1
UNIVERSIDAD AUTÓNOMA METROPOLITANA
UNIDAD IZTAPALAPA
Licenciatura en Biología Experimental
Reporte final del Proyecto Docente de Investigación
Hayde Nallely Moreno Sandoval
“LA ASOCIACIÓN DE DISTINTOS POLIMORFISMOS DEL GEN
PPARGC1A Y PPARGC1B CON LA DIABETES TIPO 2 Y EL SÍNDROME
METABÓLICO EN UNA POBLACIÓN DE LA CIUDAD DE MÉXICO”
México, D.F. 9 de abril de 2007
2
Con la aprobación de los asesores
Dra. Karina Lizeth Tuz Moya Investigador Asociado B
Unidad de Investigación Médica en Bioquímica, Hospital de
Especialidades. CMN S XXI, IMSS
Dr. Pablo Damian Matzumura. Profesor Titular C, Área de
Reproducción Animal Asistida, UAM- Iztapalapa.
3
ÍNDICE
Introducción 4
Justificación 17
Objetivo general 17
Objetivos particulares 17
Hipótesis 17
Diseño de la investigación 18
Sujetos, materiales y métodos 18
Análisis estadísticos 21
Resultados y discusión
Características clínicas del grupo control y con DT2 22
Características clínicas del grupo control y con SM 22
Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Ser482Gly 24
Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Pro203Ala 25
Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Val279Ile 26
Asociación de los SNP Ser482Gly, Pro203Ala y Val279Ile 27
con el IMC
Conclusión 32
Bibliografía 33
Anexo
Funcionamiento de las sondas TaqMan 38
4
INTRODUCCIÓN
La Diabetes constituye un grupo heterogéneo de enfermedades
metabólicas que se caracterizan por elevadas concentraciones de glucosa en
sangre. Se clasifica en dos tipos, la diabetes tipo 1 es dependiente de insulina y se
produce por una disminución en la secreción de insulina por parte de las células β
pancreáticas. La diabetes tipo 2 (DT2) es poligénica y multifactorial, se produce
por defectos en la secreción y/o acción de la insulina, intolerancia a la glucosa y
resistencia a la insulina por parte de los tejidos periféricos, como el músculo
esquelético y el tejido adiposo (Fig. 1) (Skelly, 2006). La DT2 es progresiva y uno
de los factores responsables de esta progresión es el continuo decline en la
función de las células β pancreáticas. El riesgo de padecerla es mayor en quienes
consumen una alimentación hipercalórica, tienen una vida sedentaria y
antecedentes familiares con DT2 (Steven et al., 2006).
Figura 1. Patogénesis de la diabetes tipo 2.
La DT2 es una enfermedad de importancia creciente, tanto en los países
desarrollados como en las naciones en vías de desarrollo, ya sea que se mida
Hiperglucemia
Hígado Músculo
Intestinos Páncreas
Absorción intestinal de
carbohidratos
↑ Secreción de insulina
↓ Captación de glucosa
↑ Producción de glucosa
5
esta a través de su incidencia, prevalencia, o mortalidad. En México, ha habido un
aumento significativo en la incidencia de la DT2 desde 1980 (Fig. 2) (Olvera, 2000
y Cerda et al., 2003).
De acuerdo a los resultados de la Encuesta Nacional de Salud de 2000, la
prevalencia de la DT2 en los individuos mayores de 20 años fue de 7.5%. La
prevalencia fue ligeramente mayor en las mujeres (7.8%) que en los hombres
(7.2%), este valor se incrementa de acuerdo a la edad, ya que en sujetos de entre
70 y 79 años la prevalencia fue de 22.4% (Fig. 3). Se ha estimado que para el año
2025, habrán 11.7 millones de mexicanos diagnosticados con la enfermedad (Rull
et al., 2005 y Encuesta Nacional de Salud 2000).
Figura 3. Distribución porcentual de la prevalencia de la DT2, por grupos de edad y sexo de acuerdo a la Encuesta Nacional de Salud 2000.
Figura 2. Análisis retrospectivo de la mortalidad e incidencia de la diabetes tipo 2 en México. Mortalidad e incidencia. Sistema epidemiológico y estadístico de defunciones/DGE/SSA. Tasa por cada 100 mil habitantes.
6
La presencia de Síndrome Metabólico (SM) se relaciona con un incremento
significativo de riesgo de DT2. El SM no se trata de una única enfermedad, sino de
una asociación de problemas de salud que pueden aparecer de forma simultánea
o secuencial en un mismo individuo, causados por la combinación de factores
genéticos y ambientales asociados al estilo de vida en los que la resistencia a la
insulina se considera el componente patogénico fundamental (Rodríguez et al.,
2002).
La Asociación Americana del Corazón (AHA, por sus siglas en inglés) y el
Instituto Nacional de los Pulmones, el Corazón y la Sangre (NHLBI, por sus siglas
en inglés), presentaron su definición operacional del SM, el cual se identifica por la
presencia de al menos tres de los puntos mencionados en la tabla 1 (Gruñid et al.,
2005).
El SM tiene una prevalencia de 6.7% en sujetos de 20 a 29 años de edad y
de 43.5% en sujetos de 60 a 69 años de edad, la cual es similar en ambos sexos
(Lerman et al., 2004).
Aunque la mayoría de los pacientes con SM no presentan una franca
hiperglucemia, tienen un riesgo elevado para desarrollar DT2 en un futuro. Los
pacientes con SM mantienen su homeostasis a través de la hiperinsulinemia, sin
embargo, la diabetes se presenta cuando ya no son capaces de mantener esta
compensación (Lerman et al., 2004).
Criterio Punto de corte categórico
Perímetro de cintura ≥ 102 cm. (hombres) ≥ 88 cm. (mujeres)
Triglicéridos ≥ 150 mg/dL
HDL-C < 40mg/dL (hombres) < 50mg/dL (mujeres)
Presión Arterial ≥ 130 mm Hg ≥ 85 mm Hg
Glucosa en ayuno ≥ 100 mg/dL Tabla 1. Criterios para el diagnostico clínico de síndrome metabólico de acuerdo a la AHA/NHLBI
7
La DT2 per se es un estado de resistencia a la insulina y por lo tanto, en
forma estricta, el beneficio práctico de establecer el diagnóstico del SM, es cuando
éste se realiza en forma temprana, antes del diagnóstico de la DT2 (Lerman et al.,
2004).
Si bien el estilo de vida parece ser el detonante de los factores patogénicos,
los elementos genéticos están involucrados en la etiología de la DT2. Una historia
familiar positiva para el padecimiento confiere un incremento en el riesgo a
padecer la DT2. Del 15 al 25% de los sujetos con familiares afectados en primer
grado desarrollan intolerancia a la glucosa o DT2. El riesgo a desarrollar DT2 a lo
largo de la vida se ha calculado en 38%, si uno de los padres padece la
enfermedad; en 60%, si ambos padres están afectados (Stumvoll, 2005).
Algunas líneas de investigación demuestran claramente el papel de los
factores genéticos en la patogénesis de la DT2, las cuales se anuncian a
continuación:
a) Análisis en gemelos muestran una mayor concordancia para la DT2 en
gemelos monocigóticos que en heterocigóticos.
b) Análisis de segregación muestran que la mayoría de las familias con DT2
exhiben una compleja herencia paterna, en donde la relación en primer
grado, representa un mayor riesgo a desarrollar la enfermedad.
c) La inactivación selectiva de diferentes genes en modelos animales causan
resistencia a la insulina, daños en la secreción de insulina y el fenotipo de la
DT2.
d) Estudios de mapeo genético en donde se hacen búsquedas en el genoma
entero, demuestran la participación de diferentes regiones de cromosomas
que confieren la susceptibilidad al desarrollo de la DT2 (Tusié, 2005).
La búsqueda de un gen único causante de la DT2 ha sido infructuosa, sin
embargo, hay avances importantes en la identificación de genes relacionados a la
DT2, denominados genes candidatos. El procedimiento usual de asociación
8
consiste en seleccionar uno o más genes con base en su función o relación
biológica, buscando variantes en la secuencia del DNA que se asocien con el
fenotipo de la enfermedad. Se han descrito genes relacionados con la DT2, entre
los que destacan, los que codifican para proteínas involucradas en la señalización
de la insulina, en el transporte de glucosa, en la síntesis de glucógeno, en la
síntesis y absorción de ácidos grasos y en la diferenciación adipocítica (Cruz et
al., 2005). Asimismo, los miembros de la familia del coactivador 1 del receptor γ
activador de los peroxisomas (PGC-1) se han identificado como posibles genes
candidato para la DT2 (Kunej et al., 2004 y Andersen, 2005).
Los coactivadores son proteínas o complejos de proteínas que interactúan con
factores de transcripción e incrementan la velocidad de la misma. (Puigserver,
2003). La unión de un ligando al factor de transcripción, lo activa e induce un
cambio conformacional. El receptor activado se une a secuencias específicas de
DNA y permite el reclutamiento de los coactivadores de la transcripción (Fig. 4)
(Glass et al., 1997 y Finck et al., 2006).
La familia PGC-1 está compuesta por 3 miembros: PGC-1α, PGC-β y PRC
(coactivador relacionado con el PGC-1). Son proteínas que interactúan con
factores de transcripción de la familia de los receptores nucleares, como son:
Receptor γ activador de los peroxisomas [PPARγ, PPARα, PPARβ, el receptor a
hormonas tiroideas, el receptor X de los retinoides (RXR), el receptor de
glucocorticoides (RG), el receptor de estrógenos, el factor nuclear 4 de los
hepatocitos (HNF-4), el receptor X del hígado (LXR) y el receptor relacionado con
Figura 4. La familia de coactivadores PGC-1 incrementan la transcripción. Estos coactivadores activan la transcripción al unirse a los receptores nucleares (NR) aunado al reclutamiento de los complejos de proteínas.
9
los estrógenos (ERRs)]. Además, se ha descrito que estos coactivadores
interactúan con receptores no nucleares como: el potenciador 2 específico de
miocitos (MEF-2), forkhead box 1 (FOXO1) y la proteína 1 que se une al
elemento regulador del esterol (SREBP1). A través de la asociación de estos
factores de transcripción con los coactivadores PGC-1, se ejerce un efecto sobre
muchos aspectos del metabolismo energético, como la biogénesis mitocondrial, la
gluconeogénesis, la lipogénesis, entre otros (Finck et al., 2006).
El PGC-1α y PGC-1β se expresan en tejidos con alta actividad mitocondrial,
incluyendo el tejido adiposo, páncreas, músculo esquelético, corazón y cerebro
(Handschin et al., 2006).
El PGC-1β y PGC-1α, comparten una extensa secuencia homóloga (Fig. 5)
(Puigserver, 2003). Ambos presentan una estructura multidominio: un dominio de
activación en el extremo N-terminal, un dominio central de regulación/represión
con sitios de fosforilación, sitios LXXLL los cuales son regiones de unión al factor
de transcripción, un extremo C-terminal que contiene dominios de procesamiento
de RNA, como el dominio RS y RMM (Fig. 6) (Puigserver, 2003).
Figura 5. Secuencia de la proteína de la familia PGC-1. Porcentaje de homología entre los diferentes dominios. Nótese que los dominios más conservados son el extremo N-terminal y el extremo C-terminal.
10
Figura 6. Arquitectura de la proteína PGC-1α y PGC-1β .
Las alteraciones en la expresión o las modificaciones postraduccionales del
PGC-1 pueden modular su actividad transcripcional. En el caso del PGC-1α, se ha
descrito que estímulos ambientales que promueven la activación de los receptores
β adrenérgicos como: el frío (en adipocitos marrones), ayuno (en el hígado) y
ejercicio (en el músculo esquelético), regulan su expresión y/o actividad (Finck et
al., 2006). En contraste, estos estímulos no tienen efecto en la expresión o
actividad del PGC-1β (Andersen, 2005).
La cantidad de energía para satisfacer las funciones vitales es crítica para
realizar el proceso de homeostasis. En los mamíferos, el metabolismo energético
es adaptable a ciclos nutricionales cortos como ayuno/estado postprandial y ciclos
nutricionales largos como sequía/abundancia. En este contexto, los cambios en la
regulación de la expresión y/o actividad del PGC-1 pueden servir como un
mecanismo clave en la homeostasis energética, ligando el ambiente nutricional
con el metabolismo oxidativo y la termogénesis (Pihlajamäki y Patti, 2005).
El PGC-α es un potente regulador del metabolismo energético, incidiendo
en la termogénesis adaptativa, la captación de glucosa en el tejido adiposo y
músculo esquelético, la biogénesis mitocondrial, la diferenciación de los adipocitos
y también promueve la gluconeogénesis. El PGC-1β induce un incremento en el
transporte de lipoproteínas, regula la biogénesis mitocondrial, la oxidación de los
ácidos grasos y la lipogénesis (Handschin et al., 2006).
11
Dentro de las funciones de los PGC-1 destacan:
� La expresión de los PGC-1 es muy elevada en tejidos con sistemas
mitocondriales muy desarrollados y su expresión se induce en situaciones
fisiológicas que se caracterizan por un aumento en la demanda del
metabolismo mitocondrial, para producir energía en forma de ATP o calor,
como la exposición al frío en el tejido adiposo pardo, ejercicio físico en el
músculo y ayuno en el hígado. El PGC -1α y el PGC-1β tienen un papel
significativo en la biogénesis mitocondrial en el tejido adiposo marrón y en
el músculo esquelético, coactivando la actividad transcripcional del factor de
transcripción mitocondrial A (mtTFA) y al factor 1 respiratorio nuclear (NRF-
1), que induce a su vez la expresión del NRF-1 y NRF-2 (López, 2005).
� La reducción en la coactivación del PPARα por el PGC-1 genera un
decremento en la actividad de la β oxidación, dando como resultado un
incremento en la concentración de los ácidos grasos libres en el plasma
sanguíneo. Estos ácidos grasos se acumulan dentro del tejido no adiposo,
particularmente músculo esquelético, hígado y páncreas (Muller et al.,
2003). La acumulación de ácidos grasos es un marcador temprano del
riesgo a la DT2. La acumulación intramiocelular de lípidos puede contribuir
a la resistencia a la insulina. Análogamente, la grasa ectópica en el hígado
puede conducir a la resistencia a la insulina, gluconeogénesis
descontrolada, síntesis creciente del colesterol y triglicéridos, e inflamación
(Pihlajamäki y Patti, 2005). La acumulación de lípidos en las células β
pancreáticas puede contribuir a la disfunción en la secreción de insulina,
asociándose a la obesidad y a la DT2. La disminución en la expresión de
los genes relacionados con el metabolismo mitocondrial también puede
contribuir a la acumulación de lípidos en el músculo esquelético,
contribuyendo con la resistencia a la insulina y dando como resultado la
DT2 y/o el SM. Se ha descrito que la expresión del PGC-1α y PGC-1β se
reduce significativamente en pacientes con intolerancia a la glucosa y con
DT2 (Muller et al., 2003).
12
� El PGC-1β está involucrado en la lipogénesis, coactivando al factor de
transcripción SREBP1c. En el hígado, la sobrexpresión del PGC-1β
estimula la secreción y producción de triglicéridos, resultando en
hipertrigliceridemia e hipercolesterolemia (Finck et al., 2006).
� En el hígado, el PGC-1α promueve la expresión de las enzimas
fosfoenolpiruvato carboxicinasa y glucosa 6 fosfatasa, las cuales controlan
la vía gluconeogénica. Esto indica que el PGC-1α es un modulador clave en
la gluconeogénesis hepática y es un blanco central de la acción de la
insulina en el hígado (Yoon et al., 2001).
� El PGC-1α afecta la función de las células β pancráticas, coactivando al
factor de transcripción FOXO1. Éste factor se ha visto ligado al promotor
de la glucosa 6 fosfatasa en el hígado, y por otro lado, produce un déficit
en la secreción de la insulina en las células β pancreáticas. La coactivación
de FOXO1 en las células β pancráticas, puede conducir a la supresión de
los factores dominantes de la transcripción de los islotes pancreáticos, tales
como PDX-1 (Yoon et al., 2003).
� El coactivador PGC-1α induce la expresión del transportador de glucosa
sensible a la insulina (GLUT4) incrementando la captación de glucosa en el
músculo esquelético y en el tejido adiposo marrón (Michael et al., 2001). La
expresión del gen del GLUT 4 está mediada por la unión PGC-1α al
regulador transcripcional de músculo MEF-2 (Puigserver, 2003).
� El mecanismo más conocido de la termogénesis adaptativa es el que opera
en el tejido adiposo marrón. Su base molecular es la actividad de la
proteína desacoplante 1 (UCP1), esta proteína es característica de los
adipocitos marrones, se encuentra en la membrana interna mitocondrial y
es capaz de disipar como calor la energía generada por el gradiente de
protones, desacoplando así la oxidación de sustratos metabólicos de la
13
síntesis de ATP (Fig. 7) (Palou et al., 2004). El PGC-1α coactiva receptores
nucleares de hormonas, como los receptores que se unen al promotor de
� UCP-1 y que modulan su expresión (Puigserver et al., 1998).
� El PGC-1α está involucrado en la diferenciación de los adipocitos. El PGC-
1α es la única proteína, descrita hasta el momento, capaz de activar la
expresión del UCP-1. En líneas celulares sin relación con el tejido adiposo
marrón, se ha visto que cuando se introduce el PGC-1 en células adiposas
blancas, induce la expresión endógena del UCP-1 y activa la biogénesis
mitocondrial, ambas características típicas del adipocito marrón (Fig. 8). El
PGC-1α está regulado por la activación de receptores β-adrenérgicos y
AMPc intracelular, agentes conocidos que inducen la expresión de UCP-1 y
la hipertrofia del tejido adiposo marrón (Puigserver et al., 1998).
Síntesis de ATP
H+ATP ADP + Pi
ATP sintetasa
Cadena respiratoria
Oxidación de sustratos
H+ H+ H+H2O O2
Producción de calor
UCP 1
DesacoplamientoAcoplamiento
(fosforilación oxidativa)
Espacio intermembranal
Membrana
interna
Matriz
mitocondrial
H+
H+H+H+
H+
H+H+H+
H+
H+H+ H+ H+
H+
H+H+
H+
H+H+H+
H+
H+H+H+
H+
H+H+H+
Figura 7. Esquema del funcionamiento de la UCP1 en las mitocondrias del tejido adiposo marrón.
14
Figura 8. Control transcripcional del destino de la célula adiposa. Los preadipocitos pueden diferenciarse potencialmente a adipocito blanco o adipocito marrón. La activación PPARγ/RXRα es requisito indispensable para la diferenciación de ambas células adiposas. A partir de este momento, la presencia de distintos coactivadores determinará la diferenciación hacia un tipo celular u otro. La actuación del coactivador PGC-1α puede activar la expresión génica asociada con la conversión de preadipocito a adipocito marrón. Si existe una conversión entre adipocitos marrones y adipocitos blancos se desconoce.
Algunos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP por sus siglas en inglés)
del PGC-1α y PGC-1β se han asociado con el fenotipo de la DT2 y el SM como la
resistencia a la insulina, la obesidad, la oxidación de los lípidos y los niveles de
expresión del PGC-1 (Fig. 9).
Genética• Secuencia de polimorfismos
Ambiente• Sobrenutrición• Dieta no óptima• ↓ Actividad Física
Expresión alterada del PGC-1
Fenotipo de riesgo a DT2 y SM
MÚSCULO ESQUELÉTICO
• Acumulación de lípidos
• Disfunción mitocondrial
• ↓ Oxidación de ácidos grasos
• Resistencia a la insulina
HÍGADO
• Acumulación de lípidos
•↑ Gluconeogénesis
•↑ Síntesis de triglicéridos
TEJIDO ADIPOSO
• ↓ Termogénesis
• Alteración de la función de los adipocitos
PÁNCREAS
• Acumulación de lípidos
* Deficiencia en la secreción de insulina
Figura 9. Papel del los miembros de la familia PGC-1 como mediadores de las interacciones genéticas y ambientales que participan en el desarrollo del fenotipo del SM y la DT2.
Adipocito blanco
Célula madre mesenquimal
Adipocito marrón (UCP1, Alto contenido de mitocondrias)
Otros coactivadores
Preadipocito
15
Los polimorfismos genéticos hacen referencia a la existencia de múltiples
alelos de un gen presentes en una población. Es decir, un polimorfismo es una
variación en la secuencia de un lugar determinado del ADN entre los individuos de
una población. Aquellos polimorfismos que afectan a la secuencia codificante o
reguladora y que producen cambios en la estructura de la proteína o en el
mecanismo de regulación de la expresión, pueden traducirse en diferentes
fenotipos. Un polimorfismo puede consistir en la sustitución de un solo nucleótido
(Fig. 10) (Shastry, 2002).
Se ha identificado que los SNP causan o predisponen a enfermedades y su
caracterización sirve para el diagnóstico, pronóstico, tratamiento y eventualmente
para la prevención de enfermedades. Estos SNP están asociados con la
diversidad entre las poblaciones y la respuesta individual a los medicamentos.
Algunos SNP también son útiles como marcadores genéticos ya que podrían
constituir la mutación que predispone a una enfermedad. Se ha estimado que hay
una variante en cada 1000 pares de bases de los 3000 millones que forman el
genoma humano. Una de estas variaciones debe darse al menos en un 1% de la
población para ser considerada como un SNP (Fig. 11) (Shastry, 2002).
Figura 10. Polimorfismos genéticos, alelos distintos de genes homólogos presentes en una población.
A-T C-G G-A G-C
16
Figura 11. Ejemplificación de polimorfismo de un solo nucleótido, SNP (Tomado de http://www.genomenewsnetwork.org/resources/whats_a_genome/Chp4_1.shtml).
El SNP Ser482Gly de PGC-1α es un factor de riesgo al desarrollo de la DT2
en la población caucásica Eslovena, Danesa e Inglesa (Kunej et al., 2004), así
como también en sujetos del norte de China (Sun et al., 2006). Además, se ha
reportado que el alelo Ser es el que confiere el riesgo de desarrollar DT2
(Sookoian et al., 2005).
El SNP Pro203Ala del PGC-1β se ha relacionado con la obesidad en
hombres y mujeres. Los portadores del alelo prolina en su forma homocigota
presentan una disminución en el IMC comparado con los portadores del
homocigoto alanina en sujetos daneses blancos de Copenhague. Se considera
que el alelo Ala es el que confiere el riesgo a la obesidad (Andersen, 2005).
Asimismo, el SNP Val279Ile del PGC-1β se ha asociado con la obesidad en
sujetos daneses blancos de Copenhague y se ha determinado que está en
desequilibrio de ligamiento casi completo con el polimorfismo Pro203Ala
(Andersen, 2005).
Mutación Población
general 99% 1%
17
JUSTIFICACIÓN
La DT2 y el SM representan unos de los principales problemas de salud
pública en México. Nuestro país se ubica entre los de mayor número de casos
registrados en el ámbito mundial. La perspectiva futura señala que se mantendrá
el incremento en la cantidad de individuos diabéticos y con síndrome metabólico.
De acuerdo con la información disponible, el país ocupaba el décimo lugar mundial
en 1995, con 4 millones de enfermos, y se estima que para el 2025, ocupará el
séptimo con 11.5 millones.
Los coactivadores PGC-1α y PGC-1β están involucrados en el metabolismo
energético de múltiples tejidos implicados en la patogénesis de la DT2 y el SM, se
piensa que diversos SNP en estos genes candidato pueden actuar como posibles
marcadores de susceptibilidad a desarrollar estas enfermedades en la población
mexicana.
OBJETIVO GENERAL
Determinar si los polimorfismos de un sólo nucleótido de los genes
coactivadores PGC-1α y PGC-1β están involucrados con el riesgo a desarrollar
DT2 y/o SM en una población de la ciudad de México.
OBJETIVOS PARTICULARES
Determinar la frecuencia genotípica y alélica de los SNP Ser482Gly del gen
que codifica para el PGC-1α, Pro203Ala y Val279Ile del gen que codifica para el
PGC-1β y su asociación con la diabetes tipo 2 y/o el síndrome metabólico en una
población de la ciudad de México y estimar las diferencias entre los grupos.
HIPÓTESIS
Si los SNP Ser482Gly del gen PGC-1a, Pro203Ala y Val279Ile del gen
PGC-1b aumentan el riesgo a desarrollar DT2 y/o SM en una población de la
ciudad de México, entonces podrían actuar como marcadores de susceptibilidad
para estos padecimientos .
18
DISEÑO DE LA INVESTIGACIÓN
SUJETOS, MATERIALES Y MÉTODOS
Se estudió una muestra representativa de la población de la Ciudad de
México, que incluyó 1300 sujetos, de los cuales 553 fueron controles, 448 con
DT2 y 229 con SM. Los criterios de inclusión fueron: edad de 35 a 65 años y sin
antecedentes de DT2 en familiares de primera línea.
Los individuos con DT2 que participaron en el estudio tenían un diagnóstico
previo, el cual se estableció de acuerdo a los criterios de la Asociación Americana
de Diabetes (ADA por sus siglas en inglés): glucosa postpradial ≥ 200mg/dL y la
presencia de síntomas típicos (polidipsia, polifagia, poliuria y pérdida de peso),
Selección de los pacientes
Sanos DT2 SM
Toma de sangre periférica
Prueba de integridad y cuantificación
Genotipificación en 7900HT
Amplificación del DNA, Q-PCR
Discriminación alélica
Análisis estadístico
Sondas TaqMan
Perfil Bioquímico Extracción de DNA
Examen físico e historia clínica completa
19
glucosa en ayuno ≥ 126mg/dL en dos ocasiones o niveles de glucosa ≥ 200 mg/dL
en un análisis de dos horas posterior a una sobrecarga oral de glucosa de 75
gramos.
El diagnóstico de SM se estableció de acuerdo a los criterios de la
AHA/NLHBI, los sujetos positivos requirieron de la presencia de al menos tres de
los siguientes paramentos: glucosa en ayuno ≥ 100mg/dL, presión arterial ≥
130/85 mmHg, triglicéridos ≥ 150 mg/dL, HDL-C < 50 mg/dL en mujeres y < 40
mg/dL en hombres, perímetro de cintura > 88cm en mujeres y >102 en hombres.
Se realizó historia clínica completa y examen físico a cada uno de los
sujetos. El peso (Kg) e IMC (Kg/m2) se determinó con la báscula Body
Composition Analyzae BC-418 (TANITA, Corp. Illinois). La presión arterial se
determinó con un esfingomanómetro de columna de mercurio (America Diagnostic
Corp. NY). Se realizó perfil bioquímico a cada uno de los pacientes, el cual incluyó
los siguientes parámetros: glucosa (mg/dL), insulina (µU/mL), urea (mg/dL),
creatinina (mg/dL), colesterol total (mg/dL), C-LDL (mg/dL), C-HDL (mg/dL),
triglicéridos (mg/dL), albúmina (mg/L) a través del equipo ILab 350 Clinical
Chemistri System (ILab. Barcelona). El perímetro de cintura y de cadera se midió
con una cinta métrica flexible y se obtuvo el ICC. El índice de resistencia a la
insulina se determinó a través la fórmula de Matthews (1985):
HOMAIR = [insulina (µU/mL) *glucosa (mmol/L) / 22.5
Se obtuvieron muestras de sangre periférica de todos los sujetos, a partir de
las cuales se extrajo el DNA geonómico de acuerdo al siguiente protocolo del kit
QIAamp® DNA Blood de QIAGEN:
A cada una de las muestras de sangre se le agregaron 200 µL de
proteinasa K (QIAGEN, 19155) para degradar las proteínas unidas al DNA y 2.4
mL de buffer de lisis (QIAGEN, 19075), esta mezcla se calentó en un baño con
20
agitación a una temperatura de 68 °C a 70 °C por 30 min. Posteriormente, se
agregaron 2 mL de etanol y la mezcla se transfirió a la columna, la cual se
centrifugó a 3000 rpm por 3 min. a 15 °C y se decantó el filtrado. Se agregaron 2
mL de buffer de lavado (QIAGEN, 19081) para eliminar los contaminantes de la
membrana de la columna y se centrifugó a 4000 rpm por 3 min. a 15 °C, se
añadieron 2 mL de un segundo buffer de lavado (QIAGEN, 19072) para eliminar
los restos de contaminantes en la membrana de la columna y se centrifugó a
4000 rpm por 20 min. a 15 °C. A continuación, el etanol restante se evaporó en un
horno a 70 °C durante 10 a 12 min. Por último, se agregaron 600 µL de buffer de
elusión (QIAGEN, 19077) de DNA, se incubó 5 min. a temperatura ambiente y se
centrifugó a 4000 rpm durante 8min. a 15 °C. En el sobrenadante se obtuvo el
DNA el cual se almacenó a 4°C.
Se verificó la integridad de cada una de las muestras de DNA con
electroforesis en gel de agarosa al 0.8%. Se determinó la concentración del DNA
en el fluorómetro VICTOR3 1420 Multilabel Counter (PerkinElmer precisely, Turku),
la pureza se determinó de acuerdo a la relación 260/280 nm en el mismo equipo.
La genotipificación de los sujetos se llevó a cabo con sondas TaqMan
específicas para los SNP Pro303Ala, Ser482Gly y Val279Ile en el equipo 7900HT
SDS Fast Real-Time PCR System (Applied Biosystems. California) para 384
pozos. Las sondas TaqMan utilizadas fueron: C_29133871_10, C_1643192_20 y
C_33288674_10, respectivamente.
Cada una de las sondas está marcada con 2 fluoróforos diferentes: VIC y
FAM, la discriminación alélica se determina de acuerdo a la fluorescencia emitida,
ya que si se emite sólo fluorescencia de VIC, el aleo 1 se encuentra en su forma
homocigota; si se emite sólo fluorescencia de FAM, el aleo 2 es homocigoto y si
emiten ambas fluorescencias, es heterocigoto (ver anexo).
21
A continuación se enlistan los componentes de la PCR
En cada uno de los pozos de la placa se colocaron:
Las muestras se cargaron en oscuridad. La placa se cubrió con una
membrana adhesiva MicriAmp (Applied Biosystems, California) para evitar que la
muestra se evaporara. La placa se centrifugo 3 min. a 1000 rpm y se analizó en el
equipo 7900HT SDS Fast Real-Time PCR System a los siguientes tiempos y
temperaturas:
Pasos iniciales Activación de la DNA pol AmpliTaq
Gold®
10 min a 95°C
Terminados los ciclos de amplificación PCR, se ejecutó el análisis de
Discriminación Alélica del equipo 7900HT SDS Fast Real-Time PCR System.
ANÁLISIS ESTADÍSTICOS
Se utilizó la prueba de Chi cuadrada (X2) para comparar las frecuencias
alélicas entre los casos y controles. La prueba de Razón de Momios (OR por sus
Componente de reacción
Concentración Volumen
Master mix universal para
PCR 2X 2.5 µL
Sonda TaqMan
20X 0.25 µL
DNA 20ng 1 µL Agua estéril 3 µL
Total 6.75
PCR (por cada 40 ciclos) Desnaturalización Alineación/
Elongación Ciclos
15 seg. a 95°C 1 min. a 60°C
22
siglas en inglés) se empleó para determinar la asociación del genotipo con la DT2
y el SM. Las diferencias significativas en los parámetros bioquímicos y
antropométricos entre los grupos se determinaron con la prueba de U de Mann-
Whitney. Se realizaron regresiones logísticas para estimar la relación entre el alelo
de riesgo y el IMC. Los análisis estadísticos se realizaron con el programa SPSS
versión 11.0 para Windows (SPSS INC. Illinois).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
• Características clínicas del grupo control y con DT2.
Las características antropométricas y bioquímicas del grupo control y el grupo de
pacientes con DT2 fueron significativamente diferentes (tabla 2). Se observa que
la media de glucosa en el grupo control es de 87.01 mg/dL, valor que se encuentra
en el intervalo normal, mientras que la media de glucosa en el grupo con DT2 fue
de 182.38 mg/dL, muy por encima del punto de corte de 99 mg/dL. En el grupo de
diabéticos el valor promedio del HOMA IR indica una resistencia a la insulina
(6.14), aunque no hay hiperinsulinemia en la población (considerando el valor
promedio) (tabla 2).
• Características clínicas del grupo control y con SM.
En la tabla 3 se muestran los valores promedio de las características
antropométricas y bioquímicas de los grupos control y con SM (tabla 3). Los
valores promedio de glucosa se encuentran en ambos grupos en el intervalo
normal, aunque en el grupo de SM el valor es más alto. También se observa que
en el grupo de SM hay resistencia a la insulina (determinada a través de
HOMAIR), sin encontrarse hiperinsulinemia poblacional. Con respecto a la presión
arterial, las medias de la TAS y TAD se encontraron elevadas en el grupo de SM
comparado con el control, sin llegar a ser hipertensión.
23
Tabla 2. Características clínicas entre los sujetos control y con DT2. Parámetro Control (n=553) DT2 (n=448) p Edad (años) 43.54 ± 6.58 53.42 ± 7.45 <0.0001
Talla (m) 1.65 ± 0.09 1.56 ± 0.08 <0.0001
IMC 27.52 ± 3.58 29.25 ± 4.66 <0.0001
ICC (Kg/cm2) 0.90 ± 0.06 0.92 ± 0.18 0.03
TAS (mm Hg) 116.29 ± 9.48 118.31 ± 13.87 0.01
TAD (mm Hg) 73.53 ± 7.24 76.45 ± 9.06 <0.0001
Glucosa (mg/dL) 87.01 ± 8.24 182.38 ± 79.31 <0.0001
Insulina (µU/L) 9.46 ± 4.77 14.03 ± 9.94 <0.0001
HOMA IR 2.04 ± 1.11 6.14 ± 4.89 <0.0001
Colesterol total (mg/dL) 200.82 ± 41.55 222.08 ± 65.71 <0.0001
C-LDL (mg/dL) 128.35 ± 32.94 139.42 ± 38.23 1,2 X10-4
C-HDL (mg/dL) 44.84 ± 12.04 48.73 ± 15.21 1,4 X10-4
Triglicéridos (mg/dL) 169.25 ± 92.32 237.78 ± 172.48 <0.0001
Los datos están expresados como la media ± desviación estándar.
Tabla 3. Características clínicas entre los sujetos control y con SM.
Los datos están expresados como la media ± desviación estándar. En rojo se señalan parámetros involucrados en el diagnóstico del SM. *Diferencias no significativas.
Parámetro Control (n=553) SM (n=299) p
Edad (años) 43.54 ± 6.58 44.57 ± 6.80 0.022
Talla (m) 1.65 ± 0.09 1.64 ± 0.09 0.029
IMC 27.52 ± 3.58 30.57 ± 3.96 <0.0001
ICC (Kg/cm2) 0.90 ± 0.06 0.95 ± 0.51 <0.0001
TAS (mm Hg) 116.29 ± 9.48 126.74 ± 12.49 <0.0001
TAD (mm Hg) 73.53 ± 7.24 78.47 ± 8.79 <0.0001
Glucosa (mg/dL) 87.01 ± 8.24 95.29 ± 16.31 <0.0001
HOMA IR 2.04 ± 1.11 3.19 ± 2.04 <0.0001
Insulina (µU/L) 9.46 ± 4.77 13.66 ± 7.57 <0.0001
Colesterol total (mg/dL)
200.82 ± 41.55 202.03 ± 39.80 0.81*
C-LDL (mg/dL) 128.35 ± 32.94 124.42 ± 34.93 0.109*
C-HDL (mg/dL) 44.84 ± 12.04 36.51 ± 9.17 <0.0001
Triglicéridos (mg/dL)
169.25 ± 92.32 265.23 ± 162.34 <0.0001
24
• Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Ser482Gly
En los tres grupos (controles, con diabetes tipo 2 y con síndrome metabólico), la
distribución alélica para el polimorfismo Ser482Gly se encuentra en equilibrio de
Hardy-Weinberg y la distribución de las frecuencias genotípicas se muestran
similares (Fig. 12).
Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias genotípicas y
alélicas entre los grupos de acuerdo con el valor obtenido de la prueba de X2
(p=0.5813 y p=0.5802 para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 4), por lo tanto, el
SNP Ser482Gly no esta relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la
población de la ciudad de México.
0
10
20
30
40
50
60
Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico
GG
GA
AA
Figura 12. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Ser482Gly en las tres poblaciones.
25
Tabla 4. Distribución del genotípica y alélica del polimorfismo Ser482Gly del PGC-1α con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.
� Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Pro203Ala
En los tres grupos, los alelos del polimorfismo Pro203Ala se encuentran en
equilibrio de Hardy-Weinberg, se analizó la distribución de las frecuencias
genotípicas de los tres grupos, mostrando frecuencias similares (Fig. 13).
Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias genotípicas y
alélicas entre los grupos de acuerdo con el valor obtenido de la prueba de X2
(p=0.9178 y p=0.5287, para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 5), por lo tanto, el
Genotipo Controles n (%)
Diabetes Tipo 2 n (%)
Síndrome metabólico n (%)
GG 289 (52.36) 248 (55.61) 166 (55.52) GA 228 (41.30) 165 (37.00) 112 (37.46) AA 35 (6.34) 33 (7.40) 21 (7.02) Alelo Gly 806 (73.01) 661 (74.10) 444 (74.25) Ser 298 ( 26.99) 231 (25.90) 154 (25.75) OR=1.058 OR=1.066 X2=0.30 X2=0.31 p=0.5813 p=0.5802
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico
CC
CG
GG
Figura 13. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Pro203Ala en las tres poblaciones.
26
SNP Pro203Ala no está relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la
población de la Ciudad de México.
Tabla 5. Distribución genotípica y alélica del polimorfismo Pro203Ala del PGC-1β en pacientes con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.
Genotipo Controles n (%)
Diabetes Tipo 2 n (%)
Síndrome metabólico n (%)
CC 13 (2.35) 11(2.46) 8 (2.68) CG 140 (25.32) 111(24.78) 67 (22.41) GG 400 (72.33) 326(72.77) 224 (74.92) Alelo Pro 166 (15.01) 133 (14.84) 83 (13.88) Ala 940 (84.99) 763 (85.16) 515 (86.12) OR=0.987 OR=0.913 X2=0.01 X2=0.40 p=0.9178 p=0.5287
• Frecuencias genotípicas y alélicas del SNP Val279Ile
En los tres grupos, las frecuencias alélicas del polimorfismo Val279Ile se
encuentran en equilibrio de Hardy-Weinberg, se analizó la distribución de las
frecuencias genotípicas de los tres grupos, mostrando frecuencias similares (Fig.
14).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Controles Diabetes tipo 2 SíndromeMetabólico
AA
GA
GG
Figura 14. Distribución de las frecuencias genotípicas del polimorfismo Val279Ile en las tres poblaciones.
27
Se determinó que no hay diferencias significativas en las frecuencias
genotípicas y alélicas entre los grupos de acuerdo con la prueba de X2 (p=0.7075,
p=0.8531, para DT2 y SM, respectivamente) (tabla 6), por lo tanto, el SNP
Pro203Ala no esta relacionado con el riesgo a desarrollar DT2 o SM en la
población de la Ciudad de México.
Tabla 6. Distribución genotípica y alélica del polimorfismo Val279Ile del PGC-1β en pacientes con Diabetes tipo 2, con Síndrome Metabólico y controles.
• Asociación de los SNP Ser482Gly, Pro203Ala y Val279Ile con el IMC
Se realizó un análisis de regresión logística para determinar si hay asociación con
cualquiera de los polimorfismos y el IMC, se encontró que los valores de OR no
tuvieron significancia estadística (tabla 7), por lo que no hay asociación con el IMC
y cualquiera de los polimorfismos, esto es contrario a lo que se ha descrito para
otras poblaciones, en donde se han relacionado estos polimorfismos con el
fenotipo de la obesidad (Muller et al., 2003).
El gen PPARGC1A que codifica para el coactivador PGC-1α y el gen
PPARGC1B que codifica para el coactivador PGC-1β, son genes candidato que se
han relacionado principalmente con el fenotipo de la obesidad y en el caso
particular del PGC-1α con la DT2, ya que algunos estudios han encontrado
asociaciones de riesgo con algunas variaciones en estos genes, relacionándolas
Genotipo Controles, n (%) Diabetes Tipo 2, n (%)
Síndrome metabólico, n (%)
AA 9 (1.63) 16 (3.57) 8 (2.68) GA 146 (26.50) 96 (21.43) 71 (23.75)
GG 396 (71.87) 336 (75.00) 220 (73.58)
Alelo Val 164 (14.88) 128 (14.29) 87 (14.55) Ile 938 (85.12) 768 (85.71) 511(85.45)
OR=0.953 OR=0.974 X2=0.14 X2=0.03 p=0.7075 p=0.8531
28
con el fenotipo de estos padecimientos. Esta idea, consolida más afondo la
evidencia dada por las exploraciones en el genoma, en las que se demuestra que
hay regiones específicas en los cromosomas que se asocian con la DT2 y la
obesidad y probablemente con el SM.
Las alteraciones en el PGC-1α se han relacionado con intolerancia a la
glucosa, resistencia a la insulina, factores importantes en el SM y la DT2. Sin
embargo, el papel del PGC-1α como factor protector contra mediador en la
progresión de la enfermedad es confuso, particularmente en la intolerancia a la
glucosa y en la resistencia a la insulina, las cuales varían de acuerdo al tejido (Fig.
15) (Finck et al., 2006).
Tabla 7. Análisis de regresión logística de los polimorfismos Pro203Ala, Ser482Gly o Val279Ile con el IMC en los grupos Control, DT2 y SM
Pro203Ala OR 95% IC p
Control 0.966 0.802 -1.163 0.714
DT2 0.914 0.817 - 1.023 0.18
SM 0.836 0.672 -1.040 0.108
Ser482Gly
Control 0.981 0.926 -1.040 0.526
DT2 1.000 0.956 - 1.046 1.000
SM 1.048 0.971 -1.132 0.227
Val279Ile
Control 1.059 0.989 -1.133 0.102
DT2 1.011 0.959 -1.066 0.676
SM 1.008 0.925 -1.098 0.857
29
Figura 15. La expresión y actividad del PGC-1α se ha visto incrementada en las células β pancreáticas y en el hígado de modelos animales de la DT2. Inversamente, la expresión del gen del PGC-1 es reducida en el músculo esquelético de sujetos con DT2, así como también ha una disminución en la expresión de los genes implicados en la fosforilación oxidativa (OXPHOS). En este contexto, la regulación de la actividad del PGC-1α es tejido-especifica. El PGC-1α contribuye con la resistencia a la insulina, la intolerancia a la glucosa, y deficiencia de insulina.
La actividad del PGC-1α aumenta en el hígado diabético durante el ayuno,
lo que contribuye con la hiperglucemia. El PGC-1α puede promover la resistencia
a la insulina, directamente por la inducción de TRB-3, que es un inhibidor de la
señalización Akt y es componente crítico en la vía de señalización de la insulina.
El mecanismo preciso implicado en la regulación del la vía de señalización de la
insulina por la actividad del PGC-1α en el estado diabético, representa un área de
investigación activa (Koo et al., 2004).
El PGC-1α se activa en las células β pancreáticas en algunos modelos de
obesidad y DT2 en roedores. La glucosa inhibe la sobrexpresión del PGC-1α
estimulando la despolarización de la membrana y la secreción de insulina en
cultivos de islotes o líneas celulares de insulinoma. Se han realizado transplantes
de islotes normales en ratones a los que se les indujo diabetes con
estreptozotocina y se observó que los niveles de glucosa regresaban a la
normalidad y los islotes que sobrexpresaron PGC-1α fueron incapaces de revertir
la inducción experimental de diabetes. El fenotipo de las células β pancreáticas de
ratones deficientes de PGC-1α y PGC-1β y los efectos que tienen sobre de ellas
aún no ha sido dilucidado (Yoon et al., 2003).
Incremento en la actividad PGC-1α, Estimula la producción de
glucosa hepática Resistencia a la insulina
Decremento en la actividad PGC-1α, Reducción de
OXPHOS Intolerancia a la glucosa
Incremento en la actividad PGC-1α, Suprime la secreción de insulina
Deficiencia de insulina
Hígado Músculo Páncreas
30
En contraste con los resultados que se han obtenido en el hígado y el las
células β pancráticas, hay una evidencias, que sugieren que, en el músculo
esquelético, el PGC-1α puede ser protector del desarrollo de la resistencia a la
insulina, ya que el PGC-1α promueve la expresión de los GLUT4. La
sobrexpresión PGC-1β en el músculo esquelético protege a los ratones de la
obesidad y resistencia a la insulina inducida por una dieta alta en grasas.
El PGC-1α es un amplificador de la función mitocondrial, también es un
excelente candidato a prevenir la resistencia a la insulina y la disfunción
mitocondrial. Estudios en humanos han mostrado una correlación inversa en los
niveles del PGC-1α en el músculo y la actividad mitocondrial, con la resistencia a
la insulina y la diabetes (Finck et al., 2006).
La reciente explosión de nueva información, indica que la familia de
coactivadores PGC-1 tiene funciones clave en el control transcripcional de las vías
del metabolismo energético en una gran variedad de tejidos de mamíferos (Finck
et al., 2006).
La asociación de los PGC-1 con la DT2 se ha encontrado en estudios con
polimorfismos de un solo nucleótido. El SNP Ser482Gly se localiza en la región
codificante del gen PPARGC1 y se ha relacionado con un riesgo creciente de DT2.
Sin embargo, en estudios realizados en los Caucásicos Franceses (Lacquemant
et al., 2002), Chinos (Chen et al., 2004) e Indios Pima (Muller et al., 2003), se vio
que el SNP Ser482Gly del PGC-1α no tiene efecto sobre el riesgo a desarrollar
DT2, al igual que los resultados obtenidos en nuestro estudio (tabla 4). En
contraste con estos resultados, en la población Eslovena (Kunej et al., 2004),
Danesa (Andersen et al., 2001) así como también en sujetos del norte de China
(Sun et al., 2006) este SNP está estrechamente relacionado con la DT2 (tabla 8).
Al parecer este SNP no es un factor de riesgo para la DT2 en todas las
31
poblaciones y queda por definir cuál es el papel de este polimorfismo en la
patogenia de la DT2.
Tabla 8. Comparación del genotipo y frecuencias alélicas del polimorfismo Ser482Gly en diferentes poblaciones.
En un estudio realizado en caucásicos Daneses se determinó que el SNP
Ser482Gly no esta asociado con el riesgo a desarrollar SM al igual que lo obtenido
en nuestro estudio, y no se encontraron diferencias significativas del genotipo con
respecto el IMC, lípidos en suero durante el ayuno, insulina en suero y resistencia
a la insulina (Ambye et al., 2005).
Los SNP Pro203Ala y Val279Ile se encuentran en la región codificante del
gen PPARGC1b y se les ha encontrado en equilibrio de ligamiento, estos SNP se
han relacionado con la obesidad en una población Danesa de Copenhague
(Andersen, 2005), donde al igual que en nuestro estudio, no se encontró
asociación con el riesgo a desarrollar la DT2 (tabla 5 y 6). En este estudio, no se
encontró asociación de los polimorfismos del gen PPARGC1b con el IMC, lo que
la relación de estos polimorfismos con la obesidad difiere entre las poblaciones.
Si los polimorfismos afectan o no la actividad de los PGC-1 aún se
encuentra sujeto a discusión, pero es conocido que el cambio de aminoácido en el
DT2 Controles Frecuencia del aleo Ser
GG GA AA Total GG GA AA Total p DT2 (%)
Controles (%) p
Daneses � 186 200 68 454 97 80 21 198 0.11 37 30.8 0.032 Daneses�� 262 297 96 655 243 196 52 491 0.003 37.3 30.5 0.0007 Eslovenos 141 129 35 305 114 111 15 240 0.10 32.6 29.4 0.036 Norte de
China 122 190 78 390 181 256 88 525 0.37 44.4 41.1 0.169
Franceses 280 284 95 659 323 327 98 748 0.77 36 35 0.88 Chinos 155 255 84 494 185 264 106 555 0.40 42.8 42.8 0.975 Cd. de
México * 248 165 33 448 289 228 35 553 - 25.90 26.99 0.58
� Estudio inicial, �� Estudio replicado, * Resultados del presente estudio.
32
SNP Ser482Gly es conservativo y no crea o elimina motivos funcionales de la
proteína (Esterbauer et al., 2002), mientras que se piensa que los SNP Pro203Ala
y Val279Ile que podrían tener efecto dentro de la estructura y función de la
proteína (Park et al., 2006).
Un factor importante que podría afectar los resultados de este estudio, es
el hecho de que la población de la Ciudad de México y en general del país no es
genéticamente homogénea, ya que se ha determinado que la mayor parte de la
población mexicana es una mezcla que consiste de diferentes acervos genéticos,
incluidos los amerindios (65%), los europeos (principalmente de España, 30%) y
en menor grado los africanos (5%) (Martínez et al., 2007), de tal modo que la
población mexicana se encuentra estratificada. Posteriormente, se pretende
realizar estudios más extensos sobre la estratificación de la población estudiada,
donde se utilizarán marcadores de etnicidad, con lo cual se determinará la
similitud genotípica entre los grupos estudiados.
CONCLUSIÓN
Los SNP Pro203Ala, Val279Ile y Ser482Gly no están relacionados con el
riesgo a desarrollar diabetes tipo 2 o síndrome metabólico en una población de la
Ciudad de México. De igual forma, no encontramos asociación de estos SNP con
el IMC en esta población.
33
BIBLIOGRAFÍA
Ambye L, Rasmussen S, Fenger M, Jorgensen T, Borch-Johnsen K, Madsbad S,
Urhammer SA (2005) Studies of the Gly482Ser polymorphism of the
peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator 1alpha (PGC-
1alpha) gene in Danish subjects with the metabolic syndrome. Diabetes Res
Clin Pract; 67(2):175-9.
Andersen G, (2005). Evidence of association between genetic variation of the
coactivador PGC-1b and obesity. J Med Genet 42; 402-7.
Andersen G, Urhammer S, Gaede P, et al (2001) Mutation analysis of
peroxisome proliferator-activated receptor-γγγγ coactivator- 1 (PGC-1) and
relationships of identified amino acid polymorphisms to type II diabetes
mellitus Diabetologia; 44: 2220–6.
Applied Biosystems (2005). Allelic Discrimination Getting Started Guide; Allelic
Discrimination Assay Getting Started Guide for the 7900HT Fast System. pp
1-110, Manual del usuario.
Cerda R, et al (2003). Genética de la diabetes mellitus tipo 2 en el noreste de
México. III, RESPYN 4(3).
Chen F et al (2004). Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-g
Coactivator-1a Polymorphism Is Not Associated with Essential Hypertension
and Type 2 Diabetes Mellitus in Chinese Population. Hypertens Res 27(11):
813-9.
Costa J. (2004). Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a tiempo real.
Enferm Infecc Microbiol Clin; 22(5): 299-305.
Cruz M, et al (2005), Genes candidatos como posibles marcadores de
susceptibilidad a diabetes tipo 2, REB 24(3,4): 81-86.
34
Encuesta Nacional de la salud, la salud de los adultos 2000.
Esterbauer h, Oberkofler H, Linnemayr V, Iglseder B, Hedegger M, Wolfsgruber P,
Paulweber P, Fastner G, Krempler F, Patsch W. (2002). Peroxisome
Proliferator–Activated Receptor-γγγγ Coactivator-1. Gene Locus. Associations
with Obesity Indices in Middle-Aged Women. Diabetes; 51, 1281-6.
Finck B, Kelly D, (2006). PGC-1 coactivators: inducible regulators of energy
metabolism in health and disease. Review series 116 (3): 615-622.
Glass C, Rose D, Rosenfield M (1997). Nuclear receptor coactivators. Curr Opin
Cell Biol; 9: 222-2.
Grundy S, Cleeman J, Daniels S, Donato K, Peter J (2005) Association/National
Heart, Lung, and Blood Institute Scientific Statement: Diagnosis and
Management of the Metabolic Syndrome: An American Heart Executive
Summary. Circulation; 112: 285-290.
Handschin C, Spielgeman B. (2006). PGC-1 coactivators energy homeostasis
and metabolism. Endocrine Reviews; 27:728-35.
Koo S, Satoh H, Herzig S, Lee CH, Hedrick S, Kulkarni R, Evans RM, Olefsky J,
Montminy M. (2004) PGC-1 promotes insulin resistance in liver through
PPAR-alpha-dependent induction of TRB-3 Nat Med;10(5):530-534.
Kunej T, Petrovi G, Dov P, Peterlin D, Petrovi D (2004). A Gly482Ser
polymorphism of the peroxisome Proliferator –Activated receptor-g
Coacticador-1 (PGC-1) Gene is associated with Type 2 Diabetes in
Caucasians, Folia Biologica (Praha) 50, 157-158.
35
Lacquemant C, Chikri M, Boutin P, Samson C, Froguel P (2002). No association
between the G482S polymorphism of the proliferator-activated receptor-
coactivator-1 (PGC-1) gene and type II diabetes in French Caucasians (Letter).
Diabetologia 45:602–603,
Lerman I, Aguilar A et al (2004). El síndrome metabólico. Características del
síndrome metabólico en México, 12(3): 109-122.1
López J, (2005). Función y biogénesis mitocondrial. Diferencias entre
géneros. Tesis doctoral de la universidad de Illes Balears, 123pp.
Martinez-Marignac V, Valladares A, Cameron C, Chan A, Perera A, Globus-
Goldberg R, Wacher N, McKeigue P, O’Donnell D, Shriver M, Cruz M, Parra J. E
(2007). Admixture in Mexico City: implications for admixture mapping of Type
2 diabetes genetic risk factors, Hum Genet 120:807–819.
Matthews DR, Hosker JP, Rudenski AS, Naylor BA, Treacher DF, Turner RC.
(1985). Homeostasis model assessment: insulin resistance and beta-cell
function from fasting plasma glucose and insulin concentrations in man.
Diabetologia; 28(7):412-9.
Michael F, et al (2001). Restoration of insulin-sensitive glucose transporter
(GLUT4) gene expression in muscle cells by the transcriptional coactivator
PGC-1. PNAS 98(7): 3820-25.
Muller L, Bogardus C, Pedersen O, Baier L (2003). A Gly482Ser Missense
Mutation in the Peroxisome Proliferator–Activated Receptor _ Coactivator-1
Is Associated With Altered Lipid Oxidation and Early Insulin Secretion in
Pima Indians. Diabetes, 52: 895-898.
36
Olvera, E (2000). El panorama epidemiológico de la diabetes mellitus, Revista
Mexicana de Enfermería Cardiológica 8(1-4): 56-59.
Palou A, Bonet M, Rodríguez A. (2004). Nutrigenómica y obesidad. Rev Med
Univ Navarra 48(2): 36-48.
Park K, Shin D, Park B, Cheong H, Cho Y, Lee H, Lee J, Tae Kim H, Park C, Han
H, Kimm K, Oh B (2006). Putative association of peroxisome
proliferatoractivated receptor γγγγ co-activator 1 β β β β (PPARGC1B) polymorphism
with Type 2 diabetes mellitus. Journal compilation Diabetes UK. Diabetic
Medicine; 23: 635–642.
Pihlajamäki J, Patti M (2005). Regulation of PGC-1 in Humans with Insulin
Resistance and Type 2 Diabetes: Functional Implications, Research Division,
Joslin Diabetes Center One Joslin Place.
Puigserver, P., Wu, Z., Park, C.W., Graves, R., Wright, M., and Spiegelman, B.M.
(1998). A cold-inducible coactivator of nuclear receptors linked to adaptive
thermogenesis. Cell 92, 829–839.
Puigserver P (2003). Peroxisome Proliferator-Activated Receptor-_ coactivator
1 (PGC-1): Transcriptional Coactivator and Metabolic Regulator. Endocrine
Reviews 24(1):78–90
Rodríguez, L, Sánchez M y Martínez L, (2002). Síndrome Metabólico Enfoque
actual Rev Cubana Endocrinol, 13(3):238-52.
Rull, J et al, (2005), Epidemiology of type 2 diabetes in México, Arch Med Res.
36(3): 188-196.
37
Shastry B, (2002). SNP alleles in human disease and evolution, Biomedical and
Life Sciences and Medicine; 47(11): 561-566.
Skelly, AH (2006). Type 2 diabetes mellitus. Nurs Clin North Am. 41(4):531-47.
Sookoian S et al (2005). Peroxisome proliferator-activated receptor gamma
and its coactivator-1 alpha may be associated with features of the metabolic
syndrome in adolescents. Journal of Molecular Endocrinology. 35; 373–380.
Steven, E. Kahn, Rebecca L. Hull1 & Kristina M. Utzschneider (2006).
Mechanisms linking obesity to insulin resistance and type 2 diabetes,
NATURE 444(14) 840-46.
Stumvoll, M, (2005). Type 2 diabetes: principles of pathogenesis and therapy.
Seminar 365: 1333-46.
Sun L, Yang Z, Jin F, Zhu X, Qu Y, Shi H, Wang L. (2006). The Gly482Ser variant
of the PPARGC1 gene is associated with Type 2 diabetes mellitus in northern
Chinese, especially men. Diabetic Medicine 23(10): 1085.
Tusié, L (2005). Genes and Diabetes type 2 mellitus. Arc Med Res 36: 210-22.
Yoon C, et al. (2001). Control of hepatic gluconeogénesis through the
transcriptional coactivator PGC-1. NATURE 413: 131-138.
Yoon J, Xu G, Deeney J, Yang S, Rhee J, Puigserver P, Levens, Yang R, Zhang C,
Lowell B, Berggren P, Newgard C, Weir S, Weir G Spiegelman B. (2003).
Suppression of β cell energy metabolism and insulin release by PGC-1α. Dev.
Cell. 5:73–83.
38
ANEXO. Funcionamiento de las sondas TaqMan
Una sonda TaqMan es un oligonucleótido cuya secuencia es complementaria a la
región central del DNA a amplificar (esta sonda se encuentra flanqueada por las
secuencias específicas de los iniciadores que se utilizan para la amplificación por
PCR). La sonda tiene una secuencia de 13 a 18 nucleótidos que presenta en el
extremo 5’ una marca fluorescente (reportero) y en el extremo 3’ un apagador (no
fluorescente) de tal forma que cuando estas dos moléculas se encuentran unidas
por la sonda, la fluorescencia global observada es igual a cero [fenómeno FRET
(Fluorescent Resonant Energy Transfer)] (Applied Biosystems, 2005).
Las sondas TaqMan tienen una temperatura máxima (TM) mayor que los
iniciadores, por lo que durante la etapa de alineación se unen a su secuencia, y
posteriormente los iniciadores, de tal forma que cuando la DNA polimerasa se une
al extremo 3’ del iniciador inicia la elongación, en su paso se encuentra a la sonda
y la degrada utilizando su actividad de exonucleasa 5’ – 3’. Al ser degradada,
libera al reportero del apagador lo que suprime el fenómeno FRET y la
fluorescencia emitida puede ser detectada por el sistema de detección del equipo.
Dado que la fluorescencia emitida es proporcional a la cantidad de sonda
degradada, y esta a su vez es proporcional a la cantidad de templado generado,
este sistema permite visualizar el incremento de la amplificación a lo largo de la
reacción de PCR (Applied Biosystems, 2005).
Para la determinación del SNP, se utilizan, en el mismo sistema de
amplificación, dos sondas, cada una de las cuales presenta en la posición central
una de las variantes del nucleótido dimórfico, utilizando como reporteros a FAM y
VIC para diferenciarlas entre sí. La sonda que híbrida perfectamente con la
secuencia blanco es escindida por la Taq polimerasa, mientras que una unión
inespecífica en el nucleótido dimórfico reduce la eficiencia de unión de la sonda a
la secuencia blanco. De esta forma, un aumento en la señal de uno de los
reporteros indicará homocigocidad para el nucleótido dimórfico que reporta la
fluorescencia específica; mientras que si se observa fluorescencia de VIC y FAM,
39
es un indicativo de heterocigocidad (Costa, 2004 y Applied Biosystems, 2005) (Fig.
16).
Figura 16. Ilustración de los fluoróforos VIC y FAM y como se unen a la secuencia blanco específica.
Unión específica
Unión específica
Unión no específica
Unión no específica
Alelo 1
Alelo 2
Leyenda