STRATÉGIÁK KERESÉSE, MELYEK
TÁMOGATJÁK A VÉR-AGY GÁTAT A
BEHATOLÓ SEJTEKKEL SZEMBEN
A Ph.D. értekezés téziseinek összefoglalója
Haskó János
Témavezető: Dr. Krizbai István
A Vér-Agy Gát Élettana és Kórélettana Kutatócsoport
Molekuláris Neurobiológia Kutatóegység
Biofizikai Intézet
Magyar Tudományos Akadémia Szegedi Biológiai Kutatóközpont
Elméleti Orvostudományok Doktori Iskola
Általános Orvostudományi Kar
Szegedi Tudományegyetem
Szeged
2018
1
BEVEZETÉS
Az agy különböző gyulladásos betegségei során nagyszámú
fehérvérsejt jut be a vérkeringésből a központi idegrendszerbe, mely
súlyos veszélyt jelent a megfelelő agyi működésre. A fehérvérsejteken
kívül egyes daganatsejtek is képesek átjutni az agyi ereken, melyekből az
agyban áttétek alakulnak ki. A tüdőben, emlőkben valamint a bőrben
(melanóma) kialakuló elsődleges daganatok sejtjei adnak legnagyobb
gyakorisággal agyi áttéteket, és az összes daganat közül a
melanómasejteknek van a legnagyobb hajlama az agyi áttétképzésre. A
melanóma agyi áttétjei igen rossz prognózist jelentenek, melyek a medián
túlélést hozzávetőlegesen négy hónapra csökkentik.
Az agyi mikroerek által kialakított vér-agy gát (blood-brain barrier,
BBB) biztosítja a központi idegrendszer (KIR) működéséhez szükséges
tápanyagok bejutását passzív diffúzió és aktív transzportfolyamatok révén,
valamint megakadályozza a sejtes elemek és a káros anyagok, illetve a
megfelelő idegi működést zavaró ionok bejutását az agyba. Ezen anyagok
átjutásának szabályzásával a vér-agy gát kulcsszerepet játszik az agyi
homeosztázis kialakításában és fenntartásában. A mikroerek falát alkotó
endotélsejtek sajátos tulajdonságai teszik lehetővé az agyi erek gát
funkcióját. Az endotélsejteken kívül a BBB magába foglalja az asztrocita
végtalpakat, a pericitákat, a bazális laminát, továbbá szoros kapcsolatban
áll az agyi idegsejtekkel és a mikrogliákkal. Ezek az erek körül
elhelyezkedő sejtek és struktúrák hozzájárulnak a gát-tulajdonság
fenntartásához és szabályzásához.
Mivel a KIR nem rendelkezik a klasszikus értelemben vett
nyirokkeringéssel, a fehérvérsejteknek és az áttétet képző sejteknek az
agyi vérereken, vagyis a BBB-n keresztül kell bejutniuk az agyi
parenchimába. Az rákos sejtek agyi ereken keresztüli átvándorlása egy
kevéssé feltárt folyamat a fehérvérsejtek diapedeziséhez képest.
Feltehetően ez a két folyamat több hasonlóságot is mutat, ugyanakkor
alapvető különbségek is vannak köztük
Az agyi gyulladásos folyamatok és az agyi áttétek kialakulása és
lefolyása több összetett sejtes és molekuláris mechanizmust is magába
foglal. Úgy gyulladásos megbetegedések, mint metasztatikus daganatok
esetében a hatékony terápia feltétele, hogy a fehérvérsejtek vagy a
daganatsejtek diapedezisének különböző lépései közül többet is gátolni
2
tudjon. Ilyen hatékony terápiás lehetőségeket kínálhatnak az újabb
molekuláris biológiai ismeretek, valamint az utóbbi évtizedekben leírt,
illetve előállított hatóanyagok. Ezek közül a kettes-típusú kannabinoid
receptor (cannabinoid receptor 2, CB2) agonisták és a lignánok is ígéretes
hatóanyagok lehetnek a fehérvérsejtek és a metasztatikus sejtek agyba
történő bejutásának gátlásában.
A kannabinoid rendszer aktiválásának legfőképp a pszichoaktív
hatása miatt ismert, habár leírták gyulladáscsökkentő és neuroprotektív
hatását is. A kannabinoidok elsősorban két kannabinoid receptoron, a
kannabinoid receptor 1-en (cannabinoid receptor 1, CB1) és a CB2-n
keresztül fejtik ki hatásaikat. A pszichoaktív hatásért a CB1 aktiváció
felelős, míg a CB2 aktivációja gyulladáscsökkentő hatással jár. Szelektív
CB2 agonisták, mint például a JWH133 és az O1966 lehetőséget
biztosítanak arra, hogy a CB2 aktivációjának hatását tanulmányozhassuk
fiziológiás és patológiás körülmények között a CB1 aktiválásával járó
pszichoaktív mellékhatás kiváltása nélkül. Fontos megemlíteni, hogy ezek
a szelektív agonisták gyógyszerjelöltek több gyulladással járó betegség
kezelésében is.
A lignánok polifenolos vegyületek, melyek a fitoösztrogének egyik
fő csoportját alkotják. Ezek az anyagok széles körben megtalálhatók a
különböző növényekben, és szerkezetükben hasonlóságot mutatnak a 17β-
ösztradiol endogén hormonnal. Napjainkban igen nagy az érdeklődés a
természetes eredetű hatóanyagok, például a lignánok iránt. Különböző
lignánokról sikerült kimutatni, hogy gyulladáscsökkentő hatással
rendelkeznek, többek között egyes agyi gyulladással járó betegségek
esetében is. Állatmodellek alkalmazásával azt is kimutatták, hogy egyes
lignánoknak lehetnek a tumornövekedést és az áttétek kialakulását gátló
hatásai.
CÉLKITŰZÉSEK
A fehérvérsejtek vagy a tumorsejtek agyi endotéliumon keresztüli
átjutása kulcsfontosságú lépés az agyi gyulladásos folyamatok, illetve az
agyi áttétek kialakulásában. Munkánk során a CB2 agonistáknak és a
Heliopsis helianthoides var. scabra növényből izolált lignánoknak a BBB
működésére és a sejtek agyi endotéliumon keresztüli átjutására gyakorolt
hatását vizsgáltuk. Kutatásaink során a következő célokat tűztük ki:
3
1. hogy megvizsgáljuk a CB és CB-szerű receptorok kifejeződését agyi
endotélsejtekben és melanómasejtekben,
2. hogy in vivo és in vitro kísérleti modellek felhasználásával
megvizsgáljuk a CB2 agonisták fehérvérsejt-endotélsejt interakcióra
gyakorolt hatását,
3. hogy in vivo és in vitro megfigyeléseket végezzünk arra vonatkozóan,
hogy a CB2 agonisták milyen hatással vannak az agyi endotélium gát
funkciójára,
4. hogy megértsük, hogy milyen hatással van a CB2 aktiválás a
melanómasejtek agyi endotéliumhoz való kitapadására és az azon
keresztüli átvándorlására,
5. hogy meghatározzuk, hogy a Heliopsis helianthoides var. scabra
növényből izolált lignánok milyen hatást gyakorolnak a
melanómasejtek agyi áttétképzésére és az agyi erek gát funkciójára.
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Sejttenyésztés és kezelések
In vitro kísérleteinkhez a következő sejtkultúrákat használtuk:
humán mikrovaszkuláris agyi endotélsejtek (hCMEC/D3; rövidítve: D3),
A2058 humán melanóma sejtvonal, elsődleges humán agyi
mikrovaszkuláris endotélsejtek (brain microvascular endothelial cells,
BMVECs) tenyészete, elsődleges humán monociták tenyészete, elsődleges
patkány endotélsejtek tenyészete (rat brain endothelial cells, RBECs).
A specifikus CB2 agonisták közül a JWH133 (Tocris) és az O1966
(Organic) szereket használtuk kísérleteinkhez. A H. helianthoides var.
scabra növényből izolált lignánokat együttműködés keretében Hajdú
Zsanettől és munkatársaitól kaptuk (Szegedi Tudományegyetem,
Gyógyszertudományi Kar, Farmakognóziai Intézet).
Reverz transzkripcióval kapcsolt polimeráz láncreakció (RT-PCR)
A teljes RNS-t TRIzol reagens (Life Technologies) alkalmazásával
izoláltuk. Az RNS-t SuperScript III reverz transzkriptáz kit (Life
Rechnologies) segítségével írtuk át cDNS-sé. A cDNS amplifikáció
BioRad iQ5 készülék segítségével, Maxima SYBR Green Mix
4
(Fermentas) használatával történt. A PCR termékeket etidium-bromidot
tartalmazó, 1,5% agaróz gélen elektroforézissel választottuk el.
Immunfluoreszcens festések és aktin jelölés
BMVEC sejtek konfluens rétegén a CB2 és a ZO-1 fehérjék
expresszióját vizsgáltuk immunfluoreszcens festéssel. Anti-ZO-1 (1:25;
Invitrogen) és anti-CB2 (1:100; Thermo Scientific) poliklonális antitestek
oldatában a mintákat 24 órán keresztül inkubáltuk. Az Alexa-488-cal
konjugált anti-nyúl és az Alexa-594-gyel konjugált kecskében termelt
anti-egér (Invitrogen) másodlagos antitesteket 1:400 hígításban használtuk
1 órán keresztül.
A lignán kezelések hatását D3 és RBEC sejtek konfluens
tenyészetein vizsgáltuk immunhisztokémiával. A mintákat a fixálást
követően elsődleges nyúl anti-ZO-1 poliklonális (Invitrogen)
ellenanyaggal festettük 24 órán keresztül. A festéseket Cy3-kapcsolt
kecske anti-nyúl antitesttel (Jackson ImmunoResearch Laboratories)
tettük láthatóvá.
A Hel-6 vagy Hel-11 kezelést követően az A2058
melanómasejteket Alexa488-phalloidinnel festettük (Invitrogen).
A monocita adhézió vizsgálata BMVEC sejtek tenyészetén
A BMVEC tenyészetek konfluens rétegét CB2 agonistákkal és
gyulladásos faktorokkal kezeltük. A kezeléseket tartalmazó médiumot
eltávolítottuk, majd a 24 lyukú plate-ben tenyésztett endotélsejtekre
lyukanként 2,5 x 105 fluorszcensen jelölt monocitát tartalmazó
sejtszuszpenziót helyeztünk. A sejteket együtt inkubáltuk 15 percen
keresztül, majd az endotéliumot háromszor mostuk PBS-sel, hogy
eltávolítsuk a nem letapadt monocitákat. Végül megmértük a letapadt
monociták fluoreszcenciáját.
A melanóma sejtek adhéziójának vizsgálata D3 sejtek tenyészetén
A 24 lyukú plate-ben tenyésztett D3 sejtek konfluens rétegét, illetve
az A2058 melanómasejtek tenyészetét 4 órán át kezeltük elő CB2
agonistákkal. 105 fluorszecensen megjelölt melanómasejtet helyeztünk
lyukanként endotélsejtek rétegére, és inkubáltuk őket 90 percet. Ezt
követően az endotélsejtek rétegét megmostuk, és fixáltuk, majd
5
megszámoltuk az endotélsejtekhez letapadt fluoreszcensen jelölt
melanómasejteket.
Transzmigrációs kísérletek
A 8 μm átmérőjű pórusokkal rendelkező inszerten tenyésztett
RBEC sejtek konfluens rétegét CB2 agonistával kezeltük elő, majd az
azonos módon előkezelt melanómasejtek szuszpenzióját helyeztük az
endotélsejt tenyészetre. A tenyészeteket 5 óra múlva fixáltuk, majd az
inszert felső oldaláról letöröltük a sejteket, és megszámoltuk az inszerten
átvándorolt sejteket.
Sebgyógyulási assay
A D3, illetve A2058 sejtek konfluens rétegről pipettaheggyel
sávokban lekapartuk a sejteket (“seb”). Ezután fáziskontraszt-
mikroszkóppal 24 órán át követtük a sejtek vándorlását a sejtmentes
sávokba. A vándorló sejteket 5 lekapart sáv területén számoltuk meg,
majd ezek átlagát hasonlítottuk össze.
Intravitális mikroszkópia
Kifejlett C57BL/6 egerek koponyájának jobb oldali parietális
részének egy részét műtéti úton megnyitottuk, és koponyaablakot
helyeztünk fel. A koponyaablakon keresztül a fehérvérsejtek adhézióját és
az agyi erek permeabilitását vizsgáltuk. A felszíni piális ereken tett
megfigyeléseinket a Stereo Discovery V20 epifluorescence microscope
(Carl Zeiss Microimaging) segítségével végeztük. Mély szöveti
képalkotás során a Leica TCS SP5 II MP multifoton mikroszkópot
használtuk. Az egereket a koponyaműtétet, illetve a mikroszkópiás
megfigyelést megelőzően intraperitoneális injekcióval altattuk [ketamin
(100 mg/ml, i.p.) és xylazin (20 mg/ml, i.p.) 1 ml/kg dózisban beadott
keverékével]. 50 µl 0,01% rodamin 6G (Sigma-Aldrich) oldatát
intravénásan injektáltuk az állatokba, mellyel fehérvérsejtjeiket festettük
meg in vivo. Az agyi ereket 40 kDa-os fluoreszcein-kapcsolt dextrán
intravénás bejuttatásával tettük láthatóvá. Ugyanezen festék erekből
történő kiszivárgását vizsgáltuk intravitális permeabilitási kísérleteink
során. Epifluoreszcens mikroszkópiás vizsgálataink során a vénák falára
kitapadt fehérvérsejteket standardizált átmérőjű (20-30 µm) és hosszúságú
(100 µm) erekben számoltuk, és 1 mm2
érfelszínre átlagoltuk. Multifoton
mikroszkópia során a kitapadt fehérvérsejteket véletlenszerűen
6
kiválasztott postkapilláris venulákban (20-30 µm átmérőjű, az agyfelszín
alatt 600 µm mélységi terjedő területen) kvantifikáltuk.
Western blot
Western blot kísérleteinkhez alacsony passzázs számú BMVEC
sejteket használtunk, melyekből a ProteoExtract kit (EMD Chemicals)
segítségével izoláltunk fehérjét. A fehérjéket SDS-PAGE 4–20% precast
gradiens gélen (Thermo Scientific) választottuk el, majd nitrocellulóz
membránra transzferáltuk, és 16-18 órán keresztül inkubáltuk a következő
polikloánlis antitestekkel: anti-CB2 (1:1000; Cayman Chemicals), anti-
occludin (1:500; Invitrogen), anti-claudin-5 (1:300; Invitrogen) és anti-
Na/K ATPáz (1:1000; Abcam). A membránokat HRP-kapcsolt
másodlagos antitesttel (Thermo Scientific) 1 órán keresztül inkubáltuk. A
detektáláshoz Supersignal West Pico chemiluminescence szubsztrátot
(Thermo Scientific) használtunk.
Transzendoteliális elektromos rezisztencia (TEER) mérése
A BMVEC sejtek által alkotott réteg integritásának
kvantifikálásához TEER mérést végeztünk 1600R electric cell-substrate
impedance sensing (ECIS) rendszer (Applied Biophysics) használatával.
A készülék 30 percenként végzett méréseket 24 vagy 36 órán keresztül.
Az RBEC konfluens tenyészeteinek TEER méréséhez CellZscope
készüléket (nanoAnalytics) használtunk. Amint a TEER értékek elérték a
plató értéket, az endotélsejteket Hel-6 (5 µM), illetve Hel-11 (5 µM)
lignánokkal kezeltük, majd ezt követően a TEER változásait 2 órán
keresztül követtük.
BBB permeabilitás mérése ex vivo
A BBB permeabilitás változásait nátrium fluoreszcein (sodium
fluorescein, SF) érből való kiáramlásának nyomonkövetésével végeztük.
A kísérleti állatokba intravénásan 50 µl, PBS-ben oldott 2%-os SF-t
juttattunk be. A festékanyagot 30 percig hagytuk keringeni az állatok
vérében. Ezután az állatokat PBS-sel transzkardiálisan perfundáltuk, majd
az agyszövet gyors kivételét követően homogenizáltuk azt 10-szeres
térfogatú 50%-os triklórecetsavban. A homogenizátumot centrifugáltuk,
majd megmértük a felülúszóban található SF fluoreszcenciáját.
7
EREDMÉNYEK
A kannabinoid és kannabinoid-szerű receptorok expressziója agyi
endotélsejtekben és melanómasejtekben
Első lépésként a CB2 expresszióját vizsgáltuk meg agyi
endotélsejtekben. Ehhez a CB2 és a ZO-1 fehérjék immunfluoreszcens
festését végeztük el konfluens BMVEC tenyészeteken. A ZO-1 fehérjét az
endotélsejtek közötti szoros kapcsolatok (tight junction, TJ) markereként
használtuk, melyek jelenléte elengedhetetlen az endotélium
gátfunkciójához. A BMVEC sejtekben a CB2 mérsékelt expressziója volt
megfigyelhető, míg a ZO-1 erős jelet adott az endotélsejtek határán.
Mivel a BBB fontos szerepet játszik az agyi gyulladásokban,
továbbá a CB2 aktiválása általános gyulladáscsökkentő hatású,
megvizsgáltuk, hogy hogyan változik a CB2 kifejeződés az agyi
endotéliumban gyulladásos körülmények között. Western blot módszerrel
megnéztük, hogy hogyan változik a CB2 fehérje relatív mennyisége
különböző gyulladásos faktorokkal kezelt BMVEC sejtek
membránfrakciójában. Eredményeink azt mutatják, hogy a gyulladásos
citokinek (IL1β, TNFα) és az LPS növelik a CB2 expresszióját BMVEC
sejtekben.
Következő lépésként megfigyeltük a különböző kannabinoid és
kannabinoid-szerű receptorok jelenlétét agyi endotélsejtekben és
melanómasejtekben RT-PCR alkalmazásával. Kimutattuk, hogy a D3
humán agyi endotélsejtek és az A2058 humán melanómasejtek a CB2
fehérje CB2A transzkripciós variánsát kifejezik, viszont a CB2B variánst
nem. Azt találtuk, hogy az RBEC sejtek a patkány CB2 fehérje 1-es és 2-
es transzkripciós variánsát fejezik ki. A D3 sejtek expresszálják még a
CB1, valamint a GPR18 és GPR55 fehérjék mRNS-ét, viszont a GPR119
fehérje mRNS-e nem volt jelen ebben a sejtvonalban. Kimutattuk továbbá
a CB1, a GPR118, a GPR55 és a GPR119 fehérjék mRNS-ének jelenlétét
A2058 melanómasejtekben.
8
A CB2 aktiváció hatása a fehérvérsejt-agyi endotélsejt kölcsönhatásra
és a BBB diszfunkcióra gyulladásos körülmények között
A CB2 aktiváció mérsékli a fehérvérsejtek adhézióját a piális erek
falán
In vivo kísérleteinkben intravitális mikroszkópia alkalmazásával
valós időben vizsgáltuk az agyi ereket érintő változásokat és az
immunsejt-endotélsejt interakciókat. LPS intraperitoneális injektálásával
szisztémás gyulladást és fokozott citokin termelést váltottunk ki az
állatokban. Egyes, LPS-sel kezelt állatok egyidejűleg CB2 agonista
(JWH133) kezelést is kaptak. 4 és 24 órával az LPS kezelést követően a
piális erekre kitapadó fehérvérsejtek száma jelentősen megnőtt. Azokban
az LPS-sel kezelt állatokban, melyek JWH133 kezelést is kaptak, 4 órával
a kezelést követően 56%-kal, 24 órával a kezelést követően 65%-kal
kevesebb kitapadt fehérvérsejt volt megfigyelhető a csak LPS-sel kezelt
állatokhoz képest. A JWH133-hoz hasonlóan a rezorcin alapú O1966 CB2
agonista szintén szignifikánsa csökkentette a piális erek falán kitapadó
fehérvérsejtek számát (50%-kal 4 órával, és 60%-kal 24 órával a kezelést
követően).
A CB2 aktiváció csökkenti a fehérvérsejtek adhézióját a kortikális
felszálló posztkapilláris venulákban
A hagyományos fluoreszcens mikroszkópia csak a felszíni erek
vizsgálatára alkalmas, viszont a mély szöveti területek intravitális
megfigyelésére a két-foton mikroszkópia nyújt lehetőséget. Ezért az
idegszövet belsejében futó erek vizsgálatára ezt a módszert használtuk.
Kísérleteink során egyidejű képfelvétel történt a rhodamine 6G-vel jelölt
immunsejtekről és a nagy molekulasúlyú FITC-dextránnal kitöltött
kortikális erekről. A parenchimális vénák esetében a felszíni ereknél
kimutatottakhoz hasonló tendenciát figyeltünk meg: az LPS nagyszámú
immunsejt-endotélsejt interakciót váltott ki, melyet a JWH133 vagy az
O1966 CB2 agonisták jelenléte szignifikánsan csökkentett.
Az endoteliális CB2 aktiváció csökkenti a monociták kitapadását
az agyi endotéliumon
A következő kísérletsorozatban megvizsgáltuk az endotélsejt-
specifikus CB2 aktiválás hatását a leukociták kitapadására. Konfluens
BMVEC tenyészeteket stimuláltunk TNFα-val, majd 4 órán keresztül
9
ugyanezeket az endotélsejteket JWH133 vagy O1966 CB2 agonistákkal
kezeltük. A kezelést tartalmazó médiumot eltávolítottuk, majd humán
monocitákat helyeztünk az endoteliális rétegre. Az adhéziós tesztek
eredménye igazolta, hogy az agyi endotélsejtek CB2 aktiválása elősegíti
az immunsejtek adhéziójának megelőzését. Emellett megfigyeltük, hogy a
CB2 agonisták fehérvérsejtek letapadására gyakorolt gátló hatása
dózisfüggő.
A CB2 agonisták javítják a BBB működését in vivo és in vitro
Az LPS kezelés a BBB akut megnyílását idézte elő, melynek
kialakulását a gyulladásos mediátorok és az aktivált fehérvérsejtek tovább
fokozták. Az állatokat LPS-sel kezeltük, és egyesek O1966 kezelést is
kaptak. A FITC-jelölt dextrán agyi erekből való kiszivárgását intravitális
mikroszkóppal vizsgáltuk, valamint ex vivo permeabilitási vizsgálatokat is
végeztünk. A kezelést megelőzően nem volt megfigyelhető a FITC-
dextrán agyi erekből történő kiszivárgása, és csak kis mennyiségű SF volt
detektálható a nem kezelt állatok agyi homogenátumában. Ezzel szemben
4 órával az LPS injekciót követően az agyi erek permeabilitása jelentősen
megnőtt. O1966 jelenlétében az LPS-sel kezelt állatok érfestése tisztább
maradt és kevesebb SF volt detektálható az agyszövetben a csak LPS-sel
kezelt egyedekhez képest. Ennek oka az volt, hogy jóval kevesebb dextrán
diffundált ki az erekből utalva arra, hogy a CB2 aktiválás BBB protektív
hatású.
A BBB integritás változásának in vitro vizsgálata TEER méréssel
történt. A BMVEC rétegek rezisztenciája LPS hatására gyorsan
lecsökkent (a kontroll 80%-ára), mely rezisztencia esés mérséklődött
O1966 jelenlétében. Az in vivo munkánk során megfigyeltekhez
hasonlóan in vitro eredményeink is arra utalnak, hogy a CB2 segíti, védi a
BBB működését gyulladásos körülmények között.
A következő kísérleteink során azt terveztük megvizsgálni, hogy a
CB2 aktiválás növeli-e a gátfunkciót, a strukturális integritást fiziológiás
körülmények között. Mind a két szelektív CB2 agonista alkalmazása
(O1966, JWH133) a BMVEC sejtréteg elektromos ellenállásának
fokozódását (11-15%-kal) eredményezte. Habár többféle szignalizációs
mechanizmus befolyásolhatja a BBB integritását, az endotélsejtek közötti
TJ fehérjék szerepe vitathatatlan a BBB szorosságának, ellenállásának
biztosításában. Ezért megvizsgáltuk TJ fehérjék mennyiségét a CB2
10
agonistákkal kezelt BMVEC sejtek membránfrakciójában. 4 órával a CB2
kezelés megkezdését követően O1966 és JWH133 hatására 2,2-2,7-
szeresére növekedett az occludin és a claudin-5 mennyisége a nem kezelt
sejtekhez képest.
A CB2 aktiváció hatása a melanómasejtek és agyi endotélsejtek
kölcsönhatására
Mivel a CB2 aktivációja csökkentette a fehérvérsejtek kitapadását,
megvizsgáltuk, hogy hasonló hatás észlelhető-e a tumorsejtek és az agyi
endotélsejtek kölcsönhatása esetén.
A CB2 aktiváció csökkenti a melanómasejtek agyi endotéliumhoz
történő kitapadását
Hogy megértsük a CB2 szerepét a tumorsejtek áttétképzésében,
megvizsgáltuk, hogy a JWH133 által kiváltott CB2 aktiváció hatással van-
e a melanómasejtek agyi endotéliumhoz történő kitapadására. Az agyi
endotélsejtek (D3) vagy a melanómasejtek (A2058) kezelése nem volt
hatással az endotéliumon kitapadó melanómasejtek számára. Ugyanakkor
az endotélsejtek és melanómasejtek 4 órás előkezelése, majd az azt követő
adhéziós teszt közbeni kezelés JWH133-mal csökkentette a kitapadó
melanómasejtek számát a nem kezelt kontrollhoz képest. Ezek az
eredmények arra utalnak, hogy mindkét sejttípus (endotél és melanóma)
CB2 aktiválása szükséges a JWH133 által kiváltott adhézió gátláshoz.
A CB2 agonisták csökkentik a melanómasejtek agyi endotéliumon
keresztüli átvándorlását
A következő kísérleteink célja az volt, hogy megvizsgáljuk, hogy a
CB2 aktiváció hatással van-e a melanómasejtek transzendoteliális
migrációjára. Transzmigrációs kísérleteinkhez elsődleges RBEC
tenyészeteket és A2058 humán melanómasejteket használtunk. A
JWH133-mal előkezelt endotélsejteken keresztül kevesebb melanómasejt
jutott át a nem kezelt kontrollhoz képest. Ez a hatás még kifejezettebb
volt, mikor mindkét sejttípust előkezeltük és a transzmigráció közben is
jelen volt a CB2 agonista.
11
A Heliopsis helianthoides var. scabrából izolált lignánok agyi
áttétképzés ellen kifejtett lehetséges hatása
A CB2 agonisták mellett különböző növényi lignánok is hatékony
terápiás szerek lehetnek. Kísérleteinkben a Heliopsis helianthoides var.
scabra lignánjainak hatását vizsgáltuk meg in vitro agyi metasztázis
modellünkben.
A Heliopsis helianthoides var. scabrából izolált lignánok kémiai-
szerkezeti elemzése, leírása
A vizsgált lignánokat a Heliopsis helianthoides var. scabra friss
gyökereinek metanolos kivonatának kloroform-oldékony frakciójából
azonosították. A lignánok azonosítását és szerkezeti elemzését Hajdú
Zsanett és munkatársai végezték (Szegedi Tudományegyetem,
Gyógyszertudományi Kar, Farmakognóziai Intézet). A következő hat
lignánt sikerült azonosítani: két új arilbenzofurán neolignánt, az 1"-
dehidroegonol-3"-metilétert (Hel-2) és az egonol-3"-metilétert (Hel-3),
valamint további négy ismert lignánszármazékot, a helioxantint (Hel-6), a
(7E)-7,8- dehidroheliobuftalmint (Hel-11), a heliobuftalmint (Hel-12),
valamint a 7-acetoxihinokinint (Hel-19).
A Hel-6 és Hel-11 morfológiai változásokat okoz
melanómasejtekben és gátolja migrációjukat
A lignánokkal kezelt melanómasejteket elsőként fáziskontraszt
mikroszkóppal vizsgáltuk. Megfigyeltük, hogy a Hel-6-tal kezelt
tenyészetben számos sejt meghosszabbodott, orsószerű alakot vett fel.
Továbbá azt észleltük, hogy a Hel-11 jelenlétében a sejtek kiterültebb
alakot vettek fel a nem kezelt sejtekhez képest.
A morfológiai és citoszkeletális változások nyomonkövetéséhez
Hel-6 vagy Hel-11
(5 µM) lignánnal történő kezelés után a melanómasejteket Alexa-488
konjugált falloidinnel festettük. Hel-6 kezelés hatására nagyszámú
melanómasejt elnyúlt sejtmorfológiát vett fel aktinban gazdag
kitüremkedésekkel és aktin-stressz rostokkal. Ezzel szemben Hel-11
jelenlétében a sejtek kiterült, nagyobb kitüremkedésektől, állábaktól
mentes alakot vettek fel.
Sebgyógyulási assay-t használtunk a Hel-6 és Hel-11 lignánoknak a
melanómasejtek adott irányú migrációjára gyakorolt hatásának
12
vizsgálatára. Vizsgálataink során azt figyeltük meg, hogy mindkét lignán
csökkentette az A2058 sejtek migrációját.
A Hel-6 gátolja a melanómasejtek agyi endotéliumhoz történő
kitapadását
A következőkben az izolált vegyületeknek a melanómasejtek
endoteliális kitapadására gyakorolt hatását tanulmányoztuk. Ehhez D3
humán agyi endotélsejteket és A2058 humán melanómasejteket kezeltünk
elő 3 órán keresztül a hat vizsgált lignánnal, és a sejtek az adhéziós teszt
közben is kapták a kezeléseket. A Hel-6 (2 µM) kezelés gátolta a
melanómasejtek kitapadását az endotéliumon, ugyanakkor a többi lignán
nem volt hatással a kitapadásra.
A Hel-6 által kiváltott gátló hatás sejtspecifikusságának
tanulmányozása céljából a melanóma- illetve az endotélsejtek Hel-6
előkezelést kaptak. A kezeléseket a sejtadhézós kísérlet megkezdése előtt
eltávolítottuk a sejtekről. A melanómasejtek 5 µM Hel-6-tal történő
kezelése nem gyakorolt hatást a letapadó melanómasejtek számára.
Ugyanakkor, amikor az agyi endotélsejteket kezeltük 2 µM
koncentrációjú Hel-6 lignánnal, az endoteliális réteghez tapadt
melanómasejt száma szignifikánsan csökkent, bár nem olyan mértékben,
mint amikor a Hel-6 jelen volt a tápfolyadékban az adhéziós kísérlet során
is. Az adhéziók száma nem csökkent tovább abban az esetben, ha mindkét
sejttípus kapott előkezelést és az adhézió közben is jelen volt a Hel-6,
ahhoz a kísérleti csoporthoz viszonyítva, mikor csak az endotélsejtek
voltak előkezelve Hel-6 lignánnal, és a sejtadhézió is Hel-6 jelenlétében
történt. Eredményeink arra utalnak, hogy a Hel-6 adhéziót gátló hatása
endotélspecifikusan érvényesül, mely hatás reverzibilis.
A Hel-6 és Hel-11 elősegíti az agyi endotélsejtek gát funkcióját
Az agyi endotélréteg integritását TEER mérésekkel vizsgáltuk,
mely egy általánosan elfogadott módszer a sejtek közötti junkciók
szorosságának meghatározására. Az 5 µM Hel-6 kezelés megkezdését
követő második órában az RBEC sejtek rétegének ellenállása 15-20%-kal
nőtt a nem kezelt kontrollhoz képest. A TEER gyengébb, de szintén
szignifikáns fokozódása volt megfigyelhető Hel-11 (5 µM) jelenlétében a
kontrollhoz viszonyítva.
13
A szoros kapcsolatok (TJ) folytonos jelenléte az agyi endotélsejtek
között elengedhetetlen a gátfunkcióhoz. Ezért megvizsgáltuk az egyik
fontos TJ fehérje, a ZO-1 jelenlétét az endotélsejtek közötti
kapcsolatokban. Immunfluoreszcens festéseken megfigyelhető volt a ZO-
1 fehérje fokozott expressziója (D3 és RBEC sejtekben) mind Hel-6, mind
pedig Hel-11 jelenlétében.
A Hel-6 és Hel-11 csökkenti az endotélsjetek migrációját
Az áttétek növekedésének egyik fontos lépése a metasztatikus
tumor angiogenezise, érképződése. Ebben a folyamatban az endotélsejtek
vándorlásának kulcsszerepe van. Ezért következő vizsgálataink során a
Hel-6 és Hel-11 lignánok agyi endotélsejtek migrációjára gyakorolt
hatását tanulmányoztuk sebgyógyulási assay alkalmazásával. Mind a Hel-
6, mind pedig a Hel-11 szignifikánsan csökkentette az endotélsejtek
vándorlását.
ÖSSZEFOGLALÁS
Az immunsejtek és a metasztatikus daganatsejtek átjutása a vér-agy
gáton olyan súlyos kórfolyamatok sarkalatos lépéseit jelenti, mint a
neuroinflammáció és az agyi metasztázisok kialakulása. Ezért fontos
lenne, hogy olyan stratégiákat, terápiás eszközöket találjunk, melyek
segítségével gátolni lehet ezen sejtek bejutását az agyba. Ezáltal nőne a
klinikai kezelések hatékonysága, a javulnának gyógyulási esélyek és a
betegek életminősége.
Kutatásaink során célul tűztük ki, hogy megvizsgáljuk a CB2
agonisták és a Heliopsis helianthoides var. scabra-ból izolált lignánok
hatását a BBB integritására és a sejtek agyi endotéliumon keresztüli
átjutására. Első lépésként a CB2 jelenlétét mutattuk ki humán agyi
endotéliumban és melanómasejtekben. Fontos megjegyezni, hogy
korábban a CB2 expresszióját a fehérvérsejtek több, különböző típusában
is kimutatták már. Gyulladásos stimulusoknak kitett humán agyi
endotélsejtekben megnövekedett CB2 expressziót figyeltük meg. Ezen
felül a következő kannabinoid és kannabinoid-szerű receptorokat sikerült
kimutatnunk: a CB1, GPR18 és GPR55 receptorokat a D3 humán agyi
endotélsejtekben, valamint a CB1, GPR18, GPR55 és GPR119
receptorokat az A2058 melanóma sejtekben.
14
Megvizsgáltuk, hogy milyen hatást gyakorol a CB2 aktiváció a
fokozott fehérvérsejt-endotélsejt adhézióra. Ehhez LPS indukált
enkefalitisz modellen végeztünk megfigyeléseket in vivo. A CB2 agonista
kezelés szignifikánsan csökkentette a fehérvérsejtek kitapadását mind az
agyfelszíni mind pedig a mélyebb, kortikális ereken. A CB2
fehérvérsejtek adhézióját gátló hatása szintén megfigyelhető volt humán
agyi endotéliumon, in vitro. Továbbá sikerült kimutatnunk, hogy a CB2
aktivációja javítja az agyi endotélsejtek gát funkcióját, melynek
hátterében valószínűleg a TJ fehérjék fokozott expressziója áll.
A fehérvérsejtekhez hasonlóan a CB2 aktiváció a melanómasejtek
agyi endotél sejtekhez történő kitapadását is gátolta. A JWH133 CB2
agonista csökkentette az endotéliumon keresztül átvándorló
melanómasejtek számát is.
A CB2 agonisták mellett két lignán, a helioxantin (Hel-6) és a
dibenzilbután dehydroheliobufthalmin (Hel-11) is javította az agyi
endotélium gát funkcióját, és fokozta a ZO-1 fehérje jelenlétét az agyi
endotélsejtek közötti kapcsolatokban. Ez a két lignán gátló hatást
gyakorolt a melanómasejtek és az agyi endotélsejtek migrációjára.
Emellett a Hel-6 csökkentette az agyi endotélsejtekhez kitapadt
melanómasejtek számát.
Vizsgálataink arra utalnak, hogy a CB2 agonisták és a Hel-6,
valamint a Hel-11 lignánok alkalmazása hozzájárulhat az immunsejtek
illetve a daganatsejtek vér-agy gáton keresztüli átjutásának gátlásához.
Ezen tulajdonságaik alapján ezek a vegyületek olyan potenciális terápiás
jelöltek lehetnek, melyeknek alkalmazása hozzájárulhat az agyi
gyulladással járó betegségek vagy az agyi metasztázisok kialakulásának
megelőzéséhez, valamint kezeléséhez.
PUBLIKÁCIÓK
Az értekezés alapjául szolgáló közlemények
1. Wilhelm I, Fazakas C, Molnár K, Végh AG, Haskó J, Krizbai IA.
Foe or friend? Janus-faces of the neurovascular unit in the formation of
brain metastases. J Cereb Blood Flow Metab. 2017 Jan
1:271678X17732025 (IF2016: 5,081)
15
2. Hajdu Z*, Haskó J ⃰, Krizbai IA, Wilhelm I, Jedlinszki N, Fazakas
C, Molnár J, Forgo P, Hohmann J, Csupor D. Evaluation of lignans from
Heliopsis helianthoides var. scabra for their potential antimetastatic
effects in the brain. J Nat Prod. 2014 Dec 26;77(12):2641-50 (*=társ-első
szerzők) (IF2014: 3,798)
3. Haskó J, Fazakas C, Molnár J, Nyúl-Tóth Á, Herman H,
Hermenean A, Wilhelm I, Persidsky Y, Krizbai IA. CB2 receptor
activation inhibits melanoma cell transmigration through the blood-brain
barrier. Int J Mol Sci. 2014 May 8;15(5):8063-74 (IF2014: 2,862)
4. Ramirez SH, Haskó J, Skuba A, Fan S, Dykstra H, McCormick R,
Reichenbach N, Krizbai I, Mahadevan A, Zhang M, Tuma R, Son YJ,
Persidsky Y. Activation of cannabinoid receptor 2 attenuates leukocyte-
endothelial cell interactions and blood-brain barrier dysfunction under
inflammatory conditions. J Neurosci. 2012 Mar 21;32(12):4004-16
(IF2012: 6,908)
További közlemények
1. Nyúl-Tóth Á, Kozma M, Nagyőszi P, Nagy K, Fazakas C, Haskó J,
Molnár K, Farkas AE, Végh AG, Váró G, Galajda P, Wilhelm I, Krizbai
IA. Expression of pattern recognition receptors and activation of the non-
canonical inflammasome pathway in brain pericytes. Brain Behav Immun.
2017 Aug;64:220-231 (IF2016: 5,964)
2. Krizbai IA, Nyúl-Tóth Á, Bauer HC, Farkas AE, Traweger A,
Haskó J, Bauer H, Wilhelm I. Pharmaceutical targeting of the brain. Curr
Pharm Des. 2016;22(35):5442-5462 (IF2016: 2,611)
3. Nyúl-Tóth Á, Suciu M, Molnár J, Fazakas C, Haskó J, Herman H,
Farkas AE, Kaszaki J, Hermenean A, Wilhelm I, Krizbai IA. Differences
in the molecular structure of the blood-brain barrier in the cerebral cortex
and white matter: an in silico, in vitro, and ex vivo study. Am J Physiol
Heart Circ Physiol. 2016 Jun 1;310(11):H1702-14 (IF2016: 3,324)
4. Molnár J, Fazakas C, Haskó J, Sipos O, Nagy K, Nyúl-Tóth Á,
Farkas AE, Végh AG, Váró G, Galajda P, Krizbai IA, Wilhelm I.
Transmigration characteristics of breast cancer and melanoma cells
through the brain endothelium: Role of Rac and PI3K. Cell Adh Migr.
2016 May 3;10(3):269-81 (IF2016: 3,306)
16
5. Nagyőszi P, Nyúl-Tóth Á, Fazakas C, Wilhelm I, Kozma M, Molnár
J, Haskó J, Krizbai IA. Regulation of NOD-like receptors and
inflammasome activation in Cerebral endothelial cells. J Neurochem.
2015 Nov;135(3):551-64 (IF2015: 3,842)
6. Wilhelm I, Fazakas C, Molnár J, Haskó J, Végh AG, Cervenak L,
Nagyőszi P, Nyúl-Tóth A, Farkas AE, Bauer H, Guillemin GJ, Bauer HC,
Váró G, Krizbai IA. Role of Rho/ROCK signaling in the interaction of
melanoma cells with the blood-brain barrier. Pigment Cell Melanoma Res.
2014 Jan;27(1):113-23 (IF2014: 4,619)
7. Wilhelm I, Molnár J, Fazakas C, Haskó J, Krizbai IA. Role of the
blood-brain barrier in the formation of brain metastases. Int J Mol Sci.
2013 Jan 11;14(1):1383-411 (IF2013: 2,339)
8. Fazakas C, Wilhelm I, Nagyoszi P, Farkas AE, Haskó J, Molnár J,
Bauer H, Bauer HC, Ayaydin F, Dung NT, Siklós L, Krizbai IA.
Transmigration of melanoma cells through the blood-brain barrier: role of
endothelial tight junctions and melanoma-released serine proteases. PLoS
One. 2011;6(6):e20758 (IF2011: 4,092)
9. Nagyoszi P, Wilhelm I, Farkas AE, Fazakas C, Dung NT, Haskó
J, Krizbai IA. Expression and regulation of toll-like receptors in cerebral
endothelial cells. Neurochem Int. 2010 Nov;57(5):556-64 (IF2010: 3,601)
17
KÖSZÖNETNYILVÁNÍTÁS
Elsőként témavezetőmnek, Dr. Krizbai Istvánnak szeretném
megköszönni a doktori tanulmányaim és kutatómunkám során nyújtott
tudományos útmutatását és bátorítást. Különösen hálás vagyok Dr.
Wilhelm Imolának az elméleti és gyakorlati tanácsokért, megbeszélésekért
és építő jellegű bírálatokért.
Köszönettel tartozom Dr. Yuri Persidskynek, a filadelfiai Temple
Egyetem, Patológia Tanszék (USA, Philadlephia, PA) tanszékvezetőjének,
valamint Dr. Servio Ramirez tudományos főmunkatársának, akik
lehetőséget biztosítottak arra, hogy laboratóriumukban egy éves szakmai
tapasztalatot szerezhessek, és kísérletes munkáimat elvégezhessem.
Köszönetemet szeretném kifejezni a Molekuláris Neurobiológia
Egység korábbi vezetőjének, Dr. Párducz Árpádnak, valamint jelenlegi
vezetőjének Dr. Siklós Lászlónak és az egység többi tagjának. Köszönet
illeti Dr. Ormos Pált és Dr. Zimányi Lászlót, a Biofizikai Intézet korábbi
és jelenlegi igazgatóját és az intézet többi munkatársát a kellemes
munkahelyi légkörért.
Korábbi és jelenlegi munkatársaimnak, Dr. Fazakas Csillának, Dr.
Farkas Attilának, Dr. Nagyőszi Péternek, Dr. Molnár Juditnak, Nyúl-Tóth
Ádámnak, Molnár Kingának, Kozma Mihálynak, Mészáros Ádámnak,
Andrew Skubanak, Dr. Shongshan Fannak, Holly Dykstranak, Ryan
McCormicknak, Nancy Reichenbachnak, Jonathan Cenna-nak, Dr. Slava
Romnak, Dr. Ming Zhangnak, Yu Zhounak szeretném megköszönni az
együtt eltöltött időt, a közös kutatások és felfedezések élményét.
Hálás köszönet illeti együttműködő partnereinket, különösképpen Dr.
Hajdú Zsanettet, Dr. Csupor Dezsőt és Dr. Hohmann Juditot (Szegedi
Tudományegyetem, Gyógyszertudományi Kar, Farmakognóziai Intézet) a
közös kutatásainkban elvégzett lelkiismeretes munkáért, és a közös
publikációnkért.
Hálás vagyok családomnak, barátaimnak a töretlen támogatásukért.
Végezetül szeretném megköszönni az anyagi támogatást a Hungarian-
American Enterprise Scholarship Fund (HAESF) ösztöndíj alapnak a
GINOP-2.3.2-15-2016-0020, a GINOP-2.3.2-15-2016-0034 és a GINOP-
2.3.2-15-2016-0030 programoknak, valamint a Konvergencia régióban
meghirdetett Apáczai Csere János Doktorandusz Ösztöndíjnak (TÁMOP
4.2.4.A/2-11-1-2012-0001).