FUNDAMENTOS DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIO

FUNDAMENTOS DE LAS PRCTICAS DE LABORATORIOINMUNOLOGA GENERALEQUILAVENTE A: BIOTECNOLOGA DE LA RESPUESTA INMUNE

Resistencia no especfica. Fagocitosis.

Quimiotaxis Adherencia Opsonizacin ReconocimientoPuestas en evidencia en la prctica

Ingestin Desgranulacin Destruccin Exocitosis

Pocos segundos despus del contacto de las celulas fagociticas con agentes quimiotcticos y con microorganismos, se detectan en las celulas alteraciones metablicas que incluyen cambios en el potencial elctrico de la membrana, produccin y liberacin de cAMP, liberacin del anin superxido y liberacin de enzimas lisosomales. Dentro de los cambios oxidativos que acompaan al proceso de la endocitosis se encuentran los incrementos en:a) Consumo de oxgenob) Consumo de glucosaEstallido respiratorio

c) Actividad del ciclo de las pentosas o hexosas monofosfatod) Produccin de perxido de hidrgeno y otros perxidos

G-SH : Glutatin en estado reducido(90%)G-S-S-G : Glutatin en estado oxidado (10%)

1. Reconocimiento

En levaduras opsonizadas.

Previamente estas levaduras se pusiern con suero inmunolgico, los Acs del suero las reconociern como Ags y se acoplarn a ellas (fueron opsonizadas). En la prctica se desfibrino la sangre recientemente obtenida y quedo libre de anticuerpos. Entonces, al ponerse en contacto con las levaduras opsonizas estas van a ser activadoras de la va alterna del complemento, por que el zimosan de Saccharomyces cerevisiae es un activador de ella. No puede ser va de la lectina porque la fagocitosis no se estaba dando en un estado de infeccin aguda, ni via clasica porque no haba presencia de Acs. La ventaja de ingestin de levaduras se dio porque al estar opsonizadas, los neutrofilos tienen en su membrana los receptores para la fraccin de complemento acoplada a levadura (C3b) CD35 adems de los TLRs (Receptores tipo toll), teniendo dos receptores para Ag en lugar de uno solo.

En levaduras no opsonizadas.

Al quedar sin Acs acoplados a sus membranas aqu la fagocitosis no se vio ms favorecida, pues el reconocimiento de ellas solo estuvo determinado por los TLRs.

2. Mecanismos de destruccin

Las clulas fagociticas destruyen microorganismos a travs de mecanismos dependiente e independientes del O2 . Los primeros incluyen la liberacin de radicales libres del oxigeno (ROI) generados por el sistema de la NADPH-oxidasa al transformar al oxigeno molecular en anin superxido. Los mecanismos independientes del oxgeno incluyen a hidrolasas lisosomales y a peptidos y proteinas microbicidas. Las hidrolasas lisosomales se activan al acidificarse el medio fagosomal a travs de la actividad de una bomba de protones (protn ATPasa) presente en un tipo de endosomas. La actividad conjunta de los ROI y los componentes lisosomales es la causa de la muerte de los microrganismos ingeridos.

MECANISMO INDEPENDIENTE DE OXGENO.

Estos mecanismos dependen de protenas antimicrobianas preformadas y acumuladas en los grnulos:Protenas catinicas, con actividades de tipo antibitico: Defensinas (en macrfagos de conejo y en PMN neutrfilos humanos). Son pptidos catinicos , de unos 30 aminocidos, ricos en cys y arg. Forman canales permeables a los iones en las bicapas lipdicas de los microrganismos. Actan antes de que tenga lugar la acidificacin del fagolisosoma. Catepsina G Azurozidina Lisozima, que acta rompiendo el peptidoglucano de bacterias (sobre todo de Gram-negativas). Lactoferrina (producida por neutrfilos): secuestra hierro, indispensable para las bacterias.

MECANISMO DEPENDIENTE DE OXGENO.

Con esta reaccin se definen los 3 cambios metabolicos observados en la fagocitosis, ya que esta oxidasa produce directamente un aumento en la concentracin de NADP+, que a su vez es el sustrato limitante del Ciclo de las Hexosas Monofosfato (HMP) y tambien explica el aumento en el consumo de oxgeno. La activacin del ciclo HMP es importante para los eritrocitos pues es la unica manera que tienen para mantener los niveles de poder reductor necesarios para mantener el grupo hemo en la hemoglobina en estado reducido. En los eritrocitos que no pueden neutralizar los peroxidos correctamente, se producen peroxidaciones de lipidos de membrana, que lleva a deformacin de membranas y rotura (hemlisis).Antes de que el lisosoma se fusione con el fagosoma, en ste tiene lugar la reduccin de oxgeno molecular (O2) catalizada por la NADH-oxidasa de la membrana del fagosoma; el anin superxido resultante (O-2) es txico por s mismo, pero a su vez da lugar a otros radicales txicos de vida corta, como el perxido de hidrgeno (H2O2), el radical hidroxilo (OH) y el oxgeno singlete. Una vez que el lisosoma se fusiona con el fagosoma, aqul libera la mieloperoxidasa, que acta sobre los perxidos en presencia de haluros (I- y Cl-), para producir compuestos halogenados (hipohaluros) muy txicos y de vida larga: cido hipocloroso (ClOH), e hipoiodoso (IOH).

3. Pinocitosis del Nitroazul de TetrazolioEsta ocurre despues de la ingestin de las levaduras, al estar compitiendo el NAT con el O2 por ser reducidos por la NADPH oxidasa, el NAT que esta siendo interiorizado al citoplasma del neutrofilo se encuentra de forma insoluble y azul. Entonces, en el citolplasma del neutrofilo se encuentran tanto el NAT como las levaduras ingestadas, lo que lleva a Saccharomyces cerevisiae a pinocitar al NAT.4. Reduccin del Nitroazul de Tetrazolio

Durante la fagocitosis tambien se observa un incremento en la capacidad de las celulas fagociticas para reducir el NBT. Su reduccin ocurre cuando, compitiendo con el oxigeno, la molecula es reducida por la NADPH-oxidasa hasta su estado de formazan (producto insoluble de color azul). La reduccin tambin se puede dar por efecto directo del anin superxido.

Y LO QUE SUCEDI CON LAS LEVADURAS OPSONIZADAS FUE:

Notas: No se considera que los endosomas sean orgnulos celulares sino compartimentos dentro del citoplasma que funcionan como transportadores de material procedente del exterior que entra a la clula por endocitosis. El G-SH es el mayor antioxidante endgeno producido por las clulas, participando directamente en la neutralizacin de radicales libres y compuestos de oxgeno reactivo. NAT (Espaol) = NBT (Ingls)

ANATOMA DEL SISTEMA INMUNOLGICO1. Trfico Linfocitario

El sistema inmune acta gracias a la participacin de diferentes poblaciones celulares conocidas como clulas inmunocompetentes. Estas clulas, que mayoritariamente son leucocitos, que encuentran en todo el organismo y principalmente en los rganos linfoideos. Estos rganos linfoides, se comunican entre s a travs de la circulacin sangunea y linftica que es por donde circulan estas clulas de unos lugares a otros. Esto hace posible el encuentro de las clulas inmunocompetentes con los antgenos y adems que ellas mismas interacten, aspectos stos que son necesarios para una respuesta inmune adecuada.

Las clulas con funcin inmune proceden por diferenciacin de las clulas madre CD34+ presentes en la mdula sea. Este proceso se conoce como hematopoyesis.

2. HematopoyesisLas clulas madre que en el adulto se encuentran en la mdula sea son las responsables de formar todas las clulas y derivados celulares que circulan por la sangre.

Durante las primeras semanas embrionarias se encuentran clulas madres en el saco vitelino, las cuales van diferencindose en clulas eritroides, provistas de hemoglobina embrionaria. Desde el tercer mes hasta el sptimo de embarazo, las clulas madre migran, primero al hgado fetal, y despus al bazo fetal, donde sigue la heamtopoyesis. Desde el sptimo mes, va disminuyendo la hematopoyesis en el hgado y bazo, hasta que desaparece para la poca del nacimiento, y va adquiriendo preeminencia el papel de la mdula sea.

En concreto de las clulas madre pluripotentes, se diferencian, hacia dos tipos distintos de clulas algo ms maduras. Son los progenitores de estirpe mieloide y los progenitores de estirpe linfoide o glbulos blancos. Estos procesos de diferenciacin no ocurren al azar, sino que estn estrechamente regulados por sustancias conocidas como factores estimuladores de colonias que producidos por el estroma y macrfagos de la mdula sea.3. Clulas Polimorfonucleares NeutrfilosEstas clulas tienen como funcin principal la de fagocitar y destruir patgenos. Se encuentran en continua renovacin debido a que su vida media es de tan slo varios das. Son clulas de gran tamao con un ncleo segmentado en varios lbulos y gran cantidad de grnulos en su citoplasma. Proceden de la unidad formadora de colonias granuloctico-macrofgicas CFU-GM, presente en la mdula sea. EosinfilosEstn recubiertos de IgE e IgG y son muy ricos en grnulos repletos de histamina que la vierten al exterior produciendo fuertes respuestas inflamatorias. BasfilosLos basfilos suelen encontrarse en la circulacin, posee receptores para el extremo Fc de las Igs y participan en reacciones alrgicas.4. APCLas clulas dendrticas son las clulas presentadoras de antgenos (APCs) por excelencia y adems poseen la capacidad de trasportar estos antgenos desde los tejidos hasta los ganglios. Se encuentran distribuidos por todos los tejidos. Las clulas dendrticas derivan de progenitores de la medula sea y circulan por la sangre como precursores inmaduros hasta que migran a los tejidos donde maduran y se diferencian.5. Organos linfoides primarios

Los rganos linfoides primarios son la mdula sea y el timo, donde maduran los linfocitos B y T respectivamente y aprenden a discriminar entre antgenos propios (auto antgenos), que sern tolerados y antgenos extraos en cuya destruccin colaborarn una vez maduros.

Funciones: Seleccin Diferenciacin Maduracin

Mdula sea. Est formada por un tejido esponjoso de color rojizo que se encuentra en el interior de los grandes huesos y albergan una gran cantidad de clulas madre de donde derivan las restantes clulas de la sangre, entre ellas los leucocitos. Aqu maduran los linfocitos B a travs de n proceso conocido como linfopoyesis B que es independiente de los estmulos antignicos.

Timo. El timo est constituido por una malla de clulas epiteliales rellena de clulas, timocitos, que es como se denominan a los linfocitos en fase de maduracin en el timo. El timo se organiza en lobulillos tabicados por trabculas conjuntivas y dentro de cada uno de ellos se distingue una zona externa o corteza, que contiene la gran mayora de los timocitos, y una zona interna o medular que es pobre en timocitos. Las clulas epiteliales del timo, tanto de la corteza como de la mdula, expresan altas cantidades de molculas de histocompatibilidad, imprescindibles para el reconocimiento de antgenos propios por los linfocitos T.

La maduracin de los linfocitos T en el timo o linfopoyesis T comienza con la llegada de sus precursores al timo procedentes de la mdula sea. Durante este proceso mueren la mayora de los timocitos, aprox. el 95 % de ellos. Estos timocitos que mueren son precisamente los que reconocen a los antgenos propios del organismo, mientras que el resto, 3-4%, abandonarn el timo, va sangunea, como linfocitos T maduros. Todo ello se realiza mediante un doble proceso conocido como seleccin positiva y negativa.LcT madurosTrabculasLobulillo tmicoLobulillo tmicoLcT inmaduros

6. Organos linfoides secundariosFunciones: Facilitar el trabajo de los Lc. Son sitios de encuentro entre las APC y Lc. Optimizan la activacin de LcB.Los rganos linfoides secundarios son: Los ganglios linfticos, que recogen Ag de los tejidos El bazo, que recoge Ag de la sangre Tejidos linfoides asociados a mucosas (MALT), que recogen Ag de las mucosas

El MALT es el encargado de proteger las mucosas del ataque de los agentes patgenos, tanto en una respuesta primaria como secundaria. Est formado por ndulos de tejido linfoide que, segn su localizacin, se denominan: GALT, NALT y BALT.

GALT. Tejido linfoide asociado al intestino. El GALT est formado por todo el tejido que se encuentra en las paredes intestinales . NALT. Tejido Linfoide Asociado a Nasofaringeo. Ganglios cervicales, adenoides y amigdalas. BALT. Tejido linfoide asociado a los bronquios. Est formado por todo el tejido linfoide localizado en las mucosas respiratorias, desde las fosas nasales hasta los pulmones.

Una vez que los linfocitos B y T abandonan los rganos primarios donde han madurado, pasan al torrente circulatorio, a travs del cual se mueven por todos los tejidos del organismo, y alcanzan de nuevo los ganglios linfticos, y as sucesivamente.

Si se analiza la cantidad de linfocitos en cada uno de los compartimentos, se observa que la mayor parte de los linfocitos se encuentran en los rganos linfoides, mientras que en la sangre y el bazo se encuentra una proporcin baja de los mismos.

Corpsculo de MalpighiZona marginalT. linfoide periarteriolar

Bazo. Se trata de un rgano situado en el hipocondrio izquierdo, detrs del estmago y cerca del diafragma. En el bazo se distingue la pulpa roja que es un reservorio de hemates y la pulpa blanca que contiene el tejido linfoide, el cual se dispone alrededor de una arteriola central, presentando reas mas ricas en linfocitos T y otras en linfocitos B. Se da la filtracin de la sangre, eliminacin de clulas sanguineas viejas o defectuosas y el reciclado del Fe del organismo.Arteriola esplnica

Ganglios linfaticos. Los ganglios linfticos conforman, junto a los vasos linfticos, una compleja red corporal cuya funcin es filtrar los antgenos procedentes del espacio extracelular y la linfa durante su circulacin desde la periferia hasta el conducto torcico. Los ganglios linfticos, en el humano, son redondeados y presentan un hilio donde los vasos sanguneos entran y salen.

Bsicamente, se distingue un rea B denominada crtex, un rea T denominada paracrtex y un rea medular central. La corteza contiene agregados de linfocitos B dispuestos formando folculos primarios y secundarios, segn que posean centros geminares o no en funcin de que hayan recibido estmulos antignicos. La paracorteza, contiene linfocitos T y abundantes clulas presentadoras de antgeno (clulas dendrticas), quienes presentan abundantes antgenos MHC clase II en superficie. La zona medular presenta algunos cordones linfoides separados por espacios vasculares (senos medulares) que contienen la mayor parte de las clulas plasmticas y los macrfagos sinusales de los ganglios linfticos.

7. Endotelio vascular

El endotelio vascular regula el paso a tejidos de molculas y leucocitos. Para que stos pasen desde la sangre al tejido inflamatorio o al rgano linfoide, deben de atravesar la lnea de clulas endoteliales. Para ello deben adherirse a estas clulas y luego pasar entre ellas (un proceso llamado extravasacin). Esto lo consiguen por medio de contactos especficos entre el leucocito y la clula endotelial, a travs de molculas de adhesin celular (CAM).

Existen tres familias de CAM:I. De la superfamilia de las Ig: ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1II. De la familia de la integrina (subfamilia con cadenas tipo b 2): VLA-4, LFA-1III. De la familia de las selectinas: L-selectina, E-selectina, P-selectina.

En la inflamacin se producen factores que activan a las clulas endoteliales normales, que producen selectinas E y P, y que inician la extravasacin de granulocitos neutrfilos .

En cambio, los linfocitos en reposo tienen la capacidad de extravasarse desde circulacin a ganglios y MALT a travs de las vnulas de endotelio alto (HEV). Las clulas de este endotelio especial son cuboidales, pero de hecho no son ms que producto de la diferenciacin de clulas de endotelio normal de los rganos linfoides secundarios, ante citoquinas producidas en respuesta a antgenos.

8. Descripcin macrscopica de organos linfoides del ratn

Timo: Rosaseo, bilovulado, de 2 cm de largo y 1.2 cm de ancho en la parte superior. Ganglio cervical: Estructura planada y forma ovoide. Con una depresin pequea (hilio). Blanquecino de largo 0.6 cm. Bazo: Rojo intenso, de 3.3 cm de largo, la pulpa blanca con aspecto brilloso.

PREPARACIN DE ANTGENOS. PURIFICACIN DE GAMMA GLOBULINA. INMUNIZACIN DE ANIMALESLos antigenos que se usaron en la prctica para inmunizar por primera vez a los conejos fueron gamma globulina y suero humano. De acuerdo a las clasificaciones de los Ags, estos son: Solubles Naturales Timo dependientes Protenas

1. AdyuvantesLos adyuvantes son agentes heterogeneos e inespecificos que asociados a los antigenos vacunales inducen una respuesta inmunitaria mas potente y prolongada. Mecanismos de accin

Pueden actuar a travs de dos mecanismos principales: I. Actuando a travs del sistema de liberacin de antgeno, aumentando la disponibilidad de antgeno en las clulas presentadoras de antgeno. Se consigue un retraso en el aclaramiento antignico y aumento de la respuesta al antgeno en localizaciones fisiolgicas especficas. Se incluyen en este grupo de adyuvantes las sales insolubles de aluminio, liposomas, virosomas, micropartculas (PLG), emulsiones y partculas virus-Like. II. Inmunopotenciadores: Activan directamente los receptores celulares e inducen la liberacin de citokinas. Actan como inmunopotenciadores el monofosforil lpido A (MPL) y derivados, Muramil dipptido (MDP) y derivados, oligonucletidos (CpG), RNA de doble cadena, patrones alternativosmoleculares asociados a patgenos, quils, resiquimod.

Ejemplos de adyuvantes

Vacunas de la cartilla de vacunacin (Adyuvantes y va de administracin)

1. SABIN (polio)Se adquiere el virus va oral. No necesita adyuvante. Esta vacuna contiene el virus vivo debilitado. Su presentacin es en forma lquida y se administra por va oral. La forma trivalente (TOPV) es la ms efectiva contra todas las formas conocidas de la polio.2. BCG (tuberculosis)La tuberculosis se contagia por va area, cuando las personas infectadas tosen, estornudan o escupen. Cuando esta vacuna es usada para dar proteccin contra la tuberculosis, se inyecta en la piel (intradrmica). La vacuna consiste en un preparado en el que se usan bacilos de tuberculosis (de Koch) atenuados (atontados), incapaces de provocar la enfermedad, pero capaces de estimular las defensas del cuerpo. No necesita adyuvante.

3. PentavalenteEs una vacuna combinada totalmente liquida conteniendo toxoides de difteria y ttanos, suspensin celular inactivada de Bordetella pertussis, antgeno de superficie de hepatitis B (HBsAg), y oligosacrido conjugado de Haemophilus influenzae tipo B. La va de administracin es intramuscular profunda, el sitio de aplicacin vara de acuerdo a la edad; a los menores de 3 aos en la cara antero lateral externa del tercio medio superior del muslo. Y 3 aos y ms en el brazo, a nivel del musculo deltoides. Usa como adyuvante fosfato de aluminio. 4. DPTLa vacuna absorbida antidiftrica, antitetnica y contra la tos ferina, se prepara combinando el toxoide diftrico purificado, el toxoide tetnico purificado y bacilos muertos de Bordetella pertussis. Los antgenos se absorben en el fosfato de aluminio en la forma de adyuvante. La va de administracin es intramuscular profunda.5. Triple viral (SRP)La vacuna triple viral o SRP est hecha de virus vivos atenuados (debilitados), protege contra el sarampin, la rubola y la parotiditis. La vacuna se administra mediante una inyeccin en el brazo izquierdo.6. Doble viral (SR)La vacuna doble viral o SR se elabora utilizando virus vivos atenuados (debilitados) de sarampin, y virus vivos atenuados de rubola. La vacuna se aplica en el brazo izquierdo mediante una inyeccin, como dosis nica.7. Toxoide Tetnico Diftrico (TD)La vacuna adsorbida antidiftrica y antitetnica para adultos y adolescentes se prepara combinando el toxoide diftrico purificado y el toxoide tetnico purificado. Los antgenos se absorben en el fosfato de aluminio en la forma de adyuvante. La va de administracin es intramuscular profunda, a nivel del msculo deltoides.8. Hepatitis BLa vacuna contiene antgeno de superficie de la hepatitis B, la vacuna actualmente se fabrica usando ADN recombinante (son protenas producidas mediante levaduras modificadas). La vacuna se aplica mediante inyeccin, en el muslo izquierdo en los menores de 18 meses de edad. Despus se aplica en el brazo derecho mediante una inyeccin. Usa como adyuvante alumbre.9. NeumoccicaPara adultos contiene 23 tipos (serotipos) distintos de protenas que cubren a la bacteria Streptococcus pneumoniae (neumococo) y contiene conservador. Se aplica en el brazo derecho mediante una inyeccin. Usa fosfato de aluminio como adyuvante.

10. Rotavirus

Existen dos tipos de vacuna hasta el momento:I. Una vacuna llamada monovalente que est hecha de virus vivos atenuados (debilitados) que contiene un serotipo del virus. Se presenta en un frasco que contiene la vacuna y una jeringa que contiene un lquido llamado carbonato de calcio, el cual disminuye la acidez del estmago evitando que se inactive el virus de la vacuna.II. Otra vacuna es la llamada pentavalente la cual se elabora con virus vivos que originalmente se aislaron en humanos y en bovinos, contiene 5 serotipos de virus vivos atenuados. Se presenta en un tubo de plstico con tapa de rosca que contiene una sola dosis de la vacuna.Ambas vacunas se administran por la boca (va oral). Ninguna contiene adyuvante.

Parmetros que influyen en la obtencin de Acs

1. Antgeno Carcter de extrao Tamao Composicin qumica, conformacin y complejidad

2. Animal Especie Sexo Edad Integridad biolgica

3. Proceso de inmunizacin Dosis Va de administracin Presencia de adyuvante

Mtodos de purificacin de protenas de alto peso molecular

1. Filtracin en gel. La fase estacionaria est constituida por partculas de polmeros de diferente porosidad. La separacin se basa en el tamao de las partculas.2. Electroforesis en gel SDS. 3. Precipitacin por pH.

Efecto acarreador Hapteno Proteina

Los haptenos son antignicos pero incapaces de inducir por si mismas una reaccin inmunitaria especfica, es decir, carecen de inmunogenicidad. El acoplamiento qumico de un hapteno a una protena inmungena grande, llamada portador, genera un conjugado hapteno-portador inmungeno. La inmunizacin con tal conjugado produce anticuerpos especficos para tres tipos de determinantes antignicos, anticuerpos contra el hapteno (principalmente), anticuerpos contra el portador y anticuerpos contra el hapteno y el portador.