Protocollo di binding (tipo 1)([crescenti] di radioattivo

R

[R]

R

[3R]

R

R

[10R]

R

R

R

[30R]

R

R

R

R

R

+ tutti i non-specifici rispettivi

Binding

R R

R

Separazione Filtrazione, centrifugazione

ligandoradioattivo

tessuto,membrane

R

Quant

ifica

zione

Concentrazione diFarmaco radioattivo

nM totale non specifico3 1283 3310 2917 11230 4661 33560 5682 670

100 6450 1117

Radioattivita’legata

Radioattivita’ legata in presenzadi 10 µM di farmaco non radioattivo

Radioattivo: 100 Ci/mmol50 µg/tubo

Dati sperimentali

I due tipi di binding: tipo I e tipo II

Saturazione Competizione

[X*]

[3X*]

[X*]

Protocollo di binding (tipo 2)Radioattivo fisso e [crescenti] di spiazzante non radioattivo

R

[R]

R

R

R

R

R

[R] + F

R

R

R

R

[R] + 10F [R] +1000F

R R R R

Non specifico

Perche’ utilizzare questo protocollo???

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0 20 40 60 80 100 120

Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510

10 0.1 100 Non-specifico 500

Esempio di binding (II)CONCENTRAZIONE DI RADIOATTIVO COSTANTE; INCREMENTO DI SPIAZZANTE

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

Tubo numero Ligando radioattivo Ligando non radioattivo spiegazione Farmaco radioattivo legato1 0.1 - Conte totali 34502 0.1 0.01 33503 0.1 0.03 31004 0.1 0.1 25005 0.1 0.3 17006 0.1 1 10007 0.1 3 7008 0.1 10 5509 0.1 30 510

10 0.1 100 Non-specifico 500

Curva diinibizione

A* + R AR B + R BR

KA =[AR]

[A][R]KB =

[BR][B][R]

[AR] = KA[A][R] [BR] = KB[B][R]

RT = [R] + [AR] + [BR]

= [R] + KA[A][R] + KB[B][R]

= [R](1+ KA[A] + KB[B])

[R] =(1+ KA[A] + KB[B])

RT

[AR] = KA[A]RT

(1+ KA[A] + KB[B])

[AR] RT

KA[A]

(1+ KA[A] + KB[B])=

[AR] RT

KA[A]RT

(1+ KA[A] + KB[B])=

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

0.5 IC50

Se KA e KB sono uguali:KA = 1 + KB[B]*IC50

KA = 1IC50 - D*

Esempio di binding (II)

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

0.001 0.01 0.1 1 10 100

Legame specifico: 3500 - 500 = 3000

N.S.

Legame a 0.1 nM di radioattivo

D* = 0. 1 nMIC50 = 0.2 nM

KA = 1IC50 - D*DR

RT[D*]KA

[*D]KA + 1=

Una delle prime formule che abbiamo visto!! Possiamo usare questa formula perché Ka = Kb

10 253430 2525

100 2378300 1734600 1111

1000 6873000 154

10000 101

Proviamo

L’NAADP e’ un possibile secondo messaggero. Per dimostrare che possiede recettori specifici intracellulari, e’ stato sintetizzato [32P]NAADP ad una attivita’ specifica di 800 Ci/mmol. Ilbinding e’ stato fatto con concentrazione fissa di [32P]NAADP (50 pM),100 µg di proteina e concentrazioni crescenti di NAADP.

[NAADP]pM

DPM

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

2800

10 100 1000 10000

Series1

IC50 = (2500-100)/2 = 1200 quindi 500 pM Kd = 500 - 50 = 450 pM Ka = 2.222.222.222

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

2800

10 100 1000 10000

Series1

Legame specifico = 2500 - 100 = 2400 DRRT

[D*]KA

[*D]KA + 1=

2400RT

(50*10-12)*2.2*109

+ 1=(50*10-12)*2.2*109

= 24000 dpm

In laboratorio vi viene chiesto, dietro compenso, di provare duenuovi composti per valutarne l’affinita’ sui recettori muscarinici.Utilizzate 5 nM carbacolo radioattivo (attivita’ specifica 2 Ci/mmol)

[nM] carbacolo Farmaco A Farmaco B2450 2450 2450

0.1 2450 2400 24340.3 2415 2300 2432

1 2345 1925 2420

3 2170 1467 2410

10 1750 1240 2400

30 1190 1200 2300

100 700 1190 2012

300 490 1178 1754

1000 385 1180 1626

10000 350 1176 1624

Che affinita’ hanno i due composti nel vostro preparato? In un ultimo esperimento provate A + B (entrambi 10 µM) e misurate 350 DPM legati.Cosa ne potete dedurre? Che altri esperimenti potete disegnare per caratterizzare i due composti?

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

0.01 0.1 1 10 100 1000 10000

IC50 = 20 nMIC50 = 1.5 nMIC50 = 100 nM

KA = 1IC50 - D*

KA = 1 + KB[B]*IC50

e la Bmax???????

DRRT

[D*]KA

[*D]KA + 1=

DR = 2450D* = 5 nMKA = 66666667 M-1

Competizione su due siti (cosa potrebbe succedere)

Saturazione su due siti

DRD

DR

Per studiare il recettore per la somatostatina (sst), si possono utilizzare cellule neuronali. Calcolatel’affinita’ (Kd) ed il numero di siti presenti (per mg di proteina) dall’esperimento riportato in cui s ie’ utilizzata una con centrazione di 10 pM di somatostatina 28 r adioattiva (attivita’ specifica di 80Ci/mmol) e s i sono utilizzate concentrazioni crescenti di s omatostatina non-radioattiva. In natura,esiste anche un prodotto di degradazione, la s omatostatina-14, che po ssiede attivita’ biologica.Quindi, lo stesso esperimento e’ stato effettuato con c oncentrazioni crescenti di somatostatina 14.Che a ffinita’ hanno i due peptidi per il recettore? Cosa potete ipotizzare dai vos tri risultati? Ognipunto sperimentale contiene 50 µg di proteina. Quanti recettori sono presenti?

Concentrazione disomatostatina 28 osomatostatina 14

(pM)

Contenell’esperimento con

somatostatina 28(dpm)

Contenell’esperimento con

somatostatina 14(dpm)

10 3281 340020 3091 323130 2423 310060 1444 2434

100 893 1500300 200 1234

1000 131 1189(3) Nel liquido cefalorachidiano di un paziente affetto da neuroblastoma si e’ riscontrata unaconcentrazione di 12 pM di somatostatina 28. Che percentuale dei recettori sst ci si puo’ aspettareche sia occupata a questa concentrazione?

(1) Nel presente studio si vuole valutare l’affinita’ di una nuova molecola endogena(A16) sul recettore metabotropico per il glutammato. Per fare questo si sono utilizzatecellule che esprimono questo recettore. Il glutammato e’ stato utilizzato come ligandoradioattivo (100 Ci/mmol). I risultati sono esposti nella seguente tabella. Il glutammato e’stato utilizzato ad una concentrazione di 2 nM e si e’ fatto l’esperimento conconcentrazioni crescenti di glutammato non radioattivo o A16 per compararazione.Che affinita’ ha il glutammato per il recettore? Quanti recettori sono presenti per cellulase per ogni punto sperimentale sono state utilizzate 10,000 cellule?

Concentrazione di farmaconon radioattivo (ACPD o

A16); nM

Conte nell’esperimento conl’ACPD non radioattivo

Conte nell’esperimento conl’A16

0 1520 15342 1490 15423 1340 15246 1000 1512

10 746 134030 312 987

100 200 712300 200 341

1000 202 199

(2) Per valutare la possibile che questo composto sia un vero messaggero si sono valutatii livelli endogeni prima e dopo stimolazione elettrica. Sono stati ottenuti i seguentirisultati:[A15] nella sinapsi prima di stimolare: 20 pM[A15] nella sinapsi dopo stimolazione: 45 pMCosa ne deducete? Che % di recettori saranno occupati?

Nome:

Il glutammato si puo’ legare a vari recettori. Per valutare l’affinita’ del glutammato per irecettori presenti nel midollo spinale, concentrazioni crescenti di [3H]glutammato sonostate utilizzate. Ciascun punto sperimentale era rappresentato da 50 µg di proteine.L’attivita’ specifica del 3H[glutammato] era di 1 Ci/mmol e il legame non-specifico e’stato calcolato utilizzando 100 µM glutammato non-radioattivo o 100 µM di AMPA nonradioattivo.

glutammato AMPA[3H]glutammato nM assenza presenza assenza presenza

3 218 20 218 128

10 592 49 592 345

30 1231 99 1231 716

60 1724 201 1724 1032

100 2179 364 2179 1354

Che affinita’ e che numero di siti sono presenti in questi esperimenti?

Kd =

Bmax =

Che spiegazione potreste dare per i vostri esperimenti?

Che % di recettori nel midollo sono recettori AMPA?

A che concentrazione di glutammato ci si potrebbe aspettare che il 75% dei recettori delmidollo siano occupati?