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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
INTRODUCCIÓNLos avances en el campo de la genética molecular están teniendo una
importante repercusión en nuestra capacidad para comprender, diagnosticar
y tratar una varie-
dad de enferme-
dades congénitas
y adquiridas. Así,
la posibilidad de
introducir genes
en células euca-
riotas ha permiti-
do dar comienzo a nuevos protocolos de marcado y de terapia gé-
nica humana (TG), que no resultaban abordables hace unos pocos
años y que en esencia se fundamentan en dos estrategias que se re-
cogen en la Figura 1.
TERAPIA GÉNICA EN ENFERMEDADESMONOGÉNICAS Y CÁNCERJuan A. Bueren1 y Antonio Bernad2
1División de Hematopoyesis y Terapia Génica, CIEMAT2Departamento de Inmunología y Oncología, Centro Nacional de Biotecnología, CSIC
Figura 1: Modalidadesbásicas en las que se
fundamentan losprotocolos de terapia
génica
Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
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En términos teóricos existen dos posibilidades técnicas para realizar TG.
En primer lugar podríamos plantear una "terapia de sustitución" en la que el
gen afectado (mutado) fuese sustituido por una versión correcta. Esta aproxi-
mación sería perfecta puesto que el gen introducido se encontraría en su entor-
no natural y bajo los sistemas de control/regulación de la expresión fisiológica.
Sin embargo, debido fundamentalmente al bajo índice de recombinación homó-
loga demostrada en las células eucarióticas (incluidas las de mamífero), esta
aproximación no se plantea en términos prácticos, aunque muchos grupos de
investigación trabajan activamente en el desarrollo de procedimientos para au-
mentar dicho fenómeno (Li J. y Baker M.D., 2000), y se han comunicado algu-
nos intentos con éxito (Hatada et al. 2000). En segundo lugar nos encontramos
con la denominada "terapia de adición", que pretende introducir una construc-
ción de diseño que permita aportar la función génica afectada, generar un cir-
cuito secundario que incida sobre las vías afectadas o promueva una respuesta
fisiológica que elimine las células malignas o defectivas. La mayoría de los
protocolos en desarrollo actualmente utiliza esta alternativa, combinando un
sinfín de posibilidades técnicas que viene principalmente determinado por el ti-
po de afección con la que se enfrenta el equipo de investigación. El resumen
de la experiencia acumulada hasta el momento indica que no existe una fórmu-
la universal de TG. Cada patología, y por ende cada tipo celular afectado, e in-
cluso cada paciente, tiene más posibilidades de éxito con un determinado pro-
cedimiento que con otro, y esto es necesario probarlo en la arena clínica.
En esencia, el proceso de TG puede realizarse tanto in vivo (inoculando el
vector de transferencia en el paciente), como in vitro. En este caso, la transfe-
rencia génica se realiza sobre células extraídas del paciente; las cuales, una vez
modificadas genéticamente, serán reinoculadas en el mismo. En general, los
vectores de transferencia actuales presentan una eficacia de transducción nota-
blemente superior cuando éstos se utilizan in vitro sobre las células diana a
transducir, frente a cuando éstos se inoculan in vivo. Por ello, una gran parte de
los protocolos actuales de TG tienen su fundamento en la obtención, transduc-
ción y reinfusión de las células transducidas. A pesar de ello, los vectores ade-
novirales, y en menor medida los retrovirales, se han comenzado a utilizar in
vivo en protocolos de terapia génica antitumoral, mediante inoculaciones direc-
tas en la masa tumoral del paciente
La revista Journal of Gene Medicine ha reportado que a finales del año
2005 estaban en marcha un total de 678 ensayos clínicos de terapia génica en
fase I; 219 en fases I/II, 147 en fase II y tan sólo 32 en fases II/II ó III. Los
vectores retrovirales y los adenovirales son los vectores de uso más frecuente
en estos ensayos, pues cada uno de estos vectores se está utilizando en un
25% de los protocolos. Le siguen los ensayos en los que se utiliza DNA des-
nudo (16%), lipofección (8%), y el resto está muy repartido entre ensayos
que utilizan vectores adenoasociados, virus vaccinia, y hasta 20 tipos diferen-
tes de vectores.
TERAPIA GÉNICA DE ENFERMEDADES MONOGÉNICAS
Criterios para definir el vector de transferencia a utilizar
El éxito terapéutico de los tratamientos de TG depende fundamentalmente
de dos variables. En primer lugar, resulta necesario insertar eficazmente el trans-
gén en las células diana deseadas. Por otra parte, es también necesario que el
gen se exprese adecuadamente produciendo niveles suficientes de la proteína te-
rapéutica. En el caso de enfermedades metabólicas asociadas a defectos genéti-
cos hereditarios, resulta evidente que la curación de la enfermedad sólo se ob-
tendrá cuando a las células de los tejidos afectados les llegue de manera estable
en el tiempo niveles umbrales de la proteína deficitaria. Una de las aproxima-
ciones más directas para lograr este objetivo es la de transducir la población ce-
lular afectada y/o sus células progenitoras con vectores que permitan la integra-
ción estable del transgén en el genoma celular. En los protocolos clínicos
diseñados al efecto, se han utilizado fundamentalmente vectores retrovirales, en
particular los derivados del virus de la leucemia murina de Moloney (MoMLV).
En un grupo significativo de aplicaciones clínicas –por ejemplo las relacionadas
con la terapia de la hemofilia– se ha comenzado a hacer uso de vectores adeno-
asociados (AAV). Tal como ocurre con los vectores retrovirales, estos vectores
permiten la inserción estable del transgén, si bien en este caso suelen ser varias
las copias integradas, con lo que parece que se consiguen mayores niveles de
expresión del transgén en las células diana. Los vectores lentivirales constituyen
también una herramienta ya considerada para su uso en protocolos clínicos de
TG humana, ya que mediante estos vectores se facilita la integración del trans-
gén en células poco o nada proliferativas, con lo que se confía poder transducir
de manera muy eficaz las células madre de los diferentes tejidos.
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
El esquema básico seguido en
estos ensayos clínicos es el que se
muestra en la Figura 2. Las células
de la médula ósea del paciente se
extraen de la médula ósea, se purifi-
can y se translucen con los vectores
terapéuticos. Finalmente, la pobla-
ción conteniendo células madre co-
rregidas genéticamente son infundi-
das en el paciente, el cual en
ocasiones puede haber recibido un
tratamiento submieloablativo para
facilitar el prendimiento del inóculo.
Principales enfermedades monogénicas que son objetode terapia genética
Hasta que los laboratorios de genética molecular ofrezcan alternati-
vas eficaces para el tratamiento de mutaciones dominantes, el tratamiento
genético de las enfermedades metabólicas se está centrando en la terapia de muta-
ciones monogénicas recesivas, en las cuales la expresión de una copia funcional del
correspondiente transgén pueda ser suficiente para la curación de la enfermedad.
En aquellas patologías metabólicas en las que no resulta posible, o no es
del todo eficaz la administración exógena de la proteína deficitaria, se han plan-
teado alternativas de terapia celular o génica sobre estos pacientes. En relación a
los protocolos clínicos de terapia celular, del orden de treinta enfermedades me-
tabólicas pueden ser tratadas mediante trasplante de progenitores hematopoyéti-
cos procedentes de donantes histocompatibles sanos. No obstante, debido a las
limitaciones de donantes histocompatibles y a los riesgos asociados al trasplante
alogénico, una larga serie de enfermedades metabólicas monogénicas han sido
consideradas para su tratamiento mediante la transferencia del gen deficitario en
las células que manifiestan la patología.
De todos los protocolos de TG de enfermedades asociadas a defectos mono-
génicos, a continuación se muestra el fundamento de algunos de los que han sido
más relevantes, bien por su relevancia histórica, por su eficacia terapéutica o por
las expectativas generadas.
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
Figura 2: Esquema básicodel protocolo utilizadopara la terapia génicade enfermedadeshematopoyéticashereditarias
Inmunodeficiencias genéticas
Entre las inmunodeficiencias
consideradas para su tratamiento
genético son de destacar las inmu-
nodeficiencias severas combinadas
asociadas a mutaciones en los genes
de la Adenosina Deaminasa (ADA)
y la inmunodeficiencia SCID-X1.
La ausencia de la ADA implica
una acumulación del sustrato desoxiadenosina trifosfato en las células,
resultando particularmente tóxico para los linfocitos T (Figura 3). Ésta
fue una de las primeras patologías en ser tratadas mediante protocolos
de TG con vectores retrovirales, primero en el NIH de Estados Unidos
(Blaese et al., 1995; Khon et al., 1998), y luego en el Hospital S. Raf-
faelle de Milán (Bordignon et al., 1993; 1995; Ferrari et al., 1992; Aiu-
ti et al 2002). Las dos alternativas que se han considerado para el tratamiento ge-
nético de esta enfermedad estuvieron basadas en la transferencia del gen ADA en
las células T de pacientes y también en células madre hematopoyéticas (CMH).
En todos los casos se comprobó la pre-
sencia de células transducidas en los pa-
cientes y evidencias de mejora en su in-
munocompetencia. Muy recientemente
se ha comunicado que pacientes con de-
ficiencia de ADA que fueron acondicio-
nados con protocolos poco agresivos y
trasplantados con células de médula
ósea corregida genéticamente han podi-
do hacerse independientes de la admi-
nistración exógena del ADA bovino y
recuperado su función inmune (Aiuti et
al 2002).
La inmunodeficiencia SCID-X1 representa aproximadamente la
mitad de todas las inmunodeficiencias severas y está asociada a un
defecto en la cadena γc, una proteína que forma parte de numerosos
receptores de interleuquinas (Figura 4). La TG de estos pacientes se
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Figura 3:Inmunodeficiencia
severa combinada ADA
Figura 4: Defectivaseñalización por
receptores de citoquinasen la inmunodeficiencia
X1-SCID
ha realizado mediante la
transferencia de la ver-
sión funcional del trans-
gén a CMHs, utilizando
para ello técnicas opti-
mizadas de transferen-
cia retroviral. Las
CMHs se han trasplan-
tado a once pacientes
no acondicionados, ha-
biéndose observado en
diez de ellos la apari-
ción de células del sis-
tema inmune contenien-
do el transgén y una
evidente mejoría clínica
de los pacientes, que les
permitió abandonar las unidades de aislamiento a las pocas semanas
del tratamiento (Cavazzana-Calvo et al., 2000).
Se considera que este protocolo, desarrollado en Francia por el
grupo de A. Fischer, es el primer protocolo de TG de una enfermedad metabó-
lica que ha demostrado una eficacia terapéutica incuestionable. Desgraciada-
mente, dos de los once pacientes actualmente tratados han desarrollado una
leucemia linfocítica como consecuencia de la activación del oncogén LMO2 en
las células que habían incorporado el gen terapéutico. Esta observación supone,
por tanto, también el primer efecto patogénico asociado a una inserción retrovi-
ral en un paciente, y pone de manifiesto la necesidad de evaluar el delicado
equilibrio beneficio/riesgo asociado a la práctica de la TG insercional (Hacein-
Bey-Abina et al 2003) en cada indicación clínica.
La granulomatosis crónica constituye otra inmunodeficiencia que ha recibido
atención particular para su tratamiento genético. Esta enfermedad se caracteriza por
un fallo por parte de las células fagocíticas para generar el anión superóxido, por lo
que se manifiesta mediante un síndrome recurrente de infecciones y formación de
granulomas (Figura 5). Estudios experimentales sugieren que la corrección genética
de aproximadamente un 5% de los granulocitos circulantes será suficiente para re-
portar un beneficio terapéutico (Malech et al., 1999). Los estudios clínicos basados
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
Figura 5: Granulomatosiscrónica
en el trasplante de células
CD34+ transducidas sobre pa-
cientes no acondicionados no
han mostrado beneficio tera-
péutico. No obstante, un ensa-
yo clínico comenzado en Ale-
mania con pacientes sometidos
un acondicionamiento modes-
to con busulfán ha evidencia-
do mejoría clínica en los dos
pacientes tratados.
Como conclusión a los
estudios realizados para tratar
genéticamente pacientes con
enfermedades monogénicas, la Figura 6 muestra el número de pacien-
tes con inmunodeficiencias severas, así como los que han mostrado
evidencias de mejoría clínica. De estos estudios se pone de manifiesto
que existe un número de enfermedades monogénicas, para las cuales la
terapia génica comienza a ser una realidad terapéutica. En este mo-
mento son las cuestiones de seguridad las que limitan el mayor desarrollo de es-
tos ensayos en la clínica (Ver apartado “Seguridad en terapia génica”).
Enfermedades de acumulación de sustratos tóxicos
Un número relativamente elevado de genes se ha asociado a este tipo de en-
fermedades. De entre todas ellas, la enfermedad de Gaucher es la más frecuente,
por lo que ésta es la enfermedad de acumulación lisosomal que ha sido objeto de
más estudios de TG. La enfermedad de Gaucher está asociada a una deficiencia
en glucocerebrosidasa (GC), por lo que se presentan importantes acumulaciones
de glucocerebrósido en macrófagos y en células derivadas de los mismos, produ-
ciéndose patologías de la médula ósea, hígado, bazo y cerebro. Para que la TG de
esta patología sea eficaz se requerirá, por tanto, que las células corregidas alcan-
cen órganos hematopoyéticos y no hematopoyéticos. En particular, para el trata-
miento de la patología que afecta a la microglía del sistema nervioso central, será
necesario que las células modificadas genéticamente migren al SNC y confieran
allí el efecto necesario sobre la manifestación neurológica. Hasta el momento se
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Figura 6: Beneficio clínicode pacientes con
inmunodeficienciascongénitas tratados con
terapia génica
han realizado pocos estudios piloto, aunque los mismos se encuentran todavía en
fases tempranas de estudio clínico. Otras enfermedades de acumulación de sustra-
tos, tales como la mucopolisacaridosis de tipo II (síndrome de Hunter), han recibi-
do atención para su tratamiento genético, aunque su desarrollo no se encuentra tan
avanzado como en el caso de la enfermedad de Gaucher.
Hemofilia
Tanto la hemofilia A, producida como consecuencia de un defecto en la pro-
ducción del Factor VIII de coagulación, como la hemofilia B, asociada al defecto
en el factor IX, han sido consideradas para su tratamiento por TG. Un estudio clí-
nico reciente (Kay et al., 2000) ha mostrado las primeras evidencias de eficacia clí-
nica asociada al tratamiento con vectores AAV que codifican el factor IX. En este
estudio, los vectores AAV se inocularon en el músculo de pacientes de hemofilia
B, obteniéndose resultados que sugieren que la hemofilia B podría transformarse
en una enfermedad más leve mediante la aproximación genética propuesta.
Enfermedades asociadas a defectos en la hemoglobina
La talasemia β y la anemia falciforme constituyen las dos patologías de
este grupo más estudiadas para su tratamiento mediante TG. Constituyen las
dos enfermedades monogénicas más frecuentes, y su patología molecular ha si-
do ampliamente investigada. El remplazamiento de la globina β , defectiva o
ausente en pacientes con talasemia β, puede ser curativa. Los altos niveles de
expresión del gen que codifica la globina γ normal en las células eritroides de
pacientes con anemia falciforme, se confía que sea beneficiosa, debido al en-
samblaje preferente de los tetrámeros α y γ, y la relativa inestabilidad de las
cadenas βs. La TG de esta enfermedad requerirá, sin embargo, muy altos nive-
les de expresión del transgén, lo cual supone una tarea todavía pendiente.
Anemia de Fanconi
La anemia de Fanconi (AF) es una enfermedad autosómica recesiva poco
frecuente entre la población, pero de muy mal pronóstico. Los pacientes suelen
desarrollar anomalías congénitas múltiples (en un 65% de los casos), fallo de
médula ósea y predisposición a cáncer. De promedio, la manifestación de la apla-
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
sia se observa alrededor de los 8 años de edad, siendo la supervivencia media de
estos pacientes de 16 años. Una de las características de esta enfermedad que la
hacen particularmente apropiada para su tratamiento por TG radica en la ventaja
selectiva que parecen tener las células corregidas, respecto a las células defecti-
vas en los genes de Fanconi. La AF es consecuencia de mutaciones o deleciones
en cualquiera de los ocho genes que en la actualidad se sabe están implicados en
una función celular relacionada con la estabilidad del genoma de estas células.
Los resultados publicados sobre los ensayos realizados en fase I no manifiestan
beneficios terapéuticos evidentes (Liu et al., 1999). No obstante, nuevos ensayos
con protocolos optimizados de transducción están actualmente en marcha.
Fibrosis quística
El gen de la fibrosis quística (FQ) está localizado en el cromosoma 7 y posee
un tamaño de 6,7 kB. En un 75% de los pacientes enfermos de FQ, la enfermedad
se produce por un defecto en la posición 508. Como consecuencia de las deficien-
cias de este gen se produce una alteración física y química de las secreciones de
las vías respiratorias y de las enzimas pancreáticas. Como consecuencia del defec-
to en el transporte del cloro entre las células, las mucosidades se hacen muy den-
sas, dificultando la expulsión del moco bronquial y facilitando su infección con
patógenos difíciles de eliminar. La TG prioritaria de esta enfermedad radica en la
inserción del gen de la FQ en las células respiratorias. Hasta la actualidad se han
desarrollado diversos ensayos clínicos en fase I utilizando vectores adenovirales,
adenoasociados y liposomas (Alton et al., 1998). Los protocolos con vectores ade-
novirales han mostrado ventajas respecto a su eficacia de transducción de las célu-
las diana; sin embargo, también han puesto de manifiesto su inmunogenicidad, al
haberse generado anticuerpos que neutralizaron la eficacia de los vectores adeno-
virales. Es de esperar que los protocolos actuales, con vectores menos inmunogé-
nicos y más eficaces, faciliten la mejoría clínica de estos pacientes.
TERAPIA GÉNICA DEL CÁNCER (TGC)
En los años 60 y 70 se sucedieron las primeras propuestas teóricas para el
tratamiento de enfemedades humanas mediante la introducción de material gené-
tico en los órganos o células afectados. En 1968 se reportó el primer experimento
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
en el que se utilizó un virus oncogénico modificado como transportador de mate-
rial genético potencialmente terapeútico (Rogers S. y Pfuderer P. 1968). Hubo
que esperar al año 1979 hasta que apareciera el primer modelo animal (Andreson
W.F. y Fletcher J.C. 1979), lo que catapultó la investigación general en el área.
Sin embargo, la aplicación al campo de la terapia en cáncer se retrasó hasta el
año 1987, cuando se abordó el tratamiento de leucemias (Howell et al. 1987;
Merz, B. 1987; Bank et al. 1987).
Biología molecular del cáncer
El principal problema al que se enfrenta la TGC es que, en sus formas
más habituales, no se trata de una enfermedad monogénica y las células cance-
rígenas presentan un gran número de anomalías genéticas y cromosómicas. Por
tanto, las filosofías y formas de trabajo habituales en el campo, más centradas
en conseguir una mayor eficiencia de transducción en los órganos diana, es só-
lo una parte del problema en la TGC.
En base a esta premisa general, ha si-
do necesario avanzar en el conocimiento
molecular y fisiológico del enemigo a ba-
tir, antes de contar con herramientas sufi-
cientemente eficaces para afrontar el reto
que supone conceptualmente. Actualmen-
te, y contando con que en cada tipo de tu-
mor humano los circuitos implicados prin-
cipales pueden ser distintos, conocemos
varios principios de la fisiología tumoral
sobre los que poder incidir con garantías
razonables de éxito. Las principales vías
afectadas (en solitario o en combinación)
en los tumores humanos (Hanahan, D. y
Weinberg, R.A., 2000), y en las que se
conocen genes importantes, son las si-
guientes (ver Figura 7).
1) Bloqueo de los programas de muerte celular programada.
2) Insensibilidad a señales antiproliferativas.
3) Generación de circuitos de supervivencia alternativos.
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
Figura 7: Basesmoleculares del cáncer.Adaptada de Hanahan(2000)
4) Proliferación descontrolada.
5) Invasividad y metástasis.
6) Inducción de angiogénesis asociada al desarrollo de tumores sólidos.
Todas estas vías pueden cooperar sin solución de continuidad y dependien-
do del tumor humano concreto, de forma casi aleatoria (al menos poco predeci-
ble), por lo que ha sido necesario acumular esta información, antes de poder
realizar un diseño terapéutico racional. Esta situación se resume en varias si-
nergias bien caracterizadas en tumores humanos.
Este desarrollo ha llevado a un cambio conceptual del "tumor", asumiéndo-
se actualmente que se trata de un nuevo "tejido", con necesidades fisiológicas
específicas. Frente a la visión "reduccionista" del tumor, asumiendo que es un
conjunto de células, relacionadas clonalmente pero heterogéneas por su inestabi-
lidad génica intrínse-
ca, la nueva visión
emergente entiende el
tumor como un "neo-
tejido" en constante
evolución, con unas
necesidades cambian-
tes, tanto en términos
metabólicos como
protectores. El tumor
genera señales y sus-
tancias que "manipu-
lan" su entorno fisio-
lógico en su propio
beneficio; se está ju-
gando su propia supervivencia. Los tumores primarios crecen autóno-
mamente hasta que sus necesidades nutricionales les obliga a reclutar
más recursos. Este es un momento crítico (denominado angiogenic
switch) en el que el tumor se estructura atrayendo células de soporte,
promueve la neovascularización de su entorno (angiogénesis) y atrae
células inmunes circulantes y las estimula para que secreten metaloproteasas
(p.e.) para favorecer su expansión y extravasación (Figura 8).
En cada una de las vías anteriormente descritas se conocen algunos de los
mediadores o reguladores moleculares principales (master genes) sobre los que
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
Figura 8: El tumor comoun tejido complejo.
Adaptada de Hanahany Weinberg (2000)
se plantean las distintas aproximaciones terapéuticas. Dependiendo de cuál sea
la vía principal y cuál el mecanismo molecular afectado, los argumentos y es-
trategias terapéuticas son diferentes. A modo de ejemplo, ya que es imposible
ser exhaustivo en el marco de este capítulo, mencionaremos las principales es-
trategias desarrolladas y los protocolos técnicos asociados.
Terapia génica del cáncer
Lo primero a tener en cuenta es que los tratamientos clínicos contra el cáncer
son tremendamente eficaces, eliminando un altísimo porcentaje de las células ma-
lignizadas. Los problemas fundamentales derivan bien de la agresividad de los tra-
tamientos, de la aparición de quimiorresistencias cruzadas, o bien de la existencia
de pequeños focos que no se eliminan y que pueden dar lugar a la reaparición de
los procesos neoplásicos. En la actualidad, la mayoría de los procedimientos desa-
rrollados en base a la utilización de TGC distan mucho de ser capaces de sustituir
a los tratamientos clí-
nicos actuales, aunque
pueden aspirar a com-
binarse con ellos.
La Figura 9 pre-
senta de forma muy
esquemática las prin-
cipales estrategias,
agrupadas de acuerdo
con las distintas vías
implicadas en la trans-
formación tumoral.
En términos ge-
nerales, si el princi-
pal proceso afectado
es la eliminación de
los mecanismos de
control negativo de la proliferación, se intentan introducir versiones
correctas de estos genes (p.e. los genes p53 o p16; Chen y col, 2000;
Swisher S.G. y Roth, J.A., 2000; Cowen et al., 2000; Kawacabe et
al., 2000). Si el defecto consiste en la resistencia a los mecanismos
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
Figura 9: Definiciónde dianas en terapiagénica antitumoral.Adaptada de hanahany Winberg (2000)
naturales de inducción de muerte celular programada, se intentan expresar ge-
nes que la pueden promover o hacerla más efectiva (caspasas, FasL, etc). Un
buen ejemplo es el tratamiento de gliomas mediante la expresión de caspasa-8
con vectores adenovirales (Shinoura et al., 2000) Si el tumor es muy depen-
diente de la inducción de neovascularización o es muy propenso a metastatizar,
se introducen genes que puedan bloquear o disminuir dichos procesos (VEGF-
R, análogos de angiostatina, moduladores de integrinas o metaloproteasas, etc;
Chen et al., 2000; Carmeliet, 2000; Abruzzese et al., 2000).
Los procedimientos empleados para realizar la transferencia génica son
muy variados y dependen fundamentalmente de la biología y fisiología del tu-
mor, pero esta etapa es crítica para el resultado final del tratamiento. Se emple-
an vectores virales (adenovirus, adeno-asociados, virus herpes, retrovirus, y
vectores derivados de lentivirus), vectores no-virales (liposomas, dendrímeros,
péptidos, bombardeo con micropartículas de oro que transportan las construc-
ciones génicas, etc), y el procedimiento puede ser in vivo o ex vivo.
Como es imposible en esta presentación hacer una revisión exhaustiva de
todo el panorama en desarrollo del área, nos restringiremos a aquellas aproxi-
maciones más específicas del campo o aquéllas que más se han desarrollado.
Una rama especialmente desarrollada en la TGC es la introducción de ge-
nes pro-citotóxicos en las células tumorales (fundamentalmente la timidina ki-
nasa del virus herpes-HSV-TK-, y la proteína citidin-deaminasa -CDA-) lo que
las susceptibiliza a distintos compuestos (el más empleado es el ganciclovir,
GCV) de forma diferencial con respecto a las células sanas. La administración
de estas sustancias al modelo animal o al paciente, elimina las células tumora-
les transducidas y aquellas que se encuentran en sus cercanías por un fenóme-
no conocido como "bystander", que está mediado por la transferencia de la
droga metabolizada a las células circundantes.
Dos son los modelos tumorales que más atención han recabado de las ex-
pectativas de la TGC, y lógicamente, son los tumores que peor pronóstico pre-
sentan con los tratamientos clínicos actuales: glioma maligno y melanoma
avanzados. El tratamiento de gliomas ha sido evaluado por numerosos autores
(revisado por Klatzman et al., 1998), obteniendo resultados variables. Sandmair
y col, han comparado la eficiencia del tratamiento, bien utilizando vectores re-
trovirales, bien con adenovirus (Sandmair y col, 2000). Sus resultados demues-
tran claramente que los efectos secundarios del tratamiento son aceptables, y
que los pacientes tratados con vectores adenovirales han mostrado una duplica-
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncer
ción del tiempo de supervivencia (MRI), 15.0 meses, en comparación con los
pacientes tratados con vectores retrovirales, 7.4 meses y el grupo control, 8.3
meses.
De 1998 a febrero de 2000 se han hecho públicos varios estudios clínicos
(Fase I/II) para el tratamiento de pacientes con melanoma cutáneo maligno y
metastático, mediante la administración intra-lesión de vectores adeno expre-
sando HSV-TK en combinación con dosis escaladas de ganciclovir (Klantzman
et al., 1998; Morris et al., 2000). En estos estudios se pretende determinar la
dosis máxima de GCV que puede ser administrada en combinación con la ad-
ministración autorizada del vector, evaluar la tasa terapéutica objetiva del ensa-
yo y determinar si existe efecto "bystander" en otras localizaciones lejanas al
punto de tratamiento.
Esta estrategia es bastante efectiva, aunque todavía presenta algunos in-
convenientes como los derivados de: 1) aparición de células tumorales resisten-
tes al tratamiento, 2) eficiencia del proceso de transferencia y 3) generación de
inmunogenicidad por la expresión de una proteína de origen bacteriano (TK).
De forma adicional existe una rama casi exclusiva de la TGC que lidia
con mejorar la respuesta inmune del organismo frente a los tumores (inmunote-
rapia bioquímica y/o celular). En esta aproximación se utilizan también distin-
tas aproximaciones, que se pueden resumir en las siguientes:
1) Aislamiento, amplificación ex vivo, modificación génica (en algunos
casos) y retrasplante en el paciente de linfocitos autólogos del paciente (TILs,
LAKs, ALTs) que presentan afinidad por el tumor (Weijtens et al., 1998; Bol-
huis R.L. y Gratama J.W., 1998).
2) Inmunización con DNA de oncogenes tumor-específicos (p.e - neu en
el caso de cáncer de mama-; Reilly et al., 2000; Amici et al., 2000).
3) Generación de vacunas autólogas, utilizando células tumorales inactiva-
das, primando células dendríticas (revisado por Kirk C. y Mule J., 2000), o po-
tenciando la inmunogenicidad de las células tumorales mediante la introduc-
ción de genes que favorecen el proceso (HGFs, ILs, moléculas accesorias, etc).
Ésta es una de las aproximaciones más evaluadas, con distintas filosofías. Mi-
ller y col ha demostrado que la administración intratumoral de células dendríti-
cas modificadas con adenovirus que expresan IL-7, aumenta la respuesta inmu-
ne antitumoral (cáncer de pulmón) hasta conseguir su erradicación (Miller et
al., 2000). El tratamiento del melanoma también se ha intentado mediante téc-
nicas de vacunación. Osanto y col. han publicado el tratamiento con éxito de
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
33 pacientes afectados por melanoma matastático, mediante su vacunación con
una línea celular de melanoma alogénica, manipulada para producir IL-2
(Osanto et al., 2000). Otros autores han tratado cinco pacientes con células tu-
morales autólogas transducidas para que secreten GM-CSF (Chang et al.,
2000), demostrando una remisión total en uno de los pacientes.
Cualquiera de estas aproximaciones presenta la gran ventaja respecto a los
tratamientos más convencionales de que, al menos teóricamente, sería capaz de
alcanzar los reservorios residuales del tumor (santuarios), que no son elimina-
bles por las terapias convencionales (cirugía, quimio y radioterapia), por lo que
los tratamientos más prometedores podrían ser utilizados en combinación con
los que actualmente se utilizan en clínica. Desde mi modesta opinión, estas
aproximaciones parecen las más realistas y prometedoras para aumentar el ar-
senal terapéutico en la lucha contra el cáncer.
Finalmente se han introducidos nuevos vectores virales citotóxicos con
una particularidad esencial: se replican y amplifican preferentemente en las cé-
lulas tumorales (conditional replication-competent vectors). Actualmente exis-
ten varios modelos preliminares (Alemany et al., 2000; Rancourt et al., 1999)
que necesitarán una posterior etapa de refinamiento y de bioseguridad, pero
que son muy interesantes. En este último estudio se ha desarrollado un modelo
para controlar la producción de partículas infecciosas tras la infección con un
vector adenoviral (Ad5dl312) al que se le había delecionado la función E1A, y
sustituido por una función de síntesis activada por IL-6. La generación de par-
tículas infecciosas depende de la producción celular de IL-6, por lo que el mo-
delo terapéutico tiene un gran interés en tumores que poseen un ciclo autocrino
de IL-6, como el cáncer de ovario.
Una variante de esta última aproximación, que todavía se encuentra en fa-
se de desarrollo, es la utilización de vectores retrovirales replicativos (RRV).
Solly y col. han publicado recientemente un primer estudio en el que comparan
la eficacia de transducción in vivo de los RRV (>85%) en comparación con los
vectores convencionales (<1%), para modificar masas tumorales desarrolladas
en modelos animales inmunocompetentes; los autores proponen el uso de estos
modelos para el tratamiento de tumores cerebrales en los que han demostrado
una eficiencia 1000 veces mayor que los adenovirus deficientes en replicación
(Solly et al., 2003). Si se consiguen derivar vectores RRV condicionales se ob-
tendrá una nueva valiosa herramienta para la lucha contra el cáncer mediante
técnicas de manipulación genética.
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LA SEGURIDAD EN TERAPIA GÉNICA
Problemas ocurridos en el tratamiento de la deficiencia de laOrnitín Transcarbamilasa
Esta es una enfermedad en la que los pacientes carecen de una enzima cla-
ve del metabolismo de aminoácidos –la Ornitín Transcarbamilasa (OTC)–, lo
que da lugar a una acumulación potencialmente fatal de amoniaco en la sangre.
Puesto que la actividad OTC está normalmente presente en el hígado, se consi-
dera que éste es el tejido diana de vectores que expresen la versión correcta del
gen OTC. En virtud de la eficacia de los adenovirus para infectar células hepá-
ticas, se propuso utilizar tales vectores para transducir las células hepáticas de
estos pacientes con el gen OTC. Estudios in vitro, y también en animales de
experimentación, mostraron la eficacia del protocolo propuesto. El tratamiento
de 17 pacientes con dosis progresivamente crecientes del vector no manifestó
efectos tóxicos severos. No obstante, en uno de los pacientes tratados con la
dosis más alta se manifestó un proceso febril seguido de inflamación hepática
y aumento descontrolado de los niveles de amonio, dando lugar a la entrada en
coma del paciente. Lamentablemente, el paciente falleció poco después, estan-
do todavía en investigación la causa primaria de su muerte. El fallecimiento de
este paciente como consecuencia de la inoculación del vector viral disparó las
alarmas de los organismos reguladores, principalmente en lo que se refiere a la
inoculación in vivo de vectores de la familia de los adenovirus. En la actuali-
dad se han generado nuevos vectores adenovirales desprovistos de la mayor
parte del esqueleto viral implicado en la inmunogenicidad de los mismos, por
lo que se confía que su uso prevenga de la generación de respuestas inmunogé-
nicas no previstas.
Incidencia de leucemias en pacientes X1-SCID tratadosmediante terapia génica
Desgraciadamente, tres de los diez pacientes X1-SCID que han sido trata-
dos en el Hospital Necker mediante terapia génica han desarrollado leucemias
asociadas a la inserción del gen terapéutico en la proximidad de oncogenes
(Hacein-Bey-Abina et al 2003). De particular significado ha sido la observa-
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Terapia génica en enfermedades monogénicas y cáncerBIOTECNOLOGÍA APLICADA6º Curso de
ción que en dos de estos pa-
cientes la inserción se ha ob-
servado próxima al oncogén
LMO2, implicado en leuce-
mias linfocíticas. Como se
recoge en la Figura 10, en
ninguno de los otros proto-
colos en marcha, ni tampoco
en los pacientes X1-SCID
tratados en Londres, se han
observado efectos adversos
severos similares.
El conocimiento de las
bases moleculares por los
cuales se han producido las leucemias en estos pacientes aún está por
resolver. No obstante, estas evidencias sugieren la conveniencia de
proseguir los trabajos que tienen por objeto mejorar la seguridad de
los vectores dirigidos a tratar pacientes con esta nueva aproximación
terapéutica.
Como también sucedió con la quimioterapia o la radioterapia,
los primeros efectos severos adversos asociados a la terapia génica
también han quedado ya de manifiesto. En los próximos años los investigado-
res habrán de ser capaces de demostrar que la relación entre el beneficio clíni-
co y el riesgo asociado a la terapia génica es positiva para el paciente. Este he-
cho repercutirá en la expansión de una nueva herramienta terapéutica para
pacientes que no tienen otra opción terapéutica eficaz.
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