INMUNOANALISIS
Servicio Medico Legal Santiago Q. L. Ethel Guerrero R. Q. F. L. Vctor Vidal P.
Definicin Tcnicas que utilizan la reaccin antgenoanticuerpo para el anlisis cualitativo y cuantitativo de diversas sustancias. En general se utiliza un anticuerpo como reactivo para detectar o cuantificar lo que nos interesa, el antgeno. Los anticuerpos pueden ser policlonales o monoclonales
Produccin de Anticuerpos Requiere la inyeccin de varias dosis del antgeno o hapteno unido a molcula transportadora inmungena de Peso Molecular elevado, a un animal (conejo, cabra, oveja, caballo) a intervalos regulares, para posteriormente sacrificar el animal y obtener el antisuero.
Anticuerpos Policlonales
Purificacin de anticuerposSeparar el suero
Anticuerpos Monoclonales Se obtienen de manera similar, pero se extrae el bazo o ganglios linfticos para obtener linfocitos B sensibilizados. Se incuban estos con clulas de mieloma de ratn deficitarias de la enzima HGPRT en presencia de PEG para producir la fusin celular y obtener el hibridoma
Cultivados en medio apropiado, por dos semanas, solo crecen los hibridomas, que producen diferentes tipos de Ac. especficos contra el antgeno. Por dilucin se aislan los diferentes hibridomas, obtenindose los clones adecuados, los cuales se cultivan, para producir el Ac. Monoclonal ms adecuado.
Anticuerpos Monoclonales
Linfocitos sensibilizados
Fusin
Hibridomas
Anticuerpos Monoclonales
Cultivo de clulas individuales en pequeo volumen Produccin de Ac Crecimiento continuo
-
+ +
-
+-
+
Anticuerpos Monoclonales
Cultivo en grandes volmenes
Recuperar y purificar el AcMo secretado
Anticuerpos Monoclonales Ventajas con respecto a los policlonales: Alta especificidad, reconocen un nico lugar antignico. Se pueden obtener en cantidades ilimitadas con las mismas caractersticas.
Desventajas: Mayor costo
Ejemplos
Cualitativo o de identificacin: Inmunoblot Cuantitativo: ELISA
Inmunoanlisis con reactivos marcados Dentro de estos inmunoanlisis tenemos:
radioinmunoanlisis enzimoinmunoanlisis fluoroinmunoanlisis luminoinmunoanlisis
Inmunoanlisis con reactivos marcados
homogneos y heterogneos diseo competitivo o no competitivo
Segn el diseo del ensayo
competitivos (de reactivo limitado)
no competitivos (de reactivo enexceso)
Competitivos Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antgeno o anticuerpo. Una cantidad limitada de anticuerpos que es insuficiente para unir todo el antgeno. El antgeno marcado compite con el antgeno sin marcar por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina a partir de la regresin correspondiente.
Competitivo- Captura de anticuerposEAc marcado
E ESustrato
+Ag muestra
Seal
Ag muestra + Ac marcado
Seal
[Ag]
Competitivo- Captura de AntgenoSeal
Antgeno marcado [Ag] Seal
Muestra
Lavado
Mtodos no competitivos o inmunomtricos El antgeno a cuantificar se une a un exceso de anticuerpos. Por ejemplo, con el anticuerpo fijado a la fase slida, revelando con anticuerpo marcado. La concentracin de antgeno se determina a partir de la cantidad de anticuerpo marcado que se une.
No competitivo- sandwich de anticuerposExceso de anticuerpo marcado eliminado por lavado
bloqueanteAg
+ E
E Sustrato
Seal
Seal
Curva standard
[Ag]
Segn el diseo del ensayo
homogneos
heterogneos
Heterogneos: Los ms utilizados. Diversos formatos : micro placas, partculas magnticas, Membranas de nitrocelulosa,
Implican un paso de separacin del antgeno unido del no unido. Por ejemplo ELISA, los pasos de lavado son etapas de separacin.
Homogneos Mas utilizados en drogas de abuso y monitoreo de frmacos Sin pasos de separacin, no se requiere la separacin del antgeno unido del no unido. Ejemplos Emit Cedia
Heterogneos Ventajas Menos interferencias, ms especficos y sensibles Instrumentacin menos costosa Admiten mayor tamao de muestra, as disminuye el lmite de deteccin. Ms verstiles en cuanto a tipo de analito
Homogneos Ventajas Ms precisos Al ser en general automatizados se llevan a cabo sin entrenamiento especial
Desventajas Son ms costosos en reactivos En general slo sirven para frmacos
Desventajas Ms difciles de automatizar Mayor tiempo de anlisis
Heterogneos Algunos mtodos de separacin: Precipitacin fraccionada con sulfato de amonio, etanol en fro o PEG. Unin de la forma unida a una fase slida (EIA, partculas magnticas) Centrifugacin
Homogneos Caractersticas La cuantificacin de la reaccin Ag-Ac en los EIA homogneos se realiza por cambios en la seal proveniente de la marca sin hacer separacin fsica de las formas libre y unida. El cambio de seal depende de la inhibicin , activacin o cambios conformacionales en la enzima. Monitoreo teraputico de frmacos (digoxina) deteccin de drogas de abuso.
HomogneosAc
AgEnzima
Ag
Sustrato Ag
HomogneosSAg
Enzima activa
Enzima inactiva
Deteccin y Cuantificacin:Las medidas se pueden hacer con: - un simple espectrofotmetro o con - un analizador automtico de qumica clnica.
Inmunoanlisis con reactivos marcadosCon compuestos radiactivos: RIA inmunoanlisis heterogneo y competitivo
IRMA inmunoanlisis heterogneo no competitivo
Inmunoanlisis con reactivos marcadosENZIMOINMUNOANALISIS: Las ms utilizadas son: peroxidasa fosfatasa alcalina Glucosa 6-fosfato deshidrogenasa B- galactosidasa
Ventajas disponibles comercialmente se pueden conjugar por tcnicas simples tienen varios sustratos
ENZIMOINMUNOANALISIS Enzimoinmunoanlisis homogneos:- EMIT - CEDIA
- Enzimoinmunoanlisis heterogneos: - ELISA
FLUOROINMUNOANALISIS Fluoroinmunoanlisis homogneos: - FPIA (de polarizacin de fluorescencia) - SLFIA (sustrato marcado) - FETI (transferencia de la energa de fluorescencia) - Fluoroinmunoanlisis heterogneos: - DELFIA (disociacin aumentada por lantnidos)
Inmunoensayos de FluorescenciaFluorforosO
HO
O
O C OH R2
FluorescenaR1
Quimioluminiscencia Es el fenmeno que ocurre en las lucirnagas y consiste en: una reaccin qumica con un muy alto rendimiento energtico produce una molcula potencialmente fluorescente. (No hay excitacin luminosa como en la fluorescencia) Usualmente son reacciones redox catalizadas por enzimas que involucran O2 o H2O2 y un sustrato orgnico oxidable. La energa se libera como luz visible.
Se utiliza para detectar concentraciones muy bajas de molculas, menor lmite de deteccin que en los mtodos isotpicos y en otros enzimticos.
Tcnica analtica Quimioluminiscente Para inmunoensayos se marcan Ag o Ac con sustancias que participan en la reaccin quimioluminiscente (luminol, peroxidasa), y la quimioluminiscencia es el paso final en la deteccin. Se hacen en homogneas fase slida, o en tcnicas