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TruSeq DNA & RNA サンプル調製の
ベストプラクティスとトラブルシューティング
渡辺 真子 (Masako Watanabe, PhD) テクニカルアプリケーションサイエンティスト
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Outline
TruSeq DNA & RNA サンプル調製
• 成功へのベストプラクティス
• よくある問題のトラブルシューティング
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次世代シーケンス (NGS) のためのTruSeq ライブラリー
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ライブラリーの評価
qPCR を用いたTruSeq DNA ・ RNA ライブラリーの定量
- プライマーはイルミナシーケンシングライブラリーのアダプター末端に一致
Bioanalyzerを用いた品質の評価
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ライブラリー調製のベストプラクティスとトラブルシューティング
TruSeq DNA
– ワークフロー
– インプットに用いるサンプル
– 断片化
– ゲルによるサイズセレクション
TruSeq RNA
– ワークフロー
– インプットに用いるサンプル
– 断片化
TruSeq DNA と RNAに共通すること
– 試薬の取り扱い
– サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション
– AMPure ビーズを用いた精製
– バイオアナライザートレースの評価
TruSeq DNA & RNA サポートツール (Illumina Website)
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TruSeq DNA -ワークフロー
-インプットサンプル
-断片化
-ゲルによるサイズセレクション
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TruSeq DNA ワークフロー
http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf
Gel size selection
A. ゲノムDNA の断片化
B. End repair とリン酸化
C. A-tailing
D. Index adapter のligation
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TruSeq DNA ライブラリー
Gel-free method for TruSeq Enrichment
Gel-method for whole-genome resequencing
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べストプラクティス:
インプットサンプル, DNA
TruSeq DNA 1ug ゲノム DNA
定量 蛍光ベースの方法
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い
期待していないピークの検出
Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。
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べストプラクティス:
インプットの品質, TruSeq DNA
純度 260/280nm比: 1.8-2.0
サイズの確認 ゲル電気泳動
ゲノムDNA のサイズの確認
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い
期待していないピークの検出 不正確なライブラリーサイズ
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ベストプラクティス:
TruSeq DNA 断片化
断片化方法: Covaris
Covaris での断片化
(whole-genome resequencing)
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断片化
気泡の混入
不正確なインプット
15 100 200 300 500 850 [bp]
[FU]
100
50
0
DNA インプット
– 品質
– 量
Covaris
– 気泡を防ぐ
– 脱気
– 水量
– ウォーターバスの温度 (6-8°C)
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い
不正確なライブラリーサイズ
改善策:既知のDNAでのcovaris の動作確認
Air これはどういう意味なのか?
気泡が含まれている場合
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ベストプラクティス:
ゲルによるDNA のサイズセレクション
プロトコルに準じて実施して下さい。
サンプル毎に異なるレーン、またはゲルあたり1サンプルを流すことにより、 コンタミネーションを最小にして下さい。
サイズマーカー
– 推奨のプロメガ社製のマーカーをご使用下さい。
– DNA ラダーをオーバーロードしないようご注意下さい。 (load 3µl)
SyBr Gold Nucleic acid gel stainで前染色をしたゲルをご使用下さい。
400-500bp for
whole-genome
resequencing
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正確なサイズセレクションのためには、SYBR Gold で前染色したゲルが必要
TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション– Part I
400-500 bpを選択
SYBR Gold, 前染色
470 bp
SYBR Gold, 後染色
400-500 bpを選択
360 bp
起こりうる問題:不正確なライブラリーサイズ
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Life Technologies (Invitrogen) 社製 E-gels
ターゲットとしていないサイズを選択してしまう
TruSeq DNA ゲルによるサイズセレクション – Part II
ゲル電気泳動, 300-400 bp を選択
増幅前
340 bp
増幅後
270 bp
起こりうる問題:不正確なライブラリーサイズ
ここはどのような説明をすればよいか?
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TruSeq RNA - ワークフロー
- インプットサンプル
- 断片化
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TruSeq RNA ワークフロー
http://www.illumina.com/documents//products/datasheets/datasheet_truseq_sample_prep_kits.pdf
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最終産物 ~260bp
TruSeq RNA ライブラリー
Lower
Maker
Upper
Maker
Sample
Peak
Baseline
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ベストプラクティス:
インプットサンプル, RNA
TruSeq RNA 0.1-4ug total RNA
定量 蛍光ベースの方法
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出
不正確なライブラリーサイズ
Nanodropなど紫外分光法による定量は推奨しておりません。
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ベストプラクティス:
RNA Integrity (RIN ≥ 8)
From: Agilent’s Bioanalyzer Applications for Next-Gen Sequencing: Updates and Tips March 1, 2011
Human
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い
不正確なライブラリーサイズ
例:分解したサンプルを使用すると 、ライブラリー収量が低くなる。
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ベストプラクティス:
RNA の断片化
二価陽イオンと温度 (94°C) によるRNA の断片化
不十分な断片化
– インプットRNA の量が多い
– 不正確な温度
起こりうる問題:ライブラリー収量が低い 不正確なライブラリーサイズ
不十分な断片化
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TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い
-サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
- AMPure ビーズを用いた精製
-バイオアナライザートレースの評価
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ベストプラクティス:
試薬の取り扱い
A-テーリングミックス(ATL) とライゲーションミックス (LIG) は 粘性有
試薬を分注してマスターミックスの凍結融解を回避
ユーザーガイドにリストされた順序で試薬を添加
DNA RNA
- End Repair Mix
- A-Tailing Mix
- Ligation Mix
- PCR Master Mix
- First Strand Master Mix
- Second Strand Master Mix
- End Repair Mix
- A-Tailing Mix
- Ligation Mix
- PCR Master Mix
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い 期待していないピークの検出
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ベストプラクティス:
サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
加熱 有り 加熱 無し
A B
起こりうる問題:ライブラリー収量が低いまたは無い
サーマルサイクラーのフタは
100ºC に加熱
– チューブのフタへの凝縮
– 酵素活性効率の低下
– 高い塩濃度
サーマルサイクラーのキャリブレーション
推奨の粘着シールを使用
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Agencourt AMPure XP Beads を用いたDNA のサイズ選択
磁気ビーズを用いたDNA 精製法
ビーズ溶液:サンプル比に基づくサイズセレクション
あるサイズ以上の核酸をキャプチャー。
よりサイズの小さい核酸や夾雑物を除去。
Beads Double stranded DNA Enzymes, primers, adapters, etc.
サンプル ビーズの結合 分離 エタノール洗浄 溶出 別のチューブへ
マグネット
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ベストプラクティス:
AMPure XP ビーズ
ビーズ – 室温
ビーズ をVortex で撹拌
推奨のプレートとマグネットスタンド(Ambion)
注意深いピペッティング
用時調製した80% Ethanolを使用
ドライアップ中は、プレートをマグネットスタンドに置いたままにしておく
エタノールが残ると以降のステップを阻害
magnetic stand
1 2
3 4
1) clear 2) partly
3) in suspension
4) no beads
起こりうる問題: ライブラリー収量が低い
期待していないピークの検出
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TruSeq DNAとRNAに共通すること -試薬の取り扱い
-サーマルサイクラーのセッティングとキャリブレーション
-AMPure ビーズを用いた精製
-バイオアナライザートレースの評価
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サイズが大きくブロードなピーク
AMPure ビーズの持ち込み
考えられる原因
– ビーズを用いた分離の際、異なるマグネットを使用
– ピペットを用いた溶出の際、ビーズのペレットを分散
– ライブラリーをマグネット上に推奨時間保持しない
ビーズの持ち込み マグネット上での保持を追加した後
改善策: マグネット上での保持時間の追加
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ピークが混ざっている場合
Bioanalyzer Chipへのオーバーロード
High Sensitivity DNA 5-500pg/μl
DNA 1000 0.1-50ng/μl
改善策: サンプルの希釈
希釈してロード オーバーロード
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約100bpのピークの検出
PCR プライマーダイマー
プライマーダイマー
考えられる原因
– AMPure ビーズ
– 低品質または少量のインプットサンプル
起こりうる問題: プライマーダイマーがフローセルに結合
改善策: AMPure XP ビーズ シーケンス
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約120bp のピークの検出
アダプターダイマー
考えられる原因
– AMPure ビーズ
– 低品質または少量のインプットサンプル
– End Repair Mix または A-Tailing Mix の酵素の効率低下
– ゲルでのサイズセレクション
アダプター
起こりうる問題: アダプターがクラスターを形成
改善策: AMPure XP ビーズまたはゲル精製
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サイズが大きいピーク
PCR アーティファクト
考えられる原因 : PCRプライマーの枯渇
– サイクル数の増加
– 過剰なインプットサンプル
起こりうる問題: 期待していないクラスター密度
改善策: qPCR 後にシーケンス
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定量: 蛍光法
サンプルの質: ゲル(DNA) Bioanalyzer (RNA)
断片化: Covaris (DNA)
Fragmentation mix (RNA)
試薬: 粘性試薬の取り扱い
AMPure ビーズ: ベストプラクティスに準拠
ゲルによるサイズセレクション:
ゲル精製のプロトコルに準拠
PCR: PCRプライマーの枯渇を回避
サーマルサイクラ―の設定とキャリブレーション
ライブラリーのバリデーション :
qPCR と Bioanalyzer
TruSeq ベストプラクティス まとめ
プロトコルに準拠
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ライブラリー トラブルシューティング まとめ
低収量
– インプットサンプル
– 断片化
– AMPure ビーズでの精製
– 試薬の取り扱い
– サーマルサイクラーの設定とキャリブレーション
異なるライブラリーサイズ
期待していないピーク
– インプットサンプル
– 断片化
– AMPure ビーズでの精製
– ゲルでのサイズ選択
– PCR プライマーの枯渇
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TruSeq DNA & RNAサンプル調製
サポートツール
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For More Information Visit www.illumina.com – Support
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40
References
TruSeq Sample Preparation Best Practices Guide
https://icom.illumina.com/download/summary/xDKeCXABrEa2bkONskKNAw
TruSeq DNA LT Sample Prep Kit Support
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_lt_sample_prep_kit.ilmn
TruSeq DNA HT Sample Prep Kit Support
http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_kits/truseq_dna_ht_sample_prep_kit.ilmn
TruSeq RNA Sample Prep Kit v2 Support
http://www.illumina.com/support/sequencing/sequencing_kits/truseq_rna_sample_prep_kit_v
2.ilmn
Illumina Adapter Sequences Letter
https://icom.illumina.com/Download/Summary/5kKzNLtAtUCIhbHYc3NkUw
Sequencing Library qPCR Quantification Guide
https://icom.illumina.com/download/summary/mTte7HhpAEyCxBFbeMVqTw