SELECCIÓN DE LEVADURAS AUTÓCTONASPARA LA ESTANDARIZACIÓN Y MEJORADEL QUESO DE CABRALESRM2006-00003
Baltasar MayoBaltasar MayoIPLA-CSICIPLA-CSIC
INSTITUTO DE PRODUCTOS LÁCTEOS DE ASTURIAS
OBJETIVOS
1.- Identificación y tipificación fenotípica y molecular1.1.- Clasificación fenotípica1.2.- Clasificación molecular1.3.- Tipificación
2.- Caracterización fisiológica y tecnológica2.1.- Análisis de actividades deseables y no deseables2.2.- Actividad de las cepas en leche2.3.- Relación de las cepas con bacterias lácticas y penicilios
3.- Selección de cepas como cultivos adjuntos
TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES
PTR1995-0556-OP, AGL2003-07631-C02-01
Análisis microbiológico Queso de Tielve
0123456789
10
LECHE CUAJADA QUESO 7D QUESO 30D QUESO 60D
Periodo de maduración
log uf
c/ml
totales
coliformes
enterococos
estafilococos
lactococos
lactobacilos
leuconostroc
mohos y lev
Análisis microbiológico Queso de Canales
0123456789
10
LECHE CUAJADA QUESO 7D QUESO 30D QUESO 60D
Periodo de maduración
log uf
c/ml
totales
coliformes
enterococos
estafilococos
lactococos
lactobacilos
leuconostroc
mohos y lev
TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES
Medio de cultivo-MRS
Lb. brevis
Lb. farciminis
Lb. kefiriLb. casei/ Lb. paracasei
Leuconostoc spp.
Lb. plantarum/ Lb. paraplantarum
Lactococcus spp.
Medio de cultivo-MSE
Ln. pseudomesenteroidesLn. citreum
Ln. mesenteroides
Medio de cultivo-M17
E. faecium
E. durans Enterococcus spp.Strep. parauberis
Lc. lactis subsp.. lactis
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS LÁCTICAS
TIPIFICACIÓN DEL QUESO DE CABRALES
MICROORGANISMO QuesoLeche Cuajada Superficie Interior TOTAL
LEVADURASZygosaccharomyces spp. 2 12 14Debaryomyces hansenii 14 14 (6)*Kluyveromyces lactis 1 4 6 11 (4)Pichia fermentans 3 1 5 9 (3)Pichia membranafaciens 5 5 (2)Rhodotorula mucilaginosa 3 2 (5)Candida rugosa 3 1 (4)Rhodotorula spp. 3 1 (4)Pichia norvegensis 1 1Kluyveromyces marxianus 1 1Yarrowia lipolytica 1 1Sporobolomyces salmonicolor 1 (1)Sin identificar 1 1 2
Geotrichum candidum 1 9 10
TOTAL 8 7 27 40 82
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURASIDENTIFICACIÓN MOLECULAR
PCR-RFLP gen 5.8S Regiones ITS1 e ITS2
ITS 1 ITS 2
18 S 5.8 S 28 S
Comparación de los patrones de bandas con las bases de datos
RestricciónHaeIII
HinfI
AluIRsaIHhaI
Sau3AI
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR
D. hansenii
HaeIII
HinfI
420
15090
2 x 325
HaeIII
400
HinfI
20011090
G. candidum
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
CLASIFICACIÓN MOLECULAR
A
B8
M
M M
M
7654321 14131211109 1615
87654321 14131211109 1615
Figure 1.- Different RFLP profiles with both HaeIII (A) and HinfI (B) of the ITS1-5.8S-ITS2region of representative yeast isolates from all 16 molecular species identified
IDENTIFICACIÓN DE MOHOS Y LEVADURAS
CLASIFICACIÓN MOLECULAR
AACTGCGCTCCAGCGCGCACGCTT
CTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGCAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCACTCAGATCAGGTAGGAGTACCCGCTGAACTTAAGCATATCA
ATATTGGTGCGCGGACC---TTGGCCGCCGAACTCAATTTGCCACCT--CTGGGGCGGCCGGCGAACTGCTTTGGCCGCCGAACTTGGCCGCCGAGCGAAAA
CGGCTTTACATCGAGCTCGACTATAC----ACTAAGCTCGACTCTA-----AT-----TCGACTATTAC--CA---AGCTCGACTTTA-----ACTAAGCTCGACAAAAACACCATTGAGCTCGAC
GTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCATCTCACGC-TGCTGCCGTGCGGAGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCAGGGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGC-A-A-GCAGAG--TTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCTGTGGTATTCCGCAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCGGTTCATTCTATTGATAGATGGGCTGAGTTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCGCTGGTATTCCGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGGA------GCGGAG-CTTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCCATGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGCGC-A-A-GCAGAG--TTGTTCTTGAACGCACATTGCGCCCGTCGGTATTCCGGCGGGCATGCCTGTCTGAGCGTCGTTTCCTTCTTGTGC-A-CCGCGGGGTCTT
GTGCGCGTGGGGGCGGGGTGGAGCTGGCAGCGCCTAG-GCCTTGCCGAAAAGAAACGAGGAGAAGCGG--GCGGGGGCAGCGATGCCGCCGCTGAAAAGGAGCGATTGCGGACGCGAGCGAACTAAA-GTGGTTG--CCCGCCAGGGCGTCGTTTATTTGAAATACAA--GACTACGGTTTA-GTTGTGCTACT--ACGTAGGGCTGTCTTTTTGGACGGCGCGCCCAAAGCGA---G-GGGCCTTCTG-CGCGAACTAGA-CTGTGCG--AGAACAG--GCTATGCCTTTTTCGAAATGGAACG-TCGTGGACGA-AGTGAACTAAA-CATTTAGAGCTGGCCGTGCCACTGGCCCGGCCGAAAAGAAACG-TTGCGGACGA-AGCGAACTACATCGGGAC
C-T--T
CCAGCCAGCGATGGACGTGG--------------------AC---------------GAG-CAG--A-CCTGGC--------------------------GCAG--ATCCTCTCTGCGCA
AAAACTTTCAACAACGGATCCGTTAGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGCTCTCGCACCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGGCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCAAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAGCGCAGCGAAATGCGATACCTAGTGTGAATTGCAGCCATCGTGAATCA
TCGATCGATCGATCGATCGATCGA
TGT---TAAGAATTACAAGAAACCG-TAT----AAAGTTAAG--AAATCCACTTTAACAAAAC--GATCTAAAAGAAT
CTGTGATAC-----CCTTC--CAC-TGTGTGGGCG-TACGAAACACTGCAAACATGTAAT--ACGGAAGTCAAG-GAACCTGTGATTT--CTTTCC---ACACGTGCGTGAGCG-CAC-AAACACCT-AAA--CGTATGT-AGCCTAGTCAA--ACCT
AAATAGCGGAGGAACNTNANC-TGCGNTTTAG--AC-AAGCTCATGNAANTTTTAAGTATTGATACCCAAAGAACCCTGTGATTT----ATCACC-ACAC-TGCGTGGGCGACACGAAACACCG-AAACC--GA----ACGCACGCCGTC-AAGCCTGTGATTT--ATATCTTATACACATGCGTGAGCG-CACCAAACACCT-AAAATTGTAATA-CTAATTGTCAGT-AAGTCTGTGATTATACCAACACC-ACAC-TGTGTGGGCG-CACAAAACACCT-AAACCTGGAGTATACACACGTCAAC-AAAA
3AD151AD83AD7
3AD16P. fermentans*
P. membranaefaciens**
3AD151AD83AD7
3AD16P. fermentans*
P. membranaefaciens**
3AD151AD83AD7
3AD16P. fermentans*
P. membranaefaciens**
3AD151AD83AD7
3AD16P. fermentans*
P. membranaefaciens**
3AD151AD83AD7
3AD16P. fermentans*
P. membranaefaciens**
ITS 1
ITS 2
5.8S
26S
CTG
TIPIFICACIÓN DE LEVADURASGeotrichum candidum
A BM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M10 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M10
Sorensen Coefficient
1AM13AM93AM13AM41AM33AM23AM33AM103AM193AM20
0,52 0,6 0,68 0,76 0,84 0,92 1
C
ari1 omt1
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
COMPARACIÓN CLASIFICACIÓN FENOTÍPICA-MOLECULAR
IDENTIFICACIÓN FENOTÍPICA
No. of isolates
bp of the PCR
product1
Restriction fragment length wit h the restriction enzyme2
IDENTIFICACIÓN MOLECULARHaeIII HinfI
Candida curvata (4AD6) 1 500 500 2503 Trichosporon coremiiforme
Candida intermedia (4AD4) 1 400 400 210+190 Candida intermedia
Candida rugosa (3AD13) 3 410 410 210+190 Candida catenulata
(3AD19) 1 420 420 220+200 Candida pararugosa
Debaryomyces hansenii (1AD6) 14 650 420+150+90 3253 Debaryomyces hansenii
Kluyveromyces lactis (3AD14) 11 740 655+80 290+185+120+80+65 Kluyveromyces lactis
Kluyveromyces marxianus 1 740 655+80 290+185+120+80+65 Kluyveromyces lactis
Pichia fermentans (3AD16) 9 450 340+80 250+200 Pichia fermentans
Pichia membranaefaciens (3AD15) 4 500 330+110 300+200 Pichia membranaefaciens A
(1AD8) 1 450 330+90 250+200 Pichia membranaefaciens B
Pichia norvegensis (3AD3) 1 630 420+140+80 3153 Pichia dubia
Rhodotorula mucilaginosa (2BD6) 5 640 425+215 340+225+75 Rhodotorula mucilaginosa
Rhodotorula spp. 4 640 425+215 340+225+75 Rhodotorula mucilaginosa
Sporobolomyces salmonicolor (3AD18) 1 600 400+200 290+190+120 Sporobolomyces ruberrimus
Yarrowia lipolytica (4AD16) 1 380 380 1903 Yarrowia lipolytica
Zygosaccharomyces spp. (3AD7) 13 450 330+120 250+200 Pichia spp.
(4AD7) 2 775 500+110 400+375 Saccharomyces unisporus(4AD2) 1 850 325+230+170+125 375+365+110 Saccharomyces cerevisiae
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
1AD8 (=CECT 13027T, =CBS 11679T)
NUEVA ESPECIE
IDENTIFICACIÓN DE LEVADURAS
Candida cabralensis CECT 13027T (FJ755462)
Pichia manshurica NRRL Y-17349 (EF550223)
Pichia sp. NRRL YB-4149 EF550224Candida ethanolica NRRL Y-12615T (EF550225)Pichia deserticola NRRL Y-12918T (EF550226)
Pichia sp. NRRL Y-27261 EF550229Candida californica NRRL Y-27254T (EF550230)
Pichia membranifaciens NRRL Y-2026T (EF550227)
Pichia sp. NRRL Y-27259 (EF550228)Candida thaimueangensis NRRL Y-27416T (EF550231)
Pichia kudriavzevii NRRL Y-5396T (EF550222)Pichia sporocuriosa NRRL Y-27347T (EF550232)
Candida pseudolambica NRRL Y-17318T (EF550231)
Candida inconspicua NRRL Y-2029T (EF550240)Pichia cactophila NRRL Y-10963T (EF550241)
Pichia pseudocactophila NRRL Y-17239T (EF550242)Pichia norvegensis NRRL Y-7687T (EF550239)
Pichia sp. NRRL Y-12827 (EF550245)Pichia sp. NRRL Y-12824 (EF550246)Candida rugopelliculosa NRRL Y-17079T (EF550238)Pichia occidentalis NRRL Y-7552T (EF550236)
Pichia exigua NRRL Y-10920T (EF550237)Pichia scutulata NRRL Y-7663T (EF550243)Pichia sp. NRRL Y-12830 EF550244
Pichia fermentans NRRL Y-1619T (EF550234)Pichia terricola NRRL YB-4310T (EF550233)
Pichia heedii NRRL Y-10967T (EF550252)Pichia barkeri NRRL Y-17350T (EF550247)Pichia nakasei NRRL Y-7686T (EF550248)
Pichia eremophila NRRL Y-17224T EF550249Pichia cephalocereana NRRL Y-17225T (EF550250)Pichia kluyveri NRRL Y-11519T (EF550251)
Schizosaccharomyces pombe NRRL Y-12796T
(AY048171)
6694
55
84
99
100
99
97
96
99
55
98
99
58100
97
77
86
51
0.05
Candida cabralensis
RELACIÓN DE LEVADURAS CON OTROS MICROORGANISMOSCultivos y co-cultivos de hongos y bacterias lácticas
ControlCultivos puros
2- C. famata1- D. hansenii2- K. lactis1- Y. lipolytica
3- G. candidum
1- P. membranaefaciens
1- C. pararugosa1- P. fermentans
2- Lc. lactis
1- Ln. citreum1- Lb. casei
107105
48h 25ºC48h 25ºC
Viableslevadurasbacterias pH
AspectoPerfil aromático
Compuestosvolátiles(GS-MC)
Ácidos orgánicos (HPLC)
RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS
µg/100gde leche C
ontr
ol
Lc. l
actis*
Ln.c
itreu
m
Lb.c
asei
G.c
andi
dum**
K.la
ctis*
C.fa
mat
a*
D.h
anse
nii
Y. li
poly
tica
C. p
arar
ugos
a
P. fe
rmen
tans
P. m
embr
anaf
acie
ns
G.c
andi
dum
K.la
ctis
C.fa
mat
a
D.h
anse
nii
Y. li
poly
tica
C. p
arar
ugos
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P. fe
rmen
tans
P. m
embr
anaf
acie
ns
G.c
andi
dum
K.la
ctis
C.fa
mat
a
D.h
anse
nii
Y. li
poly
tica
C. p
arar
ugos
a
P. fe
rmen
tans
P. m
embr
anaf
acie
ns
G.c
andi
dum
K.la
ctis
C.fa
mat
a
D.h
anse
nii
Y. li
poly
tica
C. p
arar
ugos
a
P. fe
rmen
tans
P. m
embr
anaf
acie
ns
Láctico 75589609702113677548 779108410591008 7661687 748 81778363880488118892976289258751 817686439249951486741003899718886 83441043996491136692928174926410997
Orótico 592837893709 303624215722562855745840574456424746 26513404360737443698405136623859 26223711374841153584 419942293845 2250 31462897 3392274432233525 3522
Cítrico 45334487 312 795299751582540557150285080 0 2715 33263633387139801953385941481953 0 0 0 0 3349 0 200 0 2165 0 0 0 0 7091764 0
Úrico 193821982169 2211 8421497224820151021 19824031902 11802000197220812016169118932036 9101971196321421979 166422051981 1053 20741864 2244179416522406 2246
Fórmico 663 545 433 484 201 724 602 745 726 990 616 447 346 457 508 489 398 563 347 360 246 442 473 431 524 543 493 449 274 449 489 0 481 606 537 554
Pirúvico 82 627 444 698 525 270 199 414 288 34 451 151 778 694 740 602 542 438 541 482 697 308 468 246 450 321 192 352 325 197 484 223 273 455 431 297
Propiónico 23 1011 330 867 192 571 305 610 609 67 238 532 119 97 382 638 164 834 196 760 216 227 349 614 406 300 220 438 508 452 683 637 8331044 918 504
Succínico 1384 177 28 57 19 536 495 171 5461204 153 0 216 235 255 171 227 250 166 18 30 18 21 15 19 41 29 21 380 23 36 29 31 160 513 25
Butírico 0 111 375 519 75 0 0 0 0 0 0 0 104 85 74 4 127 108 48 113 226 207 43 151 73 524 250 178 286 412 398 326 393 212 323 360
Acético 0 0 708 666 0 44 413 0 0 5 767 0 0 0 0 0 338 0 0 329 400 765 734 666 0 831 796 664 178 810 723 838 634 706 562 808
Cultivos individuales CocultivosLc. lactis* Ln. citreum2BC7 Lb. casei VI-19
ÁCIDOS ORGÁNICOS
RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS
COMPUESTOS VOLÁTILES
Identificación + de 50 compuestos volátiles
Acetaldehido Aroma a yogur0
50
100150
200
250
300
CONTROLL. la
ctis
L. citr
eum
L. case
iG. c
andid
umK. la
ctis
C. famata
D. han
senii
P. ferm
entan
s
Y. lipo
lytica
C. para
rugosa
P.men
brana
efacie
ns
50
100150
200
250
300
CONTROLL. la
ctis
L. citr
eum
L. case
iG. c
andid
umK. la
ctis
C. famata
D. han
senii
P. ferm
entan
s
Y. lipo
lytica
C. para
rugosa
P.men
brana
efacie
ns
Diacetilo Olor a mantequillay queso fresco
2-metil butanal3-metil butanal2-metil propanol
Compuestos málticos
Etanol
010203040506070
K. lacti
sK. L
actis
+ L. lacti
sK. L
actis
+ L. lacti
sK. L
actis
+ L. citre
umK. la
ctis+ L. ca
sei
Acetoína 2-propanolAcetona
Ningún patrón de interacción determinado entre BAL y levadurasLas interacciones parecen ser especie-específicas e incluso cepa-específicas
Abu
ndan
cia
rela
tiva
Abu
ndan
cia
rela
tiva
3-METIL BUTANAL
ACETALDEHIDO
RELACIÓN DE LEVADURAS BACTERIAS LÁCTICAS
Ethanol
0,00
5000,00
10000,00
15000,00
20000,00
25000,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
Acetaldehyde
0,00
50,00
100,00
150,00
200,00
250,00
300,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
2-propanol
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
180,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
Diacetyl
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
140,00
160,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
2+3-methyl-butanol
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
40,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
2+3-methyl-butanal
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
MILK 2BA1 Wg2 2BC7 VI-19 1AD5,2BD10
3AD19 3AD24 1AM3,3AM4,3AM9
2BD19,3AD10
3AD16 1AD8 4AD16
Lactic acid bacteria or yeast species
Rel
ativ
e ab
ound
ance
of t
he c
ompo
unds
COMPUESTOS VOLÁTILES
CEPAS SELECCIONADAS
1.- Geotrichum candidum:1AM33AM9
2.- Debaryomyces hansenii:3AD24
3.- Kluyveromyces lactis:2BD19
4.- Yarrowia lipolytica:4AD16
PRODUCCIÓN CIENTÍFICA
- Flórez, A. B., P. Álvarez-Martín, T. M. López-Díaz, and B. Mayo. 2007. Morphotypic and molecular identification of filamentous fungi from Spanish blue-veined Cabrales cheese and technological characterisation of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum strains. International Dairy Journal, 17: 350-357.
- Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, T. M. López-Díaz, and B. Mayo. 2007. Phenotypic and molecular identification of yeast species associated with Spanish blue-veined Cabrales cheese. International Dairy Journal, 17:961-967.
- Álvarez-Martín, P., A. B. Flórez, A. Hernández-Barranco, and B. Mayo. 2008. Interaction between dairy yeasts and lactic acid bacteria strains during milk fermentation. Food Control, 1: 62-70.
- Flórez, A. B., C. Belloch, P. Álvarez-Martín, A. Querol, and B. Mayo. 2010. Candida cabralensis sp. nov., a new yeast species isolated from the Spanish traditional blue-veined cheese Cabrales. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, (Aceptado).
- Álvarez-Martín, P., Flórez, A. B., and B. Mayo. 2010. Biochemical and technological properties of Penicillium roqueforti and Geotrichum candidum strains from Cabrales, a Spanish traditional, blue-veined, starter-free cheese. Acta Alimentaria, (Enviado).