TECHNIQUES SPECIALESTECHNIQUES SPECIALES

CULTURES CELLULAIRES CULTURES CELLULAIRES

CRIOFRACTURECRIOFRACTURE

CENTRIFUGATIONCENTRIFUGATION (FRACTIONATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)CELLULAIRE)

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUESTECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X

CULTURES CELLULAIRESCULTURES CELLULAIRESDefinition:Definition: LLa a culture cellulaireculture cellulaire désigne un ensemble de désigne un ensemble de techniques utilisées pour faire utilisées pour faire croître

des des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but but d'd'expérimentation scientifique ou de ou de fécondation in vitro

Les cellules mises en culture peuvent être:Les cellules mises en culture peuvent être:

1) 1) des des micro-organismes libres ( libres (bactéries ou ou levures) )

2) 2) des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme ( (biopsie,...), on parle alors de ,...), on parle alors de ""culture

primaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture ". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment,indéfiniment,

notamment à cause de leur nombre limité de notamment à cause de leur nombre limité de divisions ( (limite de Hayflick). ).

3) 3) des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture"). culture").

4) 4) des des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en . Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie devoie de

cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement., soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

5) d5) des tranches d'es tranches d'organes (d'épaisseur (d'épaisseur optimisée selon le tissu) selon le tissu)

Conditions de travailleConditions de travaille optimisation des conditions "atmosphériques" (ajout d'optimisation des conditions "atmosphériques" (ajout d'oxygène) ) optimisation de la optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de des milieux nutritifs (ajout de

certaines hormones) certaines hormones) optimisation des supports (composition en biomolécules) optimisation des supports (composition en biomolécules) culture sous culture sous agitation co-culture avec des cellules "nourricières" co-culture avec des cellules "nourricières" culture sur des tissus préalablement "tués" par un procédé de culture sur des tissus préalablement "tués" par un procédé de

congélation/décongélation /décongélation inclusion dans des gouttelettes d' dans des gouttelettes d'alginate

Installation des instruments stériles Transfert dans un nouveau milieu pour fragmentation de l'embryon

 

Introduction dans le flacon de culture d'une suspension de cellules d'embryons à l'aide d'une pipette stérile

Mise à l'étuve des flacons pendant 24 heures   à 37°C

Aplication pratiques:1. L’etude des caracteres morphologiques et biologiques2. L’etude des biologie tissulaire3. L’etude “in vivo” des cellule:

• les effects des hormones ou des facteurs de croissance• interaction entre different types des cellule

CriofractCriofractureure

CENTRIFUGATIONCENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)(FRACTIONATION CELLULAIRE)

La La centrifugationcentrifugation est une technique utilisant la est une technique utilisant la force centrifuge pour pour séparer des fluides de densités différentes ou pour isoler des éléments séparer des fluides de densités différentes ou pour isoler des éléments solides en suspension dans un fluide. solides en suspension dans un fluide.

Permet de séparer les éléments d'un mélange en le faisant tourner à Permet de séparer les éléments d'un mélange en le faisant tourner à grande vitesse.grande vitesse.

Rotors a angle fixe pour les séparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protéines plus ou moins agrégées selon les cas) et le surnageant. Utilisé surtout pour des séparations séquentielles, ŕ des vitesses de rotation croissantes.

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES

ChromatographieChromatographie :  : est une méthode physique de séparation basée est une méthode physique de séparation basée sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de sur les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile. deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile.

Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

Phase de cromatographie:Phase de cromatographie: Phase stationnairePhase stationnaire :  : phase fixe soit sur la surface intérieure d'une phase fixe soit sur la surface intérieure d'une

colonne soit sur une surface plane.colonne soit sur une surface plane. Phase mobilePhase mobile :  : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, phase qui se déplace à travers la phase stationnaire,

en entraînant les en entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir . La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.

Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) d’élution.analyte en fonction du temps (ou du volume) d’élution.

La chromatographieLa chromatographie analytiqueanalytique est utilisée pour identifier ou doser les est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration.composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration.

La chromatographieLa chromatographie préparative préparative est utilisée pour purifier assez de est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions.collecter des fractions.

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES

Classification:Classification:

classclassificationification selon la nature de la phase mobile : selon la nature de la phase mobile : la la chromatographie en phase gazeuse (CPG) également (CPG) également

appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; la la chromatographie en phase liquide (CPL) ; (CPL) ; la la chromatographie en phase liquide à haute performance

(CLHP) ; (CLHP) ; la la chromatographie en phase supercritique (CPS). (CPS).

classificationclassification selon les interactions développées par la selon les interactions développées par la phase stationnaire :phase stationnaire :

la la chromatographie d'adsorption // d'affinité ; d'affinité ; la la chromatographie de partage ;  ; la la chromatographie à échange d'ions ;  ;

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES

Chromatographie en phase liquideChromatographie en phase liquide

La La chromatographie en phase liquidechromatographie en phase liquide (CPL) ou (CPL) ou liquid chromatographyliquid chromatography (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et séparative (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et séparative principalement utilisée dans le domaine de la principalement utilisée dans le domaine de la chimie analytique comme comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines variés tels que la outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines variés tels que la chimie organique et la et la biochimie. Elle recouvre la . Elle recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la (CCM), la chromatographie sur papier, , la la chromatographie en phase liquide en colonne ouverte ou à basse ou à basse pression, et la pression, et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).(HPLC).Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés entraînés par un liquide (entraînés par un liquide (phase mobilephase mobile) à travers un solide divisé () à travers un solide divisé (phase phase stationnairestationnaire) qui est soit placé dans un tube () qui est soit placé dans un tube (colonne colonne chromatographiquechromatographique), soit fixé sur une surface inerte.), soit fixé sur une surface inerte. Chromatographie en phase gazeuse

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est, une technique qui permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle est de plus en plus utilisée dans les principaux domaines de la chimie.Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules.

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES (APLICATION (APLICATION

PRATIQUES)PRATIQUES) LLa chromatographie sur papiera chromatographie sur papier

La chromatographie sur papier est une technique de La chromatographie sur papier est une technique de chromatographie en phase liquide ..Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le papier ; ce qui signifie que les molécules par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit.rester au même endroit.

Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/comme un mélange eau/éthanol et placé dans un récipient et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne.papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne.

Les différentes substances constituant l'échantillon migrent Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.moins fortement avec le papier.

Le résultat est appelé chromatogramme.Le résultat est appelé chromatogramme. Le Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. substances de l'échantillon.

La chromatographie sur papier peut aussi constituer une La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative : pour récupérer les produits technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et redissoutes ensuite. Les quantités découpées et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.

TECHNIQUESTECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUESCHROMATOGRAPHIQUES Application pratiquesApplication pratiques

La chromatographie estLa chromatographie est utiliséeutilisée::

dans les laboratoires d'analyses médicales par exemple pour dans les laboratoires d'analyses médicales par exemple pour évaluer la quantité de vitamines dans le sangévaluer la quantité de vitamines dans le sang

dans le domaine sportif pour savoir si un athlète s'est dopédans le domaine sportif pour savoir si un athlète s'est dopé

pour analyser les substances (poudres, liquides...) prélevées sur pour analyser les substances (poudres, liquides...) prélevées sur une scèneune scène de crime dans le cadre d'investigations en police de crime dans le cadre d'investigations en police

scientifique.scientifique.

TECHNIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUESÉLÉCTROPHORÉTIQUES

La La technique de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d' de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d'ions ( (molécules ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un d'un champ électrique. Du fait de leurs caractéristiques propres et . Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.des autres.

Les molécules Les molécules anioniques (-) migrent vers l' (-) migrent vers l'anode (+) et les (+) et les molécules molécules cationiques (+) se déplacent vers la (+) se déplacent vers la cathode (−). (−).

Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support :nommés en fonction du type de support : électrophorèse sur électrophorèse sur papier ;  ; électrophorèse sur électrophorèse sur acétate de cellulose ;  ; électrophorèse sur gel (électrophorèse sur gel (amidon, , agar, , agarose, , polyacrylamide

…). …).

TECHNIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUESÉLÉCTROPHORÉTIQUES Gel d'électrophorèseGel d'électrophorèse

est utilisée pour séparer les est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leur taille et de leur biologiques en fonction de leur taille et de leur charge électrique

lle gel est constitué d'une matrice de e gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un baignant dans un tampon conducteur. conducteur.

ddeux principaux polymères sont utilisés : l'eux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le et le polyacrylamide. On peut faire varier la . On peut faire varier la concentration de polymère par rapport à celle du concentration de polymère par rapport à celle du tampon, ainsi que son taux de tampon, ainsi que son taux de réticulation. Plus le . Plus le polymère est concentré et réticulé, et plus la taille polymère est concentré et réticulé, et plus la taille des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les propriétés du gel à la taille des molécules à propriétés du gel à la taille des molécules à analyser. analyser.

L'L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'grande taille, principalement de l'ADN ou de l' ou de l'ARN ;  ;

Le Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% est utilisé à des concentrations de 4% à 20% (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : protéines, protéines, peptides et des fragments d'acides nucléiques. On et des fragments d'acides nucléiques. On peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation ; de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation ;

TECHNIQUES TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUESÉLÉCTROPHORÉTIQUES

Extraction de l'ADNExtraction de l'ADN et séparation par électrophorèseet séparation par électrophorèse

Matériel nécessaire

Cuves à électrophorèse

Micropipetage de l'ADN

Le bleu de toluidine colore l'ADN

Début de migration de l'ADN dans

le champ électrique Résultat de l'électrophorèse

DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS XDIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X La La diffractométrie de rayons Xdiffractométrie de rayons X ( (DRXDRX) est une technique ) est une technique

d'analyse basée sur la diffraction des rayons X sur la matière. d'analyse basée sur la diffraction des rayons X sur la matière.

La diffraction n'ayant lieu que sur la matière cristalline, on La diffraction n'ayant lieu que sur la matière cristalline, on parle aussi de parle aussi de radiocristallographieradiocristallographie. Pour les matériaux . Pour les matériaux

non-cristallins, on parle de diffusion.non-cristallins, on parle de diffusion.

L'appareil de mesure s'appelle un diffractomètre. Les données L'appareil de mesure s'appelle un diffractomètre. Les données collectées forment le collectées forment le diagramme de diffractiondiagramme de diffraction ou ou diffractogrammediffractogramme. .

Applications de la DRXApplications de la DRX -- ilil est possible de la nature de chaque phase cristalline est possible de la nature de chaque phase cristalline au sein d'un au sein d'un mélange (mélange de poudre ou échantillon massif polyphasique), à mélange (mélange de poudre ou échantillon massif polyphasique), à condition d'avoir auparavant déterminé la signature de chaque phase. condition d'avoir auparavant déterminé la signature de chaque phase.

- la - la méthode est qu'elle permet de distinguer les différentes formes de méthode est qu'elle permet de distinguer les différentes formes de cristallisation d'un même composécristallisation d'un même composé. . Cependant, elle ne peut Cependant, elle ne peut généralement pas permettre d'identifier des composés amorphes. Cette généralement pas permettre d'identifier des composés amorphes. Cette technique est donc complémentaire de l'analyse élémentaire. technique est donc complémentaire de l'analyse élémentaire.

- la - la méthodeméthode déterminer déterminer la identification de structures cristalline de la identification de structures cristalline de l’ADNl’ADN