BIOCHIMIE MEDICAL Suport curs pentru studenii Facultilor de Medicin i

Asisten Medical

CUPRINS

1. Proteine 2. Enzime 3. Vitamine 4. Energetica biochimic 5. Metabolismul glucidic 6. Metabolismul lipidic 7. Metabolismul proteic 8. Metabolismul nucleotidelor purinice si pirimidinice 9. Metabolismul cromoproteinelor

9.1. Biosinteza hemoglobinei 9.2. Degradarea hemoglobinei (bilirubinogenez

Abrevieri folosite n text

2

1. PROTEINE

Proteinele sunt componeni de baz ai celulei, reprezentnd aproximativ 50% din greutatea ei uscat. Proteinele se gsesc n toate compartimentele celulare, fiind substane fundamentale din toate punctele de vedere pentru structura i funcia celulei. Prin hidroliza proteinelor se obin compui cu greutate moleculara mica, aminoacizi.

n organism proteinele ndeplinesc funcii multiple (plastic, energetic, catalitic etc.) care le difereniaz de lipide sau glucide.

n alctuirea moleculelor proteice, aminoacizii se unesc prin legturi amidice numite legturi peptidice, care se realizeaz prin eliminarea unei molecule de ap ntre gruparea carboxil a unui aminoacid i gruparea amino a aminoacidului urmtor.

1.1.AMINOACIZII

Prin hidroliza proteinelor se formeaz 20 de -aminoacizi. Acetia sunt compui cu greutate molecular mic care conin dou grupri funcionale, carboxil i amino, legate de acelai atom de carbon ( C ).

Formula general a unui aminoacid este:

la care corespund toi aminoacizii cu excepia prolinei si hidroxiprolinei. Dup structura radicalului R, aminoacizii se clasific n funcie de natura radicalului R:

Tabel 1 - Clasificarea -aminoacizilor din structura proteinelor

Numele uzual

Numele tiinific Formula structural

I. Radical alifatic (acizi monoaminomonocarboxilici)

Glicina (Glicocol)

Gly (G)

Acid aminoacetic

R CH COOH

NH2

R CH COOH

NH2

H CH COOH

NH2

CH COOH

NH2

CH3

3

Alanina

Ala (A)

Acid amino-propionic

Valina

Val (V)

Acid amino-izovalerianic

Leucina

Leu (L)

Acid -amino-izocaproic

Izoleucina

Ile (I)

Acid -amino--metil-valerianic

II. Radical cu grupare acida (acizi monoaminodicarboxilici)

Acid aspartic

Asp (D)

Acid amino-succinic

Asparagina

Asn (N)

-amida acidului amino-succinic

Acid glutamic

Glu (E)

Acid -amino-glutaric

Glutamina

Gln (Q)

-amida acidului -amino-glutaric

III. Radical cu grupare bazica (acizi diaminomonocarboxilici)

Arginina

Arg (R)

Acid -amino--guanidino-n-valerianic

Lizina

Lys (L)

Acid ,-diamino-carpoic

Hidroxilizina

Hyl

Acid --diamino--hidroxi-n-carpoic

CH COOH

NH2

CH3 CH

CH3

CH3

CHCH3 CH COOH

NH2

CH2

CH COOH

NH2

CH2 CH

CH3

CH3

CH COOH

NH2

CH2OCH2N

CH COOH

NH2

CH2CH2HOOC

CH COOH

NH2

CH2HOOC

CH COOH

NH2

CH2H2N OC CH2

CH2 (CH2)2 CH COOH

NH2

NH

C

H2N

HN

H2N

CH COOH

NH2

(CH2)3CH2

H2N

CH2

OH

CH COOH

NH2

(CH2)2CH

4

Histidina

Hys (H) Acid -amino--imidazolil-propionic

IV.Radical cu grupare hidroxil (Hidroxiaminoacid)

Serina

Ser (S)

Acid -amino--hidroxi-propionic

Treonina

Thr (T) Acid -amino--hidroxi-n-butiric

V. Radical cu grupare tiolic (Tioaminoacizi) Cisteina

Cys C

Acid -amino--mercapto-propionic

Cistina

Acid --ditio-(-amino-propionic)

Metionina

Met (M)

Acid -amino--metil-tio-n-butiric

VI. Radical aromatic (aminoacizi aromatici)

Histidina (grupa

III)

Acid -amino--imidazolil propionic

clasificat n categoria amino-acizilor bazici (III)

Fenilalanina

Phe (F)

Acid -amino--fenil-propionic

Tirozina

Tyr (Y)

Acid -amino--(p-hidroxifenil) propionic

CH COOH

NH2

CH2

OH

CH COOH

NH2

CH2

NHN

OH

CH COOH

NH2

CHCH3

CH COOH

NH2

CH2

SH

CH2 CH COOH

NH2

S

CH2 CH COOH

NH2

S

S

CH2 CH COOH

NH2

CH2

CH3

CH COOH

NH2

CH2

CH COOH

NH2

CH2HO

5

Triptofan

Trp (W) Acid -amino--(3)indolil-propionic

VII. Iminoacizi

Prolina

Pro (P)

Acid pirolidin-2-

carboxilic

Hidroxiprolina

Hyp

Acid 4-hidroxi-pirolidin-

2-carboxilic

Dintre cei 20 de aminoacizi care intr n structura proteinelor animale opt aminoacizi nu pot fi sintetizai n organism: provin din alimente aminoacizii eseniali: Val, Phe, Leu, Ile, Thr, Trp, Met, Lys.

1.1.1. Proprieti fizice a) Cu excepia glicinei, toi aminoacizii conin atomi de carbon asimetric,

motiv pentru care prezint activitate optic: la pH = 7 unii sunt dextrogiri (+), iar alii sunt levogiri (-). Cu toate acestea ei aparin seriei L deoarece au configuraia L- glicerinaldehidei.

L glicerinaldehida L aminoacid

n organismele animalelor superioare apar i sunt metabolizai numai L aminoacizii, n timp ce D-aminoacizii se gsesc n peretele celular al unor microorganisme sau n lanul polipeptidic din structura unor antibiotice (gramicidina, actinomicina D).

Izomerii dextro i levo ai aminoacizilor formeaz perechi de enantiomeri care au proprieti chimice asemntoare. Amestecul lor echimolecular se numete amestec racemic i este lipsit de activitate optic. Sinteza enzimatic, fiind stereospecific,

conduce la unul sau cellalt enantiomer. Sinteza n laborator conduce la amestecuri racemice de aminoacizi. Acest tip de amestec se poate obine numai pe cale sintetic.

CHO

HO C H

CH2 OH

COOH

C HH2N

R

COOH

HN

COOH

HN

HO

CH COOH

NH2

CH2

N

6

b) Aminoacizii sunt substane cristaline, solubile n ap, puin solubile n solveni organici, cu puncte de topire de peste 200o C. n soluii apoase ei se gsesc sub forma de ioni dipolari sau zwiterioni:

Cnd un astfel de ion se dizolv n ap, el poate aciona fie ca un acid (donor de protoni), fie ca o baz (acceptor de protoni):

Ca un acid: H3N+-CH(R)-COO- H+ + H2N-CH(R)- COO

-

Ca o baza: H3N+-CH(R)-COO- + H+ H3N

+-CH(R)-COOH

Substanele care au astfel de proprieti se numesc amfotere sau amfolii. Existenta ionului bipolar explic utilizarea soluiilor de aminoacizi drept soluii tampon. Dac la soluia unui aminoacid se adaug un acid tare, protonii si vor fi neutralizai de gruprile carboxil ale aminoacidului, iar dac se adaug o baza tare, gruprile hidroxil vor fi neutralizate de gruprile NH3+, astfel nct pH-ul soluiei nu se modific.

c) Toi aminoacizii izolai din proteine absorb slab radiaiile din domeniul ultraviolet (220 nm). Triptofanul, tirozina i fenilalanina, datorit nucleului aromatic, dau absorbie specific la 280 nm, proprietate ce st la baza unei metode de dozare a proteinelor.

1.1.2. Proprieti chimice Proprietile chimice ale aminoacizilor sunt datorate att celor doua grupri

funcionale ct i prezenei radicalului R. Unele din aceste reacii se petrec i n organism, altele sunt utilizate n studiul proteinelor (identificarea aminoacizilor din hidrolizatele proteice, stabilirea secvenei de aminoacizi n proteine, identificarea aminoacizilor specifici pentru funcia proteinelor, modificarea chimic a resturilor de aminoacizi din moleculele proteice n vederea modificrii activitii lor biologice), precum i pentru sinteza lanurilor polipeptidice n laborator.

1- Reacia cu acidul azotos, din care rezulta hidroxiacizi (reacie utilizat pentru dozarea aminoacizilor prin metoda van Slyke).

2- Reacia de alchilare atomii de H de la gruparea amino pot fi nlocuii cu radicali alchil (de obicei metil), cu formare de betaine (compui n care atomul de azot este cuaternar)

Betaina glicocolului este un important donor de grupare metil n organism.

R CH COOH

NH2

+ HNO2 + H2O + N2HCl

R CH COOH

OH

+

COO

C HH3N

R

_

+ 3 CH3IR CH

NH2

COOH R CH

N(CH3)3

COO_

+

7

3- Reacia de acilare n prezenta acizilor carboxilici, a anhidridelor sau a clorurilor acide gruparea amino poate fi acilat. De la glicocol, prin acilare la nivel hepatic se obine acidul hipuric, compus ce reprezint forma de eliminare a acidului benzoic din organism.

H2H-CH2-COOH + C6H5 CO~SCoA C6H5-CO-NH-CH2-COOH + CoA-SH Acid hipuric

4- Reacia cu formaldehida gruparea amino poate reaciona reversibil cu aldehidele, formnd compui denumii baze Schiff. Aceasta reacie s la baza metodei de dozare a aminoacizilor prin metoda Srensen (formol titrarea). Bazele Schiff apar i n organism sub forma de compui intermediari n unele procese (transaminare, decarboxilare etc.).

+ HCHO + H2OR CH COOH

NH2 CH2

R CH COOH

N

5- Reacia cu ninhidrina ninhidrina este un agent oxidant care produce decarboxilarea -aminoacizilor cu eliberare de CO2, NH3 i o aldehida cu un atom de C mai puin. Ninhidrina redus reacioneaz cu amoniacul eliberat, formnd un complex colorat n albastru, ce prezint absorbie specific la 570 nm; aceasta reacie st la baza uneia din cele mai utilizate metode de dozare a aminoacizilor.

6- Reaciile specifice radicalului R sunt utilizate pentru identificarea calitativ a aminoacizilor:

- reacia Sakaguchi specific pentru arginina care n prezena -naftolului d o coloraie roie;

- reacia cu nitroprusiat specific cisteinei cu care d o coloraie roie; - reacia Pauli (soluie alcalin de acid sulfanilic diazotat) reactivul d o

coloraie roie cu histidina i tirozina; - reacia Ehrlich este specific pentru triptofan care d o coloraie albastr; - reacia Folin Cioclteu (acid fosfomolibdowolframic) specific pentru

tirozina care d o culoare roie; - reacia xantoproteic prin fierbere cu acid azotic concentrat, aminoacizii

ciclici dau o coloraie galben care trece n portocaliu la adugarea de baze. 1.2. PEPTIDE

Peptidele sunt compui rezultai din unirea a mai multor molecule de aminoacizi prin legaturi peptidice (-HN-CO-) i pot fi obinute din proteine prin hidroliz parial (chimic sau enzimatic).

n funcie de numrul de aminoacizi din molecul peptidele se mpart n: - oligopeptide conin pn la 10 aminoacizi n molecul; - polipeptide conin ntre 10 i 100 aminoacizi. Polipeptidele care conin mai mult de 100 de resturi de aminoacizi n molecul

poart numele de proteine.

8

Nomenclatura peptidelor se face indicnd numele aminoacizilor n ordinea n care se gsesc n molecul, ncepnd cu aminoacidul care conine gruparea amino-terminal liber. Denumirile aminoacizilor vor cpta terminaia il, cu excepia ultimului care conine gruparea carboxil-terminal liber: de exemplu peptidul cu secvena Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu-Cys se va citi Seril-Glicil-Tirozil-Alanil-Leucil-Cistein.

Proprietile peptidelor Peptidele, n special cele cu greutate moleculara mic, sunt solubile n ap,

insolubile n alcool absolut i au caracter amfoter ca i aminoacizii din care sunt constituite.

Gruprile amino-terminale precum i gruprile R laterale dau aceleai reacii caracteristice ca i cele din aminoacizii liberi. O reacie caracteristic este reacia biuretului, care const n tratarea peptidelor i proteinelor cu soluii alcaline de Cu2+, cu formarea unui complex colorat in violet; aceasta reacie este dat numai de compuii care conin cel puin dou legturi peptidice n molecul.

Peptide biologice 1- Tripeptide. Glutationul (-glutamil-cisteinil-glicina) este prezent n toate

esuturile vii.

Glutationul se gsete n organism n forma redus (GSH) i sub form oxidat (GSSG). El ndeplinete un important rol fiziologic, fiind socotit un important sistem oxidoreductor celular.

2 - Hormoni peptidici. Exist o serie de hormoni cu structur polipeptidic: unii hormoni hipofizari, insulina, glucagonul, oxitocina, vasopresina i ACTH.

3 Peptide cu aciune antibacterian. Penicilinele, tirocidinele (A,B), gramicidinele (A,B,C), bacitracinele i polimixinele au o structur polipeptidic. Penicilinele sunt polipeptide atipice care conin acid 6-amino-penicilanic pe molecula cruia sunt grefai diveri radicali. Cnd radicalul este C6H5-CH2- compusul se numete benzil-penicilina (penicilina G).

1.3. PROTEINE

Proteinele sunt biopolimeri macromoleculari care conin n molecul peste 100 de resturi de aminoacizi unii prin legturi peptidice. Numrul, natura i modul de aranjare al aminoacizilor n molecul variaz de la o proteina la alta. Moleculele proteice pot adopta diverse conformaii n spaiu, fiind descrise astfel mai multe niveluri de organizare: primar, secundar, teriar i cuaternar.

1.3.1. Nivele de organizare structural

Structura primar Structura primar reprezint numrul i ordinea aminoacizilor n molecul.

HOOC CH CH2 CH2 CO NHCH CONH

CH2

COOH

NH2

CH2

SH

9

Structura secundar Structura secundar reprezint cel de-al doilea nivel de organizare structural a

proteinelor, reprezentnd aranjarea spaial a moleculei proteice pe o singur\ ax\. Acest lucru este posibil datorit legturilor de hidrogen formate ntre resturile carboxil i amino aparinnd legturilor peptidice.

Cea mai mare contribuie la elucidarea structurii secundare a proteinelor au avut-o lucrrile lui Pauling si Corey care au elaborat dou modele teoretice: modelul helicoidal (spiralat) i modelul straturilor pliate, modele care explic destul de bine proprietile fizico-chimice i biologice ale moleculelor proteice.

Structura sau modelul helicoidal rezult prin spiralarea catenei polipeptidice n jurul unui cilindru imaginar.

n funcie de orientarea aminoacizilor, elicea poate fi de tip -dreapta, care are sensul de rotaie al unui urub cu filetul spre dreapta i de tip -stnga cu sensul de rotaie spre stnga. n ambele forme radicalii R ai aminoacizilor sunt proiectai spre exteriorul elicei; n elicea dreapta radicalul R se afl n poziie trans fa de oxigen, motiv pentru care aceasta forma este mai stabil.

Helixul de tip are forma unei scri n spiral. nalimea fiecrei trepte este de 1,5 , iar o spir conine 3,6 resturi de aminoacizi, ceea ce face ca distana dintre spire s fie de 5,6 .

CHNHCH

N CHC

NCHCH

R1

O

H

R2

O

H

R3

O

H

R4 COO

H3N+

CC .............

_

(CO CH NH)

R

n;

10

Aceast structur este meninut n spaiu datorit legturilor de hidrogen n care sunt implicate toate legturile peptidice. Legturile de hidrogen sunt paralele cu axul elicei i se realizeaz ntre gruparea carboxil a unui aminoacid i gruparea amino a celui de-al patrulea aminoacid.

Prezena anumitor aminoacizi provoac ndoirea lanului polipeptidic. Din aceast categorie fac parte prolina i hidroxiprolina (din cauza azotului iminic), aminoacizi care conin grupri R ncrcate electric sau cu volum mare (arginina, acidul glutamic, lizina, leucina, izoleucina).

Configuraia de tip -helix este ntlnit la multe proteine, dar nu nglobeaz totalitatea lanului polipeptidic. Astfel, n molecula de paramiozina peste 90% din aminoacizi sunt implicai n formarea -helixului, n timp ce n alte proteine spiralarea nu depete 50%.

Structura sau modelul straturilor pliate se bazeaz pe formarea legaturilor de hidrogen intercatenare i poate apare n doua variante: modelul paralel al straturilor pliate (caracteristic -keratinei) i modelul antiparalel (ce poate fi ntlnit n cazul fibroinei din mtase).

n modelul paralel (a) toate lanurile polipeptidice sunt aezate paralel, cu gruprile R

orientate n acelai sens, n timp ce n straturile antiparalele (b) catenele polipeptidice sunt aezate fa n fa. Spre deosebire de -helix, n structura de tip , legturile de hidrogen sunt aproape perpendiculare pe axa lanului polipeptidic.

Structura . Colagenul. n afara celor dou modele caracteristice pentru structura secundar a proteinelor

descrise mai sus , mai exist o structur particular ntalnit n colagen, o proteina fibrilar, insolubil i elastic prezent n esuturile animale (esut conjunctiv, tendoane, ligamente, cartilagii, piele, oase etc.) i care reprezint aproximativ 25% din proteinele corpului.

11

Structura secundara a colagenului este un triplu helix de dreapta format din trei

lanuri polipeptidice (fiecare fiind un helix de stnga) legate intre ele prin legaturi de hidrogen.

Unitatea structural a colagenului este tropocolagenul care este format din trei lanuri: dou lanuri 1 identice, iar al treilea, 2, fiind destul de asemntor cu celelalte dou. Fiecare lan conine aproximativ 1000 de resturi de aminoacizi, dintre care 1/3 sunt resturi de glicin; de asemenea exist un coninut ridicat de prolin, precum i o serie de aminoacizi mai rari: hidroxiprolina i hidroxilizina.

Hidroxiprolina se formeaz dup ce lanul polipeptidic a fost sintetizat, prin aciunea prolinhidroxilazei, enzim ce necesit O2, Fe2+, -cetoglutarat i acid ascorbic (vitamina C). n scorbut, lipsa vitaminei C mpiedic hidroxilarea prolinei i colagenul sintetizat n aceste condiii are o structura anormal, ceea ce duce la apariia leziunilor cutanate i la fragilitate vascular.

ntre cele trei lanuri polipeptidice se stabilesc legturi de hidrogen ntre gruprile >NH dintr-un lan i gruprile >C=O din alt lan i legturi van der Waals ntre resturile nepolare ale aminoacizilor. Aceste legturi sunt orientate transversal fa de axa helixului. Resturile de glicin ocup ntotdeauna al treilea loc n secvena aminoacizilor ncepnd din poziia 13 a lanului

polipeptidic.

Coninutul n iminoacid (prolina i hidroxiprolina) este important pentru stabilirea termic a colagenului; colagenul animalelor cu snge cald, cel mai bogat n prolin i hidroxiprolin, este i cel mai stabil termic.

Capetele lanurilor polipeptidice sunt nespiralate i datorit flexibilitii pot forma legturi specifice ntlnite numai n aceste tipuri de proteine.

Ca i n cazul fibrinei, molecula de colagen este stabilizat prin legturi ncruciate realizate intramolecular i intermolecular ntre resturile de lizin situate n poriunile nespiralate ale moleculei de tropocolagen.

Numrul acestor legturi variaz cu funcia fiziologic i vrsta colagenului. Astfel, colagenul din tendonul lui Achile, la obolanii maturi, are un numr foarte

12

mare de astfel de legturi, n timp ce n colagenul din coad care este flexibil, numrul legturilor este mai mic.

O caracteristic interesant a structurii colagenului este faptul c ntre capetele moleculelor de colagen se gsesc spaii libere care joac un rol nsemnat n formarea osului, ntruct n aceste spaii se fixeaz calciu, sub form de hidroxiapatit (fosfat bazic de calciu).

Elastina, constituentul major al pereilor vaselor sanguine i al l igamentelor, are un coninut ridicat de glicin, prolin i acizi aminai cu grupri nepolare (alanin, valin, leucin i izoleucin), dar conine foarte puin hidroxiprolin i acizi aminai polari i nu conine deloc hidroxilizin. Elastina matur con ine multe legturi ncruciate ce o face aproape insolubil i din acest motiv, foarte greu de analizat.

Structura teriar reprezint interaciunea spaial ntre segmente care nu sunt vecine n lanul polipeptidic, avnd ca rezultat o structur tridimens ional, globular. Ea este caracteristic n special proteinelor globulare, a cror catene macromoleculare sunt strnse sub forma unor cilindri elipsoidali cu o lungime care nu depete de 2-6 ori diametrul lor. Este rezultatul interaciunii dintre radica lii R ai resturilor de aminoacid din lanul polipeptidic. Forele de atracie implicate n formarea structurii teriare sunt datorate urmtoarelor tipuri de legturi:

a) Legturi de hidrogen care pot fi stabilite ntre gruparea fenolic a tirozinei i o grupare carboxil de la acidul glutamic sau acidul aspartic, sau ntre radicalul imidazolic al histidinei i gruparea hidroxilic a serinei.

b) Legturi ionice ntre grupele carboxil ale acizilor dicarboxilici i grupele amino ale acizilor diaminai. Realizarea acestor legturi este posibil atunci cnd distanele dintre atomi sunt cuprinse ntre 2 i 3,1 . Studii de difracie a razelor X au evideniat c n realitate se formeaz un numr mai mic de legturi ionice, datorit faptului c majoritatea gruprilor care ar putea realiza aceste legturi intr n interaciune cu solventul. ntr-adevr, n soluie, gruprile polare ale proteinelor sunt orientate spre exteriorul moleculei, ceea ce face ca proteinele s fie solubile i s se comporte ca electroliii.

c) Legturi nepolare prin fore van der Waals care se stabilesc ntre radicalii hidrocarbonai al alaninei, fenilalaninei, leucinei etc. Distanele dintre atomii care particip la astfel de legturi sunt cuprinse ntre 3,1 i 4,1 . Aceste legturi sunt cele mai importante pentru meninerea proteinei n structura teriar. Resturile nepolare, hidrofobe se gsesc n interiorul ghemului rezultat prin ncolcirea lanului polipeptidic avnd ca efect stabilizarea din punct de vedere termodinamic a moleculei, mai mult dect n cazul n care aceste resturi ar fi orientate spre mediul exterior. Din acest motiv lanurile peptidice introduse n soluie apoas se ncoltcesc spontan aa fel nct resturile nepolare se situeaz n interiorul ghemului, iar gruprile polare rmn pe suprafaa moleculei.

d) Legturi disulfidice S-S-, covalente, pot contribuie la meninerea structurii teriare a proteinelor globulare limitnd tendina de depliere a moleculei, ns contribuia lor este mic, deoarece sunt puine.

13

Structura primar a unei proteine determin aranjarea moleculei proteice n

configuraii -helix sau -foi pliate, n funcie de interaciunile radicalilor R. Prima protein a crei structur teriar a fost elucidat este mioglobina

(Kendrew i colab. 1957), o protein globular, prezent n cantiti mari n muchi, avnd rolul de a depozita oxigenul la nivel tisular. 75% din lanul polipeptidic (153 aminoacizi) din mioglobin cuprinde opt segmente elicoidale (notate A...........H), coninnd ntre 7 (segmentul D) i 24 de resturi de aminoacizi (segmentul H). Zonele elicoidale sunt ntrerupte de segmente nespiralate, la nivelul crora lanul polipeptidic i schimb direcia. n patru dintre aceste puncte se afl prolina, n celelalte plierea fiind determinat de ali factori. n acest fel, molecula se aranjeaz ntr-o form compact cu dimensiunile 45 x 35 x 25 . n interiorul moleculei se gsesc aminoacizi nepolari cu excepia a dou resturi polare de histidin care particip la legarea hemului, iar n exterior sunt plasate gruprile polare i cele cu ncrcare electric.

14

n general, proteinele intracelulare, solubile, au form sferic sau elipsoidal n funcie de raportul dintre aminoacizii cu radical R polar i aminoacizii cu radical R nepolar. Cnd raportul are valori cuprinse ntre 0,9-1,4, proteina opteaz pentru form alungit, iar cnd raportul este mic (0,3-0,6) proteina adopt forma sferic.

n cazul proteinelor membranare, nglobate n dublul strat lipidic, resturile de aminoacizi sunt repartizate invers, radicalii hidrofobi se gsesc pe partea exterioar care vine n contact cu moleculele lipidice membranare, iar resturile polare i ncrcate electric, n interior, cptuind canalele ionice ce strbat membranele.

Structura cuaternar Un numr mare de proteine sunt constituite din mai multe lanuri polipeptidice,

formnd oligomeri. Lanurile individuale se numesc protomeri sau subuniti, fiecare avnd structur primar, secundar i teriar proprie. Subunitile se asambleaz n structura cuaternar prin fore asemntoare celor din structura teriar, cu deosebirea, c n acest caz, legturile se stabilesc ntre subuniti.

n general, proteinele cu greutate molecular mai mare de 50.000 sunt formate din mai multe subuniti polipeptidice i sunt active sub form de oligomeri, protomerii fiind inactivi. n multe proteine subunitile sunt identice: chimotripsina, fosfataza alcalin (dou subuniti), aldolaza (trei subuniti), glutamat dehidrogenaza (patru subuniti), catalaza (optsprezece subuniti), iar n altele, subunitile sunt diferite:

hemoglobina (dou lanuri i dou ), lactat dehidrogenaza tetramer format din dou tipuri de subuniti notate H (heart) i M (muscle).

15

Asamblarea subunitilor n structura cuaternar este posibil datorit existenei unor zone complementare spaial si electric pe suprafeele subunitilor.

Interaciunile dintre subuniti prin suprafeele complementare sunt caracterizate prin fenomenul de cooperare, adic primele contacte odat realizate, favorizeaz formarea celorlalte.

Modificarea unui dintre protomeri (combinarea cu un compus oarecare) se

resimte la nivelul ntregii molecule oligomere, fiind deranjat structura cuaternar i deci, funcia biologic a proteinei. Acest fenomen st la baza mecanismului de reglare alosteric a activitii enzimelor.

Formarea proteinelor complexe confer proteinelor proprieti noi, fiecare subunitate catalizeaz o etap dintr-o cale metabolic. Eficiena crete mult deoarece intermediarii nu sunt pierdui n reacii colaterale, procesul desfurndu-se n flux continuu. De exemplu, piruvat dehidrogenaza este format din patru subuniti: trei subuniti catalitice (trei enzime distincte) i a patra este subunitate reglatoare.

O protein oligomer important este hemoglobina, responsabil de transportul oxigenului la vertebrate. Structura hemoglobinei a fost elucidat de Perutz prin difracia razelor X i spectre ORD (dispersia rotaiei optice).

Dou lanuri polipeptidice din hemoglobin sunt foarte asemntoare cu cel al

mioglobinei att n privina structurii primare ct i teriare. Lanul din hemoglobin

conine 141 resturi de aminoacizi, iar lanul conine 146 resturi de aminoacizi. ntre lanurile identice se realizeaz legturi polare ntre gruprile terminale -

+NH3 i COO-, iar ntre lanurile diferite, legturi de hidrogen i Van der Waals pe poriuni mai mari.

16

1.3.2. Proprietile proteinelor Proteinele izolate din diverse surse sunt n general substane solide, amorfe, care

prin purificare avansat pot fi obinute n stare cristalizat.

Solubilitatea proteinelor depinde de forma moleculei, natura solventului, structura chimic, temperatur, pH. Ea se datoreaz prezenei pe suprafaa moleculei a gruprilor polare, hidrofile (-COOH, -NH2, -OH) ce se orienteaz spre ap cu care interacioneaz electrostatic. n acest mod, molecula proteic se izoleaz de celelalte molecule i se dizolv. Proteinele globulare, avnd molecule ovoidale, se asociaz greu i de aceea sunt solubile.

Proteinele fibrilare au o suprafa mic de contact cu solventul i ca atare sunt puin solubile sau chiar insolubile n ap.

Modificarea pH-ului mediului influeneaz solubilitatea proteinelor prin modificare ncrcrii electrice. La pHi (pH izoelecteric), solubilitatea proteinelor este minim deoarece numrul sarcinilor pozitive fiind egal cu numrul sarcinilor negative, moleculele proteice nu mai interacioneaz cu moleculele polare ale apei.

Soluiile diluate de electrolii (sruri ale metalelor uoare, NaCl, MgCl2, Na2SO4, (NH4)2SO4) mresc solubilitatea proteinelor n timp ce soluiile concentrate scad solubilitatea, pn la precipitare. Astfel, globulinele sunt greu solubile n ap pur, uor solubile n soluii saline diluate i insolubile n soluii saline de concentraie mare. Aceast comportare st la baza uneia dintre cele mai simple i rspndite metode de separare a proteinelor plasmatice. Cel mai adesea se folosesc soluii de sulfat de amoniu cu grad de saturare diferit: globulinele precipit cu soluii semisaturate de (NH4)2SO4, iar albuminele, la concentraii mai mari de 75% saturaie.

Solvenii organici (eter, aceton, alcool), adugai la o soluie de protein, mpiedic interaciunea moleculelor proteice cu moleculele apei i n consecin, proteina va precipita.

Caracterul amfoter al proteinelor este dat de gruprile carboxil i amino care nu sunt angajate n formarea legturilor peptidice. Ele vor imprima proteinei caracter acid (cationi) sau bazic (anioni) n funcie de numrul gruprilor COOH i NH2 libere provenite de la acid glutamic, acid aspartic, lizin, arginin i nucleului imidazolic din histidin. Grupele carboxil i amino terminale au o contribuie mai redus n determinarea caracterului amfoter cu ct lanul polipeptidic este mai lung.

La pH fiziologic toate gruprile acide sau bazice sunt complet ionizate. Fiecare protein este caracterizat prin pH-ul izoelectric (pHi), care reprezint valoare pH-ului la care ncrcarea electric a proteinei este nul, numrul gruprilor ncrcate pozitiv fiind egal cu numrul gruprilor ncrcate negativ.

La pHi solubilitatea i mobilitatea n cmp electric a proteinei este minim. La valori de pH mult diferite de pHi proteina va fi ncrcat (+) sau (-) i va migra n cmp electric, proprietate ce st la baza metodelor electroforetice de separare a proteinelor din amestecuri.

17

Proprieti optice proteinele ca i aminoacizii, prezint activitate optic determinat de prezena atomilor de carbon asimetrici. La asimetria moleculei prin

carbon asimetric se adaug i asimetria creat de -helix. Puterea rotatorie a proteinelor este o msur a strii de integritate sau degradare a moleculei.

Denaturarea proteinelor Conformaiile native ale proteinelor globulare realizate prin interaciunile specifice dintre lanurile polipeptidice sunt fragile, fiind uor deranjate de aciunea aa numiilor ageni denaturani. Aceti ageni acioneaz prin ruperea legturilor necovalente din structurile secundar, teriar i cuaternar, dar nu afecteaz legturile covalente, legturile peptidice rmn intacte (nu se elibereaz aminoacizi).

Agenii denaturani sunt foarte diferii: temperatur ntre 50-60oC; valori extreme de pH; ureea i guanidina n concentraii mari; ageni tensioactivi; solveni organici.

Deranjarea structurii teriare a moleculelor proteice duce la modificarea proprietilor biologice a acestora. Forma moleculei proteice este determinat att de structura primar, ct i de factorii de mediu. ntr-adevr, aa cum arat White i Anfinsen, tratarea ribonucleazei cu uree 8M n prezena unui agent reductor, - mercaptoetanolul, cauzeaz deplierea complet a moleculei prin ruperea celor patru legturi disulfidice dintre resturile de cistein i n consecin pierderea activitii acestei enzime. ndeprtarea prin dializ a agenilor denaturani duce la refacerea activitii enzimei, ceea ce indic revenirea proteinei la structura teriar iniial.

Prin denaturare, proteinele i pierd proprietile chimice i fiziologice (hormonii devin inactivi, anticorpii pierd capacitatea de a precipita antigenii etc.); n aceast stare, proteinele sunt mai uor atacate de enzime dect n stare nativ.

Hidroliza proteinelor. Sub aciunea acizilor sau bazelor la cald i a enzimelor proteolitice, proteinele sunt hidrolizate prin ruperea legturilor peptidice pn la stadiul de aminoacizi.

Reacii de culoare. Proteinele dau aceleai reacii de culoare ca i aminoacizii din care sunt constituite i pot fi identificate printr-una din acestea.

Reacia xantoproteic. Prin tratarea unei soluii de protein cu acid azotic, la rece sau la cald, apare o coloraie galben datorit formrii unor nitroderivai;

Reacia biuretului. Tratarea unei soluii de protein cu reactiv biuret (o soluie alcalin de sulfat de cupru) se formeaz un complex de culoare violet caracteristic. Reacia este utilizat n practic pentru dozarea proteinelor din snge.

18

Proprietile biochimice i imunologice. Proteinele ndeplinesc n organism diferite roluri cum ar fi, rol catalitic, de rezerv, transportor, protector, structural etc.

1.3.3. Clasificarea proteinelor

Proteinele se clasific n general dup forma moleculelor i dup compoziia lor chimic.

n clasificarea proteinelor dup forma molecular deosebim:

proteine globulare (sferoproteine) care au form aproape sferic (ovoidal) i sunt, n general, solubile n ap, n soluii diluate de acizi, baze i sruri. Din aceast clas fac parte albuminele, globulinele, histonele, protaminele i prolaminele;

proteine fibrilare (scleroproteine), caracterizate prin structur fibroas, de forma unui elipsoid ntins cu raportul dintre axe de cel puin 1 : 100, sunt foarte greu solubile n ap, au vscozitate mare i putere de difuzie mic. Aceste proprieti explic prezena lor n esuturile de susinere. Din aceast clas fac parte colagenul, elastina, fibrinogenul, miozina, actina, keratina etc.

Dup compoziia chimic, proteinele se pot clasifica n:

proteine simple (holoproteine), constituite din aminoacizi;

proteine conjugate (heteroproteine), conin pe lng aminoacizi i o grupare prostetic. n funcie de natura acestei grupri, heteroproteinele se mpart n fosfoproteine, glicoproteine, lipoproteine, metaloproteine, nucleoproteine i cromoproteine.

1.3.3.1. Holoproteine

Albuminele (serumalbumina, lactalbumina, ovalbumina etc.) sunt solubile n ap, coaguleaz la nclzire, au pHi mai mare dect 7 i pot fi precipitate cu o soluie saturat de sulfat de amoniu. Greutatea molecular a albuminelor este cuprins ntre 35.000 i 75.000. Albuminele intr n constituia proteinelor plasmatice (55%), participnd la transportul glucidelor, lipidelor, hormonilor, srurilor biliare, medicamentelor i ionilor (HCO3

-, NO3-, citrat, Ca2+, Mg2+, Zn2+ etc.). Datorit masei moleculare mici i concentraiei

mari, albuminele serice asigur 80% din presiunea coloidosmotic a plasmei.

Globulinele sunt proteine globulare insolubile n ap, solubile n soluii de NaCl 5%. Prin nclzire coaguleaz. Sunt rspndite att n regnul vegetal ct i animal. Dintre globulinele de origine animal amintim globulinele din snge cu greutate molecular de aproximativ 500.000. Din totalul proteinelor plasmatice, 35-45% sunt globuline. Prin

electroforez au fost separate trei fraciuni (, i ), iar prin imunoelectroforez au fost puse n eviden peste 30 fraciuni proteice. Fiecare fraciune ndeplinete un rol bine

definit; toate particip la transportul glucidelor, -, -globulinelelor, la transportul

lipidelor, iar -globulinele au rol n imunitate, motiv pentru care se numesc i imunoglobuline. Imunoglobulinele sau anticorpii apar n serul sanguin sau n alte celule ca rspuns la ptrunderea n organism a unei proteine sau a unei macromolecule provenit de la alt specie, compus care poart numele de antigen.

Structura de baz a anticorpilor a fost elucidat de Porter n 1960. Anticorpii sunt formai din dou lanuri polipeptidice grele (H), cu greutate molecular 53.000-75.000 i

19

dou lanuri uoare (L), cu greutate molecular 23.000, unite prin legturi disulfidice. Lanurile grele au o regiune flexibil care permite rotirea capetelor amino-terminale cu un unghi variabil, ceea ce permite legarea antigenului.

Prin digestia cu papain molecula de imunoglobulin (IgG) poate fi divizat n trei fragmente active cu greutate molecular 50.000. Papaina cliveaz lanurile H n partea constant (C). Dou dintre fragmentele obinute pot lega anticorpul i din acest motiv au fost notate Fab (F de la fragment i ab de la antigen binding), iar al treilea fragment, care leag complementul, Fc.

Fragmentul Fab este format dintr-un lan L i o poriune a captului N-terminal al lanului H. Fragmentul Fc este format din cele dou capete C-terminale ale lanurilor H (Poriunea lanului H incorporat n Fab este notat Fd).

Au fost descrise mai multe tipuri de lanuri L i H. La om au fost evideniate numai

dou tipuri majore la lan L, notate K i , difereniabile serologic sau prin analiza secvenei aminoacizilor. La om aproximativ 70% din lanurile L din Ig sunt de tip K i numai 30% de

tip . O imunoglobulin conine fie dou lanuri uoare K, fie dou , dar niciodat unul K i

unul . Lanul H este unic pentru o clas de Ig, dar au fost identificate cinci tipuri notate: , ,

, , . Fiecare tip de lan H se poate asocia cu lanuri L de tip K sau genernd cele cinci

clase de imunoglobuline: IgG (), IgA (), IgM (), IgD () i IgE (). Pe lanurile

IgG (150.000) 2 Fab (50.000) + Fc (50.000)Papaina

20

polipeptidice ale Ig sunt ataate resturi glucidice (IgG conine dou resturi monozaharidice i IgM trei resturi).

Scleroproteinele sunt proteine fibrilare, de consisten solid, ntlnite numai n regnul animal, avnd rol de susinere i protecie, au un coninut mai sczut de azot fa de alte proteine, dar au un coninut crescut de sulf. Scleroproteinele sunt total insolubile n ap, n soluii acide i bazice i sunt stabile fa de aciunea enzimelor proteolitice.

Dup rolul pe care l ndeplinesc i dup esutul n care au fost identificate scleroproteinele se mpart n:

Keratine se gsesc n epiderm, pr, unghii, pene, coarne etc. i au rol de protecie. Au un coninut mare de sulf (2-5,7%) datorit proporiei mari de cistein. Graie prezenei legturii disulfidice keratinele au o rezisten mecanic mare, elasticitate i rezisten la aciunea enzimelor proteolitice i sunt insolubile.

Colagenele au coninut mare de glicocol, prolin, hidroxiprolin i hidroxilizin, avnd o structur cu totul caracteristic, adaptat funciei esuturilor din care fac parte: tendoane, ligamente, oase, cartilagii, piele. Ele reprezint 25% din proteinele corpului omenesc.

Colagenele sunt insolubile n ap, dar prin fierbere ndelungat se transform n gelatin solubil, n care o parte din legturile peptidice au fost hidrolizate. Colagenele sunt rezistente la aciunea enzimelor proteolitice (cu excepia colagenazei), n timp de gelatina poate fi hidrolizat cu pepsin i tripsin.

Elastinele se aseamn cu colagenul, ntlnindu-se alturi de acestea n esutul conjunctiv, dar ele nu pot fi gelificate. Coninutul ridicat de glicocol, alanin i valin imprim acestei proteine o elasticitate comparabil cu a cauciucului. Elastinele sunt hidrolizate specific de elastaza pancreatic.

Fibrinogenul este o protein fibrilar format din ase lanuri polipeptidice unite prin puni disulfidice. Din cauza dimensiunilor mari ale moleculei, n condiii fiziologice, fibrinogenul trece n cantiti foarte mici prin peretele capilarelor n lichidul interstiial. n inflamaii, din cauza alterrii permeabilitii capilarelor, trecere fibrinogenului este mult facilitat.

Fibrinogenul este sintetizat n ficat i este degradat n macrofage i are timpul de njumtire de 3-5 zile. Sub aciunea enzimatic a trombinei i a ionilor de calciu, fibrinogenul se transform ntr-o protein fibrilar insolubil, denumit fibrin. Fibrina formeaz o reea spaial n care sunt nglobate elementele figurate ale sngelui, formnd cheagul sanguin.

Miozina se gsete n cantitate de 40-60% n miofibrele esutului muscular. Miozina este insolubil n ap, dar solubil n soluii alcaline diluate. n structura miozinei intr aminoacizi diaminici i dicarboxilici ceea ce explic prezena a numeroase grupri polare ce i confer capacitatea de a fixa ioni metalici.

Prin combinare cu actina n proporie de 3/1, formeaz actomiozina. Actina reprezint 15% din proteinele musculare. Att miozina ct i actina au

activitate ATP-azic i joac rol esenial n contracia muscular. Tropomiozina reprezint 2,5% din totalul proteinelor musculare, avnd rol n

contracia muscular.

21

1.3.3.2. Heteroproteine

Fosfoproteinele sunt proteine conjugate care au drept grupare prostetic acidul fosforic legat prin legtur esteric de gruparea hidroxil a unui rest de serin din molecula proteic. Acidul fosforic se gsete sub forma srii sale de Ca sau K.

Dintre fosfoproteine fac parte:

caseina , principala protein din lapte (80%). ovovitelina prezent n glbenuul de ou alturi de lecitine. Ea furnizeaz

embrionului aminoacizii i fosforul necesar dezvoltrii.

Glicoproteinele formeaz o categorie de heteroproteine care au drept grupare prostetic o component glucidic; partea proteic imprim caracterul ei chimic ntregii molecule, ceea ce le deosebete de mucopolizaharide unde componenta glucidic predomin i imprim moleculei caracter glucidic.

Lipoproteinele sunt complexe ale proteinelor cu lipidele. Dup rolul pe care l ndeplinesc, lipoproteinele se mpart n dou categorii: lipoproteine de transport i sistemele de membran.

Plasma uman conine patru clase principale de particule lipoproteice care difer ntre ele prin densitate, constant de sedimentare i mrimea particulelor, prin tipurile de proteine i proporia de lipide coninute. Sunt particule sferice de mrimi diferite, formate dintr-un miez nepolar (trigliceride i esteri de colesterol) nvelit cu un strat de 2 nm constituit din colesterol liber, fosfolipide i apoproteine. Aceste particule sunt solubile n plasm i servesc la transportul lipidelor ntre diverse esuturi.

Metaloproteinele sunt combinaii complexe ale proteinelor cu ionii metalici: Fe, Cu, Zn, Mg, Mn etc. i particip n organism fie n transportul acestor metale, fie n cataliza enzimatic.

Feritina conine 20-25% fier trivalent (aproape cte un atom de Fe pentru fiecare legtur peptidic) legat de o protein numit apoferitina. Feritina constituie rezerva de fier pentru sinteza hemoglobinei i citocromilor. Se gsete n special n ficat i splin.

Siderofilina (transferina) este un transportor al Fe pentru sinteza hemoproteinelor

(fixeaz doi atomi de Fe/molecul). Ea este sczut n anemia feripriv; Ceruloplasmina conine aproximativ 0,34% Cu (opt atomi/molecul). Este o

glicoprotein care migreaz cu fraciunea 2-globulinic, are o greutate molecular de 150.000. Ceruloplasmina nu transport ionii de cupru, dar are rol n absorbia Fe, putnd oxida fierul bivalent la fier trivalent i funcioneaz ca o polifenoloxidaz. Concentraia plasmatic de ceruloplasmin crete n inflamaii.

O

NH CO CH NH CO

CH2

P OO

O

Ca2+

_

O K+

NH CO CH NH CO

CH2

P OO

O K+

_

_

_

22

Hemocianinele sunt pigmeni respiratori din sngele molutelor. Ele conin Cu i au greutate molecular de aproape 10 milioane.

Metaloproteinele cu Zn sunt n general enzime: alcool-dehidrogenaza, carbonic-anhidraza, uricaza etc.

Cromoproteine Cromoproteinele sunt proteine conjugate care au drept grupare prostetic, o grupare

cromofor. Dup natura acestei grupri, se disting dou mari clase de cromoproteine: porfirinice care conin un nucleu tetrapirolic i neporfirinice, conin drept grupare prostetic derivai de izoaloxazin sau carotene (vezi vit. B2 i A).

Dintre cromoproteinele neporfirinice deosebit de importante sunt flavoproteinele care

au drept grupare prostetic o flavin (derivat de izoaloxazin) i care ndeplinesc n organism rol catalitic, precum i carotenoproteinele, a cror grupare prostetic este un derivat terpenic (carotenii). Acestea din urm, sunt importante n procesul vederii.

Cromoproteinele porfirinice conin n molecul un nucleu substituit de porfirin. Ele ndeplinesc diverse funcii biologice, cum ar fi: transportul de oxigen, transportul de electroni, cataliza enzimatic.

Specificitatea de funcie a acestor proteine se datoreaz apoproteinei legate de nucleul porfirinic. Sunt reprezentate de mioglobin, hemoglobin, citocromi, hemenzime.

Porfirinele sunt derivai de porfirin, un compus ciclic format din patru nuclee pirolice unite prin grupri metinice (-CH=).

Prin substituirea atomilor de hidrogen din poziiile 1-8 cu diferii radicali se obin

porfirinele, care se denumesc i se clasific n funcie de aceti substitueni n: etioporfirine, mezoporfirine, protoporfirine i coproporfirine. Dintre acestea cel mai des ntlnite sunt protoporfirinele care conin patru grupri metilice, dou grupri vinil i dou resturi de acid propionic. Datorit celor trei tipuri de substitueni din molecul, pot exista 15 forme izomere de protoporfirine. Cea mai nsemnat dintre ele este protoporfirina IX (1,3,5,8-tetrametil-2,4-divinil-6,7-dipropionil-porfirina).

Porfirinele posed un sistem de duble legturi conjugate ce confer acestor compui stabilitate, culoare roie-violet, absorbia caracteristic i fluorescen. Reducerea gruprilor metinice duce la formarea de compui necolorai, numii porfirinogeni. Prin intermediul azotului pirolic, porfirinele pot fixa ioni metalici cum sunt: Fe, Mg, Zn, Cd, Co, Cu, Mn, V

sub form de compleci chelatici. Un astfel de complex al protoporfirinei IX cu Fe2+ se

23

numete protohem sau hem, un complex similar cu Fe3+ poart numele de hemin sau hematin.

Protoporfirina IX Hem

Fierul are ase poziii de coordinare care sunt ndreptate spre vrfurile unui octoedru regulat. n hem, atomul de Fe se leag de inelele II i IV prin legturi ionice, realizate prin ndeprtarea celor doi atomi de H de la azot sub form de H + i de dou legturi coordinative cu atomii de azot din ciclurile I i III. Celelalte dou poziii, 5 i 6, sunt perpendiculare pe planul determinat de cele patru legturi ale fierului cu nucleele pirolice i sunt libere. Dac aceste poziii sunt ocupate, compusul rezultat se numete hemocrom sau hemocromogen.

Hemul este situat ntr-o cavitate a moleculei proteice. Cele dou resturi propionat, ionizate la pH fiziologic, sunt orientate spre suprafa, iar restul hemului n interiorul cavitii, nconjurat de aminoacizi nepolari, cu excepia a dou resturi de histidin prin care se face legtura cu partea proteic. Un rest de histidin situat n segmentul F (HisF8) numit histidin proximal se fixeaz pe poziia 5 de coordinare a Fe2+. Cellalt rest HisE7, numit histidin distal se leag de hem prin intermediul unei molecule de ap (formele neoxigenate de mioglobin i hemoglobin). Legtura este labil i se desface uor n procesul de fixare a oxigenului, acesta nlocuind molecule de ap (formele oxigenate ale mioglobinei i hemoglobinei).

24

Mioglobina este pigmentul rou din muchi, similar hemoglobinei ca structur i rol; diferena dintre ele const n structura globinei. Globina mioglobinei este alctuit dintr-un singur lan polipeptidic, format din 150 aminoacizi, cu o greutate molecular de aproximativ 17.200, pliat sub forma unui ghem cu dimensiunile 45/35/25 . Mioglobina are o afinitate fa de oxigen de aproximativ 6 ori mai mare dect hemoglobina. Cantiti mari de mioglobin se gsesc n muchiul inimii i muchii pectorali ai psrilor care efectueaz micri ritmice de lung durat.

Hemoglobinele reprezint pigmentul rou al sngelui. Ele au aceeai grupare prostetic (hemul), dar difer n privina prii proteice, globina. Globina imprim specificitatea diferit a hemoglobinelor.

Structura hemoglobinei a fost elucidat de Perutz prin difracia razelor X i

spectre ORD (dispersia rotaiei optice). Lanurile i au o structur

asemntoare, aproximativ 70% din molecul formnd poriuni de -helix ntrerupte de poriuni ndoite ca n molecula de mioglobin. Conformaia tridimensional a lanurilor este asigurat prin legturi van der Waals ce se stabilesc ntre resturile nepolare ale aminoacizilor. Legturile polare sunt orientate spre mediul apos ceea ce explic solubilitatea hemoglobinei. Catenele polipeptidice sunt orientate aa fel, nct, formeaz ntre ele o cavitate n care este inclus molecula de hem. Legarea hemului de globin se face prin intermediul a dou resturi de histidin.

Cele patru lanuri din Hb sunt asamblate ntr-un tetramer compact (structur cuaternar), rezultnd o molecul cu dimensiunile 64/55/52 . ntre lanurile identice se realizeaz legturi polare stabilite ntre grupele terminale

NH3+ i COO-, iar ntre lanurile diferite ( i ) se stabilesc legturi de hidrogen

i Van der Waals pe poriuni mari ale acestor lanuri. Citocromii sunt pigmeni respiratori care au drept grupare prostetic tot

hemul, dar poziiile 5 i 6 de coordinare ale Fe sunt ocupate de resturi de aminoacizi din molecula proteic. Din acest motiv, citocromii nu pot participa la transportul O2, dar particip la transportul electronilor prin modificarea reversibil a valenei atomului de fier:

Se cunosc mai multe grupe de citocromi notate a, b i c. n forma lor

redus, citocromii dau benzi de absorbie caracteristice (, i ) n spectrul vizibil. Marea majoritate a citocromilor sunt puternic legai de membrana mitocondrial i nu pot fi separai cu uurin.

25

Hemenzimele sunt reprezentate de catalaze i peroxidaze care catalizeaz reacia de descompunere a apei oxigenate dup ecuaia:

AH2 + H2O2 2 H2O + A

Cloroplastele sunt pigmeni fr funcie respiratorie care conin drept grupare prostetic clorofila. Clorofila are o structur porfirinic avnd n centrul ei ionul de Mg legat prin dou covalene de dou nuclee pirolice.

Nucleoproteine Nucleoproteinele sunt o clas de heteroproteine care au drept grupare

prostetic un acid nucleic ataat la o histon sau o protamin. Ele se gsesc n toate esuturile animale i vegetale i pot fi izolate cu uurin din drojdii i unele esuturi ale cror celule au nuclee mari, cum este glanda timus.

Nucleoproteinele sunt constituenii principali ai nucleului celular (de unde vine i numele lor), dar pot fi gsite i n citoplasm asociate cu ribozomii. Virusurile sunt constituite aproape numai din nucleoproteine.

Nucleoproteinele pot fi izolate din esuturi prin extracie (cu ap, soluii alcaline diluate, soluii de clorur de sodiu i soluii tampon cu pH = 4,0-11,0), urmat de precipitarea cu acizi, soluie saturat de sulfat de amoniu sau soluie diluat de CaCl2.

Prin hidroliz acid sau bazic, nucleoproteinele se descompun n baze azotate, pentoze, acid fosforic i proteine.

Nucleotide. Un nucleotid, unitatea structural a acizilor nucleici, este format dintr-un nucleozid fosforilat la una din gruprile OH din riboz sau deoxiriboz.

Baza azotat\ ^ pentoz\ ^ acid fosforic

Nucleozid

Nucleotid

Baze azotate(Purinice, pirimidinice)

Pentoze(Riboz\ , Deoxiriboz\)

Nucleozidaze

Nucleoproteine

Acid fosforicNucleozide

Mononucleotidaze

Mononucleotide

Nucleaze

Acizi nucleici(Polinucleotide)

Proteine simple(Histone, protamine)

26

De exemplu: Adenina + Riboza + Acid fosforic Acid adenilic (AMP)

Guanina + Riboza + Acid fosforic Acid guanilic (GMP)

Citozina + Riboza + Acid fosforic Acid citidilic (CMP)

Uracil + Riboza + Acid fosforic Acid uridilic (UMP)

Timina + d-Riboza + Acid fosforic Acid timidilic (TMP)

Exist dou tipuri generale de nucleotide: ribonucleotide, care conin riboz i intr n structura acizilor ribonucleici i deoxiribonucleotide, care conin deoxiriboz i intr n structura acizilor deoxiribonucleici.

Radicalul fosfat se ataeaz n poziia 5 sau 3 (notaia atomilor din ciclul pentozei se face de la 1 la 5, acesta fiind ciclul secundar n molecula acestor compui).

P

O

HO OH

O

HH H H

OH O

CH2OH

N

N

N

N

NH2

3'

5'

P

O

HO OH

3'

5'O

H

H

H HH

O

CH2OH

N

N

N

N

NH2

Acid adenilic

3'-AMPAcid deoxiadenilic

3'-dAMP

Acid citidilic

3'-CMP

P

O

HO OH

O

HH H H

OH O

CH2OH

N

N

NH2

O

Acid timidilic

3'-dTMP

P

O

HO OH

O

H H H H

H O

CH2OH

N

NO

H

O

CH3

27

Nucleozidele purinice i pirimidinice pot fi esterificate cu o singur molecul de acid fosforic, formnd nucleozid-monofosfai (MP), cu dou molecule de acid fosforic, nucleozid-difosfai (DP) i cu trei molecule de acid fosforic, nucleozid-trifosfai (TP). De exemplu, adenina formeaz adenozin-5-monofosfat (AMP), adenozin-5-difosfat (ADP) i adenozin-5-trifosfat (ATP).

Nucleozid-trifosfaii ndeplinesc n organism funcii importante. Astfel, ATP poate transporta i ceda resturi de fosfat i pirofosfat n acele reacii enzimatice care necesit energie. Cedarea energiei se face prin hidroliza legturilor fosforice cu energie mare din molecula acestui compus, legturile dintre gruprile fosforice sunt macroergice deoarece sunt legturi de anhidrid. Refacerea moleculei de ATP se realizeaz prin refosforilarea ADP-ului n procesul de fosforilare oxidativ.

De asemenea, GPT, UTP i CTP pot furniza energie pentru unele ci de biosintez (UTP n sinteza polizaharidelor, GTP n sinteza proteinelor, iar CTP n sinteza lipidelor). n unele reacii de fosforilare particip IDP i ITP n structura crora intr hipoxantina.

N

NN

N

NH2

O

OH OH

H H

H

H2C

H

O P

O-

O

O P

O-

O

O-O P

O-

O

AMP

ADP

ATP

28

2. ENZIME

Organismele vii, mono- i pluricelulare sunt caracterizate prin unele activiti ca: micare, producere de energie, lumin etc., activiti care au la baz reacii chimice. Organismele vii sunt supuse primului principiu al termodinamicii, adic legii conservrii masei i energiei. Energia pentru sinteza moleculelor complexe din elemente sau molecule mai mici este furnizat prin degradarea moleculelor complexe n intermediari i compui mai simpli. n consecin este necesar cuplarea celor dou aspecte ale metabolismului (anabolism i catabolism) printr-un transfer de energie. O reacie chimic de forma

A + B C + D poate avea loc cnd o parte din moleculele A i B se gsesc ntr-o stare de energie ridicat, stare activat (stare de tranziie) n care exist o mai mare probabilitate ca legturilor din compuii A i B s se rup i s se formeze produii C i D. starea de tranziie este o barier nalt de energie care delimiteaz reactanii de produii de reacie. Viteza unei astfel de reacie este proporional cu moleculele aflate n stare de tranziie (activat). Exist dou posibiliti de accelerare a reaciei chimice:

- creterea temperaturii ce favorizeaz agitaia molecular, creterea numrului de molecule activate i accelerarea vitezei de reacie care n cele mai multe reacii este aproximativ dubl pentru o cretere a temperaturii cu 10oC;

- utilizarea catalizatorilor. Catalizatorul se combin temporar cu reactanii determinnd scderea energiei de

activare. Cu ct energia de activare va fi mai mic cu att catalizatorul va fi mai eficace. De exemplu, descompunerea apei oxigenate:

2 H2O2 2 H2O + O2

Necatalitic, are loc cu un consum de energie, G = 18 Kcal/mol; n prezena

catalizatorului de Pt coloidal, G = 13 Kcal/mol; iar n prezena enzimei, catalaza, numai 2 kcal/mol.

O reacie chimic este endergonic (endoterm) dac variaia energiei libere este pozitive, deci necesit un aport de energie i exergonic (exoterm) cnd variaia energiei libere va fi negativ, deci va rezulta energie.

n timpul unei reacii, catalizatorul sufer o serie de modificri, dar odat reacia terminat, acesta revine la starea iniial.

Enzimele sunt catalizatori proteici pentru reaciile chimice care se petrec n sistemele biologice. n absena enzimelor, majoritatea reaciilor din celula vie s-ar petrece cu viteze foarte mici.

Spre deosebire de catalizatorii neproteici (ioni metalici, H+, OH-) fiecare enzim catalizeaz un numr mic de reacii, de cele mai multe ori, una singur.

Exist un numr foarte mare de enzime; pentru fiecare compus organic, ct i pentru muli compui anorganici, exist mcar o enzim capabil s reacioneze cu acesta i s catalizeze o anumit modificare chimic.

29

2.1 Nomenclatura i clasificarea enzimelor Numele tiinific al unei enzime se formeaz astfel: Donor: Acceptor reacia

catalizat. De exemplu: enzima responsabil de oxidarea alcoolului etilic se numete Alcool: NAD+-oxireductaz.

Pe lng denumirea tiinific, se utilizeaz acea denumire uzual, care este n acord cu numele tiinific. Denumirea uzual este format din dou pri: prima parte indic substratul sau substratelor asupra crora acioneaz enzima, iar partea a doua indic reacia catalizat. De exemplu, alcool: NAD+-oxireductaza se numete curent alcool-dehidrogenaza (ADH).

innd seama de reacia catalizat, enzimele se clasific n ase clase: 1. Oxidoreductaze catalizeaz reaciile de oxido-reducere; n funcie de

acceptorul de electroni se pot distinge:

oxidaze transfer electronii de la un substrat direct la oxigen; dehidrogenaze transfer electronii de la un substrat la alt substrat (altul

dect oxigenul); oxigenaze ncorporeaz direct oxigenul n substrat; peroxidaze transfer electronii de la substrat la H2O2 ca acceptor. 2. Transferaze catalizeaz transferul de grupri de pe un substrat (donor) pe alt

substrat (acceptor).

C1-transferaze transfer uniti de un atom de carbon ntre substrate (exemplu: metil-transferaze);

amino-transferaze transfer gruparea amino de pe un aminoacid pe un cetoacid (transaminazele);

kinaze transfer un radical fosfat din ATP pe un substrat; fosforilaze transfer radicalul fosfat din fosfat anorganic (Pa) pe un

substrat.

3. Hidrolaze catalizeaz scindarea legturilor chimice cu ajutorul apei: fosfataze ndeprteaz radicalul PO3H2- de pe un substrat; fosfodiesteraze cliveaz legturile fosfatdiesterice, cum ar fi cele din acizii

nucleici;

proteaze scindeaz legturile peptidice din proteine. 4. Liaze catalizeaz scindarea nehidrolitic a unei grupri de pe un substrat cu

formarea unei duble legturi sau fixeaz o grupare la o dubl legtur: decarboxilaze ndeprteaz CO2 de pe substrat; aldolaze formeaz aldehide n reacii de eliminare; sintaze leag dou molecule fr implicarea ATP-ului. 5. Izomeraze catalizeaz reaciile de interconversiune a izomerilor optici,

geometrici i de caten: racemaze i epimeraze catalizeaz interconversiunea stereoizomerilor L i

D;

mutaze transfer grupri ntre atomii aceleiai molecule; cis-trans-izomeraze interconversiunea izomerilor geometrici; izomeraze care catalizeaz reacia aldoz cetoz.

30

6. Ligaze sau sintetaze unirea a doi compui utiliznd energia eliberat prin hidroliza unei molecule de ATP.

2.2. Structura enzimelor

Specificitatea mare a unei enzime este strns legat de structura ei fizic i chimic specific. Din punct de vedere chimic, o enzim este format dintr-o parte proteic apoenzima i o parte neproteic coenzima sau cofactor.

Partea proteic este termolabil i este responsabil de specificitatea enzimei, de aciune, dar mai ales de substrat, iar coenzima este termostabil i dializabil.

Apoenzima. Enzimele simple i apoproteinele enzimelor complexe sunt formate din catene lungi polipeptidice, avnd aceleai nivele de organizare structural ca i alte proteine: primar, secundar, teriar i cuaternar.

Dei toate enzimele au structuri primare, secundare i teriare, structura cuaternar nu este obligatorie.

Coenzime. Coenzima este partea neproteic, care particip efectiv la reacia catalitic (se modific temporar n timpul reaciei). Frecvent, coenzimele conin n structura lor vitamine din grupul B.

2.3. Izoenzime forme moleculare multiple ale aceleai enzime. Ele catalizeaz aceeai reacie enzimatic, dar difer ntre ele n privina proprietilor fizice, chimice i imunologice.

Interesul medical pentru izoenzime a fost stimulat prin descoperirea n 1957, n serul uman, a mai multor izoenzime LDH, a cror proporii relative se modific semnificativ n anumite stri patologice.

Cele 5 izoenzime LDH difer ntre ele n ceea ce privete structura cuaternar. Molecula activ de LDH este un tetramer (130.000) format din dou tipuri de subuniti H i M luate cte patru (fiecare subunitate are 34.000).

Subunitatea H (heart) este caracteristic muchiului inimii i n general esuturilor cu metabolism aerob, iar subunitatea M (muscle) este caracteristic muchiului scheletic i n general organelor i esuturilor cu metabolism anaerob. Excepie fac ficatul i eritrocitul.

Structura celor 5 izoenzime LDH este:

LDH1 - H4

LDH2 - H3M1

LDH3 - H2M2

LDH4 - HM3

LDH5 - M4

Sinteza celor dou tipuri este coordonat de dou gene diferite. Ulterior au fost evideniate izoenzime i pentru alte enzime creatin-kinaza

CK1(BB); CK2(MB) i CK3 (MM), hexo-kinaza, fosfataza alcalin etc.

31

2.4. Specificitatea enzimelor

Dup specificitate de aciune enzimele pot fi grupate n: enzime cu specificitate absolut, enzime cu specificitate relativ i enzime cu specificitate optic sau stereochimic.

Specificitatea absolut. Unele enzime acioneaz numai asupra unui singur substrat, cataliznd o singur reacie, de exemplu ureaza:

Aceast enzim este total inactiv fa de compui foarte asemntori structural tioureea H2N-CS-NH2. De asemenea, arginaza enzima care catalizeaz hidroliza L-argininei la uree i ornitin nu poate cataliza hidroliza esterul metilic al argininei sau scindarea agmatinei, amina rezultat prin decarboxilarea argininei.

Specificitatea relativ. Multe enzime sunt specifice numai pentru anumite tipuri de legturi chimice indiferent de structura moleculelor respective.

Din acest grup fac parte esterazele care fac posibil scindarea mono-, di- trigliceridelor i chiar ali esteri cu structur chimic mult mai complicat. De exemplu, acetilcolinesteraza, specific pentru acetil-colin, poate scinda i ali esteri ai colinei cu acizii propionic, butiric etc. Butiril-colina pare a fi substratul de elecie, fiind hidrolizat mai rapid dect ali esteri ai colinei.

Enzimele proteolitice care hidrolizeaz legturile peptidice din proteine i din ali compui neproteici, fac parte tot din acest grup.

Specificitatea optic. Enzimele catalizeaz transformarea numai a unui stereoizomer; specificitatea optic este de obicei absolut, cellalt antipod optic rmnnd neschimbat. Excepie fac racemazele care catalizeaz interconversiunea antipozilor optici.

Enzimele care recunosc substrate cu izomeri geometrici au o specificitate

geometric. Fumaraza, de exemplu, permite hidratarea acidului fumaric (izomer trans) i nu a

acidului maleic (izomer cis) cu formarea acidului malic ca produs final:

2.5. Centrul catalitic al enzimei

Structura binar a enzimelor este indispensabil aciunii catalitice. Luate separat, att coenzima ct i apoenzima nu au activitate catalitic.

Centrul catalitic a fost conceput mult vreme ca un tipar rigid, preformat, substratul potrivindu-se n enzim ca i cheia n broasc (lock and key) sau template (modelul Fischer). Dei n acest model centrul activ este rigid, el se mai folosete nc

H2N C NH2

O

+ H2Oureaza

2 NH3 + CO2

HOOC C C COOH

H

HH2O

HOOC CH

OH

CH2 COOHFumaraza

32

pentru explicarea unor proprieti enzimatice, cum ar fi legarea ntr-o anumit ordine a substratelor sau curba de saturare cu substrat.

Un model mai perfecionat este cel imaginat de Koshland, numit induced fit

(fixare indus), modelul cu cel mai puternic suport experimental. Principala caracteristic a acestui model este flexibilitatea centrului activ. n absena substratului gruprile catalitice i de legare a substratului sunt deprtate unele de altele, separate de mai multe resturi de aminoacizi. Apropierea substratului induce o modificare

conformaional a enzimei nct gruprile care particip la legarea substratului sau la reacia catalitic se apropie spaial.

Situsul (centrul) activ dintr-o enzim poate fi pus n eviden prin tratarea cu anumite substane ce au capacitatea de a se combina specific cu aminoacizii centrului catalitic, inactivnd enzima.

2.6. Factori care influeneaz activitatea enzimatic

Influena concentraiei enzimei Dac se utilizeaz concentraii crescnde de enzim cantitatea de substrat

transformat n unitatea de timp crete proporional cu concentraia enzimei.

Influena concentraiei substratului asupra vitezei de reacie

33

Dac se menine constant concentraia de enzim i se mrete concentraia de substrat S, se constat o cretere rapid a vitezei de reacie pn la o valoare limit (vmax). Dac [S] continu s creasc, curba capt o inflexiune i pentru valori mari de S, viteza nu mai crete, curba tinde asimptotic ctre o valoare maxim

(vmax).

Crescnd n continuare concentraia substratului viteza reaciei rmne constant deoarece nu mai exist enzim liber. Transformarea substratului n produs (produi) de reacie are loc cu formarea, pentru scurt timp, a unui complex enzim-substrat.

Ipoteza formrii complexului ES a fost emis prima dat de Michaelis. Existena acestui complex a fost demonstrat practic prin analiza spectrelor de absorbie n ultraviolet, vizibil, rezonan magnetic nuclear, fluorescen sau prin dializ.

Cantitatea de produs P format depinde direct de concentraia complexului ES, care depinde de viteza de descompunere a compusului ES n E + S. Aplicnd legea aciunii maselor pentru reaciile de echilibru se obine relaia:

Cnd toat enzima a fost fixat sub form de complex ES, se atinge viteza maxim a reaciei.

KM = [S] (3) care a primit numele de constanta Michaelis, definit drept concentraia substratului pentru care se atinge jumtate din viteza maxim.

Cnd numai jumtate din enzim este trecut n form [ES] i [E] =[ES] se atinge jumtate din viteza maxim vmax i relaia (2) devine:

Influena temperaturii asupra activitii enzimatice Viteza de reacie crete cu creterea temperaturii, dar n anumite limite. Studiul

vitezei iniiale a unei reacii enzimatice n funcie de temperatur determin apariia a dou faze distincte care corespuns la dou fenomene diferite:

E + S ESK1

K2

K3E ^ P (1)

K2[E] [S]

[ES]= (2)

34

- n zona de temperaturi mai mici (0 i 40oC) viteza reaciei crete cnd temperatura crete. Aceast cretere a vitezei cu temperatura se explic printr-o cretere a concentraiei complexului activat (intermediar) atunci cnd se furnizeaz mai mult energie sub form termic sistemului n reacie.

- la o temperatur ce depete 45oC se asist la o denaturarea a proteinei. Temperatura optim pentru cele mai multe enzime este de 30oC 40oC.

Exist microorganisme termofile care triesc n ap la 70oC 80oC i a cror enzime sunt active la aceast temperatur. La 0oC unele enzime i nceteaz reversibil activitatea, aceast temperatur constituind temperatura de conservare pentru unele enzime.

Influena pH-ului Variaiile de pH pot avea efecte att la nivelul enzimei, ct i la nivelul

substratului. Astfel, se poate modifica gradul de ionizare a unor grupri funcionale de pe enzim a cror sarcin pozitiv sau negativ este necesar fie formrii complexului enzim-substrat, fie meninerii conformaiei tridimensionale native a protein-enzimei. De asemenea, la nivelul substratului poate fi modificat gradul de ionizare mpiedicnd sau favoriznd formarea complexului enzim-substrat. Valoarea pH-ului la care reacia enzimatic se desfoar cu vitez maxim se numete pH optim.

35

pH-ul optim pentru cele mai multe enzime are valori cuprinse ntre 6 i 8. Excepie fac enzimele digestive, pepsina (pH=1,5-2), arginaza (pH= 9,5-10).

Influena efectorilor asupra activitii enzimelor Efectorii sunt substane care mresc sau scad aciunea catalitic a enzimelor.

Acetia pot fi activatori sau inhibitori. Activatorii sunt compui de natur organic sau anorganic care n

concentraii mici mresc viteza unei reacii enzimatice atunci cnd se gsesc n mediul de reacie.

O serie de ioni metalici, cum ar fi K, Cu, Fe, Mg, Mn, Co, Mo, au efecte pozitive

asupra unor reacii enzimatice. Fe, Mo, Cu particip n reaciile de oxido-reducere, Mg este necesar n reaciile de transfer ale gruprii fosfat, iar Ca este necesar n reaciile enzimatice ce intervin n coagularea sngelui.

Inhibitorii enzimatici sunt compui care diminueaz sau anihileaz activitatea enzimelor. Ei au compoziie chimic i mod de aciune diferit. Printre substanele capabile s se fixeze pe diferite grupri din proteine (hidroxil, sulfhidril, carboxil) i s modifice proprietile catalitice, fie prin modificarea conformaiei, fie prin blocarea centrului activ al enzimei, se gsesc ionii metalelor grele, sau compui cum sunt acidul monoiodacetic sau acidul paraclormercuri-benzoic care reacioneaz cu gruprile -SH din enzime.

- Inhibitorii competitivi sunt compui care prezint o analogie structural cu substratul enzimei i pot intra n competiie cu acesta pentru a se fixa pe locul activ al enzimei. Enzima se poate combina fie cu substratul, fie cu inhibitorul formnd complexele ES i EI:

Este clar c enzima angajat n complexul EI nu poate funciona ca un catalizator, numai complexul ES va permite formarea produilor de reacie.

Inhibiia depinde de concentraia substratului, inhibitorului, de afinitatea enzimei pentru substrat i pentru inhibitor.

La adugarea de cantiti mari de substrat inhibitorul este deplasat din centrul catalitic al enzimei, care va fi ocupat de substrat, iar viteza de reacie va reveni la valoare maxim ca i n absena inhibitorului.

Inhibiia competitiv are numeroase aplicaii practice, n special n terapeutic. Exemplul clasic este cel al sulfamidelor, analogi structurali ai acidului para-

aminobenzoic:

E

ES

EI

E + P

PX

H2N COOH H2N SO2 NH2

acid para aminobenzoic sulfonamid\

36

Sulfamidele intr n competiie cu acidul p-aminobenzoic i inhib producerea de acid folic necesar creterii bacteriilor.

Chimioterapia anticanceroas face apel la numeroi antimetabolii, n general analogi structurali ai bazelor purinice sau pirimidinice, permind inhibiia biosintezei acizilor nucleici i blocarea diviziunii celulare.

- Inhibitorii necompetitivi se fixeaz fie pe enzim (dar ntr-un loc diferit de locul activ), fie pe complexul ES pentru a forma un complex ESI, fie pe amndou.

Locul activ ale enzimei i pierd capacitatea de a reaciona cu substratul datorit unui fenomen de mpiedicare steric. Gradul de inhibiie depinde de concentraia inhibitorului i de afinitatea enzimei pentru inhibitor. Exemple de inhibitori necompetitivi sunt cianurile, care se combin cu unele metale necesare activitii enzimei (Fe2+, Fe3+) cu care formeaz complexe inactive asemntoare cu fero- sau fericianurile.

Unele metale grele (Hg, Pb, Cu, Ag) sunt inhibitori deoarece se combin cu gruprile SH ale enzimei formnd mercaptide

Enzim-SH + Ag+ Enzim-S-Ag + H+ Agenii chelatani de tipul acidului etilendiaminotetraacetic (EDTA) leag Mg2+

sau Ca2+.

Efectori alosterici

Activitatea catalitic a enzimelor poate fi alterat i de compui care se fixeaz pe enzim n locuri ndeprtate de centrul activ (loc alosteric). Aceti compui pot crete activitatea catalitic i se numesc efectori pozitivi, sau pot reduce activitatea catalitic i se numesc efectori negativi.

Enzimele alosterice au o structur cuaternar, oligomer, formate dintr-un numr variabil de monomeri legai prin legturi necovalente.

n afara situsului catalitic unde se fixeaz substratul, aceste enzime posed unul sau mai multe situsuri alosterice, care pot fi situate pe acelai lan polipeptidic unde se afl i centrul activ dar n zone diferite.

- Activatorii alosterici se fixeaz la locul alosteric determinnd o modificare a conformaiei enzimei, numit tranziie alosteric, care antreneaz o modificare a conformaiei la nivelul situsului catalitic. Acest situs determin o conformaie mai propice pentru fixarea substratului, crescnd afinitatea enzimei pentru substrat.

Legarea unui inhibitor alosteric produce o modificare conformaional care mpiedic legarea substratului la locul activ (locul activ este deformat) i enzima este inhibat.

2.7. Reglarea metabolismului

Reaciile catalizate de enzime au loc cu viteze anumite, determinate de concentraia enzimei, a substratului, pH-ului, temperaturii etc. Aceste reacii nu sunt independente unele de altele, ele sunt grupate i se succed formnd ci metabolice care funcioneaz simultan i n mod coordonat calitativ i cantitativ.

37

Principalele mecanisme prin care se moduleaz activitatea enzimelor dintr-o cale metabolic sunt reprezentate de: reglarea alosteric, transformarea pre-enzimelor inactive n enzime active i sinteza de noi molecule de enzime.

Reglarea alosteric este mecanismul cel mai complex al coordonrii metabolice. Enzimele implicate n aceast reglare sunt enzime alosterice.

n unele ci metabolice, unul din produii de reacie poate inhiba prima enzim din calea respectiv:

Transformarea substratului A n produsul final G are loc printr-o succesiune de reacii catalizate de diferite enzime. Acumularea de produs G n exces, n celule, determinnd inhibiia enzimei E1 care catalizeaz transformarea substratului A n produsul B, considerat etap limitant a succesiunii de reacii enzimatice.

Acest tip de inhibiie se numete inhibiie prin produs final, inhibiie feed-back sau retroinhibiie

Reglarea covalent Un grup mare de enzime i regleaz activitatea prin adiia sau ndeprtarea unei

grupri fosfat la un rezidiu de serin, treonin, tirozin. Fosforilarea se face pe baza ATP-ului, n prezena unei familii de enzime, denumite kinaze, iar defosforilarea se face n prezena apei i a unor fosfataze.

Rspunsul la fosforilare este diferit funcie de enzima fosforilat. Astfel, n urma fosforilrii, unele enzime se activeaz (glicogen fosforilaza), iar altele sunt inhibate (glicogen sintetaza).

n metabolismul glicogenului, n momentul fosforilrii, sunt fosforilate simultan dou enzime:

- glicogen fosforilaza, care este activat i declaneaz scindarea glicogenului;

X Aactivatoralosteric

Activare Inhibi]ie

B C D F G inhibitor alostericE1 E2 E3

ATP ADPKinaz\

fosfatazeHPO4 H2O

Enzim\

ser

OH

Enzim\

ser

O P O

O

O

_

_

_

38

- glicogen sintetaza, care este inhibat i mpiedic reformarea glicogenului.

Transformarea pre-enzimelor n enzime active are loc printr-un proces de proteoliz limitat catalizat fie de enzime proteolitice, fie de H+, ca de exemplu:

Transformarea pepsinogenului i tripsinogenului poate fi catalizat de nsi forma activ a enzimei, printr-un proces de autocataliz.

Alte procese de transformare n forme active se ntlnesc la enzimele implicate n coagularea sngelui i fibrinoliz.

Procesul de activare prin proteoliz limitat implic hidroliza unor legturi peptidice, ndeprtarea unor peptide de clivare i demascarea centrului activ al enzimei. Fenomenul se ntlnete i la unii hormoni proteici.

Reglarea sintezei de enzime reprezint un aspect particular al sintezei de proteine i se afl sub controlul aparatului genetic al celulelor, realizndu-se prin procese de inducie sau represie.

Inducia se refer la sinteza de novo a unei proteine ca rspuns la semnalul transmis de o molecul de inductor care, de multe ori, este chiar substratul enzimei (de exemplu lactoza induce sinteza de beta-galactozidaz).

Represia reprezint reprimarea sintezei de novo a unei proteine ca rspuns la prezena din mediu a unui represor. De multe ori produii reaciei catalizate de o anumit enzim acioneaz n calitate de represori limitnd sinteza respectivei enzime.

2.8. Importana biomedical a enzimelor rezid n utilizarea acestora n diagnosticul unor boli i instituirea unei terapii corecte, precum i folosirea unora n scop terapeutic.

Majoritatea proceselor enzimatice se petrec la nivel celular iar determinarea

enzimelor se face n unele lichide biologice (snge total, urin, lichid cefalorahidian, plasm etc.).

pepsinogen pepsin\

tripsinogen tripsin\

chimotripsinogen chimotripsin\

H^ sau pepsin\

tripsin\ sau enterokinaz\

tripsin\

activatori

Xa, Ca^^, fosfolipide

plasmin\plasminogen

trombin\protrombin\

39

Este important de cunoscut locul de producere al diverselor enzime,

mecanismele prin care ajung aceste enzime din celule n snge. Din acest punct de vedere se deosebesc:

enzime secretate activ n plasm, mai ales de ficat, care acioneaz asupra unor substrate din plasm ndeplinind aici un rol fiziologic. Astfel de enzime specifice plasmei se numesc enzime plasmatice funcionale. Enzimele coagulrii, pseudocolinesteraza, sunt enzime plasmatice. Lezarea organului care produce aceste

enzime determin scderea activitii enzimelor n plasm;

enzime ale secreiilor exocrine care pot difuza pasiv n snge, fr a avea rol specific la acest nivel. Astfel de enzime sunt: amilaza, lipaza, tripsina pancreatic, pepsinogenul gastric, precum i fosfataza alcalin biliar i fosfataza acid prostatic. Enzimele din aceast categorie vor scdea n snge n cazul atrofiei organului care le sintetizeaz sau vor crete cnd apar creteri ale permeabilitii membranei celulelor ce le sintetizeaz;

enzimele celulare acioneaz exclusiv intracelular, se mai numesc i enzimele plasmatice nefuncionale deoarece substratele i cofactorii lor specifici nu se gsesc n plasm. Concentraia lor n spaiul intracelular este mult mai mare dect n plasm.

Ptrunderea enzimelor celulare n snge, n condiii patologice, are loc prin creterea permeabilitii membranei celulare sub aciunea unor factori infecioi, toxici.

n leziunile distructive, att enzimele citoplasmatice ct i cele legate de organitele celulare, trec n snge. O alt cale de ptrundere a enzimelor celulare n snge o constituie blocarea cilor de eliminare normal a enzimelor (unele enzime hepatice, pancreatice) sau o cretere a concentraiei de enzime ca urmare a unei inducii enzimatice.

Scderea activitii enzimelor n plasm poate fi datorat scderii sintezei de enzime, consumului unor medicamente (cortizon, morfin, atropin) sau unor erori genetice.

40

3. VITAMINE

Vitaminele sunt substane organice cu greutate molecular mic, cu structuri chimice, proprieti fizice, chimice i biologice diferite.

Ele sunt aduse din exterior i nu constituie pentru organism surs energetic sau plastic, dar sunt absolut indispensabile pentru funcionarea normal a organismului. Din acest motiv, organismul are nevoie de un aport zilnic de vitamine

(cteva mg/zi) asigurat de raia alimentar. Lipsa unor vitamine din alimentaie duce la declanarea unor stri patologice specifice, numite avitaminoze, care, dac nu sunt de lung durat, pot fi ndeprtate prin administrarea de vitamine.

Antivitaminele sunt substane cu structur chimic asemntoare cu a vitaminelor dar cu aciune antagonist, deoarece avnd structur asemntoare cu vitaminele adevrate, pot intra n competiie cu acestea din urm.

Clasificarea vitaminelor se bazeaz pe criterii de solubilitate: vitamine liposolubile (solubile n grsimi) A, D, E, K; vitamine hidrosolubile (solubile n ap) B1, B2 B6, PP, biotina, acidul

pantotenic, acidul folic, B12, vitamina C.

3.1. Vitaminele hidrosolubile

Vitaminele hidrosolubile aparin complexului vitaminic B (B1, B2, B6, B12, PP, acid pantotenic, acid folic) i vitamina C.

Fiind solubile n ap nu se acumuleaz n organism n concentraii toxice i se elimin n principal pe cale renal.

Vitaminele hidrosolubile ndeplinesc n general rolul de coenzime. 3.1.1. Vitamina B1 (tiamina, aneurina, vitamina anti beri-beri, vitamina

antinevritic) Structural, este alctuit dintr-un nucleu pirimidinic i un nucleu tiazolic,

substituite i unite printr-o grupare metilenic.

Tiamina

Absorbia tiaminei se realizeaz la nivelul intestinului subire, prin procese active i pasive; absorbia activ presupune formarea TPP (tiamin-PP).

n organism tiamina se gsete liber (plasm, LCR) i esterificat ca TPP (80%), form sub care se stocheaz pentru scurt timp i sub care este activ biologic.

NH2H3C

N

N

N

S CH2 OH

CH3

CH2

CH2

.HCl

^

1

2

4

5

1'

3'

4'

5'6'

41

Rol metabolic. Sub form de TPP particip n calitate de coenzim la

unele procese metabolice, decarboxilarea oxidativ a -ceto-acizilor (piruvic i

-cetoglutarat). De asemenea, TPP constituie coenzima transcetolazelor, enzime din calea pentozo-fosforic.

Tulburri de aport vitaminic Simptomele deficienei pot fi cauzate de malnutriie, defecte de absorbie,

pierderi vitaminice datorate terapiei cu diuretice, hemodializ, diaree. Deficitul vitaminic poate conduce la boala numit beri-beri, ce se

caracterizeaz prin: - simptome neurologice (somnolen, dureri de cap, nevrit periferic); - simptome gastro-intestinale; - simptome la nivelul aparatului locomotor. Simptomele moderate ale deficienei tiaminice includ: confuzie mintal,

ataxie (inabilitatea de a realiza un control fin al funciilor motorii) i oftalmoplegie (pierderea coordonrii micrii ochilor).

Aceste simptome se ntlnesc i n sindromul Wernicke-Korsakoff. La animale, deficiena tiaminic conduce la pierderea coordonrii musculare,

ca retracia capului (opistotonus), caracteristic porumbeilor cu hipovitaminoz B1. Hipervitaminoza tiaminic nu apare n mod obinuit. Cu totul excepional pot

apare fenomene de intoleran (lein, dispnee, tahicardie). 3.1.2. Vitamina B2 (riboflavina)

Aparine clasei pigmenilor galbeni sau flavinelor naturale. Este constituit dintr-un nucleu triciclic, derivat de izoaloxazin i o caten lateral de ribitol:

n organism, riboflavina se gsete sub form liber (plasm, lapte, urin i retin), ct i legat (FMN, FAD, enzime flavinice) n diferite esuturi ca rinichi, ficat, inim, muchi.

Rol metabolic Riboflavina intr n structura formelor sale coenzimatice,

flavinmononucleotid (FMN) i flavinadenindinucleotid (FAD). Transformarea sa n

NH

NN

N

H3C

H3C

O

O

CH2

OH

CH

OH

CH

OH

CH2 OHCH

1 2

4

9

10

56

78

Tiamin\

Tiaminpirofosforilaz- kinaza

ATPAMP

NH2H3C

N

N

N

S CH2 O

CH3

CH2

CH2 ^

P

O

OHO

O

P

OH OHTPP

42

ester monofosforic (FMN) are loc n toate celulele organismului, sub aciunea unei flavokinaze:

Prin unirea FMN cu acidul adenozin-5-P (AMP), sub influena flavin-adenin-pirofosforilazei, se formeaz FAD-ul. Dup nomenclatura strict, FMN-ul nu este un mononucleotid, iar FAD-ul nu este un dinucleotid, deoarece n loc de pentoz au un alcool polihidroxilic, ribitolul, iar flavina nu este o baz azotat adevrat.

N

N

NH

N

H

H

H

H C

H

CH2

OH

C OH

C

OH

C

H3C

H3C

O

O

NH2

N

NN

N

O

HHH H

OH OH

O

O

OH

P CH2O

O

OH

P

FMN

FAD

AMP

Flavinenzimele particip la reacii de oxidoreducere deoarece ciclul

izoaloxazinic poate suferi reduceri reversibile, prin fixarea temporar la N1 i N10, a doi atomi de hidrogen, cu mutarea dublei legturi. Hidrogenii sunt preluai de la diferite substrate reduse (SH2), cu care intr n reacie i care se oxideaz (Sox):

FMN i FAD se gsesc n celul sub form de combinaii cu proteinele, constituind sisteme enzimatice de mare importan n oxidrile celulare flavinenzimele (peste 60).

Riboflavin\ Flavokinaz\Flavin-adenin-pirofosforilaza

FMN FAD

ATP ADPATP PPa

-2H^

^2e-

-2e-

^2H^

FMNH2 sau FADH2FMN sau FAD

1

10

R

O

O

H3C

H3C

N

N

NH

NH

HN

N

NH

NH3C

H3C

O

O

R

43

Riboflavina intervine i n mecanismul vederii (transform lungimile de und mici n lungimi de und mai mari, perceptibile), n fiziologia glandelor lacrimale, n mecanismul de producere a HCl n mucoasa gastric, n activitatea altor vitamine i hormoni (conserv activitatea vitaminei B1 i este legat de activitatea hormonilor corticosuprarenali i a insulinei).

Tulburri de aport vitaminic Hipovitaminoza se manifest prin apariia unor leziuni ale mucoasei

gastrice, buco-faringiene, leziuni cutanate.

La om, carena este cunoscut sub denumirea de pelagr fr pelagr, cu simptomele: stomatit angular, leziuni umede la colurile gurii i nasului, conjunctivit, cataract, blefarit, creterea n volum a limbii.

Hipervitaminoza. Megadozele administrate timp ndelungat determin: crampe musculare, poliurie, utilizarea i metabolizarea defectuoas a altor vitamine, datorit competiiei pentru compui de fosforilare.

3.1.3. Vitamina B6 (piridoxina, adermina, factor antidermatitic)

Vitamina B6 include trei compui naturali, derivai de piridin, care se deosebesc prin natura radicalului din poziia 4:

Rolul metabolic Piridoxalul i piridoxamina intervin n metabolism sub form fosforilat la

gruparea de alcool primar din poziia 5 (piridoxal-5-P, respectiv piridoxamin-5-P) care se obin n reacia cu ATP.

Vitamina B6 intervine n multe reacii metabolice la care particip aminoacizii: transaminare, decarboxilare (tirozina, arginina, acid glutamic), dezaminare (serina,

O

N

CHO

CH2OH

H3C

Piridoxal fosfat

Piridoxal-kinaza

ATP ADP

(CH2 NH2)

N

CHO

CH2OHOH

H3C

Piridoxal

(CH2 NH2)

PO3H2

1

45

6

45

N

CH2OH

CH2OHOH

H3C

Piridoxol

N

CHO

CH2OHOH

H3C

Piridoxal

N

CH2NH2

CH2OHOH

H3C

Piridoxamin\

1

45

44

treonina), transsulfurare (transferul sulfului de la metionin la serin pentru sinteza cisteinei), desulfurare (cistein i homocistein), activitatea kinureninei din calea de degradare a triptofanului, n absorbia din intestin i intrarea aminoacizilor n celul.

Tulburri de aport vitaminic Ca semne ale deficienei se pot meniona: strile de nervozitate, insomnie,

tulburri de mers, afeciuni cutanate n jurul nasului, ochilor, gurii, limfocitopenie. Carena vitaminei B6 favorizeaz apariia cariilor dentare, conduce la modificri

n metabolismul triptofanului, caracterizat printr-o excreie excesiv de acid xanturenic. Medicamentul ISONIAZID (hidrazida acidului izonicotinic), uzual utilizat n

tratamentul tuberculozei, reacioneaz cu B6 pentru a forma un derivat hidrazonic, care inhib enzimele ce conin piridoxal-5-P. Pacienii tratai mult timp cu isoniazid dezvolt o neutropenie periferic, care rspunde foarte bine la terapia cu B6.

N

C

OH

H3C

H

Enz

H

N

C COOHR

H

Transaminare

DecarboxilazaTreonin-

aldolaza

+

N

OH CH3

CH2OH

CHO+

Izoniazid

Vitamina B6

N CO NH NH2

N

OH CH3

CH2OH

CHN CO NH N

Piridoxal

hidrazona

spontanHOH

45

De asemenea, penicilinamina (beta- dimetil-cisteina) uzual utilizat n tratamentul pacienilor cu boala Wilson, cistinurie i artrit reumatoid, reacioneaz cu B6, pentru a forma un derivat tiazolidinic inactiv. Pacienii tratai cu penicilamin dezvolt ocazional convulsii, care pot fi prevenite prin tratament cu vitamin B6.

3.1.4. Biotina (vitamina H)

Molecula biotinei este constituit din dou nuclee condensate, un nucleu tetrahidro-imidazolic (A) i unul tetrahidro-tiofenic (B) la care este grefat o caten lateral de acid n-valerianic. Se cunosc doi izomeri naturali, alfa i beta-biotina, izolai din ficat i lapte, respectiv din glbenuul de ou:

n produsele naturale apare combinat cu lizina, compus numit biocitin:

Biocitinaza, enzim evideniat n plasm, ficat, pancreas, hidrolizeaz compusul, elibernd biotin.

Enzimele care conin biotin au n centrul catalitic, resturi de lizin, prin care se fixeaz vitamina. Cu avidina, glicoprotein termolabil din albuul de ou crud, formeaz biotin-avidina, compus stabil, rezistent la aciunea enzimelor proteolitice, nedisociabil prin dializ. Sub aceast form, vitamina nu se absoarbe n tractul digestiv.

Rol metabolic Biotina transport grupri CO2 active, n calitate de grupare prostetic a

unor sisteme enzimatice de carboxilare (carboxilaze) care catalizeaz fixarea CO 2 pe diferite substrate. n reaciile de carboxilare, CO2 activat de ctre ATP, particip sub form de carboxi-biotin-enzim:

(CH2)4 COOHC

CC

CS