UJI KARBOHIDRAT SECARA KUANTITATIF

Uji Kualitatif o Uji Molischo Uji Seliwanoffo Uji Anthroneo Uji Benedict o Uji Barfoedo Uji Iodino Uji Pembentukan Osasono Uji Fehling

Analisa Karbohidrat

Uji Kuantitatif o Cara Kimiawio Cara Enzimatiso Cara kromatografio Cara Optic (fisis)

II. Uji Karbohidrat secara Kuantitatif

HidrolisaOligo / polisakarida → monosakarida (Pati) Asam atau enzim (glukosa)

Penentuan karbohidrat dari kelompok polisarida dan oligisakarida, perlu perlakuan pendahuluan , yaitu hidrolisa sehingga diperoleh monosakarida.

Penentuan monosakarida: kimiawi fisik enzimatik kromatografi

Cara kimiawi

1. Metoda oksidasi dengan kupri

Dasar : reduksi kuprioksida menjadi kuprooksida karena adanya gula reduksi

Reagen : - Reagen Luff (campuran CuSO4, Na2CO3, dan asam sitrat) - Reagen soxhlet (campuran CuSO4 dengan K – Na –tartrat)

K-Na tartrat : pencegah pengendapan CuSO4 dalam reagen

kuprioksida - sebagai oksidator - direduksi oleh gula reduksi membentuk kuprooksida (endapan merah bata)Penentuan kuprooksida yang terbentuk: Menimbang setelah dikeringkan Melarutkan kembali, kemudian dititrasiMenentukan selisih kuprioksida sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksiPenentuan gula reduksi dalam larutan: Cara luff Schoorl Cara Munson Walker Cara Lane-Eynon

Cara Luff Schoorl

Yang ditentukan adalah CuO sebelum dan sesudah direaksikan dengan gula reduksi = (titrasi blanko – titrasi sampel)Reaksi :R – COH + CuO Cu2O + R – COOHH2SO4 + CuO CuSO4 + H2OCuSO4 + 2KI CuI2 + K2SO4

2CuI2 Cu2I2 + I2

I2 + Na2S2O3 Na2S4O6 + NaII2 + amilum : biru

Metode oksidasi dengan larutan Ferrisianida alkalis

Dasar : reduksi ferisianida ferrosianida oleh gula reduksi.2K3Fe(CN)6 + 2KI 2K4Fe(CN)6 + I2

2K4Fe(CN)6 + 3 ZnSO4 K2Zn2[Fe(CN)6]2↓ + 3 K2SO4

gula reduksi ditentukan : berdasar ∑ I2

berdasar ∑ NaS2O3 untuk titrasi

Indikator : amilum (warna biru hilang)K4Fe(CN)6 yang terbentuk dihitung dari selisih antara K3Fe(CN)6 sebelum dan sesudah reaksi reduksi.

Perlu dilakukan percobaan standarisasi

Metoda Iodometri

Kelebihan I2 dititrasi dengan Na2S2O3

Reaksi : Sampel Spesifik untuk aldosa, ketosa hanya sedikit yang teroksidasi

Harus dihilangkan zat yang dapat bereaksi dengan Iodin : etanol, aseton, mannitol, gliserin, Na laktat, Na format dan Urea

Laktosa secara kimiawi 25 ml susu + reagen filtrat 5 ml filtrat + reagen titrasi dengan Na2S2O3

100 A = (Tb – Ts) x N x 0,171 x

5

A = Kadar Laktosa (g/100 ml) Tb = titrasi blanko Ts = titrasi sampel

Susu dengan kadar protein = 3,2%, lemak = 3,5% dari 100 ml susu 48,4 ml filtrat 48,4 100 Kadar laktosa/100 ml susu = A x x 100 25

Penentuan SukrosaLangsung dengan Polirimeter/refraktometerKimia : hidrolisa (tentukan jumlah gula reduksi)

C6H12O11 + H2O C6H12O6 + C6H12O6

Sukrosa fruktosa glukosa (342) (180) (180)

∑ Sukrosa = 0,95 x ∑ gula reduksi ↓ BM Sukrosa 342 FK = =

2 BM gula reduksi 360Penting : Cek dulu kemungkinan adanya gula reduksi dalam sampel sebelum hidrolisa.

Penentuan pati

Prinsip : pati dihidrolisa dengan asam/enzim gula reduksi ditera jumlahnya[C6H10O25] m + mH2O m C6H12O6

pati glukosa BM = m.162 BM = 180 m

BM patiFK =

m . BM gula reduksi m x 162= = 0,9 m x 180

Cara Enzimatis

Terutama untuk penentuan gula dalam campuran

karena enzim bersifat spesifikMisal: penentuan glukosa dan fruktosa

Dasar : glukosa dan fruktosa difosforilasi menjadi

glu–6-fosfat (G6P) dan fruktosa-6-fosfat (F6P) dengan bantuan enzim heksokinase dan Adenosin–5-trifosfat (ATP)

G-6-P-DHG-6-P + NADP → glukonat 6P + NADPH + H+

NADPH yang terbentuk setara dengan glukosa yang bereaksi diukur dengan spektrofotometer (λ = 334, 340, 365 nm) PGIF-6-P → G-6-P

G-6P-DHG-6-P + NADP → glukonat-6-P + NADPH + H+

↓ Ditera

Glu + ATP G-6-P + ADPFruk + ATP F-6-P + ADP

Penentuan Laktosa dan Galaktosa

Dasar :

β galaktosidase

Laktosa + H2O Glukosa + β galaktosa

Gal DHβ galaktosa + NAD → asam galatonat + NADH + H+

↓ ditera (I) pada λ= 334, 340, 365 nm

C. Cara KhromatografiKhromatografi kertas/TLC : diukur besarnya Rf tiap komponoen karbohidrat

Jarak perpindahan molekul zat Rf =

Jarak perpindahan pelarut

Harga Rf tiap jenis gula tertentu untuk perlakuan yang sama dipengaruhi :

- Macam zat pelarut- Ukuran bejana- Suhu- Macam fase tetap/stasioner- Sifat zat yang dianalisa

Zat penyangga : kertas yang tersusun oleh selulosa murni (misal: kertas whatman no.1 kecepatan merambat zat sedang), dipotong sesuai kebutuhan.

Teteskan sampel (sekecil mungkin), penetesan 3-4 x (tetesan besar terjadi tailing/pemisah tidak sempurna)

Masukkan kertas ke dalam wadah berisi pelarut pelarut merambat pada kertas sampai tanda (Solvent front)

Kromatografi kertas untuk karbohidrat

- Larutan khloroglusional dan HCl dapat digunakan untuk:

Aldosa pentosa (violet) Ketosa pentosa (hijau tua) Ketoheksosa (kuning coklat) Metil pentosa (hijau )

Identifikasi :Cara fisis : menyinari kertas dengan sinar UV

pada λ: 254 – 370 nm

Kimiawi : semprot dengan larutan kimia misal:

-gula reduksi: anilinpthalat, AgNO3-gula non reduksi: naphtoresorcinol dlm asam fosfat.

Zat pelarut: zat murni atau campuran Untuk penentuan gula sederhana: Campuran butanol : asetat : air atau asam asetat : pyridin : air (4:1:5)

Uap IodinSemprotkan pada kertas diruang asamSetelah kering akan timbul noda berwarnaHitung Rf, bandingkan dengan standar

Cara fisis (Cara optic)

Penentuan index bias dengan refraktometer tiap jenis gula punya index bias tertentu. Keuntungan:

• interval skala index bias cukup besar 1,30 – 1,75• sampel sangat sedikit (beberapa tetes)• ketelitian : ± 0,0002

dinyatakan dengan

= pengukuran pada t = 20oC dengan sinar Natrium sebagai sumber sinar monokromatis.

20Dn

Pengaruh konsentrasi terhadap (α) sangat kecil diabaikan

Suhu berpengaruh perlu koreksi :

[ ] [ ] ( )[ ]20000184,01 −−−= tDt

Dt αα

Penentuan karbohidrat dengan polarimeter

Dasar: Karbohidrat bersifat optis aktif (mampu memutar bidang sinar terpolarisasi), karena mempunyai C asimetri

Keuntungan Sampel tidak mengalami kerusakan Dapat dilakukan cepat

Agar hasil teliti, maka: Larutan harus jernih dan tidak berwarnaLarutan tidak mengandung bahan asing yang bersifat optis aktif Konsentrasi sampel yang optimum: tidak terlalu pekat amupun encer

Penentuan dengan polarimeter

Hukum biot: kapasitas rotasi tiap individu gula sebanding dengan konsentrasi larutan dan panjang cairan dalam tabung

[α] : putaran/ritasi spesifikt : suhu pengukuran (oC)D : sinar Na (589 nm)α : sdf putar yang diamatiC : konsentrasi (g sampel/100 ml pelarut)I : panjang tabung (dm)

[ ]lC

Dt

αα 100=

Penentuan Serat Kasar

Serat kasar : Senyawa yang tidak dapat dicerna dalam

organ pencernaan manusia maupun binatang.

Dalam analisa : diperhitungkan banyaknya zat yang tidak larut dalam asam/basa encer pada kondisi tertentu.

Protein menyulitkan penyaringan perlu digesti pendahuluan dengan enzim proteolitik

Residu = serat kasar yang mengandung 97% selulosa dan lignin sisanya adalah senyawa yang belum dapat diidentifikasi

1. Defatting : menghilangkan lemak dalam sampel dengan pelarut lemak

2. Digestion : - pelarutan dengan asam - pelarutan dengan basa dalam keadaan tertutup pada temperatur

terkontrol (mendidih) segera dilakukan penyaringan untuk

mencegah kerusakan lebih lanjut

Langkah penentuan serat kasar