UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
RELATÓRIO DE ESTÁGIO
E MONOGRAFIA
MESTRADO EM ANÁLISES CLINÍCAS
RUTE FILIPA DIAS NOGUEIRA
LISBOA, 2016
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 2
O PRESENTE RELATÓRIO FOI ESCRITO AO ABRIGO DO ANTIGO
ACORDO ORTOGRÁFICO.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
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Índice
Índice ................................................................................................................................ 3
Agradecimentos ................................................................................................................ 5
Resumo ............................................................................................................................. 6
Abstract ............................................................................................................................. 7
Índice – Parte I .................................................................................................................. 9
Índice de Figuras ............................................................................................................ 10
Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10
Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... 11
Introdução ....................................................................................................................... 13
1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas ................................................................. 14
1.1. Colheita de outros produtos biológicos............................................................ 16
1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO) .................................................. 19
1.3. Triagem de amostras ........................................................................................ 20
2. Fase Analítica ......................................................................................................... 21
2.1. Hematologia ..................................................................................................... 21
2.1.1. Equipamentos ........................................................................................... 21
2.2. Microbiologia ................................................................................................... 34
2.2.1. Equipamentos ........................................................................................... 34
2.2.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 37
2.3. Imunologia ....................................................................................................... 45
2.3.1. Equipamentos ........................................................................................... 45
2.3.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 49
2.4. Bioquímica ....................................................................................................... 50
2.4.1. Equipamentos ........................................................................................... 50
2.4.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 51
3. Controlo de Qualidade ............................................................................................ 56
4. Fase Pós-Analítica .................................................................................................. 58
Bibliografia – Parte I ...................................................................................................... 59
Índice – Parte II .............................................................................................................. 62
Resumo ........................................................................................................................... 63
Abstract ........................................................................................................................... 64
Índice de Figuras ............................................................................................................ 65
Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... 66
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 4
Introdução ....................................................................................................................... 67
Objectivos ....................................................................................................................... 69
5. Plaquetas ................................................................................................................. 70
5.1. Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas ................................. 70
5.2. Papel na inflamação ......................................................................................... 83
5.3. Alterações quantitativas ................................................................................... 87
5.4. Alterações qualitativas ..................................................................................... 90
5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias ... 91
6. Doenças vasculares ................................................................................................. 94
6.1. Doenças Arteriais ............................................................................................. 94
6.1.1. Doença das artérias coronárias ................................................................. 94
6.1.2. Doença das artérias periféricas ................................................................. 96
6.2. Doenças Venosas ............................................................................................. 98
6.2.1. Trombose das veias profundas ................................................................. 98
7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular ..................................... 99
7.1. Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico ........... 99
8. Abordagens Terapêuticas ..................................................................................... 104
8.1. Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes
com doenças vasculares associadas .......................................................................... 104
8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes plaquetários em utilização na
prevenção de doenças vasculares ......................................................................... 104
8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica ...................................... 105
8.3. Novos agentes antiplaquetários...................................................................... 106
Conclusões e Perspectivas ............................................................................................ 108
Bibliografia – Parte II ................................................................................................... 109
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Agradecimentos
À Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa e a todos os docentes que
participaram nesta edição do Mestrado em Análises Clínicas, por todos os conhecimentos
transmitidos.
À Faculdade de Ciências da Universidade de Lisboa e a todos os docentes que
acompanharam o meu percurso ao longo da Licenciatura em Bioquímica, que em tanto
me foi útil durante estes dois últimos anos e que o será para todo o meu percurso
profissional ao longo da vida.
À Dra. Isabel Bettencourt, minha orientadora, por toda a compreensão, por todo o
acompanhamento, disponibilidade, carinho e apoio prestados ao longo da elaboração
deste trabalho.
À Dra. Fátima Consciência, Dra. Noélia Piteira, Dra. Alexandra Moutinho e
restantes colaboradoras do Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas no qual realizei o
estágio profissional, por todos os ensinamentos transmitidos ao longo destes meses.
À Dra. Rita Matos por todo o apoio e prontidão de resposta sempre que me
surgiam dúvidas no âmbito dos assuntos académicos.
Aos meus pais, por todo o amor, por todos os ensinamentos que me têm
transmitido ao longo da vida, por todo o apoio, por toda a compreensão, por toda a força
que sempre me transmitiram, impulsionando-me sempre a alcançar os meus objectivos e
por todo o acompanhamento que fazem de mim a pessoa que sou hoje.
À minha avó Maria José, por toda a força e preocupação que sempre teve comigo.
Ao Ricardo Ambrósio, por todo o amor, carinho, apoio e compreensão que tanto
foram importantes nesta recta final.
À Maria Inês, Marisa, Andreia e Beatriz pela amizade que nos une, por todos os
momentos e por toda a força que sempre me deram.
Ao Cláudio, pela força que me foi transmitida para atingir os meus objectivos.
A todas as pessoas, amigos e família, que me acompanharam e me deram forças
para chegar até aqui.
A todos os que acreditaram sempre em mim e fizeram de mim uma pessoa mais
forte.
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Rute Nogueira 6
Resumo
Este trabalho encontra-se dividido em duas partes distintas: relatório de estágio e
monografia. Na primeira parte é apresentado o relatório de estágio profissional realizado
no Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas. Neste relatório são descritos os
equipamentos e respectivas técnicas manuais utilizadas durante o estágio, nas áreas de
bioquímica, microbiologia, hematologia e imunologia.
Na fase pré-analítica abordou-se as secções de triagem e colheita de produtos
biológicos. Na triagem dos produtos biológicos há que ter vários aspectos em conta, pois
é a partir desta fase que os produtos são analisados e encaminhados para dar os resultados
aos utentes. É muito importante verificar se os produtos estão em condições de serem
analisados, ou seja, se estão na conformidade necessária à execução analítica. Caso isto
não aconteça é necessário que haja uma rejeição da amostra e será pedido ao utente que
venha repetir noutro dia, consoante a urgência. Existem situações em que a amostra pode
vir a ser utilizada, mesmo não estando em conformidade, quando existe indicação médica
para tal. Por outro lado, no que diz respeito à colheita dos produtos biológicos, também
há que ter uma elevada atenção, de modo a que a colheita seja o mais eficaz possível,
tanto no que diz respeito à satisfação do utente, como na obtenção de um produto
conforme para o laboratório.
No que diz respeito à fase analítica, ao longo desta primeira parte do trabalho,
descrevem-se os vários equipamentos que foram utilizados durante o estágio profissional,
tendo todos uma manipulação diferente e seguindo um controlo de qualidade muito
rigoroso. Para além disso, foram também realizadas várias técnicas manuais ainda em
utilização neste laboratório, imprescindíveis para uma boa obtenção de resultados
analíticos.
Para finalizar, aborda-se os princípios do controlo de qualidade posto em prática
no laboratório, sendo o seu cumprimento de grande importância para a obtenção de
resultados de elevada fiabilidade. A fase pós-analítica integra a validação biopatológica
pela directora técnica do laboratório, sem a qual a entrega dos resultados aos utentes não
é possível.
Palavras-chave: Estágio; Laboratório; Analítica; Biológico
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Abstract
This work is divided into two distinct parts: the internship report and the
monograph. On the first part it's presented the professional internship report held at
Biolabor, Clinical Analysis Laboratory. In this report, it's described the equipment and
manual techniques used during the internship in biochemistry, microbiology, hematology
and immunology.
In the pre-analytical phase it was focused the sections of screening and harvest of
biological products. Screening of biological products it's necessary to take various aspects
into account, since it's from this stage on that the products are analyzed and forwarded to
give the results to users. It's very important to check if the products are under the right
conditions to be analyzed, i.e., whether they are under the conformity to the required
analytical process. If this is not the case it's necessary to reject the sample and it will be
requested the user to come again to repeat the sampling another day, depending on the
urgency. There are situations where the sample might be used, even if it's not in
conformity. Such cases occur when there is medical indication for such. On the other
hand, regarding the harvest of the biological products, there should also be given high
attention, so that the harvest is as effective as possible, both with regard to the satisfaction
of the user, and with the obtainment of the product according to a laboratory analysis.
Regarding the analytic phase, during this first part of the work, it's described the
various equipment that were used during the professional internship, all with different
handling and following a very rigorous quality control. Besides this, it was also performed
various manual techniques still used in laboratory, essential for obtaining good analytical
results.
Finally, it’s discussed the principles of quality control implemented in the
laboratory and its application of great importance to obtain highly reliable results. The
post-analytical phase integrates biopathologic validation by the laboratory's technical
director, without which the delivery of results to the users would not be possible.
Keyword: Internship, Laboratory; Analytical; Biological
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RELATÓRIO DE ESTÁGIO
ORIENTADO PELA DOUTOURA FÁTIMA CONSCIÊNCIA
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LISBOA, 2016
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Índice – Parte I
Índice ................................................................................................................................ 3
Agradecimentos ................................................................................................................ 5
Resumo ............................................................................................................................. 6
Abstract ............................................................................................................................. 7
Índice – Parte I .................................................................................................................. 9
Índice de Figuras ............................................................................................................ 10
Índice de Tabelas ............................................................................................................ 10
Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... 11
Introdução ....................................................................................................................... 13
1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas ................................................................. 14
1.1. Colheita de outros produtos biológicos............................................................ 16
1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO) .................................................. 19
1.3. Triagem de amostras ........................................................................................ 20
2. Fase Analítica ......................................................................................................... 21
2.1. Hematologia ..................................................................................................... 21
2.1.1. Equipamentos ........................................................................................... 21
2.2. Microbiologia ................................................................................................... 34
2.2.1. Equipamentos ........................................................................................... 34
2.2.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 37
2.3. Imunologia ....................................................................................................... 45
2.3.1. Equipamentos ........................................................................................... 45
2.3.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 49
2.4. Bioquímica ....................................................................................................... 50
2.4.1. Equipamentos ........................................................................................... 50
2.4.2. Técnicas manuais ...................................................................................... 51
3. Controlo de Qualidade ............................................................................................ 56
4. Fase Pós-Analítica .................................................................................................. 58
Bibliografia – Parte I ...................................................................................................... 59
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Índice de Figuras
Figura Página
Figura 1: ADVIA 2120i, Sistema de Hematologia 20
Figura 2: Citograma de Peroxidase 22
Figura 3: Citograma BASO 22
Figura 4: Visão clássica da Cascata de Coagulação 24
Figura 5: Visão actual da Cascata de Coagulação 25
Figura 6: ADAMS A1C HA-8160 27
Figura 7: VESMATIC 30/30 PLUS 28
Índice de Tabelas
Tabela Página
Tabela 1: Resultados possíveis do BK directo 38
Tabela 2: Resultados possíveis do BK cultural 38
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Lista de Abreviaturas
ALT – Alanina Aminotransferase
ANC – Bactérias Anaeróbias e Corinebactérias
APTT – Tempo de Tromboplastina Parcial Activado
AST – Aspartato Aminotransferase
AST – Teste de Sensibilidade aos Antibióticos
BASO – Basófilos
BCL – Bacilos Gram Positivos Formadores de Esporos
CBC – Corinebactérias
CHGM – Concentração Globular Média de Hemoglobina
CK – Creatinina Cinase
CMI – Concentração Mínima Inibitória
CO2 – Dióxido de Carbono
CQI – Controlo de Qualidade Interno
CTFF – Capacidade Total de Fixação do Ferro
DIC – Coagulação Intravascular Disseminada
EDTA – Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
ELFA – Enzyme Linked Fluorescent Assay
ELISA – Enzyme Linked Immunosorbent Assay
G.S.G.C. – Meio de Gelose, Sabouraud, Gentamicina, Cloranfenicol
GGT – Gamaglutamiltranspeptidase
GN – Cocos e Bacilos Gram Negativos e Não Fermentadores
GP – Cocos e Bacilos Gram Positivos Formadores de Esporos
HbA1C – Hemoglobina Glicada
HDL – Lipoproteína de Alta Densidade
HGB – Hemoglobina
HGM – Hemoglobina Globular Média
HPLC – Cromatografia Líquida de Alta Pressão
Ht – Hematócrito
INR – Razão Normalizada Internacional
ISI – International Sensity Index
IT – Instruções de Colheita
LAC – Laboratório de Análises Clínicas
LDH – Lactato Desidrogenase
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NH – Neisseria Haemophilus
OMS – Organização Mundial de Saúde
PCR – Proteína C Reactiva
PDF – Produtos de Degradação de Fibrina
PEROX – Peróxidos
Plt – Plaquetas
PSM – Process Systems Manager
PTGO – Prova de Tolerância à Glicose Oral
RBC – Eritrócitos
Retic – Reticulócitos
SI – Sistema Informático
SYSMEX – Sysmex automated blood coagulation analyzer
TASO – Anti-estreptolisina O
TIBC – Capacidade Total de Ligação do Ferro
TP – Taxa de Protrombina
TPA – Activador Tecidular do Plasminogénio
UFC – Unifluidics
VDRL – Veneral Disease Research Laboratory
VGM – Volume Globular Médio
VIDAS – Vitek Immuno Diagnostic Assay System
VS – Velocidade de Sedimentação
YST – Leveduras
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Introdução
O relatório de estágio que se segue foi baseado no estágio profissional realizado
no Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas, no âmbito do Mestrado em Análises
Clínicas da Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa.
Este laboratório encontra-se sob a direcção técnica da Dra. Fátima Consciência,
farmacêutica especialista em Análises Clínicas. O laboratório encontra-se dividido em
diferentes áreas: recepção, zona de colheitas, área de microbiologia, área de hematologia,
área de imunologia/endocrinologia, área de bioquímica e zona de triagem.
Sendo um laboratório pequeno, durante o estágio tive oportunidade de contactar
com todas as áreas nele existente, desde a colheita de produtos biológicos, passando pela
recepção, por todas as áreas analíticas e pela triagem de amostras.
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1. Fase Pré-Analítica: Triagem e colheitas
O processo pré-analítico tem como objectivo descrever todo o processo desde o
atendimento aos utentes até à obtenção de amostras biológicas adequadas à execução
analítica, aplicando-se a todas as etapas do processo pré-analítico: atendimento, colheitas
e triagem.
No núcleo das análises clínicas, entende-se por cliente os utentes/doentes e
qualquer entidade com as quais o laboratório possui contractos de fornecimento de
serviços e que solicitem os serviços de análises clínicas. Por outro lado, existem também
os médicos prescritores (clientes intermédios), os quais definem parte dos requisitos do
serviço, sendo necessária, em determinadas circunstâncias, a comunicação entre o
laboratório e estes.
A fase pré-analítica engloba uma série de procedimentos para os quais é necessário
um bom entendimento de algumas noções:
Plasma: é o sobrenadante livre de células obtido após a centrifugação do sangue
contendo anticoagulante.
Soro: é a porção extracelular do sangue não diluída após coagulação completa e
adequada. A coagulação é considerada completa quando as amostras são deixadas
pelo menos 20 a 30 minutos à temperatura ambiente (ou tempo inferior se o tubo
for adicionado de gel ou aditivo acelerador).
Anticoagulante: aditivo que inibe a coagulação sanguínea e que é utilizado para
assegurar que os parâmetros a serem medidos são alterados o menos possível antes
da execução analítica.
O utente é recepcionado no Laboratório de Análises Clínicas (LAC) por ordem de
chegada, onde são colocadas algumas questões sobre o seu estado, tendo em conta as
análises prescritas e as respectivas condições necessárias para a execução da colheita, de
acordo com o Manual de Colheitas. Caso não se verifique a conformidade necessária à
execução analítica, deve pedir-se ao utente que se dirija ao LAC noutro dia, nas devidas
condições, salvo por indicação médica contrária. Nas situações em que exista a
necessidade de instruir o utente previamente do modo de proceder, a recepcionista deve
entregar-lhe a respectiva instrução de colheita (IC).
Durante o processo de abertura de ficha no Sistema Informático (SI), é atribuído
um número a cada utente, ao qual vão estar associadas as respectivas análises requisitadas,
identificação esta que se vai manter até que o Boletim de Análises seja emitido. Por outro
lado, cada utente vai ter um número de identificação, o qual o vai identificar no LAC,
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Rute Nogueira 15
independentemente do número de processos abertos para este doente. Em situações
excepcionais em que não haja sistema informático por qualquer razão, o utente é
identificado com pelo menos três nomes e é preenchido um impresso específico que lhe
atribui um número, sendo entregue um talão manual para levantamento dos resultados.
Em situações específicas, a ordem de atendimento pode ser alterada no caso de
existirem na sala de espera pessoas às quais deve ser concedida prioridade: pessoas com
deficiência, pessoas diabéticas, grávidas, crianças com menos de três anos e utentes com
Provas de Tolerância à Glucose Oral (PTGO).
Situações há em que o doente se dirige ao LAC sem requisição, pedindo
verbalmente o que pretende e devendo para isso preencher uma Requisição de Análises
Particular, com as análises pedidas (como nos casos em que o utente é abrangido por
algum tipo de seguro). No entanto, há análises que o doente não pode solicitar sem
requisição médica, como é o caso de análises em que seja necessário a administração de
solutos, medicamentos ou outros, por via oral ou parentérica.
Durante o atendimento ao utente, há que verificar a entidade pelo qual este está
abrangido (credencial) tendo em conta os requisitos particulares da mesma.
As salas de colheita devem ser devidamente preparadas no dia anterior, com todo
o material que possa ser necessário. Para análises específicas, devem ser colocados, no
frigorífico de amostras, tubos de EDTA-gel, seringas de 10 e 20 mL e tubos para soro
com gel ou grânulos. Por outro lado, na estufa a ± 37ºC devem estar seringas de 10 e 20
mL e tubos secos para soro. O material colocado no frigorífico deve ser mudado
periodicamente para não expirar a validade e o que é colocado na estufa deve ser mudado
diariamente para que não haja o risco de se alterar ou contaminar.
A colheita de sangue (ou de outro produto biológico que o justifique) é efectuada
com material esterilizado e não reutilizável. A cada recipiente é atribuída uma etiqueta
com código de barras, antes da colheita, com a respectiva identificação do utente. Tanto
a hora da colheita de sangue como a da centrifugação devem ser registadas. As horas da
colheita das urinas tipo II, uroculturas e diversos devem ser igualmente registadas. Na
listagem das urinas de 24 horas, o volume deve ser registado, com respectiva confirmação
deste e da análise a efectuar. A hora a que os produtos biológicos são semeados é registada
nas listas de trabalho de microbiologia.
Na punção venosa, o garrote deve ser colocado cerca de 8 a 10 cm da zona de
punção. Depois efectua-se a palpação da veia mais adequada (veias medianas, veia
basílica e veia cefálica), desinfecta-se bem o local a puncionar e, no fim da extracção de
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sangue, desaperta-se o garrote e pressiona-se bem o local da punção. A agulha deve ser
descartada em contentor próprio para perfurantes. A ordem de distribuição do sangue
pelos tubos deve ser sempre respeitada para evitar contaminações: hemoculturas, soro,
citrato, heparinato e Ácido etilenodiamino tetra-acético (EDTA). Numa punção cutânea,
a grande diferença para a punção venosa é o local a puncionar, o qual deve ser sempre
bem desinfectado (lóbulo da orelha, polpa do dedo, calcanhar).
Para a obtenção de soro, os tubos devem estar pelo menos 30 minutos à
temperatura ambiente, de modo a ser feita a coagulação completa. Após este processo,
centrifuga-se pelo menos 10 minutos a uma velocidade mínima de 2500 rpm. A
centrifugação deve ser efectuada de preferência até 60 minutos após a colheita, uma vez
que a cada hora há perda de aproximadamente 10% de glucose, sendo aceitável um
intervalo de 2 horas entre a colheita e a separação do soro. Um contacto do soro com as
células do coágulo para além de 2 horas pode causar alterações significativas de
constituintes como glucose, potássio, fósforo, creatinina, Aspartato aminotransferase
(AST) e Alanina aminotransferase (ALT).
Para a obtenção de plasmas, o sangue (citratado, EDTA e heparinizado) deve ser
centrifugado durante 15 minutos a 2000-3000 rpm. Os tubos citratados não devem ser
centrifugados nos postos de colheita.
1.1. Colheita de outros produtos biológicos
Tal como já foi referido, para além da colheita de sangue, existem outros produtos
biológicos que podem ser colhidos, de acordo com as respectivas IT’s, respeitando-se
sempre as regras de protecção individual adequada (bata, luvas, óculos e máscara de
protecção, de acordo com o que se justifique):
Colheita para exames bacteriológicos, micológicos e parasitológicos: A
colheita deve ser efectuada com zaragatoa estéril ou seringa de acordo com o local
prescrito para exame microbiológico; sempre que possível, a amostra deve ser
colhida no laboratório, ou ser enviada o mais rapidamente ao laboratório em meio
de transporte adequado.
◦ Exsudado amigdalino: O utente deve estar sentado com a cabeça
ligeiramente inclinada para trás, boca bem aberta e língua baixa. A colheita
é feita com zaragatoa na zona das amígdalas incidindo nas zonas
vermelhas e pontos brancos quando existentes.
◦ Exsudado auricular: Com o utente sentado, a colheita é feita com a
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zaragatoa a nível do ouvido direito, esquerdo ou ambos (uma zaragatoa
por ouvido).
◦ Exsudado faríngeo, orofaríngeo ou rinofaríngeo: Com o utente sentado
com a cabeça ligeiramente inclinada para trás e língua baixa, a zaragatoa
é colocada na zona da rinofaringe.
◦ Exsudado nasal: O utente deve estar sentado com a cabeça ligeiramente
inclinada para trás. Com a zaragatoa a nível da narina esquerda e direita,
esta deve ser introduzida cuidadosamente até à parte superior da narina,
até encontrar resistência (até as lágrimas virem aos olhos). Na
identificação de portadores de Staphylococcus aureus, não é necessária a
introdução muito profunda da zaragatoa.
◦ Exsudado nasofaríngeo: O utente deve estar sentado com a cabeça
ligeiramente inclinada para trás. A colheita é feita com zaragatoa flexível
ao nível da narina esquerda e direita. A zaragatoa deve introduzir-se
cuidadosamente através do nariz, o mais profundo possível.
◦ Exsudado ocular: O utente deve estar sentado, com a zaragatoa a nível do
olho direito, esquerdo ou em ambos de acordo com a prescrição médica
(uma zaragatoa por olho). A colheita é feita na parte interna da pálpebra
inferior.
◦ Exsudado vaginal: A utente tem de estar deitada em posição ginecológica.
Com a zaragatoa de alginato de cálcio ou de Dacron, a colheita é feita na
zona de maior exsudado ou do fundo do saco vaginal posterior e colo do
útero com o auxílio de um espéculo (excepto em crianças e mulheres
virgens). A operação é repetida com uma segunda zaragatoa. A primeira
zaragatoa destina-se à realização do esfregaço no acto da colheita,
enquanto a segunda se destina à sementeira.
◦ Pesquisa de Neisseria Gonorreia (Gonococcus): A colheita é feita com
zaragatoa ao nível do endocolo, glândulas de Skène ou de Bartholin, uretra
ou eventualmente ânus.
◦ Pesquisa de Chlamydia Trachomatis: Remover bem o excesso de muco
com uma zaragatoa larga de alginato de cálcio ou de Dacron. Inserir uma
segunda zaragatoa no canal endocervical, evitando o contacto com a
mucosa vaginal e rodando vigorosamente durante 15-30 segundos.
◦ Pesquisa de Mycoplasma e Ureoplasma: É feita com amostras de
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exsudado vaginal, cervical ou uretral. Deve efectuar-se bem a raspagem da
mucosa, com zaragatoa, para colher o maior número de células possível.
Colocar imediatamente a zaragatoa no frasco, com meio de transporte (do
Kit).
◦ Pesquisa de Streptococcus Hemolíticos do grupo B: Com a zaragatoa
e sem espéculo, colher uma amostra no terço inferior da vagina. Em
situações em que seja também pedida a pesquisa anal, colher outra
zaragatoa na zona rectal.
◦ Exsudado Uretral: No homem, a colheita deve efectuar-se de manhã,
antes da primeira micção ou no mínimo 3 horas depois da última micção e
antes de se lavar. Limpar a mucosa circundante com gaze esterilizada. Por
pressão do pénis fazer aparecer uma gota de secreção e colher com a
zaragatoa. Se não existir gota matinal, fazer a colheita introduzindo uma
zaragatoa fina na uretra e rodando suavemente. Na mulher, a colheita deve
efectuar-se antes de qualquer lavagem local, com zaragatoa a nível da
uretra.
◦ Hemoculturas: Com o utente sentado ou deitado (como na punção
venosa), a colheira é feita por punção venosa no início do pico febril. A
desinfecção do local a puncionar deve ser feita com Betadine e álcool a
70º e o frasco da hemocultura deve ser o primeiro a ser colhido. A tampa
do frasco da hemocultura deve ser previamente desinfectada com álcool a
70º. Volume em adultos: 8 a 10 mL; crianças: 1 a 3 mL.
◦ Pus em supurações superficiais: Colheita com zaragatoa ou agulha e
seringa. Limpar primeiro o local com solução salina estéril. Retirar pus,
secreções ou tecidos desvitalizados. Colher o pus localizado na parte mais
profunda da ferida.
◦ Pus em supurações fechadas: Colheita com agulha e seringa. Transportar
a seringa sem agulha.
Lesões cutâneas: Durante a colheita da amostra, todo o equipamento de
segurança e protecção individual deve ser utilizado. Antes da colheita, deve
limpar-se a lesão cutânea para evitar vestígios de qualquer medicamento. Se a
lesão for seca e descamativa, recolhem-se as escamas, de preferência na zona
periférica da lesão, com um bisturi esterilizado. Se a lesão for exsudativa, utiliza-
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Rute Nogueira 19
se uma zaragatoa estéril para a recolha. Para a pesquisa de pitiríase versicolor,
utiliza-se a técnica da fita adesiva transparente, colocando sobre a pele a fita
adesiva e, de seguida, sobre a lâmina de vidro. Na pesquisa de dermatófitos,
colocam-se algumas escamas cutâneas entre lâmina e lamela com potassa (de 20
a 40%) para observação microscópica, devendo a observação ser feita após meia
hora, depois da montagem da preparação.
Oniquias: Nas oniquias, na colheita de unhas infectadas, deve raspar-se a zona
atingida e recolher os fragmentos para uma placa de Petri. Na pesquisa de
dermatófitos, colocam-se algumas escamas cutâneas entre lâmina e lamela com
potassa (de 20 a 40%) para observação microscópica, devendo a observação ser
feita após duas horas. Se existir perioníquia, colhe-se o pus com uma zaragatoa
esterilizada.
Pêlos/couro cabeludo: Na colheita de pêlos, estes devem ser colhidos nas zonas
de queda ou alopecia. Colhem-se escamas e cotos resultantes da fragmentação de
cabelos parasitados, pressionando a superfície da lesão com pinça esterilizada.
Quando se pesquisa dermatófitos, colocam-se alguns cabelos entre lâmina e
lamela com potassa (de 20 a 40%), para observação microscópica. Esta
preparação deverá ser observada imediatamente.
1.2. Prova de Tolerância Oral à Glucose (PTGO)
Nas provas de tolerância oral à glucose existem dois tipos distintos: Prova de
O'Sullivan e PTGO. Na prova de O'Sullivan a colheita é feita em jejum e ocorre a ingestão
de 50 g de glucose dissolvida em 200 mL de água, havendo nova colheita ao fim de 60
minutos. Na PTGO, segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), em grávidas, a
colheita é feita em jejum, com ingestão de 75 g de glucose dissolvida em cerca 300 mL
de água. Faz-se colheita de sangue aos 60 e 120 minutos após ingestão do soluto. Fora do
contexto de gravidez, na prova de despiste de diabetes, faz-se a colheita de sangue em
jejum, seguida da ingestão de 75 g de glucose dissolvida em 250 a 300 mL de água e a
colheita de sangue é realizada 120 minutos após o início da ingestão do soluto. Em
crianças com menos de 42 kg, a ingestão de glucose é de apenas 1,75 g de glucose por
cada kg de peso da criança dissolvidos em 200 mL de água, sendo a colheita feita de igual
modo aos 60 e aos 120 minutos. A prova deve ser efectuada após jejum de 8 horas mas
não superior a 14 horas. Nos 3 dias que antecedem o teste de tolerância à glucose o
paciente deve ter uma actividade física regular e uma dieta não restrita (cerca de 150 g de
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Rute Nogueira 20
hidratos de carbono diários). Durante a prova o paciente não deve fumar, comer ou beber
(excepto um pouco de água), devendo permanecer em repouso. As PTGO não estão
indicadas em pacientes com valores de glicemia em jejum superiores a 140 mg/dL,
devendo-se sempre fazer um despiste da glicemia em jejum, salvo se tivermos um
histórico recente do doente. A pesquisa de drogas é um procedimento sobre o qual recai
muita atenção uma vez que é um processo de elevada responsabilidade. Num primeiro
momento, o utente deve preencher a Cadeia de Custódia e assiná-la. A urina tem de ser
colhida no LAC/Posto de colheitas, sempre na presença de um técnico, para dois
recipientes próprios. Estes recipientes são selados na presença do utente e devidamente
etiquetados. Um dos recipientes destina-se a ser congelado durante um período de 3
meses, para o caso de ser necessária uma contraprova. Os testes são realizados por ensaio
imunológico, para a detecção qualitativa de drogas.
Depois das colheitas, independentemente do produto biológico colhido, as
amostras e respectivos tubos são levados para a sala de triagem de amostras. Todas as não
conformidades que possam ocorrer durante a colheita são registadas, para que se possa
avaliar a necessidade de rejeição da amostra.
1.3. Triagem de amostras
Na sala de Triagem e amostras, com o auxílio do Process Systems Manager
(PSM), as amostras são preparadas e distribuídas de acordo com o procedimento:
Os tubos secos ou com gel, para a obtenção do soro, são centrifugados e
encaminhados para a secção de Bioquímica/Imunologia;
Os tubos de coagulação, para a obtenção do plasma, são centrifugados e
encaminhados para a secção de Hematologia;
Os tubos que vão ser enviados para laboratório exterior são devidamente
separados e acondicionados;
Os restantes tubos são distribuídos pelas secções conforme especificidade da
análise a efectuar.
Se a amostra não se encontrar de acordo com as especificações definidas é
rejeitada (volume insuficiente, amostras com coágulos, amostras com hemólise,
lipémicas, amostras não identificadas, entre outras).
As condições de segurança para o transporte das amostras são definidas tendo em
conta uma adequada termoestabilização, de acordo com as características da análise a
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Rute Nogueira 21
realizar, atendendo ao tempo e à distância (temperatura, protecção da luz, precauções com
a vedação) e, ainda, requisitos para minimizar o risco de troca de amostras definido pelo
Manual de Colheitas. Todas as amostras que se destinem a análises que devem ser
realizadas de imediato não podem ser obtidas nos postos de colheita.
De acordo com o protocolo de colaboração entre o LAC e laboratórios exteriores,
as amostras são preparadas e devidamente identificadas tendo em conta as especificações
dadas pelos mesmos. As amostras são posteriormente recolhidas por uma empresa de
transporte rápido (entregas no próprio dia) ou enviadas pelo correio. As listas de trabalho
enviadas para o laboratório exterior contêm a identificação do doente e respectivas
amostras, as análises solicitadas e observações com informações gerais (sempre que isso
se justifique).
2. Fase Analítica
2.1. Hematologia
A secção de Hematologia estuda, em grande parte, os elementos figurados do
sangue: hemácias (glóbulos vermelhos), leucócitos (glóbulos brancos) e plaquetas. Por
outro lado, a produção desses elementos e os órgãos onde eles são produzidos (órgãos
hematopoiéticos) também são estudados nesta secção. Para além do estado de
normalidade dos elementos sanguíneos e dos órgãos hematopoiéticos, também as doenças
a eles associados são aqui estudadas.
2.1.1. Equipamentos
2.1.1.1. ADVIA 2120i
O Advia é um analisador de hematologia com uma plataforma única: módulo
electrónico e compressor integrado (Figura 1). O funcionamento do aparelho pode ocorrer
através de três modos de aspiração diferentes: autosampler tubo fechado, manual tubo
fechado e manual tubo aberto. O modo autosampler funciona utilizando uma ou mais
racks, tem capacidade para 150 tubos, de diferentes tamanhos e não necessita de
adaptadores.
Figura 1: ADVIA 2120i, Sistema de Hematologia (Retirado de (1))
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Rute Nogueira 22
Os reagentes a bordo têm capacidade para 1950 testes CBC/DIFF e 600 testes para
os reticulócitos. A tecnologia uniFluidics (UFC) utilizada pelo aparelho tem fiabilidade
hidráulica, manutenção reduzida e é fácil de usar. Não existe substituição de tubos e a
lavagem é feita diariamente de forma automática.
Com a determinação da Hemoglobina (HGB), do Hematócrito (Ht) e da contagem
de eritrócitos é possível calcular o Volume Globular Médio (VGM), a Hemoglobina
Globular Média (HGM) e a Concentração de Hemoglobina Globular Média (CHGM), ou
seja, os índices eritrocitários. Todos estes parâmetros são calculados pelo equipamento e
fazem parte do hemograma. Para além de anemias, uma diversidade de outras patologias
podem ser detectadas através da realização dos hemogramas.
No início de cada dia, depois das manutenções diárias, deve-se passar um sangue
como primer. De seguida, devem ser colocados os controlos e só depois dos resultados
destes estarem dentro dos valores das cartas de controlo é que se pode iniciar o trabalho
das amostras para realizar os hemogramas.
Durante o funcionamento do aparelho, a válvula cerâmica divide a amostra em
cinco alíquotas, distribuídas para os diferentes canais e métodos. Os reagentes empurram
a amostra que se encontra nos segmentos desta válvula, que vão ser enviados para as
diferentes câmaras de reacção, misturando e homogeneizando. As cinco câmaras de
reacção/canais são:
Canal HGB – Hemoglobina: A lise dos eritrócitos ocorre, havendo libertação
de hemoglobina. O ferro pertencente ao grupo hemo da hemoglobina é
oxidado, passando do estado ferroso para o estado férrico, sendo depois
combinado com o cianeto do reagente para formar o produto da reacção, cuja
transmitância vai ser lida a 546 nm.
Canal RBC/Plt – Eritrócitos e Plaquetas: O reagente ADVIA contém
dodecil sulfato de sódio (SDS) e glutaraldeído que provoca a esferificação
isovolumétrica do eritrócito, sendo o factor de variação da interpretação
eliminado. As plaquetas e os eritrócitos são fixados.
Canal Retic – Reticulócitos: O reagente ADVIA autoRetic contém um
detergente surfactante que esferifica isovolumetricamente os eritrócitos. Por
outro lado, contém um corante vital, oxazine 750, que cora as células de
acordo com o seu conteúdo de RNA.
Canal PEROX – Peroxidase: Em conjunto com o stress térmico, os
surfactantes provocam a lise dos eritrócitos. O formaldeído fixa os leucócitos.
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Rute Nogueira 23
O meio hipertónico causa alguma contracção e crenação dos leucócitos,
incrementando o índice de refracção das células e melhorando a detecção dos
linfócitos. No citograma PEROX (Figura 2), as células absorvem a luz
proporcionalmente à quantidade de coloração da peroxidase presente,
enquanto as células dispersam a luz proporcionalmente ao seu tamanho.
Quando os dados de dispersão da luz e de absorção são traçados, formam-se
clusters distintos. A análise de clusters identifica cada população com base na
sua posição, área e densidade. De seguida, é processado o número de células
de cada população.
Canal BASO: O reagente ADVIA BASO contém ácido ftálico e um
surfactante, ocorrendo a lise dos eritrócitos e das plaquetas. No citograma
BASO (Figura 3), a dispersão da luz relativa à configuração do núcleo é
traçada no eixo x e a dispersão da luz relativa ao tamanho da célula é traçada
no eixo y e formam-se populações ou clusters diferentes.
Figura 2: Citograma de Peroxidade (Retirado de (14))
Figura 3: Citograma BASO (Retirado de (14))
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Rute Nogueira 24
2.1.1.2. SYSMEX CA-500
O Sysmex automated blood coagulation analyzer (SYSMEX) da série CA-500 é
um dispositivo compacto e totalmente automatizado com capacidade para análise de 5
parâmetros aleatórios para utilização em diagnóstico in vitro. É um equipamento utilizado
na avaliação da coagulação sanguínea, onde se determina a taxa de Protrombina (TP), a
razão normalizada internacional (INR), o tempo de Tromboplastina Parcial Activado
(APTT) e o fibrinogénio, pelo método da coagulação. Para esta determinação é necessário
sangue colhido em citrato de sódio na proporção 1/10.
A coagulação plasmática conduz à transformação do fibrinogénio insolúvel, em
fibrina solúvel. Na realidade, a hemostase primária e a coagulação começam praticamente
ao mesmo tempo e estão interligadas. A activação da coagulação é desencadeada in vivo
por lesões que expõem o subendotélio ao sangue e também, pelas feridas dos tecidos, as
quais introduzem na circulação uma substância pró-coagulante, o factor tecidular
(tromboplastina). Na coagulação intervêm vasos, plaquetas e factores plasmáticos da
coagulação. Neste mecanismo, os proenzimas dão origem a enzimas e todo o processo de
activação desenvolve-se através de interacções moleculares, de modo a que o fenómeno
se potencialize (tais reacções são moduladas por inibidores fisiológicos). Esta sequência
de acontecimentos designa-se por cascata da coagulação. A activação da coagulação pode
ser feita por duas vias: pela via intrínseca, por contacto do sangue com uma superfície
carregada negativamente (subendotélio, in vivo, vidro ou caolina, in vitro), ou pela via
extrínseca, devido à introdução de factor tecidular no sangue. As duas vias conduzem à
conversão do factor X em Xa (início da via comum), que provoca a formação de trombina
que, por sua vez, transforma o fibrinogénio em fibrina.
A via intrínseca é desencadeada pela fixação dos factores XI e XII, pré-calicreína
e Quininogénio de Alto Peso Molecular (HMWK) sobre toda a superfície electronegativa.
In vivo, esta superfície pode ser constituída por plaquetas agregadas. O factor XIIa
transforma, por cisão proteolítica, o XI em XIa, e a pré-calicreína em calicreína. Há
activação recíproca entre estes dois factores. O factor XIa, em presença do cálcio (Ca2+)
activa o IX por proteólise. O IXa vai activar o X, graças a um complexo formado pelo
IXa, o VIIIa, o Ca2+ e uma superfície fosfolipídica (da membrana da célula endotelial).
Na via extrínseca vai ocorrer primeiramente a interacção entre o VII e o factor tecidular
em presença do Ca2+, seguido de proteólise do VII. O factor VIIa activa o X, e vice-versa.
Na via comum ocorre a activação do factor II (pró-trombina), a qual se faz graças a um
complexo chamado pró-trombinase (que inclui o Xa, o V, o Ca2+ e fosfolípidos, sejam
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Rute Nogueira 25
plaquetários ou endoteliais). Os factores II, Xa e V fixam-se sobre os fosfolípidos. O
factor Xa transforma o II em IIa (trombina). Esta ataca as regiões terminais aminadas do
fibrinogénio, libertando duas moléculas de fibrinopéptido A e duas de fibrinopéptido B.
O fibrinogénio transforma-se em monómeros de fibrina, que se agregam
espontaneamente entre eles, resultando num polímero de fibrina solúvel que é
estabilizado pelo XIII, previamente activado pela trombina. Os factores XIIa e o IXa
podem activar o VII, que por sua vez activa o IX.
A Fibrinólise é o processo de destruição do coágulo através de um sistema de
enzimas que lisam a fibrina, dissolvendo o coágulo. É mediada pela formação de um
enzima proteolítico, a plasmina, através da activação do plasminogénio. Durante a
coagulação, o plasminogénio e a trombina ficam enredados no trombo formado. O
Plasminogénio é activado pelo Activador Tecidular do Plasminogénio (TPA) e forma-se
a plasmina. A lise química da fibrina pela plasmina resulta na produção de fragmentos
chamados Produtos de Degradação da Fibrina (PDF). A Plasmina actua sobre estes
fragmentos para formar PDF cada vez menores. Os produtos finais são eliminados pelo
sistema retículo-endotelial.
Figura 4: Visão clássica da Cascata de Coagulação. Cascata de coagulação quando o sangue é
exposto a uma superfície carregada negativamente (via intrínseca) ou quando é exposto ao factor
tecidual (via extrínseca). Legenda: HMWK – cininogénio de alto peso molecular, Fp –
fibrinopeptídeo, Pho – fosfolípidos, FT – Factor tecidual. (Retirado de (13))
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Rute Nogueira 26
O TP avalia a via extrínseca da cascata da coagulação bem como a subsequente
via comum. Reflecte alterações em três dos factores dependentes da vitamina K (factor
II, VII e X), do fibrinogénio e do factor V. É utilizado na monitorização dos
anticoagulantes orais. Consiste na adição de uma tromboplastina completa (equivalente à
tromboplastina tecidual) a plasma citratado e na avaliação do tempo de coagulação após
adição de cálcio. Não requer activação por contacto pelo que é independente da via
intrínseca. Na tentativa de obviar a enorme discrepância entre os diferentes tipos de testes
que avaliam o TP, a OMS propôs que as tromboplastinas fossem padronizadas segundo
uma preparação de referência internacional e criou o International Sensitivity Index (ISI).
Após a determinação do ISI da tromboplastina, os resultados podem ser referenciados
como INR (razão entre o TP do paciente e o TP de referência, em segundos). A variação
normal do INR é entre 0,9 e 1,2. Um INR prolongado pode traduzir deficiência dos
Figura 5: Visão actual da Cascata da Coagulação. A cascata inicia-se pela via extrínseca após exposição (pela lesão
vascular) ou expressão (induzida por mediadores inflamatórios) do factor tecidual que conduz à activação do FVII. O
complexo FVIIa/FT activa os factores IX e X. Há medida que os níveis de FXa aumentam, o complexo FVIIa/FT é
inactivado pelo TFPI. A coagulação é mantida pelas reacções da via intrínseca iniciadas pelo FXIa. Ambas as vias
intrínseca e extrínseca convergem para a via comum na qual a pró-trombina é convertida em trombina que catalisa o
fibrinogénio em fibrina. Esta é estabilizada pelo FXIIIa. Legenda: Pho – fosfolípidos, FpA – Fibrinopeptídeo, FT –
Factor tecidual, TFPI – Inibidor da Via do Factor Tecidual. Activação → Amplificação ●-----● Inibição (Retirado
de (13))
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Rute Nogueira 27
factores I, II, V, VII e X, deficiência de vitamina K, terapêutica com anticoagulantes ou
com heparina em doses elevadas, doença hepática grave, síndrome nefrótico, transfusões
sanguíneas densas. O INR pode estar diminuído em estados pró-trombóticos (como nos
períodos pós-parto ou pós-cirúrgico). Em doentes a fazer heparina, o INR deve variar
entre 2 e 3 na doença tromboembólica venosa não complicada, entre 3 e 3,5 na trombose
recorrente ou no Lúpus anticoagulante e entre 2,5 e 3,5 na trombose recorrente ou nos
doentes com prótese valvular.
O APTT avalia a via intrínseca da cascata da coagulação pelo que testa a pré-
calicreína, o cininogénio de alto peso molecular e os factores XII, XI, IX e VIII. Avalia
também a via comum (factores X, V, II e I). Utiliza-se na detecção de anticorpos lúpicos
e para a monitorização laboratorial da heparina. Neste teste utilizam-se substitutos de
fosfolípidos plaquetários como a cefalina ou a inositina que são tromboplastinas parciais,
incapazes de activar a via extrínseca. O plasma é colocado em presença de um destes
fosfolípidos pró-coagulantes, de um activador por contacto e de cálcio, sendo registado o
tempo que o plasma leva a coagular. A variação normal dos resultados obtidos pelo
Método de Manchester é de 36-48 segundos. O APTT pode estar prolongado em situações
como a deficiência dos factores I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII, pré-calicreína e HMWK,
doença hepática, coagulação intravascular disseminada (DIC) e transfusões sanguíneas
densas, terapêutica com heparina, anticoagulantes orais (doses altas) e trombolíticos. O
APTT pode estar diminuído em qualquer estado de hipercoagulabilidade.
O fibrinogénio é uma glicoproteína presente no plasma numa concentração de 2 a
4g/L. É sintetizado no fígado (1,7 a 5 g/dia) e nos megacariócitos e tem um tempo de
semivida de cerca de 3-5 dias. O doseamento do fibrinogénio é um teste para
determinação quantitativa in vitro dos níveis de fibrinogénio em plasma citratado. A
transformação do fibrinogénio em fibrina é induzida por adição de uma solução de
trombina cálcica em excesso. A concentração de fibrinogénio é directamente proporcional
ao tempo de coagulação. Este equipamento dá o valor de fibrinogénio através de um
cálculo interno do equipamento.
2.1.1.3. ADAMS HA-8160
No nosso LAC, este aparelho está integrado na secção de hematologia, sendo neste
caso utilizado sangue total. No entanto é necessário ter em atenção que em muitos
laboratórios esta análise é feita no Integra.
O HA-8160 (Figura 6) efectua a medição de hemoglobina glicada (HbA1c) e
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Rute Nogueira 28
fornece as informações necessárias para o controlo do açúcar no sangue em pessoas
diabéticas. Pode medir HbA1c, HbA1, HbF estáveis e padrões fraccionados. Desde que o
analisador seja configurado para tal, também pode ser efectuada a medição de HbA2. As
medições efectuadas são precisas uma vez que HbA1c lábil, Hb carbamilato Hb e Hb
acetil são eluídos em separado do pico HbA1c estável.
A hemoglobina glicada é formada por reacções não enzimáticas entre a
hemoglobina e a glucose. A formação desta hemoglobina é irreversível, sendo que a sua
concentração sanguínea depende da vida média dos glóbulos vermelhos (120 dias) e da
concentração sérica de glucose.
O analisador utiliza a cromatografia líquida de alta pressão (HPLC) para o
doseamento destas hemoglobinas, através da utilização de uma coluna composta por
resina de troca iónica de carácter catiónico de fase reversa. As fracções obtidas são lidas
a 415 nm e 500 nm: HbA1c, HbA1, HbF, HbA2 e hemoglobinas variantes. Este aparelho
é capaz de diluir, hemolisar e remover a base de Schiff (resultado da reacção responsável
pela formação da hemoglobina glicada) automaticamente, sendo esta remoção feita com
tetrapolifosfato (pH 6,0) durante 2 minutos a 48ºC. Após 4,2 minutos obtém-se o
cromatograma.
Os valores normais da hemoglobina glicada situam-se entre os 4% e os 6%.
Valores acima de 7% podem estar associados a um maior risco de complicações crónicas.
O uso de pressões elevadas permite uma redução no diâmetro das partículas da
fase estacionária, localizada no interior da coluna cromatográfica, promovendo uma
separação mais eficiente dos componentes da amostra. Essa "miniaturização" das
partículas da coluna permite o uso de colunas menores, menores volumes de amostras e
um gasto menor de fase móvel. Assim sendo, em cromatografia líquida de alta pressão
trabalha-se na faixa dos microlitros (μL).
Figura 6: ADAMS A1C HA-8160 (Retirado de (2))
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Rute Nogueira 29
2.1.1.4.VESMATIC 30/30 PLUS
Este equipamento (Figura 7) utiliza-se na determinação da velocidade de
sedimentação globular, possibilitando a determinação simultânea da velocidade de
sedimentação (VS) em 30 amostras de sangue. Ainda que a determinação seja automática,
os resultados são comparáveis aos resultados obtidos pelo método de Westergren (método
de referência). Os resultados são obtidos em 25 minutos (com homogeneização da
amostra). Caso seja necessária a utilização de ciclos rápidos, o tempo de análise pode ser
reduzido para 10 e 15 minutos para a primeira e segunda hora, respectivamente.
A VS globular é a velocidade a que os eritrócitos sedimentam, em amostra de
sangue anti coagulado, num determinado espaço de tempo. Quando uma amostra de
sangue anti coagulado fica em repouso, os eritrócitos vão-se aproximando uns dos outros
e agregam-se, formando estruturas cilíndricas semelhantes a pilhas de moedas
(Rouleaux). Numa primeira fase a VS é muito lenta (formação dos agregados), na fase
intermédia verifica-se uma sedimentação rápida ("descida" dos empilhamentos) e a fase
final é, novamente, mais lenta (compressão das formações de Rouleaux). Deste modo,
quanto mais comprido for o tubo, mais tempo o segundo período pode durar e maior a VS
pode ser, tal como no método de Westergren.
A amostra para este teste é sangue total anti coagulado com citrato de sódio 1/5.
O teste deve ser efectuado nas 2 horas após a colheita do sangue ou 6 horas se o sangue
for mantido a 4°C.
A VS representa a fase de resposta aguda a um estado inflamatório. Este valor é
medido num período de tempo específico e é bastante influenciado pela concentração de
algumas proteínas, cuja concentração plasmática varia na presença de processos
inflamatórios ou outras patologias. O valor é também afectado por algumas propriedades
dos eritrócitos e por situações de anemia. Valores elevados de VS podem acontecer em
situações como mieloma múltiplo, leucemia, linfomas, cancro da mama e pulmão, artrite
Figura 7: VESMATIC 30/30 Plus (Retirado de (3))
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Rute Nogueira 30
reumatóide, falha pulmonar, metástases no fígado e doenças inflamatórias agudas e
crónicas.
2.1.2. Técnicas manuais
2.1.2.1.Coombs directo e indirecto
O teste de Coombs tem como objectivo identificar a existência de anticorpos que
actuam contra os glóbulos vermelhos no organismo, sendo que estes anticorpos se podem
ligar às hemácias e provocar a sua destruição prematura (hemólise). Este teste pode ser
feito de forma directa ou indirecta.
O Coombs directo vai permitir detectar a existência de anticorpos que estão
ligados à superfície dos glóbulos vermelhos. Esta detecção é possível porque o sistema
imunitário produz anticorpos quando detecta algo que possa vir a ser prejudicial para o
organismo, de modo a tentar destruir esse agente prejudicial. Em casos em que a detecção
que o sistema imunitário faz está incorrecta, os anticorpos produzidos também não vão
ser capazes de destruir o agente prejudicial, o que pode causar graves problemas de saúde.
Por sua vez, em alguns casos, estes anticorpos vão atacar os glóbulos vermelhos,
destruindo-os e levando a uma anemia hemolítica. Este exame é muito útil na presença
de eritroblastose fetal em recém-nascidos ou em casos em que existe incompatibilidade
ABO + Rh.
O Coombs indirecto é útil na identificação de anticorpos circulantes na amostra
de soro, os quais vão actuar contra uma série de glóbulos vermelhos, mas que ainda não
estão ligados. Geralmente, este exame é utilizado em rastreios pré-natal em mulheres
grávidas, na detecção de anticorpos anti-D circulantes em mães Rh negativas
sensibilizadas ou em testes de sangue antes de uma transfusão de sangue.
Um resultado negativo indica que o utente está normal, enquanto um resultado
positivo indica que o utente tem anticorpos que actua contra as próprias células do
organismo, devido a diversas razões.
O teste de Coombs pode ser usado para colaborar numa diversidade de
diagnósticos: anemia hemolítica auto-imune, anemia hemolítica induzida por drogas,
eritroblastose fetal, mononucleose infecciosa, infecção por micoplasma, sífilis, leucemia
linfocítica crónica ou outra doença linfoproliferativa, lúpus eritematoso sistémico, entre
outras.
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Rute Nogueira 31
2.1.2.2. Grupos sanguíneos
Os grupos sanguíneos ABO são normalmente feitos, colocando os eritrócitos com
soro Anti-A e Anti-B. Os anticorpos monoclonais exibem um alto grau de potência,
avidez e especificidade, pelo que se deve ter muito cuidado de modo a evitar
contaminações cruzadas. Os reagentes Anti-A, Anti-B e Anti-AB têm como objectivo a
detecção e identificação in vitro dos grupos sanguíneos humanos ABO, por aglutinação
directa.
2.1.2.3. Factor RhD
O estabelecimento de um grupo correcto RhD é fundamental na execução de
transfusões seguras. Alguns indivíduos exibem uma redução quantitativa na expressão do
seu antigénio RhD e são classificados como D fracos (Du). Outros apresentam uma
variação qualitativa na expressão do antigénio D e são referidos como D parcial.
Indivíduos que sejam D fraco também podem ser D parcial.
Esta técnica destina-se à detecção in vitro e identificação de grupos sanguíneos
RhD humanos em amostras de doentes por aglutinação directa, e em amostras de dadores
e neonatais por teste anti globulina indirecto.
2.1.2.4. Factor Du
Na determinação do Factor Du, prepara-se uma suspensão de 3-5% de glóbulos
vermelhos a testar (lavados 3 a 4 vezes com soro fisiológico), adicionando-se, por
exemplo, 50 µL de glóbulos com 950 µL de soro fisiológico. Em tubo marcado coloca-
se uma gota de reagente anti-D (IgG + IgM) e junta-se uma gota da suspensão preparada.
Depois de bem misturada, incuba-se a 37ºC durante 15 minutos. Lava-se duas vezes com
soro fisiológico e rejeita-se o sobrenadante na última lavagem. Junta-se duas gotas de
globulina anti-humana de Coombs, mistura-se bem e centrifuga-se a 1000 rpm durante
cerca de 20 segundos. Agitando o tubo com cuidado, observa-se macroscopicamente ou
microscopicamente, verificando a existência de aglutinação (Du positivo) ou a ausência
(Du negativo).
2.1.2.5. Teste de Falciformação
A anemia falciforme é uma doença hereditária que se caracteriza pela alteração
dos glóbulos vermelhos, fazendo-os semelhantes a uma foice (falciforme). Tendo a sua
membrana alterada, estas células rompem-se mais facilmente, provocando a anemia.
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Rute Nogueira 32
No Biolabor, existem dois métodos diferentes através dos quais se detecta a
presença de células falciformes: sem ou com agente redutor (metabisulfito de sódio a
2%), com posterior observação ao microscópio.
Para que o teste de falciformação seja positivo é necessário que a concentração de
hemoglobina S seja pelo menos de 20% da hemoglobina total.
2.1.2.6. Tempo de coagulação
O tempo de coagulação é uma técnica manual em que se determina os valores do
tempo de coagulação do doente. Insere-se em dois tubos de hemólise, em vidro calibrado,
sangue total acabado de colher por punção venosa, até cerca de metade da sua altura. Os
tubos são colocados em banho-maria, verticalmente, a 37ºC e, de 2 em 2 minutos, deve
inclinar-se cuidadosamente um dos tubos, verificando se a coagulação já se iniciou. A
partir do 6º minuto, a verificação deve ser feita de minuto a minuto. A partir do momento
em que o processo de coagulação tiver início, começa a inclinar-se o segundo tubo, de 30
em 30 segundos, até que haja a formação completa do coágulo, sendo que o valor
verdadeiro do tempo de coagulação corresponde a este 2º tubo. Consideram-se valores
normais de tempo de coagulação, valores entre 7 e 12 minutos.
2.1.2.7. Tempo de Hemorragia pelo Método de Duke
Para o cálculo do tempo de hemorragia, após desinfecção do lóbulo da orelha do
utente (sem esfregar), faz-se uma ligeira incisão com uma lanceta. Depois, sem se tocar
na orelha com os dedos e sem apertar ou esfregar, absorve-se o sangue que vai escorrendo,
com um pedaço de papel absorvente. O tempo de hemorragia corresponde exactamente
ao tempo que medeia entre o aparecimento da primeira e da última gota de sangue,
considerando-se valores normais de tempo de hemorragia entre 1 e 5 minutos.
2.1.2.8. Retracção do coágulo
No fim da colheita de sangue, deve ser colocada uma quantidade certa de sangue
total (5 mL, por exemplo) num tubo graduado de vidro, seco e bem limpo, e registar a
quantidade. De seguida, colocar o tubo na estufa ou em banho-maria a 37ºC e deixar que
a coagulação se proceda totalmente, sem nunca agitar o tubo. Quando a coagulação estiver
completa, regista-se o volume ocupado pelo coágulo no tubo. O valor da retracção do
coágulo, expresso em percentagem, calcula-se através da seguinte fórmula, considerando-
se como valores normais de retracção do coágulo 48% a 90%.
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Rute Nogueira 33
% Retracção do coágulo = A ×100
B
A corresponde ao volume ocupado pelo coágulo no tubo graduado.
B corresponde ao volume total de sangue total colocado no tubo graduado.
2.1.2.9. Velocidade de sedimentação (micrométodo)
Em situações específicas, como no caso de colheitas em crianças ou em adultos
em que a punção venosa é difícil, pode recorrer-se ao micrométodo para efectuar a
determinação da velocidade de sedimentação. Nesta técnica, deve pipetar-se citrato de
sódio até à primeira marca da pipeta (correspondente ao valor 70 na escala de leitura) e,
de seguida, pipetar o sangue total (em EDTA) até à última marca da pipeta. De modo a
misturar bem o citrato com o sangue, deve escoar-se o conteúdo da pipeta para uma
lâmina e pipetar novamente o sangue citratado até à marca zero na escala de leitura. Sendo
um método manual, demora mais algum tempo que o método automático, devendo
esperar-se uma hora até se efectuar a leitura.
2.1.2.10. Pesquisa de Eosinófilos
O objectivo desta pesquisa é a observação de eosinófilos, em exsudados faríngeos
ou nasais, calculando-se a sua percentagem em relação aos outros glóbulos presentes na
lâmina. A observação é feita com a objectiva de imersão. De acordo com o pedido feito
pelo médico, deve ser preparada uma lâmina para o exsudado faríngeo e duas para o
exsudado nasal (direito e esquerdo). As lâminas obtidas são coradas com os corantes de
hematologia (HEMACOLOR – MERCK). Podem haver situações em que o médico pede
para que a pesquisa seja feita na expectoração, situação em que se devem fazer dois
esfregaços finos da zona mais purulenta da expectoração.
2.1.2.11. Estudo morfológico do sangue periférico
Quando é feito o pedido para o estudo morfológico do sangue periférico, procede-
se à picada da ponta do dedo do utente, com lanceta própria, fazendo-se a recolha de uma
gota de sangue para uma ou mais lâminas, fazendo-se um esfregaço fino. Depois de seca,
a lâmina é corada com os corantes HEMACOLOR – MERCK:
HEMACOLOR Solução 1: 5 x 1 segundo
HEMACOLOR Solução 2: 3 x 1 segundo
HEMACOLOR Solução 3: 6 x 1 segundo
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Rute Nogueira 34
Lavar com solução tampão (diluição de uma ampola de Titrisol pH 7.2
com água destilada até perfazer 1000 mL): 45 segundos
Deixar secar ao ar
De seguida, é feita a observação ao microscópio com a objectiva de imersão e
registam-se as características da série eritrocitária, plaquetária e leucocitária observada.
2.2. Microbiologia
2.2.1. Equipamentos
2.2.1.1.VITEK
O Vitek 2 é um sistema que utiliza cartões com reagentes colorimétricos, os quais
vão ser inoculados com uma suspensão microbiana de cultura pura. O perfil de
desenvolvimento é reproduzido automaticamente.
Os cartões reactivos têm 64 poços, sendo que cada um contém um único substrato
de teste. Com estes substratos são medidas várias actividades metabólicas como a
acidificação, a basificação, hidrólise enzimática e o desenvolvimento em presença de
inibidores. As placas são seladas em ambos os lados com uma película transparente que
impede o contacto entre as diferentes misturas de substrato por microorganismos,
enquanto permite a transmissão de um nível apropriado de oxigénio. Cada cartão tem um
tubo inserido antes da transferência para a inoculação. Todas as placas inseridas no
aparelho têm códigos de barras que contêm informações sobre o tipo de produto, lote,
data de validade e um identificador específico que pode ser ligado com a amostra, quer
antes ou quer depois de carregar o cartão para o sistema.
Existem quatro tipos de cartas de identificação de diferentes tipos de organismos:
ANC: Bactérias anaeróbias e corinebactétias
BCL: Bacilos Gram Positivos formadores de esporos (indústria)
CBC: Corinebactéria (indústria)
GN: Cocos e Bacilos Gram Negativos e Não-fermentadores
GP: Cocos e Bacilos Gram Positivas formadoras de esporos
NH: Neisseria Haemophilus
YST: Leveduras e organismos
Depois de se seleccionar as colónias isoladas de uma placa primária, faz-se uma
subcultura do microorganismo a ser testado em meio gelosado apropriado e incuba-se.
Depois, transfere-se para dentro de um tubo com solução salina estéril um número
suficiente de colónias morfologicamente similares, que correspondam a densidades de
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Rute Nogueira 35
acordo com cada carta. O tempo de espera da suspensão não deve exceder os 30 minutos
antes da inoculação da carta.
A carta ANC baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos
recentemente desenvolvidos. Existem 36 testes bioquímicos que medem a utilização da
fonte de carbono e a actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em
aproximadamente seis horas. A carta de identificação ANC utiliza-se para a identificação
automática das espécies de microrganismos anaeróbios e Corynebacterium de maior
relevância clínica. A suspensão de microrganismo homogénea deve ter uma densidade
equivalente a um padrão McFarland nº 2,70 e 3,30, usando o DensiChek.
A carta de identificação BCL é apenas aplicada à indústria e utiliza-se para a
identificação automatizada de microrganismos aeróbios formadores de endósporos da
família Bacillaceae, sendo que o seu uso clínico não está autorizado. O mesmo acontece
com a carta de identificação CBC que é utilizada na identificação de corinebactérias
(género Corynebacterium e géneros relacionados).
A carta de identificação GN é usada para a identificação automática dos bacilos
gram-negativos fermentadores e não-fermentadores de maior relevância clínica. A carta
GN baseia-se em métodos bioquímicos estabelecidos e substratos recentemente
desenvolvidos, que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e a actividade
enzimática. Existem 47 testes bioquímicos e um poço de controlo negativo. O poço de
Controlo Negativo para a descarboxilase (poço 52) é usado como referência do valor de
base para os poços de teste descarboxilase. Os resultados finais estão disponíveis em
aproximadamente dez horas ou menos. Para a utilização desta carta, a suspensão de
microorganismo tem de ter uma densidade equivalente a um padrão de McFarland nº 0,50
a 0,63, usando o DensiChek.
A carta de identificação GP usa-se na identificação automática dos
microrganismos gram-positivos de maior relevância clínica. A carta GP baseia-se em
métodos bioquímicos estabelecidos e em substratos recentemente desenvolvidos. Existem
43 testes bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a resistência e a
actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em aproximadamente oito
horas ou menos. A suspensão de microorganismo homogénea tem de ter uma densidade
equivalente a um padrão de McFarland nº 0,50 a 0,63, usando o DensiChek.
A carta de identificação NH usa-se na identificação automática dos
microrganismos fastidiosos de maior relevância clínica. A carta NH baseia-se em
métodos bioquímicos e substratos recentemente desenvolvidos, que medem a utilização
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Rute Nogueira 36
da fonte de carbono e a actividade enzimática. Existem 30 testes bioquímicos e os
resultados finais da identificação estão disponíveis em aproximadamente seis horas. A
suspensão de microrganismo homogénea deve ter uma densidade equivalente a um
padrão McFarland nº 1,80 a 2,20, usando um DensiChek.
A carta de identificação YST usa-se na identificação automática das leveduras e
microrganismos similares de maior relevância clínica. A carta YST baseia-se em métodos
bioquímicos estabelecidos e em substratos recentemente desenvolvidos. Existem 46 testes
bioquímicos que medem a utilização da fonte de carbono, a utilização da fonte de
nitrogénio e a actividade enzimática. Os resultados finais estão disponíveis em
aproximadamente dezoito horas. A suspensão de microrganismo homogénea deve ter
uma densidade equivalente a um padrão McFarland nº 1,80 a 2,20, usando o DensiChek.
Na utilização desta carta há que ter em atenção que as espécies filamentosas podem
recolher pequenas quantidades de glucose proveniente dos meios de isolamento, o que
pode levar à ocorrência de falsos positivos. Assim, é de evitar raspar ou esfregar a gelose
durante a preparação da suspensão do microrganismo. No que se refere às estirpes que
não formam rapidamente uma suspensão suave em solução salina, recomenda-se a
utilização de uma zaragatoa húmida para realizar a suspensão, sendo que não se deve
esfregar a superfície da gelose quando estiver a preparar uma suspensão com uma
zaragatoa húmida.
Os Testes de Sensibilidade aos Antibióticos (AST) são utilizados nos testes
automatizados, quantitativos ou qualitativos, da sensibilidade de colónias isoladas da
maior parte dos bacilos aeróbios Gram-negativos de relevância clínica, Staphylococcus
spp., Enterococcus spp., Streptococcus spp., S.pneumoniae e leveduras.
Os testes de sensibilidade são indicados para qualquer microrganismo que
contribua para um processo infeccioso que justifique uma terapia antimicrobiana. Os
testes de sensibilidade são, maioritariamente, aconselhados quando se considera que o
microrganismo encontrado possa pertencer a uma espécie que mostre resistência aos
agentes mais usados. As colónias isoladas de cada tipo de microrganismo que possa
desempenhar um papel patogénico são seleccionadas da placa de gelose e testadas quanto
à sensibilidade. Estes testes são então examinados e a concentração mínima inibitória
(CMI) é determinada. A CMI obtida com um teste de diluição pode indicar ao médico a
concentração de um agente antibiótico necessária no local da infecção para inibir o
microrganismo infeccioso. A CMI é então determinada a partir da concentração mais
baixa em que ocorre inibição do crescimento. Um critério de interpretação (sensível,
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Rute Nogueira 37
intermédio ou resistente) pode então ser atribuído a um resultado da CMI, para ajudar na
orientação da terapêutica. Para alguns antibióticos, como a gentamicina e a
estreptomicina de alto nível, é criado um resultado qualitativo. Os procedimentos padrão
e de referência baseiam-se em testes de sensibilidade que requerem 16 a 24 horas de
incubação para as bactérias e 24 a 48 horas para as leveduras.
2.2.2. Técnicas manuais
2.2.2.1. Coloração de Gram
A coloração de Gram permite diferenciar as bactérias em dois grandes grupos,
tendo por base a sua reactividade aos corantes de Gram: Gram-Positivo e Gram-
Negativo. Revela grande importância clínica, uma vez que permite obter informação
valiosa sobre as bactérias que causam determinada doença e, ao mesmo tempo, a
reactividade ao Gram ajuda também a dirigir e seleccionar os testes necessários à
identificação das bactérias.
2.2.2.2. Coloração de Ziehl (modificada)
A coloração de Ziehl modificada é uma coloração de bactérias mais agressiva que
a coloração de Gram e é utilizada com bactérias que coram mal com o Gram. O
fundamento desta técnica de coloração é a álcool-ácido-resistência das bactérias, depois
da exposição a um corante básico (por exemplo, micobactérias). Esta característica de
álcool-ácido-resistência deve-se à existência de lípidos estruturais, como o ácido
micólico, que sendo bastante longos e com grande número de ligações cruzadas,
complexam-se facilmente com os corantes básicos, resistindo à acção removedora por
parte dos ácidos.
2.2.2.3. Coloração de azul-de-metileno
A coloração de azul-de-metileno tem como objectivo realizar o exame a fresco
das fezes para pesquisa de leucócitos e eritrócitos.
2.2.2.4. BK directo e BK cultural
As amostras mais utilizadas neste procedimento são a expectoração e a urina
asséptica. Numa primeira parte, as amostras utilizadas devem ser descontaminadas. As
expectorações que forem consideradas “saliva” podem ser aceites para o exame mico-
bacteriológico. Se for uma urina, apenas os sedimentos devem ser utilizados. A
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Rute Nogueira 38
descontaminação das amostras é feita segundo o Kit respectivo. Deve ser adicionado o
tampão de neutralização para que se atinja um pH próximo de 6,8 e a centrifugação deve
ser feita em tubos de Falcon. Antes de destapar os tubos, devem aguardar-se alguns
minutos, decantando depois o sobrenadante para um contentor com lixívia a 5% preparada
no dia. O sedimento obtido é usado para a preparação de lâminas para coloração ou para
a sua cultura.
BK directo (Tabela 1): Preparam-se os esfregaços, em duplicado e em lâminas
novas, com uma gota de albumina bovina, para facilitar a adesão. As lâminas não devem
ser expostas à luz solar ou UV. Depois de secas e fixadas com o bico de Bunsen, são
coradas pela coloração de Ziehl-Neelsen modificado (bacilos álcool-ácido resistentes
corados de vermelho). Depois utiliza-se fucsina filtrada e evita-se a secagem do esfregaço
durante a coloração com fucsina, obedecendo aos tempos recomendados. O exame de
cada esfregaço deve ser feito durante 5-15 min e 100 campos antes de dar o resultado
negativo. O resultado positivo deve ser dado como “Presença de BAAR“ e em +++.
Tabela 1: Resultados possíveis do BK directo
Resultado ZN (1000x)
Não se observaram BAAR 0
Número exacto de BAAR 1-9/ 100 Campos
+ 10-99/ 100 Campos
++ 1-10/ Campo
+++ >10/ Campo
BK cultural (Tabela 2): O sedimento obtido após tratamento da amostra é semeado
(cerca de 200 µl) em meio de Lowenstein-Jensen e incubado a 37ºC durante 60 dias. Os
tubos devem estar inclinados durante 3-4 dias a cobrir a superfície, colocando-se depois
na vertical. A incubação deve ser com 10% de CO2. Os tubos devem ser examinados 1 a
2 vezes/semana. Se for detectado crescimento, realiza-se um esfregaço para confirmação
de BAAR. Se o for crescimento positivo, deve-se quantificar as colónias:
Tabela 2: Resultados possíveis para o BK cultural
Resultado Número de colónias
+ < 10 colónias
++ 10-100 colónias
+++ > 100 colónias
++++ Incontáveis
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Rute Nogueira 39
2.2.2.5. Marcação de placas dos meios de cultura
A marcação de placas é um procedimento tão ou mais importante que todos os
restantes procedimentos, uma vez que um bom resultado obtido depende de uma boa
identificação das placas, de modo a não gerar erros nem trocas de resultados.
Todas as placas com meios de cultura para exames bacteriológicos são marcadas,
no verso, com o número do tubo, o nome do utente, a data da sementeira, o produto
semeado e o número da amostra, no caso de se tratarem de amostras múltiplas. Por outro
lado, todas as placas com meios de cultura que tenham sido preparados e distribuídos no
laboratório devem conter sempre o nome do meio de cultura e a respectiva data de
validade.
2.2.2.6. Exsudado vaginal e uretral
A partir do exsudado vaginal podem ser feitos dois tipos de exames: o exame
directo e o exame cultural. O exame directo engloba o exame citológico, o exame
parasitológico e a coloração de Gram. Por outro lado, no exame cultural utilizam-se os
meios de gelose de sangue, gelose de chocolate (atmosfera CO2) e Sabouraud.
Para a identificação das estirpes utilizam-se testes auxiliares de identificação e/ou
as cartas de identificação do aparelho VITEK. Na identificação de leveduras efectua-se a
prova de filamentação.
Existem também alguns testes específicos para este exsudado. O teste do
Mycoplasma permite a cultura, identificação, numeração e testes de susceptibilidade aos
antibióticos dos micoplasmas urogenitais (Mycoplasma hominis e Ureaplasma
urealyticum). O teste da Chlamydia permite a pesquisa directa da Chlamydia trachomatis
no exsudado, através do teste rápido imunocromatográfico para detecção do antigénio.
2.2.2.7. Pesquisa de Treponema
A colheita para esta pesquisa é efectuada ao nível das lesões. A observação ao
microscópio é feita juntando uma gota de tinta-da-china. Os treponemas aparecem móveis
e com espirais regulares, sendo o resultado dado como positivo ou negativo.
2.2.2.8. Pesquisa de Leishmania
Para esta pesquisa são feitos dois esfregaços finos de sangue periférico, em
lâminas de vidro, as quais são coradas com coloração HEMACOLOR. A observação é
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feita ao microscópio com objectiva de imersão, de forma a detectar a eventual presença
do parasita.
2.2.2.9. Pesquisa de estreptococos do grupo B
O produto a analisar é colhido com zaragatoa de Dacron e semeado em meio
gelosado de isolamento e em identificação de estreptococos do grupo B (Meio Granada)
ou para meio de cultura de gelose de sangue. O meio é incubado durante 24 horas em
anaerobiose e, no caso de não serem observadas colónias suspeitas, incubar mais 24 horas.
As placas semeadas lêem-se do seguinte modo:
a. Meio de Granada: Qualquer intensidade de pigmentação laranja das
colónias é considerada como resultado Positivo.
b. Meio de gelose de sangue: No caso de suspeita da presença de
estreptococos (colónias isoladas, Gram +, catalase negativa) proceder à
sua identificação no VITEK.
Também é possível colocar o produto num caldo de enriquecimento selectivo
(Todd-Hewit) e depois efectuar uma repicagem para um meio de isolamento e
identificação de estreptococos do grupo B.
2.2.2.10. Pesquisa de Plasmodium
Com uma lanceta própria picar a ponta do dedo do utente e recolher uma gota de
sangue, pressionando um pouco se necessário, para uma ou mais lâminas, fazendo um
esfregaço fino. Depois de secas, corar com a coloração HEMACOLOR e observar ao
microscópio com a objectiva de imersão (40x e 100x), verificando a presença ou ausência
de Plasmodium. Caso se observe a presença do parasita, sempre que possível, este deve
ser classificado com base nas suas características morfológicas.
Em situações em que é pedida a técnica da gota espessa devem ser colocadas
duas gotas de sangue sem anticoagulante em cada lâmina e espalhar com movimentos
circulares durante 1-2 minutos para desfibrinizar o sangue. Deixar secar bem na estufa a
37ºC durante 1 hora ou 24 horas à temperatura ambiente. Após a secagem deve-se
deshemoglobinizar a gota espessa com água destilada e proceder à coloração referida no
caso anterior.
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2.2.2.11. Pesquisa de Gonococos
O produto colhido é semeado em gelose de chocolate e incubado na estufa a
37ºC, durante 48 h, em atmosfera de CO2. Depois, é feita a observação das placas e
identificação das colónias suspeitas (diplococos Gram-, catalase +, oxidase +), dando o
resultado como positivo ou negativo.
2.2.2.12. Pesquisa de estreptococos beta-hemolíticos
A sementeira é feita em gelose de sangue e incubada a 37ºC durante 24 a 48
horas e incubada na estufa a 37ºC, durante 24 a 48 horas. Pela observação da placa é
possível detectar a presença ou ausência de hemólise do tipo beta. Caso esta hemólise
esteja presente confirmar a presença de Estreptococos Beta-Hemolíticos (Gram +,
cadeias, catalase negativa). O resultado é dado como Positivo ou Negativo.
2.2.2.13. Expectoração
O exame directo é feito pela coloração de Gram e pela coloração de Ziehl. O
exame cultural faz-se em meio de gelose de sangue (24 a 48 horas, 37ºC), gelose de
chocolate (48 horas em atmosfera de CO2, a 37ºC), Sabouraud (quando requisitado exame
micológico) e Meio Löwenstein-Jensen (quando requisitado exame cultural de BK).
Na identificação das estirpes, são utilizadas as cartas de identificação do VITEK
e posteriormente fazem-se as cartas de susceptibilidade (antibiogramas) também no
mesmo aparelho.
2.2.2.14. Hemoculturas
Na colheita: Desinfectar a borracha do frasco de hemocultura com álcool a 70%,
desinfectar a área a puncionar em dois tempos (Limpar com álcool a 70% e desinfectar a
pele com betadine), não voltar a palpar a veia, colher cerca de 5 a 10 mL de sangue,
inocular o frasco com a máxima assepsia possível. Não é necessário mudar de agulha
antes de introduzir o sangue no frasco. Quando se realiza a colheita para outros exames
analíticos em simultâneo, o frasco de hemocultura tem de ser o primeiro a ser inoculado,
desinfectar novamente a tampa do frasco com álcool a 70%. O momento ideal da colheita
é no estado de “calafrio” (antes da subida da temperatura).
No exame cultural, o sangue recolhido é inoculado no meio de cultura Hemoline
Performance Diphasique que vai a incubar na estufa a 37ºC durante o tempo necessário
à conclusão da análise.
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Repicagem: Columbia + 5% sangue de carneiro, 37ºC, 24 a 48 horas e
Chocolate + Polivitex, 37ºC , 48 horas em atmosfera de CO2 (GENBOX CO2).
Para a identificação da estirpe, faz-se a coloração de Gram das colónias isoladas,
testes auxiliares de identificação (ID color Catalase) e eventualmente Cartas de
identificação do sistema automatizado VITEK. Depois, efectuam-se cartas de
susceptibilidade do sistema automatizado VITEK.
2.2.2.15. Uroculturas
No exame directo, faz-se a observação microscópica do sedimento urinário, para
avaliação dos elementos presentes (células epiteliais, leucócitos, piócitos, eritrócitos,
cristais, granulações, bactérias, leveduras e, eventualmente, elementos parasitários), a
coloração de Gram (se leucocitúria e/ou bactériúria) e a coloração de Ziehl (quando
pedido ou se existe discrepância citobacteriológica).
No exame cultural, faz-se a inoculação da urina com ansa calibrada de 10 mL,
para contagem de colónias, em meio selectivo para cultivo de urinas (meio CPS ID,
CLED ou outro) e a incubação na estufa a 37ºC durante 18 a 24 horas. O meio Columbia
+ 5% sangue de carneiro pode ser semeado sempre que haja pedido específico que o
justifique, fazendo-se incubação na estufa a 37ºC durante 24 a 48 horas. O meio
Lowenstein-Jensen é utilizado sempre que haja pedido de exame cultural de BAAR ou de
BK. O meio Sabouraud-Gentamicina-Cloranfenicol utiliza-se quando é pedido exame
micológico.
A identificação das estirpes faz-se através de meio de cultura CPS ID e é possível
a identificação directa ou presuntiva de algumas estirpes bacterianas:
o Colónias rosa (-glucuronidase +) e Indole (+) = E. coli
o Colónias castanho claro /escuro, TDA (+) e Indole (-) = Proteus mirabilis
o Colónias castanho claro /escuro, TDA (+) e Indole (+) = Proteus
indolagene, Monganella, Providencia
o Colónias azul turquesa (-glucosidase +), cocos = Enterococcus
No meio Columbia + 5% sangue de carneiro, com auxílio da coloração de Gram
e do teste auxiliar de identificação ID color catalase pode-se orientar a identificação do
seguinte modo:
o Bacilos Gram (+), catalase (+)..................................Corinebacterium ?
o Bacilos Gram (+), catalase (+) , com β-hemólise às 48 h ...Listeria ?
o Bacilos Gram (+), catalase (-) ........................................... Lactobacilos ?
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o Cocos Gram (+), catalase (-) ........................................... Streptococcus ?
o Cocos Gram (+), catalase (+).........................................Staphylococcus ?
Através dos testes auxiliares de identificação ou das cartas de identificação do
sistema automático VITEK, é possível identificar correctamente todas as estirpes que não
tenham sido identificadas directamente a partir do meio de cultura CPS ID. Depois de
tudo isto, fazem-se cartas de susceptibilidade no VITEK, antifungigrama do sistema
automatizado e eventualmente antibiograma manual em galerias.
2.2.2.16. Coprocultura
É o exame bacteriológico das fezes e o seu pedido engloba a pesquisa de
Salmonella, Shigella e Campylobacter, excepto em pedidos específicos de
Staphylococcus.
No exame directo, faz-se exame a fresco, com ou sem Azul-de-metileno, para
pesquisa de eritrócitos e leucócitos e coloração de Gram (quando as fezes são diarreicas),
para avaliação da riqueza da flora intestinal, o equilíbrio ou desequilíbrio entre as
proporções de germes Gram (+) e Gram (-).
No exame cultural, as fezes líquidas são usadas directamente para o exame a
fresco e para a sementeira. As fezes sólidas são suspensas em soro fisiológico, antes de
proceder ao exame directo e à sementeira. As fezes em meio de transporte devem ser
semeadas directamente do meio. Os meios de cultura usados para a sementeira são SS ou
SM2/HEKT, Campylosel (Gelose Columbia 5% sangue em substituição do Campylosel),
Rappaport (com posterior passagem para o meio de SS às 24 horas) e Chapman ou
Columbia (se pedido específico para Staphylococcus). As amostras devem ser semeadas
até 1 hora após a colheita ou, caso isto não seja possível, devem estar em meio de
transporte à temperatura ambiente (devido ao Campylobacter).
Os meios de cultura são colocados a 37ºC durante 24 a 48 horas. O meio de
Campylosel deve ser colocado de imediato em atmosfera de CO2, durante 48 a 72 horas.
Na identificação das estirpes utilizam-se os testes auxiliares e cartas de
identificação do VITEK, fazendo-se também os respectivos antibiogramas.
2.2.2.17. Exames bacteriológicos de exsudados
O exame directo é feito com a coloração de Gram. Para o exame cultural semeia-
se em meio de gelose de sangue (24 a 48 horas), em meio de chocolate (48 horas em
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atmosfera de CO2) e em meio de Sabouraud (quando requisitado exame micológico). No
exsudado nasal também pode ser utilizado o meio de Chapman. As estirpes são
identificadas a partir de cartas de identificação do VITEK, o qual também efectua o
respectivo antibiograma.
2.2.2.18. Exames micológicos
No caso dos exsudados, a sementeira é feita em meio de Gelose Sabouraud
Gentaminicina Cloranfenicol (G.S.G.C.) efectuada directamente com a zaragatoa
utilizada na colheita das amostras (incubação a 35ºC durante 72 horas).
No caso das fezes, se forem fezes moldadas, suspender aproximadamente 8 mg
de fezes com 1 mL de soro fisiológico e inocular por inundação, cerca de 125 µl da
suspensão em meio de G.S.G.C. Se forem fezes líquidas, diluir 1 gota de fezes em 4 mL
de soro fisiológico (25 mg/ 4mL) e inocular por inundação, 200 µl da suspensão em meio
de G.S.G.C. A incubação é de igual modo feita a 37ºC durante 72 horas. A contagem de
colónias faz-se através do seguinte cálculo: Nº de colónias na placa de Petri x 103 UFC/
g de fezes.
Nas faneras (pêlos, unhas e pele), a sementeira faz-se directamente do produto
no meio de G.S.G.C, em duplicado (duas placas de Petri ou uma placa de Petri e um tubo).
Um dos meios (Placa de Petri) é colocado a 35ºC durante 72 horas, para identificação de
leveduras e fungos de crescimento rápido e o outro (Placa de Petri ou tubo) colocado à
temperatura ambiente durante 4 a 5 semanas, para identificação de Dermatófitos.
Nas micoses profundas (expectoração, pus, etc.), a sementeira da amostra é feita
directamente, com auxílio de ansa, em meio de G.S.G.C. em duplicado, incubando-se
uma placa a 35ºC e outra à temperatura ambiente, durante 72 horas.
Nas urinas, faz-se a sementeira de 10 µL de urina sem centrifugação em meio de
G.S.G.C. e incuba-se a 35ºC durante 72 horas.
2.2.2.19. Exame parasitológico
Nas expectorações, uma pequena parte da expectoração, previamente
homogeneizada, é observada entre lâmina e lamela, com ou sem adição de uma gota de
Lugol. Podem-se encontrar parasitas como: Entamoeba histolytica, Pneumocystus carini,
Echinococcus granulosus, Ascaris lumbricóides, Strongyloides stercolaris, Ancylostoma
duodenale/Necator americanus, Schistosoma, Fasciola hepática e Paragonimus
westermani.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 45
O exame parasitológico de uma urina é efectuado no sedimento que resulta da
sua centrifugação. A observação microscópica pode ser feita com ou sem adição de uma
gota de Lugol (o movimento das Trichomonas vaginalis é maior sem o Lugol). Depois,
pode corar-se lâminas com a coloração HEMACOLOR para melhor apreciação da
morfologia dos parasitas eventualmente presentes, os quais podem ser Trichomonas
vaginalis, Schistosoma haematobium (urina recolhida após o utente ter corrido e saltado
durante algum tempo), Microfilárias e Enterobius vermicularis (oxiuros).
No caso de exsudados vaginais e uretrais, o exame parasitológico consiste na
observação microscópica a fresco.
No caso do sangue, exsudados nasais, faríngeos, oculares, auriculares, o exame
parasitológico consiste na observação microscópica, com objectiva de imersão, de
esfregaços de sangue corados pelo HEMACOLOR.
No exame parasitológico das fezes (pesquisa de ovos, quistos e parasitas), devem
observar-se atentamente as amostras de fezes, para detectar a possível presença de
parasitas visíveis a olho nu, que possam ter sido eliminados parcial ou totalmente
(oxiuros, Ascaris lumbricóides, anéis de ténia...). Depois, retira-se uma pequena porção
de fezes (de vários locais, caso as fezes sejam moldadas), para um tubo de vidro e
adiciona-se água comum ou soro fisiológico. Após a obtenção de uma suspensão, deixa-
se repousar durante 5 minutos e muda-se para um outro tubo cerca de 3 quartos da
suspensão, (de preferência para um tubo com fundo cónico), adicionando umas gotas de
ácido acético e um pouco de éter e tapar o tubo. Depois da centrifugação, rejeita-se todo
o sobrenadante e agita-se bem o sedimento, com posterior observação ao microscópio
directamente ou após a adição de Lugol. Para a pesquisa dos oocistos do Cryptosporidium
nas fezes devem ser feitos esfregaços finos das fezes que são corados pela coloração de
Ziehl. Estes oocistos aparecem corados de vermelho vivo, quando observados ao
microscópio com a objectiva de imersão.
2.3. Imunologia
2.3.1. Equipamentos
2.3.1.1. Cobas e411 Roche
O cobas e411 é um aparelho de alta fiabilidade, que utiliza a excelência analítica
da electroquimioluminescência, originando um excelente sistema de imunoensaios. Tem
disponíveis dezoito parâmetros de imunologia, oferecendo uma elevada disponibilidade
e tempos de resposta de 9 a 18 minutos. As células de leitura utilizam a amplificação de
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 46
sinal para a determinação de concentrações muito reduzidas de analito, eliminando assim
o número de repetições e permitindo resultados de qualidade à primeira.
É um equipamento multifacetado, que automatiza os imunoensaios dos
laboratórios. Com um amplo menu de testes, permite executar parâmetros de rotina e
especiais na mesma plataforma analítica. No caso do nosso LAC, não usufruímos de todas
as opções deste aparelho, sendo apenas utilizadas as de maior relevância clínica para a
população em causa e também as economicamente mais rentáveis:
Tiróide: TSH, T3, T4, FT3, FT4, Anti-Tg, Anti-TPO.
Hormonas de Fertilidade: ACTH, Cortisol, Estradiol, FSH, -HCG, LH,
Progesterona, Prolactina, Testosterona.
Marcadores tumorais: AFP, CA 125II, CA15-3, CA 19-9, CEA, PSA livre, PSA
total.
Anemia: Ferritina, Ácido Fólico, Vitamina B12
Alergias: IgE.
Hepatites: Anti HBc IgM, Anti HBs, HBsAg, Anti HCV.
Retrovírus: HIV combi.
TORCH: Rubeola IgG, Rubeola IgM, Toxoplasma IgG, Toxoplasma IgM, CMV
IgG, CMV IgM.
Este equipamento não possui carry over, uma vez que utiliza pontas e cuvetes
descartáveis para a execução de todos os ensaios. Existe ainda a possibilidade de
calibração automática após a violação do controlo de qualidade, o que oferece confiança
a cada resultado.
O manuseamento fácil e seguro dos reagentes é outra das vantagens deste
equipamento, uma vez que se encontram fechados durante a operação, diminuindo assim
a exposição a agentes externos. Por outro lado, esta característica permite aumentar a
estabilidade a bordo dos reagentes e das calibrações.
2.3.1.2. UNICAP (PHADIA 100)
Este equipamento é o mais pequeno dos Phadia Laboratory Systems,
proporcionando a máxima flexibilidade a pequenos laboratórios.
O Phadia 100 foi concebido para a realização de testes de alergia e auto-
imunidade, bem como para a entrega de resultados de testes clinicamente relevantes. Tem
um processamento automatizado de ensaios EliA e ImmunoCAP, um painel de alergénios
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Rute Nogueira 47
para a detecção de sensibilizações a 650 alergénios e 90 componentes alergénicos. Tem
um menu de auto-imunidade abrangente que cobre os marcadores de auto-imunidade
clinicamente relevantes para a avaliação das doenças auto-imunes mais comuns, como é
o caso da artrite reumatóide, da doença celíaca e das doenças do tecido conjuntivo. A
possibilidade de medir todos os testes a partir de uma amostra facilita a sua utilização e
rentabilidade.
Tem um rendimento de 48 resultados num único ensaio, fazendo o processamento
em lotes e permitindo guardar as curvas de calibração durante 28 dias. Caso sejam
necessárias, o aparelho faz automaticamente as diluições, de forma interna. Pode
funcionar como unidade autónoma ou ser integrado num grupo.
A fiabilidade do aparelho, baseada na excelente consistência ao longo do tempo e
entre países, sistemas, laboratórios e utilizadores, funciona como um ponto a favor da
utilização e credibilidade deste aparelho.
2.3.1.3. HYDRASIS
O Hydrasis é um sistema analítico multiparamétrico e semiautomático. Ainda que
o sistema funcione de modo integrado, existem módulos que podem funcionar de forma
independente. O aparelho comtempla vários programas de migração (fase de aplicação,
migração e secagem) e de coloração (fase de coloração, descoloração e secagem) para
técnicas de electroforese e imunofixação. Deste modo, é neste aparelho que se realizam
as técnicas de electroforese e de imunofixação em suporte de gel de agarose, a partir de
amostras biológicas (no nosso caso, de soro).
A electroforese baseia-se na diferença de mobilidade que as moléculas proteicas
possuem, de acordo com as suas cargas eléctricas, tamanho e forma. Depois, em meio
alcalino tamponado e num suporte poroso de gel de agarose são submetidas a um campo
eléctrico de corrente contínua durante um determinado intervalo de tempo, originando
um electroforetograma com diferentes fracções proteicas, as quais vão migrando do
cátodo para o ânodo.
A imunoprecipitação e a fixação são efectuadas com anti-soros de especificidades
diferentes. Após a imunofixação, as proteínas são reveladas por um corante específico. O
resultado semi-quantitativo obtém-se por densitometria (percentagem relativa de cada um
das fracções proteicas), como ocorre na realização de imunoelectroforeses.
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2.3.1.4.VIDAS
O VIDAS (Vitek Immuno Diagnostic Assay System) é um sistema
multiparamétrico de imunoanálise e de detecção de sondas nucleicas. Compreende um
módulo analítico, composto por cinco secções independentes, podendo cada uma realizar
seis testes de protocolos compatíveis. Os reagentes são apresentados sob a forma de
barretes de 60 ou 30 testes unitários com os cones e as barretes, fazendo-se acompanhar
dos consumíveis necessários (calibrador, controlos e diluente). A calibração é fornecida
numa ficha de especificações (cartão MLE).
Este equipamento permite a realização em série ou teste a teste das análises de
serologia, imunoquímica, detecção de antigénios, microbiologia industrial e detecção de
reacções de amplificação (VIDAS PROBE). Tem como vantagens a qualidade dos
resultados, a flexibilidade de utilização e a rapidez de execução das análises.
No aparelho VIDAS, a técnica utilizada, aplicável a numerosos parâmetros, é a
combinação do método ELISA com uma leitura final em fluorescência azul (ELFA –
Enzyme Linked Fluorescent Assay). A enzima utilizada neste aparelho é a fosfatase
alcalina. O substrato é o 4-metil umbeliferil fosfato (4-MUP) que é hidrolisado em 4-
metil umbeliferona (4-MU). A umbeliferona tem a propriedade de reemitir a luz a 450
nm após excitação a 370 nm. A temperatura de análise é de 37ºC no interior do aparelho.
Cada aparelho tem duas sondas térmicas de controlo por secção, para conservar a
temperatura constante.
A barrete simples do VIDAS (única utilizada no nosso laboratório) contém dez
poços. O primeiro poço é destinado a receber a amostra. Os oito poços intermédios
contêm os reagentes necessários à análise (conjugado, diluente, tampão de lavagem). O
último poço é uma cuvete de leitura na qual se mede a fluorescência do substrato. Uma
lingueta pequena permite posicionar devidamente a barrete na calha. O cone é o suporte
sólido da reacção imunológica. As suas faces internas são geralmente cobertas com
anticorpos ou antigénios consoante o parâmetro a dosear. É um suporte de pipetagem das
amostras e dos reagentes. Esse suporte permite, por conseguinte, que não haja nenhum
contacto entre fluído e aparelho. Assim a manutenção é fácil, porque não existe nenhum
tubo, seringa ou braço.
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Rute Nogueira 49
2.3.2. Técnicas manuais
2.3.2.1. Crioglobulinas
As crioglobulinas são proteínas anormais no sangue (anticorpos). Estas proteínas
anormais tornam-se espessas e sólidas a temperaturas frias e, quando engrossam, ficam
semelhantes a um gel, podendo levar ao bloqueio de qualquer vaso sanguíneo. As
complicações vão desde erupções cutâneas à insuficiência renal. A existência de um
precipitado leva ao envio para o laboratório externo, neste caso, o Laboratório Dr.
Joaquim Chaves.
2.3.2.2.Reacções de Widal, Weil Felix e Huddleson
A reacção de Widal é um teste serológico que permite detectar a infecção por
bactérias do género Salmonella, em geral pedido para indivíduos que apresentam
sintomas de febre tifóide ou de brucelose. O teste consiste em verificar a aglutinação de
anticorpos numa amostra de soro após a adição dos antigénios Typho O, Typho H,
Paratypho A-H e Paratypho B-H.
A reacção de Weil Felix é um teste serológico utilizado no diagnóstico de
infecções provocadas por Rickettsias. Os antigénios utilizados são Proteus OX2, OX19,
OXK.
A reacção de Huddleson é um teste serológico que permite fazer o diagnóstico da
brucelose. O antigénio utilizado é Brucella abortus.
O procedimento para todas estas reacções é semelhante, diferindo apenas os
antigénios utilizados. Inicialmente, utilizam-se 40 µL do soro do doente, correspondente
a um título de 1/40. Depois de 1 minuto de agitação, observa-se a formação de
aglutinação. Se não houver aglutinação, utiliza-se 80 µL de soro, correspondente a um
título de 1/20. Se houver aglutinação com o título 1/40, procede-se a mais diluições,
colocando 20, 10, 5 µL de soro na placa. O título vai corresponder à diluição do último
círculo onde se observar aglutinações de 1/80, 1/160, 1/360, respectivamente.
2.3.2.3. Reacção de Wright
A reacção de Wright é um teste utilizado na detecção da Brucella, à semelhança
do teste de Huddleson, tendo um fundamento teórico diferente: preparam-se 8 tubos de
plástico num suporte; dispensa-se 1,9 mL de soro fisiológico no primeiro tubo e 1 mL nos
restantes; dispensar 100 µL do soro do doente no primeiro tubo e agitar bem, pipetar 1
mL do primeiro tubo e dispensar no segundo tubo, agitando bem; continuar este
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Rute Nogueira 50
procedimento até ao sétimo tubo e rejeitar 1 mL deste tubo; no oitavo tubo manter só
solução salina como controlo; de seguida, agitar bem o reagente Brucella, adicionar uma
gota em cada tubo e agitar bem, incubando a 37ºC durante 24 horas. O tubo de controlo
não deve ter aglutinação. O título corresponderá ao tubo com aglutinação. Os tubos de 1
a 7 contêm soro na diluição de 1/20 e 1/1280.
2.3.2.4. Reacção VDRL
A reacção de VDRL (Venereal Disease Research Laboratory) é um exame que
permite diagnosticar a sífilis, doença de transmissão sexual, servindo também para
acompanhar a doença em doentes que sejam portadores.
Em casos em que o resultado é reactivo, pode não significar que a pessoa tem
sífilis, sendo o resultado positivo por causa de doenças como a brucelose, a hepatite,
malária, asma, tuberculose, cancro, entre outras, originando um resultado falso-positivo.
No que diz respeito à gravidez, o teste deve ser realizado no início do pré-natal,
repetindo-se no segundo trimestre, mesmo que o primeiro teste realizado tenha sido não
reactivo. Em resultados reactivos durante a gravidez, o tratamento deve ser aplicado de
imediato e seguida a evolução, garantindo a eliminação total da bactéria causadora da
sífilis, pois a mãe pode transmitir a doença ao bebé, provocando-lhe problemas
neurológicos. O tratamento é feito com penicilina.
2.4. Bioquímica
2.4.1. Equipamentos
2.4.1.1. Clinitek Atlas Automated Urine Chemistry Analyser
O Clinitek Atlas é um analisador automático de amostras de urina, que combina
os princípios de espectroscopia por refletância com um formato de reagentes que permite
disponibilizar resultados qualitativos e semi-quantitativos. O aparelho permite efectuar o
exame físico (pH e densidade) e o exame bioquímico (determinação qualitativa ou semi-
quantitativa das proteínas, glucose, corpos cetónicos, pigmentos biliares, hemoglobina,
urobilinogénio, nitritos e esterease leucocitária). O equipamento utiliza um rolo reagente
que é composto por um rolo de plástico ao qual estão presas 490 tiras reagentes. Cada tira
contém nove zonas reactivas independentes, impregnadas de substâncias químicas para a
análise de substâncias presentes na urina pela mudança da cor do reactivo. O equipamento
analisa, a comprimentos de onda definidos, a cor e intensidade da luz reflectida por uma
zona reactiva após a reacção. Adicionalmente, cada tira tem uma zona não reactiva
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Rute Nogueira 51
utilizada para a determinação da cor da amostra. O equipamento determina também a
densidade da amostra utilizando o método do índice refractário e a turvação pela medição
da transmissão e dispersão da luz que passa pela amostra. No fim da análise completa
pelo aparelho, surge um alarme com as amostras de urina que têm algum parâmetro
alterado. Neste momento, essas amostras são centrifugadas e é feita a respectiva análise
do sedimento urinário. Pode, em alguns casos, ser necessário confirmar através de tiras
teste alguns parâmetros como o pH, as proteínas ou a glucose.
2.4.1.2. Cobas Integra Plus 400
O Cobas Integra 400 plus é totalmente automatizado e analisador de múltiplos
analitos. Este sistema utiliza quatro tecnologias diferentes: absorção de fotometria,
imunoteste de polarização fluorescente, imuno turbidimetria e potenciometria. Devido às
múltiplas tecnologias empregadas, o sistema pode acomodar um amplo menu com mais
de 100 tipos de ensaios a bordo.
São utilizados sensores de pressão altamente sensíveis que detectam uma
pipetagem incorrecta, mesmo com um volume de amostra de 2 µL. Tem um sistema que
detecta amostras coaguladas, o que melhora a eficácia do aparelho e dos resultados
obtidos. Os sistemas de lavagem de alta pressão foram optimizados para remover
completamente os restos de coágulos da pipeta, evitando qualquer interrupção do fluxo
de trabalho.
O desenho das cassetes impede a evaporação e a degradação dos reagentes,
assegurando a estabilidade a longo prazo e intervalos de calibração longos.
O software verifica automaticamente as necessidades de manutenção e alerta o
utilizador quando é necessária alguma acção.
O aparelho efectua quase todas as análises bioquímicas realizadas no laboratório
ALP, AST, GGT, lípase, bilirrubina total e directa, cálcio, LDH, colesterol LDL, HDL e
total, triglicéridos, magnésio, fósforo, amílase, ferro, transferrina, CK, PCR, PCR ultra
sensível, TASO, IgG, IgA, IgM, C3, C4, Microalbuminúria na urina, Clearance de
Creatinina.
2.4.2. Técnicas manuais
2.4.2.1.Determinação do grau de digestão das fezes
No exame macroscópico, deve observar-se:
A forma (moldada ou não moldada).
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Rute Nogueira 52
A consistência (dura, média, mole, líquida...).
A cor, externa e internamente (quando a consistência o permita).
A presença de muco, de sangue, de pus, de parasitas, de restos de alimentos,
restos de medicamentos, matéria gorda, etc..
No exame microscópico, deve-se preparar uma suspensão de fezes, misturando
com soro fisiológico (excepto se estas tiverem consistência líquida) e colocar uma gota
desta suspensão em três lâminas. Na primeira, colocar a lamela e não adicionar qualquer
reagente. Na segunda adicionar uma gota de Lugol bastante concentrado e colocar a
lamela (o amido cru cora de azul-violeta escuro, o amido cozido cora de avermelhado e a
flora iodófila cora de azul). Na terceira, adicionar uma gota de uma solução de Sudan III
(as gorduras neutras coram de vermelho alaranjado e os sabões e ácidos gordos coram de
rosa a negro).
Estas lâminas permitem observar:
Proteínas (normalmente apenas se deve encontrar uma pequena quantidade de
fibras musculares, bem digeridas, não devendo encontrar-se tecido conjuntivo
(fibras musculares não digeridas);
Gorduras (normalmente 92 a 96 % da matéria gorda ingerida é utilizada pelo
organismo, pelo que não devemos encontrar nas fezes senão pequenas
quantidades de glóbulos de gordura neutra, agulhas de ácidos gordos ou sabões);
Hidratos de carbono (normalmente não se deve observar a presença de amido
cozido nas fezes. A celulose digerível deve aparecer em muito pequena
quantidade, enquanto a quantidade de celulose não digerível depende do tipo de
alimentação);
Cristais (oxalato de cálcio);
Elementos de origem intestinal
o Muco (que geralmente se vê a olho nu)
o Glóbulos vermelhos
o Glóbulos brancos
o Cristais (fosfato de amoníaco magnesiano, Charcot-Leyden, etc.)
O pH das fezes é determinado molhando a ponta de uma tira de papel indicador
de pH. A cor obtida é comparada com as diferentes cores do mostruário que acompanha
o papel indicador, sendo a cor mais semelhante a que corresponderá assim ao valor
aproximado do pH das fezes. Normalmente o pH das fezes varia entre 6,8 e 7,4. Distúrbios
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Rute Nogueira 53
na digestão das proteínas originam valores de pH 7,4 e, por seu lado, distúrbios na
digestão dos hidratos de carbono originam valores de pH 4.
2.4.2.2.Capacidade total de fixação do ferro (CTFF)
A CTFF pode ser determinada de duas formas diferentes, considerando-se como
valores normais valores entre 254-457 µg/dL:
Saturação da transferrina através da técnica descrita na bula (TIBC), seguida
da determinação do ferro, do sobrenadante obtido. O valor do ferro obtido
anteriormente (expresso em µg/dL) é multiplicado pelo factor 3, obtendo-se o
valor da CTFF.
Determinação da transferrina e posterior multiplicação desse valor pelo factor
1,43.
2.4.2.3. Magnésio Eritrocitário
Para a determinação do magnésio eritrocitário, depois da centrifugação da
amostra, elimina-se o plasma e efectua-se a hemólise e a desproteinização, utilizando para
isso tungstato de sódio e ácido sulfúrico. Depois disso, aguardar 5 minutos à temperatura
ambiente e centrifugar o preparado de novo. O doseamento é feito através da
determinação de magnésio no equipamento de bioquímica. O valor obtido é multiplicado
por 200, sendo os valores de referência entre 40 e 60 mg/L.
2.4.2.4.Índice de saturação do ferro
O índice de saturação do ferro pode ser determinado pela fórmula:
Ferro sérico
CTFF × 100
Na fórmula descrita, tanto a capacidade total de fixação do ferro como o ferro
sérico são expressos em µg/dL. O índice de saturação do ferro é expresso em
percentagem. Considera-se como valores normais de índice de saturação de ferro, valores
entre 25 e 50%.
2.4.2.5. Isoenzimas da fosfatase alcalina
A determinação das duas principais isoenzimas da fosfatase alcalina (fracção
óssea e fracção hepática) baseia-se no facto de a fracção óssea ser desnaturada pela acção
do calor (fracção termolábil) ao contrário da fracção hepática (fracção termorresistente).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 54
Primeiro que tudo, determina-se a fosfatase alcalina do soro a analisar. Depois
aquece-se a amostra em banho-maria e deixa-se arrefecer à temperatura ambiente e faz-
se nova determinação da fosfatase alcalina. Sabendo que a fracção óssea da fosfatase
alcalina foi destruída pelo calor, o valor encontrado corresponde à fracção hepática da
fosfatase alcalina, podendo-se calcular facilmente o valor da fracção óssea.
Fosfatase alcalina total = fracção óssea + fracção hepática
Consideram-se como valores normais das isoenzimas da fosfatase alcalina:
Hepática: 60 – 70 % da fosfatase alcalina total
Óssea: 30 - 40 % da fosfatase alcalina total
2.4.2.6. Contagem de ADDIS
A contagem de ADDIS (contagem minutada) da urina permite estabelecer para
cada elemento figurado da urina (leucócitos, eritrócitos e cilindros), o seu débito por
minuto. Em geral, esta contagem é feita numa urina de 3 horas (180 minutos). Do volume
total da urina são medidos 10 mL que são depois centrifugados. Desses 10 mL, são
retirados 9 mL do sobrenadante que são rejeitados. O volume restante de urina (1 mL),
deve ser bem homogeneizado e colocado na câmara de contagem. O número de elementos
figurados eliminados por minuto é calculado pela fórmula:
N = n × 100 ×V
180
V é o volume total da urina emitida nas 3 horas (180 minutos), em mL.
N é o nº total de elementos figurados eliminados por minuto (leucócitos/min,
eritrócitos /min ou cilindros /min).
n é o nº de elementos contados na câmara (nº de elementos num mL de urina
concentrada 10 vezes), que multiplicado por 100 representa então o nº de
elementos figurados por cada mL de urina emitida.
2.4.2.7.Pesquisa da Proteína de Bence Jones
A proteína de Bence Jones é uma imunoglobulina, composta por dímero de
cadeias leves (kappa ou lambda) de baixo peso molecular, sintetizada por plasmócitos. É
produzida em grande quantidade, excedendo a capacidade de metabolismo pelo rim, o
que leva à sua perda pela urina. A produção prolongada desta proteína leva a uma lesão
tubular com insuficiência renal. A pesquisa desta proteína tem como objectivo o
diagnóstico do mieloma múltiplo.
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Esta pesquisa é efectuada na urina de 24 horas. Deve verificar-se o pH da urina
com papel indicador: se o pH for superior a 5, junta-se ácido acético a 2%, gota a gota,
até se obter um valor de mais ou menos 5. Depois, coloca-se 5 mL desta urina num tubo
de ensaio e aquece-se em banho-maria a 60ºC durante cerca de 5 minutos. Verifica-se se
a urina tem turvação: se esta for fraca ou nula, junta-se 5 mL de ácido sulfosalicílico a
5%, gota a gota, mantendo a temperatura de 60ºC. Se a acidificação não provocar
qualquer turvação, a pesquisa considera-se negativa e o resultado é dado como: Não
revelou. Se, pelo contrário, a acidificação tiver provocado o aparecimento de um
precipitado deve aquecer-se a urina a 100ºC. A redissolução do precipitado leva a
considerar a pesquisa como Positiva.
Podem ocorrer situações em que aparecem falsos negativos. Para evitar esta
situação, se antes ou depois da acidificação se formar um precipitado muito intenso, que
não se dissolva com o aquecimento a 100ºC, deve diluir-se a urina acidificada com urina
normal até que a quantidade de precipitado seja normal e repetir os procedimentos
anteriores.
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3. Controlo de Qualidade
O processo analítico vai desde a execução do sistema analítico até à posterior
validação técnica dos resultados. Nesta fase inclui-se o Controlo da Qualidade Interno
(CQI), um conjunto de procedimentos postos em prática no LAC com vista a permitir um
controlo da qualidade dos resultados das análises à medida que as mesmas são executadas.
Todos os dias, no início da execução analítica dos vários equipamentos e técnicas
manuais, faz-se a determinação do controlo interno da qualidade. Os critérios de
aceitação/rejeição de resultados são analisados caso a caso. Considera-se que os
resultados das amostras de controlo estão dentro dos limites definidos se os resultados do
CQI estiverem nos limites estabelecidos, se não houver alarmes instrumentais, se os
valores de cada parâmetro não estiverem fora da especificação/valores de referência e se
as condições de execução analítica estiverem em conformidade com os procedimentos e
MBPL. Sempre que uma das condições anteriores não se verifique, as análises serão
repetidas. Após a execução analítica, os materiais reutilizáveis são encaminhados para a
secção de lavagem e os materiais descartáveis são recolhidos em recipientes apropriados
e eliminados. Todas as instalações, pavimentos, superfícies de trabalho e bancadas são
limpas diariamente, com produtos de limpeza adequados. Qualquer contaminação
acidental com sangue ou líquidos orgânicos, culturas bacteriológicas ou fúngicas deve ser
removida de imediato e as superfícies descontaminadas com desinfectante apropriado.
O controlo de qualidade interno tem como objectivo controlar os parâmetros
analisados, para que se possam detectar eventuais anomalias e avaliar erros, procedendo-
se à sua imediata correcção, assegurando a qualidade dos resultados durante a fase
analítica.
Para o controlo da exactidão e da precisão são utilizados soros comerciais. O tipo
de controlo utilizado e a frequência de utilização dependem do tipo de análise,
equipamento usado e número de amostras a analisar. Os soros controlo comerciais
liofilizados são divididos em alíquotas de uso único, após a hidratação, sendo conservadas
em condições que preservem a sua qualidade.
A precisão é avaliada pelas cartas de controlo de Levey-Jensen, as quais utilizam
a média e o desvio padrão (das bulas ou calculados no laboratório, sempre que o número
de análises assim o permita).
Na detecção de erros sistemáticos, os quais afectam a exactidão, deve verificar-
se:
Concentração atribuída aos calibradores;
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Deterioração de reagentes ou calibradores;
Reagentes mal preparados;
Erros sistemáticos de pipetagem;
Modificação de temperaturas de incubação;
Mudança de operador.
Por outro lado, na detecção de erros aleatórios, os quais afectam a precisão, deve
verificar-se:
Repetibilidade de pipetagem;
Repetibilidade de detecção;
Homogeneização de reagentes;
Bolhas de ar no sistema;
Temperaturas instáveis;
Corrente eléctrica instável.
Quando se trabalha com os valores do desvio padrão dos fornecedores, na
validação do CQI, não se aceitam mais do que dois pontos consecutivos se excederem
m+2s ou m-2s (detecção rápida de erros sistemáticos); não se aceita um ponto se exceder
+2s e este for precedido de um ponto no -2s e vice-versa (detecção de erros aleatórios) e
não se aceitam pontos se excederem m+3s ou m-3s.
Por outro lado, na validação do CQI, quando se trabalha com a média e desvio
padrão do laboratório, e o erro total do método esteja bem, não se aceitam mais do que
dois pontos consecutivos se excederem m+2s ou m-2s (detecção de erros sistemáticos) e
não se aceitam pontos se excederem m+3s ou m-3s.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 58
4. Fase Pós-Analítica
Depois de todo o processamento analítico, é necessária a validação biopatológica
para posterior entrega do boletim de resultados ao utente.
Na validação biopatológica, é necessário ter em atenção a coerência dos resultados
obtidos, tendo em conta o estado clínico do utente, os tratamentos/medicação de que foi
alvo e dos resultados obtidos anteriormente. Devem ser registadas todas as ocorrências
como as repetições de resultados, rejeição de amostras, etc. O boletim de resultados
entregue ao utente, tem de ser validado pelo especialista.
No que diz respeito aos boletins de resultados enviados dos laboratórios
exteriores, estes são anexados ao boletim do Biolabor, sendo arquivadas cópias destes.
O boletim de resultados pode ser entregue a terceiros mediante a autorização do
utente, tendo que ficar registado quem levantou o mesmo.
Os resultados das análises realizadas ao utente podem ser comunicados ao médico
prescritor quando solicitados, ou quando se trata de uma situação em que é um
prognóstico vital. Os boletins de resultados da medicina do trabalho são entregues à
empresa requisitante.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 59
Bibliografia – Parte I
1. Siemens Healthcare, Hematology Systems, [Online], 1996, [citado 14 de Fevereiro de
2015]; Obtido de: http://www.healthcare.siemens.com/hematology/systems/advia-2120-
hematology-system-with-autoslide
2. Laboratorio San Giuseppe, Ematologia, [Online], Data de publicação desconhecida,
[citado 21 de Fevereiro de 2015]; Obtido de: http://www.labsangiuseppe.it/images/ha-
8160-2.jpg
3. Diesse, Vesmatic 30, [Online], Data de publicação desconhecida, [citado 22 de
Fevereiro de 2015]; Obtido de: http://www.diesse.it/esr/ves30.php
4. Vilela, S., Teste de Coombs directo e indirecto, [Online], 2006, [citado 5 de Março de
2015]; Obtido de: http://www.plugbr.net/teste-de-coombs-direto-e-indireto-para-que-
serve-jejum-resultado-negativo-e-positivo/
5. Universidade do Porto, Hemostase, [Online], Maio de 2009, [citado 7 de Março de
2015]; Obtido de: http://fisiologia.med.up.pt/Textos_Apoio/sangue/Hemostase.pdf 09-
05-2015
6. Rcohe, Cobas Integra 400 plus, [Online], 2014, [citado 8 de Abril de 2015]; Obtido de:
http://www.roche.cl/home/productos/diagnostica/roche-professional/area-de-
suero/quimica-clinica/cobas-integra---400-plus/beneficios.html
7. Laboratório Alvaro, Proteína de Bence Jones, [Online], 2012, [citado 22 de Maio de
2015]; Obtido de: http://www.alvaro.com.br/exame/visualizar/proteina-bence-jones-
pesquisa-bence
8. Roche, Mieloma múltiplo: Formas de diagnóstico, [Online], Março de 2015, [citado 15
de Junho de 2015]; Obtido de: http://www.roche.pt/sites-
tematicos/infocancro/index.cfm/tipos/mieloma-multiplo/mm-diagnostico/
9. Wikipedia, Reacção de Widal, [Online], 27 de Junho de 2014, [citado 30 de Julho de
2015]; Obtido de: https://pt.wikipedia.org/wiki/Reac%C3%A7%C3%A3o_de_Widal
10. Wikipedia, Weil Felix Test, [Online], 1 de Abril de 2015, [citado 30 de Julho de
2015]; Obtido de: https://en.wikipedia.org/wiki/Weil%E2%80%93Felix_test
11. Tua Saúde, Exame VDRL, [Online], 6 de Outubro de 2015, [citado 22 de Outubro de
2015]; Obtido de: http://www.tuasaude.com/exame-vdrl/
12. Manual de Colheitas do Biolabor, Laboratório de Análises Clínicas
13. Amaral, E. Aula “Hemostase”, Leccionada no âmbito das aulas de Hematologia I do
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 22
de Novembro de 2013
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 60
14. Gominho, JL. Aula “Análises de citogramas e de Histogramas da Séria Leucocitária”,
Leccionada no âmbito das aulas de Hematologia II do Mestrado em Análises Clínicas,
Faculdade de Farmácia da Universidade de Lisboa, 3 de Julho de 2014
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 61
UNIVERSIDADE DE LISBOA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PLAQUETAS E AS SUAS IMPLICAÇÕES NAS DOENÇAS
VASCULARES
MONOGRAFIA ORIENTADA PELA PROFESSORA DOUTOURA
ISABEL BETTENCOURT MOREIRA DA SILVA
MESTRADO EM ANÁLISES CLINÍCAS
RUTE FILIPA DIAS NOGUEIRA
LISBOA, 2016
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 62
Índice – Parte II
Índice – Parte II .............................................................................................................. 62
Resumo ........................................................................................................................... 63
Abstract ........................................................................................................................... 64
Índice de Figuras ............................................................................................................ 65
Lista de Abreviaturas ...................................................................................................... 66
Introdução ....................................................................................................................... 67
Objectivos ....................................................................................................................... 69
5. Plaquetas ................................................................................................................. 70
5.1. Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas ................................. 70
5.2. Papel na inflamação ......................................................................................... 83
5.3. Alterações quantitativas ................................................................................... 87
5.4. Alterações qualitativas ..................................................................................... 90
5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias ... 91
6. Doenças vasculares ................................................................................................. 94
6.1. Doenças Arteriais ............................................................................................. 94
6.1.1. Doença das artérias coronárias ................................................................. 94
6.1.2. Doença das artérias periféricas ................................................................. 96
6.2. Doenças Venosas ............................................................................................. 98
6.2.1. Trombose das veias profundas ................................................................. 98
7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular ..................................... 99
7.1. Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico ........... 99
8. Abordagens Terapêuticas ..................................................................................... 104
8.1. Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes
com doenças vasculares associadas .......................................................................... 104
8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes plaquetários em utilização na
prevenção de doenças vasculares ......................................................................... 104
8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica ...................................... 105
8.3. Novos agentes antiplaquetários...................................................................... 106
Conclusões e Perspectivas ............................................................................................ 108
Bibliografia – Parte II ................................................................................................... 109
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 63
Resumo
A segunda parte deste relatório consiste numa monografia sobre o tema “Plaquetas
e as suas implicações nas doenças vasculares“, onde é feita uma revisão bibliográfica
sobre o assunto, sendo um dos objectivos encontrar uma justificação para um caso clínico
real.
Inicialmente, é feita uma introdução ao tema das plaquetas, abordando não só a
sua fisiologia (estrutura, formação e funções das plaquetas) como também o seu papel na
inflamação e as alterações quantitativas e qualitativas que podem ocorrer nas plaquetas e
que podem levar a distúrbios patogénicos no organismo humano. Para finalizar este
grande capítulo, são abordadas algumas aplicações das análises clínicas no diagnóstico
de patologias plaquetárias. Neste subcapítulo dá-se especial importância ao PFA-100, um
novo método de avaliação da função plaquetária que apresenta vantagens significativas
em comparação com o tempo de hemorragia.
Tal como o título indica, as doenças vasculares também são um dos grandes
capítulos deste trabalho, sendo essencial a sua compreensão para criar uma relação entre
as plaquetas e as doenças vasculares. Assim, são abordadas as doenças arteriais (doença
das artérias coronárias e doença das artérias periféricas) e as doenças venosas (trombose
das veias profundas). Não são abordadas todas as doenças arteriais e venosas existentes,
dando-se maior relevância às que são importantes para a compreensão da relação entre as
plaquetas e as doenças vasculares.
Sendo uma das principais motivações deste trabalho, é descrito um caso clínico
real que relaciona a trombocitopenia como consequência de doenças vasculares, sendo
feita uma descrição cronológica dos acontecimentos que têm ocorrido ao longo dos anos
e da conclusão de cada um dos procedimentos aplicados até agora.
Em forma de conclusão, são descritas algumas abordagens terapêuticas, como os
tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção do AVC em pacientes com doenças
vasculares, a monitorização/controlo laboratorial da terapêutica e os novos agentes
antiplaquetários que estão a começar a ser utilizados no mercado farmacêutico.
Palavras-chave: Plaquetas; Doenças Vasculares; Trombose; Trombocitopenia
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Rute Nogueira 64
Abstract
A monograph entitled "Platelets and its implications for vascular diseases" is
presented in the second part of this document. A literature review about this subject was
made aiming to find a justification for a real clinical case.
An introduction about platelets was made, addressing not only their physiology
(structure, formation and function of platelets) as well as its role in inflammation and the
quantitative and qualitative alterations that may occur in platelets and that can lead to
pathogenic disorders in the human organism. To end this big chapter, it’s discussed some
applications of medical tests in the diagnosis of platelet disorders. In this sub-chapter it’s
given great importance to PFA, a new method for the evaluation of platelet function that
has significant advantages compared with the time of bleeding.
As the title indicates, vascular diseases are also one of the biggest chapters of this
work, being essential their understanding to create a relationship between platelets and
vascular diseases. Thus, arterial diseases (coronary artery disease and peripheral artery
disease) and venous disease (deep venous thrombosis) are addressed. Not all existing
arterial and venous diseases are addressed, giving much more relevance to those that are
important to understand the relationship mentioned above.
Being one of the main objectives of this work, it’s described a real clinical case
relating thrombocytopenia as the consequence of vascular diseases, with a chronological
description of the events that have occurred over the years and the conclusions reached
with each of the procedures until now.
In conclusion, some therapies are described, such as antiplatelet treatments,
applied as a prevention of an AVC on patients with vascular diseases, the laboratorial
monitorization/control of the therapeutics and the new antiplatelet agents that are
beginning to be used in the pharmaceutical market.
Keyword: Platelets; Vascular Diseases; Thrombosis; Thrombocitopenia
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Rute Nogueira 65
Índice de Figuras
Figura Página
Figura 8: Megacarioblasto 70
Figura 9: Megacariócito basófilo 71
Figura 10: Megacariócito plaquetário 71
Figura 11: Plaquetas 72
Figura 12: Plaquetas activadas 72
Figura 13: Plaqueta em repouso 72
Figura 14: Estrutura das plaquetas 73
Figura 15: Desenvolvimento de megacariócitos e produção de
plaquetas
76
Figura 16: Modelo da regulação da produção de plaquetas pela TPO 77
Figura 17: Esquema ilustrado do processo que ocorre durante a ruptura
de vasos
79
Figura 18: Visão actual da cascata da coagulação 82
Figura 19: Os neutrófilos humanos formam armadilhas de neutrófilos
extracelulares em resposta a sinais das plaquetas activadas, em adição
a outro tipo de estímulos
85
Figura 20: As plaquetas são efectoras da lesão inflamatória e imune,
na evolução da aterosclerose e em complicações tromboinflamatórias
agudas desencadeadas pela ruptura da placa bacteriana
86
Figura 21: Trombocitose essencial 88
Figura 22: Diferença entre um valor normal de plaquetas e a
trombocitopenia
89
Figura 23: Esfregaço de sangue normal 90
Figura 24: Agregados plaquetários 91
Figura 25: Satelitismo plaquetário 91
Figura 26: Observação ao microscópio de um esfregaço sanguíneo 92
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 66
Lista de Abreviaturas
ADP – Adenosina difosfato
ET – Trombocitemia essencial
HMWK – High Molecular Weight Kinogen; Cininogénio de alto peso molecular
IDT – Inibidores directos da trombina
IL – Interleucina
NETs – Neutrophil extracelular traps
OCS – Open Canalicular System; Sistema canalicular aberto
PCT – Plaquetócrito
PDF – Produtos de degradação de fibrina
PDW – Índice de anisocitose plaquetária (Platelet Distribution Width)
PF3 – Factor plaquetário 3
PMN – Leucócitos polimorfonucleares
PTI – Púrpura Trombocitopenica Idiopática
TF – Factor tecidual (Tissue Factor)
TLR – Receptor Toll-like
TPA – Tecidual Plasminogen Activator; Activador do Plasminogénio Tecidual
TPO – Trombopoietina
VPM – Volume plaquetário médio
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 67
Introdução
As plaquetas são formadas a partir de células precursoras que se encontram na
medula óssea, num processo denominado Trombocitopoiese. Neste processo, ocorre uma
poliploidização, na qual a duplicação intracelular de DNA forma vários tipos celulares de
ploidia 2N – 32N (64N) (1).
Muita discussão há sobre o facto de as plaquetas dos mamíferos serem
consideradas células ou elementos figurados do sangue (fragmentos do citoplasma de
uma célula precursora). Alguns autores afirmam que as plaquetas são células anucleadas
que derivam dos megacariócitos. Por outro lado, outros autores defendem que as
plaquetas não são células, mas sim elementos figurados do sangue, uma vez que não
possuem núcleo e derivam do megacariócito, resultando da fragmentação do seu
citoplasma. Dada esta discussão, as plaquetas serão designadas ao longo desta
monografia, consoante a designação que lhe é dada nas respectivas fontes utilizadas.
Na população normal, o valor médio de plaquetas é de 219x109/l (2) e varia entre
as 150x109/l e as 450x109/l. Esta contagem varia consoante o grupo étnico em questão,
sendo semelhante dentro do mesmo. O valor do plaquetócrito (PCT) varia entre os 0,17 e
os 0,29 %, o Volume Plaquetário Médio (VPM) varia entre 7 e 10,5 fL e o Índice de
Anisocitose Plaquetária (PDW) entre os 10,5 e os 17,5%. As plaquetas têm uma vida
média de 7 a 10 dias (3).
Apesar do seu tamanho e fragilidade, as plaquetas têm várias funções de elevada
importância no organismo humano:
Protecção do endotélio vascular.
Intervenção na formação do trombo plaquetário.
Intervenção na formação de fibrina.
Intervenção na retracção do coágulo.
Intervenção no processo inflamatório (3).
A hemostase é um processo fisiológico que mantém o equilíbrio entre o risco de
uma hemorragia e o risco de uma trombose, combinando mecanismos celulares e
bioquímicos de modo a manter o sangue fluído no seio das veias e artérias. Para além de
prevenir hemorragias, após a lesão dos vasos sanguíneos, também tem como funções
prevenir tromboses, restabelecendo o fluxo sanguíneo uma vez colmatada a lesão do vaso.
Quando ocorre ruptura em vasos de menor calibre, a paragem da hemorragia é feita pelo
processo de hemostase primária. Quando ocorre num vaso de calibre médio, a formação
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 68
de um trombo plaquetário não é suficiente e é necessário que ocorra a coagulação. Quando
se tratam de vasos de grande calibre, tem que ocorrer a sutura do vaso (83).
As plaquetas são as principais células efectoras na hemostase. Para além disso,
são células inflamatórias multifacetadas com funções que abrangem, de forma contínua,
desde as respostas imunitárias inatas até à imunidade adaptativa. As plaquetas activadas
têm actividades trombo-inflamatórias essenciais numa variedade de distúrbios vasculares
e vasculopatias. Recentemente, foram identificadas actividades inflamatórias e
imunológicas que fornecem dados importantes sobre a biologia destes elementos e que
são directamente relevantes para as doenças vasculares humanas (5).
As alterações quantitativas em plaquetas podem indicar patologias hemorrágicas
e dar uma orientação ao médico na detecção de outras condições relacionadas com a
imunidade, uma vez que estas apresentam como sintoma primário a diminuição destes
elementos (6).
No que diz respeito às alterações que podem existir quanto à quantidade de
plaquetas, podem distinguir-se dois grandes grupos:
Trombocitose (aumento do número de plaquetas)
Trombocitopenia (diminuição do número de plaquetas)
Por outro lado, as plaquetas podem também apresentar alterações qualitativas,
situações em que a pessoa pode ter a contagem plaquetária normal, não significando isso
que não seja portadora de uma outra patologia relacionada com a hemostase. Assim
sendo, quando se faz a observação de um esfregaço de sangue periférico, há que ter em
atenção três aspectos essenciais: o tamanho, a distribuição e a granulação (83).
Uma doença vascular é uma doença que altera a integridade dos vasos sanguíneos.
Este tipo de doenças pode ser causado por herança familiar ou genética, por hábitos de
vida nocivos, pela vida profissional, por medicações e por traumas acidentais que podem
comprometer os vasos sanguíneos (7).
A baixa dose de Aspirina na terapia antiplaquetária continua a ser o medicamento
de escolha na prevenção de eventos cardiovasculares. No entanto, a protecção que a
Aspirina oferece para as pessoas com alto risco de eventos cardiovasculares é apenas
relativamente moderada. A evidência disponível através destes estudos mostra que o uso
de Clopidogrel com a Aspirina está associado a uma redução do risco de eventos
cardiovasculares em comparação com a Aspirina isolada em pacientes com síndrome
coronária aguda, sem elevação do segmento ST. Em pacientes com alto risco de doenças
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 69
cardiovasculares, os benefícios e riscos do tratamento combinado são ainda muito fracos
(65).
Em outro estudo feito, a comparação entre a monoterapia com Aspirina e a
combinação entre Clopidogrel e Aspirina, em doentes com doença arterial periférica
sintomática, revelou um benefício adicional no que respeita à redução dos riscos
vasculares e dos eventos trombóticos. Por outro lado, não existe uma evidência disponível
para pacientes que sofreram um acontecimento vascular sob o efeito de Aspirina, que os
resultados de alterem quando se começa a aplicar uma terapia com Clopidogrel
adicionalmente (64).
Os agentes antiplaquetários são os pilares no tratamento e prevenção do
tromboembolismo. Agentes antitrombóticos, como a Aspirina, o Clopidogrel, antagonista
da vitamina K e Foundaparinux (inibidor directo do factor Xa) já foram incorporados na
prática clínica rotineira dos serviços de terapia intensiva. Recentemente tem-se
demonstrado grande interesse nos agentes que inibem selectivamente o factor Xa e a
trombina. Estes apresentam estrutura molecular pequena e inibem simultaneamente o
factor da coagulação livre no plasma e ligado ao trombo. De entre os novos
anticoagulantes orais, Dabigatran, Rivaroxaban e Apixaban são os que apresentam
estudos clínicos em fases mais avançadas e o uso na prática clínica já é feito em alguns
países (8).
Objectivos
Uma das motivações deste trabalho prende-se com a patologia de um familiar
próximo, tentando encontrar abordagens teóricas que consigam explicar os
acontecimentos ocorridos. Fazendo uma abordagem inicial do que se vai expor
posteriormente, inicialmente foi descoberta uma baixa muito acentuada de plaquetas e,
alguns anos depois, foi revelado o entupimento da artéria femoral esquerda, com
gravidade.
Por outro lado, outra motivação que conduziu ao presente trabalho surge devido à
consciencialização da elevada importância das plaquetas no âmbito das análises clínicas
e da relação existente entre estas e as doenças vasculares.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 70
5. Plaquetas
5.1.Fisiologia: Estrutura, formação e funções das plaquetas
As plaquetas são formadas a partir de células precursoras que se encontram na
medula óssea, num processo denominado Trombocitopoiese. Neste processo, ocorre uma
poliploidização, na qual a duplicação intracelular de DNA forma vários tipos celulares de
ploidia 2N – 32N (64N). Os tipos celulares referidos correspondem a diferentes graus
funcionais e podem-se distinguir três diferentes tipos de células (1).
Existe uma grande discussão sobre o facto de as plaquetas serem consideradas
células ou elementos figurados (fragmentos do citoplasma). Alguns autores afirmam que
as plaquetas são células anucleadas que derivam dos megacariócitos, com tempo de vida
média entre os 7 a 10 dias. Por outro lado, outros autores defendem que as plaquetas não
são células mas sim elementos figurados do sangue, uma vez que não possuem núcleo e
derivam do megacariócito sob a forma de fragmentos do citoplasma. Dada esta discussão,
as plaquetas serão designadas ao longo deste trabalho consoante a designação que lhe é
dada nas respectivas fontes utilizadas.
Megacarioblasto: Célula sensivelmente maior que o pró-eritroblasto, na maioria
das vezes (Figura 8). Existe um desvio da relação núcleo-plasma em favor do
núcleo e a densidade da cromatina nuclear varia. Os nucléolos, embora sejam
numerosos, são quase sempre ocultados. As células mononucleadas predominam,
ainda que existam também algumas com dois ou quatro núcleos. Apresenta um
citoplasma muito basófilo, pouco abundante e sem granulações, podendo
apresentar projecções nas margens (1).
Pró-megacariócito: Produto da poliploidização dos megacarioblastos,
apresentando maiores dimensões que estes. Núcleos gigantes pouco lobulados
(Figura 9). A cromatina nuclear apresenta-se de forma predominante em malha
fina e os nucléolos presentes estão frequentemente ocultados. Com 40-60 µm de
Figura 8: Megacarioblasto (medula óssea)
(Retirado de (9))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 71
diâmetro, esta célula apresenta citoplasma mais abundante e muito basófilo, com
numerosas granulações azurófilas, o que indica o início da actividade
trombopocitopoiética. Evidente aumento da largura do citoplasma (1).
Megacariócito maduro: Em condições normais, trata-se da maior célula da
hematopoiese na medula óssea (Figura 10). Ocorre a formação da configuração
típica dos núcleos e do pontilhado azurófilos finíssimo do plasma, representando
os preparativos para a libertação das plaquetas. Uma pequena porção dos
megacariócitos apresenta uma redução do diâmetro celular e presença de
pequenos núcleos, isolados ou duplos, de forma redonda ou oval. Estes elementos
celulares também apresentam actividade trombopoiética (1).
Fase de libertação das plaquetas: O citoplasma do megacariócito maduro, até
então íntegro, começa a apresentar prolongamentos irregulares e desintegração
progressiva, com formação de numerosas macropartículas e, logo a seguir,
micropartículas com finos grânulos azurófilos – as plaquetas. Os núcleos
remanescentes, desprovidos de plasma, persistem no interior da medula óssea até
que ocorra a sua destruição pelos macrófagos. Assim, as plaquetas são pequenos
e simples fragmentos do citoplasma dos megacariócitos, que vão ser libertados no
sangue (1).
Plaqueta: A plaqueta apresenta uma forma discóide (em repouso) ou estrelada
(activada), como se pode observar nas figuras 12 e 13, respectivamente. Com um
Figura 9: Megacariócito basófilo (medula
óssea) (Retirado de (9))
Figura 10: Megacariócito plaquetário (medula óssea)
(Retirado de (9))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 72
diâmetro de 2-4 µm e uma espessura de ± 1 µm, a plaqueta é a menor estrutura
encontrada no esfregaço de sangue (corresponde entre ¼ a 1/5 das dimensões do
eritrócito). Resulta da fragmentação do citoplasma do megacariócito plaquetário.
É formada por um citoplasma de coloração basófila clara (hialómero) e
granulações azurófilas (granulómero), como se pode observar na figura. Pode
ocorrer a auto-aglutinação fisiológica em esfregaços sem a adição de EDTA, o
que resulta em agregados de plaquetas no esfregaço (1,9,10).
Como de seguida apresenta a figura 14, a membrana plaquetária é constituída por:
Figura 11: Plaquetas (sangue periférico), por microscopia óptica
(Retirado de (16))
Figura 12: Plaquetas activadas, microscopia
electrónica de varrimento (Retirado de (75))
Figura 13: Plaqueta em repouso, microscopia
electrónica de transmissão (Retirado de (76))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 73
Camada externa de natureza glicoproteica (glicocálice):
Glicosaminoglicanos, ácido siálico e numerosas aberturas – sistema
canicular aberto.
Dupla camada fosfolipídica.
Proteínas integrais (Glicoproteínas – GPIa, GPIb, GPIIa, GPIIb, GPIIIa,
GPIV, GPV, GPIX)
As plaquetas têm quatro propriedades biológicas (1,11):
Adesão: Capacidade de fixação a superfícies estranhas com libertação de
fosfolípidos da membrana plaquetária.
Secreção: Segregam todos os constituintes dos grânulos, os quais são
eliminados através dos canalículos (OCS), processo favorecido pela
actividade contráctil dos microfilamentos de actina/miosina.
Agregação: Por interacção do complexo membranar GPIIb/GPIIIa com o
fibrinogénio e o factor de Von Willebrand, as plaquetas adjacentes agregam-
se, formando-se um trombo plaquetário capaz de colmatar a área endotelial
lesionada.
Actividade pró-coagulante: Formação de microvesículas fosfolipídicas, na
sequência do rearranjo dos fosfolípidos da membrana (fenómeno de flip-flop),
com exposição dos fosfolípidos membranares (PF3) que ficam disponíveis
para duas reacções da cascata da coagulação (11).
Figura 14: Estrutura das plaquetas (Adaptado de (77))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 74
As plaquetas têm na sua composição cerca de 60% de proteínas (como
fibrinogénio, trombostenina, factores plaquetários, factores de coagulação, aminas
vasoconstritoras e enzimas), 15% de lípidos (como fosfolípidos, colesterol, lipoproteínas
e prostaglandinas), 8,5% de glúcidos (glicogénio e glicoproteínas) e nucleótidos (como
AMP, ADP, ATP) (11).
As plaquetas são activadas pelo aumento do cálcio citosólico, uma vez que os iões
cálcio (Ca2+) constituem um mensageiro intracelular, afectando a actividade enzimática e
as interacções proteína-proteína.
A contagem de plaquetas é um parâmetro analisado nas “análises de rotina” de
qualquer indivíduo ao longo da sua vida. No entanto, esta análise é maiss frequente e
significativa quando existem alterações que derivam de outras condições fisiológicas ou
de doenças. Não existem dados que indiquem que os valores de plaquetas são alterados
pelas variações diurnas mas, por outro lado, apresentam variações na gravidez e durante
o ciclo menstrual de algumas mulheres. Inicialmente, estudos feitos com a contagem de
plaquetas apontavam para um valor constante em indivíduos até aos 18 meses (12). Por
outro lado, foram feitos estudos recentes que apontam para uma variação não superior a
10% ao longo de 40 anos (3).
Na população normal, a contagem normal de plaquetas é de 219x109/l (2) e varia
entre as 150x109/l e as 450x109/l. Esta contagem varia dependendo do grupo étnico em
questão, mas é semelhante dentro do mesmo. O valor do PCT varia entre os 0,17 e os
0,29 %, o VPM varia entre 7 e 10,5 fL e o PDW entre os 10,5 e os 17,5%. As plaquetas
têm uma vida média de 7 a 10 dias (3).
A grande variação do número de plaquetas é compensada por diferenças no VPM.
É muito importante perceber que o corpo humano conserva a massa, mas não o número
de plaquetas. A demonstração prática deste princípio é comprovada quando o tamanho
do baço é alterado. Normalmente, o baço sequestra um terço da massa de plaquetas do
corpo, como se fosse uma reserva permutável com massa de plaquetas circulantes (13).
Numa experiência em que ratinhos foram injectados com metilcelulose, eles
desenvolveram vários tipos de esplenomegalia e trombocitopenia, sendo que a gravidade
da trombocitopenia foi directamente proporcional ao aumento do tamanho do baço
(14,15). Por outro lado, quando foi retirado o baço aos ratinhos, estes ficaram com
trombocitose. Quando finalmente foi medida a massa de plaquetas nos três grupos de
animais (normal, esplenomegálico e esplénico), verificou-se que todos tinham a mesma
massa total de plaquetas no corpo. Mais recentemente, foram relatados resultados
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 75
semelhantes com seres humanos (13). Estes dados levam à comprovação da massa de
plaquetas pelo rato de Belgrado (b/b) (16). Este rato é autossómico recessivo, tem
hipocromia severa, anemia microcítica, uma redução de 49% em megacariócitos e uma
redução em 34% na contagem de plaquetas. No entanto, a massa total de plaquetas
permanece normal, devido a um aumento de 50% no tamanho das plaquetas (16).
Os megacariócitos da medula óssea respondem às mudanças na massa de
plaquetas através da variação no seu número, tamanho e poliploidia. O aumento dos
megacariócitos, não só em tamanho como em número, tem sido um aspecto muito útil no
diagnóstico clínico da púrpura trombocitopénica idiopática (PTI) (3).
Resumindo, é importante ter em conta os seguintes princípios da fisiologia
plaquetária:
A contagem de plaquetas permanece constante ao longo da vida (excepto
em situações de patologia);
A contagem “normal” de plaquetas varia muito entre os indivíduos;
O tamanho das plaquetas é inversamente proporcional à contagem de
plaquetas;
O corpo conserva a massa, mas não o número de plaquetas;
Os megacariócitos da medula óssea respondem à s mudanças na massa de
plaquetas pela variação em número, tamanho e poliploidia (3).
Em algumas situações, pode haver um aumento da necessidade de plaquetas,
situações em que ocorre a libertação prematura de plaquetas de maiores dimensões. O
tamanho e o número de plaquetas libertadas pelos megacariócitos variam consoante o
grau de poliploidia e o estado de maturação dos respectivos citoplasmas.
As plaquetas podem ser libertadas a partir de uma poliploidia de 8N (estádios de
pró-megacariócito, megacariócito granuloso ou megacariócito plaquetário), sendo tanto
maiores quanto menor for o grau de poliploidia e tanto mais numerosas quanto maior for
o grau de maturação do citoplasma (Figura 15) (3).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 76
A regulação da trombocitopoiese, ou seja, da produção de plaquetas, é da
responsabilidade de trombopoietina (TPO) (3). A TPO é uma hormona glicoproteica,
produzida sobretudo no fígado e no rim, mas também na medula óssea e no baço. No
fígado, a sua produção é estimulada pela IL-6. A regulação da trombocitopoiese é levada
a cabo pela ligação da trombopoetina ao receptor MPL (C-MPL, CD110, TPOR), receptor
este que está presente em células CD34+, megacariócitos e plaquetas (3).
A fisiologia da TPO tem em conta princípios específicos que revelam a
importância desta hormona. Em estudos feitos em ratinhos com trombocitopenia foi
demonstrado que a TPO leva, até 24 horas para atingir o máximo da sua produção, após
o início agudo da trombocitopenia. Por outro lado, também se constatou que os níveis
circulantes de TPO são inversamente proporcionais à contagem de plaquetas em modelos
de trombocitopenia aguda ou amegacariocítica (17,18).
Os níveis de TPO diminuem exponencialmente com o aumento das plaquetas.
Existem uma relação linear e logarítmica entre os níveis de TPO e a contagem de
plaquetas, em modelos de trombocitopenia. Está também provado que a TPO nativa tem
um tempo de semivida em circulação de 45 minutos (18).
A presença do receptor da TPO (MPL, TPOR), característica que lhes permite a
ligação e remoção da TPO livre em circulação. Este processo foi provado por experiências
Figura 15: Desenvolvimento de megacariócitos e produção de plaquetas - cada unidade
nuclear possui dois conjuntos cromossómicos (N, número de conjuntos cromossómicos ou
"ploidia") (Adaptado de (11))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 77
em que o receptor foi bloqueado e no qual não ocorreu o processo de ligação e remoção
da TPO por parte das plaquetas (19,20). A produção hepática da TPO não é alterada pela
mudança na massa de plaquetas (21).
Todos os princípios referidos anteriormente deram origem a um modelo para a
regulação da produção de plaquetas pela TPO (Figura 17). A TPO é sintetizada no fígado
e entra para a circulação, onde interage com o receptor da TPO (MPL) presente nas
plaquetas, sendo o complexo internalizado e degradado. Se a massa de plaquetas for
normal, a maior parte da TPO é eliminada pelas plaquetas e um pequeno nível basal
mantém o ritmo normal da produção de plaquetas a partir dos megacariócitos na medula
óssea. Por outro lado, quando há uma redução na capacidade da massa de plaquetas
circulantes em remover a TPO, devido à diminuição do número de plaquetas, os níveis
de TPO sobem, os megacariócitos são estimulados e há um aumento da produção de
plaquetas. Assim, é a própria massa de plaquetas que regula directamente os níveis de
TPO na circulação (3).
Tendo por base o modelo de fisiologia da TPO apresentado, existem algumas
implicações patológicas que se sobressaem (Figura 16):
Os níveis de TPO são inversamente proporcionais à taxa de produção de
plaquetas.
A produção de TPO pode ser alterada por distúrbios patológicos ou por
outras moléculas.
Os efeitos da TPO podem ser alterados por alterações patológicas no
receptor dos megacariócitos ou nos eventos de sinalização após os
receptores.
A remoção da TPO pode ser alterada por desordens patológicas ou por
outras moléculas (3).
Figura 16: Modelo da regulação da produção de plaquetas pela TPO (Adaptado
de (17))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 78
Cerca de 20% das plaquetas são destruídas ao acaso e consumidas pelas células
do endotélio ou da túnica íntima. O processo de envelhecimento faz com que as plaquetas
sejam sequestradas e fagocitadas pelos macrófagos do baço, do fígado e da medula óssea
(3).
Apesar do seu tamanho e fragilidade, as plaquetas têm várias funções de elevada
importância no organismo humano:
Protecção do endotélio vascular.
Intervenção na formação do trombo plaquetário.
Intervenção na formação de fibrina.
Intervenção na retracção do coágulo.
Intervenção no processo inflamatório (3).
As plaquetas contribuem para o processo hemostático de duas maneiras distintas.
Num primeiro momento, põem em prática as suas funções adesivas e coesivas que levam
à formação de um trombo plaquetário. Depois disso, ocorre a activação de mecanismos
de coagulação por meio da exposição de uma superfície fosfolipídica adequada, actuando
como local catalítico para o desenvolvimento da coagulação e a consolidação do tampão
hemostático. Para promover a hemostase correcta, as plaquetas devem, idealmente,
manter as suas propriedades adesivas e pró-coagulantes (3).
As plaquetas também possuem funções secretoras importantes. Durante o
processo de activação, as plaquetas expressam as proteínas da membrana interna e
libertam proteínas adesivas e factores de coagulação e crescimento. Algumas das
proteínas facilitam a comunicação das plaquetas com os leucócitos e as células
endoteliais. Assim, as plaquetas desempenham um papel muito importante em eventos
inflamatórios e proliferativos, tendo um papel crítico na remodelação de tecidos e
cicatrização de feridas (3).
A hemostase é um processo fisiológico que mantém o equilíbrio entre o risco de
uma hemorragia e o risco de uma trombose e combina mecanismos celulares e
bioquímicos de modo a manter o sangue fluído no seio das veias e artérias. Para além de
prevenir hemorragias, após a lesão dos vasos sanguíneos, tem também como funções
prevenir tromboses, restabelecendo o fluxo sanguíneo uma vez colmatada a lesão do vaso.
Quando ocorre ruptura em vasos de menor calibre, a paragem da hemorragia é feita pelo
processo de hemostase primária. Quando ocorre num vaso de calibre médio, a formação
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 79
de um trombo plaquetário não é suficiente e é necessário que ocorra a coagulação (Figura
17). Quando se tratam de vasos de grande calibre, tem que ocorrer a sutura do vaso (83).
Neste processo intervêm uma série de factores como os vasos, as plaquetas, os
iões cálcio, o factor de Von Willebrand, os fosfolípidos de origem plaquetária, as
proteínas de coagulação, a trombina, os inibidores da coagulação e os factores do sistema
fibrinolítico (4).
A célula endotelial sintetiza antiagregantes plaquetários como a prostaciclina
(PGI2) e moléculas pró-agregantes, pró-coagulantes e anti-fibrinolíticas em resposta a
estímulos (3).
Os vasos têm uma dupla função na hemostase: desencadear a formação do trombo
plaquetário e activar as duas vias da coagulação de modo a formar o coágulo estável.
A hemostase pode dividir-se em três fases:
Hemostase primária – Sistema vascular (constrição do vaso lesado) e
tempo plaquetário (formação do trombo plaquetário).
Hemostase secundária (coagulação) – Formação de fibrina.
Hemostase terciária (fibrinólise) – Destruição do coágulo de fibrina e
manutenção da permeabilidade do vaso.
A hemostase primária é o processo inicial da coagulação desencadeado pela lesão
vascular. Logo após a lesão, os mecanismos locais produzem vasoconstrição, alteração
da permeabilidade vascular com produção de edema, vasodilatação dos vasos tributários
da região em que ocorreu a lesão e adesão das plaquetas. Assim, a vasoconstrição diminui
o fluxo de sangue no local de hemorragia, tornando preferencial o fluxo pelos ramos
colaterais dilatados. Simultaneamente, a formação de edema intersticial diminui o
gradiente de pressão entre o interior do vaso lesado e a região adjacente, produzindo um
tamponamento natural e auxiliando a hemostase. Em condições normais, os vasos
Figura 17: Esquema ilustrado do processo que ocorre durante a ruptura de vasos
(Retirado de (4))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 80
sanguíneos devem constituir um sistema tubular não trombogénico capaz de desencadear
por mecanismos locais, os processos que iniciam a coagulação e que, após a recuperação
da lesão anatómica, possam remover o coágulo e restabelecer a circulação local
(fibrinólise) (83).
O endotélio tem uma elevada importância no controlo de vários aspectos da
hemostase pois, além da capacidade de secretar substâncias tais como a prostaciclina
(PGI2), um potente vasodilatador com actividade antiagregante plaquetária, é responsável
pelas características não trombogénicas da superfície interna dos vasos sanguíneos.
Por outro lado, tanto a lesão anatómica quanto os distúrbios funcionais do
endotélio aumentam o risco de ocorrência de tromboses, com frequência variável, em
qualquer segmento da rede vascular. A remoção do endotélio, por qualquer mecanismo,
expõe o sangue ao contacto com o colagénio da região subendotelial, o que por si só
promove a adesão das plaquetas na presença do factor Von Willebrand (VIII:vWF).
Quando isto ocorre, as plaquetas tornam-se activadas e libertam o conteúdo dos grânulos
citoplasmáticos (4). Entre outras substâncias, estes grânulos contêm adenosina-difosfato
(ADP), serotonina e tromboxano A2 (TXA2). O ADP é responsável pela activação de
outras plaquetas e pela modificação da sua forma, que passa de discóide para esférica com
aparecimento de pseudópodes. Estas plaquetas activadas vão-se agregar umas às outras
formando um tampão que fornecerá a superfície adequada ao processo de coagulação do
sangue, produzindo um coágulo resistente. Neste estado, as plaquetas exteriorizam uma
lipoproteína denominada factor plaquetário 3 (PF3), que desempenha um papel de
superfície fosfolipídica (superfície activadora) que participa de inúmeras reacções da
cascata de coagulação (4).
A hemostase secundária ou coagulação é um processo multifactorial e dinâmico
com proteólise limitada que culmina na formação de trombina em quantidades suficientes
para a conversão do fibrinogénio em fibrina. A fibrina forma uma rede de fibras elásticas
que consolida o tampão plaquetário e transforma-o em coágulo. A coagulação caracteriza-
se por uma série de reacções químicas entre várias proteínas que convertem proenzimas
em enzimas (proteases). Essas proenzimas e enzimas são denominadas factores de
coagulação. A activação destes factores é provavelmente iniciada pelo endotélio activado
e finalizado na superfície das plaquetas activadas e tem como produto essencial a
formação de trombina que promoverá modificações na molécula de fibrinogénio
libertando monómeros de fibrina na circulação. Estes últimos vão unindo as suas
terminações e formando um polímero solúvel (fibrina S) que, sob a acção do factor XIIIa
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 81
(factor XIII activado pela trombina) e iões cálcio, produz uma base de fibras que mantêm
estável o agregado de plaquetas previamente formado (22).
A clássica cascata da coagulação foi introduzida em 1964, por Macfarlane (23,24).
Neste modelo a activação de cada factor da coagulação leva a activação de outro factor
até a eventual formação da trombina. Esses factores são numerados de I ao XIII, com seus
respectivos sinónimos. O número correspondente para cada factor foi designado
considerando a ordem de sua descoberta e não do ponto de interacção com a cascata. O
factor VI, que foi utilizado para designar um produto intermediário na formação da
tromboplastina, não possui mais qualquer designação. O factor III é a tromboplastina
tecidual, chamada actualmente de factor tecidual ou tissular (TF). O factor IV é utilizado
para designar o cálcio iónico (Ca++), que deve ser mantido na concentração sérica acima
de 0,9 mM/L para a optimização da formação do coágulo (25).
Este modelo da cascata dividiu a sequência da coagulação em duas vias: a via
intrínseca na qual todos os componentes estão presentes no sangue e na via extrínseca na
qual é necessária a presença da proteína da membrana celular subendotelial, o TF (26).
Os eventos comuns da coagulação (via final comum), quer sejam iniciados pela
via extrínseca ou intrínseca, são a activação do factor X (Xa), a conversão de trombina a
partir da protrombina pela acção do factor Xa, formação de fibrina estimulada pela
trombina e estabilização da fibrina pelo factor XIIIa (22).
A coagulação, pela via intrínseca, é desencadeada quando o factor XII é activado
pelo contacto com alguma superfície carregada negativamente (por exemplo, colagénio
ou endotoxina). Além do factor XII, estão envolvidos neste processo o factor XI, a pré-
calicreína e o cininogénio de alto peso molecular (HMWK = high molecular weight
kinogen). Tanto o factor XI quanto a pré-calicreína necessitam da HMWK para efectuar
a adsorção à superfície em que está ligado o factor XIIa. Da interacção destes elementos
é activado o factor XI, que transforma o factor IX em IXa. O factor IXa e o factor VIIa
associam-se à superfície fosfolipídica através de uma "ponte" de cálcio estimulando a
conversão de factor X para Xa (23).
De modo mais simples, na via extrínseca, a coagulação é desencadeada quando os
tecidos lesados libertam o TF (tromboplastina tecidual), que forma um complexo com o
factor VII, mediado por iões cálcio. Este complexo age sobre o factor X estimulando sua
conversão em Xa. A partir deste ponto, as duas vias encontram um caminho comum em
que ocorre a conversão de protrombina em trombina que, por sua vez, estimula a
transformação de fibrinogénio em fibrina (23).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 82
O sistema de coagulação foi considerado, por muito tempo, como sendo
constituído apenas por factores de coagulação e plaquetas. Actualmente considera-se um
sistema multifacetado, extremamente equilibrado, no qual participam componentes
celulares e moleculares. O modelo clássico da cascata da coagulação foi um grande
avanço para compreender a formação do coágulo in vitro e para a monitorização
laboratorial, porém várias falhas foram detectadas em observações clínicas in vivo. Por
exemplo, embora deficiências de cininogénio de alto peso molecular, pré-calicreína e
factor XII prolonguem o tempo de tromboplastina parcial, elas não causam alterações
significativas na hemorragia. Assim como esta, outras alterações da coagulação não
conseguiam ser explicadas com o modelo clássico da cascata. Investigadores na área da
coagulação concluíram que a via intrínseca não tem um verdadeiro papel fisiológico na
hemostase (27). O complexo formado pelo TF e factor VII (TF/FVII) iniciador da via
extrínseca pode também activar o factor IX da via intrínseca. Outra importante descoberta
foi que a trombina é activadora fisiológica do factor XI, “saltando” as reacções iniciais
induzidas pelo contacto. Estas descobertas permitiram concluir que a activação do
complexo TF/FVII é o principal evento desencadeador da hemostase (28).
Em condições normais, coagulação e fibrinólise encontram-se em equilíbrio
dinâmico de tal forma que, ocorrendo simultaneamente, enquanto a primeira interrompe
Figura 18: Visão actual da Cascata da
Coagulação. A cascata inicia-se pela
via extrínseca após exposição (pela
lesão vascular) ou expressão
(induzida por mediadores
inflamatórios) do factor tecidual que
conduz à activação do FVII. O
complexo FVIIa/FT activa os factores
IX e X. Há medida que os níveis de
FXa aumentam, o complexo
FVIIa/FT é inactivado pelo TFPI. A
coagulação é mantida pelas reacções
da via intrínseca iniciadas pelo FXIa.
Ambas as vias intrínseca e extrínseca
convergem para a via comum na qual
a pró-trombina é convertida em
trombina que catalisa o fibrinogénio
em fibrina. Esta é estabilizada pelo
FXIIIa. Legenda: Pho – fosfolípidos,
FpA – Fibrinopeptídeo, FT – Factor
tecidual, TFPI – Inibidor da Via do
Factor Tecidual. Activação →
Amplificação ●-----● Inibição
(Retirado de (82))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 83
a perda sanguínea, a última remove a fibrina formada em excesso e o sangue volta a fluir
normalmente no interior do vaso restaurado.
A plasmina, proteína que lisa a rede de fibrina é derivada do plasminogénio que
está ligado internamente à rede de fibrina. O activador tecidual do plasminogénio (TPA:
tissue plasminogen activator), libertado pelo endotélio que circunda a área da lesão é
responsável pelo desencadeamento do processo que limita a progressão desnecessária da
trombose (25).
A antiplasmina, presente no plasma, combina-se com o excesso de plasmina
libertada, impedindo o aparecimento de fibrinólise generalizada. Esta proteína está
presente na circulação numa concentração plasmática 10 vezes maior do que a plasmina
(25).
A plasmina não restringe a sua acção apenas sobre a fibrina. Também é capaz de
cindir o fibrinogénio ou agir directamente sobre a fibrina, quer seja polimerizada ou não,
formando os produtos de degradação da fibrina (PDFs). Os PDFs são removidos da
circulação principal pelo fígado e pelo sistema retículo endotelial. Entretanto, se a
produção de PDFs superar a capacidade de clearance, ocorre a acumulação do excedente
produzido, podendo atingir níveis tais que passam a inibir a coagulação normal, através
da interferência com a polimerização da fibrina e induzindo alteração funcional das
plaquetas (25).
5.2. Papel na inflamação
As plaquetas são as principais células efectoras na hemostase. Para além disso,
são células inflamatórias multifacetadas com funções que abrangem, de forma contínua,
desde as respostas imunitárias inatas até à imunidade adaptativa. As plaquetas activadas
têm actividades tromboinflamatórias essenciais numa variedade de distúrbios vasculares
e vasculopatias. Recentemente, foram identificadas actividades inflamatórias e
imunológicas que fornecem dados importantes sobre a biologia destes elementos e que
são directamente relevantes para as doenças vasculares humanas (5).
Tal como foi anteriormente referido, as plaquetas são altamente especializadas na
hemostase, auxiliando o organismo em situações de lesão vascular endotelial e de ruptura,
sendo esta a função mais conhecida das plaquetas. No entanto, as plaquetas também são
células efectoras inflamatórias e têm actividades em todo o espectro de inflamação aguda
na imunidade adaptativa (29).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 84
Existem evidências que as especializações inflamatórias de plaquetas, assim como
as suas especializações para a hemostase, são adaptações evolutivas que facilitam a defesa
do hospedeiro, a reparação tecidual e a protecção contra agentes patogénicos (30).
Para além disso, as plaquetas fornecem ligações fundamentais entre os membros
hemostáticos e inflamatórios do sistema de defesa do hospedeiro, contribuindo para a
integridade vascular, para a reparação de feridas e para a manutenção da integridade do
tecido (30–32).
As plaquetas humanas respondem com múltiplas actividades efectoras de
imunidade inata quando há sinalização por agonistas endógenos gerados ou lançados
durante os processos de hemostase e inflamação por toxinas microbianas ou por outros
agentes patogénicos microbianos. As funções chave das plaquetas nas actividades de
imunidade inata incluem a liberação de quimiocinas, citocinas e outros mediadores e
interacções com células endoteliais, monócitos e neutrófilos, os quais também têm uma
resposta crítica na imunidade inata e na inflamação aguda (29,30,33–36)
Por outro lado, as plaquetas activadas operam de forma contínua no sistema
imunológico e têm um arsenal substancial de actividades no sistema imunitário adaptativo
(29,33). Estas actividades incluem a síntese e libertação de mediadores imunes
pleiotrópicos, incluindo a interleucina (IL)-1β, o ligando CD40 (CD40L) e/ou a
quimiocina CCL5 e interacção com subclasses de linfócitos e células dendríticas (30).
São também recém-conhecidas actividades inflamatórias das plaquetas, incluindo
as respostas mediadas pelo receptor toll-like (TLR) e a capacidade de accionar a formação
de armadilhas de neutrófilos (NETs: neutrophil extracelular traps) (30) (Figura 19).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 85
Assim sendo, o estudo das actividades das plaquetas em doenças vasculares e
vasculopatias tem sido alvo de grande atenção. Para além das já conhecidas funções na
hemostase e trombose, sabe-se hoje que as plaquetas activadas têm também um papel
relevante na resposta inflamatória (30,37). A trombina e o fibrinogénio são factores pró-
inflamatórios muito importantes, para além de serem muito importantes os componentes
da cascata de coagulação (38,39). Sendo assim, as actividades tromboinflamatórias das
plaquetas contribuem para um grande número de doenças vasculares.
As plaquetas têm vários receptores de superfície que, para além de regularem e
induzirem a resposta hemostática por parte das plaquetas, muitos deles também activam
as plaquetas para uma resposta pro-inflamatória, em conjunto com a activação da cascata
pro-trombótica de sinalização (30).
As plaquetas activadas têm diversos mecanismos de sinalização inflamatória e
intracelular, assim como conseguem a transferência de factores biologicamente activos e
de informação molecular (30,33). A desgranulação rápida e a secreção de factores pré-
formados solúveis são clássicas respostas de activação das plaquetas (29,30).
As plaquetas funcionam como mediadores da inflamação em doenças vasculares.
Apesar dos agentes patogénicos, LPS e outras toxinas microbianas podem induzir
directamente as características patológicas da sepsis vascular. Há evidências substanciais
de que as plaquetas são efectoras celulares cruciais (Figura 20) (29,30,34,40).
Figura 19: Os neutrófilos humanos formam armadilhas de neutrófilos extracelulares (NETs) em
resposta a sinais das plaquetas activadas, em adição a outro tipo de estímulos. Os NET têm funções
antimicrobianas mas também medeiam a lesão tecidual e a inflamação vascular (Adaptado de (5))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 86
O sequestro das plaquetas activadas ligadas à fibrina e leucócitos pode contribuir
para a trombocitopenia em sepsis. A sinalização dependente das plaquetas do TLR pelo
LPS e outros factores bacterianos fornece um mecanismo de activação plaquetária na
sepsis (41–46). Por outro lado, a activação de plaquetas por factores do hospedeiro
gerados em sepsis, incluindo a trombina fornecem um segundo mecanismo. As respostas
patológicas dadas pelas plaquetas, incluindo a desgranulação, a secreção e a síntese
podem contribuir para a função da barreira endotelial alterada, a qual é central para a
sepsis e para o envolvimento de múltiplos órgãos, incluindo os pulmões, em diversos
síndromes sépticos de plaquetas (32,47–49).
O transcriptoma plaquetário é alterado na sepsis e pode potencialmente transmitir
alterações patológicas no proteoma das plaquetas, para além de assinaturas de
diagnóstico. Algumas micropartículas derivadas das plaquetas podem amplificar a
inflamação sistémica e a trombose (29).
A aterosclerose, doença crónica, que afecta os vasos de forma segmentar como
veremos mais à frente em pormenor, está num outro extremo do espectro de vasculopatias
inflamatórias e imunes. A inflamação da parede do vaso é central para a aterogénese. A
maioria das actividades inflamatórias das plaquetas e o seu reportório imunológico foram
implicados na iniciação e progressão das placas ateroscleróticas e em consequências
tromboinflamatórias da ruptura da placa. Ainda que não esteja completamente delineado
este aspecto, a actividade das plaquetas na imunidade imune inata e adaptativa pode
Figura 20: As plaquetas são efectoras da lesão inflamatória e imune, na evolução da
aterosclerose e em complicações tromboinflamatórias agudas desencadeadas pela ruptura
da placa bacteriana. PMN: linfócitos polimorfonucleares. (Adaptado de (5))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 87
contribuir para a evolução das lesões provocadas pela aterosclerose (50). As evidências
existentes para a contribuição das plaquetas activadas na iniciação e progressão de lesões
aterosclerótidas, incluem observações experimentais e clínicas de que as plaquetas
geralmente aderem a estrias de gordura e a placas existentes e que as plaquetas são
activadas por mediadores bioquímicos que se pensam ser importantes na aterogénese,
incluindo lipoproteínas oxidadas de baixa densidade (50).
Várias observações apoiam a existência de contribuições importantes das
plaquetas na iniciação e evolução de placas (50,51). Vários estudos clínicos sugerem a
persistente activação das plaquetas na aterosclerose e em condições que aumentam o risco
desta síndrome (37,50). Em contrapartida, muitas observações indicam que a activação
de plaquetas, as interacções célula-célula e os sinais inflamatórios são centrais nas
síndromes coronárias agudas e em outras complicações tromboinflamatórias da ruptura
de placas e em repostas nas intervenções vasculares, incluindo a angioplastia (37,52–55).
Assim, as plaquetas activadas podem ser células efectoras ubíquas em todas as fases de
inflamação vascular na aterosclerose.
Em suma, muito ainda está por descobrir sobre o repertório das plaquetas, não só
no que diz respeito à inflamação, como em muitos outros aspectos, havendo desde já a
certeza de que estas representam um papel chave na inflamação e, em particular, as
doenças vasculares.
5.3. Alterações quantitativas
As alterações quantitativas em plaquetas podem indicar patologias hemorrágicas
e dar uma orientação ao médico na detecção de outras condições relacionadas com a
imunidade, uma vez que estas apresentam como sintoma primário a diminuição destes
elementos (6).
No que diz respeito às alterações que podem existir quanto à quantidade de
plaquetas, podem distinguir-se dois grandes grupos:
Trombocitose
Trombocitopenia
A trombocitose ocorre quando existe um aumento do número de plaquetas
(superior a 400x109/L). Pode ser essencial (primária) ou reactiva (secundária).
Na trombocitose essencial ou primária, o número de plaquetas aumenta muito
significativamente (contagem superior a 1000x109/L). As principais causas da
trombocitose essencial são a trombocitemia essencial (ET) ou doenças
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 88
mieloproliferativas como a leucemia mielóide crónica, mielofibrose ou policitemia vera
(56,57).
As doenças mieloproliferativas são patologias em que as células que produzem
células sanguíneas (células precursoras) crescem e se reproduzem anormalmente na
medula óssea ou então são expulsas da mesma, devido a um desenvolvimento excessivo
do tecido fibroso. A TE integra o grupo das síndromes mieloproliferativas, cromossoma
Philadelphia negativas. Esta patologia caracteriza-se pela hiperproliferação
megacariocítica, com consequente ocorrência de trombocitose periférica e favorecendo
os fenómenos trombo-hemorrágicos. Para além da trombocitemia essencial, existem
outras doenças mieloproliferativas que podem desencadear a trombocitose essencial. A
mielofibrose tem como característica principal o envolvimento dos fibroblastos (células
que produzem tecido fibroso ou conectivo), que não são células precursoras dos
elementos sanguíneos. No entanto, os fibroblastos parecem ser estimulados por células
precursoras anormais, possivelmente megacariócitos. Nesta patologia existe um excesso
de tecido fibroso e a quantidade de glóbulos vermelhos e brancos imaturos e deformados
é elevada. Na policitemia vera, sendo também uma perturbação das células sanguíneas
precursoras que origina um excesso de glóbulos vermelhos, caracteriza-se também por
uma quantidade elevada de precursores eritróides. É uma perturbação rara e que,
geralmente, se manifesta na faixa etária dos 60 anos. Finalmente, a leucemia mielóide
crónica é uma patologia na qual uma célula que se encontra na medula óssea se transforma
em cancerosa e produz um número elevado de granulócitos anormais. Nesta doença,
existe uma quantidade elevada de mielócitos (precursores de granulócitos, um tipo de
glóbulos brancos) e uma quantidade elevada de granulócitos maduros e imaturos (6,58).
Figura 21: Trombocitose essencial (sangue periférico) (Retirado
de (78))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 89
Contrariamente à trombocitose, podem
ocorrer situações em que existe uma baixa de
plaquetas, designada por trombocitopenia, em
que os valores são inferiores a 150x109/L. Em
quantidades de plaquetas inferiores a
30x109/L, podem ocorrer hemorragias
anormais, ainda que, geralmente, este
problema não se observe até que as plaquetas
desçam abaixo das 10x109/L. Existem muitas
patologias que podem estar na origem da
diminuição da quantidade de plaquetas, mas em muitos casos não se detecta uma causa
específica. Ainda assim, conseguem distinguir-se quatro causas principais que levam a
uma diminuição na quantidade de plaquetas: produção insuficiente na medula óssea, o
sequestro das plaquetas em consequência de um baço grande, o aumento do seu uso, da
sua destruição ou, finalmente, a sua diluição no sangue (6).
Um dos primeiros sinais da diminuição na quantidade de plaquetas é a hemorragia
cutânea. Podem também ocorrer lesões punctiformes purpúreas na parte inferior das
pernas e é possível que as gengivas sangrem e se detecte sangue nas fezes ou urina. Nas
mulheres, a menstruação pode ser anormalmente intensa. Dada a dificuldade em estancar
as hemorragias, cirurgias ou acidentes podem ser perigosos. Em casos de diminuição do
número de plaquetas, a vigilância torna-se fundamental, uma vez que quanto menor for
este número, mais intensa se torna a hemorragia. Pessoas com plaquetas entre os 5x109/L
e 10x109/L de sangue correm o risco de perder grandes quantidades de sangue no aparelho
gastrointestinal ou de desenvolver hemorragias cerebrais mortais, mesmo sem existir
qualquer pancada (50,59).
A púrpura trombocitopénica idiopática é uma perturbação em que existe uma
diminuição de plaquetas que, sem causa aparente, produz uma hemorragia anormal. A
causa desta patologia é desconhecida, mas neste processo participa uma reacção
imunitária anormal (reacção auto-imune), pela qual os anticorpos destroem as plaquetas.
Embora neste caso a medula óssea aumente a produção de plaquetas para compensar a
sua destruição, a produção é inferior à procura (6,60).
Existem também situações em que a trombocitopenia é causada por uma doença.
A infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (VIH) causa com frequência
trombocitopenia, aparentemente porque os anticorpos contra o vírus também destroem as
Figura 22: Diferença entre um valor normal
de plaquetas e a trombocitopenia (Retirado de
(79))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 90
plaquetas. Outras doenças também podem causar trombocitopenia como o lúpus
eritematoso sistémico, que diminui a quantidade de plaquetas por meio da produção de
anticorpos, a coagulação intravascular disseminada, que forma pequenos coágulos em
todo o organismo que consomem precocemente as plaquetas e os factores de coagulação.
Existe também a púrpura trombótica trombocitopénica, que é uma perturbação não muito
frequente, que apresenta risco letal em que formam, de forma repentina, pequenos
coágulos de sangue em todo o organismo, levando a uma diminuição muito acentuada de
plaquetas e glóbulos vermelhos, assim como febre e lesões disseminadas em vários
órgãos (6).
5.4. Alterações qualitativas
Para além de alterações quantitativas que podem ocorrer, as plaquetas podem
também apresentar alterações qualitativas, situações em que a pessoa pode ter a contagem
plaquetária normal, não significando isso que não seja portadora de uma outra patologia
relacionada com a coagulação. Assim sendo, quando se faz a observação de um esfregaço
de sangue periférico, há que ter em atenção três aspectos essenciais: o tamanho, a
distribuição e a granulação.
Quanto ao tamanho, as plaquetas podem ser de tamanho normal, com cerca de ¼
ou menos do glóbulo vermelho; podem ser macroplaquetas com cerca de metade do
glóbulo vermelho ou, em última hipótese, podem ser plaquetas gigantes, onde o tamanho
corresponde a aproximadamente ao tamanho do glóbulo vermelho (6).
Quanto à distribuição, as plaquetas podem estar dispersas, em agregados
plaquetários ou em satelitismo plaquetário.
No que diz respeito à granulação, esta pode ser normal ou desgranulada.
Figura 23: Esfregaço de sangue periférico normal
(Retirado de (80))
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 91
5.5. Aplicação das Análises Clínicas no diagnóstico de patologias plaquetárias
Tal como em muitas outras áreas da
medicina, as análises clínicas têm um papel
fundamental no diagnóstico de patologias
plaquetárias.
Doentes que sofrem contusões e hemorragias
anormais estão predispostos à presença de
trombocitopenia. Deste modo, todos os doentes que
aparentam ter perturbações que possam originar uma quantidade de plaquetas inferior à
normal, são sistematicamente controlados, através de análises clínicas. Em algumas
situações, a presença de trombocitopenia detecta-se por meio de análises de sangue
realizadas por outras razões, em doentes que carecem de sintomas de hemorragia. É
sempre fundamental que o médico consiga detectar a causa da trombocitopenia. Por
exemplo, os doentes normalmente têm febre quando a trombocitopenia é produto de uma
infecção, de uma doença auto-imune (lúpus eritematoso sistémico, púrpura trombótica
Figura 25: Satelitismo plaquetário (sangue periférico)
(Retirado de (82))
Figura 24: Agregados plaquetários (sangue
periférico) (Retirado de (82))
Figura 26: Observação ao microscópio de
um esfregaço sanguíneo (Retirado de (81))
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Rute Nogueira 92
trombocitopénica). Por outro lado, a presença de febre não é se verifica quando a causa é
a trombocitopenia idiopática ou o uso de medicamentos. Durante o controlo clínica feito
pelo médico, pode também ser detectada a presença de um baço grande, o que sugere que
o baço está a capturar as plaquetas e que a trombocitopenia é produto de uma perturbação
que origina um aumento do baço (6).
De modo a determinar a gravidade da trombocitopenia e detectar-se as suas
possíveis causas, a amostra de sangue pode ser examinada ao microscópio ou então
avaliar-se de forma automatizada o volume e a quantidade de plaquetas. Por outro lado,
uma amostra de medula óssea (obtida por aspiração) pode fornecer informações sobre a
produção de plaquetas (6).
No diagnóstico da trombocitemia, a contagem de plaquetas é superior a 500x109/L
de sangue e, muitas vezes, ultrapassa 1000x109/L. Na análise ao microscópio, a amostra
de sangue apresenta plaquetas anormalmente grandes, grupos de plaquetas anormais e
fragmentos de megacariócitos. A distinção entre a trombocitemia primária e a secundária
pode ser feita através da pesquisa de outras doenças que possam estar a causar o aumento
da quantidade de plaquetas, sendo também útil nestes casos uma biopsia da medula óssea
(6,57).
Actualmente, na avaliação da função plaquetária é utilizado o teste de screening
da função plaquetária (PFA-100). Este teste veio substituir o tempo de hemorragia, como
teste de função plaquetária. Ainda que em muitos laboratórios este teste ainda não esteja
a ser utilizado, como no caso do laboratório do estágio descrito na primeira parte deste
trabalho, tem vindo a ser cada vez mais implementado. Este sistema tem uma velocidade
de fluxo sanguíneo muito elevada que vai dos 5000 a 6000 s-1. Neste teste não existe
interferência das células endoteliais, ao contrário do que acontece no tempo de
hemorragia em que o endotélio vascular é lesado. No sistema PFA-100 (Siemens), o
sangue anti coagulado com citrato é colocado num cartucho contendo uma membrana
revestida com colagénio/ADP ou colagénio/epinefrina. As plaquetas vão fazer a oclusão
de uma abertura da membrana por um pequeno trombo plaquetário. Este teste avalia
apenas a função das plaquetas (82).
No que diz respeito à mielofibrose, esta não costuma produzir sintomas durante
anos. Ao fim de já algum tempo, a anemia causa fraqueza e cansaço, os doentes perdem
peso e não se sentem bem. O facto de o baço e o fígado poderem aumentar, pode causar
dores abdominais (6).
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Rute Nogueira 93
Aquando da existência de mielofibrose, na observação ao microscópio, os
glóbulos vermelhos encontram-se deformados e imaturos e, para além disso, observa-se
a presença de anemia. No entanto, é sempre exigida uma biopsia da medula óssea de
modo a se obter a confirmação do diagnóstico (6).
A policitemia vera normalmente é diagnosticada através de análises de sangue de
rotina, mesmo antes de a pessoa ter qualquer tipo de sintoma. Os valores de hemoglobina
(proteína que transporta o oxigénio nos glóbulos vermelhos) e os valores de hematócrito
(percentagem de glóbulos vermelhos no volume total de sangue) são anormalmente altos.
Ainda que um valor de hematócrito superior a 54% no homem ou 49% na mulher possa
indicar policitemia, não se pode chegar a um diagnóstico apenas com este dado. Para
avaliar a quantidade de glóbulos vermelhos no organismo, é útil a realização de um exame
com glóbulos vermelhos marcados com radioactividade, facilitando o diagnóstico. Em
algumas raras situações, é necessário efectuar uma biopsia da medula óssea. Um valor de
hematócrito elevado também pode indicar uma policitemia relativa, ou seja, uma
perturbação em que a quantidade de glóbulos vermelhos é normal, mas a proporção de
líquido no sangue é baixa (6,58).
Uma policitemia secundária apresenta um excesso de glóbulos vermelhos causado
por outras doenças, como por exemplo se existir uma baixa concentração de oxigénio no
sangue, que por sua vez vai estimular a medula óssea a produzir uma maior quantidade
de glóbulos vermelhos. Por exemplo, as pessoas que sofrem de doenças pulmonares
crónicas ou cardíacas, os fumadores e as que vivem a grandes altitudes podem apresentar
um número elevado de glóbulos vermelhos. A policitemia vera pode ser distinguida de
outras formas de policitemia secundária através da medição da concentração de oxigénio
numa amostra de sangue extraída de uma artéria. Situações em que os valores de oxigénio
se encontrem anormalmente baixos podem levar à suspeita de policitemia secundária (6).
Os valores de eritropoietina no sangue, uma hormona que estimula a produção de
glóbulos vermelhos por parte da medula óssea, também podem ser quantificados e
diferem na policitemia vera e na secundária. Na policitemia vera, os valores de
eritropoietina são extremamente baixos, enquanto na policitemia secundária apresentam-
se normais ou elevados. Em casos raros, os quistos no fígado ou nos rins e os tumores do
fígado ou do cérebro produzem eritropoietina, pelo que pessoas que sofrem destas
doenças apresentam valores elevados desta hormona e podem contrair uma policitemia
secundária (6).
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Rute Nogueira 94
6. Doenças vasculares
As doenças vasculares alteram a integridade dos vasos sanguíneos e podem ser
causadas por herança familiar ou genética, por hábitos de vida prejudiciais, por hábitos
da vida profissional e por uma série de outros factores que podem causar o
comprometimento dos vasos sanguíneos (7).
Algumas doenças hereditárias podem causar a formação de coágulos, que podem
tanto afectar o fluxo de sangue num só local como podem deslocar-se pela corrente
sanguínea e alojar-se em outros órgãos, como é o caso dos pulmões. Nestes casos, o
diagnóstico familiar precoce é fundamental na sua prevenção (7).
A degradação acentuada dos hábitos de vida, com o avançar da sociedade, está
cada vez mais a ter uma influência negativa sobre o nosso organismo. Em consequência
disto, o aumento do colesterol LDL leva à sua infiltração dentro da parede dos vasos, o
que, a longo prazo, se transforma em placas de gordura e cálcio. Este processo gera uma
patologia denominada aterosclerose, referida com mais pormenor num capítulo à frente.
A acumulação das placas em diversos vasos podem levara à obstrução dos mesmos
aquando da ocorrência do desprendimento destas placas. Como forma de prevenção desta
patologia devem ser adoptados hábitos de vida mais saudáveis, uma actividade física
regular e uma alimentação mais variada (7).
Por outro lado, trabalhar de pé ou numa posição fixa pode levar a uma redução do
fluxo de sangue nas partes do corpo que se encontram mais longe do coração, podendo
levar ao aparecimento de varizes. A prevenção passa pela mudança de hábitos no local de
trabalho, mudando de movimentos e posições, tanto quanto possível, estimulando a
circulação. Medicações, como anticoncepcionais, alteram também o fluxo normal do
sangue (7).
Em suma, este tipo de patologias pode ser evitado se existir um conhecimento do
estado de saúde de todo o corpo, dependendo também dos hábitos de vida adoptados (61).
Em seguida vão ser referidos mais em pormenor os diferentes tipos de doenças
arteriais e doenças venosas existentes.
6.1.Doenças Arteriais
6.1.1. Doença das artérias coronárias
As artérias coronárias têm como função promover a irrigação e distribuição de
sangue arterial para todo o músculo cardíaco, levando o sangue que provém da artéria
aorta, directamente para artérias menores dentro do coração, irrigando as células
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 95
cardíacas. Quando ocorre a interrupção do fluxo nestas artérias, ocorre a doença das
artérias coronárias (62).
O processo anterior ocorre gradualmente e designa-se por aterosclerose. As fases
iniciais da aterosclerose iniciam com a disfunção do endotélio. Esta disfunção facilita a
deposição do colesterol e a formação de placas (63). A aterosclerose afecta as artérias do
cérebro, do coração, dos rins, de outros órgãos vitais e dos braços e das pernas. Quando
a aterosclerose se desenvolve nas artérias carótidas pode ocorrer um AVC. Por outro lado,
ao desenvolver-se nas artérias coronárias pode ocorrer um enfarte do miocárdio (7).
A aterosclerose tem início quando os monócitos migram da corrente sanguínea
para o interior da parede da artéria e transformam-se em células que acumulam
substâncias gordas. Com o tempo, estes monócitos carregados de gordura acumulam-se
e produzem espessamentos, distribuídos irregularmente pelo revestimento interno da
artéria. Cada placa aterosclerótica ou de ateroma enche-se de uma substância formada por
diversas substâncias gordas, principalmente colesterol, células musculares lisas e células
de tecido conjuntivo. Em geral, os ateromas formam-se nos locais onde as artérias se
ramificam (7).
As artérias afectadas perdem a sua elasticidade e vão-se tornando mais estreitas à
medida que os ateromas crescem. Para além disso, as artérias acumulam depósitos de
cálcio que se podem tornar frágeis e rebentar. Assim, o sangue pode entrar num ateroma
rebentado, aumentando o seu tamanho e diminuindo ainda mais o lume arterial. Um
ateroma rebentado também pode desencadear a formação de um coágulo sanguíneo. O
coágulo estreita ainda mais a artéria, podendo provocar a sua oclusão ou desprender-se e
alcançar uma artéria mais pequena, onde causará uma oclusão (embolia) (7,63).
Em geral, a aterosclerose só causa sintomas a partir do momento em que a artéria
fica gravemente estreita ou até que cause uma obstrução súbita, dependendo muito do
local onde se desenvolve. Quando há o estreitamento de uma artéria, pode ocorrer uma
dor ou uma cãibra nos momentos em que o fluxo de sangue é insuficiente para satisfazer
as necessidades de oxigénio. Há medida que o ateroma aperta a artéria, estes sintomas
vão-se desenvolvendo gradualmente. Por outro lado, quando ocorre uma obstrução
subida, os sintomas aparecem de imediato (7,63).
O risco de desenvolvimento da aterosclerose aumenta com a hipertensão arterial,
com os altos valores de colesterol, com o tabagismo, a diabetes, a obesidade, a falta de
exercício e a idade avançada (7).
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Rute Nogueira 96
Eliminar os factores de risco controláveis que contribuem para a aterosclerose é
uma forma de a prevenir. O hábito de fumar é um dos hábitos que devem ser reduzidos
ou mesmo eliminados. Para além de diminuir a concentração de HDL, aumenta a
concentração de LDL. Por sua vez, o colesterol também aumenta o valor do monóxido de
carbono no sangue, o que pode aumentar o risco de lesões do revestimento da parede
arterial e, além disso, contrair as artérias já estreitadas pela aterosclerose, diminuindo a
quantidade de sangue que chega aos tecidos (62). Por outro lado, o hábito de fumar
aumenta a tendência de coagulação do sangue, o que aumenta o risco de doença arterial
periférica, doença das artérias coronárias, AVC e obstrução de um enxerto arterial depois
de uma intervenção cirúrgica (7).
Como seria de esperar, a doença das artérias coronárias pode levar a
consequências graves, como é o caso da angina de peito e do enfarte agudo do miocárdio.
A angina de peito é o nome dado a uma sensação de desconforto torácico originada
no coração e causada pela falta de oxigénio para as células cardíacas. As necessidades do
coração em oxigénio dependem do esforço que se está a efectuar, pelo que, ao aumentar
a actividade do coração é necessário mais oxigénio. Se as artérias estão mais estreitas ou
existe uma obstrução que impede o aumento da chegada de sangue ao músculo cardíaco
para compensar a maior necessidade de oxigénio, vai ocorrer uma isquemia e, como
consequência, dor (64).
Por sua vez, o enfarte agudo do miocárdio ocorre quando parte do fluxo sanguíneo
que chega ao coração é reduzida ou interrompida de uma forma brusca e grave,
produzindo-se a morte do miocárdio por insuficiência em oxigénio. O coágulo sanguíneo
é, geralmente, a causa mais frequente da interrupção de uma artéria coronária (7,64).
6.1.2. Doença das artérias periféricas
A doença arterial oclusiva inclui a doença das artérias coronárias, que pode
levar a um enfarte, e a doença arterial periférica, que afecta a aorta abdominal e os seus
ramos principais, assim como as artérias das pernas. Ainda que existam outras doenças
vasculares periféricas, neste trabalho vão apenas ser referidas as mais relevantes para o
caso em estudo, tal como referido logo no início desta exposição (7).
Em geral, pessoas com doença arterial periférica têm aterosclerose. No entanto,
uma oclusão arterial parcial ou completa pode ser o resultado de outras causas, como um
coágulo sanguíneo. Quando ocorre o estreitamento de uma artéria, as partes do organismo
que ela irriga recebem um fluxo insuficiente. A consequente diminuição da provisão de
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Rute Nogueira 97
oxigénio (isquemia) pode manifestar-se subitamente (isquemia aguda) ou de forma
gradual (isquemia crónica) (7,65).
A prevenção desta patologia passa pela redução dos factores de risco da
aterosclerose, já referidos anteriormente. Quando a doença arterial periférica se
manifesta, o objectivo principal é o tratamento das complicações (cãibras nas pernas ao
caminhar, angina de peito, arritmias, insuficiência cardíaca, enfarte, icto e insuficiência
renal) (7).
A obstrução da aorta abdominal pode ocorrer de forma súbita e completa, em
geral,quando um coágulo transportado pela corrente sanguínea se incrusta numa artéria
(embolia), quando se forma um coágulo (trombose) numa artéria estreitada ou quando se
rompe a parede arterial (dissecação aórtica) (7,65).
Uma obstrução súbita e completa da artéria mesentérica superior, o ramo
principal da aorta abdominal que alimenta grande parte do intestino, é muito grave. No
início, aparecem habitualmente vómitos e evacuações diarreicas e o abdómen pode estar
levemente distendido. Pode aparecer sangue nas fezes e, por último, diminui a pressão
arterial e a pessoa sofre um choque ao mesmo tempo que o intestino gangrena (7).
Quando ocorre um estreitamento gradual de uma artéria das pernas, o principal
sintoma é a sensação dolorosa, cãibras ou cansaço nos músculos da perna com a
actividade física (claudicação intermitente). Em geral, a dor localiza-se na barriga da
perna, mas depende muito do local onde ocorreu o estreitamento, podendo as dores ser
aliviadas quando existe repouso. A curto prazo e com o consequente agravamento da
doença, a distância que a pessoa consegue caminhar sem sentir dor torna-se menor. A
longo prazo, a claudicação começa a ocorrer em repouso. O pé, com o afluxo de sangue
acentuadamente diminuído, arrefece e fica entorpecido. Uma obstrução grave pode causar
a morte dos tecidos (7).
O tratamento depende muito do estado do doente. Doentes com claudicação
intermitente devem caminhar pelo menos 30 minutos por dia, interrompendo a caminhada
quando existe dor. Desta forma, existem melhorias pois o exercício melhora a função
muscular e provoca o aumento de outros vasos sanguíneos que alimentam os músculos.
Por outro lado, o hábito tabágico deveria ser completamente eliminado. Dormir numa
posição mais elevada também vai ajudar, pois aumenta a irrigação sanguínea das pernas.
No que diz respeito a fármacos, a administração de Pentoxifilina para aumentar a
distribuição do oxigénio aos músculos também é usual, assim como a utilização de
antagonistas do cálcio ou a Aspirina (7).
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6.2.Doenças Venosas
As doenças que ocorrem ao nível das veias designam-se por doenças venosas e
atingem aproximadamente mais de 50% da população portuguesa com diferentes
localizações e graus de gravidade (7).
As veias são vasos sanguíneos com a função de levar o sangue de todos os órgãos
até ao coração. No entanto, podem ocorrer diversos problemas como a inflamação, a
coagulação ou a dilatação das veias que levam à ocorrência de patologias venosas (7).
As pernas contêm dois grupos principais de veias: as superficiais, localizadas na
camada subcutânea, rica em tecido adiposo por debaixo da pele, e as profundas,
localizadas nos músculos. Em geral, a pressão do sangue em todas as veias é baixa, sendo
que nas pernas esta pressão pode representar um problema. Em situações normais, quando
uma pessoa está de pé, o sangue deve circular das veias das pernas para cima, em direcção
ao coração, sendo que as veias profundas desempenham um papel crucial ao fazer a
propulsão do sangue para cima, dada a sua localização dentro dos músculos da barriga
das pernas, pois são profundamente comprimidas em cada passada. Estas veias
transportam 90% ou mais do sangue que vai das pernas para o coração. Cada válvula, de
sentido único, é formada por duas cúspides cujos bordos fazem contacto entre si. O
sangue empurra as cúspides, que se abrem como um par de portas giratórias, mas quando
o sangue tende a regressar na direcção oposta, forçado pela gravidade, empurra as
cúspides de modo a que estas se fechem (7,66,67).
As veias superficiais têm o mesmo tipo de válvulas, mas não estão sujeitas a
qualquer tipo de pressão, uma vez que não se encontram rodeadas por músculos. Assim
sendo, o sangue das veias superficiais flui mais lentamente do que o sangue das veias
profundas (7,68).
6.2.1. Trombose das veias profundas
A trombose das veias profundas resulta da coagulação do sangue nas veias
profundas. À formação de um coágulo num vaso sanguíneo denomina-se trombo. Ainda
que se possam formar trombos nas veias superficiais e profundas da perna, apenas os
trombos das veias profundas podem ser perigosos. A trombose das veias profundas pode
ser perigosa na medida em que o trombo se pode desprender, parcial ou integralmente,
deslocando-se pela corrente sanguínea e alojando-se numa artéria pulmonar, obstruindo
o débito sanguíneo. Alguns trombos podem estar em movimento em forma de êmbolo.
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Rute Nogueira 99
Quanto menor for a inflamação à volta do trombo, menos ele vai aderir à parede venosa
e maior é a probabilidade de se transformar num êmbolo. A pressão que os músculos da
barriga da perna exercem, pode levar ao desprendimento do trombo, sobretudo quando
uma pessoa convalescente começa a realizar cada vez mais actividade (7,68).
Os êmbolos originados nas veias das pernas vão obstruir uma ou mais artérias dos
pulmões, provocando uma embolia pulmonar. A gravidade desta patologia depende do
tamanho e da quantidade de êmbolos (7).
A trombose das veias profundas pode ter como causas principais causas as lesões
do revestimento interno da veia ou a hipercoagulabilidade associada a algumas formas de
cancro (7,69).
Cerca de metade dos casos de tromboses das veias profundas não têm sintomas.
A dor no peito causada por uma embolia pulmonar pode ser uma das primeiras indicações
da perturbação. Em casos em que a trombose das veias profundas causa inflamações
substanciais e obstrução da corrente sanguínea, a barriga da perna incha e pode doer,
sentir dor ao tacto e estar quente. O tornozelo, o pé ou a coxa também podem inchar em
função das veias afectadas. Alguns trombos tratam-se através da transformação em tecido
cicatricial, o que pode lesionar as válvulas das veias. Em consequência disto, vai haver
acumulação de líquido e consequente inchaço da coxa, edema este que vai piorando ao
longo do dia, devido ao efeito da gravidade. Por outro lado, durante a noite, o edema vai
desaparecer em consequência da posição horizontal das pernas, que leva ao esvaziamento
das veias. Por vezes, pode ocorrer o aparecimento de uma cor castanha na pele,
geralmente por cima do tornozelo. Esta alteração da cor deve-se ao facto de um número
significativo de glóbulos vermelhos saírem para fora das veias dilatadas. A pele
pigmentada é vulnerável e uma lesão menor, como um rasgão ou um corte podem rompê-
la e provocar uma úlcera (7,67).
7. Aplicação da patologia plaquetária e da cirurgia vascular
7.1.Trombocitopenia na sequência de doenças vasculares – Caso Clínico
Tal como foi referido na introdução deste trabalho, um dos seus objectivos prende-
se com uma patologia de um familiar próximo, tentando encontrar abordagens teóricas
que consigam explicar os acontecimentos ocorridos. Fazendo uma abordagem inicial do
que se vai expor de seguida, inicialmente foi descoberta uma baixa muito acentuada de
plaquetas e, alguns anos depois, foi revelado um entupimento grave da artéria femoral
esquerda.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 100
2008 - Após uma ida de urgência ao hospital devido a uma infecção nos
dentes, as análises estavam todas normais excepto os parâmetros de
infecção e as plaquetas, que tinham um valor de 76x109/L de sangue. Na
altura, esta situação não foi considerada significativa, a nível hospitalar.
2011 - As queixas de dores e cansaço começaram a agravar-se cada vez
mais e, após ida ao médico de família, este recomendou a realização de
análises de rotina para perceber se estava tudo bem. Os resultados das
análises, feitas no dia 15 de Novembro de 2011, permitiram verificar que
o valor de plaquetas era de 44x109/L, com registo de trombocitopenia e
observação de macroplaquetas. Esta situação, despertou, de imediato um
alerta médico, tendo o paciente sido reencaminhado, de urgência, para o
hospital. De seguida, logo no dia 24, após ida ao hospital de urgência (com
carta da médica de família), houve lugar à repetição de análises com um
valor de plaquetas de 65x109/L. A reavaliação médica levou ao início da
terapêutica com Lepicortinolo. Este medicamento tem como substância
activa a Prednisolona, glucocorticóide que pode inibir a infiltração de
leucócitos no local da inflamação, interferir com os mediadores de
resposta inflamatória e suprimir as respostas humorais. Existe assim uma
redução da reacção inflamatória, pois a Prednisolona limita a dilatação
capilar e da permeabilidade das estruturas vasculares. Uns dias depois,
logo a 30 de Novembro, as análises foram repetidas e as plaquetas
encontravam-se com um valor de 126x109/L, já sob o efeito de medicação.
A 11 de Dezembro, por indicação médica, o hemograma foi repetido a
nível hospitalar, com o objectivo de reavaliar a trombocitopenia. Por esta
altura, o valor de plaquetas era de 54x109/L, a hemoglobina de 16,9 g/L,
leucocitose de 11,4x109/L e PCR de 0,60 mg/L. A função renal e as
transaminases encontravam-se sem alterações. Neste mesmo dia foi
recomendado o estudo de doenças auto-imunes, hematológicas e
infecciosas em ambulatório, de modo a averiguar uma possível causa para
a trombocitopenia. Após 4 dias, houve uma repetição de análises que
demonstrou novamente trombocitopenia de 58x109/L, ainda com
observação de macroplaquetas. Foram realizados o teste de HIV, Reacção
de Widal, Reacção de Hudlesson e VDRL, tendo todos dado resultados
negativos. A análise feita aos anticorpos anti-nucleares (ANA) obteve
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 101
resultado positivo, em titulação de 1/160 com padrão mosqueado fino. No
âmbito destas mesmas análises foi feita a Proteína C de alta sensibilidade,
obtendo-se um resultado de 3,20 mg/L, o que representa um alto risco
cardiovascular. Todos os marcadores de hepatite deram negativos.
A 26 de Dezembro de 2011, o paciente começou a ser seguido por outra
médica e, após a realização de análises, as plaquetas subiram ligeiramente,
tendo sido encontrado um valor de 84x109/L com o PDW alterado, o que
sugeria uma alteração qualitativa ao nível das plaquetas existentes. Após
algumas análises efectuadas no serviço de imunohemoterapia do Curry
Cabral, verificou-se que a pesquisa de anticorpos antiplaquetários foi
negativa e ANA positivo com titulação de 1/320, de padrão fino granulado.
2012 - A 20 de Julho, o paciente começou a ser seguido por um especialista
em doenças auto-imunes, realizando análises no hospital que apresentaram
as plaquetas a 36x109/L, com PDW de 21,60%, ou seja, ainda muito
elevado. O anticoagulante lúpico deu um resultado fracamente positivo.
Os ANA permaneceram positivos, com titulação de 1/640 e padrão
mosqueado. A medicação continuou a mesma (Lepicortinolo). A 19 de
Setembro houve repetição dos ANA, com resultado positivo com titulação
de 1/320 e padrão mosqueado.
A 31 de Outubro, a equipa médica assistente, decidiu fazer despiste de
leucemia, fazendo um mielograma. O resultado foi o seguinte: amostra
com grumos mas com alguma destruição celular. Celularidade normal.
Série mielóide sem alterações morfológicas e/ou maturativas
significativas. Série eritróide sem alterações morfológicas e/ou
maturativas significativas. Série megacariocítica: em número ligeiramente
superior ao normal, alguns megacariócitos morfologicamente normais mas
de dimensões mais reduzidas, alguns megacariócitos igualmente de
dimensões reduzidas mas com citoplasma de contornos lisos, mais
basófilo e menos granular. Alguns macrófagos. Não se observaram células
estranhas à medula óssea nem parasitas. Trombocitopenia muito
provavelmente de causa central. Nesse momento, e com o resultado do
mielograma negativo, continuando a causa da trombocitopenia por
descobrir.
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Rute Nogueira 102
2013 - A 5 de Abril, o paciente foi transferido para outro especialista,
tendo nesta altura as plaquetas um valor de 83x109/L e o PDW de 15,40%.
Um mês depois, as plaquetas aumentaram para 109x109/L e o paciente
apresentava leucocitose, mantendo-se o PDW. Começava-se a notar
alguma instabilidade nos valores da trombocitopenia que, apesar de terem
aumentado com a cortisona, mantiveram-se muito oscilantes. A 24 de
Julho foi feito o despiste de artrite reumatóide, tendo o anticorpo anti-
citrulina dado resultado negativo.
Após o estudo de várias causas possíveis para a trombocitopenia, a médica
assistente decidiu enviar o paciente para o Hospital dos Capuchos, para o
serviço de hematologia, de modo a ser acompanhado por uma especialista
em hematologia. Nesta altura, as plaquetas encontravam-se com um valor
de 96x109/L e foi tomada a decisão de se começar a fazer o “desmame” da
cortisona de modo a poder ser feito um estudo mais aprofundado da
situação clínica do paciente, sem a interferência da medicação. Na consulta
seguinte e após análises de rotina, o paciente teve alta, com um valor de
plaquetas de 79x109/L, não tendo sido efectuado qualquer tipo de exame
mais aprofundado. Foi recomendado que apenas voltasse ao serviço caso
as plaquetas descessem para 20x109/L. Em análise feita no Instituto
Português do Sangue e da Transplantação, a 31 de Outubro, os anticorpos
antiplaquetários deram positivos.
Após tantas análises e exames, a médica acabou por diagnosticar
Trombocitopenia idiopática imune, dada a inexistência de uma causa para
a patologia encontrada.
2014 - A 25 de Janeiro, após um episódio de urgência devido a uma
infecção respiratória, as plaquetas desceram para 23x109/L, com PCR a
7,80 mg/L, o que levou ao internamento imediato do paciente, por risco de
hemorragia. Após dias com administração de altos níveis de cortisona, o
paciente teve alta com um valor de plaquetas de 72x109/L e a PCR a 0,92
mg/L.
Poucos dias depois, a 2 de Fevereiro, o paciente deixou de conseguir andar
e foi de urgência para o hospital. Nesta altura as plaquetas subiram para
162x109/L por elevado excesso de medicação, com consequências graves
para o organismo, que impossibilitavam o doente de se locomover
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Rute Nogueira 103
correctamente. Dias depois, as plaquetas voltaram aos valores habituais de
77x109/L, com PDW elevado. Para além da trombocitopenia, o paciente
sempre se queixou muito com dores nas pernas, dificuldade na locomoção,
cansaço e apneia. Com base nestas queixas, sempre lhe foi dito que eram
sintomas esperados devido à trombocitopenia apresentada. A 27 de Maio,
o paciente foi de novo à urgência, com queixa de claudicação intermitente.
Foi pedido um doppler, com o seguinte resultado: oclusão completa da
artéria femoral superficial esquerda (não havendo fluxo vascular) e
parcialmente ao nível da artéria femoral superficial direita. Com este
resultado, a médica assistente começou a relacionar os dois problemas
existentes. Muito provavelmente, e apesar de não ser muito comum, as
plaquetas estariam em baixo número como uma reacção de defesa do
organismo para que a artéria não ficasse ainda mais ocluída, tentando
evitar a formação de coágulos.
Nessa altura e após estudo do caso clínico, a abordagem médica passou
pela realização de uma cirurgia a 17 de Junho. Verificou-se presença de
isquemia grau III do membro inferior esquerdo; claudicação intermitente
do membro inferior esquerdo de agravamento progressivo e com três
meses de parestesias e dor em repouso. Sem feridas. Foi, então, realizado
um bypass e o paciente começou a fazer outro tipo de medicação:
Clopidogrel, Pentoxifilina e analgésicos.
A 29 de Outubro foi efectuada uma angio TAC que demonstrou a oclusão
do bypass femoral, tendo esta situação sido justificad pelo PDW alterado,
que fez com que as plaquetas do organismo rejeitassem um objecto
estranho como o bypass e o voltassem a ocluir. Apesar de ocluído, o
bypass pareceu resolver parcialmente a situação, pois as plaquetas
começaram a ter valores mais elevados, de 128x109/L, mas ainda com
PDW alterado e elevado.
2015 - Uma vez que a artéria voltou a ocluir, a médica assistente resolveu
recorrer a uma angioplastia à perna esquerda, com recurso a contraste, a 1
de Setembro. No final de 2015, as plaquetas mantinham-se estabilizadas e
já se observava circulação sanguínea na artéria femoral esquerda. Há
previsão de angioplastia à perna direita para 2016.
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Rute Nogueira 104
8. Abordagens Terapêuticas
8.1.Tratamentos antiplaquetários aplicados na prevenção de AVC em pacientes
com doenças vasculares associadas
8.1.1. Aspirina e Clopidogrel, antiagregantes plaquetários em utilização na
prevenção de doenças vasculares
O Clopidogrel pertence a um grupo de medicamentos denominados antiagregantes
plaquetários. Ao impedir a agregação das plaquetas, este medicamento reduz a
possibilidade de formação de coágulos sanguíneos (trombose). É utilizado em adultos
para prevenir a formação de coágulos sanguíneos (trombos vermelhos) que se formam
em vasos sanguíneos endurecidos (artérias), um processo conhecido como aterotrombose,
que pode conduzir a acidentes vasculares aterotrombóticos (70). No que diz respeito ao
seu mecanismo de acção, o Clopidogrel é um bloqueador irreversível do receptor de ADP
das plaquetas, o qual é fundamental na sua activação e agregação. Não tem efeitos a nível
dos prostanóides (mecanismo da Aspirina), sendo um avançado antagonista do receptor
de ADP que inibe a agregação plaquetária (70).
Por sua vez, a Aspirina contém ácido acetilsalicílico em baixas dosagens e
pertence a um grupo de medicamentos chamados antiagregantes plaquetários, que ajudam
a prevenir a agregação das suas plaquetas sanguíneas, prevenindo a formação de coágulos
(trombos) sanguíneos. É utilizado para ajudar a prevenir a formação de trombos em
doentes que tiveram acidente vascular cerebral, ataque cardíaco, cirurgia de bypass,
obstrução de um vaso sanguíneo ou que tenham angina de peito. Apesar de ser um
importante anti-inflamatório quando utilizado em altas concentrações, em baixas
concentrações funciona como antiagregante plaquetário, sendo a sua utilização mais
concentrada nesta aspecto (71). Como já é sabido, as plaquetas são responsáveis por
iniciar o processo de coagulação. A Aspirina tem como função inibir a agregação das
plaquetas, tornando o processo inicial da coagulação mais difícil de ocorrer. Em geral, é
prescrita em conjunto com outro antiagregante plaquetário (como o Clopidogrel) para
potencializar a inibição das plaquetas (72).
A baixa dose de Aspirina na terapia antiplaquetária continua a ser o medicamento
de escolha na prevenção de eventos cardiovasculares. No entanto, a protecção que a
Aspirina oferece para as pessoas com alto risco de eventos cardiovasculares é apenas
relativamente moderada. A evidência disponível através destes estudos mostra que o uso
de Clopidogrel com a Aspirina está associado a uma redução do risco de eventos
cardiovasculares em comparação com a Aspirina isolada em pacientes com síndrome
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 105
coraniana agudo, sem elevação do segmento ST. Em pacientes com alto risco de doenças
cardiovasculares, os benefícios e riscos do tratamento combinado são ainda muito fracos
(73).
Em outro estudo feito, a comparação entre a monoterapia com Aspirina e a
combinação entre Clopidogrel e Aspirina, em doentes com doença arterial periférica
sintomática, revelou um benefício adicional no que respeita à redução dos riscos
vasculares e dos eventos trombóticos. Por outro lado, não existe uma evidência disponível
para pacientes que sofreram um acidente vascular sob o efeito de Aspirina, que os
resultados de alterem quando se começa a aplicar uma terapia em associação com
Clopidogrel (72).
8.2. Monitorização/Controlo laboratorial da terapêutica
Ainda que a Aspirina e o Clopidogrel sejam utilizados na prevenção e tratamento
de doenças vasculares, há que ter alguma atenção aos diversos problemas secundários que
podem surgir da sua administração.
No caso do Clopidogrel, tem de se ter elevada atenção a situações que possam
levar a um risco de hemorragia, tais como hemorragias internas, cirurgias recentes ou até
mesmo cirurgias que estejam a ser planeadas. Por outro lado, doenças dos rins ou do
fígado devem também ser vigiadas. No caso de desenvolver Púrpura Trombocitopénica
Trombótica, a qual inclui febre e nódoas negras debaixo da pele que podem parecer como
minúsculos pontos vermelhos, com ou sem cansaço extremo inexplicável, confusão,
amarelecimento da pele e/ou olhos, o médico deverá ser informado de modo a avaliar a
continuação ou não do tratamento com Clopidogrel. Uma vez que o medicamento actua
ao evitando a possibilidade de se formarem coágulos de sangue, se houver um corte ou
ferimento, o tempo que leva a estancar a hemorragia poderá ser mais elevado. Para além
de tudo isto, o médico assistente deve pedir análises periódicas como forma de controlo
da terapêutica (70).
Relativamente à Aspirina, é necessário ter em atenção algumas patologias que
podem definir a possibilidade de continuar ou não com a terapêutica. No caso da
existência de diabetes, de problemas renais ou do fígado, de deficiência em glucose-6-
fosfatase desidrogenase é necessário um controlo mais apertado da toma da Aspirina. Por
outro lado, se está prevista uma cirurgia num prazo de 7 dias, o médico assistente deve
ser contactado. Grávidas e idosos não devem tomar Aspirina (enquanto antiplaquetário).
No seguimento disto, crianças com idade inferior a 16 anos também não devem tomar
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Rute Nogueira 106
Aspirina, uma vez que a sua utilização parece estar associada a uma doença muito rara
em crianças designada por Síndrome de Reye, que pode ser fatal (71).
Em suma, é necessário ter alguma atenção à toma deste tipo de medicamentos,
uma vez que, ainda que sejam benéficos para a patologia para a qual estão designados,
podem levar ao aparecimento de outro tipo de patologias ou agravar algumas já existentes,
sendo importante o controlo e monitorização constantes.
8.3. Novos agentes antiplaquetários
Os agentes antiplaquetários são os pilares no tratamento e prevenção do
tromboembolismo. Agentes antitrombóticos, como a Aspirina, o Clopidogrel, antagonista
da vitamina K e Foundaparinux (inibidor directo do factor Xa) já foram incorporados na
prática clínica rotineira dos serviços de terapia intensiva. Recentemente tem-se
demonstrado grande interesse nos agentes que inibem selectivamente o factor Xa e a
trombina. Estes apresentam estrutura molecular pequena e inibem simultaneamente o
factor da coagulação livre no plasma e ligado ao trombo. De entre os novos
anticoagulantes orais, Dabigatran, Rivaroxaban e Apixaban são os que apresentam
estudos clínicos em fases mais avançadas e o uso na prática clínica já é feito em alguns
países (8).
Os inibidores directos da trombina (IDT) bloqueiam a actividade da trombina em
dois sítios, ou seja, livre no plasma e ligada ao trombo. Consequentemente impedem a
conversão do fibrinogénio em fibrina, interferindo sobre as fases de amplificação e
propagação consideradas no modelo celular da coagulação pela diminuição da geração da
trombina. Estes inibidores têm também como vantagem a propriedade de não se ligarem
às proteínas plasmáticas. Os IDT apresentam uma estabilidade plasmática constante e
dispensam a necessidade de monitorização laboratorial. Têm um rápido pico de acção, a
eliminação é feita predominantemente de forma renal e por não serem neutralizados pelo
factor plaquetário tipo 4 (FPT4), evitam a ocorrência de síndrome clínica resultante do
efeito adverso do uso de heparinas. Pode haver uma divisão em dois grupos: os compostos
que se ligam de forma bivalente à trombina, à hirudina e à bivalirudina e os compostos
que se ligam à trombina de forma univalente (somente o sítio activo) (8).
Os inibidores directos do factor Xa (IDFXa) são uma classe de antitrombóticos
que se ligam directamente ao factor Xa, sem a necessidade da participação da
antitrombina. A actividade antitrombótica destes agentes é específica para o factor Xa,
sem nenhuma interacção ou efeito sobre outros factores das vias intrínseca e extrínseca
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Rute Nogueira 107
da coagulação e sem efeitos indesejáveis, como a trombocitopenia. Estes compostos têm
como principais vantagens o tamanho das moléculas (baixo peso molecular), a forma de
administração (uso oral) e a sua capacidade de inactivar formas circulantes e ligadas do
factor Xa. A inibição é feita de maneira estequiométrica, ou seja, uma molécula do IDFXa
inactiva uma molécula do factor Xa. Teoricamente, tem a capacisade de inibir o factor Xa
no complexo protrombinase, assim como coágulos ligados ao factor Xa, exercendo maior
controlo sobre a formação e a progressão de trombos, o que lhe confere uma maior
eficácia clínica (8).
Actualmente, a variedade de anticoagulantes utilizados na profilaxia e no
tratamento de diversas situações trombóticas em unidades de terapia intensiva é muito
ampla. Por outro lado, apesar de todos os estudos feitos até agora, ainda não se dispõe de
um anticoagulante ideal, com farmacocinética e farmacodinâmica previsíveis, posologia
simplificada, reduzida interacção medicamentosa, antídoto específico e sem necessidade
de monitorização laboratorial. Assim, o desenvolvimento de novos anticoagulantes, como
os inibidores do factor Xa e os inibidores directos da trombina, mostram-se muito
importantes no tratamento destas patologias. Entretanto, são necessárias novas evidências
para que se encontre uma alternativa para o seu cuidado de forma integral, minimizando
a ocorrência de reacções secundárias (8,74).
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 108
Conclusões e Perspectivas
Muito ainda há a fazer na área das plaquetas e cirurgia vascular. Apesar de um dos
objectivos iniciais ter sido encontrar uma justificação para a relação que a equipa médica
deu ao problema do paciente, isso não se verificou possível. Neste momento, e apesar da
revisão bibliográfica feita, o facto de a formação de trombos que estão a obstruir a artéria
femoral estarem a causar uma diminuição do número de plaquetas em circulação, parece
ainda a justificação mais plausível. A reacção do organismo em baixar o número de
plaquetas nesta situação funcionou como uma reacção de defesa do mesmo, pois desta
forma, a probabilidade de se formarem novos trombos era menor. Assim sendo, o facto
de o número de plaquetas ter aumentado após a cirurgia vascular também corrobora esta
observação. Este aumento teve também na origem a administração de Clopidogrel e
Aspirina 100 mg em associação o que, como foi explicado, tem uma relação de benefício
para o doente.
Ainda há muito a fazer nesta área pois, apesar de ter existido um aumento do
número de plaquetas, este não é uniforme e ainda não atingiu o número mínimo de
plaquetas considerado normal, estando ainda ligeiramente abaixo dos 150x109/L. Deste
modo, conclui-se que ainda existe algum facto desconhecido que está a provocar esta
descida e que, ao ser descoberto, pode melhorar em muito a qualidade de vida deste
paciente.
Em suma, a relação existente entre as plaquetas e a cirurgia vascular é ainda muito
pouco conhecida, havendo muitos factos que provocam patologias plaquetárias, no
seguimento de desordens vasculares e que ainda não são relacionadas desta forma. Por
outro lado, é cada vez mais importante a descoberta de uma maior gama e mais eficaz de
agentes antiplaquetários, que possam melhorar a qualidade de vida dos doentes com este
tipo de patologias.
Mestrado em Análises Clínicas, Faculdade de Farmácia, Universidade de Lisboa
Rute Nogueira 109
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