Transcript

Microbiologie generala

z-

Prezenta peretelui celular la bacterii este constanta ~i necesara existentei lorin conditii n:aturale, dar nu este \lniversaUi.Astfel, exista exceptii corespunzand unorbacterii la care peretele:celularpoate lipsi definitiv sau temporar. Spre exemplu,]1ico:&-lasm~}e,cele rnalrnici hacterii cunoscute care pot cre~te ~i se pot reproduce inafara celulelor gazda vii, d~i sunt parazite intracelulare, sunt liBs~ de perete celu~De asemenea, sunt cunoscute bacterii mutante cu perete celular defectiv, numiteforme "L" (d~Ja denurnirea Institutului Lister, unde au fost descoperite). Uneleforme "L" potreveni la forma bacteriana originara, din care au fost obtinute, in timpce altele sunt stabile.

La marea majoritate a bacteriilor, care prezinta peret~ celular, acesta esteo structura bine definita, rigida, care inconjoara celula bacteriana acoperindmembrana plasmatica de care este strans ata~at. EI este vizibil la microscopulelectronic ~i invizibil la microscopul optic pe preparate colorate obi~nuit, darvizibil pe frotiuri carora Ii se aplica 0 coloratie selectiva (cu albastm Alcian) ~ipe celule vii datorita refringentei. Pentru evidentierea sa microscopica se poaterecurge ~i la artificii de tehnica, cum ar fi lezarea menajata a peretelui cumijloace mecanice (ultrasunete, agitare cu perle de sticla) sau chimice (lizozim,~oc osmotic) care permit eliminarea continutului celular, peretele ramanand caun sac golit de continut. ,/ .

Pentru..-analiza comp6zitiei chimice se preQaf.a-pereti celula~rrStarepUrificat~n ru a mecanica a celulelo ~i apoi separ'!1".ec('anvelopeiinsolul5i1~d~ c stituentii ,solubili.Membrana plasmatica ~i proteinele ata~ate seindeparteaza prin intermediul proteazelor sau detergentilorn

Pe asemenea preparate peretele celular pastreaza contuml de bazarelevand componenta sa esentiala: peptidoglicanul sau murein a (Lat. <murus>= perete). Mureina formeaza un sac de jur imprejurul celulei bacteriene, avand 0

structura tridimensionala (Fig. 9). In arhitectura celulei bacteriene, pereteleprezinta 0 problema unica. In timp ce alte structuri celulare complexe (ex:membrana, ribozomii) se asambleaza spontan, peretele celular necesita inserareaunor noi blocuri de constructie intr-un strat deja mentinut ca atare prin legaturico:alente. De.ace~a, .e~terea ~i ~zvoltar~a a intr-oo~a s.pecifica i~puneeXlste~ta/ n~l~ me msm ~u tg!are d~e . a~ fin te 11'1 ceca.· ce pnve~tedeschlderea ~l mc derea enzlmaflca a Iega; nlor.

M = aciJN- acctilmuramicG = N - <lcctilglu.coz.amina

(b) --e- = punte peptidicl (e)

Fig. 9. Structura generala a peptidoglicanului din peretele celular. (a) 0 interpretare artistica aretelei de peptidoglican, nerespectfuld proportiile. Peretele apare ca 0 unitate molecularacontinua ~i uneori multistratificata ce mconjoara celula ca 0 pIasa. (b) Structura la nivelmolecular a retelei de peptidoglican. (c) Structura moleculara fundamentala a unei punti

incruci~ate peptidice care variaza ca exactitate la diferite grope de bacterii.

Deosebirile cela mai nete in structura chirnicd globald a peretelui celular seconstata mtre bacteriile Gram-pozitiye ~i Gram-negative, denumite astfel dupareactia lor la coloratia Gram. Aceasta coloratie, imaginata de C. Gram, diferentiazaimensa majoritate a bacteriilor existente ill natura ill una din cele doua categorii,corespunzand unor particularitati de tip structural, natura biochimica, patogenitate,structura antigenica diferite. Peptidoglicanul rnsa, componenta esentiala a peretelui,are 0 structura similara, ill general, la toate bacteriile.

Structura tridimensional a a peptidoglicanului (mureinei) este formatadin punct de vedere chimic dintr-un heteropolimer a1catuit din douacomponente: peptidicli ~i glicanica.

Pot1iune&-&licanica, reprezentand scheletul, are structura unor lanturilineare formate din resturile altemante a doua N-acetil hexozamine diferite:N-acetilglucoza~NAG) ~i addul N-acetil muramic (NAM) legate intreele prin legaturiC.l2:1.±) Este deci un ~iv. Acidul muramic esteunic pentru peptidoglicanul bacterian. Gruparile carboxil (-COOH) ale resturilorde acid N - acetilmuramic fumizeaza punctele de legare ale lanturilor peptidice.

Componenta peptididi contine ca unitate de constructie un tetrapeptida1catuit din D- ~i L- aminoacizi in altemanta, in general cu structura:

L-Ala - D-Glu - L-Lys - D-Ala . La diferite microorganismepeptidoglicanul difera prin: - aminoacizii 2 ~i 3 ai tetrapeptidului, - structurapuntii de legare ineuei~ata ~i - frecventa legaturilor incmei~ate.

Unitatile tetrapeptidiee apat1inand lanturilor de glican adiacente sunt larandullor legate prin punti speeializate, interpeptidice.

-'k"In raport eu struetura chimica de baza, atat glieanii cat ~i tetrapeptidelepot suferi variatii de structura care nu modifica insa semnificativ arhitecturageneral a a moleculei.* Structura peptidoglieanului permite cre~terea peretelui celular prinJintezamureinei sub aetiunea enzimelor mureinsintetaze. Mureinhidrolazele, existente in- 'peretele celular, desfac legatura peptidoglicanica iar mureinsintetazele introducmolecule noi la locul rupturilor. Printr-un meeanism similar de rupere a legaturiloractioneaza lizozimul (muramidaza, 0 mureinhidrolaza) ~i penicilina. Morfogenezaperetelui implica modifican complexe ale sintezcLp.eptidQglicanului Cll reactii- / '~ce ca ~~_oolimerizarel reglate in spatiu ca ~i in timp. Progrese inintelegerea aeestor reactii au fast realizate utilizandu-se diferite mureinhidrolaze,enzime autolitiee ~ipenieilina.

k Stmetura peptidoglieanului a fost rezolvata cu ajutorul enzimei ,lizozll;n(obtinuta obi~nuit din albu~ul de ou, prezenHi ~i in liehidele corpului), care,hidrolizeaza 0 punte glicozidiea speeifiea din lantul de gliean, producanddizaharidul NAG - NAM ce poarta diferiti substituentL Din diferite alte surse (inspecial mele) au fost obtinute enzime baeteriolitiee speeifice pentm alte legl'ituri,eu ajutorul carora pot fi obtinute 0 varietate de alte fragrnente. ldentificareacompu~ilor obtinuti pe cale enzimatica ~i a intermediarilor de biosintezaacumulati releva stmctura.

*- Intregul peptidoglican al eelulei bacteriene este 0 molecuHi giganta culegaturi covalente, numita murein sacculus (in forma de sac). Lanturi~~_de glican

ale moleculei prezinHi legatun incuci~ate atat intre ele cat ~i intre diferitelestraturi concentrice atunCf cand peptidoglicanul este prezent in mai multestraturi. Organismele patogene au 0 frecventa mai mare a legaturilor incruci~atedecat majoritatea ceiorialte specii (de exemplu: 75% la Staphylococcus aureus)ceea ce Ie face mai rezistente la liza prin lizozimul pe care 11mtalnesc ill

lichidele corpului. TaPa sacului de mureina depinde de numarul cat mai mare allegaturilor incruci~ate ~i-$-conferita de mai multe particularitati:

.:. Iantul glicanic are 0 Iegatura compacta (P-1 ,4) ca ~i in cazul chitinei(0 poIi - N - acetilglucozamina) din peretele celular al fungilor sau exoscheletulartropodelor,

.:. alternanta L- ~i D- aminoacizilor in tetrapeptide formeaza polimericompacti,

.:. structura glicanului presupune un numar mare de punti de hidrogenintre lanturile paralele.

De~i aceste trasaturi sunt raspunzatoare de retinerea unei formecaracteristice a sacului de mureina, rigiditatea sa este numai relativa. EI poates~ flexilJni (ca cele asociate mobilitaW spirochetelor), iar legaturile s~leincruci~ate flexibile, ca intr-o tesatura extensibila (stretch) p'ermit marirea' ~i~contractarea substantiala a ~olumului celulei bacteriene sub influenta---modifidirilor dltpresiune osglOtidi. ,

Pe langa peptidoglican, peretele celular bacterian are in structura sachimica ~i alti compu~i care difera cantitativ ~i calitativ la bacteriiIe Gram-pozitive fata de bacteriile Gram-negative (Fig. 10).

Bacteriile Gram-pozitive au un perete celular gros (20 - 50 nm lamicroscopul electronic), relativ omogen, care contine: peptidoglican 80 - 90 %din greutatea sa (corespunzand Ia circa 20 stratun sau mai mult); profeinc ~ipolizaharide. Polizaharidele caracteristice sunt reprezentate de acizii teichoici(Gr. <teichos> = zid, perete). (Fig. 10). Acizii teichoici sunt rp.olecule_RQ..limere-,-sub forma de lamIDi lungi ~i flexibile care ies Ia suprafata, formate din 1,5 - poli(ribitol - foSfat) ~i 1,3 - poli (glicerol - fosfat) cu diferiti substituenti (zaharuri,cholina, D - alanina) care fumizeaza~. Exista acizi teichoicil~g~ti ~ecelule si acizi teichoici solubili, care poifi excretati in cantitati man.- ' '-- '"-._-----_.. "

,-<" .\. .

protemarnembranara

Iipoproteinll'

lipopoli%abaride {antia= ..0" canal(LPS) lipid A (poru1'protomet)

peptidoglican

,r, }m<mbranl

". /, plwnaticll

rn~brana rexterna i,;spatiu: fperiplasrnic

rne;nmma·plasmatica

Fig. 10. Compararea structurii detaliate a peretelui celular la bacteriile Gram-pozitive ~i Gram~negative: (a) reprezentare tridimensionala, (b) in sectiune longitudinaHi.

Acizii teichoici legati de celuHi apartin la doua clase: 1) aClZU

lipoteichoici care traverseaza peptidoglicanul: aviind un caplit al lantillui legatde un glicolipid din membrana plasmatica, iar celalalt expus la exterior ~i care

sunt prezenti la toate bacteriile Gram-pozitive; 2) acizii teichoici de perete,prezenti la ~bacterii Gram-pozitive, care sunt at~ati de resturile de NAMale peptidoglicanului. '

Rolul acizilor teichoici din peretele celular este multiplu:* fac posibiHi identificarea bacteriilor prin tehnici imunologice, fumizandspecificitate antigenidi; A-p .* confera peretelui celul~ un plus de rigiditate, iar in cazul bacteriilor patogeneun plus de viru1enta, opunandu-se procesului de fagocitoza;* sunt implicati in transportul ionilor in ~i in afara celulei;* unii pot functiona ca receptori pentru bacteriofagi;* pot juca un rol in diviziunea celulara. .

Bacteriile Gram-pozitive pot contine in anumite cazuri ~tr!lturi exteme J .reprezentate de un polizaharid propriu-zis legat covalent (de exemplu:hidrocarbonatul C de la Streptococcus) sau de proteine. (proteina M de laStreptococcus). Proteina poate forma un strat fibrilar sau 0 zona cristalinabidimensionala corespunzand uneori mai multor straturi.

Aceste straturi superficiale de proteine sau polizaharide au rol de adezinespecifice fiind raspunzatoare de fenomenulde ~eziU!?SJa suprafete specifice.

Bacteriile Gram-negative au un perete celular care contine numai 8 - 10 %peptidoglican din greutatea sa (corespunziind obi~nuit unui singrn strat) ~inu contineacizi teichoici. tn schimb, secaracterizeazlLprin aparitia unei structuri suplirnentare,in comparatie cu peretele celular al bacteriilor Gram-pozitive ~i anume: membranaexterna (denumita ~a prin contrast cu membrana citoplasmatica ce reprezintamembrana intema a celulei bacteriene) (Fig. 11).

Peretele cehilar al bacteriilor Gram negative este alcatuit astfel din douastructuri majore: - complexul peptidoglican - lipoprotehla, cu 0 grosime de1,5 - 3,0 nm ~i ---membrana extern a, eu 0 grosime de 6 - 20 nm. In compozitiachimica a membranei' externe a peretelui celular intra: fosfolipide (35%);proteine (15%) ~i lipopolizaharide (50%).

Fosfolipidele alcatuiesc dublul strat al membranei exteme (ca ~i in cazulmembranei plasmatice) in care sunt inclavate proteine ~i lipopolizaharide(LPS). LpS determina activitatea ~,a ~i de~enij:~ a bacteriei, uneleproprietati antigenice si sensibilitatea la fag., ~' --_ ..~--..-..---..,.....,

Fig. 11. Reprezentarea schematica a compu~ilor~i straturilor anvelopei celulare la bacteriile Gramnegative. Trimerii proteinei de matrice sunt asociati ell lipoproteina ~i LPS, iar lipoproteilla esteasociata covalent de peptidoglican. Schema ilustreazA ~i unele proprietati ale membranelor.

Ca structura generala lipopolizaharidele sunt aldituite din lipidul A ~ipolizaharidul 0 sau antigenul O. Lipidul A este inclus in membrana, in timp cepolizaharidul 0 este ata~at de acesta ~i fonneaza in exterior lanturi specificealcatuite din tri-, tetra-, pentazaharide, a caror lungime difera chiar la acela~iorganism. Fata de lipidul A care contine constituenti similari la diferite specii,R£U~aharidyleste variabil ca structura ~icompozitie chimica fiiria responsabil inmare parte de;§pecificitateaantigenica a celuleL .

. Intre membrana extema a peretelui celular ~i membrana intema(membrana plasmatidi a celulei) apare spapul periplasmic (Fig. 11).Membrana extema difera ca organizare ~i functionare de membrana intema(citoplasmatica) printr-o serie de particularitati:.:. In timp ce membrana intema este mentinuta strans ata~ata de peretele celular

prin presiunea turgor a protoplastului, retemia membranei exteme necesitaata~area de peptidoglicanul aflat dedesubt. Aceasta legare ferma a membraneiexteme de peptidoglican este conditionata in primul rand de 0 lipoproteinamica (G.M. = 7,000 Da) care este prezenta in aproximativ 250.000 copii perceluHi (Escherichia coli). Lipoproteina este legata covalent de aproximativ1/10 din tetrapeptidele peptidoglicanului formand complexul peptidoglican- lipoproteina.

H \ IIf .. . - \ . Bacterii

.~:. tn stratul intern al membranei ext~~~ ambele straturi ale membraneii~t~rne) lipidel~ principale. sunt .f~tatid~ in timp ce in stratul externhpldele predommante sunt hpopohzaliiiridele (LPS).

·:·Punctia majora a membranei externe este de a fumiza 0 sita moleculara carepermite numai difuzia unor molecule relativ mici. Ea nu permite trecereaunor enzime (de exemplu: lizozim) care ar putea ataca peptidoglicanul, foartesusceptibil de altfel, pentru ca se afla intr-un strat atilt de subtire la bacteriileGram negative .

•:. Unitatile de LPS asigura, prin existen1a in por1iunea lipididi a ~ase 1anturi de-acizi gra~i, 0 coerenta mai mare dedit cea asiguraUi de cele doua lanturi alefosfatidelor. In plus, toate lanturile, in LPS, sunt saturate. Ca urmare,membrana externa este lllai,glltW fluida dec5t membrana interna .

•:. Membrana extema mai c_~erenHieste de asemenea mai uti, ~~~s~Q atii sub actiunea detergentilor sau solventilor organici ~i~L uti!!.~~.a pentru molecule hidrofobe, cum ar fi cele a numeroaseantibiotice. Protectia rezultata fata de atacul sarurilor biliare poate explica dece bacteriile din intestinul superior sunt toate Gram-negative .

•:. Pe de alta parte, proteinele sistemului imunitar (anticorpii ~i complementul)pot ataca membrana extern a, dar nu pot ajunge la membrana "interna" abacteriilor Gram-pozitive. Deci prin acest mecanism sunt omorate numaibacteriile Gram-negative .

•:. Gelurile electroforetice ale membranelor solubilizate releva 0 mare varietate. de proteine in membrana intema, corespunzand numeroaselor ei functii. Princomparatie, aceasta varietate este mai limitata in membrana externa.

Din categoria proteinelor canicteristice membranei externe, orjnelesunt relevate la microscopul electronic sub forma de .ttirnm (g.m. = 35001fDa)~fiecare subunitate prezentand uti por cu diametrul de 1nm. Porinele sunt legatenecovalent de peptidoglican, prin aceasta modalitate de ata~are putand asiguracontinuarea canalului porinei in peptidoglican. Toti porii membranei extemetransfera in cantitate suficienta mplecule mici, insa trasaturile specifice alesuprafetei porinei influenteaza rata de trecere a moleculelor mai mari. Un uumarmic de o· . Y ifi . ai m re, furniziind <:@~~

ecifice pentru substante care se intalnesc in concentratie mica sau sunt preamari pentru a trece prin porinele obi~nuite, cum ar fi ~l}a, diferitLchela ri de fier, vitamina B12•

£. Unele dintre proteinele membranei exteme servesc de asemenea caJ.e.Ceptori specifici pentru b~~tiQfagi ~i pentru Q.~llitcjDe (proteine produse

de anumite bacterii cu actiune letaUipentru bacteriile strans inrudite ~i care auun spectru ingust de actiune In comparatie cu antibioticele; aceste proteine suntcodificate de plasmide).

Periplasma sau spapul periplasmic este un compartiment pericelular,care contine un numar mare de proteine, unele de natura enzimatica (RN-aze,fosfataze, penicilinaza) ~i altele implicate ill ~a ~i in

o~ (ca proteine de legare specififa). Pe~plasma mai contineconcentratii variabile dintr-un -91igo]ahariQ.~at ilID-.me.mbrana..( M.D.a. ="membrane derived oligosaccharide") implicat inls~e&!,are; Mentinerea unuivolum optim al periplasmei este necesara pentru cre~tereaoptima a bacteriilor ~imoleculele M.D.a. fumizeaza osmomolaritatea corespunzatoare pentru a facefata presiunii turgor a protoplastului.

Funetiile perete1uicelularrn .Peretele celular functioneaza c)fG'n sistem d~ezistenta mecaniea ee

mentine intreaga stru~a a c~lulei~i da forma aeesteia~sigura proteetia celuleifata de ~oeulosmotieyP'artieipa ill proeesul de cre~terea eelulei, inAl\ocesul dediviziune (prin formarea septului transversal) ~i de sporogeneza~re rol inproeesele de schimb intre eelula ~i mediul ineonjurator. La nivelul pereteluieelular sunt localizati 0 serie de reeeptori sau suprafete de recunoa~tere euimplicatii multiple in activiHitile~i soarta eelulei bacteriene. Membrana extemaa peretelui eelulelor Gram-negative functioneaza ea 0 bariera de permeabilitatesuplimentara (sitli moleeulara) intre interiorul celulei ~i anumite substante dinmediu: anitbiotiee (penieilina), anumiti coloranti, saruri biliare ~i metale grele.D,e as~menea, membrana externa scade capacitatea de fagocitoza a celulelor6rganismului gazda pentru baeteriile Gram-negative, opunandu-seproeesului deadeziune intre fagoeit ~ibacterie. Contribuie astfel indirect la cre~tereavirulenteibacteriilor patogene. Prin natura LPS membrana extema conferaeeluleibacteriene 0 anumita "personalitate" biochimiea sau calitatea de antigen. Astfel,antigenele 0 din structura LPS ajutli la distingerea speciilor de bacterii Gram-negative (de exemplu: Salmonella) prin tehnici imunologice. Acest rol estecomparabil cu cel al acizilor teichoici din celulele Gram-pozitive. Lipidul A sauendotoxina din aldituirea LPS este toxic in circuitul sanguin al gazdeiprovodind febra ~ihemoliza intravasculara.

Prezenta spatiului periplasmic in structura peretelui unor celulebacteriene are semnificatia unui compartiment adaptativ. Posibila prelucrare asubstantelor nutritive intr-un asemenea compartiment pericelular asigura unanumit grad de eficienta procesului de nutritie, ceea ce explica aparitia sa inspecial la bacteriile din mediile naturale sarace in substante nutritive (deexemplu ape naturale). z-