CENTRO DE INVESTIGACION Y DE ESTUDIOS AVANZADOS DEL
INSTITUTO POLITECNICO NACIONAL
UNIDAD ZACATENCO
DEPARTAMENTO DE GENÉTICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
“Transportadores gliales relevantes en la sinapsis glutamatérgica”
TESIS
Que presenta
M. EN C. ORQUIDIA GUADALUPE MÉNDEZ FLORES
Para obtener el grado de
DOCTOR EN CIENCIAS
EN LA ESPECIALIDAD DE
Genética y Biología Molecular
Directores de la Tesis
Dr. Arturo Ortega Soto, Departamento de Toxicología, Cinvestav
Dra. Angelina Rodríguez Torres, Universidad Autónoma de Querétaro
Ciudad de México. Mayo, 2016
II
Agradecimiento a CONACYT:
El presente trabajo se realizó en el Centro de Investigación y de Estudios
Avanzados del Instituto Politécnico Nacional en el Departamento de Genética y
Biología Molecular, con el financiamiento del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología (CONACYT) a través de la beca de doctorado No. 290749.
III
Agradezco a: El Dr. Arturo Ortega por ser mi mentor y por compartir sin reservas su gran experiencia. A mi Comité de evaluación por incentivarme a esforzarme constantemente. Agradezco la asesoría técnica de la M. en C. Luisa Clara Regina Hernández Kelly, de la Técnico en Investigación Blanca Rocío Ibarra López y del IBQ Luis Ángel Cid Cid. A todos mis compañeros de laboratorio, que han sido muchos, a lo largo de estos años, por tan grata compañía. A esta gran institución: Cinvestav, forjadora de mentes inquietas. Gracias Gabriel López, por ser quien incondicionalmente está a mi lado.
Dedico este trabajo a mis Queridos Padres y Hermanos.
IV
Contenido
I. Agradecimientos p. 2, 3 II. Resumen p.5 III. Abstract p.6 IV. Acople de la captura de glutamato y de la captura de glucosa en las células
gliales de Bergmann p.7 a. Introducción p.8 b. El Glutamato p.8 c. Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato/ glutamina y la
lanzadera de lactato p.10 d. Receptores Glutamatérgicos p.13 e. Transportadores de Glutamato p.15 f. Células Gliales de Bergman p.18 g. Transportadores de glucosa p.19 h. Transportador de glucosa GLUT1 p.20 i. Planteamiento del problema p.22 j. Resultados y discusión p.23 k. Conclusión p.33
V. El Glutamato Regula la plasticidad funcional del transportador de GABA GAT-3 en células gliales de Müller p.35
a. Introducción p.35 b. El GABA p.35 c. Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato-GABA/ glutamina
p.36 d. Transportadores de GABA p.36 e. Células gliales de Müller p.37 f. Planteamiento del problema p.38 g. Resultados y discusión p.39 h. Conclusión p.49
VI. El Glutamato regula su propia captura a través de receptores ionotrópicos en la línea celular humana MIO-M1 p.50
a. Introducción p.51 b. Línea celular humana MIO-M1 p.52 c. Planteamiento del problema p.53 d. Resultados y discusión p.54 e. Conclusión p.62
VII. Metodología general p.63 VIII. Referencias p.72 IX. Anexos p.80
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Resumen El Glutamato (Glu) y el GABA son los principales neurotransmisores excitador e inhibidor en
el sistema nervioso central (SNC), funcionan a través de la activación de sus receptores y
transportadores específicos presentes tanto en poblaciones neuronales como gliales. Las
células gliales son el tipo celular más abundante en el SNC y son elementos importantes
que están en constante comunicación entre ellos y con las neuronas.
Los sistemas glutamatérgicos y GABAérgicos tienen como punto de convergencia las
interacciones metabólicas descritas por el ciclo Glu/GABA/Gln, el cual supone que los tres
aminoácidos comparten la misma fuente de esqueletos de carbono y que solo actividades
enzimáticas y de transporte en diferentes compartimentos celulares permiten la inter-
conversión entre ellos y tránsito entre las neuronas y las glias.
La células de Bergmann (CGB) y las de Müller (CGM) son glias radiales presentes en los
organismos adultos, que no tienen características finales de astrocitos, sino más bien se
asemejan a progenitores del SNC. Estos dos tipos celulares están estrechamente
relacionados a sinapsis glutamatérgicas in situ, por lo tanto es de particular importancia
describir las diversas señalizaciones que el Glu produce en sus sistemas de transporte
relacionados. Mediante diversos ensayos de proteína y de transporte de sustrato
encontramos que el Glu regula a la alza la expresión y funcionamiento de los
transportadores de glucosa (GLUTs) y su interacción con EAAT1/GLAST (Glu/D-Asp
transporter) en las CGB de pollo, mientras que disminuye la expresión membranal y
funcionamiento del transportador de GABA 3 (GAT3) de manera dependiente de receptores
tipo AMPA en las CGM de pollo, finalmente, el Glu aumenta el sistema de transporte de D-
Asp y la asociación relevantemente funcional de EAAT1 con Ezrina y GFAP en las células
MIO-M1 (CGM de origen humano).
Los resultados aquí descritos describen mecanismos moleculares atribuibles en
condiciones basales y que bajo condiciones patológicas se asume se ven alterados.
Palabras clave: MIO-M1, Bergmann glía, Müller glía, GLUT1, GLAST, GAT3, AMPA
receptor.
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Abstract Glutamate (Glu) and GABA are the major excitatory and inhibitor neurotransmitter in
the central nervous system (CNS), they function through activation of its specific
receptors and transporters which are present both in neuronal and glial populations.
Glial cells are the most abundant cell type in the CNS and are important elements
that are constantly communicating with each other and with neurons.
Glutamatergic and GABAergic systems have the convergent point in metabolic
interactions described as the Glu / GABA / Gln cycle, which assumes that the three
amino acids share the same source of carbon skeletons cycle and only enzymatic
and transport activities in different cellular compartments allow them inter-convert
between the different substrates and transit between neurons and glia.
The Bergmann (CGB) and Müller (CGM) cells are radial glia present in adult
organisms, which have no final characteristics of astrocytes but resemble CNS
progenitors. These two cell types are closely related to glutamatergic synapses in
situ, therefore is particularly relevant to describe the diverse signaling pathways that
are related to Glu transportation systems. Protein and substrate transport assays
indicated that Glu regulates upward expression and functioning of glucose
transporters (GLUTs) and its interaction with EAAT1 / GLAST (Glu / D-Asp
transporter) in the CGB chicken, while decreasing cell membrane expression and
functioning of GABA transporter 3 (GAT3) depends on AMPA receptor activation in
CGM chicken; finally the Glu increases the transport system D-Asp and functional
association of EAAT1 with Ezrin and GFAP in the MIO-M1 (CGM of human origin)
cells.
The results described here entail molecular mechanisms under basal conditions; the
same that under pathological conditions are assumed to be disturb.
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Acople de la captura de glutamato y de la captura de
glucosa en las células gliales de Bergmann
8
Introducción El cerebro y la médula espinal integran el sistema nervioso central (SNC), éste se
conforma principalmente por dos tipos celulares: las neuronas y las células gliales.
Éstas últimas representan la mayor parte de la población celular en el cerebro de los
mamíferos, dependiendo de la región o el tejido al que se refiera, pero en general se
ha estimado una proporción de 1.3 a 1.5 de glía/neurona (Pelvig et al., 2008; Mota
and Herculano-Houzel, 2014).
La células gliales realizan muchas funciones a lo largo del desarrollo, durante el
funcionamiento normal y en condiciones patológicas del sistema nervioso; algunas
de ellas son: el soporte físico para la migración neuronal, puente metabólico para el
abasto energético, control de la entrada y salida de sustancias desde el torrente
sanguíneo hacia el cerebro, señalización neurotrófica, modulación de la plasticidad
sináptica y transmisión controlada de información a través del sincitio glial por
regiones funcionales (Elsayed and Magistretti, 2015).
El Glutamato El aminoácido Glutamato (Glu) ha sido reconocido por largo tiempo como el principal
neurotransmisor del SNC en vertebrados (Fonnum, 1984), ya que el cerebro humano
tiene aproximadamente 10 x 1013 contactos sinápticos, de los cuales más del 90%
también son glutamatérgicos. Por su parte el ácido gamma-aminobutírico y la glicina
son los principales neurotransmisores inhibidores del SNC (Nicholls, 1993).
El ácido glutámico es transformado en GABA a través de la enzima glutamato
descarboxilasa (Kandel et al., 2000). Es un componente esencial del metabolismo
intermediario, es un bloque estructural en la formación de proteínas y de ácidos
nucleicos, es una potente neurotoxina y sirve como fuente energética (Bak et al.,
2006). Cuando el Glu ingresa en los astrocitos éste puede ser aminado por la enzima
glutamina sintetaza (GS) ó desaminado por las enzimas Glu-decarcarboxilasa o
transaminasas para convertirse en α-cetoglutarato, entonces oxidarse a succinato,
fumarato y malato, para ser procesado en el ciclo de los ácidos tricarboxílicos (TCA,
9
pos sus siglas en inglés), o descarboxilarse para formar piruvato y reducirse a lactato
(Danbolt, 2001).
Las concentraciones de Glu en el plasma sanguíneo son de 50 a 100 µM (Stegink et
al., 1982), 10 µM a 30 µM en el líquido cerebro-espinal, mientras que en el cerebro
oscilan entre 5 y 15 mM por kilogramo de peso húmedo (Danbolt, 2001). En el
espacio extra-celular se encuentra de 3 a 4 µM en condiciones basales, sin embargo
durante la neurotransmisión es al menos de 1 mM (Clements et al., 1992), aunque la
mayoría está almacenado intracelularmente (1-10 mM), ya que las vesículas
presinápticas de las neuronas contienen alrededor de 150 mM, contrariamente, en el
citoplasma de las poblaciones gliales se estima alrededor 0.6 µM dado que es
rápidamente incorporado a alguna de las vías antes mencionadas (Danbolt, 2001;
Lanz et al., 2014)
Cuando el Glu almacenado en vesículas presinápticas es liberado por exocitosis
dependiente de Ca2+ al espacio sináptico, activa a sus receptores ionotrópicos
(iGluR, que forman canales iónicos) y metabotrópicos (mGluR, que actúan a través
de segundos mensajeros), pero la es rápidamente removido a través de la captura a
través de los transportadores de aminoácidos excitadores específicos dependientes
de Na+, los EAATs (Excitatory Amino Acid Transporters) que se encuentran tanto en
la terminal pre-sináptica como en las células gliales que rodean los contactos
sinápticos (Danbolt, 2001).
El Glu es producido mediante la ruta general de síntesis de aminoácidos o por la
transaminación del α-cetoglutarato. Dado que se considera que las neuronas son
deficientes en la enzima piruvato carboxilasa (requerida para formar intermediarios
del TCA), se supone que no son capaces, en su mayoría, de sintetizar el Glu de novo
para sus neurotransmisiones y por lo tanto dependen del ciclo Glu/Gln y de sus
respectivos almacenes neuronales y astrocíticos (Broer and Brookes, 2001)
10
Acople metabólico glía-neurona: El ciclo glutamato/ glutamina y la lanzadera de lactato
Por largo tiempo se ha propuesto que la transmisión glutamatérgica depende de un
acoplamiento metabólico y energético entre las neuronas y las células gliales (van
den Berg and Garfinkel, 1971; Volk et al., 2015). La disponibilidad del Glu para ser
liberado por la neuronas involucra el funcionamiento adecuado de proteínas gliales,
como son los transportadores de Glu, la enzima GS y los SNATs. Un modelo bien
aceptado de este acople es el “el ciclo Glu/Gln” (Waagepetersen et al., 2007). La
propuesta es que el Glu liberado desde la pre-sinapsis activa a sus receptores post-
sinápticos y difunde a las glias cirundantes donde es capturado mediante los
transportadores gliales GLAST (EAAT1) y GLT1 (EAAT2) para posteriormente
convertirse a Gln por la enzima glutamina sintetasa (GS, expresada en astrocitos), la
Gln es expulsada al espacio extracelular por el simporte de un ion Na+ y el antiporte
de un H+, a través del sistema N (SNAT, Sodium-coupled Neutral Amino acid
Transporters, 3 y 5), entonces es capturado por las neuronas mediante el sistema A
(SNAT 1 y 2) de transporte de glutamina y es reconvertido a Glu gracias a la
glutaminasa dependiente de fosfato (PAG) (Broer and Brookes, 2001).
Un hito relevante de este acople es la comprobación de proximidad física y el
consecuente funcionamiento articulado de los diversos elementos moleculares que
intervienen en una vía metabólica. En este sentido, se ha encontrado que la ATPasa
Na+/K+, que es requerida para expulsar el exceso de iones sodio que ingresan a las
células gliales cuando el Glu es capturado mediante los EAATs, algunas enzimas
glucolíticas y la mitocondria, forman complejos funcionales con los transportadores
específicos de Glu (Rose et al., 2009; Genda et al., 2011; Bauer et al., 2012).
Adicionalmente se ha encontrado que la captura de Glu está relacionada a la
liberación de Gln, de tal modo que existe una interacción física y funcional entre
EAAT1 y SNAT3 en las células de glía de Bergmann (CGB) (Martinez-Lozada et al.,
2013).
Existe un cierto consenso respecto a algunas partes de este modelo, por ejemplo la
actividad de la enzima PAG para convertir Gln a Glu es específica de las neuronas
11
(Kvamme et al., 2001), la anaplerosis del Glu tiene que ubicarse en los astrocitos, ya
que ellos son los que principalmente expresan la enzima piruvato carboxilasa (PC)
(Shank et al., 1985), mientras que la Gln tiene que proceder de los astrocitos, ya que
expresan casi de manera exclusiva la GS en el SNC (Norenberg and Martinez-
Hernandez, 1979). Sin embargo, no toda la Gln es generada a partir del Glu
capturado en los astrocitos, ya que éste último puede tomar otros caminos y entrar al
TCA y ser oxidado para producir alrededor de 20 moléculas de ATP (McKenna,
2007), por tal motivo existen argumentos en contra de que la captura de Glu no
conlleve la activación de la captura de glucosa y que en vez de un ciclo Glu/Gln
existe una lanzadera de Gln, ya que esta misma puede provenir de intermediarios del
TCA (Verkhratsky and Butt, 2007) o trans-aminaciones de otros aminoácidos
(McKenna, 2013).
EL ciclo glutamato-glutamina. El Glu liberado en la sinapsis ejerce su función mediante la activación
de sus receptores en la post-sinapsis y la transmisión es terminada mediante la remoción por EAATs.
Dentro de los astrocitos el Glu puede seguir tres caminos: ser convertido a Gln mediante la GS, ser
substrato de la enzima Glutamato descarboxilasa (GDH) para producir alfa-cetoglutarato (α-KG) o ser
desaminado mediante enzimas aminotransferasas como la amino transferasa de Asp (AAT) o la
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aminotransferasa de amino ácidos ramificados (BCAT), siendo así substrato que será oxidado en el
TCA (Stobart and Anderson, 2013)
Hace más de un siglo, Charles Sherrington sugirió que la actividad neuronal y el
metabolismo están estrechamente acoplados (Nicholls, 1993). En efecto, existe
evidencia respecto a que algunas áreas discretamente activadas aumentan el
consumo local de glucosa, alrededor de un 20% (Raichle, 2003); ésta es uno de los
fundamentos para el modelo energético de que el cerebro de mamíferos es
abastecido por la oxidación de glucosa (Verkhratsky and Butt, 2007)
La hipótesis de la lanzadera de lactato Astrocito-Nuerona (ANLSH, por sus siglas en
inglés) supone el uso de sustratos energéticos alternativos a la glucosa, que son de
uso común para el abastecimiento en la transmisión sináptica glutamatérgica, como
el lactato (Verkhratsky and Butt, 2007). De este modo, un sistema eficiente de
captura de Glu aumenta la concentración de sodio e induce el trabajo de la ATPasa
NA+/K+, además de que la GS también consume ATP al producir Gln,
consecuentemente la captura de glucosa aumenta, tanto para generar lactato (que
puede ser capturado y oxidado en las neuronas) que liberan extracelularmente los
astrocitos, como para abastecer sus propias demandas energéticas y anabólicas
(Bittar et al., 1996).
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Hipótesis de la lanzadera de lactato astrocito-neurona. El Glu liberado en la sinapsis es capturado
por los astrocitos a través de los EAATs (GLT1 y GLAST), los cuales co-transportan tres iones sodio
por cada Glu, por lo tanto el desbalance iónico es compensado por el funcionamiento de la ATPasa
Na+/K+ y la Gln formada por la GS a partir del Glu. Ambos procesos consumen ATP, en consecuencia
la tasa de captura de Glucosa incrementa y el metabolismo no oxidativo de la misma también, lo cual
se deriva de la isoforma LDH5 (lactato-deshidrogenasa 5) de alta afinidad a piruvato que está
presente en astrocitos, favoreciendo así la conversión a lactato. El transportador 4 de
monocarboxilatos (MCT4) expulsa el lactato hacia el espacio extracelular, de donde es capturado por
las neuronas mediante el (MCT2). Aunque en condiciones basales la neuronas pueden capturar
eficientemente la glucosa, durante la transmisión sináptica se ha reconocido que más fácilmente
pueden oxidar un sustrato como el lactato (Magistretti and Allaman, 2015).
Receptores glutamatérgicos
En los mamíferos se han identificado 22 subtipos de receptores glutamatérgicos, que
han sido categorizados en dos principales clases: los ionotrópicos (iGluR) y los
metabotrópicos (mGluR). Los primeros son canales iónicos abiertos por ligando de
acción rápida; mientras que los segundos son receptores de siete segmentos
transmembranales acoplados a proteínas G (Gasic and Hollmann, 1992).
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Los iGluR son subdivididos de acuerdo a sus propiedades farmacológicas, se
reconocen los de tipo NMDA (N-metil-D-Aspartato), los receptores tipo AMPA (ácido
α-amino-3-hidroxi-5-metil-4-isoxazol propiónico) y los receptores de ácido kaínico
(KA). Por su parte los mGluR integran tres grupos (I-III) y están catalogados
conforme a sus similitudes en la estructura primaria y rutas de segundos mensajeros
involucrados en sus mecanismos de señalización (Gasic and Hollmann, 1992).
Diversos sistemas de nomenclatura han identificado a los receptores ionotrópicos de
Glu, sin embargo el creciente descubrimiento de unidades heteroméricas ha
incentivado el desarrollo de nomenclaturas sistemáticas que faciliten la identificación
de las mismas, por ejemplo la nomenclatura de la Unión Internacional de
Farmacología (IUPHAR, por sus siglas en inglés) descrita en la tabla a continuación
(Collingridge et al., 2009).
Fuente: http://www.guidetopharmacology.org/LGICNomenclature.jsp
Los receptores ionotrópicos de glutamato son canales abiertos por ligando de
respuesta rápida (< 1 s) que forman estructuras transmembranales de 4 a 5
subunidades arregladas radialmente en torno al poro central que es permeable a
cationes, cada subunidad consta de un extremo amino-terminal extenso (S1) que
interactúa un asa extracelular (S1) para formar el sitio de unión para el agonista,
existen tres fragmentos transmembranales (TM1, TM3 y TM4) con un solo segmento
re-entrante (MD2) que se inserta desde la cara citoplasmática (entre TM1 y TM3) y el
extremo carboxilo terminal de ubicación citoplasmática que funciona como sitio de
15
interacción con proteínas de de la densidad post- sináptica de dominios PDZ
(Madden, 2002).
Los receptores metabotrópicos son polipéptidos extensos (~1000 aa) con un extremo
amino-terminal largo (~600 aa) que aloja el sitio de unión para el agonista y un
dominio rico en cisteínas, cuya función es estabilizar la estructura tri-dimensional, a
continuación se reconocen los siete segmentos transmembranales y un extremo
carboxilo terminal citoplasmático, igualmente funcional para la interacción con otras
proteínas; constan de una sola unidad funcional, aunque se ha descrito la formación
de dímeros que se encuentran acoplados a las proteínas G trimétricos (Collingridge
et al., 2009).
Los receptores ionotrópicos glutamatérgicos abiertos por ligando forman estructuras tetraméricas
(Collingridge et al., 2009).
Transportadores de glutamato
En general los transportadores neuronales de Glu capturan alrededor del 20%,
mientras que los gliales el 80% restante (Kirischuk et al., 2007).
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Los Transportadores de Amino Ácidos Excitadores” (EAAT) pertenecen a la familia
de acarreadores de solutos SLC1. Las funciones de estas proteínas transportadoras
son: participar en el mecanismo de reciclamiento que permite el re- abastecimiento
de las pozas intracelulares del transmisor, delimitar temporal y espacialmente la
actividad, definir que receptores van a ser activados y contribuir a mantener los
niveles basales extracelulares del neurotransmisor(Otis and Dodson, 2009). La
captura de Glu ha sido descrita significativamente mayor en los co-cultivos de células
gliales y neuronales del cerebelo que en los monocultivos neuronales, lo cual sugiere
que las células astrogliales son el principal componente de la captura. La
concentración de los aminoácidos excitadores en las vesículas sinápticas
intracelulares se logra mediante los transportadores vesiculares, proteínas
pertenecientes a la familia SLC17 (Bak et al., 2006).
Los EAATs son acarreadores de solutos con estructuras homo ó
heteropentaméricas, donde cada subunidad consta de dominios carboxilo y amino-
terminal ubicados en el citoplasma, 8 pasos transmembranales y al menos un asa re-
entrante. Otro modelo sugiere la formación de homotrímeros en forma de tazón
donde cada subunidad se inserta como cuña, ya que las regiones de 2 asas
reentrantes se unen en la parte más interna de la membrana, esta región se
considera el sitio de unión y transporte individual para una molécula de Glu por cada
subunidad, de modo que cada subunidad puede transportar Glu independientemente
La estequiometria de un ciclo completo de transporte de Glu incluye el co-transporte
de tres iones sodio, un protón y el anti porte de un ión potasio (Kavanaugh, 2004;
Otis and Dodson, 2009).
Se han descrito cinco subtipos de EAATs, cuyos patrones de distribución y
propiedades cinéticas son diferentes en el cerebro. Entre sus características
compartidas se describe que poseen un peso molecular oscilante entre 65 y 77 kDa,
debido al grado de glucosilación que presenten, además de que poseen una
homología estructural del 50 % (Danbolt, 2001).
EAAT-1 y EAAT-2 (GLAST y GLT-1, respectivamente en humanos y ratas) se
expresan casi de forma exclusiva en las células gliales. El primero de ellos abunda
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en el cerebelo, mientras que GLT-1 está presente posiblemente en el cerebro
anterior.
EAAT-3 y EAAT-4 son expresados por neuronas, el primero prevalece en neuronas
de Purkinje del cerebelo y el segundo en neuronas corticales.
EAAT5 es casi exclusivo de neuronas de la retina.
El transportador EAAT1 (Excitatory Amino Acid Transporter 1), ó GLAST, es
marcadamente expresado en la capa molecular de la corteza cerebelar, por lo tanto
es la molécula responsable de la captura de glutamato de alta afinidad acoplada a
Na+, en esta región es donde extienden sus procesos las CGB (Zhou and Danbolt,
2013).
Localización y estructura de los transportadores de Glu y GABA en el cerebellum. Esquema de
la localización de los EAATs en una hendidura sináptica glutamatérgica, específicamente de contactos
FP-CP (Fibra Paralela-Célula de Purkine) en la capa molecular del cerebelo; los cuales están
rodeadas por membranas astrogliales que contienen densidades promedio de 4700 y 740 moléculas
de GLAST y GLT1, respectivamente, por micrómetro cuadrado de membrana. EAAT4 es abundante
en las zonas de la membranas de CP cubiertas por procesos astrogliales y en menor proporción en la
densidad post-sináptica, la densidad promedio es de 1800 moléculas por micrómetro cuadrado de
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membrana. EAAT3 se distribuye en las membranas y en el citoplasma de las PC (Zhou and Danbolt,
2013).
Células gliales de Bergmann
Las células gliales de Bergmann son astrocitos radiales especializados y el tipo glial
más abundante en la corteza cerebelar, sus somas están ubicados en la capa de
Purkinje y extienden sus procesos a través de la capa molecular (3-6 ramificaciones
principales) hasta contactar la superficie pial. Estos procesos contienen muchas
mitocondrias e infinidad de filamentos intermedios, constituidos por vimentina y
proteína acídica fibrilar glial (GFAP) (Verkhratsky and Reichenbach, 2009).
Cada CGB tiene un volumen aproximado de 3600 µm3, lo cual en conjunto ocupa del
15 al 18% del volumen de la capa molecular en roedores. En relación a las
interacciones neurona-glia se ha descrito que existen 8 CGB por cada CP (en ratón),
por lo que las primeras cubren alrededor de 6000 contactos sinápticos de la segunda
(Verkhratsky and Reichenbach, 2009).
Durante la morfogénesis los procesos radiales de las CGB sirven como guía para la
migración de las neuronas granulares, sus pies terminales se arreglan de modo que
conforman una barrera glial y tras concluir la etapa de desarrollo envuelven las
sinapsis formadas por las células de Purkinje, donde asisten en la neurotransmisión
(Koirala and Corfas, 2010).
Algunas características moleculares identificadas en las CGB son moléculas quimio
atractivas o quimio-repulsivas (como la semaforina 4B) útiles para la migración
neuronal crecimiento dendrítico y formación de contactos sinápticos; receptores y
transportadores de glutamato (GLAST), Proteínas Transmembranales Reguladoras
de AMPA (TRAPs); enzimas como la Glutamina sintetiza, Piruvato carboxilasa,
Lactato deshidrogenasa (LDH) y transportadores de monocarboxilatos como MCT1 y
MCT4 (Koirala and Corfas, 2010).
Entre los receptores glutamatérgicos inotrópicos expresados por las células gliales
de Bergman se encuentra el AMPA (subunidades GluR 1, 3, 4), que no cuenta con
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subunidades GluR2, por lo tanto permean Ca2+; esta entrada iónica selectiva se ha
visto relacionada con la permanencia de los procesos gliales en los contactos
sinápticos de las CP (Verkhratsky and Reichenbach, 2009). Existen reportes de que
en rata se transcribe el RNA mensajero de la subunidad NR2B; mientras que en pollo
se ha corroborado la existencia funcional de estos receptores (Lopez et al., 1994).
De los receptores metabotrópicos se ha reportado a la subunidad mGluR5 (Grupo I,
relacionado a la activación de la PLC, potenciación a largo plazo), que tras su
activación se produce una liberación de Ca2+ intracelular (del Retículo endoplásmico)
dependiente del metabolismo de fosfoinosítidos (1,4,5-trifosfoinositol = IP3), evento al
que ha sido mayormente adjudicado el incremento en la concentración de Ca2+ tras
los estímulos con glutamato, ya que los receptores tipo AMPA se desensibilizan
rápidamente (Verkhratsky and Reichenbach, 2009). Aunque existen reportes previos
de la presencia de los tres grupos de receptores metabotrópicos (Lopez-Juarez,
2008).
El cerebelo tiene una estructura altamente organizada, en la cual la posición y las
proporciones de los tipos celulares son fijos y bien establecidos. Los tres tipos de glía
que en él se encuentran están distribuidos de la siguiente forma: los oligodendrocitos
en la materia blanca, los atrocitos en la capa granular y las células de glía de
Bergmann en la capa molecular. Estas células son el tipo glial predominante en el
cerebelo y envuelven las sinapsis establecidas por las células de Purkinje. Tomando
de partida que todos los contactos de las espinas dendríticas de las CP con las FP
están en estrecha relación anatómica con los procesos de las CGB y son
glutamatérgicos (Teichberg, 1991), se pueden relacionar los eventos
desencadenados por el glutamato en estas ultimas células a los contactos sinápticos
PF-PC.
Transportadores de glucosa
La glucosa es la fuente principal de energía metabólica y es el esqueleto de carbón
para la síntesis de proteínas, de lípidos y ácidos nucleicos en las células de
mamíferos. Proporciona energía en forma de ATP a través de la glucolisis, del TCA
y el poder reductor en forma de NADPH. También se utiliza en la síntesis de glicerol
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para la producción de triglicéridos y proporciona productos intermedios para la
síntesis de aminoácidos no esenciales (Zhao and Keating, 2007).
Los transportadores de glucosa son proteínas integrales de membrana que permiten
el transporte de glucosa y sustancias estructuralmente relacionadas a través de las
membranas celulares. Se han identificado dos familias de transportadores de
glucosa: a) la familia de transportadores de glucosa de difusión facilitada (símbolo del
gen Slc2a, símbolo de la proteína GLUT, de “Glucose Transporter”), la cual se
constituye por trece miembros (GLUT 1-12, HMIT y 4 pseudogenes); b) la familia de
transportadores dependientes de Na+ (símbolo del gen SLC5A, símbolo de la
proteína SGLT), de la que se han reportado seis miembros, pero solo SGLT1 y
SGLT2 han sido bien caracterizados (Zhao and Keating, 2007; Wilson-O'Brien et al.,
2010).
Transportador de glucosa GLUT1
La isoforma GLUT1 también es conocida como el transportador de glucosa del
eritrocito, cerebro o de la línea celular Hep-G2 y comprende del 3 al 5% de la
proteína total de la membrana del eritrocito. En particular, es expresada en altos
niveles en las barreras endotelial y epitelial del cerebro, ojos, nervios periféricos,
placenta y glándulas mamarias lactantes (Wilson-O'Brien et al., 2010)
La actividad del transporte de glucosa de GLUT1 se ha evaluado en los ovocitos de
Xenopus, GLUT1 transporta la glucosa con una KM de 20 a 21 mM para el 3-O-
metilglucosa bajo condiciones de equilibrio de intercambio de flujo, de 5 mM para el
2-desoxi-D-glucosa y de ~3 mM para la glucosa (Keller et al., 1989).
El modelo conformacional de GLUT1 asume la existencia de 12 segmentos
transmembranales α hélices, un amino y carboxilo terminal intracelular, una gran asa
intracelular y un N-glicosilado en la primer asa extracelular (Carruthers et al., 2009).
En el cerebro, el GLUT1 ha sido detectado en dos distintas isoformas codificadas por
el mismo gen y difieren únicamente en su extensión de glucosilación: la isoforma de
55 kDa se encuentra localizada en la membrana luminal y abluminal de las células
21
endoteliales de los capilares del cerebro presentes en la BHE, mientras el GLUT1 de
45 kDa se expresan en toda las células neuronales (Vannucci et al., 1997).
GLUT1 está conformado por 488 aminoácidos en el pez, 490 en el pollo y 492 en
humano, bovino, rata y ratón con un peso molecular de aproximadamente 54 kDa, es
la isoforma más conservada y presenta aproximadamente de 74 a 98% de identidad
de secuencia entre estas especies (Zhao and Keating, 2007).
22
Planteamiento del problema:
Las CGB están en contacto estrecho con la sinapsis glutamatérgica de la Fibra
paralela con la célula de Purkinje, expresan receptores y transportadores específicos
para el Glu.
Dado que el Glu genera un acople energético entre las neuronas y células gliales en
diversos modelos:
¿La exposición a Glu induce un aumento en la captura de un análogo de la glucosa
en las CGB?
¿Existe una interacción física entre el principal transportador de glucosa astrocítico
GLUT1 y el EAAT1?
23
Resultados y discusión
La posibilidad de que la neurotransmisión glutamatérgica se asocie al metabolismo
glial fue sugerido mucho tiempo atrás (Pellerin et al., 1998), sin embargo se
desconocen los eventos moleculares involucrados en esta “sinapsis tripartita”. Entre
los modelos propuestos para intentar explicar este acople se encuentran el ciclo
Glu/Gln y la lanzadera de lactato astrocito-neurona (Pellerin et al., 1998;
Waagepetersen et al., 2007).
La fig. 1 muestra por inmunodetección en fase sólida (a), inmunofluorescencia (b) e
inmunohistoquímica con diaminobenzidina (c). La presencia de GLUT1 y GLUT3 en
los cultivos primarios de CGB (a,b) y en rebanadas de cerebelo de embrión de pollo
de 18 días (c). De igual manera que con otras glías, los cultivos primarios de CGB de
cerebelo de pollo presentan típicamente el transportador de alta afinidad y amplia
distribución GLUT1. Sin embargo también encontramos evidencia de la expresión de
GLUT3, el cual es una isoforma mayormente reportada en estirpes neuronales, pero
al ser las CGB gliales radiales, no es raro hallar una amplia e incluyente expresión de
proteínas típicas de progenitores neuronales (Patten et al., 2006). Adicionalmente ya
hay reportes de que este transportador GLUT3 ya ha sido encontrado basalmente en
cultivos de astrocitos (Maher et al., 1991), además de que puede ser inducido por
óxido nítrico (Cidad et al., 2001).
Adicionalmente también puede apreciarse la presencia de KBP (Kainate Binding
Protein), proteína que funciona como marcador molecular para este tipo celular
(Somogyi et al., 1990).
El panel C de la Figura 1 muestra la detección de patrones de marcaje típicos de
calbindina, para identificar la capa de Purkinje, mientras que KBP y GLAST marcan
la región abarcada por las CGB, en la corteza de las rebanadas de cerebelo de
embriones de pollo de 18 días. La inmunodeteccción de GLUT1 y GLUT3
corresponden mayormente con el patrón marcado por GLAST y KBP, indicando su
presencia en las CGB.
24
Fig 1. Expresión de transportadores de glucosa (GLUTs) en CBG y en el cerebelo de embriones de
pollo.
El transporte del análogo de glucosa [H3]2DOG en las CGB es saturable con el
tiempo y alcanza un equilibrio próximo a los 30 min (fig. 2 a), por lo cual es
dependiente de proteínas transportadoras específicas. Pese a que es preferible una
captura en la fase lineal de la curva, optamos por medir el influjo de [H3]2DOG a los
30 minutos para tener una señal de mayor intensidad. Un análisis cinético de la
captura de [H3]2DOG en las CGB (fig. 2b) muestra que es saturable con
concentraciones crecientes del sustrato, con una capacidad máxima de transporte
aproximada de 3112 pmol/mg prot./min y una KM de 1.3 mM. Estos valores
concuerdan con lo reportado para GLUT1 y GLUT3, ya que son los dos GLUTs de
mayor afinidad (Vannucci et al., 1997; Carruthers et al., 2009). Se ha documentado
una KM de1.3 mM para GLUT1 expresado en ovocitos de Xenopus (Colville et al.,
1993) y de 1.6 mM en astrocitos de rata (Carruthers, 1990).
25
Fig 2. El transporte de [H3]2DOG en las CGB es saturable a tiempos y concentraciones crecientes.
Considerando que el L-Glu es el principal neurotransmisor excitador del SNC en
todos los vertebrados y que se ha observado inducir el transporte de glucosa en
modelos semejantes (Loaiza et al., 2003), decidimos evaluar si la exposición a L-Glu
en CGB es capaz de alterar la captura de 2DOG marcado. La figura 3 panel a
muestra que tanto Glu como D-As son capaces de inducir un aumento en el
transporte de la glucosa. El hecho de que D-Asp, el análogo no transportable del Glu
mimetice su efecto sugiere fuertemente que el evento está relacionado con la captura
del neurotransmisor Glu. Una parte fundamental en la regulación de la
neurotransmisión es el sistema de captura y alrededor del 80% de la misma es
realizada por los EAATs gliales (Kirischuk et al., 2007).
Los paneles b y c de la figura 3 muestran una relación dosis-efecto de estimulación
en la captura de [H3]2DOG en CGB con valores de EC50 de 11.7 y 9 µM para D-Asp y
L-Glu. Estos datos están próximos a la afinidad aparente previamente reportada para
el transporte de D-Asp en el mismo sistema, con una KM de 26.4 µM (Ruiz and
Ortega, 1995), por lo tanto refuerza la idea de que este incremento en la captura del
análogo de glucosa en las CGB es mediado en gran medida por el transporte de Glu.
26
Fig 3. EL transporte de Glu aumenta la captura de [H3]2DOG.
La actividad de captura de proteínas transportadoras puede ser regulada mediante
un cambio en la afinidad hacia su sustrato (KM) o mediante el cambio en la capacidad
de máxima de captura (Vmax).
Con miras a dilucidar cuál de las dos anteriores posibilidades era la responsable del
efecto de L-Glu sobre la captura de 2DOG, por lo que medimos los valores cinéticos
en condiciones no estimuladas (NS) y con 1 mM de L-Glu por 30 min en las CGB.
La figura 4 A es el conjunto de tres experimentos independientes que sugieren un
aumento significativo en la Vmax pero no así en la KM. Las curvas son
significativamente distintas.
La rápida inserción de GLUTs en la membrana citoplasmática es una respuesta bien
documentada (Ismail-Beigi, 1993), por lo tanto ese aumento en la capacidad máxima
de captura de [H3]2DOG puede reflejar un aumento en la cantidad de GLUTs
27
funcionales en la membrana plasmática. Una forma de corroborar esto fue marcando
con biotina las proteínas de la membrana plasmática y detectar por western-blot.
Como resultado la figura 4 b muestra que la inmunodetección de GLUT1 es mayor en
las CGB se exponen a Glu o D-Asp. Como controles de las facciones el panel c de la
figura 4 muestra la inmunodetección de las proteínas GLAST y α-actina para las
fracciones membranales y citoplasmáticas, respectivamente. EL aumento rápido en
la expresión membranal de GLUT1 se ha documentado con anterioridad en
fibroblastos (Loaiza et al., 2003) y mastocitos (Gunnink et al., 2014).
Fig 4. Incremento en la velocidad máxima de transporte y en la expresión de GLUT1 en la superficie
membranal en CGB tratatadas.
Con miras a indagar el mecanismo por el cual se produce el aumento en la captura
de [H3]2DOG. El transporte de Glu por GLAST/EAAT1 es dependiente del co-
transporte de iones Na+, por lo tanto evaluamos si en medio sin sodio (con Tris-HCl)
28
se producía o no el evento. La figura 5 a muestra que el efecto del Glu y D-Asp no se
presenta en ausencia de sodio. Considerando que el tráfico de receptores y
transportadores puede involucrar arreglos del citoesqueleto y éste último se organiza
de manera dependiente de calcio (Sullivan et al., 2007; Fehon et al., 2010; He et al.,
2014), decidimos evaluar si la ausencia de Ca2+ afectaba en la inducción del
aumento de la captura del análogo de glucosa. En efecto, la respuesta a Glu y a D-
Asp depende de la presencia de este ion también (Fig 5 b).
La señalización por PKA y PKC ha sido relacionada con la regulación de GLUT1,
adicionalmente en las CGB de cerebelo de pollo expresan el transportador
sodio/calcio (NCX), mismo que trabaja en conjunto con la activación de GLAST
(Martinez-Lozada et al., 2011). Por lo tanto evaluamos si la inhibición de PKA (por
H9), de PKC (por BisI) y del NCX (por KBR7943) afectaba en la respuesta de la
captura de [H3]2DOG a la exposición de D-Asp. En efecto la figura 5 c muestra que
tanto PKC como el NCX participan en la señalización. Recientemente se encontró
que el transportador GLUT1 puede insertarse en la membrana plasmática gracias a
una fosforilación directa por PKC en S226 (Lee et al., 2015).
En tanto que se ha propuesto que la activación de PKA puede modular la expresión y
el funcionamiento de GLUT1 a periodos largos de horas y a tiempos cortos, donde
adicionalmente se ha mostrado la gran relevancia del calcio intracelular, en un
modelo murino de la barrera hemato-encefálica en que también se expresa GLUT3
(Kim et al., 2012; Meireles et al., 2013). En el presente trabajo no encontramos
participación de la cinasa PKA pero si encontramos un efecto importante de la
presencia de calcio extracelular para la producción del efecto del transporte de GLU
en el transporte del análogo de la glucosa (Fig. 4 b, 5 c).
Adicionalmente comprobamos que el efecto de L-Glu, mimetizado por D-Asp es
dependiente del funcionamiento de los transportadores de Glu expresados en las
CGB, por lo que la figura 5 d muestra que los bloqueadores generales de los EAATs,
THA (transportable) y TBOA (no transportable) abaten el efecto en la captura del
análogo de glucosa. La regulación de GLUT1 por corrientes de sodio y calcio
29
dependientes del funcionamiento de EAATs fue demostrado con anterioridad en
astrocitos de cerebro rata (Porras et al., 2008).
Fig 5. El efecto de Glu en la captura de [H3]2DOG es dependiente de sodio, calcio y es mediado por
los EAATs.
Los dominios funcionales en las membranas celulares facilitan el desenvolvimiento
de funciones metabólicas de manera más eficiente, dada la proximidad física de las
proteínas involucradas en una ruta específica. Por tal motivo exploramos la
posibilidad de que los transportadores GLAST y GLUT1 establezcan una relación
30
más estrecha cada que el neurotransmisor Glu o su análogo D-Asp estén en el
medio extracelular.
La figuras 6 A y B confirman que dichos transportadores co-inmunoprecipitan cuando
las CGB son expuestas con L-Glu o D-Asp, aunque esta posible interacción parece
ser más rápida ya que se evaluó a los 15 min. Este resultado encaja en la dinámica
funcional que ha sido descrita para múltiples proteínas gliales relacionadas al acople
glía-neurona. Por ejemplo los EAAT1 y EAAT2 con subunidades de la ATPasa
Na+/K+, con diversas enzimas glucolíticas y con la mitocondria (Rose et al., 2009;
Genda et al., 2011; Bauer et al., 2012; Whitelaw and Robinson, 2013).
La figura 6 paneles C y D muestras que la regulación de los transportadores de
glucosa puede ser desde un nivel traduccional, ya que las cantidades totales de las
proteínas GLUT1 y GLUT3 aumentan rápidamente en los extractos totales de
proteínas de CGB tratadas por 30 min con Glu y D-Asp. Esto apunta a que una
probable regulación traduccional diferencial exista, ya que se ha demostrado que un
efecto de Glu por 30 min en las CGB es disminuir la tasa global de traducción y
concomitantemente favorece la traducción de proteínas en el rango de peso
molecular de 40 a 60 kDa (Barrera et al., 2008; Flores-Mendez et al., 2013).
31
Fig 6. Asociación bioquímica entre los transportadores de glucosa y de Glu.
32
Fig 7. El transporte de Glu incrementa la expresión membranal de los GLUTs y la función de los
mismos en las membranas plasmáticas de la CGB. En el panel de la izquierda: el Glu en el espacio
extracelular entra a las células gliales junto con tres iones Na+ a través de los EAATs (GLAST), el Glu
sirve de substrato para que la GS forme Gln, mientras que el desbalance electroquímico es
compensado por el trabajo de la ATPasa NA+/K+. Ambos procesos consumenATP, por lo que una
demanda de energía propicia un incremento en la captura de glucosa. En el panel derecho: las
acumulaciones locales de calcio podrian activar a la cinasa PKC, la cual podria tener como blanco
directo alal GLUT1, entonces las reservas intracelulares de GLUTs pueden ser transferidas a la
membrana plasmática, donde pueden trabajar como unidades independientes o diméricas y el
transportador de Glu GLAST/EAAT1 puede estar en e mimo dominio citoplasmático.
33
Conclusión
La captura de glucosa es incrementada por la captura de Glu en la células gliales de
Bergmann, dicho evento está relacionado con el funcionamiento de la cinasa PKC,
con un aumento en la capacidad máxima de captura y con una mayor presencia del
transportador GLUT1 en la membrana plasmática. Adicionalmente se demostró que
existe una aproximación física entre los transportadores GLAST/EAAT1 y GLUT1, la
cual es potenciada por la presencia del neurotransmisor Glu.
34
El Glutamato Regula la plasticidad funcional del transportador de GABA GAT-3 en células gliales de
Müller
35
Introducción
Las células astrogliales se encuentran en contacto estrecho con las neuronas y es
bien aceptado que existe una comunicación bidireccional mediada por diversos
mensajeros químicos liberados en todo el SNC (de Melo Reis et al., 2008). Los
gliotransmisores son moléculas activas liberadas por poblaciones gliales que
modulan varias funciones neuronales, tales como la supervivencia, la diferenciación y
protección neuronal. En este sentido las sinapsis GABAérgicas en el SNC son
conformadas por una estructura tripartita que incluye los elementos neuronales pre-
sinápticos (con vesículas llenas del neurotransmisor), postsinápticos (con los
receptores ionotrópicos GABAA y GABAC y metabotrópicos GABAB) y lo elemento
gliales. La terminación de la transmisión glutamatérgica depende de su captura en la
presinapsis, en la células gliales, en las células ependimarias y en la aracnoides
(Kanner, 2006; Eulenburg and Gomeza, 2010).
El GABA El ácido gamma-aminobutírico o GABA es el principal neurotransmisor inhibidor en el
SNC. La principal fuente de este transmisor en el cerebro es la descarboxilación de
Glu por la enzima Glutamato-descarboxilasa (GAD). Alrededor del 60 del GABA
sintetizado procede de esta ruta, donde puede haber un paso por el ciclo TCA (Leke
et al., 2008).
La enzima GAD se expresa exclusivamente en poblaciones neuronales pero
raramente en glía, lo cual hizo suponerse que ésta últimas no sintetizan GABA,
aunque recientes estudios han reportado concentraciones altas de GABA en
astrocitos del hipocampo (5-10 mM), en astrocitos laminares y en las células de
Bergmann (Lee et al., 2010; Le Meur et al., 2012; Yoon et al., 2014), por lo cual se
intuye la relevancia del elemento glial, además de que existe una intercomunicación
GABAérgica glía-neurona.
36
El GABA Ejerce sus funciones mediante la activación de receptores en la terminales
pre y post-sinánticas, con el objetivo de reducir la liberación de neurotransmisores
excitadores como el Glu y producir las corrientes post-sináptica inhibidoras (IPSCs
por su denominación en inglés) o hiper-polarizar a las neuronas (Liang et al., 2006)
Acople metabólico glía-neurona: El ciclo Glu / GABA/ Gln EL mecanismo mediante los cuales los astrocitos pueden regular la transmisión
GABAérgica es mediante los transportadores y las enzimas. De tal modo que la Gln
liberada por los astrocitos (SNATs, sistema N) es capturada por las neuronas
(SNATs, sistema A), convertida a Glu (GAP, glutaminasa activada por fosfato) y
luego descarboxilada a GABA (GAD), para finalmente ser empacado en vesículas
sinápticas gracias al funcionamiento de otro transportadores, los vGAT.
Adicionalmente, para completar el ciclo hay que considerar que el Glu liberado por
las neuronas y que es capturado en células gliales (EAATs) es convertido a Gln, por
la GS (Bak et al., 2006).
Transportadores de GABA
Se conocen cuatro isoformas de los transportadores de GABA y que pertenecen a la
familia Slc6a: GAT1 (slc6a1), GAT2 (slc6a13), GAT3 (slc6a11) y BGT1 (slc6a12),
mismas que se encuentran todas expresada en las poblaciones gliales, pero el GAT3
es el predominante. Funcionan de manera dependiente de sodio / cloro y de forma
similar que los EAATs, se ha reportado transporte no acoplado, la estequiometría del
transporte de los GAT 1-3 es 2Na+:1Cl-:1GABA, mientras que para BGT1 3Na+:2Cl-
:1GABA (Nelson and Lill, 1994; Zhou and Danbolt, 2013).
La afinidad aparente oscila con valores de KM de 0.8, 8, 18 y 80 µM para el
transporte de GABA en GAT3, GAT1, GAT2 y BGT1, respectivamente. La
identificación de funciones independientes es abordada farmacológicamente, de
modo que el ácido nipecótico y el beta-guanidinopropionato inhiben a los
transportadores GAT1-3, GAT1 y GAT2 tienen una menor IC50 para isoserina, Beta-
37
alanina e hipotaurina, mientras que tiagabina es altamente selectivo para GAT1
(Zhou and Danbolt, 2013).
En cultivos primarios de células de Glía de Müller de pollo se he determinado que el
transportador GAT3 es la principal ruta de captura de GABA, así mismo es sensible a
β-alanine y Zn2+, pero no a NNC-711 (De Sampaio Schitine et al., 2007).
Células gliales de Müller Las células de Müller (CGM) son el principal componente glial de la retina de los
vertebrados, atraviesan todas las capas de la retina: desde la superficie del humor
vítreo hasta el fondo sub-retiniano. Dan soporte al metabolismo y funcionamiento de
todas las neuronas, son elementos activos en el sistema de la visión; además
contactan los vasos sanguíneos y sirven de conducto para productos de desechos,
iones, agua y otras moléculas (Reichenbach and Bringmann, 2013).
La células de Müller (M) se expanden a lo largo de toda la retina y están organizado en un patrón regular. Esquema de la retina humana. El pericarion de las células de Müller se ubica en la capa nuclear interna (INL). Los pies terminales de la M y lo astrocitos (AG) dan forma a la capa interna de la retina y contactan con los vasos sanguíneos. Los procesos basales de las M (ONL) capa nuclear externa envuelven el pericarion de los fotoreceptores (PRS). Las células microgliales (MG) se localizan en la capa plexiforme y en la capa ganglionae (GCL). (A) células amacrinas, (B) células bipolares, (G) células ganglionares, (H) células horizontales, (P) pericitos y (RPE) Epitelio pigmentoso de la retina (Reichenbach and Bringmann, 2013).
38
Planteamiento del problema El transporte de GABA en los cultivos primarios de CGM es atribuible a GAT3 y
disminuye alrededor del 60 % cuando el cultivo es expuesto a medio condicionado
(MC) de cultivos neuronales de retina. Considerando que el MC es filtrado, es
probable que un neurotransmisor, quizá el excitador mas abundante, el Glu, sea el
causante de este efecto.
39
Resultados y discusión Anteriormente se ha demostrado que el cultivo purificado de CGM obtenido a partir
de retinas de embriones pollo expresa los transportadores GAT1 y GAT3, captura
[3H]GABA de manera dependiente del tiempo, de la concentración de sustrato,
necesita de sodio y cloro, además de que se inhibe con bajas temperaturas y
farmacológicamente se identificó una preponderancia en el funcionamiento de GAT3,
de alrededor del 80% de la captura de [3H]GABA. Dichos cultivos fueron expuestos a
medio condicionado de cultivo de neuronas (MC) durante 24 h, lo cual produjo un
decremento en la actividad de captura de [3H]GABA de aproximadamente 60% (De
Sampaio Schitine et al., 2007). Dado que ese medio enriquecido no contenía células
ni proteínas y que el Glu es el principal neurotransmisor del SNC, decidimos indagar
si era el Glu, el agente causante de tal decremento en el sistema de captura de
[3H]GABA en el cultivo primario de CGM.
A como se observa en la Fig 1a, la exposición a 2 mM de Glu produjo un 50 % de
decremento en la captura de [3H]GABA con una magnitud semejante a la inducida
por el MC, mismo que desapareció al pre-exponer el cultivo a dos inhibidores de
receptores ionotrópicos glutamatérgicos, MK-801 (antagonista no competitivo de
receptores tipo NMDA) y DNQX (inhibidor competitivo de receptores tipo AMPA).
Consecuentemente era necesario indagar si solo la despolarización de la membrana
con 80 mM de KCl era capaz de disminuir la captura de [3H]GABA, en efecto se
redujo la captura de [3H]GABA en proporciones semejantes a las producidas por Glu,
no así en presencia de MK-801 y DNQX (Fig 1b). Por lo tanto puede suponerse que
Glu u otro mensajero químico liberado por las mismas CGM sea el agente causal, ya
que también se ha mostrado que el KCl produce la liberación de Glu y ATP de CGM
de aves (Loiola and Ventura, 2011). Entonces decidimos medir por HPLC la cantidad
de Glu contenida tanto en el CM como en el medio DMEM-F12 fresco, sin embargo
no se encontró diferencia significativa (Fig 1c); lo cual sugiere que algún elemento
adicional puede producir la liberación de Glu del mismo CGM cultivo; uno de estos
elementos puede ser la D-Serina, ya que se ha mostrado ser liberada en la retina de
40
vertebrados y que puede activar al receptor glutamatérgico tipo NMDA (Gustafson et
al., 2015).
Si un neurotransmisor como el Glu produce los cambios en el sistema de captura de
GABA, es necesario conocer si existen corrientes entrantes de calcio en las CGM.
Para este efecto se recurrió a la técnica de Imagen de calcio de una sola célula
(SCCI, por su nombre en inglés) usando la sonda fluorescente Fura2-AM. El panel e
de la fig. 1 muestra la imagen de un experimento, analizando la respuesta a 2 mM de
Glu (flecha en el gráfico, panel d) en 30 ROIs (Regiones de Interés) que representan
30 células de Müller. El incremento de dos veces la proporción de emisión de
fluorescencia entre las longitudes de onda (F340/380) indica incremento en iguales
magnitudes del contenido de calcio intracelular (panel d).
Fig 1. El Glu y el medio condicionado por neuronas de retina de pollo disminuyen la captura de
[3H]GABA en la CGM. (A) el Glu (2 mM) o MC (1:1 v/v con medio del cultivo de CGM) obtenido de
cultivos de neuronas de la retina de pollo inducen una diminución de alrededor de 50% en la captura
de [3H]GABA hasta por 2 h, lo cual es prevenido por la pre-incubación de 10 uM MK-801 y 70 uM
DNQX. (B) EL efecto es mimetizado por 80 mM de KCl y también inhibido por la presencia de los
D) E)
41
agonistas MK-801 y DNQX. (C) Contenido de Glu en el MC y medio nuevo (DMEM-F12), determinado
a través de HPLC-ED. (D) Detección de los niveles de calcio intracelular a través de la sonda
fluorescente Fura-2 AM, el estímulo de 2 mM Glu es indicado por la flecha en la gráfica. (E) Imagen
representativa del análisis de imagen de calcio de una sola células, se muestran 30 campos de interés
indicados por los círculos sobre las células seleccionadas en la imagen.
El efecto de Glu sólo es observable a concentraciones elevadas, como 1 y 2 mM
(Fig. 2 a), lo cual podría justificarse por la alta densidad de transportadores de Glu
que en las células gliales existe (Gadea et al., 2004). Este efecto se presenta desde
los 10 min hasta las 48 h en que fue evaluado (Fig. 2 b). Sin embargo una relación
dosis-respuesta robusta, próxima a los 30 uM fue encontrada en concentraciones
crecientes de los agonistas glutamatérgicos kainato (Fig. 2 c) y NMDA (Fig. 2 d).
Dicho efecto del agonista NMDA depende de la ausencia de Mg2+ y es bloqueado por
el antagonista MK-801 (Fig. 2 e). Debido a que la activación de los receptores
metabotrópicos glutamatérgicos del grupo I activa a la Fosfolipasa C (PLC) y
desencadena la liberación de calcio desde los almacenes intracelulares y a que ha
sido mostrada como regulador de GAT1 (Beckman et al., 1999), evaluamos si la
activación por DHPG emulaba el efecto de Glu, sin embargo esta ruta parece no
participar en el efecto inducido por Glu (Fig. 2 c).
42
Fig 2. Los receptores glutamatérgicos aumentan la captura de [3H] GABA en CGM. El efecto de Glu
sobre la captura de GABA se presenta a altas concentraciones de 1 y 2 mM (A) y desde los 10 min
hasta las 48 h (B). Curvas de dosis-respuesta de Kainato (C) y NMDA (D) en solución sin Mg2+ para la
disminución de la captura de [3H]-GABA. (E) El efecto NMDA en la captura de GABA es bloqueado por
la presencia de iones de Mg2+ y del antagonista específico para receptores tipo NMDA, MK801.
Diferentes concentraciones del agonista de la familia I de receptores metabotrópicos, DHPG, no tienen
efecto sobre la captura de [3H]GABA en CGM. *p < 0.05.
Considerando que se ha reportado que PKC fosforila a GAT1 y promueve su
distribución sub-celular en neuronas del hipocampo (Beckman et al., 1999),
decidimos evaluar la activación de PKC mediante concentraciones crecientes de su
activador específico PMA. El panel b de la figura 3 muestra una relación dependiente
de dosis con una IC50 de 300 nM; sin embargo el efecto de Glu no depende de esta
cinasa, ya que la pre-incubación de varios inhibidores de PKC como: estaurosporina,
43
calfostina C, Ro 320432 y Bis I (no mostrado), no revertieron la disminución en la
captura de [3H]GABA (Fig. 3 b).
La proteína cinasa A (PKA) ha sido descrita como moduladora del funcionamiento de
GAT1 en la retina de aves (Ferreira et al., 2014), donde la activación de dicha cinasa
puede ser mediada por receptores D1A, D1B para dopamina y por receptores a
PACAP, como ha sido específicamente mostrado para el cultivo purificado de CGM
(Kubrusly et al., 2005). Por tales motivos evaluamos diversas señales que
desencadenan la activación de PKA; tales como Forskolina, el agonista sintético de
D1 (SCH23390) o PACAP, pero ningua de ellas tuvo efecto en la disminución de la
captura de [3H]GABA aun en la presencia de 2 mM de Gu (Fig. 3 c). Considerando
que existe una interacción entre la señalización glutamatérgica (receptores tipo
NMDA y AMPA) y del ATP (a través de su receptor P2X7) produciendo muerte
neuronal en cultivos mixtos glía de Müller-neuronas de retina de pollo (Anccasi et al.,
2013), evaluamos si la entrada de calcio mediada por ATP y por su receptor
purinérgico P2X7 mediaban la señalización de Glu, sin embargo no se observó
efecto en la activación o bloqueo de tal receptor mediada por Azul brillante G (BBG)
(Fig. 3 d).
44
Fig 3. El efecto de Glu sobre la actividad de GAT3 no depende de la activación de PKC. (A) La captura
de [3H]GABA en las CGM es dependiente de la actividad de PKC, una curva dosis-respuesta con
concentraciones crecientes de su activador PMA aproxima una IC50 de 300 nM. (B) La pre-incubación
de diversos inhibidores de PKC (100–500 nM estaurosporina, 100 nM Calfostina C o 1 µM Ro 32–
0432) no previene el efecto de Glu sobre la captura de [3H]GABA. (C) Efecto de la activación de PKA.
La aplicación aislada de PACAP38 (Polipéptido de la pituitaria activador de la enzima adenilato
ciclasa)o concomitante de: forskolina (FK, activador de la enzima adenilato ciclasa), SCH23390
(antagonista del receptor metabotrópico D1), H89 (inhibidor de PKA) o PACAP6-38 (antagonista del
receptor para PACAP38) con 2 mM de Glu no intervino en la disminución de la captura de [3H]GABA.
(D) La adición de 0.01 a 1 mM de ATP o de 100 nM del colorante Azul brillante G (BBG, inhibidor de
P2X7) no tuvo efecto en la acción inhibitoria de Glu sobre captura de [3H]GABA. *p < 0.05.
Retomando que la señalización vía PKC, PKA o diversas moléculas señalizadoras no
se relacionan con la disminución en la captura de [3H]GABA generada por Glu,
decidimos describir el efecto sobre los transportadores. De este modo evaluamos por
inmunodetección en fase sólida la cantidad de GAT3 que se encuentra en la
membrana citoplasmática, a través del marcaje con biotina de las proteínas de la
superficie celular y su separación por acople a avidina del extracto total de proteínas.
En la figura 4 a observamos un experimento representativo y en el panel b se
resumen tres experimentos independientes, mostrando que 1 y 2 mM de Glu
producen un desplazamiento de GAT3 hacia la fracción citoplasmática. De igual
forma encontramos que el Glu induce la disminución en la cantidad de RNA
mensajero de GAT1 y GAT3 tras 2h de estímulo (no mostrado).
45
Fig 4. Los niveles de expresión de GAT3 en la membrana celular son modulados por Glu. El
tratamiento por treinta minutos con cantidades crecientes de Glu (1 y 2 mM) aumentan la cantidad de
GAT3 en la fracción biotinilada (membrana citoplasmática) y la disminuye en el sobrenadante
(citoplasma). La menor inmunodetección de alfa-actina en la fracción biotinilada y mayor en la
citoplasmática son mostradas como controles. (B) Se grafican los valores promedio de tres
experimentos independientes +/- SEM, . *P < 0.05, **P < 0.01 (NS vs. Glu, fracción biotinilada), +P <
0.05 (NS vs. Glu, fracción citoplasmática). Se evaluó la presencia del transportador GAT3 desde la etapa embrionaria hasta la
posnatal fue evaluada a través de extractos proteicos totales de la retina de pollo. La
figura 5 muestra una presencia constante, aunque una mayor abundancia a partir del
día embrionario 16 y principalmente en la etapa post-natal.
46
Fig 5. Ontogénesis en la retina de pollo del transportador GAT3. Inmunodetección en fase sólida de
GAT3 y ERK total durante el desarrollo de la retina de pollo.
Finalmente decidimos evaluar la presencia de GAT3 en la retina de pollos. De este
modo se encontró que en condición control (solo inyección de PBS) el GAT3 se ubica
mayormente en las capas plexiforme interna (IPL) y en la nuclear interna (INL),
donde se encuentran la mayor cantidad de las células amacrinas. Por su parte las
CGM, marcadas por su antígeno específico 2M6 (Schlosshauer et al., 1991) no
presentan co-localización con GAT3 (Fig. 6 a). Un protocolo bien conocido de neuro-
degeneración de la retina tras 15 días de la aplicación in situ de 2 µmol de NMDA
(Fischer and Reh, 2001) fue efectuado en el ojo derecho de pollos de 10 días,
mientras que en el ojo control (izquierdo) solo se inyectó el mismo volumen de PBS.
Esta lesión fue corroborada mediante el disminución del grosor de las capas de la
retina, visible con el marcaje de los núcleos (Fig. 6 b), con la disminución en la
detección de Brn3a (marcador específico de las células ganglionares) de los paneles
c al d en la fig. 6 y el aumento de la proteína GFAP (proteína acídica fibrilar glial)
como indicador de astrogliosis característica de una lesión (Fig. 6 e vs. f). El patrón
de marcaje para GAT3 se modificó tras la lesión, de modo que esta condición
patológica favorece la colocación con 2M6 (recuadro de la Fig. 6 b), de modo que las
fibras radiales de CGM ahora más visibles muestran la presencia de GAT3. Estos
resultados sugieren una regulación positiva en la expresión de GAT3 en las CGM,
probablemente a causa de la gliosis reactiva producto de la lesión en la retina. De
47
manera interesante, también el cultivo primario de las CGM presentan el
transportador de GAT3 en la membrana celular dos semanas después de la siembra
(Fig. 6 g).
Fig 6. Inmunodeteción de GAT3 en la retina de pollo adulto y en el cultivo purificado de CGM. (A) En la
condición control (ojo izquierdo, inyectado con PBS) el marcaje de GAT3 (rojo) es visible en la capa
Plexiforme interna (IPL) y en algunos somas en la capa nuclear interna (INL). Las CGM son visibles a
través de su antígeno específico: 2M6 (verde), sin co-localización con GAT3. (B) La lesión
neurodegenerativa inducida por la inyección de NMDA (ojo derecho) induce la expresión de GAT3
48
(rojo) en porciones mas internas de la retina, mostrando co-localización con el marcaje de 2M6 (verde)
característico de CGM, probablemente en los pies terminales de las CGM (amarillo, indicado por las
flechas). El recuadro es un acercamiento del área indicada en B, la cual muestra la co-localización de
los marcajes verde y rojo (2M6 y GAT3). (C) Abundante expresión del marcador específico de células
ganglionares de la retina, Brn3a, (RGC, en verde) en la condición control con PBS, (D) mientras que
en la lesión con NMDA se observa un marcado decremento en a inmuodetección de Brn3a. La
Proteína Acídica Fibrilar Glial (GFAP, rojo) muestra niveles bajos en la condición normal (E), mientras
que en la lesión con NMDA se incrementa, un signo de astrogliosis (F). El cultivo purificado de CGM
muestran al marcador prototípico 2M6 (verde) y expresan al transportador GAT3 (puntos amarillos y
naranja). Las capas de la retina son identificadas convencionalmente con sus siglas en inglés: ONL,
capa nuclear externa; OPL, capa plexiforme externa; INL, capa nuclear interna; IPL, capa plexiforme
interna; GCL, capa de células ganglionares. N = 4. La escala de las barras en los paneles es: 50 µm
en B, 10 µm en D, 50 µm en F y 10 µm en G. Considerando que la expresión de GAT3 es evidente en las CGM después de la
neurodegeneración en el presente estudio, podemos inferir que en el caso de
cualquier lesión in vivo de la retina, isquemia por ejemplo, ésta puede ser potenciada
debido a la disminución en el tono inhibitorio causado por un aumento en el
transportador de GABA en las CGM. Sería interesante considerar las herramientas
farmacológias que podrían reducir la captura de GABA y aumentar el tono inhibitorio
en las lesiones con el objetivo de disminuir la excitotoxicidad. El cultivo primario de
las CGM y la retina de aves parecen un modelo de estudio adecuado para evaluar
procesos moleculares relacionados con la neurodegeneración de la retina.
Las CGM son unidades neuroquímicamente plásticas porque contactan una amplia
diversidad de ambientes a lo largo de la retina (GABA, Gly, Glu, dopamina y
acetilcolina). De este modo se ha reportado que presentan receptores y
tansportadores Glutamatérgicos, GABAérgicos, receptores y enzimas del sistema
dopaminérgico; además de que se ha visto que pueden suplir un funcionamiento
dopaminérgico y han sido usadas en terapia celular de reemplazo de fotoreceptores
(Kubrusly et al., 2005; Kubrusly et al., 2008; Stutz et al., 2014). En este sentido el
presente trabajo aporta conocimiento referente a la plasticidad en el sistema
GABAérgico en condiciones semejantes a procesos patológicos.
49
Conclusión
En este trabajo demostramos que el Glu, actuando a través de sus receptores
ionotrópicos, señaliza para reducir la función del sistema de transporte de GABA. Se
observó un marcado decremento en la captura de [3H]GABA en los cultivos de CGM
expuestos a Glu.
50
El Glutamato regula su propia captura a través de receptores ionotrópicos en la línea celular humana
MIO-M1
51
Introducción El Glu es el principal neurotransmisor excitador en el cerebro y en la retina, ejerce
sus acciones a través de la activación de receptores ionotrópicos y metabotrópicos
específicos (Coutinho and Knopfel, 2002; Rojas and Dingledine, 2013). La sinapsis
glutamatérgica es terminada mediante la remoción del Glu mediante transportadores
dependientes de sodio de alta afinidad. Actualmente se han identificado 5 variantes:
del EAAT1 al 5; de las que se reconoce a EAAT1 y EAAT2 (conocido como GLAST,
homólogos no humanos) como las principales isoformas de células gliales, mientras
que EAAT3, 4 y 5 se localizan predominantemente en células de Purkinje y en
neuronas de la retina (Rothstein et al., 1996; Arriza et al., 1997; Gadea and Lopez-
Colome, 2001)
Entre estos transportadores, EAAT1 se expresa a través del SNC durante el
desarrollo temprano, mientras que su expresión disminuye y se restringe a
poblaciones de glías radiales en tejidos ya diferenciados, como en el cerebelo, la
retina y el bulbo olfatorio, donde EAAT1 es responsable de alrededor del 90% de la
captura de Glu (Danbolt, 2001) y por lo tanto son elementos necesarios en el ciclo de
Glu entre glía y neurona.
En el ciclo de la visión, el Glu es el principal transmisor excitador, sigue una ruta
vertical que va desde los fotoreceptores hasta las células ganglionares. La liberación
continua de Glu desde los fotoreceptores se mantiene durante la oscuridad, es
modulada por la luz. En la capa plexiforme externa (IPL), las células bipolares-ON
liberan Glu durante la exposición a la luz, mientras que las células bipolares-OFF
liberan el mismo neurotransmisor en la oscuridad. Los fotoreceptores y las células
bipolares no generan potenciales de acción, sino que responden con potenciales
graduales que a su vez modulan la liberación tónica de Glu. En tal sistema es
evidente la necesidad de un control estrecho en las cantidades de Glu en la
hendidura sináptica, para lo cual es remarcable la participación de las células gliales
de Müller, mismas que adicionalmente participan en la modulación de la transmisión
excitadora, debido a su proximidad y contacto con la neuronas a lo ancho de las
52
capas de la retina. EAAT1 es el principal transportador en las células de Müller, se
localiza en los procesos que ramifican extensivamente dentro de las capas
plexiformes externas e internas, envolviendo los contactos sinápticos (Copenhagen
and Jahr, 1989; Juusola et al., 1996; Newman and Reichenbach, 1996; Rauen et al.,
1998).
En nuestro grupo de trabajo previamente caracterizado los receptores a Glu en las
células de Müller, acoplados a la cascada de fosfoinosítidos, a la entrada de calcio y
la activación de PKC y de las proteínas cinasas activadas por mitógeno (MAPK)
(Lopez-Colome et al., 1993; Lopez-Colome and Ortega, 1997; Lopez-Colome et al.,
1997; Lopez et al., 1998). Igual se ha encontrado un incremento en la unión del factor
de transcripción AP-1 a DNA mediada por receptores de Glu (Lopez-Colome et al.,
1995). También se ha demostrado que el transporte de Glu dependiente de sodio es
regulado por la activación de la cinasa PKC (Gonzalez et al., 1999). Pese a que las
descripciones de modelos de células Gliales de Müller son abundantes, el
conocimiento en tanto a estirpes humanas es escaso.
Línea celular humana MIO-M1 Las células gliales de Müller son poblaciones de glía radial que sobreviven hasta la
etapa adulta, atraviesan verticalmente todas las capas d la retina y sus somas se
encuentran en la capa plexiforme interna (IPL), donde se ubican la mayoría de los
tipos de células amacrinas, muestran una bipolaridad ya que se distingue claramente
una región distal donde establecen contactos con los fotoreceptores y otra proximal
donde junto con la membrana basal constituyen la membrana limitante interna,
próxima a la capa de las células granulares (Limb et al., 2002).
Las células gliales de Müller presentan una plasticidad neuroquímica que representa
la diversidad de ambientes que contacta a lo largo de la retina. De este modo se ha
reportado que presentan receptores y transportadores Glutamatérgicos,
GABAérgicos (tipo B), receptores dopaminérgicos como D1A y D1B, las enzimas
tirosina hidorxilasa y L-dopa descarboxilasa, además de que se ha visto que pueden
53
suplir un funcionamiento dopaminérgico y han sido usadas en terapia celular de
reemplazo de fotoreceptores (Kubrusly et al., 2005; Kubrusly et al., 2008; Stutz et al.,
2014). Estas células son igualmente importantes en procesos patológicos, en la
recuperación de lesiones, en la re-vascularización y participa en desórdenes de
proliferación en la retina(Limb et al., 2002).
Las células MIO-M1 recibieron su nombre del lugar de obtención de la muestra
(Moorfields/Institute of Ophthalmology-Müller 1), en Londres, Reino Unido y del
número de la clona. La cual fue obtenida por inmortalización espontánea a partir de
tejidos retinianos procedentes de donación post-mortem (36 h posterior a la muerte)
de una mujer de 68 años. La expresión de marcadores moleculares como el factor de
crecimiento epidermal (EGF), la vimentina, la proteína celular de unión a
retinaldehído (CRALBP, no expresada por astrocitos) y la enzima glutamina sintetasa
(GS) fue corroborada hasta el pase 45. Sin embargo se observaron aneuploidías
cromosómicas a partir del pase 43. La morfología, textura de la membrana,
bipolaridad de las células, conexiones inetercelulares y características subcelulares
de las células MIO-M1 corresponden bien con las observadas en cultivos primarios
de células gliales de Müller (Limb et al., 2002).
Planteamiento del problema El transporte de Glu es auto-regulado en algunos sistemas, por tal motivo exploramos la participación de los receptores de Glu en la regulación de EAAT1 en la
línea celular human MIO-M1.
54
Resultados y discusión Entre las múltiples funciones descritas para las células de Müller se encuentra la
terminación de la neurotransmisión glutamatérgica, mediante la captura de alta
afinidad de este neurotransmisor. La células MIO-M1 expresan el transportador
EAAT1, a como se observa en el panel a de la fig. 1, donde se muestran como
controles los extractos totales de células de Bergmann de cerebelo de pollo y de
cerebro de rata, la inmunodetección próxima al marcador de peso molecular de 66
kDa corresponde al peso estimado de 60 kDa en humanos. El patrón de bandeo
amplio que se observa en la imagen puede corresponder a diferentes perfiles de
glicolisación que han sido observados en tejidos humanos versus de rata (Bauer et
al., 2010), además de que la estructura de los transportadores de Glu presenta una
extensa asa extracelular glicosilada, entre las porciones trans-membranales TM3 y
TM4 (Kanai et al., 2013).
La captura de [3H]DAsp es saturable a tiempo y dosis creciente del sustrato, a como
puede observarse en los paneles b y c de la fig.1. La concentración de la molécula
radiomarcada corresponde a 31 nM en todos los experimentos. Se observa un
equilibrio de transporte próximo a los 30 min, por lo cual los ensayos subsecuentes
evaluaron la captura al mismo tiempo. El análisis de la curva de saturación de
transporte (Fig. 1 c) mostró una KM con valor de 18 µM y una Vmax de 75
pmol/min/mg de prot. Estos valores corresponden bien con los reportados en otras
preparaciones (Danbolt, 2001).
55
Fig. 1 Expresión de EAAT1 en las células Mio-M1. (a) Una cantidad igual de extractos de proteína (50
µg) de cerebelo de rata, células Mio-M1 y células gliales de Bergmann fueron cargadas en cada carril.
Se aprecia la banda de 60 kDa en todas las muestras. Una imagen representativa de tres
experimentos similares. (b) Captura basal de [3H]D-Asp a 0, 5, 10, 20, 30 y 60 min. (c) Curva de
saturación de influjo de [3H]D-Asp en células Mio-M1 a treinta minutos en presencia de
concentraciones crecientes de D-Asp no marcado (0, 10, 25, 50, 100 y 200 µM). El análisis cinético
identificó una Vmax de 75 pmol/min/mg Prot. y una KM de 18 µM. Los valores graficados representan el
valor promedio ± SEM de tres experimentos independientes realizados por cuadruplicados.
En otros modelos de células gliales de Müller ha sido evidente que la exposición a
Glu regula la actividad de captura del mismo neurotransmisor (Gadea et al., 2004).
Por tal motivo indagamos si la exposición la exposición a Glu, a sus agonistas o
antagonistas produce algún cambio en la actividad de captura de [3H]D-Asp. Asi
observamos que AMPA y NMDA+L-Gly inducen un incremento alrededor de 50% en
la actividad de captura, en caso contrario el D-Asp y L-Glu inducen un decremento
significativo, el cual es mimetizado en menor medida por el agonista transportable
THA; por tal motivo la pre-incubación del antagonista de receptores tipo NMDA, MK-
801, evitó el aumento significativo en la captura de [3H]D-Asp (Fig. 2 a).
56
De forma semejante a lo encontrado en células gliales de Müller de pollo (Gadea et
al., 2004), el transporte de Glu o de su análogo transportable, el D-Asp, es
disminuido mediante su propia captura (Fig. 2 a y b), ya que la reducción en dicha
actividad no es revertida mediante la incubación de antagonistas ionotrópicos
(DNQX) y metabólicos (L-AP4). De manera importante se resalta que la activación de
receptores ionotrópicos, mayormente del tipo NMDA, aumenta la captura de [3H]D-
Asp, lo cual es segregado del efecto global de solo exponer a L-Glu los cultivos,
donde parece prevalecer el efecto mediado por el abundante sistema de transporte.
Fig. 2 La activación de receptores ionotrópicos tipo AMPA y NMDA incrementan la captura de [3H]D-
Asp en las células Mio-M1. (a) Los cultivos confluentes fueron pre-expuestos treinta minutos al
antagonista glutamatérgico MK-801 (10 µM) y al bloqueador transportable THA (0.1 mM). Los
estímulos de treinta minutos fueron aplicados AMPA (1 mM), NMDA+L-Gly (0.5 y 0.01 mM,
respectivamente), D-Asp (1 mM) y L-Gu (1 mM), posteriormente se midió la actividad de captura de
[3H]D-Asp por 30 min adicionales. (b) El efecto de diferentes antagonistas glutamatérgicos fue
analizado mediante la pre-incubación por 30 min de DNQX (50 µM) y L-AP4 (10 µM), posteriormente
se estimuló con L-Glu (1 mM) y se procedió a medir la actividad de captura. Los valores representan el
valor promedioa ± SEM de tres experimentos independientes, las diferencias entre la condición no
estimulada (NS) y las condiciones experimentales fueron analizadas mediante análisis de variancia de
una sola vía y prueba de comparación múltiple de Dunnett (***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).
Las respuestas rápidas en los transportadores mayormente corresponden a trafico
entre el compartimiento sub-celular y la membrana plasmática, por lo tanto es preciso
saber si la reducción en el influjo de [3H]D-Asp corresponde a un cambio en la
afinidad del transporte o en la capacidad máxima del transporte. Para tal efecto
57
evaluamos la actividad de captura a diferentes concentraciones del sustrato
transportable D-Asp (Fig. 3 a). De este modo encontramos semejanza entre las
curvas de la condición control (NS), del antagonista sólo (MK-801) y del antagonista
más el estímulo (MK-801 + NMDA+L-Gly), en caso contrario, la sola activación de los
receptores de NMDA produjo un aumento significativo en la velocidad máxima y no
así en la afinidad aparente (KM). Esto parece indicativo de que una mayor inserción
de transportadores en la membrana plasmática es inducida por efecto de los
receptores tipo NMDA. Adicionalmente una biotinilación e inmunodetección en fase
sólida corroboró este supuesto, ya que la fracción de la membrana plasmática
presenta mayor inmunodetección de EAAT1, no así en la fracción citoplasmática
donde no se aprecian cambios significativos y solo una tendencia a disminuir la señal
de EAAT1 (Fig. 3 b).
La incubación de concentraciones saturantes de 1 mM de L-Glu seguramente
permiten el trabajo y señalización eficiente tanto de receptores como de
transportadores, por lo tanto, existe la posibilidad de que no todos los
transportadores EAAT1 aumentados por el estímulo de L-Glu (Fig. 3 b) estén
efectivamente funcionando en la membrana (Fig. 2 a, b), a como puede ser sugerido
por la dependencia de EAAT1/GLAST a asociaciones con proteínas de andamiaje o
asociadas al citoesqueleto (Fig. 4) (Lopez-Colome et al., 2012).
58
Fig. 3 La activación del receptor tipo NMDA promueve el aumento de EAAT1 en la membrana
citoplasmática. (a) Las monocapas de células Mio-M1 fueron mantenidas en la solución de ensayo sin
tratamiento (NS), con NMDA-Gly (0.5 y 0.01 mM, respectivamente), pre-expuestas al antagonista MK-
801 (50 µM) y Mk-801 + NMDA+L-Gly durante 30 min, posteriormente se midió la actividad de captura
de [3H]D-Asp en concentraciones saturantes de D-Asp no marcado (0, 25, 50, 100 y 200 µM). Los
datos graficados son el valor promedio ± SEM de un experimento representativo de tres
independientes con tendencia semejante. (b) Los cultivos fueron expuestos durante 30 min a 1 mM de
L-Glu y a NMDA+L-Gly, posteriormente se marcaron las proteínas de la superficie celular con biotina.
Los extractos proteicos fueron separados por acople con avidina para obtener la fracción biotinilada
(proteínas de la membrana celular) y el sobrenadante (proteínas intracelulares). Se muestra la
inmunodetección en fase sólida de EAAT1 y se grafican el valor promedio de 5 experimentos
independientes ± SEM. Los análisis estadísticos fueron una ANOVA de una via más una prueba
múltiple de Dunnett para identificar las diferencias significativas respecto al control (***p < 0.001; **p <
0.01).
Con la intención de describir los mecanismos moleculares que puedan explicar el
incremento en los niveles de EAAT1 en la membrana plasmática, exploramos su
posibilidad de asociación proteína-proteína con Ezrina y GFAP, elementos
importantes en complejos proteicos de andamiaje (Nijboer et al., 2013). La figura 4
59
muestra que la asociación más fuerte de EAAT1 con proteínas asociadas al
citoesqueleto y de andamiaje aumenta con la presencia de los estímulos. Una mayor
inmunodetrección de Ezrina y p-Ezrina (Tyr354) fue encontrada cuando las células
fueron expuestas a NMDA+L-Gly (Fig. 4 a, b), mientras que la interacción con GFAP
fue mayor tanto con L-Glu como con NMDA+L-Gly (FIg. 4 c). Estas asociaciones
fueron corroboradas con el proceso inverso, inmunoprecipitando con GFAP, ezrina
total, p-Ezrina e inmunodetecctando a EAAT1 (Fig. 4 d).
La proteína GFAP es un miembro poco estudiado del citoesqueleto, pese a que en la
descripción inicial de las células MIO-M1, la detección baja de esta proteína y en
pocas células es considerado como un punto a favor ya que convencionalmente se le
relaciona a procesos de astrogliosis y lesiones del sistema nervioso (Limb et al.,
2002), en los últimos años se ha encontrado que GFAP se asocia a proteínas ERM
(“actin associated ezrin, radixin an moesin proteins”), partiendo desde el
citoesqueleto hasta fuera de la membrana celular (Derouiche and Frotscher, 2001).
Por lo tanto una relevancia en el anclaje de proteínas en la membrana fue inferida.
Posteriormente se describió la importancia funcional de la interacción de GLAST con
NHERF1, Ezrina y GFAP; pese a que no se considera que halla una asociación
directa GLAST-GFAP, el formar parte del mismo complejo aumenta la posibilidad de
que GLAST se encuentre en la membrana citoplasmática, además de que GFAP
parece contribuir a la estabilidad de los procesos astrocíticos (Derouiche and
Frotscher, 2001). Por lo tanto, el hecho de que tanto L-Glu como NMDA+L-Gly
aumenten la interacción de EAAT1 con GFAP (Fig. 4 C) concuerda con que
encontremos una mayor inserción de dicho transportador en la membrana celular
(Fig. 3 b), pero el hecho de que el transporte de [3H]D-Asp disminuya con L-Glu
puede explicarse también por la falta de proteínas importantes en el complejo
funcional de EAAT1/GLAST, como la ezrina (Fig. 4 a, b) (Sullivan et al., 2007; Nijboer
et al., 2013).
60
Fig. 4 Interacción de EAAT1 con proteínas asociadas al citoesqueleto. Las células Mio-M1 fueron
tratadas durante 30 min con 1 mM de L-Glu o NMDA+L-Gly (0.5 mM. 0.01 mM, respectivamente),
entonces los extractos proteicos pre-absorbidos de de IgG fueron incubados con anticuerpos anti-
EAAT1 acoplados a Proteína A-agarosa. Se muestra la imagen representativa de uno de tres
experimentos independientes para la inmunodetección en fase sólida (WB) de p-Ezrina en Tyr354 (a),
Ezrina total (b) y GFAP (c). (d) Después del mismo tratamiento previamente descrito, los extractos
fueron inmunoprecipitados con GFAp, Ezrina, y p-Ezrina y se inmuno-detectó a EAAT1. Las gráficas
representan el valor promedio ± SEM. Los análisis de ANOVA de una vía más una prueba de
comparación multiple de Dunnett identificó diferencia significativa respecto del control (***p < 0.001;
**p < 0.01).
61
El presente trabajo también sugiera un papel funcional para el complejo EAAT1-
GFAP en condiciones basales, sin embargo se sugiere que en condiciones
patológicos, como hipoxia, estas relaciones porteína-proteína se modifiquen de modo
que los transportadores de L-Glu se han observado des-localizados y las
proyecciones astrocíticas retraídas, explicando así parte de la excitotoxicidad
comúnmente observada (Nijboer et al., 2013).
Una caracterización detallada del efecto de Glu a través de activar a sus receptores o
de sus transportadores, está comenzando a estudiarse (Fig. 5).
Fig. 5 El Ca2+ extracelular y la activación PKC están involucrados en el aumento en el aumento de la
captura de [3H]D-Asp en las células Mio-M1. La células fueron pre-incubadas por 20 min en las
siguientes condiciones: medio libre de calcio (wo/Ca2+), el inhibidor de PKC Bisindolylmaleimide (BisI,
1 µM), el antagonista de calmodulina N-(6-aminohexyl)-5-chloro-1- naphthalenesulfonamide
hydrochloride (W-7, 25 µM), el bloqueador no transportable de los EAATs (TBOA, 100 µM) o con el
inhibidor de la síntesis de proteínas cicloheximida (Chx, 10 µg /ml). Posteriormente las células fueron
estimuladas con NMDA+L-Gly (0.5 mM y 0.01 mM, respectivamente) durante 30 min y se procedió a
medir la actividad de captura de [3H]D-Asp. Los valores representan el valor promedio ± SEM de tres
experimentos independientes, evaluados mediante una ANOVA de una solo vía y una comparación
múltiple de Bonferroni para todos los pares de columnas, Control vs. su respetivo tratamiento,
identificado con el mismo patrón (***p < 0.001; **p < 0.01; *p < 0.05).
62
Conclusión Describimos la participación de los receptores ionotrópicos glutamatérgicos en la
regulación de EAAT1 en la línea celular humana MIO-M1. La activación de los
receptores tipo AMPA y NMDA conducen a un aumento en la captura de [3H]D-Asp,
pero concentraciones elevadas de L-Glu promueven un decremento en la actividad
de captura. La activación de los receptores tipo NMDA inducen una mayor presencia
de trnasportadores EAAT1 en la membrana plasmática, lo cual se corresponde con
una mayor asociación de EAAT1 con GFAP y Ezrina, sin embargo L-Glu no incluye a
la proteína Ezrina en tal asociación.
63
Métodoogía general Materiales:
Los reactivos de cultivo fueron obtenidos de GE Healthcare (Carlsbad, CA, USA). La
Deoxy-D-glucose, 2-[1,2-3H (N)] (Actividad específica 20 Ci/mmol) y el [3H]D-Asp de
Perkin Elmer (Boston, MA, USA). [3H]GABA (Amersham Pharmacia Biotech,
Piscataway, NJ, USA).
L-Gln, D-Asp, L-Glu y 2-Deoxy-D-glucose (2DOG) no marcada fueron obtenidos de
Sigma-Aldrich, Mexico. El Bisindolylmaleimide I (Bis I) de Calbiochem, (EMD
Millipore, Darmstadt, Germany), el H-9 dihydrochloride, KB-R7943 mesylate, DL-
threo-b-Benzyloxyaspartic acid (TBOA), threo-b-hydroxyaspartate (THA), MK801
(Cat. No.0924), CNQX (Cat. No. 1045) y DNQX son de Tocris-Cookson (St. Louis,
MO, USA).
Anticuerpos: policlonal conejo anti Ezrina (sc-20773), conejo anti p-Ezrina, Tyr354
(sc-101678), policlonal cabra anti GFAP (sc-6170), policlonal IgG de cabra anti-
GLUT1 (sc-1605) y anti-GLUT3 (sc-7581) son de Santa Cruz Biotechnology, Dallas,
TX USA. El anticuerpo monoclonal anti-calbindina D (C-8666) fue de Sigma-Aldrich,
St. Louis, MO, USA), GAT-3 (AB1574) de Millipore, el IgG de conejo anti-la proteína
de unión a cainato (KBP) y el suero de conejo anti-GLAST fue producido y
caracterizado en nuestro laboratorio (Martinez-Lozada et al.). El anticuerpo
monoclonal anti-alfa-actina fue donado pro el Prof. Manuel Hernández (Cinvestav-
IPN).
Las partículas de agarosa acopladas a la proteína A y G, los anticuerpos secundarios
anti IgG de ratón, cabra y conejo acoplados a la peroxidasa de rábano, el sustrato
para quimioluminiscencia ECL (de “Enhanced Chemilumiscence”), GABA, PMA,
metosulfonato Ro 31-8220, calphostin C, estaurosporina y forskolina fueron
obtenidos de GE Healthcare Life Sciences (Mexico DF). La biotina EZ-Link Sulfo-
NHS-LC-Biotin, No-WeighTM Format (Cat. 21335, from Thermo Scientific), la
suspensión de perlas CaptAvidin agarosa sedimentada (Cat. 21386) y el Fura-2 AM
fueron de Molecular Probes. Los reactivos restantes fueron obtenidos de Sigma (St.
Louis, MO, USA).
Cultivo celular y protocolo de estimulación:
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Los cultivos primarios de las CGB fueron preparado a partir de cerebelos de
embriones de pollo de 14 días, a como previamente fue establecido (Ortega et al.,
1991). Las células fueron sembradas en cajas de cultivo de 24 y 6 pozos, para
ensayos de radiactividad y de proteínas, respectivamente. Las células disgregadas
fueron re-suspendidas en el medio de cultivo OPTIMEM con 4% de suero fetal
bovino, gentamicina (50µg/ml), crecidas en mezcla gaseosa con 5% de CO2 durante
3 o 4 días antes de ser usadas para experimentación.
Los cultivos de glía de Müller se obtuvieron a partir de retinas de embriones de 9 días
(E9), a como se ha descrito anteriormente (Reis et al., 2002). Se considera ¼ parte
de una retina por cada pozo de 35 mm de una placa de 6 pozos. El tejido es
disociado con tripsina y sembrado en medio DMEM con 10% FBS (suero fetal
bovino). A los 10 días de incubación, si es necesario, se adiciona 4 mM de ácido
ascórbico y se deja actuar durante 90 min aproximadamente para eliminar la mayor
parte de neuronas. Se realiza un lavado con DMEM y el cultivo se incuba durante
unos 5 días más, para ser usado alrededor de los 15 días in vitro.
Línea celular MIO-M1 y subcultivo:
Las células MIO-M1 fueron cultivadas en DMEM con alta glucosa, Glutamax I—
[Gibco BRL, Cat. 31966-047], 10 % FBS, penicilina y estreptomicina. Los pases
fueron realizados una vez por semana, sembrando aproximadamente ½ millón de
células en un frasco de 25 cm2 y el medio de cultivo es reemplazado cada 3-4 días.
Se usa una solución de Tripsina-EDTA (5.0 g/L trypsin, 2.0 g/L EDTA and 8.5 g/L
NaCl, 10X de Gibco BRL, Cat. 354000-027) durante 2-3 min a 37 ºC para despegar
la monocapa, la reacción es detenida con medio DMEM 10% FBS. Las células son
separadas mediante una centrifugación a baja velocidad y el paquete celular es
suspendido de nuevo en DMEM con suero al 10%, la siembra se realiza a una
densidad de 19 105 células por pozo (35 mm) y se incuba a 37ºC hasta alcanzar
confluencia. Los pases usados fueron hasta máximo 40.
Previo a cualquier tratamiento el medio de cultivo fue reemplazado por la solución de
ensayo (25 mM HEPES-Tris, 130 mM NaCl, 5.4 mM KCl, 1.8 mM CaCl2, 0.8 mM
65
MgCl2, 5 mM glucosa y 1 mM NaH2PO4, pH 7.4). Los experimentos que incluyen
diferentes condiciones iónicas en la solución de ensayo: el Tris-HCl reemplaza
equimolarmente al NaCl, cuando es en ausencia de calcio se acrecentaron 0.1 mM
EDTA. Los inhibidores y bloqueadores de algún sistema fueron pre-expuestos 20
minutos antes del tratamiento.
Captura de [3H]-2-D-deoxyglucosa ([3H]2DOG):
Las monocapas confluentes de CGB sembradas en placas de 24 pozos fueron
estimuladas por 30 o 15 minutes en la solución de ensayo. A continuación se
realizaron 30 minutos de captura en la misma solución de ensayo solo que sin
glucosa, en su lugar se adiciona 1-5 mM de 2DOG no marcada más 0.4 µCi/ml de
[3H]2DOG (20 nM). Donde se indica el NaCl fue reemplazado por Tris-HCl y el calcio
sustraído de la solución más EDTA. El influjo de [3H]2DOG fue iniciado mediante la
adición de la solución de captura a cada unidad experimental (0.25 ml). Los valores
cinéticos fueron estimados mediante los ensayos de captura con concentraciones
crecientes de 2DOG no marcada (0, 0.1, 0.5, 1, 2 ) mas la cantidad antes indicada de
[3H]2DOG. El tiempo de captura fue d 30 min. La reacción fue detenida mediante
lavados extensos con la solución de ensayo fría sin glucosa ni análogo de la mismas.
La monocapa de CGB fue lisada en solución 0.1 M de NaOH en agitación, a
temperatura ambiente por 2h, una alícuota fue tomada para el cálculo de la
concentración de proteínas con el ensayo de Bradford, lo restante de la lisis celular
fue mezclado con líquido de centelleo y las muestras analizadas en un contador de
centelleos de Perkin Elmer. Cada experimento se evaluó por lo en tres ocasiones
independientes, con cuadruplicados cada condición experimental.
Captura de GABA en células de glía de Müller (CGM)
Los cultivos fueron estimulados, y subsecuentemente incubados en la solución de
captura con [3H]GABA (0.4 µCi/ml) y 100 µM de GABA en solución de captura. Los
antagonistas fueron incubados 15 min antes del tratamiento: PMA (0.1–2 µM), DHPG
(10, 50 and 100 µM), MK801 (10 µM), DNQX (70 µM).
Captura de [3H]D-Asp
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Las monocapas confluentes de células MIO-M1 sembradas en placas de 24 pozos
fueron cambiadas a solución de ensayo que contiene 0.4 µCi/ml de [3H]-D-Asp, la
reacción es detenida mediante lavados en solución fría. Las células fueron lisadas
con 0.1 M de NaOH durante 2 h a temperatura ambiente, la concentración de
proteínas determinada mediante el ensayo de Bradford y la radiactividad en las
muestras fue estimada por un contador de centelleos. Todos los experimentos
incluyeron cuadruplicados.
Cuantificación de L-Glu por HPLC-ED
Los niveles de L-Glu en las células y en el medio fueron medidos a través de
cromatografía líquida de alta resolución acoplada a detección electro-química
(HPLC–ED; Shimadzu, Japan). El protocolo usado corresponde a la adaptación de
uno anteriormente usado (Monge-Acuna and Fornaguera-Trias, 2009). Las muestras
desproteinizadas con ácido tri-cloroacético (TCA; 10%) fueron congeladas a -70ºC,
hasta su uso posterior. Una vez descongeladas se mezclaron con una solución
derivadora de sulfito de o-Ftalaldehído (Rowley et al., 1995) y corridas a través de
una columna de fase reversa de C-18 (Sigma-Aldrich, USA) antes de ser detectadas.
SDS-PAGE e inmuno-detección en fase sólida
Los cultivos sembrados en placas de seis posos fueron tratadas en la solución de
ensayo, la reacción fue detenida por lavado en PBS frío. La cosecha fue realiza en
PBS (10 mM K2HPO4, 150 mM NaCl, pH 7.4) con inhibidores de proteasas (1 mM
phenylmethylsufonyl fluoride –PMSF-) y fosfatasas (10 mM NaF, 1mM Na2MoO4). La
pastilla de células fue obtenida por centrifugación en frío (16 000 x g, 5 min), las
células fueron lisadas y solubilizadas en el tampón de 50 mM Tris-acetato, pH 7, 5
mM EDTA, 1 mM PMSF, 1 mM Na3VO4, 1 µg/ml aprotinin 1 µg/ml leupeptin y 0.2%
SDS (Sodium Dodecyl Sulphate). Los restos celulares fueron descartados mediante
centrifugación en frío (16000 x g, 5 min) y se estimó la concentración de proteínas
por el ensayo de Bradford en micro-placa usando una mezcla de gamma-globulinas
bovinas para la curva estándar. La cantidad necesaria de muestra (alrededor de 50
µg) fue desnaturalizada hirviendo por 5 min en el tampón azul de muestra (Laemmli’s
buffer), posteriormente analizada mediante electroforesis desnaturalizante en poli-
67
acrilamida 8-10% (SDS-PAGE), elctro-transferidos a membranas de nitrocelulosa y la
tinción de Ponceau fue documentada y usada como control de carga. Las
inespecificidades fueron bloqueadas con solución al 5% de leche descremada de
vaca o de soya por 30 a 60 min. Los anticuerpos primarios se incubaron en solución
de TBS-0.1% Tween, 0.25% BSA, en frío por 12 h aproximadamente, en las
siguientes concentraciones: cabra anti-GLUT1 (1:500), cabra anti-GLUT3 (1:500),
conejo anti-GLAST (1:2000) y conejo anti-GAT3. Los anticuerpos secundarios
acoplados a la peroxidasa fueron incubados dos horas a temperatura ambiente,
1:4000. La quimioluminiscencia de la inmuno-reactividad fue detectada mediante el
foto-documentador MicroChemi (DNR Bio-Imaging System) con cámara CCD
(charge-coupled device). Los análisis densito-métricos fueron realizados con el
programa Image J64 (Schneider et al., 2012) y los datas graficados y analizado
mediante el programa Prism 5, GraphPad (San Diego, CA, USA).
Biotinilación de proteínas de la membrana plasmática
Dos pozos por cada placa de cultivo de 6 fueron usados para cada condición
experimental. Posterior al tratamiento las monocapas de células fueron lavadas con
PBS/Ca2+/M2+ (1 mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+), incubadas en frío por 30 min con una
solución de EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin (0.14 mg/ ml or 0.25mM) en PBS/Ca2+/M2+.
La biotina no ligada fue retirada mediante tres lavados con PBS/Ca2+/M2+/L-Gly (1
mM Ca2+, 0.5 mM Mg2+, 0.1 M L-Glicina) en frío y agitación lenta (3 min c/u). Las
células fueron cosechadas, centrifugadas, lisadas y la concentración de proteínas
cuantificada, a como se indica en la sección de SDS-PAGE. Por lo menos 300 µg, de
cada condición experimental, fueron acoplados con 30 ml de streptavidina acoplada
a partículas de agarosa (SA) en volumen de 400 µl de PBS, en agitación lenta, en
frío, durante 12 h. Las muestras fueron centrifugadas (16000 x g, 10 min, 4º C), el
primer sobrenadante guardado como la fracción citoplasmática, los precipitados de
SA fueron lavados tres veces con PBS 0.1% tritón en frio, centrifugando cada vez. Al
final la pastilla, los sobrenadantes y los “inputs” (proteína sin interactuar con SA)
fueron desnaturalizados por ebullición 5 min con el tampón azul de muestra
(Laemmli’s buffer), a continuación de procedió al procedimiento de inmunodetección
en fase sólida.
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Inmunoprecipitacion de proteínas
Posterior a los tratamientos las células fueron cosechadas, centrifugadas, lisadas, los
extractos clarificados y cuantificados por el método de Bradford a como se indica en
la sección “SDS-PAGE e inmuno-detección en fase sólida”. Los extractos fueron
limpiados de IgGs mediante la incubación (agitación lenta y en frío) de los mismos
por 30 min con 3 µl de las partículas de agarosa acoplada a la proteína G (para
anticuerpos cuyo hospedero es la cabra) o A (para anticuerpos cuyo hospedero es el
conejo) para cada condición experimental. Los anticuerpos para inmunoprecipitar
fueron acoplados con las proteínas G o A, por interacción en PBS frío, agitación
lenta, durante 4 h. Posteriormente, por lo menos 200 µg de proteínas de los extractos
pre-aclarados se mezclaron con los complejos “Prot. G/A + anticuerpo”, se dejaron
interactuar en agitación lenta, en frío, 12 h. Los primeros sobrenadantes fueron
guardados para cargarlos en los geles. Las patillas de las inmunoprecipitaciones
fueron lavadas tres veces con PBS (400 µl) y centrifugadas cada vez. Los “inputs”
(proteína que no interactuó con Prot. G/A ni anticuerpo), los sobrenadantes y los
inmunoprecipitados fueron desnaturalizados por 5 min de ebullición en el tampón
azul de muestra y procesados para inmunodetección en fase sólida.
Inmunofluorescencia e inmunohistoquímica
Los cultivos fueron sembrados en cubre-objetos de 21 mm de diámetro, estimulados,
lavados con PBS en frío y fijados por 4 % PFA (paraformaldehído) durante 10 min en
temperatura ambiente. Los aldehídos residuales fueron inactivados por una lavado
con solución de cloruro de amonio (0.05 M NH4Cl, 5 min) La membranas celulares
fueron permeabilizadas por 15 min con solución de PBS 0.2% de Tween 20, las
inespecificidades fueron bloqueadas durante 30 (PBS-0.1 % Tween 20 con 1% BSA
y 0.3 M L-Gly). Los anticuerpos primarios fueron incubados por 12 h en frío: anti-
GLUT1 (1:250), anti-GLUT3 (1:250), anti-KBP (1:500), IgG de ratón anti–2M6
(específico para glía de Müller) 1:500, conejo anti GAT-3 (Millipore) 1:200, conejo anti
GFAP (Spring, M3782) 1:100 y anticuerpo monoclonal anti Brn3a en solución de
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anticuerpos (PBS con 0.1 % BSA). Los cubreobjetos fueron lavados tres veces y el
anticuerpo secundario incubado 2 horas a temperatura ambiente: Alexa Fluor 488
burro anti-goat IgG 1:1000 (A11055), TRITC goat anti-conejo IgG 1:200 (81-6114),
goat anti- ratón Alexa 488 y cabra anti-mouse Alexa 555 (Invitrogen). Los cubre-
objetos fueron lavados tres veces con PBS, enjuagados en agua milliQ, secados por
inmersión en etanol completo y montados sobre porta-objetos con el medio de
montaje Fluoroshield con DAPI (F6057, Sigma-Aldrich), los bordes fueron sellados
con barniz de uñas sin color. Las preparaciones fueron analizadas en una plataforma
confocal Leica TCS SP8.
La inmunohistoquímica fue realizada en secciones de 50 µm de espesor (crio-
preservadas) de cerebelos de embriones de pollo de 18 días. Los cerebelos fueron
lavados exhaustivamente por inmersión en PBS frío antes de fijar durante 1 h con
una solución de 4% PFA in PBS (pH 7.4). El fijador fue cambiado una vez y dejado a
4°C por 48 h. El cerebelo fue criopreservado por inmersión sucesiva en soluciones
de sacarosa en PBS (10 – 20 – 30%). Los cortes fueron realizados sagitalmente en
un criostato (Microm International GmbH, Walldorf, Germany). Los tejidos fueron
lavados exhaustivamente en PBS para remover los excesos de aldehídos y entonces
incubados por 10 min en solución de peróxido de hidrógeno (1.8%) para inactivar la
peroxidasa endógena. La inespecificidad de los anticuerpos fue bloqueada por
incubación en solución de bloqueo por 1 h a temperatura ambiente (PBS-0.3% tritón
con 3% de suero de cabra). Las secciones fueron incubadas a 4°C durante 48 h con
los anticuerpos primarios en la solución de bloqueo: ratón anti-calbindina (1:5000),
anti-KBP (1:2500), anti-GLUT1 and anti-GLUT3 (1:500). El anticuerpo primario fue
lavado tres veces en PB (tampón de fosfatos) y se colocaron los anticuerpos
secundarios biotinilados durante 3 h (1:1000; Vector Laboratories, Inc., Burlingame,
CA, USA), anti-conejo para KBP, anti-cabra para GLUT1 y GLUT3. El complejo de
avidina-biotina-peroxidasa fue incubado durante 1 h (1:250; Vector Labs). Los
complejos de anricuerpo-peroxidasa fueron revelados con una solución 0.05% de
diaminobenzidina, sulfato de níquel (10 mg/mL; Fisher Scientific, Pittsburg, PA, USA),
cloruro de cobalto (10 mg/mL; Fisher Scientific) y 0.01% de peróxido de hidrógeno, lo
cual produjo un precipitado color negro-púrpura. Las secciones de tejido fueron
70
montadas sobre cubre-objetos gelatinizados, deshidratados, aclarado con Hemo-De
(Fisher Scientific) y montados con el medio de montaje Permount. Los cortes fueron
analizados en un microscopio Olympus BX41.
Obtención de la retina de pollo (P10):
Los ojos son enucleados, cortados perpendicularmente para obtener dos secciones
iguales, las cuales fueron fijadas por inmersión en paraformaldehído al 4% en PB
(tampón de fosfatos 0.16 M, pH 7.2) durante 2 h. Posteriormente se lavaron en PB y
se crioprotegieron con sacarosa (15 y 30%) por 24 h. Las secciones de ojo fueron
montadas con el medio OCT (Sakura Finetek, Torrance, CA), congeladas, cortadas
en rebanadas de 12 a 16 micrómetros y fijadas sobre cubre-objetos tratados con poli-
L-Lisina (Sigma Aldrich).
Imagen de calcio de una sola célula (Single Cell Calcium Imaging, SCCI)
El protocolo usado para evaluar los niveles en calcio intracelular ([Ca2+]) es una
adaptación del reportado anteriormente (De Melo Reis et al., 2011). Las células
fueron cargadas con 5 µM de Fura-2/AM diluido en una solución de Krebs (132 mM
NaCl, 4 mM KCl, 1.4 mM MgCl2, 2.5 mM CaCl2, 6 mM glucose, 10 mM HEPES, pH
7.4) que contiene 0.1 % BSA y 0.02% de ácido plurónico F-127, durante 40 min, en
una incubadora (5% CO2, 95% mezcla atmosférica). La lisis completa de la sonda fue
asegurada con un reposo a temperatura ambiente por 10 min en solución Krebs. Los
cubre-objetos con las mono-capas de células fueron montados en una cámara RC-
20, sobre una plataforma P-5 (Warner Intruments, Hamden, CT) sobre la platina de
un microscopio de epi-fluorescencia invertido (Eclipse Ti-U; Nikon). Una perfusión
continua por gravedad mantiene un baño de Krebs y del estímulo de 2 mM de Glu en
la cámara RC-20. El sistema Lambda DG4 illumination sysmtem (Sutter Instrument,
Novato, CA) permite excitar al indicador de calcio a dos los longitudes de onda (340
y 380), mide la fluorescencia emitida a 510 nm. Las imágenes son obtenidas por una
cámara EMCCD enfriada de 16-bit (Photometrics, Tuscon, AZ), cuando las
fluorescencia es captada por un objetivo de 40x y un filtro de paso de 510 nm
(Semrock, Rochester, NY). Los datos generado son procesados por el programa
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Meta Fluor (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). Los valores de la proporción de la
fluorescencia de Fura-2 del tratamientos son analizados respecto a un nivel de
incremento igual o mayor al 20% respecto la condición control.
Neurodegeneracíón de retina
Este ensayo fue efectuado en pollos de diez días (P10). Se injectaron 5 μl de una
solución 50 mM de NMDA en el ojo derecho, en el ojo izquierdo se injectó la misma
cantidad de PBS estéril. Después de inducir la lesión los pollos fueron mantenidos 15
días en ciclo luz/oscuridad normal, posteriormente sacrificados para la obtención de
las retinas.
Análisis estadístico
Los datos del trabajo con las CGB fueron expresados con un valor promedio ± el
error estándar de la media (SEM). Un análisis de variancia de una sola vía (ANOVA)
permitió ver la diferencia entre grupos y la significancia (con un nivel = ó > 0.05) de
las condiciones experimentales vs. el control fue determinada por pruebas pos-hoc
como la comparación múltiple de Dunnett, usando el programa Prism 5, GraphPad
Software (San Diego, CA, USA).
Los datos del trabajo con las CGM fueron analizados a través del programa Prism 6,
usando la prueba t de Student o ANOVA de una sola vía, seguidas por las pruebas
para comparación múltiple de Tukey o de Dunnett; salvo que se indique de otro
modo, se presentan valores promedio +/- SEM de al menos 3 experimentos con
triplicados.
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Anexos
Anexos
1.- Envío del trabajo: “Coupling of glutamate and glucose uptake in cultured Bergmann glial cells”
2.-Artículo: “Functional plasticity of GAT-3 in avian
Müller cells is regulated by neurons via a glutamatergic input”
3.- Artículo: “Glutamate Receptor stimulation up-regulates Glutamate uptake in human Müller glía
cells”
4.- Revisión: “Glia plasma membrane transporters: Key players in glutamatergic neurotransmission”
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ANEXO 1
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ANEXO 2
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ANEXO 3
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ANEXO 4