MỤC LỤC

MỞ ĐẦU

Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI

1.1. Chất thải nguy hại 1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam 1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại

Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ XỬ LÝ SINH HỌ CHẤT THẢI NGUY HẠI

2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy hại

2.2. Tiềm năng sử dụng các phương pháp sinh thái học vi sinh vật mức độ phân tử để xử lý sinh học chất thải nguy hại

Phần 3 KẾT LUẬN

TAI LIỆU THAM KHẢO

MỞ ĐẦU

Công nghệ sinh học có thể được định nghĩa là “ứng dụng nguyên lý kỹ thuật và khoa học trong việc xử lý các vật liệu bằng tác nhân sinh học để cung cấp sản phẩm và phục vụ”. (Cator,2000). Trong lịch sử, công nghệ sinh học đầu tiên sử dụng nấm men để lên men bia, rượu, váuwr dụng vi khuẩn để tạo sữa chua. Năm 1972, là năm sinh ra công nghệ DNA tái tổ hợp đã đưa công nghệ sinh học tới một tầm cao mới và hình thành một nền công nghiệp mới. sự tiến bộ trong công nghệ sinh học đã thực sự được ghi nhận. Trong vòng 4 năm khám phá ra kỹ thuật DNA tái tổ họp, các vi sinh vật chuyển gen (GMOs) đã tạo ra insulin nguời, interferon, và hocmon sinh trưởng người. Ngày nay, công nghệ DNA tái tổ hợp và các sản phẩm của nó như GMOs được ứng dụng rông rãi trong công nghệ sinh học môi truờng (Glick và Pasternark,1988; Cowan,2000). Xử lý sinh học chất thải nguy hại là một trong những lĩnh vực phát triển mạnh nhất trong công nghệ sinh học môi trường. Sử dụng xử lý sinh học chất thải nguy hại để làm sạch môi trường rất được phổ biến nhờ chi phí thấp và được con người chấp nhận. Thực sự, xử lý sinh học chất thải nguy hại đạt hiệu quả cao, nhanh hơn nữa khi được hỗ trợ bởi kỹ thuật phân tử vốn đã được phát triển trong nhiều lĩnh vực khác nhau trong công nghệ sinh học. Những năm 1990 là thập kỷ cho sinh thái vi sinh vật phân tử phát triển. Việc áp dụng kỹ thuật phân tử giúp các nhà khoa học nhận ra rằng cộng đồng vi sinh vật trong môi trường tụ nhiên có thể phục vụ tốt hơn nhiều các phương pháp nuôi cấy truyền thống. Sử dụng các phương pháp sinh thái học phân tử, như tách chiết DNA trực tiếp từ mẫu môi trường, điên di gel gradient biến tính (DGGE), phương pháp PCR, phương pháp lai phân tử, chúng ta có thể nghiên cứu quần thể vi sinh vật có khả năng phân hủy chất thải trong môi trường. Những phương pháp này hứa hẹn sự hiểu biết điều khiển tốt hơn các quá trình công nghệ sinh học môi trường, nhờ đó cho phép việc xử lý sinh học môi trường bị ô nhiễm và các chất thải độc hiệu quả và ít tốn kém hơn.

Phần 1 TỔNG QUAN VỀ XỬ LÝ SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI

1.1. Chất thải nguy hại

1.1.1.Định nghĩa- Theo UNEP

Chất thải độc hại là những chất thải (không kể chất thải phóng xạ) có hoạt tính hóa học, hoặc có tính độc hại, cháy nổ, ăn mòn gây nguy hiểm hoặc có thể gây nguy hiểm đến sức khỏe hoặc môi trường khi hình thành hoặc tiếp xúc với các chất thải khác.

Chất thải không bao gồm trong định nghĩa trên:+ Chất thải phóng xạ được xem là chất thải độc hại nhưng không bao gồm trong

định nghĩa này bởi vì hầu hết các quốc gia quản lý và kiểm soát chất phóng xạ theo qui ước, điều khoản, qui định riêng.

+ Chất thải rắn sinh hoạt có thể gây ô nhiễm môi trường do chứa một ít chất thải nguy hại tuy nhiên nó được quản lý theo hệ thống chất thải riêng. Ở một số quốc gia đã sử dụng thu gom tách riêng chất thải nguy hại trong rác sinh hoạt.

- Theo Luật bảo vệ môi trườngCTNH là chất thải chứa yếu tố độc hại, phóng xạ, dễ cháy, dễ nổ, dễ ăn mòn,

dễ lây nhiễm, gây ngộ độc hoặc đặc tính nguy hại khác (khoản 11, điều 3, chương 1 Luật Bảo Vệ Môi Trường).

QLCTNH gồm các hoạt động liên quan đến việc phòng ngừa, giảm thiểu, phân loại, thu gom, vận chuyển, lưu giữ, xử lý (kể cả tái chế, thu hồi), tiêu huỷ CTNH (khoản 1, điều 2, chương 1 Thông Tư 12/2006/TT-BTNMT).1.1.2.Đặc tính của chất thải nguy hại

- Chất có khả năng gây cháy: chất có nhiệt độ bắt cháy <600C, chất có thể cháy do ma sát, tự thay đổi về hóa học. Những chất gây cháy thường gặp là xăng, dầu, nhiên liệu, ngoài ra còn có cadmium, các hợp chất hữu cơ nhu benzen, etybenzen, toluen, hợp chất hữu cơ có chứa clo…

- Chất có hoạt tính hóa học cao: Các chất dễ dàng chuyển hóa hóa học; phản ứng mãnh liệt khi tiếp xúc với nước; tạo hỗn hợp nổ hay có tiềm năng gây nổ với nước; sinh các khí độc khi trộn với nước; các hợp chất xyanua hay sunfit sinh khí độc khi tiếp xúc với môi trường axit, dể nổ hay tạo phản ứng nổ khi có áp suất và gia nhiệt, dễ nổ hay tiêu hủy hay phản ứng ở điều kiện chuẩn; các chất nổ bị cấm.

- Chất có tính ăn mòn: Là những chất trong nước tạo môi trường pH < 3 hay pH > 12,5; chất có thể ăn mòn thép. Dạng thường gặp là những chất có tính axit hoặc bazo…

- Chất có tính độc hại: Những chất thải mà bản thân nó có tính độc đặc thù được xác định qua các bước kiểm tra. Chất thải được phân tích thành phần trong các pha hơi, rắn và lỏng. Khi có thành phần hóa học nào lớn hơn tiêu chuẩn cho

phép thì chất thải đó được xếp vào loại chất thải nguy hại. Chất độc hại gồm: Các kim loại nặng như thủy ngân, cadmium, asenic, chì và các muối của chúng; dung môi hữu cơ như toluen, benzen, axeton, cloroform…; Các chất có hoạt tính sinh học (thuốc sát trùng, trừ sâu, hóa chất nông nghiệp…); Các chất hữu cơ rất bền trong điều kiện tự nhiên nếu tích lũy trong mô mỡ đến một nồng độ nhất định thì sẽ gây bệnh (PCBs: Poly Chlorinated Biphenyls).

- Chất có khả năng gây ung thư và đột biến gen: Dioxin (PCDD), Asen, cadmium, benzen, các hợp chất hữu cơ chứa clo…

1.1.3.Nguồn gốc phát sinh chất thải nguy hạiTheo khoảng 2, Quyết định số 23/2006/QĐ-BTNMT, ngày 26/12/2006, Chất

thải nguy hại phát sinh từ 19 nhóm:1) Chất thải từ ngành thăm dò, khai thác, chế biến khoáng sản, dầu khí và than.2) Chất thải từ ngành sản xuất hoá chất vô cơ.3) Chất thải từ ngành sản xuất hoá chất hữu cơ.4) Chất thải từ ngành nhiệt điện và các quá trình nhiệt khác.5) Chất thải từ ngành luyện kim.6) Chất thải từ ngành sản xuất vật liệu xây dựng và thuỷ tinh.7) Chất thải từ quá trình xử lý, che phủ bề mặt, tạo hình kim loại và các vật liệu

khác.8) Chất thải từ quá trình sản xuất, điều chế, cung ứng, sử dụng các sản phẩm che

phủ (sơn, véc ni, men thuỷ tinh), chất kết dính, chất bịt kín và mực in.9) Chất thải từ ngành chế biến gỗ, sản xuất các sản phẩm gỗ, giấy và bột giấy.10)Chất thải từ ngành chế biến da, lông và dệt nhuộm.11) Chất thải xây dựng và phá dỡ (kể cả đất đào từ các khu vực bị ô nhiễm).12) Chất thải từ các cơ sở tái chế, xử lý, tiêu huỷ chất thải, xử lý nước cấp sinh

hoạt và công nghiệp.13) Chất thải từ ngành y tế và thú y (trừ chất thải sinh hoạt từ ngành này).14) Chất thải từ ngành nông nghiệp, lâm nghiệp và thuỷ sản.15) Thiết bị, phương tiện giao thông vận tải đã hết hạn sử dụng và chất thải từ

hoạt động phá dỡ, bảo dưỡng thiết bị, phương tiện giao thông vận tải.16) Chất thải hộ gia đình và chất thải sinh hoạt từ các nguồn khác.17) Dầu thải, chất thải từ nhiên liệu lỏng, chất thải dung môi hữu cơ, môi chất

lạnh và chất đẩy (propellant).18) Các loại chất thải bao bì, chất hấp thụ, giẻ lau, vật liệu lọc và vải bảo vệ.19) Các loại chất thải khác.

1.1.4.Phân loạiTrên thực tế, có nhiều hệ thống phân loại chất thải nguy hại. Hệ thống phân

loại theo tiêu chuẩn Việt Nam phân loại theo các đặc tính của chất thải, TCVN 6706:2009 chia CTNH thành 7 nhóm sau:

Bảng 1: Hệ thống phân loại CTNH theo TCVN 6706:2009

TTMã số BASEL

Nhóm loại Mô tả tính chất nguy hại

1

1.1

1.2

1.3

1.4

H 3

H 4.1

H 4.2

H 4.3

Chất thải dễ bắt lửa, dễ cháy (C)

Chất thải lỏng dễ cháy

Chất thải dễ cháy

Chất thải có thể tự cháy

Chất thải tạo ra khí dễ cháy

Chất thải lỏng có nhiệt độ bắt cháy dưới 60oC

Chất thải không là chất lỏng, dễ bốc cháy khi bị ma sát trong điều kiện vận chuyển, khi bị ẩm, bị ướt thì xảy ra tự phản ứng và bốc cháy, cháy ở nhiệt độ và áp suất khí quyển.

Chất thải có khả năng tự bốc cháy do tự nóng lên trong điều kiện vận chuyển bình thường, hoặc tự nóng lên do tiếp xúc với không khí và có khả năng bốc cháy.

Chất thải khi gặp nước, tạo ra phản ứng giải phóng khí dễ cháy hoặc khí tự cháy.

2

2.1

2.2

H 8 Chất thải gây ăn mòn (AM)

Chất thải có tính axit

Chất thải có tính ăn mòn

Chất thải (bằng phản ứng hóa học) gây ra sự ăn mòn khi tiếp xúc với vật dụng, bình chứa, hàng hóa hoặc mô sống của động vật, thực vật.

Chất thải lỏng có pH bằng hoặc nhỏ hơn 2.

Chất thải thể lỏng có thể ăn mòn thép với tốc độ lớn hơn 6,35 mm/năm ở nhiệt độ 55oC.

3 H 1 Chất thải dễ nổ (N) Là chất rắn hoặc lỏng hoặc hỗn hợp rắn – lỏng tự phản ứng hóa học tạo ra nhiều khí, nhiệt độ và áp suất có thể gây nổ.

4 Chất thải dễ bị ô xi hóa (OH)

4.1

4.2

H 5.1

H 5.2

Chất thải chứa các tác nhân oxy hóa vô cơ

Chất thải chứa peoxyt hữu cơ

Chất thải có chứa clorat, pecmanganat, peoxyt vô cơ, nitrat và các chất oxy hóa khác khi tiếp xúc với không khí, tích lũy oxy thì kích thích cháy các chất hoặc vật liệu khác.

Chất thải hữu cơ có cấu trúc phân tử - O – O - không bền với nhiệt độ nên có thể bị phân hủy và tạo nhiệt nhanh.

5

5.1

5.2

5.3

H 6.1

H 11

H 10

Chất thải gây độc cho người và sinh vật (Đ)

Chất thải gây độc tính cấp

Chất thải gây độc chậm hoặc mãn tính

Chất thải sinh ra khí độc

Chất thải có chứa chất độc có thể gây tử vong hoặc tổn thương trầm trọng khi tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua da với liều nhỏ.

Chất thải có chứa các chất gây ảnh hưởng độc chậm hoặc mãn tính, hoặc gây ung thư do tiếp xúc qua đường tiêu hóa, hô hấp hoặc qua da.

Chất thải chứa chác thành phần mà khi tiếp xúc với không khí hoặc tiếp xúc với nước thì giải phóng ra khí độc đối với người hoặc sinh vật.

6 H 12 Chất thải độc hại cho hệ sinh thái (ĐS)

Chất thải chứa các thành phần mà có thể gây ra tác động có hại nhanh hoặc từ từ đối với môi trường thông qua tích lũy sinh học và/hoặc gây ảnh hưởng đến các hệ sinh vật.

7 H 6.2 Chất thải lây nhiễm bệnh (LN) Chất thải có chứa các vi sinh vật sống hoặc độc tố của chúng, được biết hoặc nghi ngờ

là có các mầm bệnh có thể gây bệnh có người và cho gia súc.

1.1.5.Ảnh hưởng của chất thải nguy hạiTác động của một vài chất thải nguy hại đến môi trường:

Khí SO2

+ SO2 là chất khí không màu, có mùi hăng và cay khi nồng độ trong khí quyển là 1ppm. Sunfurơ là một trong những nguồn ô nhiễm chính trong khí quyển và gây ảnh hưởng tới sức khỏe con người, độ bền vật liệu và là nhân tố chính gây nên mưa axit theo cơ cấu sau:

SO2 + H2O ------> H2SO3

H2SO3 -----> H+ + HSO3- ------> 2H+ + SO3

2-

SO32- + H2O ------> H2SO4

+ Hơi axit gặp lạnh sẽ ngưng tụ thành sương mù axit, chúng tồn tại lơ lửng trong không khí hoặc hấp thụ thêm hơi nước tạo thành những giọt axit loãng H2O - H2SO4 và đó là nguyên nhân gây nên những cơn mưa axit.

+ SO2 tương đối nặng nên thường ở gần mặt đất, ngang với tầm sinh hoạt của con người. Sunfurơ có khả năng hoà tan trong nước cao hơn các khí gây ô nhiễm khác, nên dễ phản ứng với các cơ quan hô hấp của người và động vật. Khi hàm lượng thấp SO2 làm sưng niêm mạc, khi hàm lượng cao (>0,5 mg/m3) SO2 gây tức thở, ho, viêm loét đường hô hấp.

+ Khi có mặt đồng thời SO2 và SO3, chỉ cần nồng độ thấp chúng cũng sẽ có tác động hợp lực, phản ứng sinh lý phát sinh mạnh hơn so với phản ứng của từng chất riêng biệt, thậm chí gây co thắt phế quản mạnh và ở nồng độ cao có thể dẫn đến nguy hiểm chết người.

Các hợp chất chứa Halogen+ Khi hít phải Cl, nó sẽ đi vào phế quản, phế nang. Clo sẽ tiếp xúc với các

chất nhày ướt ở mô sống của cơ thể, tạo ra HClO vượt qua màng tế bào và phá hủy các tế bào, Cl tạo nên dẫn suất nitơ clo hóa.

+ Các hợp chất khí chứa halogen chỉ cần ở nồng độ rất nhỏ cũng đã gây độc, nhiễm độc nặng và có khả năng gây ô nhiễm trên phạm vi rộng lớn.

+ HF gây bệnh sụn xương, viêm phế quản, tổn thương răng. HF hạn chế độ sinh trưởng của cây, làm rụng quả, lép quả.

+ HCl làm giảm độ bóng mỡ của lá, gây thương tổn cho cây trồng, tổn thương vật nuôi và làm giảm lượng sữa.

Các hợp chất hữu cơ+ Các hợp chất hữu cơ thường rất độc với cơ thể người và vật. Một số hợp

chất hữu cơ như Bezen và PAH (hợp chất cacbuahydro thơm đa nhân) có thể là nguyên nhân gây bệnh ung thư.

+ Một số chất hữu cơ halogen là xúc tác cho quá trình phân hủy ozon ở tầng bình lưu. Một số chất hữu cơ hoạt tính khác, lại xúc tiến cho quá trình phân hóa vật chất và đặc biệt một số chất hữu cơ gây ô nhiễm do mùi như các mecaptan và alđêhyt. Mùi này gây cảm giác khó chịu và đôi khi còn kèm theo cả nhiễm độc và là nguyên nhân gây bệnh cho người.

+ Dioxin và furan là những chất rất độc. Ở hàm lượng thấp cũng gây các bệnh về da, phụ nữ có thai khi tiếp xúc với với các chất này sẽ sinh con thiếu tháng hoặc quái thai. Nhiễm độc nặng sẽ gây nên các bệnh về gan, máu, kể cả ung thư và dẫn đến tử vong. Động vật bị nhiễm Dioxin và Furan sẽ giảm trọng lượng tới 50% và sẽ chết trong vòng 2 – 3 tuần.

Kim loại nặng+ Kim loại nặng là khái niệm để chỉ các kim loại có nguyên tử lượng cao,

thường có độc tính đối với sự sống, và thường có liên quan đến vấn đề ô nhiễm môi trường. Nguồn gốc phát thải của kim loại nặng có thể là tự nhiên (như asen-As), hoặc từ hoạt động của con người, chủ yếu là từ công nghiệp (các chất thải công nghiệp) và từ nông nghiệp, hàng hải (tràn dầu)…

+ Việc sử dụng nhiều loại chế phẩm trong công nông nghiệp làm nước và đất ở nhiều vùng, nhất là trong cặn lắng của các dòng sông, bị nhiễm kim loại nặng ở mức độ rất cao.

+ Có một số hợp chất kim loại nặng thụ động và đọng lại trong đất, song có một số hợp chất có thể hoà tan dưới tác động của nhiều yếu tố khác nhau, nhất là do độ chua của đất, của nước mưa. Điều này tạo điều kiện để các kim loại nặng có thể phát tán rộng vào nguồn nước ngầm, nước mặt và gây ô nhiễm đất.

+ Một số chất tẩy rửa gia dụng có chứa các tác nhân tạo phức mạnh (như EDTA, NTA) khi thải ra đã góp phần làm tăng khả năng phát tán của kim loại nặng.

+ Các kim loại nặng có mặt trong nước, đất qua nhiều giai đoạn khác nhau trước sau cũng đi vào chuỗi thức ăn của con người. Chẳng hạn các vi sinh vật có thể chuyển thuỷ ngân (Hg) thành hợp chất metyl thủy ngân (CH3)2Hg, sau đó qua động vật phù du, tôm, cá... mà thuỷ ngân đi vào thức ăn của con người. Sự kiện ngộ độc hàng loạt ở Vịnh Manimata (Nhật Bản) năm 1953 là một minh chứng rất rõ về quá trình nhiễm thủy ngân từ công nghiệp vào thức ăn của con người.

+ Khi đã nhiễm vào cơ thể, kim loại nặng có thể tích tụ lại trong các mô. Đồng thời với quá trình đó cơ thể lại đào thải dần kim loại nặng. Nhưng các nghiên cứu cho thấy tốc độ tích tụ kim loại nặng thường nhanh hơn tốc độ đào thải rất nhiều. Thời gian để đào thải được một nửa lượng kim loại nặng khỏi cơ thể được xác định bằng khái niệm chu kỳ bán thải sinh học, ví dụ với thuỷ ngân chu kỳ này vào khoảng 80 ngày, với cadimi là hơn 10 năm.

Điều này cho thấy cadimi tồn tại rất lâu trong cơ thể nếu bị nhiễm phải.

Bảng 2: Tác hại của một số kim loại nặng

Độc tố kim loại nặng

Mức độ nguy hại

Triệu chứng/Hậu quả lâu dài

Arsenide – Asen (III)

XXXXXNguy hại cho da, hệ thống thần kinh, tim mạch và thâm chí gây ung thư sau 3 – 5 năm.Arsenide – Asen

(V)X

Lead – Pb – Chì XXXTrẻ em: Chậm phát triển thể chất, trí tuệ và tinh thầnNgười lớn: Gây hại thận và tim mạch

Cadmium – Cd – Cadmi

XXXNgắn hạn: Tiêu chảy, tổn thương ganDài hạn: Gây bệnh thận, tim mạch, gan

Nickel – Ni – Niken

XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan

Nickel – Ni – Niken

XX Dài hạn: Giảm cân, hại tim, phổi, gan

Selenium – Se XXRụng tóc, móng tay chân, ngón tay, ngón chân và vấn đề tim mạch

Antimony – Sb XXTăng Cholesterol trong máu và giảm đường huyết

Barium – Ba – Bari

XX Tăng huyết áp

Cyanide (free) – Syanua

XX Nguy hại hệ thần kinh

Chromium – Cr(VI) – Crôm

XX Gây dị ứng, mẩn ngứa

Manganese – Mn – Mangan

XChuyển màu nước từ nâu – đen gây cặn đen và vị tanh

Iron – Fe – Sắt X Màu cam đỏ trong nước, có váng sắt, vị tanhFloride – F – Flo X Gây xỉn răng, ố vàngCopper – Cu – Đồng

X Vị tanh, váng màu xanh

Hg – Thủy ngân X Gây xỉn da, chấm nâu trong lòng trắng mắtAliuminium – Al – Nhôm

X Nước đổi màu

Zinc – Zn – Kẽm X Vị tanh

Sự kiện bị ngộ độc cadimi trên thế giới là sự kiện cũng xảy ra ở Nhật Bản với bệnh Itai - Itai nổi tiếng có liên quan đến ô nhiễm nguồn nước bởi cadimi.

Cadimi dễ dàng tạo ra các tương tác với protein và chuyển vào gan, thận. Thuỷ ngân và chì lại dễ đi vào hệ thần kinh do tạo thành các hợp chất alkyl ái lipit. Các kim loại nặng như chì, cadimi có thể tập trung trong xương, ức chế emzym axit 5-amino-levulin và gây bệnh thiếu máu. Cadimi có khả năng đuổi kẽm khỏi một số emzym và gây bệnh máu heamatopoiesis, v.v…

1.2. Quản lý chất thải nguy hại tại Việt Nam

Nước ta đang trong quá trình chuyển đổi từ nền kinh tế kế  hoạch tập trung sang nền kinh tế thị trường. Với mục tiêu phấn đấu đến năm 2020, về cơ bản Việt Nam sẽ trở thành một nước công nghiệp hóa và tất yếu là sự đô thị hóa ở các thành phố lớn. Theo dự báo, đến năm 2020 tỷ lệ đô thị hóa của nước ta sẽ đạt 45% tương ứng với quy mô dân số đô thị năm 2020 là khoảng 46 triệu người. Với quy mô đô thị hóa của nước ta, gia tăng dân số và công nghiệp hóa như trên thì lượng chất thải nói chung và chất thải nguy hại nói riêng sẽ tăng lên nhanh chóng. Việc xử lý chất thải nguy hại này sẽ là một áp lực rất lớn với công tác bảo vệ môi trường ở nước ta hiện nay và trong tương lai.

Theo số liệu điều tra của Cục Môi trướng, riêng tổng lượng chất thải rắn nguy hại (CTRNH) phát sinh hàng năm chủ yếu tại 3 khu vực kinh tế trọng điểm chính là Hà Nội, Hải Phòng, Quảng Ninh ở phía Bắc, thành phố Hồ Chí minh, Đồng Nai, Bà Rịa - Vũng Tàu ở phía Nam và Quảng Nam, Đà Nẵng, Quảng Ngãi ở miền Trung. Trong đó, CTRNH phát sinh ở khu vực kinh tế trọng điểm phía Nam khoảng 80.332 tấn/ năm, lớn gấp 3 lần khu vực phía Bắc và lớn gấp 20 lần lượng phát sinh ở khu vực miền Trung.

Theo Thống kê của Cục Môi trường, tổng lượng CTRNH phát sinh hàng năm trên toàn quốc là 152.000 tấn, bao gồm chất thải của các ngành công nghiệp nhẹ (60.000 tấn), hóa chất (45.000 tấn), cơ khí luyện kim (26.000 tấn), y tế (10.000 tấn), chất thải sinh hoạt đô thị (5.000 tấn) và chất thải chế biến thực phẩm, điện - điện tử có số lượng ít nhất trong số các ngành trên (2.000 tấn) nhưng lại chứa các chất hữu cơ khó phân hủy như PCB và kim loại nặng, đó là các chất đặc biệt nguy hại tới sức khỏe con người và môi trường.

Bên cạnh các chất thải của các ngành trên còn có chất thải từ thuốc bảo vệ thực vật (BVTV) tồn lưu. Theo số liệu của Cục Môi trường và các sở công nghiệp địa phương, chỉ trong 2 năm 2000 - 2001 , tổng lượng thuốc BVTV tổn lưu trên phạm vi 61 tỉnh/ thành phố là khoảng 300 tấn, trong đó thuốc BVTV dạng lỏng là 9.7.374 lít thuốc BVTV dạng bột là 109.145 kg; các bao bì chứa thuốc BVTV 2.137.850 (bao gồm cả hộp, chai và lọ).

Lượng chất thải rắn y tế phát sinh trên phạm vi toàn quốc theo ước tính của Bộ Y tế năm 2001 là khoảng 12.500 tấn/ năm. Theo số liệu điều tra của Bộ Y tế cho thấy, hiện nay có khoảng 61 lò đốt chất thải y tế được lắp đặt trên toàn quốc, trong đó có 41 lò đã đăng ký thẩm định và có 20/41 lò đạt đủ các yêu cầu về mặt kỹ thuật. Tính đến tháng 6 năm 2002, tổng công suất xử lý của các lò là 30 tấn/ ngày. Tuy nhiên, tại nhiều cơ sở y tế, CTRNH vẫn còn bị để lẫn với các chất thải khác tại khu vực chôn lấp và được chôn lấp tại các bãi rác sinh hoạt.

CTRNH sẽ phát sinh ngày càng tăng trên phạm vi toàn quốc đến năm 2020, phụ thuộc vào các yếu tố như; dân số đô thị, trình độ văn minh, phong tục tập quán cũng như thói quen sinh hoạt và tiêu dùng của từng vùng, nhịp độ phát triển kinh tế và GDP bình quân đẩu người.

Lượng CTR đô thị và khu công nghiệp ở nước ta sẽ tăng ở mức tối thiểu là 0,9 kg/ người/ngày, cho tới năm 2010 và chỉ số này sẽ là 1,3 kg/ người/ ngày tới năm 2020.

Số lượng CTRNH phát sinh ở Việt Nam được các chuyên gia xác định là chưa nhiều nên mức độ ảnh hưởng của nó đến sức khỏe con người và môi trường chưa lớn. Tuy nhiên, trong tương lai, với sự gia tăng dân số và nhu cầu tiêu dùng cùng nhịp độ phát triển kinh tế lớn, số lượng CTRNH ở Việt Nam ước tính sẽ tăng lên gấp 5 lần, đạt 846.000 tấn vào năm 2010 và đạt 1.548.000 tấn vào năm 2020 (số liệu dự báo của Bộ Xây dựng).

Nếu không được quản lý tốt, lượng CTRNH này sẽ tác động đến con người, môi trường và trở thành một gánh nặng kinh tế lớn.

Theo một số chuyên gia môi trường, do thiếu đầu tư ngân sách của các cấp chính quyền và các bộ, ngành trong quản lý chất thải, hiện nay, ngoại trừ Hà Nội, Hải Phòng, thành phố Hồ Chí Minh và Đà Nẵng, các tỉnh thành phố còn lại đều chưa có các bãi chôn lấp chất thải đảm bảo vệ sinh môi trường. Trong khi đó, cả nước chưa có tỉnh, thành phố nào có đủ khả năng xử lý toàn bộ CTRNH phát sinh trên địa bàn.

Thực tiễn công tác quản lý CTRNH trong nước và quốc tế cho thấy, các nước muốn tiến hành công nghiệp hóa đều phải đầu tư xây dựng các trung tâm xử lý tập trung các CTRNH. Các cơ sở phát sinh CTRNH sẽ chuyển CTRNH của mình đến các trung tâm này để xử lý và phải trả chi phí cho việc xử lý. Việt Nam cũng đi theo hướng này để xử lý CTRNH phát sinh trong quá trình phát triển kinh tế - xã hôi. Tuy nhiên cho đến nay, chúng ta vẫn chưa xây dựng được các khu xử lý tập trung các CTRNH . Đã có những dự án bắt đầu được triển khai, Đồng Nai đang là tỉnh đi tiên phong về vẩn đề này. Trong khi chờ đợi có các khu xử lý tập trung CTRNH, hầu hết

các cơ sở sản xuất kinh doanh phát sinh CTRNH đều phải tạm thời tồn trữ CTRNH. Và đây chỉ là một biện pháp tình thế. Vì vậy việc xây dựng các khu xử lý tập trung các CTRNH đã và đang trở thành một trong những vấn đề rất cấp bách của công tác quản lý chất thải.

Theo ông Phạm Khôi Nguyên – Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường, việc xử lý CTRNH có thể thực hiện bằng nhiều phương pháp như: xử lý cơ học, xử lý hóa lý, xử lý nhiệt, chôn lấp.... Hiện nay một số nước như Na Uy, Thụy Điển, Nhật Bản, Hàn Quốc..., ngoài việc áp dụng các phương pháp trên đã nghiên cứu áp dụng phương pháp thiêu đốt chất thải bằng lò nung clinke. Qua khảo sát của Cục Môi trường và Dự án VCEP cùng một số cơ quan liên quan , đây là một phương pháp có một số ưu điểm về mặt kinh tế và kỹ thuật. Phương pháp này đã tận dụng được nhiệt độ rất cao và thời gian lưu cháy dài của lò nung clinke để phá vỡ các cấu trúc bền vững của CTRNH. Hầu hết các loại chất thải hữu cơ dạng rắn và lỏng, kể cả các chất thải có chứa PCB đều có thể thiêu đốt trong lò nung clinke. Tuy nhiên các chất thải này cần phải qua cung đoạn chế thành nhiên liệu, chất phụ gia đạt các tiêu chí nhất định trước khi đưa vào lò nung clinke. Việc thiêu đốt CTRNH trong lò cklinke có thể áp dụng cho rất nhiều loại chất thải nguy hại như: các dung môi hữu cơ, dầu thải chứa PCB, sơn, keo, dán vecni, plastic kể cả PVC, lốp cao su... Quá trình cháy trong lò clinke sẽ phá hủy cấu trúc của các chất nguy hại, tro xỉ còn lại tham gia vào cấu trúc thành phần xi măng mà không gây ảnh hưởng tới thành phần của xi măng.

Ngoài ra, còn có các phương pháp xử lý CTRNH như trung hòa để xử lý chất thải có tính axit hay kiềm ; xử lý nước thải để loại bỏ các chất vô cơ kim loại, xyanua, sunfit trong nước thải và cả các chất hữu cơ; xử lý chất thải nguy hại lỏng/rắn bằng cách rửa đất, chiết dung môi, lọc, hỏa luyện kim, thủy luyện kim, chưng cất. Hoặc phương pháp cố định hóa: ổn định hóa/ hóa rắn. Quy trình này áp dụng cho CTRNH chứa kim loại nặng hay kim loại trong chất thải phải được gắn với một chất nền không rò rỉ. Người ta cũng có thể dùng công nghệ xứ lý sinh học: dùng vi sinh vật gây xúc tác phản ứng hóa học định trước để chuyển hóa chất nguy hại, độc hại sang dạng đỡ nguy hiểm hơn.

Chi phí cho xử lý chất thải nguy hại tùy thuộc vào thành phần, nồng độ chất thải, phương pháp, công nghệ và thiết bị xử lý. Vì vậy, đối với từng loại CTNH khác nhau , chi phí xử lý cũng rất khác nhau. Theo số liệu của Công ty Sam sung Hàn Quốc, chi phí trung bình cho xử lý CTNH tại công ty này khoảng 80 - 90 USD/ tấn. Tại Việt Nam, Cục Môi trường đang phối hợp với một số cơ quan liên quan tổ chức xử lý thí điểm thuốc BVTV, chi phí xử lý dự tính là khoảng 50 triệu đồng/ tấn bằng phương pháp xử lý đốt; từ 30 - 35 triệu đồng/ tấn bằng phương pháp hóa sinh.

Bộ trưởng Bộ Tài nguyên và Môi trường khẳng định hướng xử lý CTNH tập trung bằng cách quy hoạch các trung tâm xử lý CTRNH tại các đô thị và khu công nghiệp. Chính phủ đã dự kiến ưu tiên xây dựng hai trung tâm xử lý CTRNH tại hai khu vực kinh tế trọng điểm phía Bắc và phía Nam. Tuy nhiên, sau 3 năm thực hiện chiến lược này, khu vực miền Trung do được đầu tư nhiều dự án phát triển kinh tế nên khả năng phát sinh CTRNH gia tăng và vì vậy cần thiết phải xây thêm một trung tâm xử lý CTRNH tại khu vực này.

1.3. Xử lý sinh học chất thải nguy hại

Chất thải nguy hại được xử lý bằng các phương pháp như: phương pháp hóa học và vật lý; phương pháp nhiệt; phương pháp chôn lấp trong đó có phương pháp xử lý sinh học. Chất thải nguy hại được xử lý bằng phương pháp sinh học ở điều kiện hiếu khí và yếm khí như chất thải thông thường. Tuy nhiên, bổ sung các chủng loại vi sinh phải thích hợp và điều kiện tiến hành được kiểm soát chặt chẽ hơn.

- Quá trình hiếu khí: quá trình xử lý sinh học hiếu khí là quá trình hoạt động của vi sinh vật chuyển chất hữu cơ thành các hợp chất vô cơ (quá trình khoáng hoá) trong điều kiện có oxy. Sản phẩm của quá trình là CO2, H2O.

- Quá trình yếm khí: quá trình xử lý sinh học yếm khí là quá trình khoáng hoá, nhờ vi sinh vật ở điều kiện không có oxy. Công nghệ xử lý sinh học yếm khí tạo thành sản phẩm khí sinh học CH4 chiếm phần lớn, CO2 và H2, N2, H2S, NH3.

Thông thường biện pháp sinh học ít và khó áp dụng để xử lý chất thải nguy hại do tác động độc hại của độc thất đến cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, ở hàm lượng và loại thuốc BVTV nhất định, có thể sử dụng vi sinh để xử lý.

Xử lý thuốc bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học là quá trình dùng vi sinh vật để khử các chất thải độc hại nhờ các quá trình phân huỷ do sinh vật thực hiện, biến đổi các chất ô nhiễm thành các sản phẩm ít độc hại như: CO2, H2O và một số chất khác. Tuy nhiên, hiệu suất, tốc độ phân huỷ chất ô nhiễm thường thấp, thời gian xử lý kéo dài. Để tăng tốc độ xử lý các chất ô nhiễm, người ta đã tối ưu hoá các điều kiện sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật như: độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy, và một số cơ chất cần thiết...

Điều kiện môi trường tối ưu cho vi sinh vật sinh trưởng và phát triển tất, tạo điều kiện cho quá trình tiêu huỷ thuốc bảo vệ thực vật trong đất đạt hiệu quả cao là:

- pH của môi trường ủ vi sinh giới hạn trong khoảng 4 - 10; các vi khuẩn nấm mốc ưa môi trường axit.

- Dinh dưỡng trong đất ủ đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình sinh trưởng và phát triển của sinh vật, hàm lượng Nhỏ đạt từ 100 - 1000 mg/kg đất thì gây cản trở

phát triển của vi sinh. Ngược lại hàm lượng Nào từ 0 - 110 mg/kg lại thúc đẩy quá trình phân huỷ của vi sinh.

- Nồng độ thuốc bảo vệ thực vật nhiễm trong đất cũng phải nằm trong giới hạn cho phép.

- Yếu tố độ ẩm trong đất ủ: khi độ ẩm đạt toàn phần thì tốc độ phân huỷ thuốc bảo vệ thực vật là cao nhất.

- Độ thoáng khí: việc bổ sung ôxy trong quá trình phân huỷ vi sinh thuốc bảo vệ

thực vật có ảnh hưởng nhất định đến hiệu suất quá trình, điều này đặc biệt rõ rệt khi xử lý phân huỷ thuốc bảo vệ thực vật loại lân hữu cơ. Ngoài ra cần chú . đến các chất độc sinh học trong đất không được vượt quá giới hạn cho phép làm cản trở quá trình vận động của sinh vật.

Bảng 3: Tóm tắt thuận lợi và khó khăn của xử lý sinh học chất thải nguy hại

Phần 2 ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PHÂN TỬ TRONG XỬ LÝ

SINH HỌC CHẤT THẢI NGUY HẠI

2.1. Vi sinh vật và kỹ thuật phân tử ứng dụng trong sử lý sinh học chất thải nguy hại

Xử lý sinh học chất thải nguy hại dựa trên sự phân hủy chất ô nhiễm hoặc lợi dụng khả năng trao đổi chất của vi sinh vật. Biện pháp này phụ thuộc vào hoạt động chao đổi chất của vi sinh vật sử dụng, tối ưu hóa điều kiện cho sự phát triển và phân hủy tại chỗ. Trong nhiều chiến lược xử lý sinh học chất thải nguy hại được thương mại hóa, tập đoàn vi sinh vật sử dụng được xử lý như những “ hộp đen” không gồm việc phân tích các cá thể vi sinh vật hợp thành và cố gắng tìm hiểu được chúng hoạt động thực sự như thế nào hoặc là nếu chúng có mối quan hệ cộng sinh với nhau. Một trong những vấn đề làm đau đầu các nhà khoa học trong việc xử lý sinh học chất thải nguy hại là làm thế nào để nhận biết và mô tả được quần thể vi sinh vật sống tại vị trí bị ô nhiễm. Các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật truyền thống các vi sinh vật phân hủy chất ô nhiễm bao gồm phân lập, phân loại và đặc điểm sinh thái học. Nuôi cấy là một phương pháp truyền thống để xác định các loài vi sinh vật. Các chủng vi sinh vật đặc trưng cho một loài được phân lập từ hỗn hợp nuôi cấy và mọc trên một môi trường đã được tiệt trùng trong thiết bị đã được điều chỉnh nhiệt độ. Các kỹ thuật phụ thuộc vào nuôi cấy như Biolog- mặt sinh lý học ở mức quần thể (CLPP ) cũng được sử dụng để ước tính khả năng trao đổi chất ngoài vị trí của các thành viên trong quần thể vi sinh vật phân lập từ các nguồn môi trường khác nhau. CLPP cung cấp một chỉ số đa dạng trao đổi chất hiện có trong môi trường với lượng cơ chất đã định trước có thể bị trao đổi (Juck và cộng sự, 2000). Những nghiên cứu như vậy có thể không đạt được, tuy nhiên phản ánh được sự đa dạng vi sinh vật và các hoạt động diễn ra. Thực sự, ít hơn 1% tất cả các vi sinh vật đã từng hoặc có thể được nuôi cấy trong phòng thí nghiệm (Trevors,1997; Watanable và Baker,2000). Tập hợp vi sinh vật bao gồm công nghệ sinh học môi trường như bùn hoạt tính và đất/trầm tích, là phức hệ, cho phép chúng tác động lên đa dạng chất ô nhiễm. Vào đầu những năm 1990, khi kỹ thuật phân tử được phát triển để tìm hiểu sinh thái vi sinh vật, các nhà nghiên cứu bắt đầu phân tích các cộng đồng vi sinh vật thích hợp cho sự phân hủy chất ô nhiễm trong môi trường (các vi sinh vật thân thiện với môi trường- ERMs) (Watanable và Baker,2000). Vì vậy bắt đầu nghiên cứu tập hợp vi sinh vật sử dụng sinh học phân tử , như tách AND đích từ mẫu môi trường và sau đó khuyếch đại xác định trình tự gen đặc hiệu. Sau khi nhận diện, trình tự gen có thể đem so sánh với một dữ liệu lớn gồm rRNA 16S, trình tự các sinh vật được phân lập ban đầu. Hình 1 tổng kết các bước chính trong việc mô tả tập hợp vi sinh vật trong mẫu môi trường bằng kỹ thuật phân tử,

nhưng ở hình 1 là kết quả có được khi sử dụng các phương pháp phân rử này để xác định mối quan hệ phát sinh loài trong quần thể vi khuẩn phân hủy hydrocacbon.

Để phân tích các quần thể vi sinh vật, một số sự kết hợp các kỹ thuật phân tử đã được áp dụng, như: Điện chuyển gel gradient biến tính (DGGE), PCR, TRFLP, lai acid nucleic (DNA-DNA, DNA-RNA, RNA-RNA) (Hazen và Jimenez,1988; Harry và cộng sự, 2000). Những kỹ thuật này có những thuận lợi hơn những phương pháp truyền thống vốn thiếu tính đặc hiệu và nhạy cảm cần thiết trong việc điều khiển xử lý sinh học chất thải nguy hại. Các phương pháp dựa trên phân lập và xác định acid nucleic của các cá thể mục tiêu khắc phục được những vấn đề này. Chúng có tiềm năng có ích cho việc phát hiện và điều khiển sự duy trì thường xuyên và phân tán của các vi sinh vật tự nhiên và các vi sinh vật phóng thích vào môi trường (Atlas và cộng sự,1992). Sự kết hợp các phương pháp phụ thuộc vào nuôi cấy ( phương pháp truyền thống) và không phụ thuộc vào nuôi cấy cũng như các kỹ thuật phân tử, hóa sinh cho ta một con đường linh động để thiết lập đa dạng vi sinh vật trong mẫu môi trường. Tính đặc hiệu cao, nhạy của phương pháp PCR phát hiện ra những trình tự DNA đặc hiệu trong các mẫu môi trường phức tạp đã đóng góp quan trọng vào bước tiến tìm hiểu về vi sinh học môi trường (Holben và Tjedje,1998; Holben và cộng sự,1988; Pickup,1991; Bej và Mahbubani,1992; Amann và cộng sự 1995; Onuki và cộng sự, 2000).

Mục đích của các nhà khoa học môi trường không chỉ để hạn chế các chất ô nhiễm, mà xa hơn là để làm sạch các vùng bị ô nhiễm để tránh sự lan truyền dần các chất ô nhiễm tới xung quanh hoặc trên bề mặt nguồn nước.

Hình1 :

Tách chiết DNA

Các kỹ thuật tách chiết DNA trực tiếp hiện nay đóng một phần quan trọng vào việc nghiên cứu sinh thái vi sinh vật. Chúng rất hữu ích để xác định sự có mặt của các vi khuẩn gốc và các vi khuẩn được đưa vào môi trường, GMOs hoặc GEMs là những sinh vật đã được chuyển gen (Torsvik,1980; Steffan và cộng sự, 1988; Sommerville và cộng sự, 1989; Tsai và Olson,1991; Saano và Lindstrom,1995). Với một phân đoạn lớn, thường khoảng 90-99% các tế bào vi sinh vật có trong mẫu môi trường không thể được nuôi cấy trên môi trường vi sinh. Những vi sinh vật nào tồn tại được có thể chỉ thu hồi lại được một phần từ các mẫu môi trường nhờ các phương pháp truyền thống. Việc phát hiện ra chúng thông qua các kỹ thuật phân tử thường yêu cầu phải có hiểu biết thực sự về sintêh thái vi sinh vật trong bất kể môi trường nào.

Hai kỹ thuật khác nhau để phân lập DNA từ đất có thể thực hiện:

- Phương pháp tách chiết tế bào và giải trình tự, hoặc

- Phương pháp phân tích trực tiếp

Hình 2:

Trong kỹ thuật đầu, việc tách chiết các tế bào vi sinh vật từ đất thực hiện trước khi chiết rút DNA, trong khi công nghệ thứ 2 DNA được tách chiết trực tiếp từ đất. Hầu hết các phương pháp được miêu tả dựa trên sự tách chiết DNA từ môi trường nước, đất, và trầm tích (Ogram và cộng sự, 1987; Atlas, 1992; Saano và Lindstrom,1995; Zhou và cộng sự ,1996). Các phương pháp đều có cùng mục đích: lượng DNA tinh khiết được tách chiết có hàm lượng cao thuận lợi cho việc xác định sử dụng sinh học phân tử . Lượng DNA tinh khiết và được tách chiết có thể nhận biết được trên gel agarose và so sánh với ngân hàng DNA. Nồng độ DNA được biểu thị bằng nanogram/ gram trầm tích (đất) khô hoặc nanogram/ml nước (Pickup,1991). Kỹ thuật phân tích trực tiếp này thuận lợi cho việc thu hồi DNA từ vi sinh vật hấp thụ mạnh và ít bị đào thải bằng phương pháp tách chiết tế bào. Kỹ thuật phân tích trực tiếp này cũng gặp phải trở ngại do mùn và độ pH trong đất được tách chiết.

Tất cả các phương pháp đều có mục đích thu được lượng DNA cao và đủ độ tinh khiết cho việc phân tích phân tử bằng phương pháp lai DNA-DNA, phương pháp phân

tích đa dạng chiều dài các đoạn giới hạn cuối (TRFLP) hoặc phương pháp khuyếch đại bằng phản ứng chuỗi polymerase. Các hợp chất mùn và đất sét trong nhiều mẫu đất ức chế quá trình phân tích, và sự có mặt của chất keo collid làm cho việc tách chiết DNA gặp vấn đề. Vì lý do này, thêm một bước tinh sạch trong sơ đồ quy trình phân lập DNA là rất cần thiết (Sambrook và cộng sự,1989; Dijkmans và cộng sự,1993; Volossionk và cộng sự,1995).

Việc phân lập DNA điển hình gồm các bước sau (Sambrook và cộng sự,1989; Pickup,1991): 1. Phá hủy tế bào; 2. Tách DNA từ các thành phần tế bào như polysaccharit và protein; 3. Tinh sạch DNA chiết rút từ các phần đất và các thành phần như các axit humic, đất sét, hoặc ion; 4. Kết tủa DNA.

Như đã từng công bố 300ng DNA và gần 100 ng DNA có thể chiết rút từ 10 g đất (Saano và Lindstrom,1995). Một vài phương pháp thu hồi DNA và kết quả chuyển đổi của nó được chỉ ra trong bảng 4. Quá trình tinh sạch có thể kết hợp siêu li tâm CsCl-EtBr , hydroxylapatite, hoặc sắc ký ái lực, chiết tách chloroform/ phenol, kết tủa etanol, thẩm tách, hoặc xử lý bằng polyvinylpoly-pyrrolidone (PVPP) (Sambrook và cộng sự,1989; Pickup,1991). Trong nhiều trường hợp, sơ đồ tinh sạch tiêu chuẩn không thao tác được với mọi mẫu môi trường, và điều kiện yêu cầu phải thích ứng với một cách phân tích riêng biệt. Một số tạp chí gần đây đã cho thấy tiến bộ của của sự phát triển các phương pháp phân lập DNA (Holben và cộng sự,1988; Sayler và Layton,1990; Pickup,1991).

Bảng 4:

PCR- phản ứng chuỗi polymerase

Sử dụng phương pháp PCR trong vi sinh học môi trường được công bố bởi Bej và Mahbubani (1992). Sự phát triển kỹthuật này đã là một khám phá chính ra phương pháp luận trong sinh học phân tử. Phương pháp này đang được sử dụng trong nhiều phòng thí nghiệm liên tâm đến sinh học phân phân tử từ việc chuẩn đoán đến nghiên cứu sự tinh khiết. Với tính đặc hiệu cao, nhạy PCR có thể phát hiện ra các trình tự DNA đặc trưng của mẫu môi trường hỗn hợp, điều này đã đóng góp rất hữu ích vào sự tiến bộ hiểu rõ về vi sinh vật học môi trường và các lĩnh vực cần nghiên cứu ( như phát hiện ra các bệnh do vi sinh vật gây ra, chuẩn đoán bệnh, phát hiện đột biến, sự hình thành các mẫu dò DNA và sinh sản vô tính từ sản phẩm PCR) (Pillai và cộng sự, 1991; Toze,2000; Watson và Blackwell,2000). Ứng dụng quan trọng nhất thu được từ phương pháp này là nâng cao khả năng phát hiện ra các đầu dò trong các chuỗi gen đặc trưng. Bằng cáh khuyếch đại một chỗi mục tiêu, PCR tăng khả năng phát hiện ra những trình tự hiếm gặp trong hỗn hợp DNA tách ra từ mẫu môi trường. PCR là một kỹ thuật khuyếch đại DNA lớn, hứa hẹn một phương pháp đặc hiệu, nhạy để kiểm soát cá vi sinh vật trong môi trường (Steffan và Atlas,1991). Một quá trình PCR điển hình đòi hỏi một số lượng các chu trình khuyếch đại chuỗi DNA đặc trưng. Mỗi chu trình gồm 3 giai đoạn: Biến tính, bắt cặp, tổng hợp. Một chu kỳ thường kéo dài 3 đến 5 phút. Mỗi bước trong suốt quá trinh khuyếch đại thường thực hiện được là nhờ thiết bị block nhiệt được cài đặt trương trình và tự động.

Nhìn chung, phương pháp PCR gồm chu kỳ lặp lại giữa một nhiệt độ cao với nhiệt độ biến tính DNA, một nhiệt độ tương đối thấp cho phép các primer gắn hoàn toàn vào vùng DNA mục tiêu, và một nhiệt độ trung bình cho phép các primer kéo dài ra hoặc sao chép.

Trong các nghiên cứu về môi trường, phương pháp PCR được sử dụng để phát hiện ra các vi sinh vật, như các vi sinh vật được tháo tác gen (GMOs, GEMs), các bệnh, các sinh vật chỉ định. Steffan và Atlass (1998) sử dụng PCR để khuyếch đại các vùng đặc biệt dài 1.0-kilobase (kb) vốn là một phần trong chuỗi dài 1.3-kb của bộ gen vi khuẩn phân hủy thuốc diệt cỏ Pseudomonas cepacia AC11000 giúp tăng tính nhạy của phương pháp dot-blot các sinh vật. DNA vi khuẩn được phân lập từ mẫu trầm tích (cát, bùn..). Sau quá trình khuyếch đại, P.cepacia AC1100 có thể được phát hiện ngay ở nồng độ 1 tế bào/ g bùn. Điều này làm tăng độ nhạy gấp 103 lần so với mẫu không được khuyếch đại. Chaudhry và cộng sự . (1989) cũng đã sử dụng phương pháp PCR để phát hiện các vi sinh vật được thao tác gen như Pennisetum purpureum. Kết quả phát hiện ra GMOs trong mẫu môi trường nhờ kỹ thuật PCR có trong nghiên cứu của Jansson (1995) và Prosser (1994).

Vai trò quan trọng khác khi sử dụng kỹ thuật PCR là phân tích chuỗi RNA ribosom để nhận diện và mô tả đặc điểm phát sinh loài của các vi sinh vật. Điều này rất thuận lợi trong quá trình nghiên cứu sinh thái vi sinh vật. Xác định phát sinh loài và tìm ra các vi sinh vật quan tâm ngay tại chỗ mà không cần nuôi cấy, công bố bởi Amam và công sự (1995). Số lượng thông tin thu được hiện nay mà liên quan đến các vùng khác nhau và được duy trì cao giữa rRNA 5S và 16S cho phép sự lựa chọn khá đơn giản vị trí mục tiêu của các primer để khuyếch đại chuỗi gen rRNA mong muốn (Olsen vầ cộng sự,1986; Lin và cộng sự,1997; Laupara và cộng sự,2000). Manz và cộng sự (1994) đã chỉ ra làm thế nào các mẫu dò oligosachrit đặc hiệu có thể ứng dụng xử lý tại chỗ các quần thể vi sinh vật trong mùn hoạt tính của 2 cây xử lý nước thải . Trong bài báo khác, các tế bào vi khuẩn trong đất và mùn được phát hiện nhờ phương pháp PCR (Tsai và Olson,1991). Jansson và cộng sự (2000) đã tổng kết sự phát triển mà sử dụng các maker sinh học ( một trình tự DNA đưa vào cơ thể sinh vật vốn khác nhau ở kiểu gen và kiểu hình để quản lý hiệu quả xử lý sinh học chất thỉa nguy hại.

Một ví dụ khác sử dụng kỹ thuật phân tử trong xử lý sinh học chất thải nguy hại là nhờ đặc tính của quần thể vi khuẩn trao đổi metan có tại vị vị bề mặt nước bị nhiễm trichloroethylene (Bowman và công sự, 1993). Các vị trí bị nhiễm hydrocacbon chlororinate, trichloroethylene (TCE), tetrachloroethylene (PCE) có thể đe dọa đến an toàn nguồn nước uống. Sự khoáng hóa hoàn toàn TCE tạo ra CO2 có thể đạt được nhờ kết hợp hoạt động trao đổi metan và trao đổi dị dưỡng của quần thể vi sinh vật. Từ lúc vi sinh vật trao đổi metan được đưa vào tự nhiên, chúng được xem là phương tiện xử lý sinh học chất thải ngay tại chỗ bị ô nhiễm. Đặc điểm của vi khuẩn trao đổi metan

bao gồm phân hủy TCE thực hiện nhờ tách chiết DNA và giải trình tự đầu dò của gen ( gen sMMD của enzyme methane monooxygenase ) trong mẫu môi trường.

Chuỗi gen rRNA 16S

Phương pháp nhận biết này có thể áp dụng được với vi khuẩn cổ như vi khuẩn và Eukarya . Nó dựa vào xác định vị trí phát sinh loài của sinh vật chưa biết được trong sô các sinh vật đã biết. Chuỗi này được xem là tốt nhất cho việc xác đinh tiến hóa của loài vì nó được bảo tồn cao giữa các loài (Head và công sự,1998).

Có thể thu nhận chuỗi rRNA16S bằng rất nhiều cách. Một trong những cách thông dụng và hiệu quả nhất là PCR, có thể tạo bản sao của chuỗi rRNA16S .Sau đó chuỗi này được so sánh với trình tự của các vi sinh vật khác nhau có trong dữ liệu. Woese và cộng sự (1990) đã xây dựng cấu trúc của 3 lớp vi sinh vật ( vi khuẩn cổ, vi khuẩn, eukarya ) trong mối quan hệ với thành phần khác dựa trên sự khác nhau giữa các nucleotide trong chuỗi rRNA16S của chúng. Các cặp trình tự từ các vi sinh vật khác nhau được sắp xếp, và sự khác nhau trong trình tự các nucleotide được tính toán. Số điểm khác nhau tạo cơ sở để xây dựng quá trình tiến hóa giữa các loài. Hơn nữa, biết được vị trí phát sinh loài của một vi sinh vật không cần nuôi cấy, chưa được biêt đến đôi khi có thể cho phép suy ra được đặc tính sinh lý của nó nhờ đó đưa ra điều kiện nuôi cấy để phân lập nó.

Phần 3 TIỀM NĂNG SỬ DỤNG CÁC PHƯƠNG PHÁP SINH THÁI HỌC VI SINH VẬT MỨC ĐỘ PHÂN TỬ ĐỂ XỬ LÝ CHẤT THẢI NGUY HẠI

Để tiến hành xử lý sinh học tại một khu vực thì mối quan hệ giữa ảnh hưởng của việc xử lý và những tác động lên hệ sinh thái cần được làm sáng tỏ. Do đó, việc phân tích các quần thể vi sinh vật chiếm một phần không thể thiếu trong xử lý sinh học tại chỗ. Nhưng cho đến nay, việc phân tích này luôn là một thách thức đối với các nhà sinh vật học do phần lớn các vi khuẩn trong môi trường tự nhiên không thể được nhân giống (nuôi) bằng các kỹ thuật thông thường trong phòng thí nghiệm mà cần bổ sung kỹ thuật nuôi cấy để có thể hiểu sâu hơn về cấu trúc và tính động lực của các quần thể vi sinh vật này (5,6). Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử để phát hiện và xác định vi sinh vật bằng các marker phân tử xác định ngày càng được sử dụng thường xuyên trong các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật, phương pháp này có thể được sử dụng trong xử lý sinh học tại chỗ.

Phát hiện và giám sát vi khuẩn đích Sự phát hiện và giám sát các vi khuẩn đích, liên quan trực tiếp đến sự suy thoái của các chất gây ô nhiễm, là rất cần thiết để theo dõi và tối ưu hóa của quá trình xử lý sinh học. Các phát hiện ở mức độ đơn bào của các vi sinh vật cụ thể cũng được công nhận là một kỹ thuật hiệu quả để phái hiện và liệt kê các vi khuẩn xác định trong một phức hợp các quần thể vi sinh vật (45- 47). Các kỹ thuật phát hiện ở mức độ đơn bào gồm:

Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ

Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ (FISH) với RNA ribosom (rRNA) được gắn các đầu dò oligonucleotide (oligonucleotide probes) đã được sử dụng thành công trong các nghiên cứu sinh thái học vi sinh vật.

Các phân tử rRNA bao gồm các vùng bảo tồn cao xen kẽ với các vùng biến đổi (48,49). Do đó các chuỗi rRNA thường được sử dụng để xây dựng các cây phân loại, các trình tự của một số nhóm và loài vi khuẩn nhất định từ đó được xác định (50-52)

FISH liên quan đến sư lai hóa của tín hiệu huỳnh quang – các đầu dò oligonucleotide đã được đánh dấu nội bào rRNA. Những tế bào có sự lai hóa đặc biệt với các đầu dò có thể được nhận diện và đếm bằng kính hiển vi huỳnh quang. Hiệu quả hơn nữa, phân tích bằng phương pháp đếm tế bào dòng chảy cho phép xác định và đếm một lượng lớn các các tế bào trong một thời gian ngắn (1.000 tế bào/giây) (45).

Tuy nhiên,vể độ nhạy của kỹ thuật FISH, khi sử dụng chuẩn FISH với FITC đơn (mono-FITC) – các đầu dò được đánh dấu phát tín hiệu mạnh chỉ khi các tế bào hoạt động trao đổi chất và do đó chứa một lượng lớn các rRNA (53-55).

Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ HNPP - FISH, sử dụng 2-hydroxy-3-naphthoic axit 2’-phenylanilide phosphate (HNPP) và Fast Red TR. Kỹ thuật này có tín hiệu huỳnh quang gấp 8 lần so với FITC - FISH

Kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ sử dụng các đầu dò oligonucleotide được đánh dấu ở Cy3 cũng có hiệu quả để làm tăng độ nhậy(59,60).

Hình 3: Nguyên tắc của các kỹ thuật lai hóa huỳnh quang tại chỗ.

Kỹ thuật PCR tại chỗ. Kỹ thuật PCR này có thể khuếch đại và phát hiện các gen mục tiêu ở bên trong các tế bào vi khuẩn riêng biệt.

Kỹ thuật này cho phép phát hiện các gen chức năng cụ thể có trong một bản sao đơn lẻ (single coppy) hoặc trong một lượng nhỏ các bản sao (low copy numbers) ở các tế bào nguyên vẹn mà bằng kỹ thuật FISH không thể phát hiện được (61). Ví dụ như Kurokawa và cộng sự (62) đã chỉ ra độ đa dạng và sự phân bố của các vi khuẩn mang gen sltII trong nước sông bằng kỹ thuật PCR tại chỗ.

Bên cạnh đó, sử dụng kết hợp giữa phiên mã ngược tại chỗ với PCR tại chỗ, có thể nghiên cứu biểu hiện gen trong tế bào vi khuẩn đáp ứng với các điều kiện môi trường. Chen và cộng sự (63) đã sử dụng kỹ thuật này để phát hiện Pseudomonas putida F1 biểu hiện gen tod C1 trong nước biển tiếp xúc với hơi toluene.

Hình 4: Nguyên tắc của PCR tại chỗ. (In situ PCR)

Bên cạnh sự phát hiện ở mức độ đơn bào, phương pháp PCR định lượng sử dụng số lượng lớn ADN từ quần thể các vi sinh vật trong tự nhiên có thể là một cách tiếp cận hiệu quả để giám sát các vi khuẩn đích. Nghiên cứu của Nakamura và cộng sự (10) đã thành công trong việc giám sát lượng Ralstonia eutropha KT-1 ở thử nghiệm tăng sinh học trong TCE –nước mặt bị ô nhiễm bằng phương pháp PCR định lượng với LightCyclerTM (Roche) đích theo trình tự lặp đối xứng ngoài gen (REP)

Giám sát thay đổi trong đa dạng vi sinh vật

Quần thể vi sinh vật đóng một vai trò quan trọng trong chu trình địa hóa sinh học và góp phần vào việc duy trì hệ sinh thái (2-4). Do đó, điểu tra ảnh hưởng của xỷ lý sinh học dựa trên quần thể vi sinh vật là cần thiết để chứng minh tính an toàn trong xử lý sinh học tại chỗ. Các phương pháp giám sát thay đổi trong đa dạng vi sinh vật gồm:

Điện di trên gel biến tính gradient (Denaturing gradient gel electrophoresis – DGGE) của PCR khuếch đại phần rDNA 16S được sử dụng như một công cụ tiện lợi và mạnh mẽ để xác định sự khác nhau về thời gian hoặc không gian trong quần thể vi sinh vật và để giám sát sự thay đổi trong đa dạng quần thể vi sinh vật (64-71).

PCR - khuếch đại các phần 16S rDNA từ một quần thể vi sinh vật, về cơ bản có cùng kích thước, có thể tách thành các dải đơn riêng rẽ trong quá trinh điện di trên gel

polyacrylamide có chứa một gradient tuyến tính tăng của DNA bị biến tính. Sự phân tách này dựa trên sự giảm điện tích di động của phân tử DNA bị biến tính một phần trong gel.

Trong DGGE, các phân tử DNA sợi đôi riêng biệt bị biến tính theo trình tự của chúng. Mỗi một phần biến tính của chúng di động và dừng lại tại một vị trí nhất định, bằng cách đó tạo ra các dải riêng biệt trên gel. Do đó, sự đa dạng của quần thể vi sinh vật có thể quan sát thấy bởi các dải riêng biệt trên DGGE. Bằng cách gắn với một GC giữ, GC- nhiều trình tự, các phần DNA, tất cả các trình tự có thể được phát hiện (72).

Các dải riêng biệt có thể được tách ra, tái khuếch đại và xác định trình tự hoặc lai hóa với các đầu dò oligonucleotide để xác định thành phần của quần thể vi sinh vật. Bên cạnh đó, phân tích định lượng các dải mẫu làm cho DGGE trở nên hữu ích hơn khi giám sát tập tính của quần thể vi sinh vật trong một thời gian dài (73-77).

Hình 5: Nguyên tắc của DGGE

Kỹ thuật nghiên cứu tính đa hình chiều dài của các phân đoạn DNA dựa trên đầu cuối của điểm cắt giới hạn (terninal restriction fregment lengh polymorphism) (T-RFLP) (81).

Trong phương pháp này, một tín hiệu huỳnh quang – mồi được đánh dấu sẽ được dùng để khuếch đại một vùng gen của vi khuẩn mã hóa rRNA 16S xuất phát từ quần thể vi sinh vật. Các sản phẩm PCR bị cắt bởi các enzyme giới hạn, và các tín hiệu huỳnh quang- đầu cuối phần giới hạn đã đánh dấu được đo chính xác bởi máy giải trình tự DNA tự động.

Hình 6:

Độ dài các phần sau khi cắt bởi enzyme giới hạn khác nhau và phụ thuộc vào trình tự chuỗi DNA.

Kỹ thuật T-RFLP có độ phân giải cao hơn một chút so với DGGE (82). Marshi và cộng sự đã phát triển mạng lưới các công cụ nghiên cứu cơ bản giúp các nhà điều tra, nghiên cứu có được một con đường nhanh chóng để tối ưu hóa các mồi và các enzyme giới hạn kết hợp trong phân tích quẩn thể vi sinh vật bằng T-RFLP.

Phần 3 KẾT LUẬN

Phương pháp sinh học phân tử cung cấp cho các nhà vi sinh vật học môi trường những công cụ độc đáo với các giá trị đã được thiết lập để nghiên cứu quần thể vi sinh vật, khả năng tiềm tàng của các môi trường cụ thể và các quần thể vi sinh vật phân hủy đặc biệt bao gồm các quá trình xử lý sinh học.

Phương pháp dựa trên DNA đã được chứng minh là đáng tin cây để theo dõi các vi sinh vật cụ thể. Đặc biệt là sàng lọc DNA của chúng có thể được áp dụng như là chỉ số hoạt động của vi sinh vật để đánh giá chất lượng các loại đất, trầm tích, nước… bị ô nhiễm.

Bảng 5: Các mẫu dò DNA của vi sinh vật sử dụng trong các nghiên cứu môi trường

(Theo Hazen và Jimenez, 1988)

Kỹ thuật PCR được sử dụng phổ biến nhất trong nghiên cứu môi trường. Đây là một phương pháp rất hữu ích (theo Bej và cộng sự, 1992) để:

- Theo dõi biến đổi gen (di truyền) của vi sinh vật và giám sát chỉ số các quần thể, các tác nhân gây bệnh trong nước, đất và trầm tích.

- Đo lường sự biểu hiện gen của vi sinh vật tồn tại cũng như phát hiện các quẩn thể cụ thể dựa trên các trình tự gen chẩn đoán.

- Nhân dòng các gen, cho phép tạo ra trình tự gen, thậm chí từ các vi sinh vật rất quan trọng với môi trường nhưng vẫn chưa thể nuôi cấy được.

Sử dụng các axit nucleic (DNA, RNA) là một bước ngoặt trong phân tích môi trường. Nhiều nghiên cứu cho đến nay đã chứng minh được tính khả thi của việc phát triển một loạt các mẫu dò (probes) đặc biệt đối với các gen vi sinh vật quan trọng với môi trường.

Các nhà vi sinh vật học môi trường có thể áp dụng các kỹ thuật này để phát hiện, định lượng vi sinh vật trong môi trường và nghiên cứu chuyển gen, duy trì chúng trong các quần thể tự nhiên.

Kỹ thuật sinh học phân tử có tiềm năng lớn trong phân tích sự đa dạng vi sinh vật, nhưng kết quả của các nghiên cứu này vẫn còn rất ít. Mặc dù sự đa dạng trong các quần thể vi sinh vật là rất lớn nhưng với những phương pháp kỹ thuật này, các chủng vi sinh vật mới có thể được nhận biết, phân lập, mô tả đặc điểm/ tính chất về cả sự phát sinh loài và sinh lý học. Bên cạnh đó, giám sát tại chỗ cũng cho phép chúng ta nghiên cứu về vi sinh vật ngay tại nơi khu trú của chúng.

Các kỹ thuật sinh học phân tử còn cho phép chúng ta có thể kiểm soát, giám sát và phát triển các chiến lược xử lý sinh học tốt hơn, mang lại hiệu quả về chí phí, thân thiện với môi trường và hiệu quả làm sạch môi trường.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Grazyna Plaza, Krzysztof Ulfig, Terry C.hazen, Robin L.Brigmon. Use oF moleculer techniques in bioremediation. 2001.205-218

2. Tomatada Iwamoto and Masao Nasu. Current Bioremediation Practice and Perspective. Journal of bioscience and bioengineering. 2001.

3. M.Vidali. Bioremediation. An overview. 2001. 1163-1172

4. http://www.gr-indtech.com/web/?frame=news&id=42

5. Goggle search: Báo cáo thực tập-Tìm hiểu quy trình xử lý chất thải nguy hại bằng phương pháp lò đốt tại công ty cổ phần Môi Trường Việt Úc