QUITOSANA SULFATADA: CARACTERIZAÇÃO E ESTUDO DA PROPRIEDADE ANTITROMBOGÊNICA
A.F.Moraes1, R.N.F.M. Filho1, A.P. Cunha 1, C.C.2Oliveira, L.K.A.M. Leal 2, R.S.Vieira1.
1Grupo de Pesquisa em Separação por Adsorção-UFC 2Centro de Estudos Farmacêuticos e Cosméticos - UFC Universidade Federal do Ceará, Departamento de Engenharia Química, Campus do Pici-Bloco 709, CEP – 60455-760, Fortaleza – Ceará, Brasil. [email protected] RESUMO Dispositivos médicos de contato com o sangue muitas vezes induzem a formação de trombos ao longo do tempo de implante levando pacientes ao óbito. Com isso, este estudo objetivou desenvolver filmes de quitosana sulfatada com propriedade antitrombogênica para aplicações biomédicas. As caracterizações da quitosana sulfatada através da análise elementar, FTIR-ATR, RMN13C e viscosimetria evidenciaram a introdução de grupos sulfatos na cadeia de quitosana, apresentando GS de 1.37 e uma quitosana parcialmente 2,N-3,6,O-sulfatada com massa molar de 5.050 g/mol. Para estudar a hemocompatibilidade dos filmes realizou-se o ensaio de adsorção de proteínas, adesão plaquetária e atividade anticoagulante. Os resultados mostraram que a quitosana sulfatada foi capaz de reduzir a adsorção de BSA (36,84%) e fibrinogênio (20%) e principalmente a adesão plaquetária (93.7%), mostrando ainda atividade anticoagulante na fase intrínseca (72.15s, 200μg/mL) em relação a QN (26.57s, 200μg/mL). Estes resultados indicaram características antitrombogênica promissoras para dispositivos de contato com o sangue. Palavra chave: Quitosana sulfatada, adsorção de proteínas, adesão plaquetária, atividade anticoagulante. 1. INTRODUÇÃO
Estudos em diversas áreas buscam estratégias para melhorar a
biocompatibilidade de dispositivos médicos de contato com o sangue, uma vez que
ao longo do tempo de uso do implante, podem ocasionar falhas clínicas, como é o
caso de reestenose e formação de trombos. Uma das estratégias para melhorar a
hemocompatibilidade da superfície desses materiais é o revestimento da superfície
com polímeros que apresentem propriedades hemocompatíveis (1).
Estudos na área biomédica tem-se voltado para a quitosana devido apresentar
propriedades favoráveis para biomateriais, como biocompatibilidade,
biodegradabilidade, atoxicidade e atividade antimicrobiana (3, 4, 5). A quitosana é um
derivado N-desacetilado parcial ou total da quitina, um polímero natural encontrado
principalmente na carapaça de crustáceos. Este polímero é linear e composto de
unidades N-acetil-2-amino-2-desoxi-D-glicopiranose e 2-amino-2-desoxi-D-
glicopiranose ligados por uma ligação (1,4)-β-glicosídica (6).
Embora esse polímero apresente propriedade trombogênica quando em
contato com o sangue (7), possui em sua cadeia grupos amino (NH2) e hidroxilas
(OH) altamente reativos, o que facilita sua modificação química para as mais
diversas aplicações, sem alterar o seu esqueleto fundamental. A introdução de
grupos sulfato (SO42-) na cadeia de quitosana pode reduzir a sua propriedade
trombogênica(8), uma vez que essa modificação a torna com carga superficial
negativa, o que causa a repulsão eletrostática de proteínas do sangue carregadas
negativamente, possuindo ainda estrutura muito similar a um anticoagulante natural
do sangue, a heparina, demonstrando mecanismo biomolecular de atividade
anticoagulante, antiviral e com baixa toxicidade(4, 9).
Com isso, este trabalho objetivou desenvolver filmes de quitosana sulfatada
com propriedade antitrombogênica e com potencial para aplicações biomédicas.
2. MATERIAIS E MÉTODOS
Foram utilizados quitosana, Fibrinogen from bovine plasma, Bovine serum
albumin e phosphate buffered saline (PBS) obtidos da Sigma-Aldrich (EUA). Ácido
clorossulfônico (HClSO3) foi obtido da Merck. Hidróxido de sódio e metanol foram
obtidos da Labsynth. N.N-Dimetilformamida (DMF) e Glutaraldeído foram obtidos da
VETEC Química Fina (Brasil). Todos os outros reagentes utilizados foram de grau
analítico. A membrana de diálise foi obtida da INLAB possuindo Cut-off de peso
molar de 12.000-16.000 g/mol e porosidade de 25 Angstrons.
2.1 Preparação dos filmes de quitosana natural (QN)
Uma solução 2% (p/v) de quitosana natural em 10% (v/v) de ácido acético foi
preparada e conduzida à agitação mecânica por 24 h. Com a solução pronta,
dispersou-se 18 g em placa de Petri de 10 cm de diâmetro e em seguida conduziu-
se à estufa a 60ºC/5 horas ou até que a massa permanecesse constante. Em
seguida, o filme foi imerso em solução de NaOH 2M por 24h. Após isso, o filme foi
lavado exaustivamente até que a água de lavagem atingisse pH neutro e conduzido
ao dessecador a vácuo para secagem.
2.2 Preparação dos filmes de quitosana sulfatada (QS6) O procedimento para sulfatação da quitosana foi realizado segundo
metodologia proposta por Carreónet al.(10), com algumas modificações. Uma solução
de quitosana natural foi preparada de acordo como descrito anteriormente e
precipitada com NaOH 2M. Em seguida, o gel foi lavado com água MiliQ até atingir
pH neutro. Após, iniciou-se uma série de trocas de solventes (metanol e DMF) em
concentrações de: 20, 40, 60, 80 e 100% em intervalos de 30 minutos cada. Um
complexo sulfatante foi preparado utilizando ácido clorossulfônico e DMF (6:60).
Após, adicionou-se o gel de quitosana impregnado com DMF ao complexo sulfatante
e a mistura foi aquecida entre 35-40ºC/ 5 h. Depois disso, a solução foi reagida com
NaOH 10M até atingir pH 12. Os sólidos foram filtrados, lavados com metanol e
secos a temperatura ambiente. O sólido seco foi disperso em água destilada e
conduzido à diálise contra água destilada por 48h, com duas trocas de água por dia.
Finalmente, a solução foi concentrada e conduzida à liofilização para obter o pó de
quitosana sulfatada (QS6). Uma solução 2% (p/v) de quitosana sulfatada foi
preparada e dispersa em placas de poliestireno e conduzidas à estufa a 50ºC para
secagem, obtendo então os filmes de quitosana sulfatada.
2.2.1 Reticulação
Devido à solubilidade do filme sulfatado em solução PBS nos ensaios de
adsorção de proteínas e adesão plaquetária, realizou-se uma reticulação do filme de
quitosana sulfatada com glutaraldeído a 2,5% para melhorar sua estabilidade em
solução.
2.3 Caracterização dos filmes
A análise elementar dos filmes de quitosana natural e sulfatada foi realizada
utilizando Analizador Elemental LECO CHNS 932. O grau de substituição (GS) foi
calculado de acordo com Zhang, K. et al.(11), a partir dos resultados obtidos na
análise elementar: GS= (%S/32)/(%N/14). Para confirmação da introdução de
sulfatos na cadeia de quitosana, foi realizado espectroscopia de infravermelho com
Transformada de Fourier com modo de Reflectância Total Atenuada (FTIR/ATR) em
Equipamento espectrofotométrico de marca VERTEX 70 utilizando acessório Golden
Gate Single Reflection Diamond ATR System na região entre 500-4000 cm-1 e
resolução de 4 cm-1.
Ressonância magnética de carbono (RMN13C) e ressonância magnética de
próton (RMN1H) foram feitos utilizando-se de equipamento Agilent DD2 de 600 MHz
equipado com uma sonda OneProbe de 5 mm de diâmetro interno (1H-19F/15N-31P)
de detecção inversa e gradiente de campo no eixo “z“, a uma temperatura de 90°C.
O padrão interno utilizado foi o propionato de tetrametilsilil (TMSP-d4) em 0ppm. A
amostra de quitosana foi preparada dissolvendo 10 mg em solução 1% (p/v) de
HCl/D2O. Já a quitosana sulfatada foi dissolvida 10 mg em 1 mL de D2O. As
soluções foram agitadas durante 24 h para completa homogeneização e filtradas
para retirada de interferentes.
A massa molecular foi determinada por viscosimetria utilizando-se de
viscosímetro SCOTT CT 52 sob banho termostático a 25ºC ± 0,1 °C, capilar Cannon
Fenske (ø = 1.26 mm) e uma solução tampão de ácido acético e acetato de sódio
(pH~4.5). A viscosidade intrínseca foi obtida utilizando-se da equação de
Staudinger-Mark-Houwink: [] = K Mva, onde K e a são constantes específicas dos
solventes utilizados, e foram adotados valores proposto por Rinaudo, Milas &
Dung(12): K = 0,074 e a = 0,76.
Para verificar a morfologia das superfícies, foi utilizado um microscópio
eletrônico de varredura Quanta-FEG FEI. Já para estudar a cristalinidade das
amostras foi utilizando Difratômetro de Raio-X marca Bruker, modelo D8 Advance
Davinci em ângulo 2θ com alcance entre 5-60º, velocidade de leitura de 1º/min e
radiação CuKα, λ= 0,1542, 40 kV, 40 mA.
2.4 Estudos antitrombogênicos 2.4.1 Adsorção de proteínas
Filmes de quitosana sulfatada reticulada e quitosana natural com área de 1 cm2
foram imersos em solução PBS pH 7.4 a 37ºC/ 1h. O PBS foi subtraído e 3mL de
cada uma das soluções BSA e fibrinogênio (1,0 mg/mL) foi adicionada e incubada a
37ºC/ 2h com agitação suave. As absorbâncias das soluções de fibrinogênio e BSA
foram medidas utilizando um espectrofotômetro Biomate 3S em um comprimento de
onda de 280 nm e a quantidade de proteína adsorvida nos filmes foi estimada
através da seguinte fórmula: Q = [(C0-CF) V]/A. Onde, C0 e CF são as concentrações
das soluções de proteínas antes e depois da adsorção, respectivamente. V é o
volume total da solução (mL) e A é a área do filme utilizado (cm2).
2.4.2 Ensaio de Adesão Plaquetária
O procedimento utilizado foi conforme o utilizado por Xue et al.(13), com
algumas modificações. Sangue coletado de voluntários saudáveis em tubos
Vacutainer® de 4,5 mL, contendo como agente anticoagulante uma solução de
citrato de sódio 0,105 M/ 3,2%, foi centrifugado a 1000 rpm por 15 min a 25ºC para
obter Plasma Rico em Plaquetas (PRP). Os filmes foram equilibrados a 37ºC/ 1h.
Após, o PBS foi subtraído e adicionado 2mL de PRP para cada amostra seguido de
incubação a 37ºC/1h em banho termostático com agitação suave. O PRP foi
removido e as amostras foram lavadas com PBS a pH 7.4 pelo menos três vezes. A
fixação das plaquetas foi realizada com uma solução de glutaraldeído 2,5%
(glutaraldeído/PBS) durante 24h sob refrigeração. Ao final, as amostras foram
lavadas com PBS e submetidas a um processo de secagem com uma série de
trocas graduais de acetona/PBS (30, 50, 70, 80, 90, 95 e 100% v/v) com intervalos
de 30 minutos cada. O ponto crítico de secagem foi realizado com
Hexametildisilazano (HMDS). Os filmes secos foram cobertos por uma fina camada
de ouro (20 nm) usando um sistema de revestimento de alto vácuo marca Quorum
Q1SOT ES e observados em um microscópio eletrônico de varredura Quanta-FEG
FEI.
2.4.3 Atividade anticoagulante
As amostras foram preparadas em solução 1% NaCl/ácido acético (v/v) na
concentração de 50, 100 e 200 µg/Ml e neutralizada com NaOH 2 M. O veículo
utilizado foi o mesmo solvente das amostras. Para realização dos testes, foi utilizado
um “pool” de plasma humano citratado (0,9%) obtido a partir da centrifugação do
sangue total a 3000 rpm/ 15 min. Como controle dos testes foi utilizada a heparina a
0,5UI/mL.
Para determinação do Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPa), o
plasma foi incubado a 37 °C/ 10 min com QN (50, 100 e 200 µg/mL), QS (50, 100 e
200 µg/mL) ou Veículo (NaCl) . Em seguida, uma alíquota de 50 µL do reagente
cefalina ativada foi adicionada e os tubos foram incubados por mais 3 min. A reação
foi iniciada pela adição de 50 µL de cloreto de cálcio 0,25 M e o tempo de
coagulação, em segundos foi registrado em coagulômetro.
Para determinação do Tempo de Protrombina (TP), o plasma foi incubado a
37 °C /10 min com QN (50, 100 e 200 µg/mL), QS (50, 100 e 200 µg/mL) ou veículo
(NaCl). Em seguida foi adicionado o reagente (tromboplastina, 100 µL) disparando a
cascata de coagulação através do complexo protrombínico e o tempo em segundos
foi aferido em um coagulômetro.
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Caracterização
TABELA 1- Análise Elementar dos filmes de QN e QS6. GS: Grau de substituição.
3.1.1 Análise Elementar
Através dos resultados mostrados na TABELA 1, pode-se sugerir que houve a
modificação química da quitosana, uma vez que o enxofre apresentou-se em 12.9%
na amostra, indicando um grau de substituição por unidade monossacarídica de 1.4.
3.1.2 Espectroscopia no Infravermelho (FTIR-ATR)
Os resultados podem ser observados na Figura 1. Os espectros de
infravermelho obtidos para os filmes de QN e os filmes de QS podem confirmar a
introdução de grupos sulfatos na cadeia de quitosana, uma vez que houve o
aparecimento de novos picos referentes às vibrações das bandas referentes ao
grupo sulfato (R-SO42-) em 1206 cm-1 (S=O) e a vibração referente ao estiramento C-
O-S em 794 cm-1, indicando o sucesso da modificação nesse filme.
3.1.3 Ressonância Magnética Nuclear (RMN)
Os resultados da RMN13C mostraram que a reação de sulfatação realizada
neste estudo resultou em uma quitosana parcialmente 2,N-3,6,O-sulfatada (FIGURA
2). Os deslocamentos químicos do 13C em ppm estão apresentados na tabela 2. A
substituição no grupo amino se torna requerida quando se quer obter uma
propriedade anticoagulante do polímero, uma vez que o grupo amino reativo da
quitosana é bloqueado, gerando carga negativa com o novo grupo funcional, o que
aumenta a repulsão eletrostática entre proteínas do plasma reduzindo a adsorção na
superfície do material e consequente formação de trombos.
Amostras % C % H % N % S GS
QN 38,5 7,4 7,1 0,1 - QS6 21,6 4,5 4,1 12,9 1,4
A B
O grau de desacetilação (GD) é uma propriedade importante a ser determinada
no estudo de polímeros biomédicos, uma vez que este implica nas características
físicas, químicas e biológicas do material, o que vai diferenciar sua aplicação dentro
da área biomédica(17). O GD obtido para a QN e QS6 foi de 77% e 58%,
respectivamente.
3.1.4 Determinação da Massa Molecular por viscosimetria De acordo com os resultados obtidos pela viscosimetria, a quitosana natural
trabalhada neste estudo e utilizada para a sulfatação foi de baixa massa molecular
(MM), com 78.093 Da, assim como seu derivado sulfatado, com 5.050 Da. Essa MM
encontrada foi bem próxima a da heparina (5.000 a 70.000Da).
3.1.5 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Através das micrografias obtidas por MEV (FIGURA 3), observou-se superfícies
lisas e sem porosidades para os filmes analisados. Características essas
QUITOSANA QS6
C1 99-100 105
C2 58,4 59,2-59,3
C2-S - 57,9
C3 77-77,7 76-76,4
C3-S - 83,7
C4 79,8 81,3-81,9
C5 72,7 76,7
C6 62,5-63,3 69,4
C6-S - 69,8
TABELA 2 – Deslocamentos químicos do 13C para QN e QS6 em ppm.
FIGURA 2 – RMN13C da QN (A) e QS6 (B).
importantes de superfícies voltadas para uso de contato com o sangue, uma vez que
evita a formação de trombos no local.
3.1.6 Difração de Raio-X (DRX)
A QN mostrou picos semicristalinos em 10° e 20° em 2Ɵ, característicos para
este polímero de acordo com a literatura(13). Já para a quitosana sulfatada, essas
reflecções desapareceram (FIGURA 4), mostrando-se como uma forma amorfa.
Essa modificação sugere uma redução na sua capacidade de formar ligações de
hidrogênio intermoleculares devido a substituição do grupo sulfato nos grupos –OH
e/ou –NH2 da quitosana.
3.2 Estudos antitrombogênicos
3.2.1 Adsorção de proteínas
Observou-se uma redução de 36,84% e 20% da quantidade adsorvida de BSA
e fibrinogênio, respectivamente, para as superfícies modificadas quando
comparadas com a superfície não modificada (GRÁFICO 1). Essa redução pode ser
explicada pela repulsão eletrostática ocorrida entre essas proteínas e a superfície do
QN QS
FIGURA 4 – Difratogramas de QN (a) e QS6 (b)
FIGURA 3 – Micrografias em MEV da QN e QS.
a
b 0 10 20 30 40 50
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Inte
nsi
da
de
ângulo de difraçao
Gráfico 1 – Adsorção de BSA e Fibrinogênio em QN e QS6 reticulada.
filme de QS, uma vez que em pH 7.4, ambas as proteínas assumem cargas
negativas. Além da carga negativa apresentada pela QS, a hidrofilicidade foi outra
característica importante para a redução da adsorção de BSA e Fibrinogênio,
causada também pela inserção de grupos sulfatos (hidrofílicos) à cadeia polimérica.
3.2.2 Adesão plaquetária
Através das microimagens obtidas por MEV (FIGURA 6), pode-se observar
uma redução da quantidade de plaquetas aderidas na superfície sulfatada quando
comparada com a superfície de quitosana natural. Essa redução pode ser atribuída
a redução da adsorção de fibrinogênio na superfície, assim como a sua
hidrofilicidade.
A contagem de plaquetas aderidas foi estimada utilizando-se a área das
imagens e com a ajuda do programa ImageJ. A partir das imagens do MEV com
área 2799,81μm2, foi feito uma média do número de plaquetas em cinco áreas
diferentes de cada filme. A partir desta área, foi encontrado para a QN um número
de plaquetas de 3,49 x 10-2 ± 28,61/ μm2, enquanto que para o filme de QS6
reticulado foi encontrado 0,22 x 10-2 ± 1,48/ μm2 (GRÁFICO 2), indicando uma
redução de 93,7% do número de plaquetas aderidas na superfície sulfatada, quando
comparado a superfície de QN.
A B C
FIGURA 6 – MEV de plaquetas aderidas nos filmes de QN (A) e QS6 reticulada (B) e contagem de plaquetas (C).
3.2.3 Atividade anticoagulante
Para o TTPa (FIGURA 7), a QN não apresentou atividade anticoagulante em
relação ao grupo controle. Já a QS apresentou atividade anticoagulante significativa
em 38.84s, 53.58s e 72.15s em relação ao controle (27.00s). No caso do TP
(FIGURA 7), observou-se que não houve diferença significativa entre as
concentrações de QS testadas (15.00s, 15.76s e 15.70s) em relação ao controle
(14.9s). Tanto a quitosana sulfatada quanto a heparina, assim como outros
polissacarídeos sulfatados, não tem forte influência nesta fase da coagulação (19).
Desta forma, a quitosana sulfatada mostrou maior efeito na fase intrínseca da
coagulação e nenhum efeito significativo na fase extrínseca nas concentrações
testadas (50,100 e 200 µg/mL). No entanto, quando comparada a quitosana natural,
a atividade anticoagulante foi melhorada.
4. CONCLUSÃO
FIGURA 7 – Tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e tempo de
Protrombina (TP) da QN e QS6.
Os resultados de caracterização e de estudos antitrombogênicos estudados
neste trabalho indicaram que o filme de quitosana sulfatada encontrou-se com
características e potencial antitrombogênico favoráveis a aplicação em dispositivos
médicos de contato com o sangue.
AGRADECIMENTOS À Central Analítica da UFC, Embrapa, CEFAC, Universidade de Málaga e CETENE. REFERÊNCIAS
(1) BALAN, V.; VERESTIUC, L. Strategies to improve chitosan hemocompatibility: A
review. European Polymer Journal, v. 53, p. 171–188, 2014.
(3) BENABBOU, R. et al. Inhibition of Listeria monocytogenes by a combination of
chitosan and divergicin M35. Canadian Journal of Microbiology, v.55, p. 347-355,
2009.
(4) CHANG, S.H.; HUANG, J.-J. Biodegradability and anticoagulant properties of
chitosan and sulfonated chitosan films coated on TiNi alloys. Surface and Coatings
Technology, v.206, n. 23, p. 4959-4963, 2012.
(5) MAHANTA, A.K. et al. Polyurethane-Grafted Chitosan as New Biomaterials for
Controlled Drug Delivery. Macromolecules, v.48, p. 2654−2666, 2015.
(6) VAKILI, M. et al.Application of chitosan and its derivatives as adsorbents for dye removal from water and wastewater: A review.Carbohydrate Polymers, v. 113, p. 115–130, 2014.
(7) WANG, X. et al. Improvement in hemocompatibility of chitosan/soy protein composite membranes by heparinization. Bio-Medical Materials and Engineering, v. 22, p. 143–150, 2012. (8) SHELMA, R., SHARMA, C.P. Development of lauroyl sulfated chitosan for
enhancing hemocompatibility of chitosan.Colloids and Surfaces B: Biointerfaces,
v. 84, p. 561–570, 2011.
(9) LIMA, P.H.L. et al. Blood protein adsorption on sulfonated chitosan and κ-
carrageenan films. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, v. 111, p.719–725,
2013.
(10) CARREÓN, J. et al. Mercury recovery from aqueous solutions by polymer-enhanced ultrafiltration using a sulfate derivative of chitosan. Membrane Water Treatment, v. 1, n. 4, p. 231-251, 2010.
(11) ZHANG, K. et. al. NMR and FT Raman characterisation of regioselectively
sulfated chitosan regarding the distribution of sulfate groups and the degree of
substitution. Polymer, v. 51, p. 4698-4705, 2010.
(12) RINAUDO, M. MILAS, M.; DUNG, P.L. Characterization of chitosan. Influence of
ionic strength and degree of acetylation on chain expansion. International Journal
of Biological Macromolecules, v. 15, 1993.
(13) XUE, J. et al.Blood compatibility of polyethersulfone membrane by blending a sulfated derivative of chitosan. Carbohydrate Polymers, v.95, p. 64–71, 2013. (17) GONSALVES, A.A. et al. Diferentes estratégias para a reticulação de quitosana. Química Nova,v. 34, n. 7, p. 1215-1223, 2011. (19) YANG, J. et al. Preparation, characterization and in vitro anticoagulant activity of highly sulfated chitosan. International Journal of Biological Macromolecules, v. 52, p.25–31, 2013.
SULFATED CHITOSAN: CHARACTERIZATION AND ANTITROMBOGENIC PROPERTY STUDY
ABSTRACT Devices designed to be used in contact with blood can induce thrombus formation during a long time of implant, what can leading the patient to death. Thus, this study aimed to develop chitosan sulfated surfaces with antithrombogenic property for biomedical applications. The sulfated chitosan characterization by elemental analysis, FTIR-ATR, RMN13C and viscosimetry showed the introduction of sulfur groups into the chitosan chain, presenting GS of 1.37 and a partially sulfated 2,N-3,6,O-chitosan with molecular mass of 5.050 Da. For hemocompatibility characterization it was performed the adsorption protein, platelet adhesion and anticoagulant activity assay. The results showed that sulfated chitosan reduced the BSA (36,84%) and fibrinogen (20%) adsorption and main the platelet adhesion (93.7%), presenting an anticoagulant activity in the intrinsic pathway (72.15s, 200μg/mL) in relation to the natural chitosan (26.57s, 200μg/mL). These results indicated antitrombogenic characteristics promising to medical devices in contact with blood.
Key-words: Sulfated chitosan, protein adsorption, platelet adhesion, anticoagulant activity.