SpektrofotometerSpektrofotometer

SPEKTROMETER : INSTRUMENNYA MEMAKAI CELAHYANG TETAP PADA BIDANG YG FOKAL

SPEKTROFOTOMETER : SPEKTROMETER YG DILENGKAPI DGN DETEKTOR YG BERSIFAT FOTOELEKTRIK

SPEKTROFOTOMETRI : PENGUKURAN INTERAKSI (HUBUNGAN) ANTARA RADIASI ELEKTROMAGNETIK DGN MOLEKUL/ATOM DARI SUATU BAHAN KIMIA

PADA PRINSIPNYA INTERAKSI REM DGN MOLEKUL AKAN PADA PRINSIPNYA INTERAKSI REM DGN MOLEKUL AKAN MENGHASILKAN SATU ATAU DUA MACAM DARI TIGA KEJADIAN MENGHASILKAN SATU ATAU DUA MACAM DARI TIGA KEJADIAN

YANG MUNGKIN TERJADIYANG MUNGKIN TERJADI

HAMBURAN (SCATTERING)HAMBURAN (SCATTERING)

ABSORPSI (ABSORPTION)ABSORPSI (ABSORPTION)

EMISI (EMISION)EMISI (EMISION)

RADIASI ELEKTROMAGNETIK Al Hasan 400 SM : benda tampak oleh

panca indera mata karena benda tsb memantulkan cahaya/sinar (An Noor)memantulkan cahaya/sinar (An Noor)

Sir Isaac Newton : cahaya merupakan zarrah (partikel yg sangat kecil) yg dipancarkan keseluruh penjuru dgn kecepatan yg tinggi (teori korposkuler)

Max Planck : cahaya merupakan suatu paket yg diskrik yg disebut foton

James Clark Maxwell : cahaya secara fisik merupakan gelombang elektromagnetik, merupakan gelombang elektromagnetik, artinya mempunyai vektor listrik dan vektor magnet yg keduanya saling tegak lurus dgn arah rambatan

Panjang GelombangPanjang Gelombang

Panjang gelombang

Komponen listrikKomponen listrik

Panjang gelombang

Arah rambat

Komponen magnetKomponen magnet

Merupakan anggota teknik analisis spektroskopik yg memakai sumber radiasi elektromagnetik ultra violet dekat (190 380 nm) dan sinar tampak (380 (190 380 nm) dan sinar tampak (380 780 nm)

Keuntungan metode spektro UV-Cahaya Tampak

1. Dapat digunakan untuk analisis suatu zat dlm jumlah yg cukup kecil

2. Pengerjaannya cepat, sederhana dan murah

3. Bersifat non destruktif3. Bersifat non destruktif

4. Metode analisis yg dikembangkan umumnya cukup peka dan teliti serta mudah dalam menginterprestasikan hasil yang diperoleh.

Gambar Spektrum UV-Vis

Semua gugus atau gugusan atom ygmengabsorpsi radiasi UV-Vis disebut sbgkromofor.

Gugus fungsionil yg mempunyai elektronbebas spt OH; O-NH2 dan OCH3 ygmemberikan transisi (n *) disebutgugus auksokrom.

Terikatnya gugus auksokrom oleh gugus kromofor akanmengakibatkan pergeseran pita absorpsi menuju kepanjang gelombang yg lebih panjang (pergeseran merah= batokromik) disertai peningkatan intensitas (efek

hiperkromik).hiperkromik).

Pergeseran batokromik juga terjadi pada dua ikatanrangkap yang terkonjugasi -C=C-C=C-

Hukum-hukum yg berkaitan dgn spektrofotometri

HUKUM LAMBERT

Menyatakan hubungan antara energi radiasi dari cahaya masuk (Io) dan energi dari cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi dari jarak yg dilalui cahaya (b) pada cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi dari jarak yg dilalui cahaya (b) pada konsentrasi (c) yang tetap.

Log I/Io = - ab

Log T = - ab I/Io = T

Log 1/T = ab log 1/T = A

A = ab

HUKUM BEERMenyatakan hubungan antara energi radiasi dari cahaya masuk (Io) dan energi dari cahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsi dari konsentrasi (c) pada jarak yg dilalui dari konsentrasi (c) pada jarak yg dilalui cahaya (b) yg tetap

Log I/Io = - ac

Log T = - ac c = konsentrasi

Log 1/T = ac

A = ac

Kombinasi kedua hukum diatas (Hukum LAMBERT-

BEER)Menyatakan hubungan antara energi radiasidari cahaya masuk (Io) dan energi daricahaya yg ditransmisikan (I) sbg fungsidari konsentrasi ( c ) dan jarak yg dilaluicahaya (b)cahaya (b)

Log I/Io = - abcLog T = - abcLog 1/T = abcA = abc dasar perh. Spektro

1. Membandingkan serapan larutan standardan larutan uji

* Diukur serapan lart. Standar kemudianlart ujilart uji

serapan uji Konsentrasi uji = X kons. standar

serapan standar

Keuntungan:

kondisi antara larutan standar dan uji sama

Kelemahan :Kelemahan :

tidak ada standar, tidak bisa melakukanperhitungan dgn cara ini

2. Menggunakan Kurva BakuMetoda ini dengan cara membuat grafik

perbandingan antara lart. standar dalam

berbagai konsentrasi terhadap absorben.abs

Konsentrasi (g/ml)10 20 30 40 50

A1

A2

A3

A4

A5

Ax

X

Keuntungan:

jika jumlah sampel banyak, lebih praktis

Kelemahan :

1. linieritas (lurus) dari suatu kurva baku tidak1. linieritas (lurus) dari suatu kurva baku tidak

range thd konsentrasi, krn bila konsentrasi

terlalu tinggi, kurva akan menyimpang.

2. kurva baku tsb harus sering dicek bila

digunakan spektrofotometer lain dan reagensiadari merk lain dari yg kita uji

DAYA SERAP (a)

3. Menggunakan Daya Serap (a) Atau SerapanJenis (A 1%,1cm) / Koefisien Extingsi(E1%,1cm)

adalah serapan/absorban (A) dibagi dgn hasilperkalian kadar ( c ) dinyatakan dalam gram/liter dan tebal lapisan/kuvet (b) dinyatakan dlm cm.

A A

a = c =

b.c (g/l) a.b

SERAPAN JENIS (A 1%,1cm)adalah serapan/absorban (A) dibagi dgn hasil perkalian kadar ( c ) dinyatakan dalam gram/100 ml (%) dan tebal lapisan/kuvet (b) dinyatakan dlm cm.

AA 1%,1cm = A 1%,1cm =

b.c (g/100 ml)

AC (g/100 ml) = c = 10a

A (1%,1cm) . b

Keuntungan:

tidak ada standar, perhitungan dpt dilakukan dgncara ini

Kelemahan :

harga a / A 1%,1cm dlm literatur diperoleh dgncara dan peralatan yg mungkin berbeda dgninstrumen yg kita pakai (kesalahan 5%)

Pada dasarnya Spektrofotometer tdd :

1. Sumber energi/radiasi/cahaya

2. Monokromator

3. Tempat cell/kuvet

4. Detektor

5. Amplifier

6. Recorder/alat pembaca

1 2 3 4 5 6

SUMBER RADIASI

Untuk tujuan pengukuran absorpsimolekuler diperlukan suatu sumberkontinyu yg mempunyai energi tdkmengalami perubahan tajam pada daerahpanjang gelombang yg diinginkan.panjang gelombang yg diinginkan.

Sumber radiasi pd Spektrofotometer UV-Vis ada dua :

Lampu D2 (Deuterium)/Hidrogen

Lampu ini menghasilkan spektrumkontinyu dlm daerah UV ( 190-380 nm). Pada pengukuran dgn lampu D2 sebaiknya digunakan kuvet dari bahansilika/quartz (kuarsa), krn kalau dipakaisilika/quartz (kuarsa), krn kalau dipakaibahan gelas, gelas tsb akanmengabsorpsi sinar UV shg absorbanyg dihasilkan akan tinggi (abs kuvet + abs zat).

Umur/life time D2 sekitar 500 jam pemakaian

Lampu Wolfram/TungstenSumber radiasi yg umum digunakanpd daerah cahaya tampak/visible dan IR dekat adalah lampu filamen. Pada kondisi operasi, hasil lamputungsten/wolfram ini memadai daritungsten/wolfram ini memadai darikira-kira 325-900 nm.

Umur/life time lampu Tungsten sekitar1000 jam

MONOKROMATOR Berfungsi memisahkan radiasi cahaya putih yg

polikromatis menjadi cahaya yg monokromatis(mendekati monokromatis)

Monokromator terdiri dari :

a. Celah/slita. Celah/slit

sistem celah/slit pada monokromator

ada dua :

celah masuk (inslit) dan celah keluar

(exit slit)

Fungsi Celah/slit

menentukan sifat monokromatis radiasiyg dihasilkan

menentukan sifat resolusi panjanggelombang

b. Kolimatorc. Alat pendispersid. Lensa/cermin pemusat

Yang terpenting adalah Slit dan alat pendispersi

Sumberradiasi

inslit

kolimator Alat pendispersi

Lensa/

cermin pemusat Exit

slit

kuvet

1. Monokromator Prisma

Komponen ini terbuat dr bahan kuarsa/silika ygbisa digunakan untuk daerah UV-Vis maupunIRIR

Prisma ada dua :

1. Prisma Cornu

Apabila merupakan prisma yg utuh, shg sinaryg terdispersi akan diteruskan/ ditransmisikandan diterima oleh sampel.dan diterima oleh sampel.

polikromatis

monokromatis

2. Prisma Littrow

Berupa bangunan prisma, dibagian belakangterdapat cermin. Sehingga sinar yg terdispersiakan dipantulkan kembali, baru diterima olehsampel.

2. Monokromator Grating (kisi)

Dispersi radiasi UV-Vis dapat diperoleh dgnmenjatuhkan sinar polikromatis pada gratingtransmisi atau pada permukaan grating refleksi.

Lebih praktis, shg banyak digunakanLebih praktis, shg banyak digunakan

Pada umumnya spektrofotometri melibatkanlarutan, dgn demikian memerlukan suatuwadah/sel untuk menempatkan larutan didalam arah sinar.dalam arah sinar.

Sel/kuvet tsb harus terbuat dari bahan yg dptmeneruskan sinar dari daerah spektrum ygdigunakan

Bahan pembuat kuvet

Kuvet dari bahan leburan silika (kuarsa)

dapat dipakai untuk analisis pada daerahpengukuran 190-1100 nm

Kuvet dari bahan gelas dipakai pada daerahpengukuran 380-1100 nm, karena bahan gelaspengukuran 380-1100 nm, karena bahan gelasmengabsorpsi radiasi UV

Kuvet dari bahan plastik, sering digunakan untukpengukuran pd daerah cahaya tampak.Kelemahan : mudah korosif dgn pelarut tertentu

Matching of Cells

Adalah pasangan kuvet yg sama dan identik betul.

Akan sangat penting untuk :Akan sangat penting untuk :

Spektrofotometer UV-Cahaya Tampak

Double Beam.

Analisis kuantitatif

Macam-macam detektor yg biasa digunakan dlm Spektrofotometer UV-Cahaya tampak

Fotosel

Tabung Foton Hampa

Tabung Penggandaan Foton

(Photomultiplier Tube)

Photo Diode-Array (teknologi modern)

Dilihat dari sistem optiknya, Spektrofotometer UV-Cahaya Tampak dibagi menjadi dua :

1. Radiasi berkas tunggal (Single Beam)

Radiasi berkas ganda (Double Beam)2. Radiasi berkas ganda (Double Beam)

Pertama kali Spektro UV-Cahaya tampak ygdiperkenalkan untuk analisis kuantitatif adalahSpektro dgn sistem optik radiasi berkas tunggal(Single beam). Kemudian dgn kemajuanelektronika mulai dipopulerkan Spektro radiasiberkas ganda (Double beam), dgn asumsimengambil suatu keuntungan tdk terpengaruhmengambil suatu keuntungan tdk terpengaruhpenurunan intensitas radiasi dari sumber radiasisemula (Io), sehingga :

Io It dpt dikatakan konstan pd pengukuran

Io

Salah satu kelemahan Spektro radiasi berkasganda adalah :

1. Tdk mungkin kedua kuvet yg dipakai adalahbetul-betul identik (matching)

2. Intensitas radiasi yg menuju ke kedua kuvettdk mungkin betul-betul sama.

2. Intensitas radiasi yg menuju ke kedua kuvettdk mungkin betul-betul sama.

Sehingga pada era terakhir ini sistem optikSpektro UV-Vis cenderung kembali ke sistemoptik radiasi berkas tunggal, krn ketelitian & ketepatan pengukurannya lebih baik darisistem optik radiasi berkas ganda.

RADIASI BERKAS TUNGGAL (SINGLEBEAM)

Sample Detektor Amplifier RecorderSumber radiasi

MonokromatorSample

CompartmentDetektor Amplifier Recorder

RADIASI BERKAS GANDA (DOUBLEBEAM)

Monokromator

Reference cell

Sumber radiasi

Monokromator

Sample Cell

DetektorAmplifier Recorder

Pengukuran dgn Spektrofotometer yg Pengukuran dgn Spektrofotometer yg berbeda dpt memberikan sedikit berbeda dpt memberikan sedikit variasi pada variasi pada yg diukur, oleh karena yg diukur, oleh karena itu dlm analisis lebih baik dicari itu dlm analisis lebih baik dicari maksimum yg sebenarnya dari maksimum yg sebenarnya dari maksimum yg sebenarnya dari maksimum yg sebenarnya dari instrumen yg kita pakaiinstrumen yg kita pakai

Dapat menggunakan Dapat menggunakan maksimum yg maksimum yg tertera pada pustaka/monografi dgn tertera pada pustaka/monografi dgn toleransi yg diperbolehkan.toleransi yg diperbolehkan.

Menurut Farmakope Edisi III hal 773 :

1. Untuk pengukuran pd 240-280 nm penyimpangan yg diperbolehkan adalah 0,5 nm dari yg ditentukan.

2. Pada 280-320 nm tidak boleh lebih dari 1 nm

3. Tidak lebih dari 2 nm diatas 320 nm 3. Tidak lebih dari 2 nm diatas 320 nm

Menurut Farmakope Edisi IV hal. 1066 :

Toleransi yg diperkenankan lebih kurang

1 nm untuk jangkauan 200-400 nm dan lebihkurang 3 nm untuk jangkauan 400 600 nm

Bila yg diamati melewati batas toleransi ygdiperbolehkan spt diatas, maka perlu dilakukankalibrasi thd Spektrofotometer yg digunakan

Kalibrasi panjang gelombang

Untuk kalibrasi ada beberapa cara standar yg dpt dilakukan :

Spektrum garis lampu busur uap raksa

Spektrum garis lampu hidrogen atau Spektrum garis lampu hidrogen atau deuterium

Serapan maksimum holmium perklorat LP

Yang terbaik untuk kalibrasi adalah lampu busuruap raksa pada serapan maksimum

253,70 nm; 287,15nm; 302,25nm;313,16 nm; 334,15 nm; 365,48 nm; 404,66 nm; 435,83 nm; 546,07 nm; 576,96 nm dan 579,07 nm.

Lampu Deuterium dengan garis spektra : 486,00 Lampu Deuterium dengan garis spektra : 486,00 nm

Salah satu yg sering digunakan adalah holmium filter yg memberikan pita-pita serapan yg khas & tetap pada 241,15 nm; 361,50 nm dan 536,30 nm

Serapan suatu zat menunjukkan kerapatan optik dr zat tsb dan besarnya utk setiap berbeda. Ketepatan pengukuran serapan bergantung pd jml sinar yg terdeteksi jg pada alat-alat optik yg tdp didalamnya.pada alat-alat optik yg tdp didalamnya.

Kalibrasi skala fotometrik/serapan dptdilakukan dgn :

1. Lart. Kalium Nitrat (KNO3) p.a 1% (b/v) dlmair suling.Diukur serapannya pd 302 nm, lalu dihitungA 1%,1cm, harga yg diperoleh harus berkisarantara 0,70 0,71Lart. Kalium bikromat (K Cr O ) p.aantara 0,70 0,71

2. Lart. Kalium bikromat (K2Cr2O7) p.aDitimbang 30,03 mg dlm 0,01 N H2SO4 hinggadiperoleh 500 ml larutan.Hasil yg diperoleh dibandingkan dgn standaryg ditentukan.

Toleransi yang diperbolehkan

PanjangPanjang gelombanggelombang ToleransiToleransiPanjangPanjang gelombanggelombang(nm)(nm)

ToleransiToleransimaksimummaksimum

235235 122,9 122,9 126,2126,2

257257 142,4 142,4 145,7145,7

313313 47,0 47,0 50,350,3

350350 104,9 104,9 108,2 108,2

Timbulnya kesalahan dlm pengukuran Timbulnya kesalahan dlm pengukuran spektrofotometri disebabkan oleh adanya spektrofotometri disebabkan oleh adanya penyimpangan hukum Lambert Beer dan penyimpangan hukum Lambert Beer dan dikategorikan menjadi 2 kelompok, yaitu :dikategorikan menjadi 2 kelompok, yaitu :

1.1. Penyimpangan instrumentalPenyimpangan instrumental

Kesalahan-kesalahan dlm Spektrofotometri UV-Visible

1.1. Penyimpangan instrumentalPenyimpangan instrumentalMisalnya : Misalnya : * Bila sinar masih polikromatis* Bila sinar masih polikromatis* Timbulnya sinar sesatan/cahaya sampingan/ * Timbulnya sinar sesatan/cahaya sampingan/

stray lightstray light* Adanya noise yg tinggi* Adanya noise yg tinggi

2. Penyimpangan kimia2. Penyimpangan kimia

Disebabkan oleh pengaruh pelarut yg Disebabkan oleh pengaruh pelarut yg mungkin dpt menimbulkan disosiasi, mungkin dpt menimbulkan disosiasi, asosiasi & reaksi tertentu yg hasilnya asosiasi & reaksi tertentu yg hasilnya berbeda dgn analitnya.berbeda dgn analitnya.

SumberSumber--sumber kesalahan dlm pengukuran sumber kesalahan dlm pengukuran SumberSumber--sumber kesalahan dlm pengukuran sumber kesalahan dlm pengukuran tsb perlu diperhatikan, selain itu kesalahan tsb perlu diperhatikan, selain itu kesalahan utama sering dilakukan pd teknik utama sering dilakukan pd teknik pelaksanaan penyediaan larutan sampel yg pelaksanaan penyediaan larutan sampel yg akan dianalisisakan dianalisis

Dianjurkan agar hasil lebih teliti sebaiknya Dianjurkan agar hasil lebih teliti sebaiknya bekerja pd pengukuran larutan dgn bekerja pd pengukuran larutan dgn konsentrasi, dimana transmitannya konsentrasi, dimana transmitannya berkisar 80 berkisar 80 20 %T atau absorbannya 20 %T atau absorbannya berkisar 0,2 berkisar 0,2 0,8.0,8.

Dari kondisi ini dpt diharapkan kesalahan Dari kondisi ini dpt diharapkan kesalahan hanya 2hanya 2--5 %.5 %.hanya 2hanya 2--5 %.5 %.

Ketelitian maksimum akan diperoleh bila Ketelitian maksimum akan diperoleh bila bekerja pd 36,8 %T atau abs 0,4343bekerja pd 36,8 %T atau abs 0,4343

KesalahanKesalahan utamautama biasanyabiasanya pd pd konsentrasikonsentrasilarutanlarutan ituitu sendirisendiri..

PadaPada resapanresapan rendahrendah intensitasintensitas sinarsinar masukmasukdandan sinarsinar keluarkeluar hampirhampir samasama sehinggasehinggakesalahankesalahan akanakan menjadimenjadi besarbesar krnkrn ygygdideteksidideteksi adalahadalah perbedaanperbedaan daridari keduakeduadideteksidideteksi adalahadalah perbedaanperbedaan daridari keduakeduaintensitasintensitas tersebuttersebut..

ResapanResapan tinggitinggi energienergi ygyg diteruskanditeruskan kecilkecil shgshgsukarsukar diukurdiukur oleholeh detektordetektor

1010

1515

2020

2525

Abs rendahAbs rendahAbs tinggiAbs tinggi

(%) (%) kkeessaallaahhaa

2020 4040 6060 8080 100100 (%T)(%T)

55

1010

00

000,20,20,80,8 0,40,40,60,611 (Abs)(Abs)

aan n rreellaatt

II

ff