hombre”.
Actualmente, la biotecnología moderna emplea técnicas de ingeniería
genética, e incluye la producción de proteínas recombinantes, el
mejoramiento de cultivos vegetales y del ganado, el empleo de
organismos para limpiar el medio ambiente, y otras aplicaciones
industriales”.
ANTIBIOTICOS SINTÉTICOS Y SEMI-
SINTETICOS
Los antibióticos sintéticos se producenen el laboratorio a través de procesos desíntesis química, como es el caso de lassulfamidas. Otros antibióticos seobtienen a partir de cultivos microbianosy luego se modifican químicamente.Éstos últimos son los antibióticos semi-sintéticos, como por ejemplo, laampicilina, derivada de la penicilina.
¿QUE TIPOS DE ANTIBIOTICOS
EXISTEN?
Según su mecanismo de acción, algunos antibióticosimpiden la síntesis de la pared celular de losmicroorganismos, otros alteran la membrana plasmática,y la mayor parte de ellos inhiben la síntesis de ácidosnucleicos o proteínas.
Según la estructura química se diferencian las penicilinas,cefalosporinas, amino glucósidos, tetraciclinas, sulfamidas uotros.
Según su espectro de acción, es posibledividirlos en agentes de amplio espectro, queactúan frente a multitud de bacterias, y agentesde espectro restringido que solo actúan frente aalgunos tipos de bacterias.
Fleming llamó a este principio activo “penicilina notatum”.
Del Hospital St. Mary de Londres, quien estabainteresado en el desarrollo de métodos deprofilaxis y asepsia. Mientras se encontrabatrabajando con bacterias del tipo estafilococosobservó que una de las placas de cultivo habíasido contaminada por un hongo.
Decepcionado, pero sorprendido, Flemingobservó que alrededor del hongo se formaba unenorme halo sin bacterias. Era evidente que elhongo (que luego se supo era de la especiePenicillum notatum) producía “algo” capaz dematar a las bacterias.
La penicilina es el antibiótico que revolucionó el tratamiento de las infecciones bacterianas, como laneumonía, sífilis, tuberculosis y gangrena, y dio origen a la industria farmacéutica. El descubrimientode la penicilina fue un hecho casual, que se debe al trabajo de Alexander Fleming, bacteriólogo
Alexander Fleming y el descubrimiento de la penicilina
FABRICACIÓN INDUSTRIAL DE LA
PENICILINA
El hongo se introduce estérilmente y se inicia la fermentación,durante la cual el aire estéril permite el crecimiento del hongo y laagitación facilita su distribución en el fermentador. Después deunas 50 a 90 horas la tasa de crecimiento del hongo disminuye, elfermentador se enfría a 5 ºC para prevenir la desestabilización delantibiótico y el hongo se separa por filtración.
Pero después el desarrollo del método de “fermentación sumergida”permitió disminuir los requerimientos de espacio y,consecuentemente, los costos de producción.
El hongo utilizado industrialmente para la producción de penicilina es Penicillumchrysogenum. El primer sistema de producción de penicilina fue el conocidocomo “método de superficie”, donde el hongo crecía en la superficie de unacapa de medio de cultivo en bandejas.
EN BUSQUEDA DE NUEVOS ANTIBIOTICOS
La búsqueda de nuevos antibióticos es probablemente más urgente en la actualidad que en los tiempos deFleming, ya que muchos antibióticos que fueron alguna vez altamente efectivos han perdido utilidad frentea los organismos patógenos.
Se cree que el uso indiscriminado de antibióticos por parte del hombre, ha acelerado elproceso de selección natural por el cual las bacterias más resistentes se han vistobeneficiadas frente a las más sensibles. Estas cepas resistentes sobreviven a la presencia delantibiótico y pueden propagarse exitosamente.
Si bien los antibióticos son compuestos químicos producidos naturalmente por losmicroorganismos, y la adquisición de resistencia a los antibióticos también es un proceso naturalen los seres vivos, se considera que el hombre ha influido en este acontecimiento evolutivo.
Este hecho es el resultado de un proceso por el cual los microorganismos desarrollan resistencia frentea antibióticos que en el pasado les resultaban letales.
Conscientes del riesgo que significa que los antibióticos sean inocuos para losmicroorganismos patógenos, Diferentes centros de investigación o compañíasfarmacéuticas en todo el mundo realizan extensas búsquedas de microorganismos o denuevas moléculas antibióticas con diferentes mecanismos de acción.
Sin embargo, el mayor desafíoes encontrar antibióticoscompletamente nuevos. Paraeso, se realiza un arduo ysistemático trabajo debúsqueda o rastreo, llamado“screening”, que se podríaresumir en los siguientes
pasos:
Los nuevos antibióticosgeneralmente seobtienen por modificaciónquímica de los que ya seusan, para otorgarlesnuevas propiedades.
Se obtiene la mezcla de microorganismos que hay en
diferentes muestras de tierra o de agua.
Se analiza la capacidad que tiene cada muestra de
producir algún tipo de antibiótico a través de
antibiogramas u otros tipos de ensayos.
Si el resultado es positivo, se aíslan los diferentes
componentes de la muestra, se los cultiva por separado
y se analiza su efecto antibacteriano, con el objetivo de
individualizar al microorganismo productor de
antibióticos.
Se estudia de qué tipo de antibiótico se
trata para comprobar que no sea uno ya
conocido.
Se estudia de qué bacteria u hongo se trata
para ver cómo puede crecer en cultivo.
Se ensaya la producción del antibiótico
haciendo crecer al microorganismo en
pequeños fermentadores, para pasar luego
a más grandes.
MEJORAMIENTO DE LOS ANTIBIOTICOS
Una de las técnicas empleadas para lograrlo es la mutagénesis, que introduce cambios azarosos en el ADN que pueden favorecer o acelerar la síntesis del
antibiótico.
Otra alternativa es, una vez conocidas las enzimas queparticipan en la síntesis del antibiótico, dirigir la mutación a losgenes que codifican para estas enzimas para que trabajen más yfabriquen más producto.
Otra técnica que se puede emplear es la ingeniería genética para aumentar el número de copias de los
genes que codifican para las enzimas que intervienen en la producción del antibiótico.
MUTAGENESIS: QUE INTRODUCE CAMBIOS EN
EL ADN QUE PUEDE FAVORECER O
ACELERAR LA SÍNTESIS DE ANTIBIÓTICOS.
Dada la baja frecuencia de mutaciones, sololos microorganismos con alta tasa decrecimiento, pueden alcanzar cifrassuficientemente altas como para que seandetectables. Las mutaciones en las bacterias,frecuentemente afectan propiedadesfácilmente reconocibles como requerimientosnutricionales, morfología o resistenciaantibiótica.
La mayoría de estos errores o alteraciones introducidos en el genoma, son corregidos por los mecanismos de reparación del ADN, pero algunos escapan a la corrección y pueden originar
cambios heredables que proporcionan una diversidad
genética.
Además de las mutacionesespontáneas, pueden ocurrirmutaciones inducidas, provocadas poragentes mutagénicos (químicos, físicoso biológicos) que proporcionan unaherramienta para introducir cambios enel genoma bacteriano en el laboratorio.
Una mutación es un cambio heredable en lasecuencia de bases de los ácidos nucleicos queconstituyen el genoma de un organismo; ésta seproduce en condiciones naturales con bajafrecuencia y se deben fundamentalmente a erroresen los procesos de replicación del ADN.
Algunas mutaciones pueden conferir almutante una ventaja frente a la cepa que ledio origen, bajo ciertas condicionesambientales, de manera que la protege dedicha célula mutante es capaz de superar elcrecimiento de la cepa original y sustituirla.
Muchas mutaciones que originan unproducto proteico defectuoso,pueden ser suprimidas por unsegundo evento de mutación en otrositio del genoma (mutacionessupresoras), restaurándose elfenotipo original.
También puede suceder que elcodón se convierta en unaseñal de terminación (mutaciónsin sentido) y en ese caso seTraducirá una proteínaincompleta no funcional.
Las mutaciones puntuales, sonaquellas que implican un cambio enuna única base; pueden provocarque se cambie un aminoácido porotro en el producto proteico. Otrasveces no se traducen en ningúncambio (mutación silenciosa), dadoque como sabemos existe más deun codón para cada aminoácido.
Este es el caso de lasmutaciones que confierenresistencia a los antibióticos,en las que el mutanteresistente se seleccionará enun ambiente en el que lasbacterias estén expuestas alantibiótico.
Enzimas que participan en la síntesis de
antibióticos.
Una vez conocidas las enzimas que participan
en la síntesis del antibiótico, dirigir la mutación
a los genes que codifican para estas enzimas
para que trabajen más y fabriquen más
producto.
actualmente las nuevas tecnologías genómicas están permitiendo realizar unaaproximación más racional al diseño de nuevos antibióticos. La genética obiosíntesis combinatoria y el ADN se están utilizando para intercambiar genes delmetabolismo secundario entre microorganismos productores de antibióticos o paracrear genes híbridos de enzimas clave en el metabolismo que permitan la síntesis
de nuevas moléculas antibióticas.
Ingeniería Genética Y
Biotecnología
Incluso hoy en día se handesarrollado métodos paraextraer la informacióngenética de microorganismosproductores de antibióticosdirectamente de muestras desuelo, con objeto de clonarlos genes demicroorganismos que seríandifíciles de aislar y cultivar.
En este sentido, también ha sidoparticularmente productiva lasíntesis de nuevos antibióticos através de la creación de polipéptidosintetizas híbridas y/o mutantes.Este proceso combinado con laposibilidad de modificar las rutasde biosíntesis de los azúcares hapermitido crear nuevas moléculasde antibióticos macrólidos dereconocida importancia clínica.
Especialmentesignificativos son losestudios de BiologíaMolecular realizadospara conocer losprocesos de síntesisde los antibióticos β-lactámicos.
TECNOLOGÍA DEL ADN
RECOMBINANTE
Concepto.
• La tecnología nos permite obtenerfragmentos de ADN en cantidadesilimitadas, que llevará además el gen olos genes que se desee. Este ADNpuede incorporarse a las células deotros organismos (vegetales, animales,bacterias) en los que se podrá"expresar" la información de dichosgenes.
De una manera muy simplepodemos decir que "cortamos" ungen humano y se lo "pegamos" alADN de una bacteria; si porejemplo es el gen que regula lafabricación de insulina, lo queharíamos al ponérselo a unabacteria es "obligar" a ésta a quefabrique la insulina.
ADN recombinante es una molécula queproviene de la unión artificial de dosfragmentos de ADN. Por lo tanto, latecnología de ADN recombinante es elconjunto de técnicas que permiten aislarun gen de un organismo, para suposterior manipulación e inserción enotro diferente.
GENERALIDADES
El término DNA recombinante hacereferencia a la creación de nuevascombinaciones de segmentos o demoléculas de DNA que no se encuentranjuntas de manera natural.
La tecnología del DNA recombinante utilizatécnicas que provienen de la bioquímica de losácidos nucleicos unidas a metodologías genéricasdesarrolladas originalmente para la investigaciónde bacterias y de virus. La utilización del DNArecombinante es una herramienta poderosa parael aislamiento de poblaciones puras desecuencias específicas de DNA a partir de unapoblación de secuencias mezcladas.
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El desarrollo de las técnicas de DNArecombinante ofrece nuevas oportunidades parala investigación, ya que simplifica la obtención degrandes cantidades de DNA que codifican genesespecíficos, y facilita las investigaciones de laorganización, estructura y expresión génicas.
EL DESARROLLO DE LATECNOLOGÍA DEL ADNRECOMBINANTE FUEPOSIBLE GRACIAS A VARIASLÍNEAS DE INVESTIGACIÓN:
El conocimiento de las enzimas de restricción.
La replicación y reparación de ADN.
La replicación de virus y plásmidos
La síntesis química de secuencias de
nucleótidos.
En 1975 Daniel Nathans y Hamilton O.
Smith descubrieron un tipo de proteínas -
las enzimas endonucleasas o enzimas de
restricción- que actúan como "tijeras
moleculares", cortando la doble cadena de
ADN a través del esqueleto de fosfatos sin
dañar las bases.
Cómo cortar y pegar el ADN? Tijeras moleculares: ENZIMAS DE
RESTRICCIÓN:
Técnicas Utilizadas
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN. ESTE TIPO DE ENDONUCLEASAS PUEDE DEJAR
DOS TIPOS DE EXTREMOS.
En el primer caso, el corte genera nucleótidos de simple cadena llamados extremos cohesivos.
Estos extremos se pueden unir por medio de otra enzima, la ADN ligasa.
En el segundo caso, se generan extremos doble cadena (extremos romos). Estos extremos
también pueden ser unidos con la ayuda de una enzima ligasa pero, como no los extremos no son complementarios, la unión será más inespecífica.
Cómo introducir ADN recombinante en las bacterias
Una vez que los biólogos encontraron cómo fabricar ADN
recombinante usando enzimas de restricción y ligasas, el
desafío siguiente fue cómo producir grandes cantidades de
genes y cómo introducirlos en bacterias u otras células
huésped. El primer problema fue solucionado con el uso de
plásmidos, pequeñas moléculas de ADN circular presente en
muchas bacterias.
PODEMOS CREAR UNA MOLÉCULA DE ADN
RECOMBINANTE USANDO UN PLÁSMIDO. ESTE PROCESO
CONSTA DE LAS SIGUIENTES ETAPAS:
Cortamos el ADN circular del plásmido con enzimas
de restricción, para generar extremos
cohesivos.
Cortamos el ADN que queremos multiplicar.
Debemos asegurarnos de que los extremos del
plásmido y los del ADN a insertar sean
complementarios y puedan unirse.
Unimos el gen que queremos introducir
(inserto) por medio de la enzima ADN-ligasa y luego introducimos el
plásmido con inserto en bacterias.
Seleccionamos las bacterias que hayanintroducido el plásmido con la ayuda deantibióticos. Dado que los plásmidoscontienen un gen de resistencia a antibiótico,al exponer las bacterias a ese antibiótico, sólolas que hayan incorporado el plásmido (y conél la resistencia) sobrevivirán, mientras quelas que no lo tengan morirán.
Los aminoglucósidos por su probadaeficacia continuarán siendo utilizadosen la práctica clínica como terapiaantimicrobiana, a pesar de susefectos adversos, de la resistenciabacteriana de bajo y alto nivel y delsurgimiento de nuevos
antimicrobianos.
DESARROLLO DE
AMINOGLICOSIDOS
Se han realizado innumerablesesfuerzos para reducir la toxicidad delos aminoglucósidos, perolas soluciones, de existir, están por serencontradas. La alternativa más útilhasta el momento parece ser laaplicación de monodosis en terapiascombinadas.
Los aminoglucósidos son productos naturales o
derivados semisintéticos. Algunos derivan de
numerosas especies de Streptomyces, el primero
fue la estreptomicina del griseus, la neomicina
del fradiae, la kanamicina de kanamyceticus, la
tobramicina del tenebrarius; asi como la
paromomicina, mientras que la gentamicina y la
sisomicina fueron aisladas de diferentes especies
de Actinomycete del géneroMicromonospora.
La amikacina y la dibekacina son derivados
obtenidos por modificaciones químicas de la
molécula de la kanamicina, y la netilmicina es un
derivado semisintético de la sisomicina.
Su estructura química se compone de aminoazúcares unidospor enlaces glucosídicos a un alcohol cíclico hexagonalcon grupos amino (aminociclitol). Por tanto, su denominacióncorrecta sería "aminoglucósidos aminociclitoles". No obstante,en la práctica se utiliza sólo el primer nombre para designar aeste grupo de antibióticos.
PROPIEDADES QUÍMICAS Y
CLASIFICACIÓN
Componentes de esta familia
(espectinomicina y
trospectomicina) son
exclusivamente aminociclitoles
porque no tienes aminoazúcares.
Aminoglucósido con
aminociclitol.
Aminociclitol sin aminoglucósido.
Mecanismo de
acción
Los aminoglucósidos son antimicrobianos bactericidas (otrosaminociclitólicos como la espectinomicina son bacteriostáticos), queactúan sobre el ribosoma bacteriano, inhibiendo la síntesis deproteínas. Se unen fundamentalmente a la subunidad ribosomal 30S.
Para alcanzar el ribosoma tienen que sertransportados a través de lasmembranas celulares, pero debido a su altapolaridad necesita un mecanismodetransporte activo y utilizan el metabolismoque depende de oxígeno.
Ellos interrumpen el ciclo normal dela función ribosomal, interfiriendo al menos enparte con el primer paso de la síntesis proteica(reacción de iniciación) con la consiguienteformación de complejos anormales (monosomas).Otro efecto derivado de su acción es lalectura errónea del código genético.
ESPECTRO ANTIMICROBIANO
Los aminoglucósidos son de
gran utilidad en la terapéutica de
infecciones debidas a bacilos
aeróbicos gram (-), particularmente
los resistentes a las penicilinas y
cefalosporinas. Bacterias gram (-):
Acinetobacter, Citrobacter,
Enterobacter, E. Coli, etc
Bacterias gram (+): Staphilococcus
aureus, Staphilococcus epidermidis, Streptococccus
faecalis. La estreptomicina y la kanamicina inhiben el
crecimiento del Mycobacterium tuberculoso y la
Amikacina es activa contra mycobacterias atípicas.
RESISTENCIA
MICROBIANA
Existen al menos 3 mecanismosconocidos por los cuales lasbacterias gram (-) desarrollanresistencia a los aminoglucósidos:
Disminución de la permeabilidad celular, no permitiendoque la droga penetre dentro de la célula. Las bacteriasanaeróbicas son resistentes debido a la ausenciadel sistema de transporte activo dependiente de oxígeno,necesario para dicha penetración.
Alteraciones en el sitio de acción por mutaciones ribosomales. Se han descrito en cepas de E. Coli, P.
aeruginosa y Streptococcus faecalis. En estos casos no existe sinergismo con las penicilinas.
Enzimas microbianas producidas por plasmidas o factoresR. Constituyen el principal mecanismo de resistencia.Existen numerosas enzimas involucradas en la misma, lascuales que son capaces de causar adenilación, acetilacióny fosforilación; ocurre que 7 inactivan a la kanamicina, 6 latobramicina, 4 la gentamicina y la dibekacmicina ysolamente 2 a la amikacina.
Ototoxicidad: Todos los aminoglucósidos pueden producir afectación de ambas funciones. Sinembargo, se produce mayor daño coclear con: kanamicina, amikacina y neomicina, mientrasque vestibular la estreptomicina y la gentamicina. La tobramicina afecta ambas funciones porigual.
Efectos indeseables de los aminoglucósidos:
En Cuba existen programas que establecen la deteccióntemprana de los déficit auditivos en la niñez. Uno de los criteriosde inclusión en estos programas es el antecedente de uso deaminoglucósidos. Los eventos asociados a la aparición deototoxicidad son: Terapias por más 8 días. Administraciónconcurrente con diuréticos. Antecedentes de tratamiento conaminoglucósidos.
Los aminoglucósidos deben usarse con precaucióndurante el embarazo, por la probabilidad de daño ótico orenal del feto, sin embargo su empleo en la madre nocontraindica la lactancia natural.
RESISTENCIA A LOS AMINOGLUCÓSIDOS
Conceptos.
• Es la Alteración del sitio blanco. Por mutación de los genes de proteínasribosomales o del ARN 16S, lo que tiene importancia clínica paraestreptomicina.
Reducida acumulación intracelular del compuesto.Esta disminución, principalmente observada enPseudomonas spp y otros bacilos gramnegativosno fermentadores, se puede atribuirfundamentalmente a la impermeabilidad de lamembrana externa, causada por varios factores,como son cambios en las proteínas de membranaexterna, determinando un nivel de susceptibilidadintermedio a estos agentes antibacterianos.
Los aminoglucosidos (EMA) se dividen en 3 grupos:
Aminoglucósido-acetiltransferasas (AAC), que acetilan
grupos amino utilizando como cofactor la acetilcoenzima A.
la gentamicina ha sido informada en nuestro país, con un
importante incremento de cepas que la producen,
posiblemente a causa del uso frecuente de este
aminoglucósido.
Aminoglucósido-adeniltranferasas (AAD, actualmente
designadas como ANT), enzimas conocidas también como
nucleotidiltransferasas, que adenilan ciertos grupos
hidroxilos.
Aminoglucósido-fosfotransferasas
(APH), que también modifican los
grupos hidroxilos mediante fosforilación.
Estos dos tipos de enzimas utilizan
nucleósidos trifosfatos, especialmente
ATP, como cofactor.
ORIGEN GENÉTICO DE LA RESISTENCIA A
AMINOGLUCÓSIDOS
Esto es fundamental al considerar la potencial diseminación de estos genes de resistencia hacia cepas susceptibles.
En la última década sin embargo, se ha detectado la presencia de nuevos elementos genéticos que participarían en la resistencia bacteriana. Se trata de cassettes genéticos
que albergan genes que codifican resistencia a antibacterianos.
Los cassettes se encuentran asociados a integrones, los cuales son capaces de captar estos determinantes de resistencia gracias a la acción de una recombinasa específica de
sitio (integrasa) y proporcionarles el o los promotores necesarios para su expresión.
Gracias por su atención
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