I. Introducción

La correcta identificación de un microorganismo permite entender mejor el comportamiento del mismo, para ello es importante el uso de técnicas especializadas en dicho campo, que permitan establecer diferencias morfológicas, químicas, físicas entre otras. Ante dicha necesidad, la tinción diferencial de Gram nos brinda la solución, pues permite la diferencia de 2 grupos de bacterias: Gram (+) y Gram (-), a partir de la estructura de su pared celular.

Como toda técnica de reconocimiento tiene cierto pasos que debe seguirse con exactitud. Empezando por requerir 4 soluciones el primero, el colorante básico que tiñe la célula; el segundo el mordiente, ayuda en la fijación del colorante en las estructuras; el tercero, el decolorante que retira el colorante en las Gram (-) mientras que en el otro grupo no tiene efecto dicha sustancia es principalmente quien establece diferencias entre ambas divisiones y el cuarto que es el contrastante, da el color contrastante al inicial principalmente en las Gram (-). Expuesto lo anterior se procede a mostrar los procedimientos adecuados así como la fundamentación teóricos para desarrollar dicha técnica.

Objetivos:

Demostrar a través de la técnica de tinción diferencial de Gram, la existencia de dos grupos principales de bacterias.

Comprender el uso de cada compuesto que compone la tinción de Gram y entender su propósito de uso.

Staphylococcus aureus teñida por tinción Gram.

II. Materiales y métodos

Materiales

SAFRANINACRISTAL VIOLETA DECOLORANTE ACEITE DE INMERSIÓN

TUBO DE ENSAYO CON MUESTRA

ASA DE KOLLEPORTA OBEJETOS

MECHERO SOPORTE PARA TINCIÓN

PINZA

MICROSCOPIO

LUGOL

PROCEDIMIENTO

2. Agregar el colorante en exceso: Cristal Violeta. Reposar 30 segundos y lavar la muestra.

3. Agregar el mordiente en exceso: Lugol. Reposar 2 minutos y lavar la muestra.

1. Preparar 4 láminas fijas de:

1 Escherichia coli.

2 Staphylococus aureus.

3 Bacillus cereus.

4 Mezcla de los 3 mencionados anteriormente.

4. Agregar el decolorante 6-8

gotas: Alcohol Acetona. Su adición sirve para retirar el colorante debe repetirse 2 veces de ser posible para una correcta tinción posterior de las Gram (-). Lavar la muestra.

6. Secar la muestra con papel toalla. Debe ser con toque suaves para evitar la perdida de la muestra, seguido limpiar con algodón la parte anterior del cubre objetos para quitar el humo segregado por el mehero. Colocar dos gotas de aceite, colocar al microscopio y observar.

5. Agregar el

colorante contrastante en exceso: Safranina Dejar reposar por 2 minutos y lavar.

III. Resultados

Figura 1 – Escherichia coli (EC) – Gram negativa

Figura 2 – Bacillus cereus (BC) – Gram positiva

Figura 3 – Staphylococcus aureus (ST) – Gram positiva

Figura 4 - Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus

Bacterias (y combinaciones)

Tinción Gram Visualización de la muestra

Escherichia coli (EC).

Gram negativa.

Pequeñas bacterias en forma de cocobacilo (muchas de ellas apenas perceptibles a la vista), de color rosado (no llego a teñirse de rojo intenso como se esperaba).

Bacillus cereus (BC). Gram positiva.

Bacterias medianas en forma de bacilo, de color violeta intenso, mostrando asociación de estreptobacilo.

Staphylococcus aureus (ST).

Gram positiva.Bacterias medianas en forma de coco, de color violeta intenso, mostrando asociación de estafilococo.

Escherichia coli, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus.

Gram negativa, Gram positiva y Gram positiva, respectivamente.

Se observa la comparación del tamaño de las tres bacterias, donde el Bacillus c. y el Staphylococcus a. muestran tener un tamaño idéntico. Mientras que la Escherichia c. muestra tener un tamaño mucho menor a tal punto que llega a ser casi imperceptible a la vista.

IV. Discusión de los resultados

Una de las coloraciones diferenciales más aplicadas en microbiología, la tinción Gram, fue inventada por el médico danés Christian Gram en 1884, cuando buscaba nuevos métodos para colorar bacterias. Dicha tinción consiste en tratar un “frotis” con un compuesto de la pararosanilina (como por ejemplo, el cristal violeta, luego con una solución de ioduro de potasio (lugol), decolorarlo con alcohol y finalmente tratarlo con un colorante llamado contraste (que puede ser la fucsina, safranina, marrón Bismarck, etc). Las bacterias que no pierden el primer colorante luego de ser tratadas con alcohol, apareciendo de color violeta, se llaman Gram positivas. Y aquellas que se decoloran con el alcohol y se decoloran con el segundo colorante o de contraste, apareciendo teñidas de rosado, se denominan Gram negativas. Así, este método sirve para distinguir dos grandes grupos de bacterias. (Garassini L.; 1958).

En la práctica, se trabajo con tres muestras de bacterias: La Escherichia coli, un bacilo Gram negativo relacionado con las vías entéricas (patógeno dentro y fuera de la misma), es la causa más común de infecciones de las vías urinarias y de sepsis por bacilos Gram negativos. Es una de las dos causas más importantes de meningitis neonatal agente que más a menudo acompaña a la “diarrea del viajero”; también es el anaerobio facultativo más abundante en colon y heces. El bacillus cereus, un bacilo Gram positivo, que al igual que los bacillos Gram positivos, es un formador de esporas, y es importante en medicina debido a que causa intoxicación alimentaria. Y por último, el Staphylococcus aureus, que al igual que los demás estafilococos, son cocos esféricos ordenados a menudo en grupos irregulares, siendo un genero importante en medicina junto con el género Streptococus, y careciendo de aparato locomotor y la habilidad de formar esporas. (Wevinson W, Jawtz E.; 1999).

La propiedad de retener el colorante es una particularidad característica no solo de bacterias sino también de levaduras, pero esta propiedad puede variar con la edad de la bacteria y con el pH. Del medio principalmente, pues se observa que cuanto más joven es el cultivo más fuertemente reaccionan los microorganismos Gram positivos, perdiendo esta propiedad a medida que el cultivo envejece, transformándose en Gram negativos (Garassini L.; 1958). Se vuelven Gram negativos debido a que se tiñen por la safranina. Análogo efecto produce en ocasiones por cambios en el medio del organismo, o por ligeras modificaciones en la ejecución de la práctica. Por este motivo, es preciso atenerse, en la práctica del procedimiento establecido (Pelczar M., Reid R.; 1966). Un ejemplo de mala praxis en la práctica, es dejar que el decolorante (el alcohol) actúe durante largo tiempo (en vez de echar unas cuantas gotas a modo de lavado, como se recomienda en la mayoría de los manuales, aplicar una gran dosis y/o dejar reposar el decolorante por mucho tiempo) en la muestra. Consecuencia de ello es que los organismos Gram positivos pueden decolorarse también, de manera que después de que la tinción se completa, aparecerán como Gram negativos. Por otra parte, si la decoloración no se lleva a cabo durante tiempo suficiente (respetar el tiempo establecido

en la práctica de cada colorante), los organismos Gram negativos pueden aparecer como Gram positivos. Por lo tanto, se necesita mucha práctica antes de llevar a cabo la tinción de gran con éxito (Burdon K., Williams R.; 1971).

Este distinto comportamiento de las bacterias se basa en la propiedad que tienen los colorantes básicos, derivados de la pararosanilina, de formar en presencia de soluciones ioduradas, compuestos iodados, que se fijan intensamente sobre ciertas sustancias, combinándose con ellos en forma estable y que los disolventes tardan en descolorar (Garassini L.; 1958).

El cuerpo citoplasmático de algunas bacterias contienen dichas sustancias, fijándose, por lo tanto, el primer colorante fuertemente al actuar la solución de lugol. Los microorganismos, cuyo citoplasma no se combina con los compuestos iodurados del cristal violeta, al tratarlos con el alcohol se descoloran y pierden este colorante, y al tratarlos con otros colorantes se coloran nuevamente (Garassini L.; 1958).

Benians afirma que el yodo forma con e lvioleta genciana una gran molécula soluble en el alcohol, que es arrastrada de las bacterias Gram negativas, y que retienen las Gram positivas; la diferencia se debería a la distinta permeabilidad de la membrana celular en los dos tipos de bacterias. Chruchman cree que los microorganismos Gram positivos poseen una zona cortical que es responsable de la retención del colorante. Stearns y Atarns han demostrado que las proteínas de las bacterias Gram positivas tienen un punto isoeléctrico más ácido que las de las Gram negativas, lo que explica por qué estos microorganismos muestran mayor afinidad por los colorantes básicos (Merchant I., Packer R.; 1970).

Una hipótesis sugiere que en las bacterias quedan reacción positiva (que retiene el cristal violeta) existe un complejo especial de magnesio-ácido ribonucleico-proteína-hidrato de carbono, el cual forma un compuesto insoluble con el colorante y el iodo. Una de las observaciones que apoyan esta hipótesis es el hecho de que, tratando las bacterias gram-positivas con la enzima ribonucleasa, se hacen gran-negativas; la ribonucleasa degrada el ácido ribonucleico, y destruye así el complejo que se une al colorante. (Pelczar M. Reid R.; 1966).

Deuszen afirma que la tinción de Gram se debe a una reacción química dependiente de la propiedad de la nucleoproteína bacteriana de formar nuevos compuestos. La teoría de Churchman ha sido reforzada cerca a la década de los setenta por Henry y Stacey, quienes han logrado despojar a las bacterias Gram positivas de una parte escencial de su material Gram positivo, dejando citoesqueletos y un extracto Gram negativos. Los investigadores mencionados lograron obtener estos resultados realizando un extracto de bacterias lavadas a 60oC con una solución acuosa de una sal biliar al 2%, en presencia de oxígeno. El producto extraído puede precipitarse por el alcohol y consiste en ribonucleato de magnesio, polisacáridos inertes y vestigios de proteínas. Fue posible devolver la Gram positividad a las bacterias “aplicando” el extracto al citoesqueleto. Las bacterias fundamentalmente Gram negativas no responden a esta técnica (Merchant I., Packer R.; 1970).

Una nueva prueba en apoyo de sus investigaciones lo lograron Henry y Stacey cuando consiguieron convertir en Gram negativas algunas especies conocidas por su Gram positivdad, como Streptococcus salivarius cultivándolo en medio totalmente desprovisto de magnesio (Merchant I., Packer R.; 1970).

De todas las citas mencionadas, en síntesis, se concluye que la explicación más aceptable de la tinción Gram es que el material Gram positivo es un complejo macro-molecular, formado por la combinación de un substrato proteico básico reducido, con ribonucleato magnésico (Merchant I., Packer R.; 1970).

Una vez explicado el complejo que se forma en las Gram positivas y les da el color característico diferencial, se explicará a continuación el porqué dicho material no se escapa de las Gram positivas pero si de las Gram negativas una vez que se usa el decolorante.

Burdon K. y Williams R. (1971) nos sugieren que el carácter especial de las paredes celulares de los organismos Gram negativos puede ser el factor determinante. Estas paredes celulares son relativamente delgadas y contienen abundante material graso (quizá diez veces más lípidos que en las paredes de las células Gram positivas). Se ha supuesto que la permeabilidad de las paredes celulares de los organismos Gram positivos puede disminuirse por efecto de deshidratación al entrar en contacto con el alcohol. El alcohol puede aumentar la permeabilidad de los Gram negativos por la extracción de los lípidos de la pared celular hecho que permite el escape rápido del complejo yodo violeta de cristal.

Pelczar M. y Reid R. (1966) nos explican casi lo mismo: Los organismos Gram negativos tienen un elevado contenido graso en sus paredes celulares, ascendiendo hasta el 20% de dichas paredes. Las pruebas experimentales muestran que, durante la práctica del procedimiento, el tratamiento alcohólico extrae las grasas, aumentando la porosidad o permeabilidad de la pared celular en los microorganismos Gram negativos. El complejo cristal violeta-iodo se extrae así por el alcohol, y el organismo Gram negativo se decolora. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas, a causa de su diferente composición, se deshidratan por el alcohol, el tamaño de los poros disminuye, se reduce la permeabilidad, y el complejo cristal violeta-iodo no se extrae.

Una explicación más actual (siglo 21) proviene de Madigan M., Martinko J., Dunlan P. y Clarck D. (2009), dichos autores nos explican lo siguiente: Las diferencias estructurales entre las paredes celulares de bacterias Gram positivas y Gram negativas son las responsables del diferente comportamiento de las células en la tinción Gram. En dicha tinción, se forma dentro de las células un complejo insoluble cristal violeta-yodo que en el caso de las Gran negativas puede extraerse con alcohol, pero no en las Gram positivas. Las bacterias Gram positivas tienen paredes celulares muy gruesas compuestas por varias capas de peptidoglicano (representando el 90% del material de la pared celular). Éstas se deshidratan por el alcohol, provocando el cierre de los poros de las paredes e impidiendo la salida del complejo cristal violeta-yodo. Por el contrario, en las Gram negativas el alcohol penetra rápidamente en la capa externa que es rica en

lípidos y la fina capa de peptidoglicano (representando un total del 10% de la pared celular) no impide el paso del solvente u la extracción del complejo. Después del tratamiento con alcohol, las bacterias Gram negativas son casi invisibles a menos que reciban una tinción de contraste con un segundo colorante en la tinción de Gram.

Prescott L., Harley J. y Klein D. (2002) nos explican básicamente lo mismo que los autores del párrafo anterior, salvo con ciertas anotaciones: La retención del colorante, en Gram positivas, se debe a que el alcohol contrae los poros de la gruesa capa de peptidoglicano. En consecuencia, el complejo colorante-yodo no es eliminado durante la fase de decoloración u las bacterias continuarán de color morado. Por el contrario, la capa de peptidogliano de las bacterias Gram negativas es muy fina, sin tantos enlaces y con poros de mayor tamaño, además, también es posible que el tratamiento con alcohol extraiga suficientes lípidos de la envoltura de las células Gram negativas, como para aumentar su porosidad. Por estos motivos, el alcohol elimina más eficientemente el complejo cristal violeta-yodo en las bacterias Gram negativas.

Con estas citas se concluye, que la naturaleza física de las paredes de las bacterias Gram positivas y Gram negativas, influyen bastante en evitar el escape del complejo cristal violeta-yodo que se forma dentro de las bacterias. Además, recalca la existencia de dicho complejo que se forma en el interior de las células, y que les da el color característico de dicha tinción: morado o violeta.

V. Conclusiones

- La tinción diferencial de Gram efectivamente muestra la existencia de dos grandes grupos de Bacterias: Las Gram positivas y las Gram negativas, tiñéndose de morado y rojo, respectivamente. Dichas bacterias se diferencian principalmente en la estructura de su pared celular.

- Dicha tinción se fundamenta en la formación de un complejo insoluble cristal violeta-yodo en el interior de las células, el cual da el color morado característico de la tinción Gram. Dicho complejo, una vez utilizado el decolorante, es retenido en las bacterias Gram positivas y en las Gram negativas no, esto debido a la diferencia de la estructura de sus paredes celulares: las Gram positivas tienen una gruesa capa de peptidoglicano y las Gram negativas una delgada capa de peptidoglicano junto con una pared externa, además de otras inclusiones en ambos casos.

- Es preciso atenerse al procedimiento establecido en la práctica, además de desarrollar la habilidad de manejo. Esto debido a que una mala praxis puede traer consigo consecuencias no deseadas. Ambas observaciones en conjunto, aseguran el éxito de la práctica a desarrollar.

IV. Bibliografía

- Burdon K., Williams R. 1971. Microbiología. Primera Edición en español. Publicaciones Cultural, S.A. México, D.F.

- Garassini L. 1958. Microbiología. Primera Edición. Editorial Sucre C.A. Venezuela.

- Madigan M., Martinko J., Dunlan P., Clark D. 2009. Biología de los microorganismos. Duodécima edición. Pearson Educación, S.A. Madrid, España.

- Merchant I., Packer. 1970. Bacteriología y virología veterinarias. Tercera Edición española-Primera reimpresión. Editorial Acribia. España.

- Pelczar M., Reid R. 1966. Microbiología. Segunda Edición. Ediciones Castilla, S.A. Madrid, España. Prescott L., Harley J., Klein D. 2002. Microbiología. Quinta Edición. Mc Graw Hill. España.

- Wevinson W., Jawtz E. 1999. Microbiología e inmunología: Autoevaluación y repaso. Segunda Edición en español, traducida de la segunda y tercera ediciones en ingles. Editorial El Manual Moderno, S.A. de C.V. México, D.F.