Purification de protéines - stratégies
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Propriétés des protéines et stratégie de purification
• Instabilité à la température• Stabilité au pH• Stabilité au solvants organiques• Nécessité d’utiliser des détergents• Sel (force ionique)• Co-facteur et stabilité d’activité• Sensibilité aux protéases• Sensibilité aux métaux• Activité redox• Poids moléculaire• Charge• Affinité biospécifiques• Modifications post-traductionelles• Hydrophobicité
Purification de protéines - stratégies
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Définir la pureté nécessaire
99% Utilisation thérapeutique, études in vivo
95-99% Cristallographie, caractérisationphysico-chimiques
< 95 % Antigène pour production d’anticorps, séquençage d’Edman
Minimiser les étapes de purification
Pure
téFinitionHaute pureté
Purif. Interm.Enlever les impuretés
CaptureIsoler, concentreret stabiliser
PréparationExtraction, clarification
Étapes
Purification de protéines - stratégies
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Étapes de purification
Amersham BiosciencesProtein PurificationHandbook18-1132-29
Echange d’ion
Interaction hydrophobique
Affinite
Exclusion
Phaseinverse
Chromatographie par échange d’ions
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Principe de séparation
Concentration de proteines de charge opposee
Gradient de force ionique et déplacementde protéine faiblement associée à la résine
Elution progressive des protéines avec l’augmentation du gradient de force ionique
Chromatographie par échange d’ions
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Types de résines
Résine Groupes fonctionnels pH oper.________________________________________________________
Anion
Diethylaminoethyl -O-CH2-CH2-N+H(CH2-CH3)2 3-8
Amino ethyl quaternaire -O-CH2-CH2-N+H(C2H5)2–CH2-CHOH-CH3 3-11
Ammonium quaternaire -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-N+(CH3)3 3-11
Cation
Carboxymethyl -O-CH2-COO- 5-11
Methyl sulfonate -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CHOH-CH2-SO3- 4-11
Sulfopropyl -O-CH2-CHOH-CH2-O-CH2-CH2-CH2SO3- 4-11
Chromatographie par échange d’ions
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Sélection selon le pI de la protéineChar
ge
net
te
pI
102 4 6 8
Gamme de stabilité
Courbe de titration théorique
Chromatographie par échange d’ions
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Sélection du pH et ordre d’élution
pH acide inférieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeusede cation
pH basique supérieuraux pI des protéines, interactions préférentielles avec résine échangeused’anion.
pH moins basique. Uneprotéine positivementchargée (rouge) interagitavec la résine cationiqueet peut être séparée des autres. Alternativementles autres protéinespeuvent etre séparéesavec une résine anionique, alors que la protéine en rouge n’est pas retenue.
pH moins acide. Uneprotéine negativementchargée(bleu) interagitavec la résine anionique et peut être séparée des autres. Alternativement les autres protéines peuventetre séparées avec unerésine anionique, alors quela protéine en bleu n’estpas retenue. résine échangeuse d’anion
résine échangeuse de cation
Chromatographie par échange d’ions
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Force ionique et facteur de capacité
Ln(k
’)
1/√I
lysosyme α-chymotrypsinogen
Cytochrome C
ou: Ap: Aire du polyelectrolyteσp: Densité de chargeF : Constante de Faradayε0: Cst. Permittivitéεr: Cst dielectrique de la phase mobileI : Force ioniqueΦ: Rapport volume occupé par phase
stationnaire et mobile: Vs/Vm
Anal. Chem, 63, 1867 (1991)
Chromatographie par échange d’ions
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Sélectivité et élution
Gradient linéaire
Elution par plateau
Chromatographie par échange d’ions
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Diamètre des particules et résolution
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Chromatographie par échange d’ions
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Caractéristiques des résines
Chromatographie par échange d’ions
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Tampons
Purifying proteins for proteomicsR.J. Simpson, p. 127
Chromatographie par échange d’ions
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Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Anion (faible)
Anion (fort)
Anion (fort)
Anion (faible)
Chromatographie par échange d’ions
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Exemples de séparation
Amersham BiosciencesIon Exchange Chromatography& ChromatofocusingPrinciples and Methods11-0004-21
Résine échangeuse de cation
Chromatographie par échange d’ions
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Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Phase stationnaire : pores de taille contrôléeGels (agarose, dextrane, polyacrylamide)Supports rigides (silice poreuse)
Phase mobileSolubilise l’échantillonGonfle le gelCompatible avec le système de détectionIsocratiqueEx : TRIS, phosphate, NaCl, et detergent neutre
Séparationbasée sur la taille des molécules, et donc leur aptitude à pénétrer dans le réseau de pores
Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Gel, structure et porosité
Harris, 6e Ed. p. 652Structure de polyacrylamide
Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Coefficient de distribution et masse moléculaire
ViV0
Vm
VR = V0 + KD Vi KD = VR – V0Vm – V0
Volume mort, V0 est determiné en utilisant le dextran blue 2000 (Mr = 2 x 106 Da). Vmcorrespond au volume de la phase mobile et est la somme du volume mort et du volume interne Vi.
Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Exemple de séparation
L’ordre d’élution est inversementproportionel à la masse moléculaire.
Utilité pour l’observation et le contrôledu repliement et de l’aggrégation de protéines. Frequemment utilisée pour désaler les protéines par exempleaprès digestion ou modification chimique.
Harris, 6e Ed. p. 653
Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Gamme de linéarite
Diamètre des pores de la phase stationnaire de polystyrene
Harris, 6e Ed. p. 653
Pour chaque phase stationnaire il existe un domaine ou le log Mr et le volume d’élution est linéaire. La gamme de masse augmente avec la dimension des pores (Ex: G2000SW, pore 13 nm, separation: 0.5-60 kDa et G5000SW, pore 100 nm, separation > 1.5 MDa)
Chromatographie d’exclusion moléculaire
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Tampons volatils recommandés
pH Tampons Contre-ion pK-pour tampon
2.0 Formic acid H+ 3.75
2.3-3.5 Pyridine/formic acid HCOO- 3.75; 5.25
3.0-5.0 Trimethylamine/formic acid HCOO- 3.75; 9.25
3.0-6.0 Pyridine/acetic acid CH3COO- 4.76; 5.25
4.0-6.0 Trimethylamine/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25
6.8-8.8 Trimethylamine/HCI CI- 9.25
7.0-8.5 Ammonia/formic acid HCOO- 3.75; 9.25
8.5-10.0 Ammonia/acetic acid CH3COO- 4.76; 9.25
7.0-12.0 Trimethylamine/carbonate CO32- 6.50; 9.25
7.9 Ammonium bicarbonate HCO3- 6.50; 9.25
8.0-9.5 Ammonium carbonate/ammonia CO3
2- 6.50; 9.25
8.5-10.5 Ethanolamine/HCI CI- 10.0
8.5 Ammonium carbonate CO32- 6.50; 9.25