Download pdf - Rakutsükli kontroll

Transcript
Page 1: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli kontrollOnkobioloogia

Taavi Päll lektor, Tallinna Tehnikaülikool

Page 2: Rakutsükli kontroll

/

Page 3: Rakutsükli kontroll

Recap

/

Page 4: Rakutsükli kontroll

Tuumor-suppressor geenidTuumor-suppressor geen, või anti-onkogeen, on geen mis hoiab ära raku transformatsiooni.Kui see geen muteerub rakus ja tema funktsioon kaob või väheneb, siis võib see rakk arenedavähiks. Tavaliselt on vaja ka teisi onkogeenseid lisamuutusi (Wikipedia).

/

Page 5: Rakutsükli kontroll

Rakutsükkel

Page 6: Rakutsükli kontroll

http://tpall.github.io/Rakutsyklikontroll

RakutsükkelRakutsükkel on järjestikuste sündmuste jada mille käigus rakk duplitseerib kõik omakoostisosad ja jaguneb kaheks tütarrakuks

Rakutsüklit kontrolliv 'masinavärk' on universaalne kõigis organismi rakutüüpides.

Raku rakutsüklisse sisenemist ja 'masinavärgi käivitamist' reguleerivad raku väliskeskkonnasignaalid

·

·

·

/

Page 7: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli käivitamist reguleerivad rakuvälisedsignaalid

Eksponentsiaalselt kasvav imetajarakk peab peale igat raku jagunemist otsustama,

Seda otsust mõjutavad mitogeensed kasvufaktorid - kui neid on piisavalt siis rakk jätkabjagunemist, vastasel juhul jääb rakk vaikeolekusse

·

kas kasvada ja jaguneda veel üks tsükkel või

jääda vaikeolekusse

-

-

·

/

Page 8: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli käivitamist reguleerivad rakuvälisedsignaalidKeskkonna signaalid, mis rakku jagunema/mittejagunema mõjutavad, pärinevad erinevatestallikatest:

türosiin kinaas retseptorid (mitogeenid)

G-valk retseptorid (GPCR)

toitainestaatus

·

·

·

/

Page 9: Rakutsükli kontroll

Ka rakutsüklist väljumist reguleerivad rakuvälisedsignaalidKa raku vaikeolekuse minek võib olla aktiivselt reguleeritud.

TGF- on üks kesksemaid anti-mitogeene

Vaikeolek on rakkudel enamasti pöörduv

Rakke mis enam ei jagune ja on terminaalselt diferentseerunud nimetatakse post-mitootilisteks, nt. neuronid

· β

·

·

/

Page 10: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli faasidRakutsüklis on neli üksteisele järgnevat faasi:

G1 algab peale mitoosi ja kestab kuni DNAreplikatsiooni alguseni S faasis,

S-faasis toimub genoomse DNA süntees

G2 faas on intervall DNA sünteesi edukalõpu ja mitoosis toimuva kromosoomidelahknemise vahel

M-faas mitoos.

·

rakk kasvab ja valmistub sisenema Sfaasi

-

·

·

suhteliselt lühike

mitoosis vajalike valkude süntees

-

-

·

/

Page 11: Rakutsükli kontroll

M-faasis toimub kromosoomide lahknemine Mitoosi faasid vesiliku kopsurakus

Mitoosi faasid

Profaasis toimub kromosoomidekondenseerumine

Metafaasis joonduvad õdekromatiidid

Anafaasis toimub õdekromatiididelahknemine poolustele

Telofaasis moodustub uuestituumamembraan ja tuum

Tsütokinees: moodustub kaks tütarrakku

·

Moodustub mitoosikääv-

·

·

·

·

Pilt: DOI: 10.1126/science.1082177

/

Page 12: Rakutsükli kontroll

Rakutsükkel liigub ühes suunasTuuma tsükkel on koordineeritud raku kasvu ja pooldumisega

Replikatsioon peab toimuma vaid üks kord rakutsükli jooksul

Replikatsioon peab eelnema kromosoomide lahknemisele

Kromosoomide lahknemine peab omakorda olema toimunud enne tsütokineesi e. rakujagunemist

·

·

·

·

/

Page 13: Rakutsükli kontroll

Rakkude kasv vs jagunemineKui rakk on aktiivses kasvu-jagunemise tsüklis, siis peab see rakk kohe peale mitoosi läbimistvalmistuma uueks jagunemiseks

Selleks peab rakk 'kahekordistama' oma suuruse

Pärmi katsed on näidanud, et raku suurus valitseb rakutsükli üle: väikesed rakud ei jagune

Mutatsioonid mis kiirendavad rakutsükli kulgu põhjustavad väiksemate rakkude tekke.

Rakkude kasv toimub G1 faasis

·

·

·

·

·

Mutation of Tsc1 Increases Cell and Organ Size. Source: DOI: 10.1016/S0092-8674(01)00333-6

/

Page 14: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli kontrollpunktid, checkpoints1. G1-S DNA kahjustuste kontrollpunkt: S-faasi sisenemine on blokeeritud kui genoom on

vigane

2. S-faasi kontroll: replikatsioon aeglustub või seiskub vastusena DNA kahjustustele.

3. G2-M kontroll blokeerib raku mitoosi sisenemise kuni genoomi replikatsioon S-faasis onlõpule viidud

4. eksisteerib veel hilise G2 dekatenatsiooni kontroll mis monitoorib, et kromosoomid ei oleksomavahel 'sõlmes'

5. M faasis kontrollpunkt mis blokeerib sisenemise anafaasi kuni kõik kromosoomid onkorrektselt käävile kinnitunud

/

Page 15: Rakutsükli kontroll

Komosoomi aberratioonid RAD17 flox/−rakkudes. Metafaasi komosoomid:

Rad17: genoomi replitseeritakse ainult üks kordRad17 sensorvalgu fosfrüleerimine ATRi poolt on vajalik DNA-kahjustuste poolt indutseeriudG2-faasi blokiks

Katkenud komosoomid (all vasak, nool).

Endoreduplitseerunud kromosoomid (allparem).

·

·

/

Page 16: Rakutsükli kontroll

ATR replikatsiooni checkSeriin-treoniin kinaas ATR tagab fragiilsetesaitide stabiilsuse

ATR aktiveeritakse vastuseksüheahelalisele DNA-le

Aktiveeritud ATR fosforüleerib CHK1kinaasi ja käivitatakse signaalirada mis viibrakutsükli blokini

·

·

·

/

Page 17: Rakutsükli kontroll

See BUB1-vaigistatud rakk on kaotanudkromosoomid 1 ja 6.

BUB1: käävi kontrollpunktKäävi kontrollpunkt ( , SAC) hoiab ära aneuploidia tekke

Mutatsioonid mitoosikäävi kontrollpunktisvõib põhjustada kromosomaalseebastabiilsuse ja aneuploidsuse, üle 90%tahketest kasvajatest sisaldabkromosomaalseid aberratsioone.

BUB1 funktsiooni eksperimentaalnepärssimine on piisav rakkudesaneuploidse fenotüüpi tekkeks.

·

·

/

Page 18: Rakutsükli kontroll

G1 restriktsioonipunktTagab mitogeense kontrolli rakutsükli kulgemise üle

Varases- ja keskmises G1 faasis on S-faasi sisenemine seerum sõltuv.

Hilises G1 faasis on rakud juba pühendunud S-faasi sisenemisele ja ei sõltu enamrakuvälistest signaalidest

·

Samuti on rakud tundlikud TGF- anti-mitogeensele toimele.- β

·

/

Page 19: Rakutsükli kontroll

Ka rakutsükli masinavärki reguleerivad kinaasidRakutsükli kinaaside (CDK) substraadid:

Tsentrosoomi valke ( ) fosforüleeritakse G1/S üleminekul tsentrosoomiduplitseerumiseks

Enne S-faasi aktiveeritakse replikatsioonikompleks ( )

fosforüleerimine S ja M faasis kromatiini kondenseerumiseks

Tuumamebraani valkude ( ) fosorüleerimine põhjustab tuumamembraani lagunemiseM-faasis

·

·

·

·

/

Page 20: Rakutsükli kontroll

Rakutsükli kinaasid (CDK)CDK on Ser/tre-kinaasid

40% aa järjestusest identsed

CDK aktiveerub seostumisel tsükliiniga

Tsükliinid tagavad ka substraat spetsiifilisuse

·

·

·

tsükliin E + CDK2 kompleksi kinaasne aktiivsus tõuseb 400000 korda-

·

Mechanism of CDK activation revealed by the structure of a cyclinA-CDK2 complex. Jeffrey, P.D., Russo, A.A., Polyak, K., Gibbs, E., Hurwitz, J., Massague, J.,Pavletich, N.P. (1995) Nature 376: 313-320

/

Page 21: Rakutsükli kontroll

TSÜKLIINI

KINAAS

TSÜKLIIN RAKUTSÜKLI FAAS

CDK4/6 D1, D2, D3 varane G1

CDK2 E1, E2 hiline G1, G1/S

üleminek

CDK2 A S

CDC2 (CDK1) A S/G2

CDC2 B M

Iga tsükliin paardub kindla kinaasiga kindlasrakusükli faasis

/

Page 22: Rakutsükli kontroll

Tsükliinide hulk rakus muutub rakutsükli käigusTsükliine kontrollitakse läbi proteolüütilise lagundamise

Tsükliini järkjärguline tõus ja kiire lagundamine tagab rakutsükli 'hammasrataste' liikumiseühes sunas

D-tsükliinid erinevad: nende puhu ei toimu järske kõikumisi rakutsükli käigus

D-tsükliinid on reguleeritud mitogeensete signaalide poolt

·

·

·

·

/

Page 23: Rakutsükli kontroll

Erinevad mitogeensed rajad konvergeeruvad tsükliinD regulatsioonilKasvufaktorid stimuleerivad kiire tsükliin D taseme tõusu rakus, samuti kasvufaktorite 'äravõtmine' koekultuuri tingimustes viib tsükliin D lagundamiseni (poolestuseg ~30 min)

Kasvufaktorite rajad mis kontrollivad tsükliin D ekspressiooni:

GF türosiin kinaas reseptorid Ras Raf/RalGDS Fos/Jun D1

GF HER2/Neu Sp1 D1

Wnt -kateniin Tcf/Lef D1

Tsütokiinid tsütokiini retseptorid Jak STAT D1

Hedgehog Patched Smoothened Gli D1

Erinevad ligandid erinevad retseptorid IKK NF- B D1

· → → → → →

· → →→→ →

· →β → →

· → → → →

· → → → →

· → → → κ →

/

Page 24: Rakutsükli kontroll

Kolme D-tüüpi tsükliini induktsioonimuster erinebSIGNAALI ALLIKAS SIGNAALIRADA D TSÜKLIINI ISOVORM

RANK retseptor NF­ B D1

Prolaktiini retseptor Jak/Stat D1

Östogeeni retseptor AP1 (Fos/Jun) D1

Focal adhesion kinase D1

HER2/Neu E2F ja Sp1 D1

Wnt­Frizzled ­kateniin­Tcf/Lef D1

Bcr/Abl D2

FSH retseptor cAMP D2

erinevad mitogeenid Myc D2

IL­4/7 retseptor D2

IL­5 retseptor STAT3/5 D3

E2F transkriptsiooni faktorid D3

κ

β

/

Page 25: Rakutsükli kontroll

Tsükliin D1 regulatsiooni mehhanismidGF-Ras-Raf-Erk ja Wnt signaalirada kontrollib tsükliin D1 ekspressiooni ning stabiilsust ja GSK3on siin negatiivne regulaator.

β

Stabiilne 5–6 tundi kestev ERK signalisatsioon indutseerib tsükliin D1 ekspressiooni kesk-G1faasis (~8–9 tundi peale mitogeense stimulatsiooni algust vaikeolekus rakkudes)

PI3-kinaas/Akt fosforüleerib glükogeen süntaasi kinaasi 3 (GSK3 ) ja inhibeerib selleaktiivsuse

GSK3 fosforüleerib tsükliin D1 Thr286 mistõttu see translokeerub tuumast tsütoplasmasseja satub lagundamisele

Teisalt indutseerib Wnt signaalirada D1 ekspressiooni läbi -kateniini

·

· β β

· β

· β

-kateniini lagundamist kontrollib samuti GSK3

lisaks kontrollib GSK3 p27Kip1 degradatsiooni

- β β

- β

/

Page 26: Rakutsükli kontroll

Tsükliin D-CDK4/6 lükkavad raku läbi Restriktsiooni-punkti

Rakud vastvad rakuvälistele mitogeensetele signaalidele kuni R-punktini

Peale R-punkti läbimist on tsükliinide E A B regulatsioon automaatne jaautonoomne

·

· → →

/

Page 27: Rakutsükli kontroll

Lisaks tsükliinidele reguleerivad tsükliin-sõltuvaidkinaase ka CDK inhibiitorid (CdkI)Praeguseks on kirjeldatud seitse erinevat CdkI-d

INK4 valgud (inhibitors of CDK4), mis inhibeerivad spetsiifiiselt ainult CDK4 ja CDK6

p21Cip1 , p27Kip1 , p57Kip2 : inhibeerivad kõiki teisi tsükliin-CDK komplekse

·

p16INK4A , p15INK4B , p18INK4C , p19INK4D-

·

Crystal structure of the p27Kip1 cyclin-dependent-kinase inhibitor bound to the cyclin A-Cdk2 complex. Russo, A.A., Jeffrey, P.D., Patten, A.K., Massague, J.,Pavletich, N.P. (1996) Nature 382: 325-331. Structural basis for inhibition of the cyclin-dependent kinase Cdk6 by the tumour suppressor p16INK4a. Russo, A.A.,Tong, L., Lee, J.O., Jeffrey, P.D., Pavletich, N.P. (1998) Nature 395: 237-243.

/

Page 28: Rakutsükli kontroll

TGF- indutseerib p15INK4BβTGF- peamine raku jagunemist pidurdav mehhanism töötab läbi p15INK4B

p15INK4B blokeerib tsükliin D-CDK4/6 komplekside moodustumise ja inhibeeribolemasolevaid

Ilma aktiivse tsükliin D-CDK4/6 pole rakutsükkel võimeline arenema läbi varase ja keskmiseG1 faasi R-punktini

Kui rakk on juba R-punkti läbinud pole enam D-CDK4/6 aktiivsus vajalik

Peale R-punkti muutub rakk 'tundetuks' ka TGF- inhibeerivale toimele

CDKN2A/B lookuse naabruses asuv 9p21.3 lookus on üks sagedamini muteerunud piirkondieri tüüpi vähkides (vt. Supplementary Table 3)

· β

·

·

·

· β

·

/

Page 29: Rakutsükli kontroll

p21Cip1 aktiveeritakse vastusena stressilep21Cip1 toimib läbi terve rakutsükli

TGF- indutseerib nõrgalt ka p21Cip1

Peamine p21Cip1 induktor on DNA kahjustused

p21Cip1 inhibeerib E-CDK2, A-CDK2, A-CDC2, B-CDC2 komplekse

Kui DNA kahjustused on parandatud, siis võetakse p21Cip1 -blokk maha

p21Cip1 inhibeerib ka DNA replikatsiooni masinavärgi valku PCNA ()

·

· β

·

·

·

·

Pilt: p21 (A, punane) blokeerib PCNA-l (sliding clamp) DNA polümeraasi seostumiskoha (B, C). http://www-bioc.rice.edu

/

Page 30: Rakutsükli kontroll

Mitogeenne signalisatsioon inhibeerib p21Cip1 jap27Kip1PKB/Akt inhibeerib p21Cip1 ja p27Kip1 tuuma lokalisatsiooni

HER-2/neu-vahendatud raku jagunemine käib läbi Akt aktivatsiooni,

Akt seostub p21Cip1 ja fosforüülib selle treoniin-145, põhjustades tsütoplasmalokalisatsiooni

Akt raja blokeerimine dominant-negatiivse Akt mutandiga taastab p21Cip1 tuumalokalisatsiooni ja rakkude jagunemist inhibeeriva toime

Sarnaselt toimub p27Kip1 inhibitsioon, seal fosforüülib Akt treoniin-157

Aktiveeritud Akt ekspresseerivad rakkudes ei suuda p27WT tekitada G1 arresti

Tsütoplasmaatiline p27 esines 41% (52/128) inimese primaarsetes rinnavähkides kus onkõrge Akt aktivatsiooni (Liang et al. 2002)

Tsütoplasmaatiline p27 korreleerub halva prognoosiga

·

·

·

·

·

·

·

/

Page 31: Rakutsükli kontroll

p21/p27 dko rakkudes on vähem tsükliin D-CDK komplekse Cheng et al. 1999.

p21Cip1 ja p27Kip1 seostumine on vajalik D-CDK4/6aktivatsiooniks

Primaarsed hiire fibroblastid, millespuuduvad nii p21 ja p27 ei suudamoodustada aktiivseid tsükliin D-CDKkomplekse,

Tsükliin D-CDK4/6 tase tõuseb rakusvarases-keskmises G1 faasis ja korjab ärap21 ja p27 nii, et see ei saa inhibeeridatsükliin E-CDK2

·

ekspresseerivad palju vähem tsükliinD ning

neis ei lokaliseeru tsükliin D tuuma

-

-

·

/

Page 32: Rakutsükli kontroll

RB fosforülatsioon reguleerib restriktsioonipunktiläbimist

Kui rakud läbivad M/G1 ülemineku, siis RBdefosforüleeritakse täielikult (PP1fosfataas)

G1 faasis tsükliin D-CDK4/6hüpofosforüleerib RB

Hüpofosforüleeritud RB muutub tsükliin E-CDK2 substraadiks jahüperfosforüleeritakse

RB jääb hüperfosforüleerituks koguülejäänud raku tsükli (kuni jälle G1-ni)

·

·

·

·

/

Page 33: Rakutsükli kontroll

RB valgud ehk 'taskuvalgud' (pocketproteins)RB, p107 ja p130 moodustavad 'taskuvalkude' perekonna

RB on 25% homoloogne ülejäänud kahega ja p107 ning p130 on omavahel 54% identsed

RB on hiirele embrüonaalselt surmav, kuid p107 või p130 -il pole silmaganähtavat fenotüüpi

RB omab tugevat tuumorsupresorfunktsiooni ja p107/p130 mutatsioonid on vähkidesharvad

·

·

·

·

Molecular mechanisms underlying RB protein function. Frederick A. Dick & Seth M. Rubin. Nature Reviews Molecular Cell Biology 14, 297-306 (May 2013)doi:10.1038/nrm3567

/

Page 34: Rakutsükli kontroll

Imetajate E2F TF perekondKaheksa geeni E2F1-8, kolm toimivad aktivaatoritena (E2F1-3a) ja ülejäänud repressoritena(E2F3b-8)

E2F1-6 valgud sisaldavad DP1,2 ( ) heterodimerisatsiooni domäänija seostuvad DNA-le heterodimeerina koos DP valguga

E2F1-5 valgud seovad RB 'taskuvalke' üle C-terminaalse domääni

Taskuvalgud pRB, p107 ja p130 seovad E2F ainult hüpofosforüleeritud olekus

·

·

·

·

Pilt: Signalling In The Epidermis: The E2f Cell Cycle Regulatory Pathway In Epidermal Morphogenesis, Regeneration And Transformation, doi:10.7150/ijbs.1.87

/

Page 35: Rakutsükli kontroll

RB valgud toimivad läbi E2FHüpofosforüleeritud pRB seostumine maskeerib aktivaatoritel transkriptsiooni aktivatsioonidomääni

Repressorvalkude E2F4 ja E2F5 seostumine taskuvalkudele (peamiselt p107 ja p130)moodustab E2F märklaudgeenide promootoritele repressorkompleksid

Hüpofosforüleeritud RB valgud seostuvad ka DNA-l olevatele E2F valkudele vaigistadesniimoodi geeniekspressiooni. Kompleksi 'tõmmatakse' ka histooni deatsetülaas HDAC mismuudab kromatiini struktuuri transkriptsioonile mittepermissiivseks

pRB seostub eelkõige E2F1-3 valkudele ning p107 ja p130 E2F4/5

·

·

·

·

/

Page 36: Rakutsükli kontroll

pRB valkude E2F TF seostumiskoht onkonserveerunud

Rb tasku on konserveerunud (mida punasem seda konserveerunum) nii eri liikidel kui valguisovormidel p107 ja p130 valkudel (Lee et al. 1998). Kollane on E2F2 peptiid mis onseostunud taskusse.

Tärniga nool näitab B-domäänil asuvat LxCxE-motiivi sisaldavate valkude (HPV E7)seostumiskohta (Lee et. al 2002)

HPV E7 valgu seostumine RB-le rikub 'tasku' konformatsiooni nii, et see ei saa enam sidudaE2F valke

·

·

·

/

Page 37: Rakutsükli kontroll

Transkriptsioonist sõltumatu RB rakutsükliregulatsioonRB stabiliseerib p27Kip1

RB vahendab ka p27 proteolüütilist lagundamist vahendava Skp2 degradatsiooni

Skp2 on ubikvitiini ligaasi kompleksi p27 ära tundev subühik

RB seob Skp2 üle oma C-terminaalse domääni ja esitleb selle APC/C () lagundamisele

APC seostub RB B-boxi LxCxE-motiivi sisaldavate valkude seostumiskohta

·

·

·

·

/

Page 38: Rakutsükli kontroll

pRB hüperfosforüleerimist võimendab positiivnetagasisideG1/S faasi kiire ülemineku tagavad positiivse tagasiside mehhanismid

Tsükliin E transkriptsiooni reguleerib E2F ja hüpofosforüleeritud RB repressioonist vabanevE2F võimendab edasist kiiret RB hüperfosorüleerimist läbi tsükliin E-CDK2

p27Kip1 on tsükliin E-CDK2 substraat ning fosfo-p27 määratakse ubikvitiin-proteasoomselelagundamisele

·

·

/

Page 39: Rakutsükli kontroll

Vähis mitmeid strateegiaid RB funktsioonitasalülitamiseks, MYC

RB geeni mutatsioonid retinoblastoomis, osteosarkoomis ja väikserakulisteskopsukasvajates

HPV E7 seostumine pRB-le inaktiveerib selle >99.7% emakakaela vähkides

Myc-Max aktiveerib tsükliin D2 ja CDK4 transkriptsiooni

Myc on üle ekspresseeritud 15-30% vähkides

Lisaks aktiveerib Myc-Max ka Cul1 transkriptsiooni, mis on SCF(SKP2) sisaldava kompleksiE3 ubikvitiin ligaas ja ubikvitineerib fosfo-p27kip

Myc-Miz1 heterodimeer inhibeerib aga p15INK4B ning p21Cip1, p27Kip1 transkriptsiooni

·

·

·

·

·

·

/

Page 40: Rakutsükli kontroll

Tsükliini kinaasi inhibiitorid toimivad läbi RBD-tsükliini inhibiitorite p15/p16 mutatsioonid ja RB mutatsioonid välistavad teineteistvähkides

·

Link andmetele: RB vs CDKIs

/

Page 41: Rakutsükli kontroll

Normaalselt TGF- supresseerib Myc ekspressiooniVõttes arvesse Myc-i võimet p15INK4B ekspressioon kinni panna ja seega TGF- jagunemistkontrolliv mõju nullida, siis

Tabel. Erinevates rakutüüpides CdkI üles-regulatsioon varieerub vastusena TGF-stimulatsioonile, kuid Myc alla-regulatsioon on universaalne.

RAKUD P15INK4B P21CIP1 P57KIP2 C­MYC

epiteeli eellasrakud üles üles alla

neuraalsed eellasrakud, astrotsüüdid üles üles alla

hematopoeetilised eellasrakud üles alla

T rakud üles alla

ββ

normaalsetes rakkudes on Myc geen siiski TGF- raja kontrolli all

Fosfo-SMAD3 istub koos E2F4/5 (repressiivsed E2F valgud), p107 ja C/EBP valkudega Mycgeeni promootoril ja paneb sellelt transkriptsiooni efektiivselt kinni

· β

· β

β

/

Page 42: Rakutsükli kontroll

Molekulaarsed muutused kasvajates mis viivadrakutsükli deregulatsiooniniErinevat tüüpi kasvajates kuni 90% vähke sisaldab muutusi rakutsükli regulatsioonis.

/

Page 43: Rakutsükli kontroll

Lingid teistele loengutele

Page 45: Rakutsükli kontroll