TECHNIQUES SPECIALES

• CULTURES CELLULAIRES

• CRIODECAPAGE

• CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

• TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES • TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

• DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X

CULTURES CELLULAIRESDefinition:• La culture cellulaire désigne un ensemble de techniques utilisées

pour faire croître des cellules hors de leur organisme ("ex-vivo") ou de leur milieu d'origine, dans un but d'expérimentation scientifique ou de fécondation in vitro

• Les cellules mises en culture peuvent être:

1) des micro-organismes libres (bactéries ou levures ex. collectés avec une boulette de coton les dépôts crémeuse des candida albicans et effectuer une culture

cellulaire; résultats positive - plus de dix colonies mycélium )

2) des cellules "saines" prélevées fraîchement d'un organisme (biopsie,...), on parle alors de "culture primaire". Ces cellules ne peuvent habituellement pas être maintenues en culture indéfiniment, notamment à cause de leur nombre limité de divisions.

3) des cellules ayant une capacité de division non limitée (on parle d'"immortalité en culture").

4) des lignées cellulaires. Les lignées sont soit des cellules cancéreuses, soit des cellules en voie de cancérisation, soit des cellules saines rendues "immortelles" artificiellement.

5) des tranches d'organes (d'épaisseur optimisée selon le tissu)

Conditions de travaille• optimisation des conditions "atmosphériques" (ajout d'oxygène...) • optimisation de la composition des milieux nutritifs (ajout de certaines

hormones,...) • optimisation des supports (composition en biomolécules,...) • culture sous agitation • co-culture avec des cellules "nourricières" • culture sur des tissus préalablement "tués" par un procédé de congélation

/décongélation • inclusion dans des gouttelettes d'alginate

Installation des instruments

stériles Transfert dans un nouveau milieu pour fragmentation de l'embryon

 

Introduction dans le flacon de culture d'une suspension de cellules d'embryons à l'aide d'une pipette stérile

Mise à l'étuve des flacons pendant 24 heures à 37°C

Aplication pratiques:1. L’etude des caracteres morphologiques et biologiques2. L’etude des biologie tissulaire3. L’etude “in vivo” des cellule:

• les effects des hormones ou des facteurs de croissance• interaction entre different types des cellule

LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE • Definition:

La technique de cryodécapage consiste en cassant à part (fracturant) un échantillon biologique congelé; le détail structurel exposé par le plan de la fracture est alors envisagé par la déposition en vide de platine carbone pour faire un réplica (copie exacte) pour l'examen dans le microscope électronique de transmission (obtenir une image miroir de la surface fracturée).

• Étapes:

1. la congélation rapide2. la fracture3. produire le réplica 4. le nettoyage de la réplique

LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGELe protocole de travail: 1. La congélation rapide

- dans les protocoles de routine, une étape de prétraitement est exécuté avant congeler, comprenant typiquement la fixation dans glutaraldehyde suivi par la cryoprotection avec glycérol. - pour congeler le tissu on doit plonger rapidement un échantillon convenablement monté dans un agent de refroidissement liquide (par ex., azote liquide sousrafraîchi). -pour éviter la formation des cristaux de glace, on appelle a l’étape de prétraitement; le cryoprotectant le plus utilisé est le glycérol; comme l'exposition au glycérol (ou d'autre cryoprotectants) peut causer des défets dans la structure de la membrane cellulaire, la pratique standard doit réaliser la fixation chimique avec glutaraldehyde d'abord.

2. La fracture- la fracture de l'exemplaire congelé est d'habitude réalisé sous le vide en utilisant une lame de microtome rafraîchie de d'azote liquide ou en cassant l'exemplaire congelé à part dans un dispositif articulé; la fracture se fait avec une lame de rasoir sous l'azote liquide à la pression atmosphérique; la fracture par la lame de microtome rafraîchie suppose le placement de l’échantillon sur un support rafraîchi.

3. Le nettoyage de la réplique- après réaliser la réplique, l'échantillon est apporté à la pression atmosphérique et à la température environnementale; la matière biologique est enlevée de la réplique en utilisant la solution du sodium hypochlorite, l'acide chromique ou d'autres agents de nettoyage; après le lavage dans l'eau distillé, les morceaux de réplique sont montés sur les grilles pour l'examen dans la microscopie électronique de transmission.

4. Résultats- un petit morceau du réplica est montait sur une grille, vue aux grossissements successifs; la première image dans la série montre le réplica comme vu sous le microscope binoculaire; les deux images suivantes sont de très bas grossissement en MET (microscopie électronique de transmission); pour refléter des détails, le grossissement dans le microscope électronique est augmenté davantage.

LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGE

Détails sur le protocole de travail

Etapes de la technique de cryodécapage

(une image miroir de la surface fracturée)

LA TECHNIQUE DE CRYODÉCAPAGEAplication pratiques:

• le cryodécapage est unique parmi les techniques microscopiques car il fournit des vues planaires de l'organisation interne des membranes;

• la corrosion profonde des échantillons rapidement congelés permettent la visualisation de la structure de surface de cellules et leurs composants;

• les images fournies par le cryodécapage et les techniques collatérales ont changé profondément notre compréhension de la morphologie fonctionnelle de la cellule.

CENTRIFUGATION (FRACTIONATION CELLULAIRE)

• La centrifugation est une technique utilisant la force centrifuge pour séparer des fluides de densités différentes ou pour isoler des éléments solides en suspension dans un fluide.

• Permet de séparer les éléments d'un mélange en le faisant tourner à grande vitesse.

Rotors a angle fixe pour les séparations les plus simples entre culot (cellules, organites, membranes, protéines plus ou moins agrégées selon les cas) et le surnageant. Utilisé surtout pour des séparations séquentielles, ŕ des vitesses de rotation croissantes.

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES• Chromatographie : est une méthode physique de séparation basée sur

les différences d'affinités des substances à analyser à l'égard de deux phases, l'une stationnaire ou fixe, l'autre mobile.

• Selon la technique chromatographique mise en jeu, la séparation des composants entraînés par la phase mobile, résulte soit de leur adsorption et de leur désorption successives sur la phase stationnaire, soit de leur solubilité différente dans chaque phase.

Phase de cromatographie:• Phase stationnaire : phase fixe sur la surface intérieure d'une colonne

soit sur une surface plane.• Phase mobile : phase qui se déplace à travers la phase stationnaire, en

entraînant les analytes. La phase mobile ne doit pas interagir avec la phase stationnaire mais uniquement avec les analytes.

• Chromatogramme : graphique d’une fonction de la concentration en analyte en fonction du temps (ou du volume) d’élution.

La chromatographie analytique est utilisée pour identifier ou doser les composés chimiques d'un mélange et apprécier leur concentration.

La chromatographie préparative est utilisée pour purifier assez de produit pour d'autres utilisations. Son but est d'obtenir de la substance ; c'est pourquoi, à toute échelle, elle implique de collecter des fractions.

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES• Classification:

– classification selon la nature de la phase mobile :• la chromatographie en phase gazeuse (CPG) également

appelée CPV (chromatographie en phase vapeur) ; • la chromatographie en phase liquide (CPL) ; • la chromatographie en phase liquide à haute performance

(CLHP) ; • la chromatographie en phase supercritique (CPS).

– classification selon les interactions développées par la phase stationnaire :

• la chromatographie d'adsorption / d'affinité ; • la chromatographie de partage ; • la chromatographie à échange d'ions ;

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES• Chromatographie en phase liquide

La chromatographie en phase liquide (CPL) ou liquid chromatography (LC) est une technique d'analyse quantitative, qualitative et séparative principalement utilisée dans le domaine de la chimie analytique comme outil scientifique majeur mais aussi dans des domaines variés tels que la chimie organique et la biochimie. Elle recouvre la chromatographie sur couche mince (CCM), la chromatographie sur papier, la chromatographie en phase liquide en colonne ouverte ou à basse pression, et la chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC).Ce type de chromatographie repose sur la séparation de composés entraînés par un liquide (phase mobile) à travers un solide divisé (phase stationnaire) qui est soit placé dans un tube (colonne chromatographique), soit fixé sur une surface inerte.

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• Chromatographie en phase gazeuse• La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est,

une technique qui permet de séparer des molécules d'un mélange éventuellement très complexe de nature très diverses. Elle s'applique principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans décomposition. Elle est de plus en plus utilisée dans les principaux domaines de la chimie.

• Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une substance active solide ou liquide appelée phase stationnaire, puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de phase stationnaire avec ces molécules.

• La chromatographie sur papier – La chromatographie sur papier est une technique de La chromatographie sur papier est une technique de

chromatographie en phase liquide..Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou Pour effectuer une telle séparation, une petite quantité de la ou des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de des solutions à analyser est déposée sur le bord d'une bande de papier de chromatographie. Cet échantillon est papier de chromatographie. Cet échantillon est adsorbé par le par le papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce papier ; ce qui signifie que les molécules interagissent avec ce dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit.dernier et qu'elles auront tendance à rester au même endroit.

– Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un Le papier est ensuite trempé dans un solvant (éluant) comme un mélange eau/mélange eau/éthanol et placé dans un récipient fermé. Pendant et placé dans un récipient fermé. Pendant que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il que le solvant (éluant) monte le long du papier par capillarité, il rencontre l'échantillon et l'entraîne.rencontre l'échantillon et l'entraîne.

– Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à Les différentes substances constituant l'échantillon migrent à différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins différentes vitesses selon qu'elles interagissent plus ou moins fortement avec le papier.fortement avec le papier.

– Le résultat est appelé chromatogramme.Le résultat est appelé chromatogramme. Le chromatogramme est Le chromatogramme est utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur utilisé pour comparaison avec d'autres analyses effectuées sur des substances connues et prises dans des conditions des substances connues et prises dans des conditions identiques, pour identifier les substances de l'échantillon. identiques, pour identifier les substances de l'échantillon.

– La chromatographie sur papier peut aussi constituer une La chromatographie sur papier peut aussi constituer une technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi technique micro-préparative : pour récupérer les produits ainsi séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées séparés, les portions du papier où ils se situent sont découpées et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre et redissoutes ensuite. Les quantités récupérables sont de l'ordre du milligramme ou moins.du milligramme ou moins.

TECHNIQUES CHROMATOGRAPHIQUES

• application pratiquesLa chromatographie est utilisée:

– dans les laboratoires d'analyses médicales par exemple pour évaluer la quantité de vitamines dans le sang

– dans le domaine sportif pour savoir si un athlète s'est dopé

– pour analyser les substances (poudres, liquides...) prélevées sur une scène de crime dans le cadre d'investigations en police scientifique (dans les études médico-légales)

TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES

• La La technique de l'électrophorèse est fondée sur le de l'électrophorèse est fondée sur le déplacement d'déplacement d'ions ( (molécules ayant perdu leur neutralité ayant perdu leur neutralité électrique) sous l'effet d'un électrique) sous l'effet d'un champ électrique. Du fait de . Du fait de leurs caractéristiques propres et en fonction des leurs caractéristiques propres et en fonction des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des conditions de l'électrophorèse ces ions auront des vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer vitesses de migration différentes, ils vont donc se séparer les uns des autres.les uns des autres.

• Les molécules Les molécules anioniques (-) migrent vers l' (-) migrent vers l'anode (+) et les (+) et les molécules molécules cationiques (+) se déplacent vers la (+) se déplacent vers la cathode (−). (−).

• Les différents types d'électrophorèses de zones sont souvent nommés en fonction du type de support :– électrophorèse sur électrophorèse sur papier ;  ; – électrophorèse sur électrophorèse sur acétate de cellulose ;  ; – électrophorèse sur gel (électrophorèse sur gel (amidon, , agar, , agarose, ,

polyacrylamide).).

TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUES• Gel d'électrophorèse:

– est utilisée pour séparer les macromolécules biologiques en fonction de leur taille et de leur charge électrique

– le gel est constitué d'une matrice de polymère baignant dans un tampon conducteur.

– deux principaux polymères sont utilisés : l'agarose et le polyacrylamide. On peut faire varier la concentration de polymère par rapport à celle du tampon, ainsi que son taux de réticulation. Plus le polymère est concentré et réticulé, et plus la taille des pores du gel est petite. On peut ainsi ajuster les propriétés du gel à la taille des molécules à analyser.

– L'agarose est utilisé à des concentrations de 0,5% à 2% (poids/volume) et permet de séparer des molécules de très grande taille, principalement de l'ADN ou de l'ARN ;

– Le polyacrylamide est utilisé à des concentrations de 4% à 20% (poids/volume) et permet de séparer des molécules plus petites : protéines, peptides et des fragments d'acides nucléiques. On peut aussi faire varier sa réticulation (taux de ramification) lors de la polymérisation pour moduler les paramètres de séparation.

TECHNIQUES ÉLÉCTROPHORÉTIQUESExtraction de l'ADN et séparation par électrophorèse

Matériel nécessaire

Cuves à électrophorèse Micropipetage de l'ADN

Le bleu de toluidine colore l'ADN

Début de migration de l'ADN dans le champ électrique

Résultat de l'électrophorèse

DIFFRACTOMÉTRIE DE RAYONS X• La diffractométrie de rayons X (DRX) est une technique

d'analyse basée sur la diffraction des rayons X sur la matière.

• La diffraction n'ayant lieu que sur la matière cristalline, on parle aussi de radiocristallographie. Pour les matériaux non-cristallins, on parle de diffusion.

• L'appareil de mesure s'appelle un diffractomètre. Les données collectées forment le diagramme de diffraction ou diffractogramme.

Applications de la DRX - il est possible de la nature de chaque phase cristalline au sein d'un mélange (mélange de poudre ou échantillon massif polyphasique), à condition d'avoir auparavant déterminé la signature de chaque phase. - la méthode est qu'elle permet de distinguer les différentes formes de cristallisation d'un même composé. Cependant, elle ne peut généralement pas permettre d'identifier des composés amorphes. Cette technique est donc complémentaire de l'analyse élémentaire. - la méthode déterminer la identification de structures cristalline de l’ADN