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2010/ 2011
01 de Março de 2011
Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
Alunas:
Andreia Sousa
n.º 40261
Alexandra Salvado
n.º 40267
Bioquímica I
1.º Ano - 2.º Semestre
2 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1. Apresentação, Tratamento e Discussão
de Resultados
1.1.Estudo da influência do pH na capacidade de uma solução
tampão
Cálculos:
pH
Fracção molar
H2PO4-
Fracção molar HPO4
-
Volume KH2PO4 0,1 M (mL)
Volume K2HPO4 0,1 M (mL)
pHi
c
pHiexp
pHf
c
pHfexp
∆pHc
∆pHexp
5.9 0.910 0.091 9.10 0.91 5.89 5.76 5.52 5.59 -0.37 -0.17
6.3 0.794 0.206 7.94 2.06 6.31 6.15 6.16 6.04 -0.15 -0.11
6.7 0.606 0.394 6.06 3.94 6.70 6.52 6.61 6.42 -0.09 -0.10
6.9 0.495 0.505 4.95 5.05 6.90 6.73 6.81 6.65 -0.09 -0.08
7.1 0.382 0.619 3.82 6.19 7.10 6.88 7.01 6.79 -0.09 -0.09
7.5 0.197 0.800 1.97 8.03 7.49 7.28 7.37 7.13 -0.12 -0.15
7.9 0.089 0.911 0.89 9.11 7.90 7.62 7.68 7.43 -0.22 -0.19
Quadro 1. Estudo do efeito do pH na capacidade de uma solução tampão de fosfatos
0.1M.
3 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
H2PO4-
HPO42- + H+
Ci cf
pH = 5.9
4 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH final (pHfc)
H2PO4-
HPO42- + H+
Ci cf
pHc
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,31
pH
pH = 6,3
pH final (pHfc)
pHfc =6,16
5 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,7
pH
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 6,9
pH
pH = 6,7
pH final (pHfc)
pHfc =6,61
pH = 6,9
pH final (pHfc)
pHfc =6,81
6 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,10
pH
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,49
pH
pH final (pHfc)
pHfc =7,01
pH = 7,1
pH = 7,5
pH final (pHfc)
pHfc =7,37
7 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Concentrações
Fracção Molar
Volumes
Volume K2HPO4 Volume KH2PO4
pH inicial (pHic)
pHic = 7,90
pH
pH = 7,9
pH final (pHfc)
pHfc =7,68
8 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
5,5
5,6
5,7
5,8
5,9
6
6,1
6,2
6,3
6,4
6,5
6,6
6,7
6,8
6,9
7
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
5,76 6,15 6,52 6,73 6,88 7,28 7,62
pH
Fracção molar de HPO42-
pHic e pHi
exp versus fracção molar de HPO42-
pH inicial calculado
pH inicial experimental
Gráfico 1. Gráfico que representa pHic versus fracção molar de HPO2-
4 (pontos unidos por uma linha a cheio) e pHi
exp versus fracção molar de HPO2-4 (pontos individuais). Ambos os conjuntos
de pontos são para o intervalo de valores de pH entre 5.9 e 7.9.
Os valores de pH experimentais foram em todos os casos mais baixos que o pH
calculado. Pode-se então concluir que ocorreram erros na medição dos volumes –
foram medidos volumes menores do que o devido. Tendo em conta que o erro ocorrido
manteve-se “constante” em todas as medições - a diferença entre o pH experimental e
o pH calculado é idêntica em todas – é possível considerar que a escolha do material
para a medição pode não ter sido a mais apropriada (devido ao erro associado ao
material - dever-se-ia ter optado por um material cujo erro associado fosse o menor).
9 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pHfc pHf
exp
5.52 5.59
6.16 6.04
6.61 6.42
6.81 6.65
7.01 6.79
7.37 7.13
7.68 7.43
Gráfico 2 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus pH inicial calculado.
Após a adição de 0,1 mL de HCl registaram-se os valores
finais do pH. Através do Quadro 2 é possível observar que houve
alguma discrepância entre os valores de pH calculados e
experimentais. No entanto, como foi referido anteriormente, os
erros na medição mantiveram-se e por isso, no final, a variação
de pH experimental, na maioria dos casos, foi aproximadamente
igual à calculada, como se pode comprovar no gráfico abaixo
(Gráfico 2).
Numa solução tampão o ácido e a sua base conjugada encontram-se em
equilíbrio. Quando se adiciona pequenas quantidades de ácido ou base a variação de
pH é quase insignificante.
O valor de pH para o qual se considera efectivo um sistema tampão é o valor
que tiver menos variação de pH, ou seja, é o valor para o qual o ácido e a sua base
0
0,03
0,06
0,09
0,12
0,15
0,18
0,21
0,24
0,27
0,3
0,33
0,36
0,39
5,89 6,31 6,7 6,9 7,1 7,49 7,9
|Δp
H|
pHic
ΔpH experimental e ΔpH calculado versus pHc
i
Δ pH final calculado
Δ pH final experimental
Quadro 2 Quadro com os valores de pH finais, calculados e experimentais.
10 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
conjugada têm a mesma concentração, já que é quando reagem e neutralizam de igual
modo tanto as bases como os ácidos adicionados, respectivamente. Através da
equação de Henderson-Hasselbalch concluímos então que a capacidade tamponante é
máxima quando o pH é igual ao pKa.
Pode-se comprovar o que foi dito anteriormente no gráfico, pois quando o pH é
mais perto de 6.89 (que é o valor de pKa) a variação que ocorreu por se adicionar HCl
foi muito mais pequena do que para os outros valores de pH, tanto para a esquerda
como para a direita do gráfico – quanto mais longe o valor de pH estiver do de pKa
mais efeito tem o HCl, pois mais variação ocorre. Logo, existe uma menor capacidade
tampão do sistema.
1.2.Preparação de uma solução tampão de fosfatos por diferentes
métodos
Quando se preparam soluções tampão o pH nem sempre é o que se esperava.
A razão para tal é que o pH é medido em relação à actividade do par ácido-base e não
pela concentração do ácido ou da base conjugada. Assim, quando queremos preparar
uma solução com um pH exacto muitas das vezes é necessário acertá-lo gota a gota.
No caso dos cálculos do grupo 4, que foi o que os operadores realizaram, o volume de
NaOH igual a 13,42 mL não resultou no valor de pH esperado (7,2), visto que
ultrapassou esse valor (7,4). Não se pôde adicionar HCl para fazer descer o pH porque
iria reagir com o NaOH o que, numa solução tampão não é permitido, visto que não é
suposto os reagentes reagirem. Então a solução é repetir o procedimento e adicionar
menos quantidade volúmica de NaOH. Experimentou-se, então, realizar esta parte do
procedimento com um volume de 12 mL e pH também ainda não era o esperado, mas
como não o ultrapassava foi-se adicionando, gota-gota, NaOH até perfazer o pH de
7,2. Para agitar melhor a solução e para se observar o efeito do aumento do pH mais
rapidamente utilizou-se uma barra magnética.
11 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Grupo 1
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
A relação entre a concentração do ácido e da base é igual para todos.
pH tampão fosfatos 0,05 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
12 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,05 M
Grupo 2
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
13 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,10 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,05 M
Grupo 3
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
14 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,15 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,15 M
Grupo 4
Método 1 – Toda a molaridade provém do ácido.
[
15 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
pH tampão fosfatos 0,20 M
Método 2 – Toda a molaridade provém da base conjugada
[
pH tampão fosfatos 0,20 M
16 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1.3. Estudo da influência da molaridade na capacidade de uma
solução tampão
Quadro 3 Estudo do efeito da molaridade na capacidade de uma solução tampão de fosfatos (pH7,2) – registo dos resultados calculados e experimentais.
Solução pHic pHi
exp pH f*c pHf*exp pHc pHexp
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,05M
7,2 7,19 7,01 6,87 -0,19 -0,32
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,10 M
7,2 7,26 7,18 7,05 -0,02 -0,21
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,15M
7,2 7,27 7,2 7,13 0 -0,14
Tampão de Fosfatos (pH = 7,2) 0,20M
7,2 7,21 7,20 7,15 0 -0,06
Na apresentação desta tabela é de salientar que não se mediu o pH da água
destilada devido à falta de tempo com que nos deparámos. No entanto, teoricamente
sabemos que o pH da água destilada deveria ser 7, mas experimentalmente o pH
deveria ser um pouco mais baixo devido ao seu contacto com o ar (que contem CO2),
pois ocorre a reacção: H2O + CO2 H2CO3. Ao adicionar HCl o pH deveria descer
ainda mais, o que causaria uma variação de pH negativa (sendo a maior variação de
todos os casos, já que não é uma solução tampão) tanto teórica como
experimentalmente.
17 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
Gráfico 3 Gráfico que representa pH final calculado e pH final experimental versus molaridade da solução tampão.
Nos restantes casos, soluções tampão, a variação de pH variou com diferentes
concentrações de fosfatos. Ao adicionar HCl, foram adicionados iões H+ à solução que
contribuíram para o gasto da base conjugada e para a formação de ácido, fazendo o
pH descer ligeiramente.
Através da análise do quadro e do gráfico acima representados (Quadro 3,Gráfico
3, respectivamente) pode-se concluir que quanto maior a concentração de fosfatos,
mais pequena é a variação de pH. Assim, podemos dizer que a molaridade tem
consequências na capacidade tampão: quanto maior a molaridade da solução, maior a
capacidade tampão. Isto deve-se ao facto de quando a molaridade é maior o número
de moles em solução também é maior – haverá maior o número de iões que
neutralizam o ácido e consequentemente haverá menor variação de pH.
0
0,02
0,04
0,06
0,08
0,1
0,12
0,14
0,16
0,18
0,2
0,22
0,24
0,26
0,28
0,3
0,32
0,34
0,05 0,1 0,15 0,2
|Vari
ação
de p
H|
Molaridade da Solução tampão
ΔpH experimental e ΔpH calculado versus molaridade da solução tampão
Δ pHc
Δ pHexp
18 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
1.4. Estudo da influência da temperatura no valor de pH de uma
solução tampão
Quadro 4 Estudo do efeito da temperatura no valor de pH de uma solução tampão – registo de resultados.
Solução Tampão
Condições Usadas
Temperatura (ºC)
pHexp
Tampão de
Fosfatos (pH 7,2)
0,1 M
1 – Gelo
2 7,29
2- Temperatura Ambiente
20 7,19
3 – Banho Termostatizado
37 7,17
Como é visível no quadro acima apresentado (Quadro 4) o valor de pH aumenta
com a diminuição de temperatura. Como referido anteriormente, o pH é medido em
relação à actividade do par ácido-base por isso, com o aumento da temperatura, a
actividade dos iões H+ aumenta e consequentemente o pH ( ) diminui.
Quando a temperatura diminui a actividade dos iões H+ diminui e portanto o pH
aumenta. Nesta actividade laboratorial, por falta de tempo, as soluções 1 e 3 só
estiveram colocadas no gelo e em banho de água, respectivamente, durante cerca de
15 minutos e não os 30 minutos devidos, também não foi possível realizar o
procedimento com o Tris-HCl.
2. Bibliografia
Simões, José A. Martinho, Guia do laboratório de Química e Bioquímica, 2ª
edição, Lidel, Lisboa, 2008;
Voet, D. e Voet, J.G. (1995) Biochemistry, 2ª ed., John Wiley & Sons: New York,
pp. 56-62 & 105-119.
19 Preparação e Propriedades de Soluções Tampão
01 de Março de 2011
3. Questionário
3.1. Quais são os critérios gerais mais importantes a considerar na escolha de uma solução
tampão a ser usada em experiencias bioquímicas? Justifique sucintamente.
A escolha de uma solução tampão deve ser feita em relação aos seguintes
critérios: o intervalo de pH que se vai estudar; deve ser impermeável relativamente às
membranas celulares (muito solúvel em água e pouco solúvel noutros solventes); não
deve interferir nos processos biológicos; não deve absorver radiação visível ou UV; não
deve formar compostos insolúveis (precipitação); de ter uma contribuição mínima para
a composição iónica (força iónica do meio influencia processos biológicos); a influência
da temperatura na alteração do pH deve ser limitada e o pKa deve distar pouco do pH.
3.2 Muitos protocolos de purificação de proteínas requerem que todos os procedimentos
sejam realizados a 4ºC para se minimizar a inactivação das proteínas. No caso de se
trabalhar com uma proteína muito sensível ao valor de pH do meio, a preparação das
soluções tampão e o acerto final do seu valor de pH são realizadas numa câmara
frigorífica. Justifique o procedimento anterior.
Como foi provado nesta actividade laboratorial, a temperatura afecta o valor de
pH logo, se se está a trabalhar com uma enzima que é muito sensível ao pH, deve-se
preparar a solução tampão nas condições em que a proteína está activa, para quando
a solução estiver em contacto com ela não sofrer (ou sofrer poucas) alterações e a
proteína não ser desactivada/desnaturada.
Assim, como a proteína está activa aos 4ºC prepara-se a solução tampão num
frigorífico à mesma temperatura para evitar mudanças no valor de pH e a inactivação
da mesma.