Oleh:
Tim Asisten Prinsip Bioteknologi
Akuakultur
BUDIDAYA PERAIRAN 2020
Prinsip Bioteknologi Akuakultur
BUKU PANDUAN PRAKTIKUM
PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR
NAMA :
NIM :
KELOMPOK :
PROGRAM STUDI BUDIDAYA PERAIRAN
JURUSAN MANAJEMEN SUMBERDAYA PERAIRAN
FAKULTAS PERIKANAN DAN ILMU KELAUTAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2020
KATA PENGANTAR
Syukur Alhamdulillah kami panjatkan kehadirat Allah SWT atas segala
limpahan rahmat dan Karunia-Nya sehingga Buku Panduan Praktikum Prinsip
Bioteknologi Akuakultur dapat disusun.
Buku panduan merupakan susuatu pedoman yang menyajikan metode
pelaksanaan praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur yang pada dasarnya
dirangkum dari berbagai referensi untuk menuntun praktikan. Materi yang
disajikan mengenai Isolasi Bakteri dan Ekstrasksi DNA udang vannamei
(Litopenaeus vannamei).
Buku panduan ini merupakan penuntun praktikum Prinsip Bioteknologi
Akuakultur sehingga dapat bermanfaat bagi praktikan dan pembaca. Kami
menyampaikan terimakasih kepada pihak-pihak yang secara langsung maupun
tidak langsung telah membantu dalam penyelesaian buku ini. Tim penyusun
menyadari akan keterbatasan yang dimiliki sehingga kami mengharapkan saran
atau kritik konstruktif bagi penyempurnaan buku ini di lain waktu.
Malang, 30 Agustus 2020
Tim Penyusun
TATA TERTIB PRAKTIKUM
PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR
1. Mempersiapkan diri dan masuk beberapa menit sebelum praktikum dimulai.
2. Dilarang meninggalkan praktikum tanpa seizin koordinator praktikum
3. Dilarang makan dan minum selama praktikum berlangsung kecuali seizin
koordinator praktikum
4. Wajib mengikuti rangkaian praktikum diantaranya pretest, posttest, praktikum
kelas (melalui Google Meet), ujian akhir praktikum serta mengerjakan
laporan praktikum
5. Mengikuti ketentuan praktikum kelas
6. Apabila tidak mengikuti salah satu dari rangkaian praktikum maka tidak ada
susulan
7. Jika terdapat kendala dapat menghubungi asisten kelompok masing-masing
8. Terdapat absensi pada kegiatan praktikum
9. Menjaga ketertiban dan kelancaran jalannya praktikum
1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Segala sesuatu yang menggunakan jasad hidup mikroorganisme atau
produknya untuk menghasilkan barang dan jasa demi kemaslahatan manusia
merupakan konsep dasar yang harus dipahami sebelum mempelajari cakupan
bioteknologi secara luas. Prinsip dasar bioteknologi adalah adanya agen biologi
(mikroba, enzim, sel hewan, sel tumbuhan), pendayagunaan “teknologi” untuk
memanipulasi DNA, serta menggunakan berbagai disiplin ilmu yang saling
berkaitan (Nugroho dan Rahayu, 2017).
Dalam kurun waktu 20 tahun terakhir ini, bioteknologi telah mengalami
perkembangan sangat pesat. Di beberapa negara maju, bioteknologi
mendapatkan perhatian serius dan dikembangkan secara intensif dengan
harapan dapat memberi solusi untuk mengatasi berbagai permasalahan yang
dihadapi manusia pada saat ini maupun yang akan datang yang menyangkut;
kebutuhan pangan, obat-obatan, penelitian, yang pada gilirannya semuanya
bertujuan untuk meningkatkan kesejahteraan hidup umat manusia (Nurcahyo,
2011).
Kemajuan-kemajuan ilmu pengetahun dan teknologi yang telah ada baik
di bidang fisika, kimia, matematika dan biologi telah memicu majunya
bioteknologi. Selain itu, banyak hal yang juga ikut berperan dalam memicu
lahirnya bioteknologi, diantaranya adalah karena semakin besar tuntutan untuk
mencapai target yang diinginkan dengan proses yang lebih cepat dan terobosan
yang inovatif yang bisa menguntungkan bagi umat manusia. Bioteknologi juga
memiliki peran penting dalam ilmu pengetahuan dewasa ini, bioteknologi sendiri
mengalami berbagai pembaruan dari bioteknologi yang bersifat tradisional
kearah bioteknologi yang modern. Manfaat bioteknologi bagi kehidupan manusia
dalam meningkatkan kesejahteraan dan perbaikan hidup telah terbukti, antara
lain penerapannya untuk memerangi kelaparan, mengatasi kelangkaan sumber
daya energi, mengurangi pencemaran lingkungan dan masih banyak lagi
(Sutarno, 2016).
Usaha akuakultur dapat dibedakan menjadi dua, yaitu (1) budidaya
perikanan berbasis di darat (land-based aquaculture) dan (2) budidaya perikanan
berbasis di laut (marine based aquakultur). Berdasarkan sistem produksinya,
budidaya dibedakan menjadi : budidaya tradisional, budidaya semi-intensif, dan
budidaya intensif. Kesemuanya dapat memberikan hasil yang maksimal apabila
ditunjang dengan adanya bioteknologi yang memadai (Saru, et al., 2004).
Oleh sebab itu, salah satu alternatif untuk mengatasi permasalahan
tersebut di atas, perlu dilakukan perbaikan terhadap sistem budidaya perikanan
yang diterapkan selama ini, yaitu dapat dilakukan dengan melalui pemanfaatan
mikroba menguntungkan. Melalui aplikasi bioteknologi diharapkan produktivitas
budidaya dapat ditingkatkan.
1.2 Maksud
Maksud dari Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur adalah untuk
menambah pengetahuan, dan melakukan teknik pelaksanaan ekstraksi DNA,
pengenalan dan teknik gambaran pelaksanaan PCR hingga proses
elektroforesis. Selain itu mahasiswa dapat mengetahui bagaimana prosedur
untuk menanamkan bakteri
1.3 Tujuan
Tujuan dari Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur yaitu:
1. Mengetahui prinsip kerja PCR
2. Mengetahui dan mampu melaksanakan cara ekstraksi DNA udang dan
bakteri
3. Mengetahui dan mampu melaksanakan prosedur amplifikasi
4. Mengetahui dan mampu melaksanakan cara elektroforesis
1.4 Tempat dan Waktu Pelaksanaan
Praktikum Prinsip Bioteknologi Akuakultur dilaksanakan daring melalui
Google Meet pada tanggal 11 Oktober 2020.
2. MATERI DAN METODE
2.1 Kultur Bakteri.
Bakteri adalah mikroorganisme yang berukuran mikroskopis. Menurut
Mohamad et al. (2014), bakteri merupakan mikroorganisme prokariotik, yaitu
organisme yang paling sederhana strukturnya. Prokariota tidak memiliki inti dan
organel kompleks. Bentuk bakteri yang paling biasa ditemui adalah batang, cocci
(bundar), dan bentuk spiral. Beberapa spesies memiliki flagela yang
memungkinkan bakteri berenang dan bergerak. Spesies bakteri biasanya
dikelompokkan menjadi beberapa jenis dan ada beberapa jenis yang biasanya
bersifat pathogeni seperti Salmonellae, E. Coli, dan Vibriones.
Austin (1988) mengatakan Vibrio merupakan patogen oportunistik yang
dalam keadaan normal ada dalam lingkungan pemeliharaan, kemudian
berkembang dari sifat saprofitik menjadi patogenik jika kondisi lingkungan
memungkinkan. Bakteri vibrio yang patogen dapat hidup dibagian tubuh
organisme lain baik di luar tubuh dengan jalan menempel, maupun pada organ
tubuh bagian dalam seperti hati, usus, dan sebagainya. Menurut dampak
langsung bakteri patogen dapat menimbulkan penyakit, parasit, pembusukan
DNA toksin yang dapat menyebabkan kematian biota yang menghuni perairan
yang terkontaminasi Vibrio sp.
Proses kultur bakteri Vibrio sp. pada media TSB (Trypticase Soy Broth) 2%
adalah sebagai berikut:
Ambil stock bakteri V. alginolyticus dari Freezer (-80oC).
Siapkan media TBS steril.
Nyalakan LAF (Laminary Air Flow).
Kultur Bakteri Vibrio alginolyticus
Nyalakan bunsen di dalam LAF (Laminary Air Flow).
Ambil 100 µl bakteri V. alginolyticus dengan mikropipet.
Tanam bakteri pada media TSB steril.
Vortex selama 10 detik.
Inkubasi maksimal 2 x 24 jam pada inkubator bersuhu 30°C.
Media yang sering digunakan secara umum dalam mirkobiologi antara lain:
Lactose agar, EMBA (Eosin Methylene Blue Agar), NA (Nutrient Agar), NB
(Nutrient Broth), TSB (Trypticase Soy Broth), PCA (Plate Count Agar), PCA
(Potato Dextrose Agar)
Skema Kerja Pembuatan Media TSB (Trypticase Soy Broth)
Siapkan erlenmeyer 100 ml
Timbang TSB
TSB = 30/1000 x ∑ tabung reaksi x ∑ ml untuk 1 tabung reaksi
Tambahkan NaCl sebanyak 2% dari volume TSB
Masukan aquades pH 7 sebanyak 50 ml(5 tabung) pada gelas ukur
Larutkan TSB dan NaCl dalam aquades pada Erlenmeyer
Tutup dengan kapas dan alumunium foil
Homogenkan dengan hot plate
Masukan dalam tabung reaksi masing masing 10ml sebanyak 5 tabung
dengan bantuan bola hisap dan pipet volume
Sterilisasi dengan autoklaf pada suhu 121’C tekanan 1 atm selama 15
menit
Keluarkan dari autoklaf dan biarkan sampai hangat kuku
Didapatkan media TSB steril
Hasil
TSB (Trypticase Soy Broth)
Hasil
2.2 Pengertian PCR (Polymerase Chain Reaction)
PCR ditemukan oleh Kary Muilis tahun 1983. PCR menjadi teknik umum
yang digunakan dalam laboratorium penelitian medis dan biologi untuk berbagai
keperluan, seperti pengurutan gen-gen dan diagnosis penyakit turunan,
identifikasi sidik-jari genetik (digunakan dalam pengujian forensik dan paternitas),
deteksi dan diagnosis penyakit infeksi dan pembentukan organisme transgenik.
PCR juga digunakan dalam biosistematika, biologi populasi, biologi konservasi,
ekologi, biologi perkembangan, dan genetika.
PCR adalah salah satu teknik dalam biologi molekuler untuk
mengamplifikasi atau menggandakan sejumlah kecil DNA secara in vitro
menggunakan system enzimatik dan suhu. PCR merupakan suatu sistem
pemeriksaan untuk replikasi DNA yang memungkinkan suatu rangkaian DNA
target spesifik mengalami amplifikasi secara selektif atau bertambah dalam
waktu beberapa jam saja. PCR dimulai dengan DNA template (cetakan) dalam
jumlah yang sangat sedikit, kemudian setelah melalui beberapa siklus
amplifikasi, jumlah copy DNA kan menjadi jutaan kali lipat.
Menurut Lo (2006), prinsip dasar yang dilakukan PCR sebenarnya sangat
sederhana, karena PCR memiliki prinsip kerja berlandaskan terjadinya replikasi
DNA yang terjadi selama proses pembelahan sel. PCR adalah teknik yang paling
populer dan banyak digunakan di semua bidang studi biologis. Metode PCR
banyak disukai karena cepat dan tidak menimbulkan senyawa radioaktif hanya
dengan menggunakan alat Thermal cycler yang dapat dilihat pada Gambar 1.
Gambar 1. Thermal Cyler
Manfaat PCR sendiri adalah isolasi gen, DNA Sequencing, forensik, dan
diagnosa penyakit. Pada akuakultur sendiri, PCR paling sering digunakan untuk
mengidentifikasi apakah terdapat penyakit atau tidak pada suatu organisme yang
diuji. Menurut Zulfahmi (2013), teknologi PCR ditemukan oleh Mullis dan Faloona
pada tahun 1987. Alat ini ditujukan untuk pemanfaatan penanda molekuler DNA
dan diaplikasikan pada berbagai bidang. Teknik PCR telah banyak digunakan
pada penelitian mengenai filogenetik. Oleh karena itu, dalam bidang perikanan
teknik PCR ini dapat digunakan untuk mengetahui hubungan kekerabatan antar
genus ikan yang berbeda.
Kelebihan PCR:1. Memiliki spesifitas tinggi
2. Sangat cepat dapat memberikan hasil yang sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus hidup
5. Mudah di set up
Kelemahan PCR:1. Sangat mudah terkontaminasi
2. Biaya peralatan dan reagen mahal
3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum tervalidasi untuk semua penyakit
infeksi misalnya infeksi pasif atau laten
4. Teknik prosedur yang kompleks dan bertahap membutuhkan keahlian
khusus untuk melakukannya.
2.3 Ekstraksi DNA
Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis
DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel,
yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan
langkah-langkah laboratorium untuk memecahkan dinding sel dan membran inti,
dilanjutkan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel. Prinsip utama dalam
isolasi DNA ada tiga yakni penghancuran (lisis), ekstraksi atau pemisahan DNA
dari bahan padat seperti selulosa dan protein, serta pemurnian DNA.
Proses pengeluaran DNA dari nukleus, mitokondria maupun organel lain-
dengan cara diekstraksi atau dilisiskan, biasanya dilakukan dengan homogenase
dengan penambahan buffer ekstraksi atau buffer lisis untuk mencegah DNA
rusak. Pada saat melakukannya, DNA harus dijaga agar tidak rusak dan
didapatkan DNA dalam bentuk rantai yang panjang.
Isolasi DNA khusus untuk udang post larva, diambil semua bagian
tubuhnya, sedangkan udang yang berukuran lebih dari 4 cm (umur 1,5 bulan)
hanya diambil hepatopankreas. Hepatopankreas merupakan organ target infeksi
bakteri dan merupakan organ yang bertanggung jawab dalam proses pertahanan
tubuh.
Sampel yang diambil pada udang ada 3 (karena ada gen pertumbuhan)
1. Tangkai mata, ada MIH (Moulting Inhibiting Hormone)
2. Hepatopankreas, ada CypA (Cyclophilin A)
3. Daging, ada SIBD (Single Insulin Binding Domain)
Skema Kerja Ekstraksi DNA Udang Vannamei (Litopanaeus vannamei) dengan Metode Lysis Buffer
Ditimbang sebanyak 100 mg menggunakan timbangan digital.
Sampel dihancurkan dan haluskan pada botol film lalu dimasukkan ke
dalam mikrotube 1,5 mL.
Tambahkan 500 µL Lysis Buffer, dan homogenkan.
Inkubasi pada suhu 95oC selama 10 menit.
Sentrifuge 12.000 rpm selama 10 menit.
Pindahkan 200 µL supernatan dalam tube baru, tambahkan 400 µL
ethanol 95 %.
Voretex kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit.
Buang supernatan secara hati-hati, kering anginkan pelet DNA selama
10 menit.
Larutkan DNA dengan ddH2O atau TE Buffer sebanyak 100 µL.
Simpan DNA pada lemari pendingin dengan suhu 2-8oC.
Skema Kerja Ekstraksi DNA bakteri Vibrio alginolyticus dengan Metode Lysis Buffer
Isolat bakteri diambil sebanyak 1 mL.
Sentrifuge dengan kecepatan 10.000 rpm selama 2 menit suhu 4oC.
Diambil 500 µL supernatant.
Tambahkan 500 µL Lysis Buffer, dan homogenkan.
Inkubasi pada suhu 95oC selama 10 menit.
Sentrifuge 12.000 rpm selama 10 menit dengan suhu 4oC.
Pindahkan 200 µL supernatan dalam tube baru, tambahkan 400 µL
Sampel
Hasil
Isolat Bakteri
Ethanol 95 %.
Vortex kemudian sentrifuge 12.000 rpm selama 5 menit dengan suhu
4oC.
Buang supernatan secara hati-hati, disisikan filtrat sebanyak 500 µL.
Larutkan pelet dengan ddH2O atau TE Buffer sebanyak 100 µL.
Simpan DNA pada lemari pendingin dengan suhu 2-8oC.
Macam-Macam Ekstraksi DNA :
A. Penggunaan KIT
Kelebihan : - Mudah digunakan
- Proses lebih cepat
- Hasil ekstraksi bagus
- Sudah tersedia dalam 1 paket
- Bisa digunakan untuk DNA dan RNA
Kekurangan : - Harganya relative mahal
- Membutuhkan peralatan canggih
- Komposisi hanya diketahui oleh perusahaan
B. C-TAB atau D-TAB
Kelebihan : - Umum digunakan
- Dapat digunakan hampir semua jenis sampel
- Hasil pita DNA tebal
Kekurangan : - Terlalu banyak bahan yang digunakan
- Harga mahal
- Proses lama
C. Lysis Buffer
Kelebihan : - Mudah digunakan
Hasil
- Bahan-bahan yang digunakan sedikit
- Proses lebih cepat
- Harga terjangkau
Kekurangan : - Hasil DNA kurang jelas atau kurang tebal
D. Phenol Chloroform
Kelebihan : - Umum digunakan
- Bahan mudah dicari
- Proses lebih cepat
- Hasil DNA lebih bagus
Kekurangan : - Menghasilkan senyawa toksik yang bersifat karsinogenik
2.4 Uji Kuantitatif DNA
DNA genom hasil isolasi dilakukan uji kuantitatif menggunakan
spektrofotometer untuk melihat kemurnian DNA sampel. Tingkat kemurnian isolat
DNA murni memiliki nilai yang berkisar antara 1,8-2,0 dan uji kualitatif
menggunakan metode standar berupa identifikasi, pemisahan, dan purifikasi
fragmen DNA yaitu elektroforesis gel agarose. Jika tingkat kemurniannya rendah
maka akan mempengaruhi pada penempelan primer terhadap situsnya dan akan
menghambat aktivitas enzim polimerase DNA.
Spektrofotometer merupakan alat yang digunakan untuk mengukur absorbansi
suatu bahan dengan cara melewatkan cahaya dengan panjang gelombang
tertentu pada suatu objek kaca atau kuarsa yang disebut cuvet. Sebagian dari
cahaya tersebut akan diserap dan sisanya akan dilewatkan.
Prinsip kerja : menembakkan cahaya untuk diserap dan dibaca pantulannya.
Skema Kerja Uji kuantitatif DNA
Sambungkan ke arus listrik.
Dikalibrasi menggunakan 1 µL aquades pada sensor hingga
konsentrasinya 0 ng/µL.
Tekan penutupnya.
Jalankan alat menggunakan software dengan panjang gelombang 260
nm untuk uji DNA dan 280 nm untuk uji protein.
Tunggu sampai hasil terbaca (0).
Masukkan DNA sampel sebanyak 1 µL.
Tutup penutupnya dan jalankan menggunakan software.
Blasting adalah metode untuk mengetahui index similaritas DNA. Aplikasi yang
digunakan adalah Mega 7,026
Uji dengan Nanodrop Spectrophotometer 3 kali ulangan
Rumus uji kuantitatif kemurnian DNA:
nilai absorbansi panjang gelombang DNA
nilai absorbansi panjang gelombang protein
Keterangan :
nilai absorbansi pada panjang gelombang DNA = 260 ng/ µL
nilai absorbansi pada panjang gelombang protein = 280 ng/ µL
*Protein merupakan kontaminan utama dalam kemurnian DNA
Nanodrop Spectrophotometer
Hasil
Uji kuantitatif kemurnian DNA =
2.5 Amplifikasi DNA dengan PCR
Amplifikasi adalah suatu proses yang dapat menggandakan atau
mereplikasi suatu DNA yang semulanya sedikit (bisa 1 atau 2 dan seterusnya)
bisa menjadi banyak atau berlipat ganda. Pada setiap n siklus PCR akan
diperoleh 2n kali banyaknya DNA target. Kunci utama pengembangan PCR
adalah menemukan bagaimana cara amplifikasi hanya pada urutan DNA target
dan meminimalkan amplifikasi urutan non-target.
Menurut Lo (2006), pada dasarnya PCR terjadi dalam tiga tahap, yakni
denaturasi, annealing dan extension. Denaturasi akibat adanya panas yang
diberikan kepada DNA. Annealing atau penempelan DNA primer dalam
temperatur yang dingin, dan yang terakhir adalah pemanjangan/ekstensi dari
DNA primer yang telah dilakukan proses annealing dengan menggunakan DNA
polimerase. Proses dasar siklus dari PCR ini akan berulang hingga 30-35 siklus.
Siklus dari PCR dapat dilihat pada Gambar 2.
Untuk menjalakan proses amplifikasi diperlukan beberapa komponen
untuk berjalannya proses ini. Adapun komponen dari PCR yang diperlukan
antara lain:
a. DNA template
b. dNTPs
c. Primer
d. Buffer
e. DNA polymerase
f. NFW (steril water)
g. MgCl2
h. Thermal cycler
Gambar 2. Siklus PCR
Skema Kerja tahapan PCR dari Sampel Udang
Siapkan master mix, yaitu: Primer F (0,5 µL) Primer R (0,5 µL) Steril Water (ddH2O) (3 µL) 2x Go Taq Green PCR (5 µL)
Masukkan master mix ke dalam mikrotube 0,5 mL.
Dihomogenkan sampai bening.
Siapkan mikrotube ukuran 200 µL.
Masukkan master mix ke dalam mikrotube ukuran 200 µL dengan
konsentrasi yang telah ditentukan.
Tambahkan 1 µL DNA template.
Masukkan mikrotube pada Thermal cycler yang sudah disetting
waktunya.
Ambil mikrotube dari Thermal cycler.
2.6 Elektroforesis
Prinsip dasar dari elektroforesis adalah memisahkan molekul berdasarkan
muatan listrik. Elektroforesis DNA biasanya digunakan untuk memisahkan DNA
Sampel
Hasil
berdasarkan perbedaan ukurannya. Semakin besar ukuran molekul maka laju
dari migrasi akan semakin rendah. Molekul DNA bermuatan negatif sehingga di
dalam medan listrik akan bermigrasi melalui matriks gel menuju kutub positif
(anode).
Ada bermacam-macam zat kimia yang dapat digunakan sebagai gel di
dalam proses elektroforesis. Penggunaan jenis gel disesuaikan dengan tujuan
yang akan dicapai. Secara umum ada 2 jenis gel yang biasa digunakan yaitu
Agarose Gel Electrophoresis (AGE) dengan visualisasi menggunakan ethidium
bromide dan Polyacrilamide Gel Electrophoresis (PAGE) dengan visualisasi
menggunakan silver staining. Kedua cara elektroforesis ini banyak digunakan
dalam visualisasi produk PCR. Prinsipnya alat elektroforesis dibagi menjadi 2
yaitu horizontal elektrophoresis dan vertical elektrophoresis.
Prinsip dasar elektroforesis berhubungan dengan gaya gerak Iistrik yang
digunakan untuk mendorong atau menarik molekul melalui matriks gel. Molekul
bermuatan yang ditempatkan di dalam "sumur" gel dan dialiri arus listrik akan
bergerak melalui matriks dengan kecepatan berbeda, menuju anoda jika
bermuatan negatif atau menuju katoda jika bermuatan positif (catatan bahwa
Elektroforesis gel bekerja sebagai sel listrik; anoda bermuatan positif dan katoda
bermuatan negatif). Alat yang digunakan untuk proses eletroforesis dapat dilihat
pada Gambar 3.
Gambar 3. Alat Elektroforesis
Skema Kerja Pembuatan Gel Agarose
Ditimbang sebanyak 0,45 gr.
Masukkan ke dalam erlenmeyer.
Tambahkan TBE 1X pH 8 sebanyak 30 ml.
Dihomogenkan dan dipanaskan dalam microwave.
Tunggu hingga bening.
Angkat dan tunggu hingga hangat kuku.
Tambahkan larutan EtBr sebanyak 1 ml.
Tuang ke dalam cetakan yang telah disiapkan.
Tunggu hingga gel agarose menjadi padat.
Bubuk gel agarose
Hasil
Skema Kerja Elektroforesis
Letakkan gel agarose padat ke dalam Gel Tank dan pastikan
letaknya sudah sesuai.
Tambahkan TBE 1X pH 8 sampai menggenangi gel agarose.
Gel agarose yang digunakan berkosentrasi 1,5%. Gel agarose ada 2:
1% : pori-pori lebih besar, untuk whole DNA (DNA murni) / DNA
utuh suatu organisme
1,5% : pori-pri lebih kecil, untuk pengujian DNA spesifik/potongan
khusus
Ambil 5 µL sampel DNA hasil PCR dan homogenkan dengan 1 µL
loading dye pada mikrotitter menggunakan mikropipet.
Masukkan ke dalam sumuran gel agarose secara hati-hati.
Marker 1Kb yang digunakan letakkan pada ujung dari agarose
sebanyak 6 µL.
Tutup alat elektroforesis sambungkan pada power supply dan tekan
power supply “ON”.
Tunggu hingga 60 menit untuk proses elektroforesis.
Angkat agarose dan rendam agarose dengan aquades selama 15
menit.
Visualisasikan agarose dengan menggunakan Gel Doc.
Elektroforesis
Hasil
FUNGSI ALAT DAN BAHAN
1. ddH2O atau TE Buffer : untuk melarutkan dan menambah kemurnian
DNA
2. DNA template: sebagai cetakan untuk pembentukan molekul DNA baru
yang sama atau sebagai sampel DNA yang akan digandakan.
3. DNTPs: sebagai building block DNA yang diperlukan dalam proses
ekstensi DNA. dNTP akan menempel pada gugus –OH pada ujung 3’ dari
primer membentuk untai baru yang komplementer dengan untai DNA
templat.
4. Primer: sebagai pembatas fragmen DNA target yang akan diamplifikasi
dan sekaligus menyediakan gugus hidroksi (-OH) pada ujung 3’ yang
diperlukan untuk proses eksistensi DNA.
5. Primer F dan R: sebagai kodon yang mengawali dan mengakhiri sampel
DNA yg akan digandakan
6. Buffer: untuk menjamin pH medium.
7. DNA polymerase: sebagai katalisis untuk reaksi polimerisasi DNA. Pada
proses PCR enzim ini diperlukan untuk tahap ekstensi DNA.
8. MgCl2: sebagai kofaktor yang berfungsi menstimulasi aktivitas DNA
polimerase. Dengan adanya MgCl2 ini akan meningkatkan interaksi
primer dengan templat yang membentuk komplek larut dengan dNTP
(senyawa antara). Dalam proses PCR konsentrasi MgCl2 berpengaruh
pada spesifisitas dan perolehan proses.
9. Thermal cycler: sebagai alat yang melakukan proses PCR
10. 2x Go Taq Green PCR: bahan yang berisi basa-basa nitrogen untuk
memperbanyak DNA
11. TBE (Tris-Borate-EDTA “Ethylene Diamine Tetra Acetic Acid”) buffer: membantu agar electron yang ada di DNA berjalan dan tidak meluber
kemana-mana
12. EtBr (Ethidium Bromide): untuk staining, bersifat karsinogenik
13. Loading dye: sebagai pemberat dan pewarna DNA
14. Ethanol: untuk menghilangkan residu dan meningkatkan kemurnian DNA
DAFTAR PUSTAKA
Austin, B. 1988. Metode-metode untuk Bakteriologi Akuatik (terjemahan Ratna Hadioetomo). PAU IPB. Bogor. p: 125-133.
Lo, D. 2006. Clinical Applications of PCR : Second Edition. New Jersey : Humana Press.
Nugroho, E. D. dan D. A. Rahayu. 2017. Pengantar Bioteknologi (Teori dan Aplikasi. Deepublish. Yogyakarta. 133 hlm.
Nurcahyo, H. 2011. Diktat Bioteknologi. Universitas Negeri Yogyakarta. Yogyakarta. 121 hlm.
Saru, A., A. R. Pratiwi, B. Rosida, E. T. Setiatin, dan Y. Yelita. 2004. Bioteknologi dan aplikasinya di berbagai bidang: suatu tinjauan umum. Artikel Ilmiah. ITB. Bogor. 18 hlm.
Sutarno. 2016. Rekayasa genetik dan perkembangan bioteknologi.Prosiding Biology Education.13(1): 23-27.
GLOSARIUM PRAKTIKUM PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR
1. Bioteknologi : Cabang ilmu yang mempelajari pemanfaatan makhluk
hidup (bakteri, fungi, virus, dan lain-lain) maupun produk dari makhluk hidup
(enzim, alkohol) dalam proses produksi untuk menghasilkan barang dan
jasa.
2. Diploid (2n) : Sel yang berisi dua set lengkap kromosom atau disebut
juga berjumlah 2n (n ialah jumlah pasangan kromosom).
3. DNA : Asam nukleat yang menyimpan semua informasi tentang
genetika.
4. DNA Polimerase: Enzim yang mengkatalisis polimerisasi nukleotida
menjadi untaian DNA.
5. DNA Templete : DNA untai ganda yang membawa urutan basa fragmen
yang akan digandakan.
6. Elektroforesis : Teknik yang digunakan untuk memisahkan makromolekul
(DNA, RNA dan Protein) berdasarkan ukurannya.
7. Gen : Bagian dari kromosom atau salah satu kesatuan kimia
(DNA) dalam lokus pada kromosom.
8. Genbank : Aplikasi untuk mengetahui kemiripan serta kode gen
dari objek yang diteliti.
9. Genom : Keseluruhan informasi genetik yang dimiliki suatu sel
atau organisme, atau khususnya keseluruhan asam nukleat yang memuat
informasi tersebut.
10. Haploid (n) : Sel yang hanya berisi satu set lengkap kromosom atau
disebut juga berjumlah n (n ialah jumlah pasangan kromosom).
11. Hepatopankreas: Organ terpenting pada udang yang memiliki fungsi
seperti hati dan pankreas pada mamalia.
12. Isolasi : proses pemindahan bakteri dari media asal ke media
buatan (baru) untuk memperoleh biakan murni.
13. Isolat : Biakan murni pertama yang dibuat dari sumber segar
aslinya.
14. Kromosom : Unit pewaris dalam inti dari semua sel eukariot yang
didalamnya tersusun oleh banyak DNA.
15. Kultur : Suatu metode untuk menanam atau memelihara sel atau
jaringan dalam suatu laboratorium.
16. Lisis : Peristiwa pecahnya sel karena kerusakan membran
plasma.
17. Patogen : Mikroorganisme parasit yang dapat menyebabkan penyakit pada
inangnya.
18. Polimerisasi : Suatu reaksi pengabungan molekul-molekul kecil
(monomer) yang membentuk molekul yang besar.
19. Primer : Rantai DNA pendek yang terdiri atas beberapa
nukleotida.
20. Purifikasi : Proses pemisahan mikroorganisme yang diinginkan dari
populasi campuran ke media biakan (buatan) untuk mendapatkan kultur
murni.
21. Residu : Ampas, sisa pengendapan dari sebuah zat tertentu yang
mengalami pemisahan kepekatan.
22. Sequencing : Penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul
DNA yang relatif pendek.
23. Similaritas : Sebuah kemiripan dalan gen satu ke gen yang lain yang
dihasilkan dengan sekuen yang telah ada di dalam Genbank.
24. Supernatan : Substansi hasil sentrifugasi yang memiliki bobot jenis
yang lebih rendah.
25. Transgenik : Proses pemindahan gen (transgen) ke organisme hidup
sehingga organisme memiliki sifat dan ciri-ciri baru yang akan diteruskan ke
keturunannya.
DAFTAR NAMA ASISTEN PRINSIP BIOTEKNOLOGI AKUAKULTUR 2020
No. Nama NIM No. HP / ID Line Alamat
1. Wahyu Pangestu Gusti 175080507111015 087866801298 /
wahyupgstJl. Kenanga Indah 1
2. Izzah Linatul Khariroh 175080500111007 081332943232 /
izzahlinaJl. MT. Haryono Gg. 5 No. 273
3. Winda Lestari Marhaningsih 175080500111023 085607799475 /
windalemJl. Sumbersari Gg. 1A No.82
4. Rizza Mayang Anggraini 175080500111003 081216868684 /
rizzamayangJl. Sumbersari Gg. 4 No. 225 K
5. Yolani Jamilatul Uswah 175080500111035 089616233153 /
yolanijamilatuluJl. Kerto Rahayu No. 41
6. Derliana Anantya Sari 185080500111014 081554592824 /
derlianantyasJl. Sumbersari Gg. 4 No. 280
7. Nanin Dewi Fitriyah 185080500111047 0895607999866 /
nanindewiJl. Sumbersari Gg. 4 No. 270
8 Nisa Wahyu 185080500111022 081232716505 / nisawahyuu
Jl. Kertorejo No. 33
9 Irsanti Mawaddah Nur 185080500111046 081252300342 /
mawaddahirsa31Jl. Sumbersari Gg. 2
10 Jamiilah Zahrotul Jannah 185080507111015 08970862432 /
jamiilahzjJl. Sumbersari No. 200 C
11. Khalimatus Sya’diyah 185080501111031 085848355892 /
lisakhalimatusJl. Kertosentono N0. 29
12. Kevin 185080501111013 082261303160 / sanjayakevin
Jl. Semanggi Barat No. 3 B