(12) TŁUMACZENIE PATENTU EUROPEJSKIEGO (19) PL (11) PL/EP 2007420 RZECZPOSPOLITA POLSKA
Urząd Patentowy Rzeczypospolitej
Polskiej
(96) Data i numer zgłoszenia patentu europejskiego: 12.04.2007 07755417.8 (97) O udzieleniu patentu europejskiego ogłoszono: 06.03.2013 Europejski Biuletyn Patentowy 2013/10 EP 2007420 B1
(13) (51)
T3 Int.Cl. C07K 14/33 (2006.01) A61K 39/08 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01)
(54) Tytuł wynalazku:
Rekombinowane, atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka
(30) Pierwszeństwo:
17.04.2006 US 792553 P
(43) Zgłoszenie ogłoszono:
31.12.2008 w Europejskim Biuletynie Patentowym nr 2009/01
(45) O złożeniu tłumaczenia patentu ogłoszono:
30.08.2013 Wiadomości Urzędu Patentowego 2013/08
(73) Uprawniony z patentu:
INTERVET INTERNATIONAL B.V., Boxmeer, NL
(72) Twórca(y) wynalazku:
MARK D. COCHRAN, Carlsbad, US GARY PETERSEN, Omaha, US STEVEN V. LAIR, Temecula, US RICHARD SYNENKI, San Diego, US
(74) Pełnomocnik:
PL/E
P 20
0742
0 T3
rzecz. pat. Magdalena Tagowska PATPOL KANCELARIA PATENTOWA SP. Z O.O. ul. Nowoursynowska 162 J 02-776 Warszawa
Uwaga: W ciągu dziewięciu miesięcy od publikacji informacji o udzieleniu patentu europejskiego, każda osoba może wnieść do Europejskiego Urzędu Patentowego sprzeciw dotyczący udzielonego patentu europejskiego. Sprzeciw wnosi się w formie uzasadnionego na piśmie oświadczenia. Uważa się go za wniesiony dopiero z chwilą wniesienia opłaty za sprzeciw (Art. 99 (1) Konwencji o udzielaniu patentów europejskich).
EP 2 007 420 B1
1
Opis
ODNOŚNIKI DO ZGŁOSZEŃ POKREWNYCH
5
[0001] To zgłoszenie jest zgłoszeniem nie tymczasowym, które zastrzega pierwszeństwo, zgodnie z §
119(e) 35 U.S.C, zgłoszenia tymczasowego USA nr seryjny 60/792,553, złożonego 17 kwietnia 2006.
DZIEDZINA WYNALAZKU
10
[0002] Ten wynalazek dotyczy atenuowanych organizmów Clostridium, sposobów ich wytwarzania i stoso-
wania oraz mutein toksyny alfa i kodujących je kwasów nukleinowych.
TŁO WYNALAZKU15
[0003] Beztlenowe patogeny bakteryjne stanowią poważne obciążenie ekonomiczne dla przemysłu rolnego.
Bakterie z rodziny Clostridium są szczególnym obciążeniem, ponieważ bakterie te powodują poważne cho-
roby u drobiu i innych ekonomicznie wartościowych zwierząt domowych. Wcześniejsze wysiłki mające na
celu zwalczanie tych organizmów opierały się na środkach sanitarnych i podawaniu antybiotyków w paszy
dla zwierząt.20
[0004] Konkretnie, Clostridium perfringens („C. perfringens”) jest bakterią beztlenową, która znajduje się w
glebie, rozkładając substancję organiczną, a po części we florze jelitowej u ludzi i zwierząt. Różne szczepy
C. perfringens są oznaczone jakoe biotypy od A do E, w zależności od spektrum wytwarzanych toksyn [Ju-
stin i wsp., Biochemistry 41, 6253-6262 (2002); McDonel (1986) PHARMACOLOGY OF BACTERIAL
TOXINS ; F Domer and J Drews (Red.) Pergamon Press, Oxford]. Szczepy biotypu A są szczególnie ważne25
jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych. Szczególnie poważną chorobą jelitową
wywoływaną przez C. perfringens jest nekrotyczne zapalenie jelit (znane również jako „martwicowe zapale-
nie jelit”), zgorzel jelit skutkująca martwicą, posocznicą i hemolizą, zarówno u ludzi, jak i u zwierząt domo-
wych [patrz, Pearson i wsp., J. Am. Vet. Med. 188(11):1309-10 (1986); Al-Sheikhy and Truscott, Avian Dis.
21(2):256-63 (1977)]. W przypadku ptaków, np. kur (Gallus gallus), zgorzelinowe zapalenie jelit to znaczą-30
cym problem. C. perfringens zarówno typu A, jak i typu C, może spowodować znaczne straty, zwłaszcza w
produkcji brojlerów [Ficken and Wages, Necrotic Enteritis, W Diseases of Poultry, wyd. 10., str 261-264
(1997)]. Oprócz strat związanych z wybuchem nekrotycznego zapalenia jelit, istnieją doniesienia o obniżeniu
produktywności w stadach z chorobą związaną z C. perfringens [Lovl and Kaldhusdal, Avian Pathology
30:73-81 (2001)]. Jak wspomniano powyżej, środki antybakteryjne dodawane do paszy są najczęściej sto-35
sowaną metodą kontroli. Jednak, środki przeciwbakteryjne, np. antybiotyki, są kosztowne i stanowią przed-
miot rosnących obaw związanych z promowaniem oporności bakterii.
[0005] Niedawno podjęto próby dostarczenia szczepionek przeciwko szkodliwym gatunkom Clostridium. Na
przykład, Lovland i wsp. [Avian Pathology 33(1):83-92 (2004)] przedstawili szczepionki - kandydatów oparte
na toksoidach (anatoksynach) C. perfringens typu A i typu C, z wodorotlenkiem glinu jako adiuwantem. Do-40
niesiono, że szczepienie kur rodzicielskich dostarcza specyficznych przeciwciał dla ochrony potomstwa
przed zmianami jelitowymi wywoływanymi przez subkliniczną prowokację C. perfringens. Znane są inne
EP 2 007 420 B1
2
szczepionki oparte na toksoidach, wytworzone z detoksyfikowanych toksyn C. perfringens [patrz np., patent
USA nr 4,292,307, który opisuje anatoksyny C. perfringens typów A, B i D, Cl. oedematiens i Cl. septicum].
[0006] Zaproponowano również preparaty rekombinowanych anatoksyn. Na przykład, Titball i wsp., [patenty
USA nr 5,851,827, 6,403,094 oraz 5,817,317] poinformowali o kwasach nukleinowych, które kodują antyge-
nowe peptydy C. perfringens, jak również same peptydy oraz szczepionki wytworzone z peptydów. Opisane 5
są, na przykład, peptydy, które mają reszty aminokwasowe od 261 do 300 z naturalnej toksyny alfa C. per-
fringens, ale nie mają domen fosfoplipazy C i hydrolizyn sfinogmieliny naturalnej toksyny. Doniesiono rów-
nież, że te peptydy indukują ochronę immunologiczną przeciwko naturalnej toksynie. Ponadto patent USA nr
6,610,300 opisuje szczepionkę opartą na fragmencie antygenowy mmuteiny toksyny beta C. perfringens.
[0007] Jednak bez względu na to, czy szczepionka anatoksynowa pochodzi z organizmu natywnego, czy10
jest uzyskana rekombinacyjnie, uważa się, że wytwarzanie i podawanie białek anatoksyny zwierzętom wy-
magających immunizacji jest uciążliwe ekonomicznie, z wyjątkiem szczególnych okoliczności (np. leczenie
ludzi, którzy mogliby być uczuleni albo wrażliwi na inne składniki oparte na całych organizmach). Ponadto,
szczepionki oparte na białku/anatoksynie zazwyczaj wymagają powtarzanych szczepień przypominających
w celu podtrzymania pełnej skuteczności.15
[0008] Innym proponowanym rozwiązaniem było skonstruowanie antygenowo aktywnego wirusa, który bę-
dzie wytwarzać muteinę toksyny alfa, zamiast toksyny typu dzikiego. Na przykład, Bennet i wsp. [Viral Im-
munol. 12(2):97-105 (1999)] przedstawili rekombinowany wektor wirusa krowianki, który wyraża nietoksycz-
ną domenę C toksyny alfa C. perfringens. Niestety, chociaż podczas ostatnich 20 lat zaproponowano kilka
rekombinowanych szczepionek opartych na wirusie krowianki, nadal istnieją długotrwałe obawy dotyczące 20
bezpieczeństwa uwalniania do środowiska żywych, zakaźnych wirusów krowianki, które mogłyby być prze-
kazywane tym osobom, które nie są odporne na tego wirusa.
[0009] Wiadomo, że toksyna alfa (gen plc) z C. perfringens posiada wiele aktywności biologicznych, w tym
aktywność hemolityczną, fosfolipazy C, sfingomielinazy, fosfodiesterazy, oraz działania letalne. Istnieje wiele
doniesień w tej dziedzinie dotyczących mutacji tej toksyny alfa, które zmniejszają toksyczność. Schoepe i 25
wsp. [Infect. and Immun. 69(11):7194-7196 (2001)] opisują naturalnie występujący szczep C. perfringens,
który wytwarza nietoksyczną toksynę alfa. Jednak, byłoby trudne zmodyfikowanie tego szczepu tak, aby
wywołać ochronę immunologiczną przeciw innemu wariantowi - toksycznemu gatunkowi C. perfringens typu
dzikiego.
[0010] Williamson i Titball [Vaccine 11(12):1253-1258 (1993)] wykazali, że region toksyny złożony z amino-30
kwasów 247 do 370 był wystarczający do immunizacji myszy przeciwko zgorzeli gazowej wywołanej ekspe-
rymentalnie przez C. perfringens. Alape-Girón i wsp. [Eur. J. Biochem. 267:5191-5197 (2000)] donieśli, że
podstawienia w pozycjach Asp269, Asp336, Tyr275, Tyr307 i Tyr331 zmniejszają toksyczność toksyny alfa.
Nagahama i wsp. [Infect. and Immun. 65:3489-3492 (1997)] donieśli, że podstawienia w pozycjach Asp-56,
Asp-130 lub Glu-152 powodowały zmniejszenie toksyczności toksyny alfa. Nagahama i wsp. [J. Bacteriology 35
177:1179-1185 (1995)] donieśli, że podstawienie histydyny w pozycji 68 aminokwasem obojętnym, takim jak
glicyna, w toksynie alfa C. perfringens spowodowało całkowitą utratę aktywności hemolitycznej, fosfolipazy
C, sfingomielinazy i letalej muteiny toksyny alfa. Uważa się, że ta pojedyncza zmiana aminokwasowa inak-
tywuje jedną z trzech domen białka wiążących cynk. Domena wiążąca cynk inaktywowana przez podstawie-
nie His68 została później nazwana Zn2 [Justin i wsp., Biochemistry 41:6253-6262 (2002)].40
EP 2 007 420 B1
3
[0011] Schoepe i wsp., Anaerobe, Londyn, GB, tom. 12, nr 1, luty 2006, str. 44-48 donoszą o ochronie my-
szy przed toksyną alfa Clostridium perfringens przez immunizację przy zastosowaniu wariantu 121A/91-
R212H toksyny alfa.
[0012] Pomimo powyższego, istnieje zapotrzebowanie w tej dziedzinie na bezpieczny, tani i skuteczny spo-
sób ochrony intensywnie hodowanych zwierząt domowych, w tym, ptaków, takich jak kurczęta, przed zaka-5
żeniem gatunkami Clostridium, w tym C. perfringens.
[0013] Przytoczenie tu dowolnego odnośnika nie może być interpretowane jako przyznanie, że taki odno-
śnik jest dostępny jako „dokument wcześniejszy” względem obecnego zgłoszenia.
STRESZCZENIE10
[0014] W celu podjęcia próby przezwyciężenia opisanych powyżej niedociągnięć w tej dziedzinie, obecny
wynalazek dostarcza cząsteczek kwasu nukleinowego, które kodują zasadniczo nietoksyczną muteinę tok-
syny alfa Clostridium perfringens.
15
[0015] Konkretnie, niniejszy wynalazek dostarcza co następuje:
1. Cząsteczki kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clo-
stridium perfringens, gdzie muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3
minus 9 kolejnych aminokwasów rozciągających się od Trp62 do Trp70.
2. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, przy czym ta cząsteczka kwasu nukleinowego kodu-20
je muteinę, w której te usunięte dziewięć kolejnych aminokwasów są zastąpione przez pojedynczą
resztę leucynową.
3. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 1, zawierającej sekwencję kwasu nukleinowego z SEK
ID NR: 2, w której nukleotydy 268-294 cząsteczki kwasu nukleinowego są usunięte.
4. Cząsteczki kwasu nukleinowego według pkt. 3, w której usunięte nukleotydy są zastąpione przez 25
sekwencję nukleotydową kodującą pojedynczą resztę Leu.
5. Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens, przy czym muteina toksyny
alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus dziewięć kolejnych reszt aminokwa-
sowych, które rozciągają się od Tyr62 do Trp70.
6. Zasadniczo nietoksycznej muteiny toksyny alfa Clostridium perfringens według pkt. 5, w której30
dziewięć kolejnych aminokwasów jest usuniętych i zastąpionych przez pojedynczą resztę Leu.
7. Zasadniczo nietoksycznego atenuowanego organizmu Clostridium perfringens uzyskanego przez
włączenie cząsteczki kwasu nukleinowego według dowolnego z pkt. 1-4 do chromosomu nieatenu-
owanego organizmu Clostridium perfringens.
8. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7, w którym cząsteczka kwasu nukle-35
inowego znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki
kwasu nukleinowego kodującego toksynę alfa typu dzikiego obecną w nieatenuowanym Clostridium
perfringens.
9. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 7 lub pkt. 8, którym jest Clostridium
perfringens typu A.40
EP 2 007 420 B1
4
10. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 9-7, przy czym nie-
atenuowany Clostridium perfringens, z którego został uzyskany, wyizolowano ze zwierzęcia gospoda-
rza, którym jest albo ssak albo ptak.
11. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 10, przy czym ten ssak jest wybra-
ny z grupy składającej się z bydła, owiec i świń.5
12. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 10, przy czym tym zwierzęciem jest
kura, indyk, gęś, kaczka, łabędź, gołąb (ang. dove, pigeon), głuszcowaty lub kuropatwa.
13. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według dowolnego z pkt. 7-12, który zawiera co
najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens.
14. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 13, gdzie ten polipeptyd nie z Clo-10
stridium perfringens jest polipeptydem niebakteryjnym.
15. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 14, gdzie polipeptydem niebakte-
ryjnym jest polipeptyd ptasi lub ssaczy.
16. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 15, gdzie polipeptydem niebakte-
ryjnym jest polipeptyd ptasi.15
17. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 15, gdzie polipeptydem niebakte-
ryjnym jest cytokina.
18. Atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według pkt. 17, gdzie cytokiną jest kurza IL-18.
19. Atenuowanego Clostridium perfringens, jak określony w poprzednich pkt. 7-18, do zastosowania
jako szczepionka w sposobie wywoływania odporności na choroby powodowane przez zakażenie20
Clostridium perfringens u zwierząt, przy czym ten Clostridium perfringens podaje się w dawce sku-
tecznej immunologicznie.
20. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka
jest do podawania drogą doustną, domięśniową, dożylną, doskórną, podskórną lub donosową.
21. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, gdzie szczepionka jest 25
umieszczana na wierzchu paszy dla zwierzęcia.
22. Atenuowanego Clostridium perfringens do zastosowania według pkt. 19, przy czym szczepionka
jest do podawania w postaci spray’u zwierzętom do dostarczania do podawania doustnego.
23. Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-054, mający nr depozytu
ATCC PTA7364.30
24. Organizmu Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-053, mający nr depozytu
ATCC PTA7365.
25. Szczepionki zawierającej atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z pkt.
7-18, 23 lub 24.
26. Szczepionki według pkt. 25, zawierającej ponadto jedną lub więcej z następujących: farmaceu-35
tycznie dopuszczalny bufor, substancję pomocniczą lub adiuwant.
27. Paszy dla zwierząt, która zawiera szczepionkę według pkt. 25 lub 26.
[0016] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która
zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 18 kolejnych reszt amino-
kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto czą-40
steczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z
sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usu-
EP 2 007 420 B1
5
niętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która
koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co
najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest
His68. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która
zawiera sekwencję aminokwasową z sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 6 kolejnych reszt amino-5
kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ujawniona jest ponadto czą-
steczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z
sekwencji SEK. ID. NR: 3, minus co najmniej 3 kolejne reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych
reszt aminokwasowych jest His68.
[0017] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego według niniejszego wynalazku, która kodu-10
je muteinę, w której nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji amino-
kwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę,
w której nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z
SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie
więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 15
3. Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje muteinę, w której nie więcej niż 18
kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3.
[0018] Ujawniona jest ponadto cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę, w której dziewięć kolej-
nych reszt aminokwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną
jest His68. W konkretnym wykonaniu tego typu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której20
usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciąga się od Tyr62 do Trp70 w SEK. ID. NR: 3. W
dalszym konkretnym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego koduje muteinę, w której tych usuniętych
dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową.
[0019] W innym wykonaniu, cząsteczka kwasu nukleinowego zawiera sekwencję nukleotydową z SEK. ID.
NR: 2, w której usunięte są nukleotydy 268-294. W konkretnym wykonaniu tego typu, nukleotydy 268-294 z 25
sekwencji nukleotydowej SEK. ID. NR: 2 są zastąpione przez trzy nukleotydy, które kodują pojedynczą resz-
tę leucynową.
[0020] Jak opisano powyżej, wynalazek dostarcza również zasadniczo nietoksycznych mutein toksyny alfa
Clostridium perfringens. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwa-
sową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 18 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym jedną z usunię-30
tych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która zawiera sekwen-
cję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 12 kolejnych reszt aminokwasowych, przy czym
jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny alfa, która
zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 9 kolejnych reszt aminokwasowych,
przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest muteina toksyny 35
alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 6 kolejnych reszt amino-
kwasowych, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68. Ponadto ujawniona jest mute-
ina toksyny alfa, która zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus co najmniej 3 kolejne
reszty aminokwasowe, przy czym jedną z usuniętych reszt aminokwasowych jest His68.
[0021] Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 48 kolejnych reszt aminokwa-40
sowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera dele-
cję nie więcej niż 36 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujaw-
EP 2 007 420 B1
6
niona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej niż 24 kolejnych reszt aminokwasowych z se-
kwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3. Ujawniona jest ponadto muteina, która zawiera delecję nie więcej
niż 18 kolejnych reszt aminokwasowych z sekwencji aminokwasowej z SEK. ID. NR: 3.
[0022] Ujawniona jest ponadto zasadniczo nietoksyczna muteina, w której dziewięć kolejnych reszt amino-
kwasowych jest usuniętych z sekwencji aminokwasowej SEK. ID. NR: 3, z których jedną jest His68. W bar-5
dziej konkretnym wykonaniu tego typu, usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciągało się
od Tyr62 do Trp70 w SEK. ID. NR: 3. W dalszym konkretnym wykonaniu, w sekwencji aminokwasowej muteiny
tych usuniętych dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucy-
nową.
[0023] Wynalazek dostarcza ponadto atenuowanych organizmów Clostridium perfringens, które mają czą-10
steczkę kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium per-
fringens włączoną do ich chromosomów. Korzystnie , włączona cząsteczka kwasu nukleinowego znajduje
się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do lokalizacji cząsteczki kwasu nukleinowego, która
koduje toksynę alfa typu dzikiego w organizmie Clostridium perfringens typu dzikiego. Zatem, atenuowany
organizm Clostridium perfringens według wynalazku może być zasadniczo nietoksyczny z powodu braku 15
działającego genu plc typu dzikiego. Jak tu przedstawiono przykładowo, atenuowanym organizmem Clostri-
dium perfringens może być Clostridium perfringens typu A.
[0024] W konkretnym wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens
jest Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 (nr depozytu ATCC PTA7364). W innym konkretnym
wykonaniu niniejszego wynalazku, atenuowanym organizmem Clostridium perfringens jest Clostridium per-20
fringens CPERF/ΔαToxin 365-053 (nr depozytu ATCC PTA7365).
[0025] Organizm Clostridium perfringens, który jest atenuowany sposobami według niniejszego wynalazku
może być wyizolowany od zwierzęcia gospodarza, którym jest bądź ssak, bądź ptak. Takie ssaki mogą
obejmować: bydło, owce i świnie. Przykłady odpowiednich ptaków obejmują kury, indyki, kaczki, gołębie
(ang. pigeons i doves), gęsi, łabędzie, kuropatwy i głuszcowate.25
[0026] Niniejszy wynalazek dostarcza również szczepionek. Takie szczepionki mogą zawierać atenuowane
organizmy Clostridium perfringens według wynalazku. Szczepionki według wynalazku mogą również zawie-
rać dopuszczalne farmakologicznie bufory, substancje pomocnicze i/lub adiuwanty.
[0027] Wynalazek dostarcza ponadto sposobów indukowania odporności na Clostridium perfringens u zwie-
rzęcia. Jedno z takich wykonań obejmuje podawanie zwierzęciu skutecznej immunologicznie dawki szcze-30
pionki według niniejszego wynalazku. Szczepionki według niniejszego wynalazku mogą być podawane wie-
loma drogami, w tym: doustnie, domięśniowo, dożylnie, doskórnie, podskórnie, donosowo. Szczepionka
według niniejszego wynalazku może być nałożona na paszę dla zwierząt i/lub rozpylona na zwierzęta w celu
jej dostarczenia do podawania doustnego. Wynalazek dostarcza ponadto paszy zwierzęcej, która zawiera
szczepionkę według niniejszego wynalazku.35
[0028] Niniejszy wynalazek dostarcza również atenuowanego organizmu Clostridium perfringens według
niniejszego wynalazku, który, dodatkowo, wyraża co najmniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostri-
dium perfringens. W jednym z takich wykonań jeden lub więcej polipeptydów nie z Clostridium perfringens to
polipeptydy bakteryjne, takie jak białka antygenowe z E. coli, Salmonella, Lawsonia lub Campylobacter itd.
i/lub ich kombinacje. Alternatywnie albo łącznie z tym, polipeptydem nie z Clostridium perfringens może być 40
polipeptyd niebakteryjny. Przykłady takich polipeptydów niebakteryjnych obejmują białka ssacze lub ptasie,
EP 2 007 420 B1
7
np. cytokiny, takie jak kurza IL-18, wirusów takich jak rotawirus lub koronawirus; oraz pasożytów, takich jak
Eimeria, Isospora i Cryptosporidium.
[0029] Ponadto ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z epitopem, którego brakuje w zasad-
niczo nietoksycznej muteinie toksyny alfa Clostridium perfringens. Takie przeciwciała mogą odróżnić zasad-
niczo nietoksyczną muteinę od toksyny alfa Clostridium perfringens typu dzikiego.5
[0030] Ujawnione są też zastawy testowe, które zawierają ujawnione przeciwciała do stosowania w identyfi-
kowaniu, czy dane zwierzę było szczepione lub alternatywnie, zostało naturalnie zakażone organizmem
Clostridium perfringens.
[0031] A zatem, dostarczone są również sposoby identyfikowania i/lub odróżniania zwierzęcia, które zostało
naturalnie zakażone organizmem Clostridium perfringens od tego, które zostało zaszczepione atenuowanym 10
organizmem Clostridium perfringens. W jednym z takich wykonań sposób obejmuje doprowadzenie do kon-
taktu próbki płynu od zwierzęcia z przeciwciałem, które wiąże się wybiórczo z epitopem znajdującym się w
toksynie alfa Clostridium perfringens typu dzikiego, który został usunięty z zasadniczo nietoksycznej muteiny
toksyny alfa Clostridium perfringens według niniejszego wynalazku. Zatem, przy pomocy przeciwciała można
odróżnić te zwierzęta, które zostały zaszczepione zasadniczo nietoksyczną muteiną toksyny alfa Clostridium 15
perfringens według wynalazku (i/lub atenuowanym organizmem Clostridium perfringens wyrażającym mute-
inę) od tych, które są zakażone lub były zakażone toksyną alfa Clostridium perfringens typu dzikiego. Na-
stępnym krokiem jest określenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu, np., wiąże się z antygenem za-
wartym w próbce płynu. Zwierzę identyfikuje się jako takie, które jest/było naturalnie zakażone organizmem
Clostridium perfringens, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu.20
KRÓTKI OPIS FIGUR[0032]
Fig. 1 przedstawia mapę genomową regionu kodującego toksynę alfa C. perfringens. Pokazane jest
położenie, odpowiednio, dwóch dużych fragmentów (1182 par zasad i 1746 par zasad), które były wy-25
korzystywane do wytworzenia CPERF001. Wskazane jest również położenie uzyskanej delecji 27 par
zasad. „Yplc” oznacza gen yplc (CPE0035), „plc” oznacza gen kodujący toksynę alfa (fosfolipazę C), a
„CobW” oznacza gen leżący poniżej.
Fig. 2A przedstawia sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID. NR: 4; jest to
część SEK. ID. NR: 22, (tj., nukleotydy 262-300) z fragmentu genu plc z CP6] i odpowiadającą mu se-30
kwencję peptydową (SEK ID NR: 5), w której podkreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonu-
kleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji.
Fig. 2B przedstawia sekwencję startera (SEK. ID. NR: 6) stosowaną do utworzenia delecji w rodziciel-
skim szczepie 1240 C. perfringens, z uzyskaniem szczepu z delecją CPERF001. Podkreślenie wska-
zuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI zawarte w starterze dla ułatwienia konstruowania35
delecji. Przedstawiony jest również odpowiadający temu peptyd (SEK. ID. NR: 7).
Figura. 2C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF001 (SEK. ID. NR: 8; nukleotydy 103-
117) i w odpowiadającym temu peptydzie (SEK. ID. NR: 9). Podkreślenie wskazuje przywrócone miej-
sce dla endonukleazy restrykcyjnej BamHI.
Fig. 3A przedstawia ponownie sekwencję części genu plc ze szczepu CP6 C. perfringens [SEK. ID.40
NR: 4, nukleotydy 262-300] i odpowiadającą jej sekwencję peptydową (SEK. ID. NR: 5), w której pod-
kreślenie wskazuje miejsce restrykcyjne dla endonukleazy BamHI stosowane przy tworzeniu delecji.
EP 2 007 420 B1
8
Fig. 3B przedstawia sekwencję startera (SEK. NR. ID: 10) stosowanego do utworzenia delecji w ro-
dzicielskim szczepie 29 C. perfringens, dającej początek szczepowi CPERF002 z delecją. Przedsta-
wiony jest również odpowiedni peptyd (SEK. ID. NR: 11).
Fig. 3C przedstawia sekwencję uzyskanej delecji w CPERF002 (SEK. ID. NR: 12) i odpowiedni peptyd
(SEK. ID. NR: 13).5
SZCZEGÓŁOWY OPIS
[0033] Zatem, wynalazek dostarcza zmodyfikowanych organizmów i hodowli organizmów Clostridia, które
wyrażają jedną lub więcej toksyn Clostridia, np. toksyn alfa, takich jak muteiny, które nie mają wykrywalnej10
toksyczności i/lub mają zasadniczo niską toksyczność w porównaniu z toksynami Clostridia natywnymi lub
typu dzikiego. Korzystnie, zmutowane organizmy C. perfringens według wynalazku można łatwo podawać
zwierzętom jako żywą szczepionkę. Dostarczone są również muteiny toksyn alfa C. perfringens według wy-
nalazku, wraz z cząsteczkami kwasu nukleinowego, które kodują muteiny, wektorami do ekspresji toksyn
alfa i sposobami ich stosowania.15
[0034] W celu dostarczenia jasnego opisu wynalazku, kilka terminów jest zdefiniowanych jak następuje.
Szczepionka jest kompozycją, która zawiera immunogen i inne ewentualne dopuszczalne farmaceutycznie
składniki, obejmujące, w niektórych wykonaniach, odpowiednie adiuwanty. Stosowany tu termin „immuno-
gen” opisuje kompozycję, substancję lub wektor, który po wprowadzeniu do organizmu zwierzęcia, stymuluje
odpowiedź odpornościową. Dla celów niniejszego wynalazku, przyjmuje się, że immunogen obejmuje do-20
wolny wektor zdolny do ekspresji lub wprowadzania muteiny toksyny alfa według wynalazku do zwierzęcia,
które ma być immunizowane. Wektor obejmuje, np., C. perfringens według wynalazku lub inny odpowiedni
drobnoustrój, który wyraża muteinę toksyny alfa według wynalazku, gdy wektor jest wprowadzony do zwie-
rzęcia. Wektor obejmuje również cząsteczki kwasu nukleinowego znane w tej dziedzinie, np. plazmidy i tym
podobne, które ulegają ekspresji do muteiny toksyny alfa według wynalazku, gdy są wprowadzone bezpo-25
średnio do zwierzęcia, np. przez wniknięcie do komórki zwierzęcia i wyrażenie muteiny toksyny alfa u zwie-
rzęcia. Immunogenem jest również białko, takie jak toksyna alfa według wynalazku, zastosowane samo lub
jako część odpowiedniej kompozycji szczepionki.
[0035] Stosowane tu terminy „immunizować” i „szczepić”, o ile nie zaznaczono, że jest inaczej, są synoni-
mami i są stosowane zamiennie dla opisania wprowadzania immunogenu do zwierzęcia w celu wzbudzania30
odpowiedzi odpornościowej u zwierzęcia. Wzbudzona odpowiedź odpornościowa dostarcza traktowanemu
zwierzęciu ochronnej odporności, która ogranicza lub zmniejsza oznaki kliniczne choroby, np., zgorzeli ga-
zowej i/lub śmiertelności u zaszczepionych zwierząt, które są później prowokowane wirulentną dawką ga-
tunku C. perfringens, dla których szczepionka według wynalazku jest ochronna.
[0036] Termin „adiuwant” jest zdefiniowany jako jedna lub więcej substancji, które powodują stymulację35
układu odpornościowego. W tym kontekście, adiuwant jest stosowany do wzmocnienia odpowiedzi odporno-
ściowej wobec jednego lub większej liczby antygenów/izolatów szczepionkowych. Adiuwant można podawać
docelowemu zwierzęciu przed, w kombinacji z lub po podaniu szczepionki. Adiuwanty według wynalazku
można uzyskać z dowolnego z wielu źródeł, w tym ze źródeł naturalnych, źródeł rekombinowanych i/lub są
one syntetyzowane chemicznie, itd. Przykłady związków chemicznych stosowanych jako adiuwanty obejmu-40
ją, ale nie wyłącznie, związki glinu, metabolizowane i niemetabolizowane oleje; polimery blokowe; ISCOM
(kompleksy immunostymulujące); witaminy i minerały (w tym, ale nie wyłącznie: witaminę E, witaminę A,
EP 2 007 420 B1
9
selen, witaminę B12); Quil A (saponiny); usieciowane polimery oparte na kwasie akrylowym (np. polimery
kwasu prop-2-enowego), usieciowane do różnych poziomów z polieterem polialkenylowym, jak sprzedawane
pod znakiem towarowym CARBOPOL®; i/lub jednorodnie zdyspergowane, rozmiarów mikronowych, kropelki
emulsji wodnej, np., jak sprzedawane pod znakiem towarowym Emulsigen®.
[0037] Dodatkowe przykłady adiuwantów, które są niekiedy konkretnie określane wyraźnie jako immuno-5
stymulatory, obejmują składniki ściany komórkowej bakterii i grzybów (np. lipopolisacharydy; lipoproteiny,
glikoproteiny, muramylopeptydy, beta-1,3/1,6-glukany), różne węglowodany złożone pochodzące z roślin
(np. glikany, acemannany), różne białka i peptydy pochodzące ze zwierząt (np. hormony, cytokiny, czynniki
kostymulujące) i nowe kwasy nukleinowe pochodzące z wirusów i innych źródeł (np. dwuniciowy RNA, CpG).
Ponadto, dowolna liczba kombinacji wyżej wymienionych substancji może dostarczyć działania adiuwanto-10
wego, a zatem może stanowić adiuwant według niniejszego wynalazku.
[0038] Stosowany tu termin „przeciwciało”, ma obejmować przeciwciała poliklonalne, przeciwciała monoklo-
nalne i/lub ich fragmenty lub rekombinowane pochodne, w tym skonstruowane białka wiążące zawierające
domeny zmienne przeciwciał.
[0039] Stosowana tu numeracja reszt i pozycji reszt aminokwasowych białek toksyny alfa według wynalazku 15
opiera się na systemie numeracji opisanym dla szczepu 13 Clostridium perfringens. Toksyna alfa ze szczepu
13 C. perfringens jest opisana pod numerem dostępu GenBank NC 003366, jak pokazano w SEK. ID. NR: 1.
Całe białko ma długość 398 aminokwasów. Toksyna alfa kodowana przez wektory dla muteiny przedstawio-
ne tu przykładowo poniżej odpowiadają białku z SEK. ID. NR: 1 mającego delecję reszt aminokwasowych
90-98. Jest tam 28-aminokwasowa sekwencja sygnałowa, która jest odcinana podczas dojrzewania białka. 20
Zatem przykładowa delecja odpowiada resztom aminokwasowym 62-70 dojrzałego białka, które ma długość
370 aminokwasów (SEK. ID. NR: 3).
[0040] Numeracja kodonów w DNA kodującym białka toksyny alfa według wynalazku opiera się na genie plc
szczepu 13 Clostridium perfringens, jak opisano w GenBank nr dostępu NP 560952 i jak pokazano w SEK.
ID. NR: 2. Sekwencja kodująca dla toksyny alfa rozciąga się od nukleotydu 48590 do 49786 w szczepie 13 25
C. perfringens. Delecja kodonów w przedstawionych tu przykładowo dwóch konstruktach odpowiada nukle-
otydom 48857 do 48883 (włącznie) genu NP 560952. Delecja ta znajduje się w obrębie genu toksyny alfa i
odpowiada nukleotydom 268-294 w sekwencji kodującej SEK. ID. NR: 2.
[0041] Ponadto, stosowanie terminów w liczbie pojedynczej dla wygody w opisie nie ma na celu stanowie-
nia jakiegokolwiek ograniczenia. Zatem, na przykład, odniesienie się do kompozycji zawierającej komórki C. 30
perfringens obejmuje odniesienie się do jednej lub większej liczby takich komórek.
[0042] W konkretnym aspekcie niniejszego wynalazku, dostarczone są nierewertujące mutanty C. perfrin-
gens, które są „zasadniczo nietoksyczne”, tj., organizmy, które wyrażają immunogenną toksynę alfa o małej
toksyczności lub bez, co czyni je odpowiednimi do stosowania jako szczepionki ochronne. Organizmy C.
perfringens według wynalazku wykazują zatem odpowiednio zmniejszoną toksyczność w stosunku do orga-35
nizmów C. perfringens typu dzikiego, aby sprawić, że są dopuszczalne jako szczepionka lub antygen, gdy
stosuje się je w warunkach skutecznych do wzbudzenia odpowiedzi odpornościowej anty-toksyna alfa lub
anty-C-perfringens u zwierzęcia, które zostało tak zaszczepione. A zatem, organizm C. perfringens według
wynalazku jest „atenuowany” w stosunku do C. perfringens typu dzikiego.
[0043] Zwrot „zasadniczo nietoksyczny” ma mieć również zastosowanie do wyżej wymienionych immuno-40
gennych mutein toksyny alfa, które mają wystarczająco niską toksyczność lub brak, co sprawia, że są od-
powiednie także do stosowania w szczepionce ochronnej.
EP 2 007 420 B1
10
[0044] Zmniejszenie toksyczności mierzy się, np., jednym z następujących testów znanych w tej dziedzinie:
aktywności hemolitycznej, aktywności fosfolipazy C, aktywności sfingomielinazy, aktywności fosfodiesterazy i
ogólnej aktywności letalnej w grupie badanych zwierząt. Na ogół w takich standardowych testach resztkowa
toksyczność nie jest wykrywalna. Jednak obecność minimalnego poziomu jednej lub większej liczby tych
aktywności, np., od około 10-4 do około 10-2, w odniesieniu do toksyczności równoważnej liczby jednostek 5
zakaźnych toksyny alfa C. perfringens typu dzikiego, z której muteina pochodzi, może okazać się dopusz-
czalna w warunkach weterynaryjnych.
[0045] W jednym z wykonań, wynalazek jest wykonywany z zastosowaniem biotypu A szczepów C. perfrin-
gens, które mają szczególne znaczenie jako czynniki etiologiczne różnych typów zgorzeli i chorób jelitowych.
Konkretnie, toksyna alfa z C. perfringens jest celem dla delecji-atenuacji, ponieważ osłabienie tej toksyny 10
jest wystarczające dla uczynienia C. perfringens wystarczająco nieletalnym w stosunku do szczepów typu
dzikiego.
[0046] Ogólnie, gen plc C. perfringens wyraża muteinę toksyny alfa.
[0047] Muteina toksyny alfa ma delecję, która obejmuje His z pętli Zn2, razem z resztami flankującymi, w
celu znacznego zmniejszenia możliwości jakiegokolwiek mutacji powrotnej do postaci toksycznej. Obecnie 15
stwierdzono, że delecja reszty His z pętli Zn2, np. His68 z SEK. ID. NR: 3, wraz z delecją dodatkowych reszt
flankujących resztę His z pętli Zn2 zapewnia zachowanie dostatecznej immunogenności toksyny alfa dla
indukowania ochronnej odporności u zwierząt zaszczepionych C. perfringens według wynalazku, przy czym
jest także mało prawdopodobne, aby podlegała mutacji powrotnej do kodowania toksyny alfa typu dzikiego.
Dodatkowe reszty, które można usunąć, są usuwane w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N, w sto-20
sunku do His68, a ich liczba może wahać się od około 4 do około 60 reszt w obydwu tych kierunkach. Alter-
natywnie, w podobny sposób mogą być usunięte His148 i reszty flankujące.
[0048] Jedna z mutein toksyny alfa zawiera także, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 30 reszt amino-
kwasowych, z każdej strony (w kierunku końca C i/lub w kierunku końca N) pozycji His68, w stosunku do
sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 25
20 reszt aminokwasowych z każdej strony His68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Opisana muteina
toksyny alfa zawiera, oprócz delecji His68, delecję co najmniej 5 reszt aminokwasowych z każdej strony
His68, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Muteina toksyny alfa według wynalazku zawiera delecję od
około reszty 62 do około reszty 70, w stosunku do sekwencji SEK. ID. NR: 3. Ewentualnie, usunięte reszty
aminokwasowe są zastąpione przez jedną lub więcej innych reszt, na przykład, przez pojedynczą resztę30
leucynową.
[0049] W jeszcze dalszym, innym aspekcie, muteina toksyny alfa C. perfringens jest wytwarzana i izolowa-
na z C. perfringens lub z alternatywnego rekombinowanego organizmu do zastosowania jako odczynnik do
badań i/lub w zestawach diagnostycznych lub testach, np. jako cel dla przeciwciał anty-toksyna alfa. Jeszcze
innym zastosowaniem białek mutein toksyny alfa C. perfringens są wyspecjalizowane szczepionki dla zwie-35
rząt, np. ludzi, którzy mogą nie tolerować szczepienia atenuowanym organizmem C. perfringens według
wynalazku.
[0050] Ponadto, ujawnione jest przeciwciało, które wiąże się swoiście z toksyną alfa typu dzikiego w sto-
sunku do mutein toksyny alfa według niniejszego wynalazku.
[0051] Ujawnione jest ponadto przeciwciało, które wiąże się selwktywnie z białkiem toksyny alfa C. perfrin-40
gens typu dzikiego, wykazując minimalne lub brak wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku, np.
unikając wiązania się z muteiną toksyny alfa, która ma delecję, jak opisano szczegółowo powyżej. Dostar-
EP 2 007 420 B1
11
czone przeciwciało jest zatem przydatne do odróżniania muteiny toksyny alfa z delecją od toksyny alfa typu
dzikiego, a zatem jest również przydatne do rozróżniania zwierząt zaszczepionych szczepionką według ni-
niejszego wynalazku od zwierząt, które zostały zakażone C. perftingens typu dzikiego. Sposoby wzbudzania
i wyszukiwania takich wybiórczych przeciwciał są znane w tej dziedzinie. Podobnie, można wytwarzać prze-
ciwciała, które rozpoznają muteinę toksyny alfa według niniejszego wynalazku, ale nie białko typu dzikiego. 5
Przeciwciała mogą być poliklonalne, monoklonalne („mAb”) albo fragmentami lub fragmentami uzyskanymi
na drodze inżynierii genetycznej lub pochodnymi takich przeciwciał zachowującymi właściwości swoistego
wiązania.
[0052] Techniki wytwarzania i wyszukiwania przeciwciał monoklonalnych zostały obszernie opisane
[patrz, np., Stites. i wsp. (red.) Basic and Clinical Immunology (wyd. 4.), Lange Medical Publications, Los 10
Altos, California (1988); Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988); Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles and Practice (wyd. 2.), Academic Press, New York (1986); i Kohler and
Milstein, Nature 256:495-497 (1975).
[0053] Na przykład i bez ograniczeń, odpowiedź odpornościowa jest wzbudzana w odpowiednich zwierzę-
tach, takich jak mysz lub kura, przez szczepienie oczyszczonym białkiem toksyny alfa C. perfringens typu 15
dzikiego, np. łącznie z odpowiednim adiuwantem. Na przykład, w celu uniknięcia toksyczności białka alfa
typu dzikiego, immunogenem jest peptyd odpowiadający usuniętym resztom i, jeśli to konieczne, immuno-
genność peptydu jest wzmacniana przez skojarzenie z odpowiednim adiuwantem lub połączenie z odpo-
wiednim białkiem nośnikowym. Łączenie z białkiem nośnikowym jest znane w tej dziedzinie i można je
przeprowadzić, np. przez dostarczenie peptydu z końcową cysteiną i przyłączenie go do hemocyjaniny ze 20
skałoczepa (KLH,) lub albuminy z surowicy bydlęcej (BSA) stosując bądź reakcję chemiczną z użyciem ma-
leimidu, bądź łącznika sulfosukcynimidylo-4-[N maleimidometylo]cykloheksano-1-karboksylowego (od Pier-
ce). Można również zastosować łącznik karbodiimidowy bez wymogu końcowej cysteiny.
[0054] Aby uzyskać przeciwciała monoklonalne, od immunizowanego zwierzęcia można otrzymać limfocyty
śledzionowe, wytworzyć z tych limfocytów hybrydoma i można otrzymać jedną lub większą liczbę tych po-25
tencjalnie odpowiednich hybryda wyrażających przeciwciało anty-białko toksyny alfa. Hybrydoma przeszuku-
je się pod kątem zarówno muteiny, jak i białka alfa typu dzikiego i hybrydoma wyrażające przeciwciało, które
wiąże się tylko z toksyną alfa typu dzikiego identyfikuje się, klonuje i wykorzystuje do wytwarzania przeciw-
ciał monoklonalnych, które wiążą się tylko z białkiem toksyny alfa typu dzikiego. Ewentualnie, ze zidentyfi-
kowanej klonalnej linii hybrydoma otrzymuje się cDNA i przeciwciała rekombinowane lub fragmenty przeciw-30
ciał można wytwarzać w innych, dobrze znanych w tej dziedzinie, układach ekspresyjnych.
[0055] Jak omówiono powyżej, jedną z potencjalnych wad szczepienia jest na ogól to, że uzyskane szcze-
pione zwierzęta mogą dawać wyniki fałszywie dodatnie, gdy testuje się je pod kątem zakażenia stosując
przeciwciała przeciw naturalnie występującemu szczepowi, co utrudnia identyfikację zwierząt zakażonych.
Zatem, ujawniony jest zestaw testowy do odróżniania osobników – zwierząt, które zostały zakażone wystę-35
pującym naturalnie organizmem C. perfringens, od tych zaszczepionych muteiną toksyny alfa według niniej-
szego wynalazku.
[0056] Jeden z takich zestawów testowych zawiera ilość wybiórczego przeciwciała anty-toksyna alfa typu
dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa według wynalazku.
Zestaw może również zawierać inne odpowiednie odczynniki, wystarczające do przeprowadzenia co naj-40
mniej jednego testu diagnostycznego. W dalszym wykonaniu, przeciwciało zawiera znacznik lub jest wyzna-
kowane łatwo wykrywalną resztą markerową, np. dowolnym znanym w tej dziedzinie markerem enzymatycz-
EP 2 007 420 B1
12
nym, np. peroksydazą; znacznikiem fluorescencyjnym, np. fluoresceiną; kulkami, w tym, kulkami magnetycz-
nymi; i tym podobnymi. Ewentualnie, zestaw może ponadto zawierać znakowane przeciwciało, które wiąże
się wybiórczo z wybiórczym przeciwciałem anty-toksyna alfa typu dzikiego. Testy immunologiczne są dobrze
znane w tej dziedzinie i obejmują kanapkowy test immunologiczny, konkurencyjny test immunologiczny,
enzymatyczne testy immunosorpcyjne (ELISA, testy radioimmunologiczne (RIA) i inne.5
[0057] Dostarczone są również sposoby identyfikacji i odróżniania zwierzęcia, które zostało zakażone przez
organizm C. perfringens występujący naturalnie, tj. typu dzikiego, od zwierzęcia zaszczepionego szczepion-
ką zawierającą atenuowany organizm C. perfringens według wynalazku, które przeprowadza się na przy-
kład, w następujących etapach:
(a) kontaktowanie próbki płynu od zwierzęcia z opisanym powyżej wybiórczym przeciwciałem anty-10
toksyna alfa typu dzikiego, które wykazuje minimalne lub nie wykazuje wiązania z muteiną toksyny alfa
według niniejszego wynalazku; i
(b) ustalenie, czy przeciwciało reaguje z próbką płynu;
przy czym, gdy przeciwciało reaguje z próbką płynu, zwierzę jest identyfikowane jako to, które zostało zaka-
żone organizmem C. perfringens występującym naturalnie.15
Wytwarzanie atenuowanych szczepów C. perfringens
[0058] Proces przekształcania izolatu C. perfringens typu dzikiego w szczep atenuowany lub zasadniczo
nietoksyczny, odpowiedni do podawania jako szczepionka, można przeprowadzić jak następuje. Gen toksy-20
ny alfa (plc) można zastąpić na chromosomie bakteryjnym genem kodującym jedynie muteinę toksyny alfa,
nie pozostawiając żadnej zdolności organizmu C. perfringens do wytwarzania toksyny alfa typu dzikiego.
Bardzo szeroko, proces wytwarzania organizmu szczepionkowego obejmuje, ale nie wyłacznie, następujące
ogólne etapy, niekoniecznie w podanej kolejności.
(1) Identyfikacja typu zwierzęcia, które ma być chronione przez szczepienie i jednego lub więcej izola-25
tów klinicznych uzyskanych dla celów badań przesiewowych. Etap ten jest zazwyczaj opcjonalny w
przypadku toksyny alfa, ponieważ izolaty z jednego gatunku zwierzęcia prawdopodobnie nie będą za-
pewniać ochrony innym gatunkom zwierząt.
(2) Powielenie genu plc z izolatu lub izolatów C. perfringens, np. przez zastosowanie reakcji PCR lub
innej znanej w tej dziedzinie techniki amplifikacji kwasu nukleinowego, z odpowiednimi starterami flan-30
kującymi i zastosowanie amplifikacji z odpowiednimi starterami w celu utworzenia żądanej mutacji de-
lecyjnej. Alternatywnie, można przeszukać odpowiednią bibliotekę z użyciem sondy .
(3) Wytworzenie wektora samobójczego zawierającego gen plc z delecją, z którego usunięty został
początek replikacji C. perfringens i/lub początek replikacji, który może replikować się w C. perfringens
po prostu nie jest tam obecny; i w każdym przypadku obejmującego odpowiednie markery selekcyjne, 35
np. markery antybiotykowe, sąsiadujące ze zmutowanym genem plc. Taki wektor można następnie
wprowadzić do organizmów C. perfringens, np. przez elektroporację lub innymi metodami znanymi w
tej dziedzinie.
(4) Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których gen plc dla muteiny został z powodzeniem
włączony do chromosomu bakteryjnego. Dokonuje się tego przez hodowanie organizmów C. perfrin-40
gens z etapu (3) w obecności czynnika selekcyjnego, np. antybiotyku(ów) odpowiadającego(ych) mar-
kerom selekcyjnym. Na przykład, tylko organizm C. perfringens, który rósłby w warunkach selekcji na
EP 2 007 420 B1
13
antybiotyk byłby takim, który przez rekombinację homologiczną ma bezpośrednio włączony do chro-
mosomu bakteryjnego wektor samobójczy z jego genem(ami) oporności na antybiotyki. Te rosnące
organizmy C. perfringens miałby zatem dwa sąsiadujące geny plc, jeden będący typu dzikiego, pod-
czas gdy drugi miałby mutację delecyjną.
(5) Selekcjonowanie organizmów C. perfringens, w których nastąpiło dalsze zdarzenie rekombinacyj-5
ne, które usuwa markery selekcyjne, np. markery antybiotykowe, wraz genem plc typu dzikiego. Do-
konuje się tego przez hodowlę organizmów z (4) w nieobecności czynnika selekcyjnego, np. antybio-
tyku i selekcjonowanie klonów niehemolitycznych na agarze z krwią.
[0059] Ponieważ wprowadzenie kwasu nukleinowego dla muteiny można osiągnąć na drodze rekombinacji
homologicznej, cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca muteinę toksyny alfa jest włączana w pozycji na10
chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukleinowego kodującej toksynę alfa
typu dzikiego, która jest obecna w nieatenuowanym Clostridium perfringens.
[0060] Bardziej szczegółowo, izolaty polowe C. perfringens otrzymuje się od chorych zwierząt lub z innych
źródeł. Początkowo, genomowy DNA uzyskany z izolatów polowych będących przedmiotem zainteresowania
wstawia się do odpowiedniego wektora wahadłowego dla dwóch mikroorganizmów, np. plazmidu wahadło-15
wego z markerami selekcyjnymi, np. markerami antybiotykowymi, w celu zbadania ich zdolności do trans-
formacji. Ogólnie, odpowiedni wektor wahadłowy będzie obejmować jedną, dwie, trzy lub więcej z następu-
jących właściwości: miejsce do klonowania, początek replikacji C. perfringens, początek replikacji E. coli i
gen oporności na antybiotyk i/lub marker selekcyjny. Znane w tej dziedzinie wektory odpowiednie do tego
celu lub podlegające łatwej adaptacji do tego celu obejmują, na przykład, rekombinowany plazmid wahadło-20
wy pHR106 opisany przez Robertsa i wsp., [Appl. Env Mircobiol 54: 268-270 (1988)]; plazmidy pJIR750 i
pJIR751 opisane przez Bannama i wsp. [Plasmid 29:233-235 (1993)]; bezpromotorowy wektor pPSV do
selekcji promotorów według Matsushita i wsp., 1994, Plasmid 31 317-319; plazmidy wahadłowe pJIR1456 i
pJIR1457, opisane przez Lyrasa i wsp., 1988, Plasmid 39, 160-164 oraz wektor wahadłowy pAK201, opisa-
ny przez Kim i wsp., 1989, Appl. Environ Microbiol 55, 360-365. Usunięcie początku replikacji C. perfringens25
przekształca wektor wahadłowy w wektor samobójczy.
[0061] Na przykład, jednym z plazmidów wahadłowych jest pJIR418, opisany przez Sloan i wsp., 1992,
Plasmid 27, 207-219.
[0062] Izolaty dające ≥104 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i które są wrażliwe na marker
antybiotykowy np. chloramfenikol lub erytromycynę, są potencjalnymi kandydatami dla delecji. Genomowy 30
DNA ze szczepów - kandydatów stosuje się następnie jako matrycę do reakcji PCR o dalekim zasięgu dla
genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących ze szczepów - kandydatów. Na przykład, jak przedstawiono
dla przykładu poniżej, chromosom szczepu 13 C. perfringens zastosowano do identyfikacji starterów do am-
plifikacji genu kodującego toksynę alfa. Startery zastosowano następnie do klonowania genu toksyny alfa z
innego szczepu, który był izolatem CP6 z drobiu.35
[0063] Po subklonowania produktów PCR gen toksyny alfa i regiony flankujące poddano sekwencjonowaniu
i mapowaniu restrykcyjnemu. Zsyntetyzowano nowe startery oligonukleotydowe z flankującymi miejscami
restrykcyjnymi i produkty z dwóch oddzielnych amplifikacji sklonowano do odpowiedniego plazmidu samo-
bójczego (początek replikacji C. perfringens został usunięty), np. jak przedstawiono dla przykładu poniżej,
jako plazmid 1192-23.1, w celu wytworzenia żądanego szczepu szczepionkowego z delecją.40
[0064] Dostarczony(e) wektor(y) samobójczy(e) swoisty(e) dla izolatu(ów) wprowadza się do odpowiedniego
szczepu zwierzęcego C. perfringens dowolną standardową metodą znaną w tej dziedzinie. Na przykład,
EP 2 007 420 B1
14
dokonuje się tego przez elektroporację. Gdy wektor samobójczy (bez początku replikacji C. perfringens)
wprowadza się do C. perfringens, jest on niezdolny do replikacji w cytoplazmie i przeżycia, o ile nie włączy
się z powodzeniem do chromosomu bakteryjnego. Jedynymi organizmami, które będą rosły w obecności
antybiotyku odpowiadającemu nowo wprowadzonemu genowi markera antybiotykowego, są integranty.
[0065] Można zastosować dowolny znany w tej dziedzinie gen markera selekcyjnego, chociaż w wektorach 5
przedstawionych przykładowo poniżej użyte są markery: chloramfenikol i/lub erytromycyna.
[0066] Te zdarzenia rekombinacyjne są wynikiem homologii genu plc typu dzikiego z genem plc z delecją w
DNA plazmidowym. Uzyskane rekombinowane bakterie są nazywane integrantami. Integrant zawiera kopię
wprowadzonego wektora z homologią, który jest włączony w locus genu plc. Zatem uzyskany w rezultacie
integrant zawiera dwie kopie genu plc, oryginalną kopię prawidłową i wprowadzoną wersję z delecją. Wpro-10
wadzone geny oporności na antybiotyki znajdują się między dwiema kopiami genu plc. Między dwiema ko-
piami genu plc mogą pojawić się rzadkie zdarzenia rekombinacji losowej. To zdarzenie rekombinacji może
dać jeden z dwóch wyników. W obu przypadkach zostaje usunięty DNA znajdujący się między dwiema ko-
piami genu plc (w tym geny odporności) . Jako pierwszy wynik, odtworzony zostaje gen plc prawidłowy lub
typu dzikiego, w rezultacie czego następuje odzyskanie wyjściowego szczepu rodzicielskiego bez markerów 15
antybiotykowych. Jako drugi wynik, gen plc typu dzikiego jest zastępowany przez kopię z delecją, dając po-
żądany konstrukt dla toksyny alfa z delecją bez markerów antybiotykowych.
[0067] Usunięcie antybiotyków z pożywki hodowlanej umożliwia tym bakteriom, w których nastąpiła rekom-
binacja, przeżycie i replikację. Rekombinowane klony delecyjne identyfikuje się przez wzrost na agarze z
krwią, bez hemolizy normalnie wykazywanej przez C. perfringens, który wyraża toksynę alfa typu dzikiego.20
Zwierzęta do szczepienia
[0068] Zwierzęta, dla których można wytworzyć szczepionkę z atenuowanym C. perfringens i dla których
można wyizolować przydatne szczepy C. perfringens typu dzikiego, obejmują ogólnie, dowolne zwierzęta, 25
dla których zakażenie C. perfringens stanowi problem. Kręgowce będące przedmiotem zainteresowania
obejmują ptaki, ssaki i ryby, a zwłaszcza zwierzęta ważne w gospodarce i/lub rolnictwie. Poniższa lista zwie-
rząt to te, które jak się uważa, odniosą korzyść ze szczepionki z C. perfringens, i/lub od których można uzy-
skać izolaty C. perfringens typu dzikiego. Chociaż możliwe jest czasami, że takie szczepionki zawierają
składnik (żywy lub nieżywy), który został pierwotnie wyizolowany z tego samego rodzaju lub gatunku zwie-30
rzęcia, który ma być szczepiony, nie stanowi to wymogu.
[0069] Nieograniczająca lista takich zwierząt obejmuje te z rodzin ptaków, bydła, owiec, itd., jak również
zwierząt wodnych, np. które mogą być poddane akwakulturze i/lub zbierane ze środowiska naturalnego i
utrzymywane przy życiu w zbiornikach przez czas przed sprzedażą. Obejmuje to ryby, takie jak pstrąg lub
łosoś i inne gatunki hodowane lub zbierane dla korzyści ekonomicznych. Zwierzęta wodne inne niż kręgow-35
ce obejmują homary, kraby, mięczaki, np., kalmary, ośmiornice, małże, ostrygi, ślimaki, przegrzebki i tym
podobne. Określenie „ptasi” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, kury, indyki, , gęsi, kaczki itp.
Określenie „bydlęcy” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, bydło, wołowina, cielęcina itp. Okre-
ślenie „owczy” ma być rozumiane jako obejmujące, na przykład, jagnię, itp.
[0070] Dla celów niniejszego wynalazku, termin „ryba” ma być rozumiany, jako obejmujący, ale nie wyłącz-40
nie,, zgrupowanie ryb Teleosti, tj. doskonałokostnych. W obrębie ugrupowania Teleosti zawarty jest zarów-
EP 2 007 420 B1
15
no rząd Salmoniformes (który obejmuje rodzinę Salmonidae), jak i rząd Perciformes (który obejmuje rodzinę
Centrarchidae).
[0071] Przykłady potencjalnych ryb - biorców obejmują m.in. rodzinę Salmonidae, rodzinę Serranidae, ro-
dzinę Sparidae, rodzinę Cichlidae, rodzinę Centrarchidae, rybę z rodziny luszczowanych (Parapristipoma
trilineatum) i plekostomusa niebieskookiego (Plecostomus spp.).5
Rodzina SalmonidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWACoregonus clupeaformis Sieja amerykańskaCoreqonus hoyi Ryba siejowataOncorhynchus keta Keta (gatunek łososia)Oncorthynchus gorbuscha GorbuszaOncorhynchus kisutch Kiżucz (łosoś srebrny)Oncorhynchus masou SimaOncorhynchus nerka NerkaOncorhynchus tshawytscha Czawycza(łosoś królewski)Prosopium cylindraceum Koniek, wałekOncorhynchus clarki Łosoś ClarkaOncorhynchus mykiss Pstrąg tęczowySalmo salar Łosoś szlachetny, łosoś atlan-
tyckiSalmo trutta Troć wędrownaSalmo trutta X S. fontinalis Hybrydowy pstrąg tygrysiSalvelinus alpinus Golec zwyczajnySalvelinus confluentus Pstrąg byczy
Salvelinus fontinalis Pstrąg źródlanySalvelinus leucomaenis KundżaSalvelinus malma MalmaSalvelinus namaycush Palia jeziorowa, palia amery-
kańskaThymallus thymallus Lipień pospolity
Niektórzy przedstawiciele rodziny SerranidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWACentropristis ocyurus ang. Bank sea bassCentropristis philadelphicus ang. Rock sea bassCentropristis striata strzępiel czarnyDiplectrum bivittatum ang. Dwarf sandperchDiplectrum formosum Strzępiel piaskowyEpinephelus flavolimbatus Granik strojnyEpinephelus morio Granik morioSerranus phoebe ang. TattlerSerranus tortuqarum ang. Chalk bass
Niektórzy przedstawiciele rodziny SparidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAArchosarqus probatocephalus Sparus owczarzArchosarqus rhomboidalis Sparus jednoplamyCalamus penna ang. Sheepshead porgyLaqodon rhomboides ang. PinfishPagrus Major Pagrus japońskiSparus aurata DoradaStenotomus chrysops Skap
Niektórzy przedstawiciele rodziny CichlidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAequidens latifrons Akra błękitnaCichlisoma nigrofasciatum Pielęgnica zebaCrenichichla sp. ang. Pike cichlidPterophyllum scalare Skalar
EP 2 007 420 B1
16
Tilapia mossambica Tilapia mozambickaOreochromis spp TilapiaSarotherodon aurea Tilapia złota
Niektórzy przedstawiciele rodziny CentrarchidaeNAZWA SYSTEMATYCZNA NAZWA ZWYCZAJOWAAmbloplites rupestris Bass czerwonookiCentrarchus macropterus Bass pawik, okoń pawik
Okoń moczarowyElassoma okefenokee ang. Okefenokee pigmy sun-
fishElassoma zonatum Okończyk paskowanyEnneacanthus gloriosus Bassek diamentowyEnneacanthus obesus Bassek zielonyLepomis auritus Bass różowyLepomis cyanellus Bass zielonyLepomis cyanellus X L. qibbosus Bass zielony x bass słoneczny Lepomis gibbosus Bass słoneczny, słonecznica
pstraLepomis gulbsus ang. WarmouthLepomis humilis ang. Orange-spotted sunfishLepomis macrochirus Bass pręgowany, bass błękit-
noskrzelny, bass niebieski Lepomis megalotis ang. Longear sunfishMicropterus coosae ang. Shoal bassMicropterus dolomieui Bass małogębowyMicropterus punctulatus ang. Spotted bassMicropterus salmoides Bass wielkogębowy, oko-
niopstrągPomoxis annularis Bass białyPomoxis nigromaculatus Bass czarny
[0072] W dalszym wykonaniu, zwierzęciem jest zwierzę do towarzystwa lub człowiek. Dla celów niniejszego
wynalazku, termin zwierzę „do towarzystwa” ma być rozumiany jako obejmujący wszystkie zwierzęta - konie
(koniowate), koty (kotowate), psy (psowate) i gryzonie, w tym,gatunki myszy, szczurów, świnek morskich, 5
królików oraz ptaki, takie jak gołębie, papugi, i tym podobne.
[0073] Ptaki otrzymujące takie szczepienie mogą być związane bądź z komercyjną, bądź z niekomercyjną
hodowlą ptaków. Obejmuje to np. Anatidae, takie jak łabędzie, gęsi i kaczki, Columbidae, np. gołębie (ang.
doves and pigeons), takie jak gołębie domowe, Phasianidae, np. kuropatwę, głuszcai indyki, Thesienidae,
np. kury domowe, Psittacines, np. papużki, ary i papugi, np., hodowane jako zwierzęta domowe lub markery 10
dla zbiorników. Kury zilustrowano poniżej.
Źródła izolatów typu dzikiego
[0074] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku można wytwarzać, na ogól, rozpoczynając 15
od C. perfringens typu dzikiego, który został pierwotnie wyizolowany z dowolnego zakażonego zwierzęcia
będącego przedmiotem zainteresowania, jak omówiono powyżej, i/lub ze środowiska. Środowisko obejmuje
dowolny materiał, który zawiera żywotne organizmy C. perfringens i/lub żywotne spory C. perfringens, w tym
na przykład, zanieczyszczoną żywność, glebę, wodę, ściółkę zwierzęcą, odchody i tym podobne.
[0075] Justin i wsp. [Biochemistry 41, 6253-6262 (2002)] scharakteryzowali toksyny alfa z różnych szcze-20
pów C. perfringens, które są niemal identyczne pod względem sekwencji i właściwości biochemicznych.
Jednakże Justin i wsp. opisują również szczep, który został wyizolowany ze źródła ptasiego (łabędzia), który
EP 2 007 420 B1
17
miał toksynę alfa wykazującą duży stopień zmienności sekwencji i zmienioną specyficzność substratową w
porównaniu z innymi szczepami. Z tego powodu uważa się, że większość izolatów będzie, po przekształce-
niu w postać atenuowaną, wzbudzać ochronną odporność na toksynę alfa z wielu innych szczepów C. per-
fringens występujących naturalnie. Niemniej jednak, z uwagi na możliwość różnic w toksynie alfa między
izolatami, często korzystne będzie izolowanie i atenuacja organizmów C. perfringens z gatunków zwierząt, 5
dla których pożądana jest szczepionka anty-C. perfringens. Izolat przedstawiony przykładowo poniżej został
wyizolowany od kury i badany w tym gatunku.
Szczepionki
10
[0076] Atenuowane organizmy C. perfringens według wynalazku zwykle formułuje się jako farmaceutycznie
dopuszczalne kompozycje szczepionkowe. Kompozycje szczepionkowe formułuje się zgodnie z drogą po-
dawania i są one kompatybilne z aktywnym czynnikiem antygenowym. Aktywnym czynnikiem antygenowym
jest, na przykład, jeden lub więcej szczepów atenuowanych organizmów C. perfringens typu A według wyna-
lazku. Ewentualnie, kompozycja szczepionkowa może również zawierać jeden lub więcej typów nietoksycz-15
nego białka toksyny alfa, w kombinacji z atenuowanymi organizmami C. perfringens typu A.
[0077] Na przykład, zasadniczo wszystkie atenuowane organizmy C. perfringens typu A wchodzące w skład
szczepionki są żywe i żywotne, chociaż w pewnych specyficznych sytuacjach, np. do immunizacji niektórych
ludzi lub zwierząt o upośledzonej odporności, szczepionka będzie zawierać wyłącznie zabite atenuowane
organizmy C. perfringens typu A.20
[0078] Kompozycja szczepionkowa zawiera fizjologicznie kompatybilne bufory i/lub sole, ewentualnie w
kombinacji z adiuwantami i/lub ewentualnymi czynnikami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność
(podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach, np. przed lub po szczepieniu).
[0079] Odpowiednie immunostymulatory obejmują, ale nie wyłącznie, cytokiny, czynniki wzrostu, chemoki-
ny, supernatanty z hodowli komórek limfocytów, monocytów, komórki z narządów limfoidalnych, preparaty 25
komórkowe lub ekstrakty komórkowe (np. Staphylococcus aureus lub preparaty lipopolisacharydowe), mito-
geny lub adiuwanty oraz farmaceutyki o niskiej masie cząsteczkowej. Czynnik immunostymulujący można
podawać in ovo w dowolnym czasie podczas inkubacji. W konkretnym aspekcie, czynnik immunostymulujący
podaje się w pożywce zawierającej atenuowane organizmy C. perfringens typu A.
30
Sposoby podawania szczepionki
[0080] Opisane powyżej szczepionki podaje się, na przykład, przez wstrzyknięcie lub zaszczepienie przez
jedną lub kombinację następujących dróg: doustnie, donosowo, pozajelitowo, podskórne, przez zadrapanie
skóry i/lub podanie domięśniowe, w dowolnej odpowiedniej formulacji znanej w tej dziedzinie, np. w kompa-35
tybilnym buforze i/lub dopuszczalnej fizjologicznie soli, w ewentualnej kombinacji z adiuwantami i/lub czynni-
kami wzmacniającymi lub stymulującymi odporność (podawanymi jednocześnie lub podawanymi w seriach,
np. przed lub po szczepieniu). Dla szczepionek/sposobów szczepienia podawanych doustnie, można łatwo
zastosować dowolny z fizjologicznie odpowiednich buforów lub środków zawieszających, które są znane w
tej dziedzinie. Ponadto, kompozycja może być włączona, np. zmieszana z wodą do picia lub rozpylona na 40
granulki pożywienia, lub posypana lub rozpylona na kukurydzę lub inne ziarna i tym podobne.
EP 2 007 420 B1
18
[0081] Przewód żołądkowo-jelitowy jest częstym miejscem zakażenia C. perfringens, a zatem podawanie
doustne jest rozważane jako jeden ze sposobów inokulacji. Rozważa się możliwość, że obecność żywych
atenuowanych organizmów C. perfringens według wynalazku w przewodzie pokarmowym będzie wywoływać
miejscowe ochronne reakcje odpornościowe zlokalizowane w warstwie błony śluzowej przewodu żołądkowo-
jelitowego i może również działać konkurencyjnie zapobiegając następującej potem kolonizacji C. perfrin-5
gens typu dzikiego.
[0082] Dla ptaków, takich jak drób, w tym kur, kaczek, gęsi, itp., najbardziej przydatnymi drogami szczepie-
nia są sposób doustny lub wstrzykiwanie in ovo. Droga in ovo jest podana jako przykład tu poniżej i daje
aktywną immunizację i ochronę przed prowokacją u wyklutych kurcząt.
10
Ekspresja obcych genów przez C. perfringens
[0083] Stosując techniki opracowane w poprzednich przykładach, dowolny gen niewystępujący naturalnie,
tj., obcy dla C. perfringens, może być ewentualnie wstawiony do chromosomowego DNA C. perfringens. Dla
ekspresji obcych białek, można wytworzyć fuzje genowe, które zabezpieczają sekwencje flankujące gen15
toksyny alfa, promotor toksyny alfa i jej sekwencję sygnałową. W jednym wykonaniu, większość sekwencji
kodującej genu plc jest zastąpiona przez obcy gen. Pozostałe nukleotydy genu plc poniżej wstawionego
genu są poza ramką odczytu, a zatem nie jest wytwarzana funkcjonalna toksyna alfa. Alternatywnie, obcy
gen można wprowadzić w ramce do sekwencji nukleotydowej kodującej muteinę toksyny alfa, tworząc fuzję
białkową toksyna alfa-obce białko.20
[0084] Startery oligonukleotydowe dla obcego genu można zsyntetyzować np. z N-końcową sekwencją
znacznika FLAG i odpowiednimi miejscami restrykcyjnymi. Produkty PCR można wklonować do wektora
samobójczego; znacznik FLAG i obcy gen są wstawione w ramce z sekwencją sygnałową toksyny alfa. Obce
białko ulega ekspresji pod kontrolą promotora toksyny alfa i jest kierowane do sekrecji przez sekwencję sy-
gnałową plc. Wydzielane obce białko można wykryć w supernatancie hodowlanym przez analizę Western 25
przy użyciu przeciwciała anty-FLAG.
[0085] W ten sposób można wstawić do genomu C. perfringens dowolny odpowiedni obcy gen. Obejmuje
to, na przykład, DNA kodujący antygeny z patogenów przewodu żołądkowo-jelitowego, w tym, np. białka
antygenowe z bakterii, takich jak E. coli, gatunki Salmonella, gatunki Campylobacter, gatunki Lawsonia i tym
podobne; białka antygenowe pasożytów, takich jak gatunki Eimeria, gatunki Isospora, gatunki Cryptospori-30
dium i tym podobne oraz białka antygenowe wirusów, takich jak rotawirusy, koronawirusy i tym podobne, w
celu immunizacji zwierząt traktowanych takim rekombinowanym C. perfringens. Inne białka, które mogą być
wyrażone przez taki rekombinowany C. perfringens obejmują białka lub peptydy terapeutyczne. Ewentualnie,
obejmują one peptydy, które są endogenne dla przewodu żołądkowo-jelitowego, obejmując czynnik trójlistny
lub dowolny typ cytokiny znany w tej dziedzinie, np. kurzą IL-18 i tym podobne.35
[0086] Jeden z takich konstruktów C. perfringens wyraża kurze białko IL-18. Podawanie żywych bakterii
zawierających fuzję genową umożliwi dostarczenie terapeutycznych dawek IL-18 do jelita, będąc jednak
stosunkowo nieszkodliwymi dla zwierzęcia-gospodarza ze względu na brak wytwarzania toksyny alfa. Za
pomocą tego systemu można również uzyskać ekspresję innych środków leczniczych.
[0087] Poniższe konkretne przykłady są włączone dla celów ilustracji i nie mają na celu ograniczenia zakre-40
su wynalazku, o ile nie wskazano, że jest inaczej.
EP 2 007 420 B1
19
Przykład 1WEKTOR W OPARCIU O HOMOLOGIĘ DLA TOKSYNY ALFA C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0088] Wytworzono wektor plazmidowy 1162-55-20 w oparciu o homologię, przydatny w konstrukcji toksyny
alfa C. perfringens z delecjami. Plazmid zawiera wiele ważnych elementów; region replikacji z plazmidu E.
coli pUC18; geny oporności na chloramfenikol (catP) i erytromycynę (ermBP) C. perfringens (obydwa podle-5
gają również ekspresji w E. coli); i gen toksyny alfa (plc) C. perfringens inaktywowany przez konkretną dele-
cję 9 aminokwasów. Plazmid 1162-55-20 został wytworzony w kilku etapach, jak następuje.
[0089] Najpierw sklonowano gen plc z ostatniego ptasiego izolatu C. perfringens (szczepu CP6). Do zapro-
jektowania starterów oligonukleotydowych do zastosowania w klonowaniu genu plc wykorzystano sekwencję
szczepu 13 C. perfringens (GenBank NC 003366, SEK. ID. NR: 2). Te i wszystkie kolejne startery otrzymano10
komercyjnie z Sigma Genosys, Woodlands. Starter sensowny’, położony w obrębie genu yplc (CPE0035),
5’AGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC 3' (SEK. ID. NR: 14), odpowiada nukleotydom 47675-47700
szczepu 13 (SEK. ID. NR: 2). Starter antysensowny, położony w obrębie genu cobW (CPE0037),
5'GCAGAAACTCTTCTTAGACCTATTCTTTTAGGC 3' (SEK. ID. NR: 15), jest komplementarny do nukleoty-
dów 50597-50629 szczepu 13. Startery te zastosowano wraz z genomowym DNA ze szczepu CP6 C. per-15
fringens w reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) o szerokim zasięgu. Produkt o długości 2955 par zasad, od
leżącego po stronie 5’ genu yplc do leżącego po stronie 3’ genu cobW, przewidziano ze znanej sekwencji
szczepu 13 (jak pokazano na Fig. 1). Promotor toksyny alfa, sekwencja sygnałowa i sekwencja kodująca
genu plc (CPE0036) są zawarte w tym fragmencie, tj. między leżącym powyżej genem yplc i leżącym poniżej
3’ genem cob W. Fragment PCR złożony z 2955 par zasad wklonowano następnie do wektora do klonowa-20
nia, pCR-Blunt (Invitrogen Corporation, Carlsbad, CA), otrzymując plazmid 1162-52.1. Z tego fragmentu
określono sekwencję nukleotydową regionu kodującego plc złożonego z 2955 par zasad ze szczepu CP 6
(SEK ID NR: 22, a odpowiedni polipeptyd to SEK. ID. NR: 23) i wykazano, że jest zasadniczo homologiczny
do tego w genie plc ze szczepu 13 C. perfringens (SEK. ID. NR: 2).
[0090] Następnie sklonowano region replikacji E. coli i geny oporności C. perfringens z plazmidu wahadło-25
wego pJIR418 (Sloan i wsp., 1992, Plasmid 27, 207-219; GeneBank M77169)). Plazmid pJIR418 strawiono
enzymami restrykcyjnymi BamHI i SpeI i końce wypełniono przy zastosowaniu polimerazy Klenowa. Ligacja
dużego fragmentu wytworzyła plazmid 1162-45.1 i odtworzyła miejsce restrykcyjne BamHI. Plazmid ten za-
chowuje region replikacji E. coli, ale w przeciwieństwie do pJIR418, nie zawiera początku replikacji C. per-
fringens. Plazmid jest zatem zdolny do autonomicznej replikacji w E. coli, ale nie w C. perfringens.30
[0091] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego 1162-45.1.
Trawienie plazmidu 1162-52.1 BamHI i EcoRI uwolniło fragment złożony z 1742 par zasad zawierający C-
końcową część genu toksyny alfa, od unikatowego miejsca BamHI znajdującego się w obrębie genu plc
poprzez leżący poniżej gen cobW do miejsca EcoRI znajdującego się w miejscu wielokrotnego klonowania
zgrupowaniu miejsc do klonowania plazmidu rodzicielskiego. Fragment złożony z 1742 par zasad wklono-35
wano między miejscami BamHI i EcoRI położonymi w obrębie miejsc wielokrotnego klonowaniaplazmidu
1162-45.1. W uzyskanym plazmidzie 1162-53.7, C-końcowa połowa genu plc jest w tej samej orientacji tran-
skrypcyjnej co geny catP i ermBP plazmidu rodzicielskiego.
[0092] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc wklonowano do unikatowego miejsca BamHI pla-
zmidu 1162-53.7. Osiągnięto toprzez utworzenie fragmentu PCR pochodzącego z genu toksyny alfa, sub-40
klonowanego w plazmidzie 1162-52.1. Starter sensowny, 5' ggatccAGCTGCATAAGCAAAAGTTCCAACTC
3' (SEK. ID. NR: 16), był identyczny z wcześniej wymienionym starterem yplc (SEK ID NR: 4), z tą różnicą,
EP 2 007 420 B1
20
że włączono flankujące miejsce BamHI (małe litery). Starter antysensowny, położony w obrębie genu toksy-
ny alfa, 5' ggatccaATGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3' (SEK. ID. NR: 17), był komplemen-
tarny do nukleotydów 48824-48857 szczepu 13 i zawierał flankujące miejsce restrykcyjne BamHI i łącznik
nukleotydowy dla zachowania ramki odczytu (małe litery). Fragment BamHI powstały w reakcji PCR z zasto-
sowaniem tych starterów i matrycy DNA plazmidu 1162-52-1 wklonowano w unikatowym miejscu BamHI 5
plazmidu 1162-53.7. Wyizolowano plazmid zawierający dwa regiony genu plc w tej samej orientacji tran-
skrypcyjnej. Ten plazmid, 1162-55.20, zawiera gen plc z pożądaną dziewięcioaminokwasową delecją i do-
daniem reszty Leu między Ala 61 i Asp 71 toksyny typu dzikiego (patrz Fig. 2). Sekwencjonowanie DNA
plazmidu potwierdziło ramkę odczytu i usunięcie w sumie 24 kodonów (kodujących osiem reszt aminokwa-
sowych).10
PRZYKŁAD 2KONSTRUKCJA REKOMBINOWANEGO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CPERF001
[0093] Wersję genu plc z delecją, skonstruowaną w Przykładzie 1, wprowadzono do C. perfringens stosując
następującą strategię. Wektor w oparciu o homologię 1162-55.20 jest nazwany „plazmidem samobójczym”15
C. perfringens, ponieważ jego początek replikacji w C. perfringens został usunięty.
[0094] Gdy tym plazmidem transformowano C. perfringens, nie był on zdolny do replikacji i nie przeżywał.
Jednak, jeśli transformowane bakterie poddaje się selekcji na chloramfenikol i/lub erytromycynę, można
forsować rekombinację plazmidowego DNA z genomem bakterii przez homologię z genem plc. Uzyskana
rekombinowana bakteria jest nazywana integrantem. Integrant zawierał kopię wprowadzonego wektora w 20
poparciu o homologię, który został włączony w locus genu plc. A zatem, otrzymany w rezultacie integrant
zawierał dwie kopie genu plc, prawidłową kopię oryginalną i wprowadzoną wersję z delecją. Wprowadzone
geny oporności znajdowały się między dwiema kopiami genu plc. Po usunięciu selekcji antybiotykowej
względem integranta, nastąpiła rekombinacja między dwiema kopiami genu plc. To zdarzenie rekombinacji
może dawać jeden z dwóch wyników. W obydwu przypadkach, DNA wstawiony między dwie kopie genu plc25
(w tym geny oporności) został usunięty. Jako pierwszy wynik, odtworzony został prawidłowy gen plc, co pro-
wadzi do odzyskania wyjściowego szczepu rodzicielskiego. Jako drugi wynik, prawidłowy gen plc jest zastą-
piony przez kopię z delecją, co daje żądany konstrukt toksyny alfa z delecją. Ponieważ toksyna alfa ze
szczepu z delecją jest inaktywowana, ten szczep był niehemolityczny. Dlatego żądany integrant z delecją był
identyfikowany przez przeszukiwanie pod kątem klonów niehemolitycznych na płytkach agarowych z krwią.30
[0095] Ponieważ spodziewano się, że zdarzenie rekombinacji skutkujące żądanym integrantem wystąpi z
niską częstością, kluczowe było zastosowanie szczepu rodzicielskiego C. perfringens mającego wysoką
wydajność transformacji. Dlatego kilka ostatnich izolatów ptasich C. perfringens analizowano pod kątem
wydajności transformacji. Izolaty transformowano plazmidem wahadłowym pJIR418, jak zostało opisane
przez Allena i Blascheka (Applied and Environmental Microbiology 54:2322 (1988)), z niewielkimi modyfika-35
cjami (opisanymi poniżej). Szczep 1240 wykazał najwyższą wydajność transformacji (patrz Tabela 1), 9,2 x
106 transformantów/µg DNA plazmidu pJIR418. Szczep ten został wybrany jako szczep rodzicielski do kon-
strukcji szczepu z delecją CPERF001. Szczep 29 został wybrany jako szczep rodzicielski dla CPERF002.
40
EP 2 007 420 B1
21
Tabela 1Wydajność transformacji dla ptasich izolatów C. perfringens
Szczep A C. perf. Transformanty/µg pJIR418
29 3,6 x 104
23 5,6 x 102
1220 4,0 x 108
1240 9,2 x 106
CP-2 Żadnych1230 7,1 x 103
5227 Żadnych5230 Żadnych
Źródłem wyżej wymienionych szczepów typu dzikiego była dr J. Glenn Songer, Dept. of Veterinary Scien-ces and Microbiology,University of Arizona, Tucson, Arizona 85721
[0096] Komórki szczepu 1240 C. perfringens z całonocnej hodowli beztlenowej w pożywce TSYC (30 g/l
bulionu sojowego (Tryptic Soy Broth), 5 g/l ekstraktu drożdżowego, 0,5 g/l cysteiny) rozcieńczano 1:25 i ho-
dowano do A600= 0,5436. Po odwirowaniu 100 ml komórek przy 18000 x g przez 10 minut, przygotowano
komórki elektrokompetentne przez dwukrotne zawieszenie komórek w równej objętości wstępnie zreduko-5
wanej sacharozy w buforze - fosforanie magnezowym („SMP” wytworzono jako 270 mM sacharoza, 1 mM
MgCl2, 7 mM NaPO4, pH 7,3), a następnie zawieszono ostatecznie w 0,5 ml SMP. Doprowadziło to do koń-
cowej objętości około 2,0 ml.
[0097] Próbki 100 µl komórek poddano elektroporacji przy użyciu 4 µg plazmidu 1162-55.20 w 0,2 cm kuwe-
tach. Zastosowano Bio-Rad Gene Pulser II przy 1,37 kilowoltach, 100 omach oporu i 50 mikrofaradach po-10
jemności. Natychmiast po elektroporacji komórki rozcieńczono w 2,0 ml wstępnie zredukowanej pożywki z
trypsynizowanym ekstraktem sojowym, drożdżowym, z cysteiną („TSYC” wytwarza się jako 30 g bulionu
tryptozowo-sojowego, 5 g ekstraktu drożdżowego, 0,5 g cysteiny, 950 ml wody) i inkubowano przez trzy
godziny w temperaturze 37°C, w beztlenowym słoju. Po okresie regeneracji, rozcieńczone komórki wysie-
wano na płytki z TSYC + 25 μg/ml chloramfenikolu. Płytki te inkubowano w temperaturze 37°C przez noc w 15
beztlenowym słoju.
[0098] Po wzroście przez noc, zaobserwowano średnio 50 kolonii odpornych na chloramfenikol na mikro-
gram DNA 1162-55.20. Pojedyncze kolonie siedmiu domniemanych integrantów hodowano w pożywce nie-
selekcyjnej TSYC w czterech kolejnych hodowlach i wysiewano na nieselekcyjne płytki agarowe z krwią.
Jedna z niepoddawanych selekcji partii, 1192-31.7, wykazywała obecność kilku kolonii niehemolitycznych. 20
Dwadzieścia jeden z tych kolonii niehemolitycznych przeniesiono na nieselektywne płytki wzorcowe i i wyko-
nano replikę na płytkach TSYC + chloramfenikol. Dwie z 21 kolonii były wrażliwe na chloramfenikol.
[0099] Jeden z wrażliwych na chloramfenikol domniemanych klonów z delecją, 1192-32.14, hodowano rów-
nolegle ze szczepem dzikim 1240 i integrantem 1192-31.7 i wysiewano na płytki agarowe z krwią. Szczep
typu dzikiego 1240 wykazał wyraźne strefy hemolizy beta, natomiast szczep z delecją 1192-32.14 był czystą25
hodowlą kolonii niehemolitycznych i został przemianowany na CPERF001.
[0100] Inne płytki z krwią zastosowano jako płytki wzorcowe i repliki dla pożywki selekcyjnej i nieselekcyjnej.
Szczepy, dziki i CPERF001, były wrażliwe na chloramfenikol i erytromycynę. Integrant, 1192-31.7, był opor-
ny zarówno na chloramfenikol, jak i erytromycynę, zgodnie z oczekiwaniem.
EP 2 007 420 B1
22
[0101] Aby wykluczyć możliwość, że geny oporności na antybiotyki były obecne, ale nie podlegały ekspresji
w CPERF001, zsyntetyzowano startery specyficzne dla genów, chloramfenikolowego i erytromycynowego,
do zastosowania w reakcjach PCR. Genomowe DNA wytworzono ze szczepu typu dzikiego, integranta i
CPERF001 i zastosowano jako matryce do reakcji PCR ze starterami genów antybiotykowych. Wyniki anali-
zy PCR wykazały reakcję dodatnią tylko dla plazmidu samobójczego i integranta, a nie rodzicielskiego 1240 5
lub szczepu z delecją CPERF001. Potwierdza to przewidywaną utratę sekwencji genów oporności.
[0102] Aby potwierdzić delecję w obrębie genu toksyny alfa, region 1086 bp otaczający delecję amplifiko-
wano przez PCR stosując odpowiednie startery specyficzne dla toksyny alfa. Amplifikowany fragment sklo-
nowano i zsekwencjonowano. Wyniki sekwencjonowania potwierdziły delecję dziewięciu aminokwasów od
Tyr 62 do Trp 70 z genu toksyny alfa i wprowadzenie pojedynczej Leu (patrz Fig. 2A-2C).10
[0103] CPERF001 badano pod kątem ekspresji inaktywowanego białka anatoksyny alfa. Po 6 godzinach
wzrostu beztlenowego 1 ml próbki komórek zebrano i odwirowano. Piętnaście mikrolitrów niezatężonej po-
żywki z supernatantów analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym i poddano analizie We-
stern z zastosowaniem króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko rekombinowanemu
białku toksyny alfa (Vaccine 11(12): 1253-1258 (1993)). Wyniki pokazały reaktywność swoistego przeciwcia-15
ła z białkiem o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.
[0104] CPERF001 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-
cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep
ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie
przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.20
PRZYKŁAD 3KONSTRUKCJA REKOMBINOWANEGO CLOSTRIDIUM PERFRINGENS CPERF002[0105] W celu skompensowania niższej wydajności transformacji szczepu 29 C. perfringens (patrz Tabela 1,
powyżej) skonstruowano nowy wektor w oparciu o homologię. Nowy wektor zawierał sekwencje C. perfrin-25
gens sklonowane bezpośrednio z genomu szczepu 29. Przewidywano, że będzie to skutkowało bardziej
wydajnym etapem rekombinacji. Nowy wektor, 1192-38.3, wytworzono jak następuje.
[0106] W pierwszym etapie region replikacyjny E. coli i geny oporności C. perfringens sklonowano z plazmi-
du wahadłowego pJIR418 (Sloan i wsp., Plasmid 27, 207 (1992); GeneBank M77169). Plazmid pJIR418
strawiono enzymem restrykcyjnym NdeI. Ligacja dużego fragmentu dała plazmid 1192-23.1. Plazmidowi 30
temu brakuje początku replikacji C. perfringens, ale w przeciwieństwie do plazmidu 1162-45.1, który został
skonstruowany w Przykładzie 1, zachowuje całe miejsce wielokrotnego klonowania z pJIR418.
[0107] W następnym etapie, C-końcową połowę genu plc wklonowano do plazmidu pośredniego 1192-23.1.
Genomowy DNA ze szczepu 29 zastosowano jako matrycę do PCR o szerokim zasięgu. Amplifikowano
region genu plc (toksyny alfa) od miejsca BamHI przez część genu CPE0038. Starter sensownydla plc, 5’35
CTGGGATCCTGATACAGATAATAATTTCTCAAAGGAT 3' (SEK. ID. NR: 18), odpowiada nukleotydom
48880-48916 szczepu 13 (GenBank NC003366). Starter antydensowny w obrębie genu CPE0038, 5’
actctgcagTTGTCATATCAATTAAATTAACTATAATCCC 3’ (SEK. ID. NR: 19) jest komplementarny do nukle-
otydów 51244-51275 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące, obejmujące miejsce restrykcyjne PstI (ma-
łe litery). Otrzymano produkt złożony z 2402 par zasad i strawiono enzymami restrykcyjnymi BamHI i PstI. 40
Fragment ten poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-23.1 strawionego BamHI i PstI, z wytworzeniem
plazmidu 1192-36.10.
EP 2 007 420 B1
23
[0108] W końcowym etapie, N-końcową połowę genu plc sklonowano przez PCR. Starter sensowny, 5’ act-
gagctcCTAGACACTTTGCTTCAATATTTGGGAA 3’ (SEK. ID. NR: 20) jest komplementarny do nukleotydów
46513-46540 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce SacI (małe litery). Starter antysensowny,
5’ actggatccGCATTCTTATCATAATCTGGATAAGTAGAACC 3’ (SEK. ID. NR: 21) jest komplementarny do
nukleotydów 48824-48855 szczepu 13 i zawiera nukleotydy flankujące i miejsce BamHI. Wytworzono pro-5
dukt złożony z 2363 par zasad i strawiono go enzymami restrykcyjnymi SacI i BamHI. Strawiony fragment
poddano ligacji z dużym fragmentem 1192-36.10 strawionego SacI i BamHI, z wytworzeniem plazmidu
1192-38.3. Przeprowadzone następnie sekwencjonowanie regionu flankującego miejsce BamHI w plc w
1192-38.3 potwierdziło delecję dziewięciu aminokwasów od Tyr 62 do Trp 70.
[0109] Plazmid 1192-38.3 użyto do elektroporacji komórek szczepu 29 C. perfringens. Wykazano uprzed-10
nio, że szczep 29 daje się transformować z wydajnością 3,6 x 104 transformantów/µg DNA plazmidu
pJIR418. Szczep 29 hodowano i poddano elektroporacji, jak w Przykładzie 2, z tą różnicą, że zastosowano
technikę selekcji płynnej po okresie trzech godzin regeneracji. Zamiast wysiewania, 0,67 ml próbki komórek
rozcieńczano w 12 ml TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i hodowano przez noc w 37°C w beztlenowym słoju.
Zastosowano tę modyfikację ze względu na niższą wydajność transformacji i wysiewania szczepu 29 w sto-15
sunku do 1240. Po wzroście przez noc, komórki rozcieńczono ponownie w pożywce selekcyjnej. Komórki z
drugiej hodowli pasażowano następnie pięciokrotnie bez selekcji przed wysianiem na płytki agarowe z krwią.
Żadna z kolonii z płytek agarowych z krwią nie była niehemolityczna. Dwie płytki z krwią wysiano metodą
replik na płytki TSYC, TSYC + 25 µg/ml chloramfenikolu i TSYC + 50 µg/ml erytromycyny. Wszystkie kolonie
były wrażliwe na erytromycynę, ale tylko jedna z 130 kolonii była wrażliwa na chloramfenikol. Ta kolonia, 20
1192-45.4B została przemianowana na CPERF002. Analiza PCR genomowego DNA z CPERF002 ze starte-
rami specyficznymi dla toksyny alfa wykazały dodatni prążek dla toksyny alfa. Ten prążek był mniejszy niż
odpowiadający mu prążek z DNA szczepu 29 typu dzikiego. Startery specyficzne dla genów oporności na
chloramfenikol i na erytromycynę nie amplifikowały DNA CPERF002, ale wykazywały silne pozytywne prążki
z plazmidu 1192-38.3. Sekwencjonowanie alfa-toksyny CPERF002 potwierdziło dziewięcioaminokwasową25
delecję (patrz Fig. 3).
[0110] CPERF002 badano pod kątem ekspresji białka inaktywowanej anatoksyny alfa. Po 6 godzinach
wzrostu beztlenowego próbki 1 ml komórek zebrano i odwirowano. Piętnaście mikrolitrów niezatężonej po-
żywki z supernatantów analizowano przez elektroforezę w żelu poliakryloamidowym i poddano analizie We-
stern z zastosowaniem króliczego przeciwciała poliklonalnego skierowanego przeciwko rekombinowanemu30
białku toksyny alfa (Vaccine 11: 1253 (1993)). Wyniki wykazały swoistą reaktywność przeciwciała z białkiem
o wielkości oczekiwanej dla białka anatoksyny alfa.
[0111] CPERF002 jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens typu A z dele-
cją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ szczep
ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje znaczną część antygenowości toksyny, będzie on 35
przydatny jako szczepionka do ochrony przed chorobą wywoływaną przez C. perfringens.
PRZYKŁAD 4SZCZEPIONKI Z C. PERFRINGENS Z DELECJĄ [0112] Szczepy szczepionkowe z delecją, CPERF001 i CPERF002, opisane w Przykładach 2 i 3, oceniano40
pod kątem ich zdolności do dostarczania ochrony przed prowokacją C. perfirngens typu dzikiego. Pierwszą
część badań zaprojektowano w celu określenia, czy podawanie żywych szczepów szczepionkowych ma
EP 2 007 420 B1
24
jakikolwiek negatywny wpływ na wykluwalność z jaj z zarodkami. Przyporządkowanie grup doświadczalnych
i wyniki bezpieczeństwa są opisane w Tabeli 2.
TABELA 2WYNIKI BEZPIECZEŃSTWA
Grupa* Szczepionka (dawka) ** Liczba jaj podlegających wykluciu (%)1 CPERF001 (0,8 x 102)X 18 (90%)2 CPERF001 (0,8 x 103) 17 (85%)3 CPERF001 (0,8 x 104) 11 (55%)4 CPERF001 (0,8 x 105) 16 (80%)5 CPERF002 (1,9 x 102) 16 (80%)6 CPERF002 (1,9 x 102) 17 (85%)7. CPERF002 (1,9 x 104) 14 (70%)8 CPERF002 (1,9 x 105) 12 (60%)9 Szczep 1240 (1,5 x 103) 16 (80%)10 Szczep 29 (3,7 x 103) 13 (65%)11 Kontrole dla pożywki 19 (95%)12 Kontrole niezainkulowane 18 (90%)
* 20 jaj na grup** Dawka 100 µl podawana in ovo w 18 dniu rozwoju zarodka (IM)x Miano na dawkę jest mierzone jako jednostki tworzące kolonie („cfu”)
[0113] Przy dawce 103 lub mniejszej (grupy 1, 2, 5 i 6), wykluwalność w tych grupach nie była znacząco 5
niższa niż w grupie zaszczepionej tylko pożywką (grupa 11) lub w grupie, która nie została zaszczepiona
(grupa 12). Przy najniższej dawce CPERF001 wykazywał tę samą wykluwalność co kontrola z pożywką i
lepszą niż niezaszczepiona grupa kontrolna.
[0114] Ponieważ wyższe dawki szczepów z delecją mogłyby mieć niekorzystny wpływ na wykluwalność jaj,
tylko dwie najniższe grupy dawkowania dla każdego szczepu z delecją włączono do części badania pod 10
kątem skuteczności. Te grupy, razem z ptakami z kontroli dla pożywki (grupa 11), prowokowano szczepem
CP6 C. perfringens (typu dzikiego), który był podawany doustnie w ilości 108 cfu/ml/ptaka, gdy ptaki były w
wieku 20, 21 i 22 dni. Wszystkie ptaki zostały poddane sekcji w 25 dniu życia i zmiany w jelicie cienkim oce-
niano przy zastosowaniu skali ocen dla martwiczego zapalenia jelit (NE, ang. necrotic enteritis) zestawionych
poniżej. 15
Wynik 0 Martwicze zapalenie jelit1+
Martwicze zapale-nie jelit
2+
Martwicze zapalenie jelit3+
Martwicze zapa-lenie jelit
4+Brak dużych zmian NE wjelicie cienkim;jelito ma pra-widłową ela-styczność (samo zwijasię z powro-tem na po otwarciu).
Cienka i wiotka ścia-na jelita (jelito pozo-staje płaskie po otwarciu i nie zwijasię z powrotem do normalnej pozycji);nadmiar lub zagęsz-czony śluz pokrywa-jący błonę śluzowąlub ogniskowe albowieloogniskowe ła-godne zaczerwienie-nie śluzówki lub przekrwienie naczyńbłony surowiczej.
Pojedyncze lub kilka wieloognisko-wych obszarówzaczerwienienia i obrzęku ściany jelita; jedno lub kilka wieloognisko-wych obszarów owrzodzenia lubmartwicy błony śluzowej jelita.
Rozległe wieloogni-skowe obszary mar-twicy i owrzodzenia błony śluzowej jelita ± znaczne krwawie-nie lub warstwa fibry-ny lub szczątkówmartwiczych na po-wierzchni błony ślu-zowej (wygląd ręcz-nika tureckiego).
Martwe zwierzę z dużymi zmianami NE z wynikiem 2+ lub wyższym.
Ocena wyniku z niewielkimi modyfikacjami jest według Charlesa Hofacre, DVM, MAM, Ph.D., University of Georgia, Poultry Diagnostic and Research Center, 953 College Station Road, Athens, GA 30602.
EP 2 007 420 B1
25
[0115] Pięć (5) ptaków z nieszczepionej grupy kontrolnej (nie prowokowanej) poddano sekcji na zakończe-
nie badania, aby potwierdzić, że nie było w ekspozycji na C. perfringens w trakcie badania. Wyniki są przed-
stawione w Tabeli 3.
TABELA 3
GRUPY TRAKTOWANIA DLA OCHRONY* WYNIKIGrupa* Szczepionka Dawka szczepionki in-
ovo (cfu)Dni życia przy prowokacji C.
perfringens N Średnia
1 CPERF001 1x102 20, 21 i 22 9 0,672 CPERF001 1x103 20, 21 i 22 13 0,465 CPERF002 1x102 20, 21 i 22 12 1,336 CPERF002 1x103 20, 21 i 22 12 1,08
11 Kontrola dla po-żywki
Żadna 20, 21 i 22 15 1,80
12 Żaden Żadna Nie prowokowana 5 0,00* Sekcja zwłok w 25 dniu życia
5
[0116] Wyniki dla grup 1 i 2 były znacząco statystycznie niższe w porównaniu z grupą 11 (test kolejności par
Wilcoxona p≤0,0250). Średnie wyniki dla Grup 5 i 6 były niższe niż dla Grupy 11, ale nie różniące się staty-
stycznie (test sumy rang Wilcoxona p≥0,2177). Ocenę skuteczności szczepionki przeprowadzono zgodnie z
procedurą opisaną przez David Siev [Journal of Modern Applied Statistical Methods Tom. 4, nr 2, 500-508
(2005)]. Skuteczność szczepionki w zmniejszaniu ciężkości choroby oceniono na 54% dla Grupy 1, 65% dla 10
Grupy 2, 20% dla Grupy 5 i 27% dla Grupy 6, w porównaniu z Grupą 11.
Przykład 5KONSTRUKCJA ŚWIŃSKIEGO C. PERFRINGENS Z DELECJĄ
15
[0117] Strategie zastosowane w Przykładach 1 i 2, jak wyżej, stosuje się do konstruowania mutantów dele-
cyjnych toksyny alfa ze świńskich szczepów C. perfringens. Początkowo, izolaty polowe od chorych świń
poddaje się elektroporacji z plazmidem pJIR418, aby ocenić ich zdolność do transformacji. Izolaty dające
≥104 transformantów na mikrogram plazmidowego DNA i wrażliwe bądź na chloramfenikol, bądź erytromycy-
nę są kandydatami dla delecji.20
[0118] Genomowy DNA ze szczepów – kandydatów stosuje się jako matrycę dla PCR o dużym zasięgu dla
genu plc (toksyny alfa) i sekwencji flankujących. Po subklonowaniu produktów PCR, gen toksyny alfa i re-
giony flankujące sekwencjonuje się i mapuje restrykcyjnie. Syntetyzuje się nowe startery oligonukleotydowe
z flankującymi miejscami restrykcyjnymi i produkty dwóch oddzielnych amplifikacji klonuje się w plazmidzie
samobójczym 1192-23.1 w celu wytworzenia delecji 27 par zasad, jak w Przykładzie 1.25
[0119] Świński wektor samobójczy wprowadza się przez elektroporację do odpowiedniego świńskiego
szczepu C. perfringens i izoluje się mutanty delecyjne przy zastosowaniu metod opisanych w Przykładzie 2,
powyżej. Mutanty delecyjne potwierdza się brakiem hemolizy beta na płytkach agarowych z krwią i przez
sekwencjonowanie DNA genu toksyny alfa.
[0120] Ten konstrukt jest uzyskanym na drodze inżynierii genetycznej szczepem C. perfringens Typu A z 30
delecją. Szczep ten wydziela inaktywowaną postać anatoksyny dla toksyny alfa C. perfringens. Ponieważ
ten szczep ten nie wyraża już aktywnej toksyny alfa, ale zachowuje jeszcze znaczną część antygenowości
toksyny, jest przydatny jako szczepionka do ochrony świń przed chorobą powodowaną przez C. perfringens.
EP 2 007 420 B1
26
DEPOZYT BIOLOGICZNY
[0121] Hodowle z następujących materiałów biologicznych zostały zdeponowane w następującym między-
narodowym depozycie:
[0122] American Type Culture Collection (ATCC) 10801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, 5
USA, w warunkach, które spełniają wymogi Traktatu Budapeszteńskiego o międzynarodowym uznawaniu
depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego.
Organizm Nr dostępu Daty złożenia depozytu
Clostridium perfringens CPERF/ΔαToxin 365-054 PTA7364 7 lutego 2006
Clostridium perfringens CPERF/ΔαtToxin 365-053 PTA7365 7 lutego 2006
Lista sekwencji10[0123]<110> Cochran, Mark Lair, Steven Synenki, Richard Petersen, Gary
<120> REKOMBINOWANE ATENUOWANE ORGANIZMY CLOSTRIDIUM I SZCZEPIONKA15
<130> AH06175
<150> 60/792,553<151> 2006-4-17
20<160> 23
<170> PatentIn version 3.3
<210> 125<211> 398<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens
<400> 130
EP 2 007 420 B1
30
<210> 45<211> 39<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 410
aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct 39
EP 2 007 420 B1
31
<210> 5<211> 13<212> PRT<213> Oligopeptyd
5<400> 5
<210> 610<211> 14<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 615
aatgcattgg atcc 14
<210> 7<211> 420<212> PRT<213> Oligopeptyd
<400> 725
<210> 8<211> 15<212> DNA30<213> Oligonukleotyd
<400> 8
aatgcattgg atcct 1535
<210> 9<211> 5<212> PRT<213> Oligopeptyd40
<400> 9
45<210> 10<211> 14<212> DNA<213> Oligonukleotyd
50<400> 10
aatgcggatc cagt 14
<210> 1155<211> 4<212> PRT<213> Oligopeptyd
<400> 1160
<210> 12<211> 1265<212> DNA<213> Oligonukleotyd
EP 2 007 420 B1
32
<400> 12
aatgcggatc ct 125
<210> 13<211> 4<212> PRT<213> Oligopeptyd
10<400> 13
<210> 1415<211> 26<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 1420
agctgcataa gcaaaagttc caactc 26
<210> 15<211> 3325<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 1530
gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc 33
<210> 16<211> 32<212> DNA35<213> Oligonukleotyd
<400> 16
ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 3240
<210> 17<211> 41<212> DNA<213> Oligonukleotyd45
<400> 17
ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 4150
<210> 18<211> 37<212> DNA<213> Oligonukleotyd
55<400> 18
ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37
<210> 1960<211> 40<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 1965
actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 40
EP 2 007 420 B1
33
<210> 20<211> 37<212> DNA<213> Oligonukleotyd
5<400> 20
actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 37
<210> 2110<211> 41<212> DNA<213> Oligonukleotyd
<400> 2115
actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41
<210> 22<211> 119720<212> DNA<213> Szczep CP6Clostridium perfringens
<400> 2225
<210> 2330<211> 398<212> PRT<213> Szczep CP6 Clostridium perfringens
<400> 2335
EP 2 007 420 B1
35
5LISTA SEKWENCJI
[0124]<110> Cochran, Mark D10Petersen, Gary RLair, Stephen VSynenki, Richard M
<120> Rekombinowane atenuowane organizmy Clostridium i szczepionka15
<130> AH06175WO
EP 2 007 420 B1
36
<140> PCT/US2007/009135<141> 2007-04-12
<150> US 60/792,5535<151> 2006-04-17
<160> 23
<170> PatentIn version 3.410
<210> 1<211> 398<212> PRT<213> Szczep 13 Clostridium perfringens15
<400> 1
EP 2 007 420 B1
39
<210> 45<211> 39<212> DNA<213> Clostridium perfringens
<400> 410aacgcctatg atctatatca agatcatttc tgggatcct 39
<210> 5<211> 13
EP 2 007 420 B1
40
<212> PRT<213> Clostridium perfringens
<400> 55
<210> 6<211> 14<212> DNA10<213> Sztuczna
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
15<400> 6
aatgcattgg atcc 14
<210> 720<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna
<220>25<223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie
<400> 7
30
<210> 8<211> 15<212> DNA<213> Sztuczna35
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 840
aatgcattgg atcct 15
<210> 9<211> 545<212> PRT<213> Sztuczna
<220><223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie 50
<400> 9
55<210> 10<211> 14<212> DNA<213> Sztuczna
60<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 1065
aatgcggatc cagt 14
EP 2 007 420 B1
41
<210> 11<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna
5<220><223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie
<400> 1110
<210> 12<211> 12<212> DNA15<213> Sztuczna
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
20<400> 12
aatgcggatc ct 12
<210> 1325<211> 4<212> PRT<213> Sztuczna
<220>30<223> Sekwencja aminokwasowa zawarta/wstawiona do białka po delecji. Może być zsyntetyzowana chemicznie
<400> 13
35
<210> 14<211> 26<212> DNA<213> Sztuczna40
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 1445
agctgcataa gcaaaagttc caactc 26
<210> 15<211> 3350<212> DNA<213> Sztuczna
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie55
<400> 15
gcagaaactc ttcttagacc tattctttta ggc 3360
<210> 16<211> 32<212> DNA<213> Sztuczna
65<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
EP 2 007 420 B1
42
<400> 16
ggatccagct gcataagcaa aagttccaac tc 32
<210> 175<211> 41<212> DNA<213> Sztuczna
<220>10<223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 17
ggatccaatg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 4115
<210> 18<211> 37<212> DNA<213> Sztuczna20
<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 1825
ctgggatcct gatacagata ataatttctc aaaggat 37
<210> 19<211> 4030<212> DNA<213> Sztuczna
<220><223> Zsyntetyzowana chemicznie35
<400> 19
actctgcagt tgtcatatca attaaattaa ctataatccc 4040
<210> 20<211> 37<212> DNA<213> Sztuczna
45<220><223> zsyntetyzowana chemicznie
<400> 2050
actgagctcc tagacacttt gcttcaatat ttgggaa 37
<210> 21<211> 41<212> DNA55<213> Sztuczna
<220><223> Zsyntetyzowana chemicznie
60<400> 21
actggatccg cattcttatc ataatctgga taagtagaac c 41
<210> 2265<211> 1197<212> DNA<213> Szczep CP6 Clostridium perfringens
<400> 2270
EP 2 007 420 B1
45
Zastrzeżenia patentowe5
1. Cząsteczka kwasu nukleinowego, która koduje zasadniczo nietoksyczną muteinę toksyny alfa Clostridium
perfringens, przy czym muteina toksyny alfa zawiera sekwencję aminokwasową z SEK. ID. NR: 3 minus 9
kolejnych reszt aminokwasowych rozciągających się od Tyr62 do Trp70.
2. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, która koduje muteinę, przy czym te usunięte dziewięć
kolejnych aminokwasów jest zastąpionych przez pojedynczą resztę leucynową.10
3. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 1, zawierająca sekwencję kwasu nukleinowego z SEK.
ID. NR: 2, w której nukleotydy 268-294 cząsteczki kwasu nukleinowego są usunięte.
4. Cząsteczka kwasu nukleinowego według zastrz. 3, w której usunięte nukleotydy są zastąpione przez se-
kwencję nukleotydową kodującą pojedynczą resztę Leu.
5. Zasadniczo nietoksyczna muteina toksyny alfa Clostridium perfringens, która zawiera sekwencję amino-15
kwasową z SEK. ID. NR: 3 minus dziewięć kolejnych reszt aminokwasowych rozciągających się od Tyr62 do
Trp70.
6. Zasadniczo nietoksyczna muteina toksyny alfa Clostridium perfringens według zastrz. 5, w której dziewięć
kolejnych reszt aminokwasowych jest usuniętych i zastąpionych przez pojedynczą resztę Leu.
7. Zasadniczo nietoksyczny atenuowany organizm Clostridium perfringens uzyskany przez włączenie czą-20
steczki kwasu nukleinowego według dowolnego z zastrz. 1 - 4 do chromosomu nieatenuowanego organizmu
Clostridium perfringens.
8. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 7, w którym cząsteczka kwasu nukleinowe-
go znajduje się w pozycji na chromosomie, która jest homologiczna do położenia cząsteczki kwasu nukle-
inowego kodującego toksynę alfa typu dzikiego obecną w nieatenuowanym Clostridium perfringens.25
9. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 7 albo zastrz. 8, którym jest Clostridium
perfringens typu A.
EP 2 007 420 B1
46
10. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 - 9, przy czym nieatenu-
owany Clostridium perfringens, z którego został uzyskany atenuowany organizm wyizolowano ze zwierzęcia
- gospodarza, którym jest albo ssak albo ptak.
11. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 10, przy czym ssak ten jest wybrany z
grupy składającej się z bydła, owiec i świń.5
12. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 10, przy czym ptakiem tym jest kura, indyk,
gęś, kaczka, łabędź, gołąb, głuszec lub kuropatwa.
13. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 - 12, który zawiera co naj-
mniej jeden gen kodujący polipeptyd nie z Clostridium perfringens.
14. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 13, w którym polipeptyd nie z Clostridium 10
perfringens jest polipeptydem niebakteryjnym.
15. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 14, w którym polipeptydem niebakteryjnym
jest polipeptyd ptasi lub ssaczy.
16. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 15, w którym polipeptydem niebakteryjnym
jest polipeptyd ptasi.15
17. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 15, w którym polipeptydem niebakteryjnym
jest cytokina.
18. Atenuowany organizm Clostridium perfringens według zastrz. 17, w którym cytokiną jest kurza IL-18.
19. Atenuowany Clostridium perfringens, jak określono w poprzednich zastrz. 7 - 18, do zastosowania jako
szczepionka w sposobie wywoływania odporności na choroby powodowane przez zakażenie Clostridium 20
perfringens u zwierząt, przy czym ten atenuowany Clostridium perfringens podaje się w dawce skutecznej
immunologicznie.
20. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest do
podawania drogą doustną, domięśniową, dożylną, śródskórną, podskórną lub donosową.
21. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest 25
podawana na wierzchu paszy dla zwierzęcia.
22. Atenuowany Clostridium perfringens do zastosowania według zastrz. 19, przy czym szczepionka jest do
podawania jako spray dla zwierząt w celu jej doustnego dostarczania .
23. Organizm Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-054 o numerze depozytu ATCC
PTA7364.30
24. Organizm Clostridium perfringens, którym jest CPERF/ΔαToxin 365-053 o numerze depozytu ATCC
PTA7365.
25. Szczepionka zawierająca atenuowany organizm Clostridium perfringens według dowolnego z zastrz. 7 -
18, 23 albo 24.
26. Szczepionka według zastrz. 25, zawierająca ponadto jedną lub więcej z następujących: farmaceutycznie 35
dopuszczalny bufor, substancję pomocniczą lub adiuwant.
27. Pasza dla zwierząt, która zawiera szczepionkę według zastrz. 25 albo 26.
40
EP 2 007 420 B1
48
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
EP 2 007 420 B1
49
ODNIESIENIA CYTOWANE W OPISIE
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
SEK
. ID
. NR
:SE
K. I
D. N
R:
EP 2 007 420 B1
50
Lista odnośników cytowanych przez zgłaszającego ma jedynie służyć wygodzie czytelnika. Nie stanowi ona
części europejskiego dokumentu patentowego. Mimo że wyboru odnośników dokonano z wielką staranno-
ścią, nie można wykluczyć błędów lub przeoczeń, a EUP nie bierze żadnej odpowiedzialności w tym wzglę-
dzie.
Dokumenty patentowe cytowane w opisie
Literatura niepatentowa cytowana w opisie