UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ERVA MATE (Ilex paraguariensis) NO
PROCESSO DE NEOVASCULARIZAÇÃO EM CAMUNDONGOS.
Autora: Renata Moreira da Silva Orientadora: Dra. Susana Elisa Moreno
Campo Grande
Mato Grosso do Sul Abril de 2015
UNIVERSIDADE CATÓLICA DOM BOSCO PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO BIOTECNOLOGIA
AVALIAÇÃO DO EFEITO DA ERVA MATE (Ilex paraguariensis) NO PROCESSO DE NEOVASCULARIZAÇÃO EM CAMUNDONGOS.
Autora: Renata Moreira da Silva Orientadora: Dra. Susana Elisa Moreno
“Dissertação apresentada, como parte das exigências para a obtenção do título de MESTRE EM BIOTECNOLOGIA, no Programa de Pós-graduação em Stricto Sensu em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco - Área de Concentração e Biotecnologia em Saúde Animal e Humana”.
Campo Grande Mato Grosso do Sul
Abril de 2015
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
(Biblioteca da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB, Campo Grande, MS, Brasil)
S586a Silva, Renata Moreira da
Avaliação do efeito da erva mate (Ilex paraguariensis) no processo de
neovascularização em camundongos./ Renata Moreira da Silva;
orientação Susana Elisa Moreno -- 2015.
57 f.
Dissertação (mestrado em biotecnologia) – Universidade
Católica Dom Bosco, Campo Grande, 2015.
. Inclui bibliografia
1. Biotecnologia 2. Neovascularização 3. Cafeína 4. Erva – mate
I Moreno, Susana Elisa II. Título
CDD – 660.6
“A menos que modifiquemos a nossa maneira de pensar, não seremos
capazes de resolver os problemas causados pela forma como nos
acostumamos a ver o mundo”. (Albert Einstein)
Dedicatória
Aos meus pais Gilberto (in memorian) e Ida
a minha eterna gratidão pelo incansável incentivo
e presença carinhosa.
A minha filha Rafaela, fonte de inspiração
da vida. Agradeço a Deus pela sua presença
cheia de vida e doçura que estimula o meu
caminhar. Mamãe é linda!
AGRADECIMENTOS
Não foi fácil chegar ao término de mais uma jornada. Confesso que nesses
dois anos tive momentos de alegrias, tristezas, correrias, perdas e conquistas. Mas
posso dizer que valeu apena cada etapa e hoje celebro um sonho realizado.
Mas que para esse sonho fosse realizado várias pessoas passaram pelo meu
caminho e que estiveram presente nessa conquista, assim esse é o momento de
agradecer.
A Deus, que me iluminou, deu força e sabedoria nos momentos de dúvidas,
fraquezas e dificuldades.
Ao meu pai pelo exemplo de vida e pelos ensinamentos, referências de
caráter, humildade e amor. A vida não permitiu que nesse momento estivesse ao
meu lado mais sei que estaria orgulhoso por me concluir esse trabalho. A minha
mãe pelo apoio incondicional e pelos valores que sempre me transmitiu, entre os
quais a força para nunca desistir de lutar. Amo vocês!
A minha pequena Rafaela que embora pouca idade, foi grande em
pensamentos, sabendo apoiar e compreender minhas dificuldades e ausências. É
para ela que me levanto todos os dias. Meu amor eterno.
A minha irmã Julyana que sempre se manteve presente em minha vida sendo
meu porto seguro. Ao meu cunhado Rafael pela paciência e amizade.
A minha família e amigos por apoiarem e torceram para que tudo desse certo.
Ao Lucas e Gabriel meu carinho especial, meus amores.
As minhas amigas Claudia, Priscilla, Michelle, Andrea, Rita, Bia, Camila e
Rosane que me apoiaram durantes todos esses anos, deixo meu carinho, respeito e
amizade.
Ao Centro Universitário da Grande Dourados – UNIGRAN – na figura da
magnífica reitora Rosa Maria D’Almato De Déa, pelo incentivo na busca de uma
melhor qualidade profissional.
A minha Orientadora Susana Elisa Moreno pela oportunidade, paciência e
pelos valiosos ensinamentos.
Aos meus colegas e a toda equipe do Programa de Pós-graduação em Stricto
Sensu em Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB.
As minhas amigas Claudia e Célia e ao meu amigo Miguel, que
compartilharam viagens e histórias durante esses dois anos. Obrigada por esses
momentos.
A Silvia, secretária do Programa de Pós-graduação em Stricto Sensu em
Biotecnologia da Universidade Católica Dom Bosco – UCDB – a minha gratidão e
reconhecimento pela disponibilidade e dedicação.
Aos meus alunos e alunas, pois são vocês que inspiram e nutrem a trajetória
da minha temporalidade de docente meu carinho e respeito.
A todos aqueles que colaboraram direta ou indiretamente para a realização
desse trabalho, meu muito obrigada!
BIOGRAFIA
Renata Moreira da Silva, filha de Gilberto Moreira da Silva e Ida Azevedo
Moreira, nascida em 10 de Junho de 1980 em Santa Mariana, no estado do Paraná,
graduou-se em Fisioterapia pelo Centro Universitário da Grande Dourados, 2003.
Pós-graduada em Fisioterapia Dermato-funcional e Cardiorrespiratória pela
Universidade de Ribeirão Preto – UNAERP/SP, ambas em 2004. Pós-Graduada em
MBA em Estética e Saúde pela Universidade Camilo Castelo Branco –
UNICASTELO/SP em 2009. Integrou no corpo docente do Centro Universitário da
Grande Dourados – UNIGRAN em 2006 permanecendo até os dias atuais nos
cursos presenciais e pós-graduação à distância. Em 2013 ingressou no Curso de
Mestrado Biotecnologia (Universidade Católica Dom Bosco - UCDB, área de
concentração em Biotecnologia em Saúde Animal e Humana). Atualmente
desenvolve pesquisa na área da Estética e Cosmetologia.
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................. IX
LISTA DE TABELA ..................................................................................................... X
Resumo ..................................................................................................................... XI
Abstract .................................................................................................................... XII
1INTRODUÇÃO ........................................................................................................ 13
1.1 Biotecnologia e prospecção de moléculas de interesse farmacológico ..... 13
1.2 Erva Mate ........................................................................................................... 15
1.3 Compostos fitoquímicos da erva mate ............................................................ 18
1.4 Angiogênese ...................................................................................................... 22
1.4.1 Mediadores químicos envolvidos na angiogênese ........................................... 24
1.4.2 Modelo de estudo da angiogênese .................................................................. 26
2 OBJETIVOS ........................................................................................................... 28
2.1 Objetivo Geral .................................................................................................... 28
2.2 Objetivos Específicos ....................................................................................... 28
3 MATERIAIS E MÉTODOS ..................................................................................... 29
3.1 Extrato de erva mate ......................................................................................... 29
3.2 Animais .............................................................................................................. 29
3.3 Técnicas da implantação subcutânea de fragmentos de esponja ............... 30
3.3.1 Confecção e preparo dos fragmentos de esponja ............................................ 30
3.3.2 Implantação das esponjas ................................................................................ 30
3.3.3 Remoção dos fragmentos de esponjas ............................................................ 31
3.4 Dosagem de hemoglobina ................................................................................ 31
3.5 Análise histológica ............................................................................................ 32
3.5.1 Determinação do colágeno ............................................................................... 32
3.5.2 Análise histológica da inflamação e neovascularização .................................. 33
3.6 Análise estatística ............................................................................................ 33
4 RESULTADOS ....................................................................................................... 34
4.1 Resultados referentes do 1º ao 14º dia de implantação das esponjas ......... 34
4.2 Peso médio das esponjas ................................................................................. 35
4.3 Avaliação da hemoglobina ............................................................................... 36
4.4 Avaliação histológica dos discos de esponjas ............................................. 37
4.4.1 Avaliação do infiltrado e neovascularização ..................................................... 37
4.4.2 Avaliação do colágeno ..................................................................................... 37
5 DISCUSSÃO .......................................................................................................... 39
CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................................... 44
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 45
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Distribuição geográfica da erva mate ....................................................... 15
Figura 2 – Aspectos botânicos da Ilex paraguariensis .............................................. 16
Figura 3 – Principais componentes orgânicos no extrato de Ilex paraguariensis ...... 19
Figura 4 – Estrutura molecular das Metilxantinas ...................................................... 21
Figura 5 – Esquema das vias da síntese e degradação da cafeína .......................... 21
Figura 6 – Processo de formação dos novos vasos capilares sanguíneos na
angiogênese .............................................................................................................. 23
Figura 7 – Etapa do processo de angiogênese ......................................................... 24
Figura 8 – Fatores do processo da angiogênese ...................................................... 25
Figura 9 – Modelo de matriz esponjosa .................................................................... 30
Figura 10 – Matriz esponjosa, apresentando alterações vasculares visíveis ao 14º
dia ............................................................................................................................. 34
Figura 11 – Avaliação do peso médio dos implantes das esponjas .......................... 35
Figura 12 – Determinação dos níveis de hemoglobina como indicativo da
neovascularização dos implantes de esponja em camundongos .............................. 36
Figura 13 – Avaliação do infiltrado inflamatório nos implantes de esponja em
camundongos ............................................................................................................ 38
Figura 14 – Avaliação histológica do infiltrado inflamatório nos implantes de esponja
em camundongos ...................................................................................................... 38
Figura 15 – Avaliação histológica da presença de colágeno nos implantes de
esponjas em camundongos....................................................................................... 38
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Formas de aplicações industriais da erva mate ...................................... 17
Tabela 2 – Compostos bioativos da erva mate e seus efeitos .................................. 20
Tabela 3 – Distribuição dos grupos experimentais .................................................... 31
RESUMO
A I. paraguariensis, popularmente conhecida como erva mate, é encontrada
principalmente na região sul do Brasil. Possui grande papel socioeconômico e
ambiental, podendo ser utilizada na indústria de alimentos, medicamentos,
cosméticos entre outras. Em sua composição fitoquímica destacam-se os ácidos
fenólicos e alcalóides purínicos, flavonóides, saponinas triterpênicas, taninos,
minerais e vitaminas. O Objetivo do presente estudo foi avaliar a ação do extrato
hexânico da erva mate sobre o processo de neovascularização, em modelo de
implante de esponjas de poliéster-poliuretano, em camundongos C57-black6.
Esponjas embebidas em 5, 10 e 30% do extrato hexânico da erva mate ou salina
(controle negativo) foram implantadas subcutaneamente no dorso dos animais. Após
14 dias as esponjas foram retiradas, sendo conduzida a avaliação da
neovascularização por meio da dosagem de hemoglobina e análise histológica para
investigação do infiltrado inflamatório e colagênese. Nossos resultados demonstram
que as esponjas tratadas com o extrato hexânico de I. paraguariensis nas
concentrações de 10 e 30% apresentaram maior quantidade de hemoglobina
quando comparado ao grupo controle negativo, indicando o aumento na
angiogênese. Por meio da análise histológica observou-se que as concentrações de
10 e 30% do extrato também foram capazes de induzir aumento no infiltrado de
células inflamatórias nas esponjas. Do mesmo modo, as mesmas concentrações do
extrato da erva-mate foram capazes de estimular a colagênese após o 14º dia de
implantação das esponjas. Em conjunto esses dados nos permitem concluir que o
extrato da erva mate possui substâncias bioativas capazes de aumentar a
neovascularização e a produção de colágeno, sugerindo o potencial uso da erva-
mate na cicatrização de feridas cutâneas, bem como em outros eventos onde seja
necessário o aumento da neovascularização local.
Palavra-chave: Angiogênese, erva mate, cicatrização.
ABSTRACT
The I. paraguariensis, popularly known as mate, is found mainly in southern Brazil. It
has great socio-economic and environmental role and can be used in the food
industry, medicine, cosmetics and others. In its phytochemical composition stand out
phenolic acids and purine alkaloids, flavonoids, saponins, tannins, minerals and
vitamins. The objective of this study was to evaluate the effect of the hexane extract
of yerba mate on the neovascularization process in model implant polyester-
polyurethane sponges in C57-black6 mice. Sponges soaked in 5, 10 and 30% of
hexane of yerba mate extract or saline (negative control) were implanted
subcutaneously in the back of the animals. After 14 days sponges were removed,
conducted the evaluation of neovascularization by levels of hemoglobin and
histological analysis to investigate the inflammatory infiltrate and collagenesis. Our
results demonstrate that the sponges treated with the hexane extract of I.
paraguariensis in concentrations of 10 and 30% had higher amounts of hemoglobin
compared to the negative control group, indicating an increase in angiogenesis.
Through histological analysis it was observed that concentrations of 10 and 30% of
the extract were also able to induce increased inflammatory cell infiltrate in the
sponges. Similarly, the same yerba mate extract concentrations were able to
stimulate collagenesis after the 14th day of implementation of sponges. Together
these data allow us to conclude that the yerba mate extract has bioactive substances
capable of increasing neovascularization and collagen production, suggesting the
potential use of yerba mate in the healing of skin wounds, as well as other events
where necessary the increasing local neovascularization.
Keyword: Angiogenesis, Mate, Healing.
1 INTRODUÇÃO
O termo Biotecnologia nos remete a conceitos estabelecidos no séc. XX e XXI
e está diretamente ligada a melhoria na qualidade de vida da sociedade ao longo de
seu desenvolvimento. Apesar da contemporaneidade do termo, é importante
ressaltar que a presença dos estudos ligados a essa área remonta a um passado
não tão recente nas relações científicas, estando assim, presente mesmo que de
maneira oculta, nas grandes descobertas que envolveram e envolvem as relações
biológicas e tecnológicas (ALBAGLI, 1998; BRAUNNER, 2005, FELIPE, 2007;
PAES; BAPTISTA, 2014).
Para que a Biotecnologia seja definida de uma forma mais abrangente
Malajovich (2012) propõe como uma área baseada na qual o conhecimento é
multidisciplinar, utilizando agentes biológicos para fazer produtos úteis ou resolver
problemas.
1.1 Biotecnologia e prospecção de moléculas de interesse farmacológico
O avanço da Biotecnologia passou por uma ampla avaliação a respeito da
sua importância econômica e social, ocasionando o desenvolvimento de áreas
estratégicas como a descoberta e a fabricação dos primeiros produtos derivados de
estudos biotecnológicos (insulina, hormônios de crescimento humano, entre outros).
Essas descobertas estimularam o investimento em diversos outros produtos de base
biotecnológica, como alimentos e combustíveis (MAYOR, 1992; FELIPE, 2007).
Estudos com plantas são considerados um elo entre a comunidade científica
e a tradicional, compartilhando informações e interesses para o desenvolvimento e
aprimoramentos de estudos (LEAL, 2012).Cerca de 20% das plantas encontradas no
mundo já foram ou estão sendo submetidas a testes biológicos e/ou farmacológicos
(SUFFREDINI et al., 2004 apud ARRAIS, 2012).
Atualmente o uso de plantas como fonte de moléculas com aplicação
terapêutica representa ainda nos dias atuais um importante recurso para o
desenvolvimento de medicamentos (MORAES, 2008; MORAIS, 2011).
O uso de plantas na forma de infusão, por exemplo, atrai grande parte da
população devido à ampla variedade de aromas, sabores e benefícios a saúde,
sendo utilizada como um recurso a mais no tratamento de doenças. É caracterizada
como uma terapia não convencional, e sua eficácia ainda são questionadas pelo fato
de não haver estudos rigorosos para análise de resultados e pela falta de uma base
racional dos conhecimentos científicos atuais (CORDEIRO, 2011).
Através de novos estudos diferentes técnicas vêm sendo utilizadas para as
descobertas de novos produtos, uma vez que a descoberta de novos princípios
ativos mostrou à importância de uma padronização desses medicamentos a base de
plantas e produtos da biodiversidade (PEREIRA FILHO, 2013).
Recentemente, as plantas medicinais ganharam espaço com as
comprovações de ações farmacológicas por meio de pesquisas científicas, porém
não podemos esquecer que a existência de uma vasta literatura sobre um
determinado componente não comprova sua segurança no que diz respeito ao seu
uso, independente da forma de que será utilizado (alimentos, infusão, entre outros)
(ANVISA, 2007; MORAES, 2008; MORAIS, 2011).
Os estudos toxicológicos de vegetais possuem a finalidade de avaliar a ideia
de que plantas medicinais, por serem naturais, são isentas de efeitos tóxicos ou
adversos, sendo fundamental estabelecer segurança, eficácia e a qualidade das
preparações de produtos vegetais (BASTOS, 2011).
A Organização Mundial de Saúde (OMS) destaca a importância e o
conhecimento sobre produtos da biodiversidade, sendo considerado um importante
instrumento para o desenvolvimento de novos produtos. No Brasil, diretrizes do
Ministério da Saúde determinam prioridade na investigação das plantas medicinais
(PEREIRA FILHO, 2013).
O Brasil é considerado um grande detentor da biodiversidade do planeta,
possuindo numerosas espécies produtoras de substâncias bioativas, pertencentes
aos diferentes Reinos. Os grandes avanços científicos mostram a capacidade de
consolidar a competência cientifica em varias áreas do conhecimento, com destaque
a elucidação do potencial da biodiversidade na geração de produtos (MAYOR, 1992;
FELIPE, 2007, MORAES, 2008; ARRAIS, 2012).
1.2 Erva Mate
A Ilex paraguariensis St. Hil. Var. paraguariensis (Aquifoliaceae), conhecida
popularmente como erva-mate é uma espécie nativa da América do Sul como
ocorrência natural restrita a três países: Brasil, Paraguai e Argentina (Figura 1)
(VIEIRA et al., 2010). No Brasil o cultivo da erva mate está localizado principalmente
no Paraná, Santa Catarina, Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, São Paulo e
Rio de Janeiro (MAZUCHOWSKI, 1989; FILIP, FERRARO, 2004 apud EFING et al,
2009).
Figura 1 - Distribuição geográfica da erva-mate. GOOGLE IMAGE 2014.
As seguintes denominações para Ilex paraguariensis são referidas por Daniel
(2009) erva-mate, caaguaçu, orelha de burro, caá, erva mate de talo branco, erva
piriquita, carvalho branco, mate, erva. Em espanhol, yerba mate; em Inglês, maté; no
Paraguai ka’a.
A primeira descrição sobre a Ilex paraguariensis, foi realizada pelo naturalista
francês Auguste de Saint-Hilaire (A. St.-Hil. (abreviatura oficial)) no qual suas
observações faziam a descrição de uma árvore perene com muitos ramos e folhas.
Sua altura varia de 8 a 15 metros em seu habitat natural, mas em cultivo (plantação)
devido às podas o seu tamanho pode não ultrapassar os sete metros (BERTÉ,
2011).
Apresenta um crescimento lento, florescendo entre os meses de setembro e
dezembro com a maturação de frutos entre janeiro a abril (EFING, 2008 apud
CUNHA, 2011). Possui caule cinza, folhas ovais e fruto pequeno verde a vermelho-
arroxeado, sendo as folhas da erva-mate aproveitadas na culinária, de várias
formas, conforme Figura 2 (DALLA NORA, 2008; NASCIMENTO, 2013).
Castaldelli e colaboradores (2011) relatam que o consumo da planta foi
promovido à categoria de tradição em algumas partes da América do Sul durante a
colonização, tendo o chimarrão como bebida típica, com consumo diário por pessoa
variando de 1,5 a 6 litros. Destaca-se no preparo de outras bebidas como tererê, chá
mate e mate cozido (SILVA, 2007; BARG, 2010; JACOB, 2012).
Figura 2–Aspectos Botânicos da Ilex paraguariensis. (BERTÉ, 2011).
A utilização da erva mate foi difundida através das nações Guarani e Quíchua
através da ingestão de infusões com as folhas sendo um hábito popular consumindo
principalmente no Rio Grande do Sul, Mato Grosso do Sul, Paraguai, Uruguai e
Argentina (DALLA NORA, 2008).
Segundo Esmelindro e colaboradores (2002), cerca de 80% da área de
ocorrência da erva mate pertencem ao Brasil, sendo a região Sul a maior produtora,
com 596 municípios envolvidos na atividade ervateira, com a maior parte são
extraídos de ervais nativos.
O valor social e econômico da Ilex paraguariensis é considerado indiscutível,
tanto que importantes grupos de pesquisadores têm investigado a utilização da erva
mate na área genética, da produção e da industrialização (STORCK et al., 2002;
BARG, 2010).
A ampla variedade de empregos para a erva mate está associada a sua
composição fitoquímica. Em sua composição pode-se citar os alcalóides (cafeína,
teofilina e teobromina), compostos fenólicos, vitaminas (A, B1, B2, C e E), sais
minerais (alumínio, cálcio, fósforo, ferro, magnésio, manganês e potássio), proteínas
(aminoácidos essenciais) glicídios (frutose, glicose, rafinose e sacarose), lipídeos
(óleos essenciais e substâncias ceráceas), além de celulose, dextrina e gomas
(FRIZON, 2011; NASCIMENTO, 2013).
Apesar de a Ilex paraguariensis possuir inúmeras possibilidades de emprego
(Tabela 1), a literatura aponta que há necessidade de aprimoramento na qualidade
dos seus produtos e na projeção das suas potencialidades (CORREA et al., 2011;
COLPO, 2012).
Tabela 1 – Formas de aplicações industriais da erva mate
Aplicação Industrial Sub-produtos Comerciais Forma de Consumo
Bebidas Chimarrão e tererê Chá mate Mate solúvel
Infusão quente ou fria
Refrigerantes e sucos, cerveja; vinho
Extrato de folha diluído
Insumos de alimentos Corante natural e conservante alimentar
Clorofila e óleo essencial
Sorvete, balas, bombons, chicletes e gomas
Medicamentos Estimulantes do Sistema Nervoso Central
Extrato de cafeína e teobromina
Compostos pra o tratamento de hipertensão, bronquite e pneumonia
Extrato de flavonóides
Higiene Geral Bactericida e antioxidante hospitalar e doméstico Esterilizante e emulsificante
Extrato de saponinas e óleo essencial
Tratamento de esgoto
Reciclagem de lixo urbano
Produtos de uso pessoal Perfumes, desodorantes, cosméticos e sabonetes
Extrato de folhas seletivo e clorofila
Fonte: Adaptado MACCARI JUNIOR (2005).
O uso da erva mate tem sido explorada tanto pela indústria de alimentos
(tererê, chimarrão, chá mate solúvel, chá mate verde, chá mate tostado, refrigerante,
bebidas energéticas, balas, ingredientes para produtos alimentícios) quanto pela
indústria química (tintas e resinas, medicamentos, desinfetantes, adstringentes,
cosméticos e perfumaria) (PAGLIOSA, 2009).
Maccari Junior (2000 apud MACCARI JUNIOR, 2005) levantou através de
seus trabalhos informações sobre diversas formas de aplicação para a erva mate
como na produção de medicamentos, cosméticos produtos de limpeza e na indústria
de alimentos.
O consumo das bebidas derivadas da erva mate possuem efeitos benéficos
que envolvem a prevenção dos fatores de risco das doenças cardiovasculares, ação
hipocolesterolêmica e atividade vasodilatadora (SOUZA, 2009).
Quanto ao uso de produtos à base da erva mate, estudos tem demonstrado a
presença de substâncias nos extratos de erva mate com ação antioxidante, anti-
inflamatório, antimutagênico, agente antiglicação e redutor de peso (MATSUMOTO,
et al., 2009; HECK, MEJIA, 2007; FILIP et al., 2010; COLPO, 2012, BRACESCO, et
al., 2011).
Estudos recentes sobre os efeitos da Ilex paraguariensis mostram atividades
quimiopreventivas (prevenção do dano celular) efeitos coleréticos e propulsão
intestinal, efeitos vasodilatadores, inibição da glicação (reação enzimática entre
açúcares sanguíneos, proteínas e lipídeos, formando produtos que se acumulam e
promovem locais estáveis para a catalisação da formação de radicais livres e
aterosclerose). Em relação à ação antioxidante da erva mate, pesquisas mostram
uma atividade antioxidante equivalente ou superior à vitamina C e à vitamina E
(BARG, 2010; RIL et al., 2010).
1.3 Compostos Fitoquímicos da Erva mate
Entre os compostos fitoquímicos presentes em produtos a base de Ilex
paraguariensis, destaca-se principalmente a presença de minerais, vitaminas e
constituintes que são metabólitos secundários da planta (COLPO, 2012).
Veronese (1944) mostra que a erva mate é constituída de água, celulose,
gomas, dextrinas, micilagem, glicose, pentoses, substâncias graxas, resina
aromática, legumina, albumina, cafeína, teofilina, cafearina, cafamarina, ácido
matetânico, ácido fólico, ácido virídico, clorofila, colesterina e óleo essencial. As
cinzas são compostas por potássio, lítio, ácido fosfórico, sulfúrico, carbônico,
clorídrico e cítrico, além de magnésio, manganês, ferro, alumínio e traços de
arsênico (GIRARDI, 2010). As folhas de mate possuem ainda, em sua composição,
alcalóides, flavonóides, vitaminas, taninos, ácido clorogênico e saponinas; o nível de
polifenóis é maior do que aquele encontrado no chá-verde e no vinho tinto
(LUNCEFORD; GUGLIUCCI, 2005 apud SILVA, 2009; GIRARDI, 2010).
O perfil fitoquímico de Ilex paraguariensis apresenta diversos constituintes
químicos ativos que podem ser responsáveis pelas inúmeras atividades biológicas
desta espécie (SANTOS, 2011). Dentre os componentes (Figura 3) podemos citar
aqueles que apresentam em maior quantidade como os à classe dos ácidos
fenólicos (ácido clorogênico e seus derivados) e alcalóides purínicos (metilxantinas,
como cafeína, teobromina e teofilina) seguidos pelos flavonóides (quercetina,
canferol e rutina), saponinas triterpênicas, taninos, minerais e vitaminas (A,
complexo B, C e E) (JACOB, 2012).
Figuras 3 - Principais componentes orgânicos no extrato de Ilex paraguariensis. Adaptado e retirado BRACESCO, et al. (2011).
Barg (2010) afirma em seu estudo que a cafeína o ácido hexadecanóico,
flavonóides, minerais (P, Fe e Ca) e vitaminas C, B1 e B2 são os maiores
constituintes encontrados na erva mate. Alguns estudos indicam ainda que a
acumulação simultânea de cafeína e teobromina parece ser uma característica
particular da Ilex paraguariensis (SANTOS, 2011).
Para Esmelindro (2002) apesar da grande quantidade de estudos realizados
sobre a erva mate, grande parte não apresenta resultados que possam ser
considerados definitivos, particularmente quanto às determinações quantitativas de
substâncias na composição química. Deve-se ressaltar que a composição química
da erva mate, assim como de outras plantas, pode sofrer alterações qualitativas e
quantitativas em função de diversos fatores, como o tipo de cultivo, clima, solo,
idade da planta, e a época da colheita (PAGLIOSA, 2009; CUNHA, 2011; SANTOS
2011; NASCIMENTO, 2013).
Estudos demonstram que as saponina presentes na erva mate possuem
atividades antitumoral, anti-edematogênica e pode auxiliar na redução do colesterol.
Os polifenóis são antioxidantes, anti-inflamatórios e anticarcinogênicos. As
metilxantinas são compostos interessantes devido às propriedades farmacológicas,
como estimulantes do sistema nervoso central, inibição do sono, diminuição da
fadiga e diuréticos, sendo os mais abundantes na espécie (Tabela 2) (DANIEL,
2009; CUNHA, 2011).
Tabela 2 – Compostos bioativos da erva mate e seus efeitos biológicos
Compostos Efeitos biológicos
Metilxantinas (Cafeína, teobromina e teofilina)
- Estimulador do Sistema nervoso central, cardíaco, muscular e renal. - Diurético. - Regulador da saciedade, termogênese, lipólise e oxidação lipídica. - Antiinflamatório.
Flavonóides (Quercetina, rutina) - Antiinflamatório. - Antioxidante. - Hipocolesterolêmico. - Hepatoprotetor.
Cafeoil-derivados (Ácido cafeíco, ácido clorogênico, ácidos dicafeoilquinicos)
- Antioxidante. - Antiinflamatório. - Neuroprotetor.
Saponinas (Matesaponina) - Antiinflamatório. - Hipocolesterolêmico.
Fonte: Adaptado e retirado Yamada (2013).
Em relação a erva mate, a cafeína (C8H10N4O2) ou 1,3,7-trimetilxantina,
classificada como um alcalóide pertencente ao grupo de compostos químicos
denominados metilxantinas, a cafeína é a que mais atua sobre o sistema nervoso
central (Figura 4) (ARAÚJO, 2011).
Figura 4 – Estrutura molecular das metilxantinas; 1: cafeína, 2: teobromina e 3: teofilina. Adaptado e retirado Andrade (2011).
Os estudos relacionados à biossíntese da cafeína se iniciaram na década de
1970. A substância é um derivado de um composto chamado xantosina, que é
convertido em cafeína em uma reação de biossíntese na qual intervém a ação de
três enzimas (ZAMPIER, 2001; DUTRA, 2009; OLIVEIRA, 2007). A biossíntese da
cafeína (Figura 5) é regulada pelas enzimas N-metiltransferases, principalmente
pelas 7-Metilxantosina sintetase e cafeína sintetase ou em alguns casos pela
teobromina sintetase. A cafeína é sintetizada nos tecidos jovens e a cafeína
sintetase encontra-se nos cloroplastos das folhas em desenvolvimento.
Figura 5 – Esquema das vias de síntese (A) e de degradação (B) da cafeína (OLIVEIRA, 2007)
Os alcalóides são responsáveis pelas propriedades estimulantes do mate. A
cafeína e a teobromina estimulam e facilitam a atividade cortical inibindo o sono, a
sensação de fadiga, estimulam os centros respiratórios e vasomotores, aumenta a
velocidade do metabolismo, já a teofilina ativa diurese e os movimentos peristálticos
facilitando a micção e a evacuação respectivamente (NOWACKI, 2010,
NASCIMENTO, 2013).
Zampier (2001), Andrade (2011) e Nascimento (2013) afirmam que a cafeína
assume destaque por suas propriedades farmacológicas, e boa parte das ações
fisiológicas atribuídas a erva mate deve-se à presença da cafeína. É a droga mais
amplamente utilizada em todo o mundo, presente em vários tipos de bebidas e
medicamentos.
De acordo com estudos o teor de cafeína encontrado na erva mate (Ilex
paraguariensis) observa-se uma variação sobre a fertilidade do solo, tipo de cultivo
nativo ou reflorestamento, a exposição ao sol ou sombreamento, a idade da planta e
o mês do ano para coleta da amostra. No estudo de Zampier (2001), em erva mate
cultivada em solo com adubação orgânica houve um aumento no teor cafeína que
variaram de 1,10% a 1,32% referente a outros cultivos de erva mate (SANTOS,
2004; NASCIMENTO, 2013).
Com relação aos compostos fenólicos ou polifenóis são considerados uma
das principais classes de metabólicos secundários, no qual são conhecidos pela sua
capacidade antioxidantes no organismo humano. Estudos relacionam a presença
dos ácidos fenólicos, cumarinas, ligninas, taninos, flavonóides e fazendo parte de
alcalóides e terpenóides (BERTÉ, 2011; NASCIMENTO, 2011).
De acordo com literatura os compostos fenólicos apresentam uma ação de
defesa a radicais livres produzidos, normalmente, pelo metabolismo das células ou
em resposta a fatores externo, porém estudos recentes sugerem que essas ações
podem atuar interferindo em vias inflamatórias e na regulação do metabolismo
energético e na saúde do intestino (COLPO, 2012; SOTO VACA, 2012).
Conforme os estudos in vitro as metasaponinas contidas nas folhas de Ilex
paraguariensis evidenciaram ação antiinflamatória e inibiram a proliferação de
células de câncer de cólon (PUANGPRAPHANT, et al., 2011;COLPO, 2012).
A relação dos efeitos anti-inflamatórios e imuno-moduladores de plantas que
apresentam polifenóis na sua composição vêm sendo investigada e apresentando
resultados promissores, destacando o estudo realizado por Puangpraphant e Mejia
(2009), no qual a avaliação do potencial anti-inflamatório do extrato de erva mate
através da capacidade de alguns compostos fitoquímicos e suas interações
produzindo a inibição da COX2/PGE e INOS/NO.
1.4 Angiogênese
Para Folkman; Brem (1992 apud FERREIRA 2006) o termo angiogênese foi
utilizado pela primeira vez em 1935 por Hertig para descrever a vascularização na
placenta e progressivamente foram desenvolvidos vários modelos in vitro e in vivo
para o estudo de seus mecanismos moleculares, modulação e a sua importância
nos processos fisiológicos e patológicos.
Outros autores utilizam para definir a angiogênese como um processo de
neoformação de estruturas vasculares a partir de capilares e vênulas pós-capilares
pré-existentes em resposta a diversos estímulos, denominados estímulos
angiogênicos, que por sua vez levam a formação de novos vasos que necessitam da
migração e proliferação de células endoteliais, para que ocorra o crescimento
vascular (FOLKMAN; HAUDENSCHILD, 1980; FOLKMAN; KLAGSBRUN, 1987).
O desenvolvimento vascular obedece a uma sequência organizada de
diversos eventos os quais devem ser coordenados por células e moléculas
especificas (SILVA, 2012). Esses mecanismos celulares e moleculares envolvidos
no crescimento vascular são diferenciados nos vários tecidos existentes, assim, os
neovasos apresentarão aspectos morfológicos e funcionais de acordo com as
necessidades de cada tecido (FERREIRA, 2006).
Conforme Borba (2012) no processo denominado angiogênese, a rede
primária de vasos sofre uma remodelagem combinados a partir de eventos de morte
e regressão vascular iniciado pela sobrevivência e ramificações de capilares de
vasos pré-existentes.
Para Castro (2012) e Almeida (2014) a formação de novos vasos sanguíneos
é regulada por um equilíbrio entre fatores pró e anti-angiogênicos e ocorre tanto em
processos fisiológicos (duração de dias a semana) como patológicos (persiste por
meses).
Jain (2003 apud FERREIRA, 2006) relatam que as etapas que levam a
formação do processo de angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular, degradação da membrana basal, perda das junções entre
as células endoteliais, migração e proliferação das células endoteliais, formação de
cordões endoteliais, formação da membrana basal, maturação e remodelamento,
recrutamento das células periendoteliais (Figura 6).
Figura 6: Processo de formação de novos capilares sanguíneos por angiogênese. (BORBA, 2012).
Jain (2003 apud FERREIRA, 2006) relatam que as etapas que levam a
formação do processo de angiogênese envolvem vasodilatação e aumento da
permeabilidade vascular, degradação da membrana basal, perda das junções entre
as células endoteliais, migração e proliferação das células endoteliais, formação de
cordões endoteliais, formação da membrana basal, maturação e remodelamento,
recrutamento das células periendoteliais.
Diferentes autores descrevem que o inicio da resposta angiogênica ocorre por
um estímulo desencadeador que leva a dilatação dos vasos adjacentes ativando as
células endoteliais que iniciam a produção de novas moléculas (enzimas
proteolíticas responsáveis pela degradação da membrana basal e da matriz
extracelular). (BRITO, 2007)
Seguindo a degradação da matriz, as células endoteliais migram em torno do
tecido em resposta a quimiocinas angiogênicas, no qual os fatores de crescimento
podem contribuir para a mobilidade das células endoteliais levando a um movimento
aleatório de células (quimiocinese) ou para a migração dirigida para um fator
estimulante (quimiotaxia) (ALMEIDA, 2014)
Após a degradação da membrana basal ocorre à liberação dos fatores
angiogênicos que por sua vez, estimulam a proliferação e migração de células
endoteliais e a invasão do tecido, esse processo leva à formação do tubo capilar, a
deposição de uma nova membrana basal e a anastomose leva ao fluxo sanguíneo
(Figura 7) (BRITO, 2007; CASTRO, 2012; COSTA, 2012, ALMEIDA, 2014).
Figura 7– Etapas do processo de neovascularização. (A) Células endoteliais. (B) As células endoteliais secretam proteases que degradam a membrana basal e matriz extracelular. (C) Formação do Broto capilar pelo resultado da migração direcionada das células endoteliais. (D) Crescimento por mitose e migração celular dos vasos. (E) formação de um lúmen e nova membrana basal. (F) A Alça capilar é formada pela união de dois brotos. (G) uma segunda geração de brotos capilares começa a se formar. Modificado Brito (2007).
Conforme Zhang e colaboradores (2011) e Almeida (2014), a angiogênese
pode ser o resultado de um aumento da atividade dos fatores pró-angiogênicos ou
de uma redução da atividade dos fatores anti-angiogênicos.
1.4.1 Mediadores químicos envolvidos na angiogênese
As primeiras observações sobre as etapas envolvidas no processo de
angiogênese foram descritas por Sandison (1924) e posteriormente por Ausprunk e
Folkman (1977) indicando que os vasos neoformados ocorrem por uma série de
eventos morfológicos e bioquímicos complexos em sequências independente do
estimulo angiogênico inicial (CASTRO 2012).
Conforme Zart (2007) e Borba (2012) o processo de angiogênese ocorre pela
interação entre células, fatores de crescimento e citocinas que determinam o
surgimento de uma rede capilar a partir de um único vaso capilar. Esse processo
complexo chamado angiogênese é resultado de um balanço entre ativadores e
inibidores (Figura 8) em um equilíbrio dinâmico de concentrações estritamente
controladas, mas que pode ser rapidamente estimulado ou inibido o processo.
Figura 8 – Fatores do processo da angiogênese. Adaptado e retirado BORBA (2012).
O processo de angiogênese pode ser dividido em dois grandes subgrupos: os
fatores de crescimento e as citocinas. O fator de crescimento mais importante é uma
proteína conhecida como VEGF (fator de crescimento endotelial vascular), que atua
seletivamente nas células endoteliais para estimular a angiogênese através da
migração e proliferação das células endoteliais. Os chamados fatores de
crescimento ligam-se a receptores na superfície das células e ativam a proliferação
e/ou diferenciação celular. Dentre os fatores de crescimento mais investigados
estão: o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), o fator transformador
(TFG-beta), o fator de crescimento fibroblástico (FGF), o fator de crescimento
semelhante à insulina (IGF) e o fatores estimulantes da multiplicação de granulócitos
e monócitos (GM-CSF) (WENDT, 2005; ZHANG et al, 2011; ALMEIDA, 2014).
Entre as citocinas pode-se ressaltar as interlucina6 (IL-6) e a interlucina 8 (IL-
8), que estimulam a proliferação queratinócita. As citocinas são polipeptídeos que
induzem uma ou mais etapas do processo de angiogênese interagindo com
receptores específicos nas células endoteliais e/ou recrutando e ativando células
como os macrófagos e leucócitos, que possuem a capacidade de produzir os fatores
angiogênicos (BRITO, 2007; CASTRO, 2012; ALMEIDA, 2014).
Visto que para um novo vaso estar estável e funcional impedindo uma ruptura
ou deformações, são necessários outros componentes como a lâmina basal,
pericitos e músculo liso. As células da musculatura lisa vascular também agem na
estabilização dos vasos recém-formados, inibindo a migração de proliferação de
células endoteliais. Neste contexto a matriz extracelular é essencial para a
maturação e desenvolvimentos vascular, sendo ela responsável pelo suporte dos
vasos durante o crescimento, e por armazenar e mobilizar peptídeos, fatores de
crescimento e citocinas. E o pericitos ou células murais, participam da manutenção
do tônus vascular, maturação e a consolidação dos vasos recém formados
(ARROYO et al., 2010; DIAS, 2010) .
1.4.2 Modelos de estudo da angiogênese
Atualmente diversos estudos na área de biomateriais, biotecnologia, e
engenharia tecidual têm permitido a criação de dispositivos implantáveis com
aplicação médica e/ou farmacêutica no intuito de oferecer novas estratégias para a
restauração da estrutura e função de tecidos lesionados (CASTRO, 2012).
Existe uma variedade de modelos experimentais in vitro e in vivo para
mensurar o processo da angiogênese, onde a maioria das etapas da cascata
angiogênica pode ser monitorada (SILVA, 2012).
Diante desse fato Ferreira (2006) e Araujoet al. (2010) mostram o modelo de
implantação de esponjas subcutâneas em animais que foi descrito inicialmente por
Grindlay e Waugh(1951) e modificado por Andrade et al. (1987),no qual a
implantação de matrizes sintéticas induzem uma reação inflamatória levando a
formação do tecido de granulação rico em novos vasos sanguíneos, representando
um excelente ensaio para o estudo da angiogênese inflamatória.
Conforme Silva (2012) a matriz sintética induz um processo inflamatório, ou
seja, ocorre uma reação inflamatória tipo corpo estranho formando o tecido de
granulação rico em células inflamatórias e consequentemente a formação de novos
vasos sanguíneos, sendo a matriz esponjosa envolvida por uma cápsula fibrosa,
considerada um excelente modelo para estudo da angiogênese inflamatória.
Outra informação importante sobre a utilização do modelo de implante de
esponja auxilia na caracterização de alterações histológicas na formação do tecido
de granulação, monitorar a cinética de proliferação celular além de permitir o estudo
do infiltrado inflamatório, da angiogênese e da deposição da matriz extracelular, bem
como o efeito de drogas ou outro estímulo sobre o processo (COSTA, 2012).
Nesse contexto o presente trabalho tem como objetivo avaliar o modelo de
matriz esponjosa após 14 dias, o efeito do extrato hexânico de erva mate (Ilex
paraguariensis) no processo de neovascularização em camundongos.
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar o efeito do extrato hexânico de erva mate (Ilex paraguariensis) no
processo de neovascularização em camundongos.
2.2 Objetivos específicos
- Analisar a capacidade do extrato hexânico de erva mate em induzir a formação de
novos vasos sanguíneos em camundongos no modelo de implante de esponja;
- Avaliar a neovascularização por meio da dosagem de hemoglobina nas esponjas
na presença do extrato hexânico da erva mate.
- Avaliar a neovascularização por meio de análise histológicas das esponjas na
presença do extrato hexânico da erva mate.
- Avaliar a produção de colágeno induzido pela implantação das esponjas na
presença do extrato hexânico da erva mate.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Extrato de erva mate
A matéria-prima vegetal, composta de folhas e talos de Ilex paraguariensis
erva mate foi coletada pela mestranda, no mês de novembro de 2013 na empresa
Erva Mate Caseira, localizada na Avenida José Roberto Teixeira, 288 - CEP 79822-
090 - Dourados / MS, no qual foi separado manualmente, triturada e macerado com
hexano. Para a realização do extrato foi utilizado 1 kg aproximadamente de material
vegetal composto por folhas.
As folhas foram trituradas e colocadas no Erlenmeyer e na sequência foi
adicionado o solvente hexânico (até a cobertura de todo o material vegetal),
permanecendo em temperatura ambiente com agitação ocasional por uma semana.
Após o período pré-estabelecido de uma semana o macerado entre erva mate e o
solvente hexânico foi submetido ao processo de filtração, no qual o extrato líquido foi
filtrado em papel filtro e submetido à evaporação do solvente hexânico em
rotaevaporador à 40ºC, sendo armazenado em recipiente hermético.
3.2 Animais
Os animais utilizados foram fêmeas da linhagem C57 Black6, com idade de 6
a 8 semanas, pesando aproximadamente 20 gramas, provenientes do Biotério da
Universidade Católica Dom Bosco – UCDB – Esses animais permaneceram no
Biotério de Manutenção – Sala E 103/UCDB, com livre acesso a água e ração, e sob
o ciclo claro/escuro, até o momento dos experimentos.Todas as fases dos
experimentos e procedimentos foram realizadas de acordo com as normas
internacionais de ética em pesquisa com animais, com o protocolo número
014/2013.
No delineamento experimental, cada grupo de animais recebeu um implante
de esponja subcutânea (região cervical) embebido por 200 μL de salina e 200 μL de
extrato hexânico de erva mate em diferentes concentrações (5%, 10% e 30%),
conforme a tabela 3
Tabela 3 – Distribuição dos grupos experimentais.
GRUPOS Tratamento
Grupo 1 Salina
Grupo 2 Extrato hexânico 5%
Grupo 3 Extrato hexânico 10%
Grupo 4 Extrato hexânico 30%
n= 6 animais por grupo
A escolha para avaliação dos parâmetros bioquímicos e histológicos para o
estudo da neovascularização teve como base diferentes trabalhos anteriores que
evidenciaram importantes fenômenos de recrutamento celular e formação de tecido
fibrovascular em um período de 14 dias após o implante subcutâneo de esponja.
3.3 Técnica da implantação subcutânea de fragmentos de esponja
3.3.1 Confecção e preparo dos fragmentos de esponja
A partir das placas de poliéster-poliuretano (espuma convencional) foram
obtidos fragmentos com tamanho de 8 mm de diâmetro e 5 mm de espessura. As
esponjas foram lavadas e fervidas em água destilada por aproximadamente 30
minutos, após foram secas em temperatura ambiente e mantidas em condições
estéreis até o momento do implante (ANDRADE et al., 1987). Para o implante, as
esponjas foram colocadas individualmente em placa de 96 poços, contendo 200µl de
salina ou dos extratos nas diferentes concentrações (Figura 9).
Figura 9 – Modelo de implante de esponja.
3.3.2 Implantação das esponjas
Para o implante dos fragmentos de esponjas, os animais foram anestesiados
com solução de Cetamina (150mg/kg) e Xylazina (10mg/kg) e submetidos à
tricotomia e assepsia da região cervical. Foi realizada uma incisão 1 cm na pele, que
foi em seguida divulsionada, formando uma cavidade onde foi implantada a esponja.
A incisão foi suturada com fio de nylon 3.0. Após, os animais receberam
intraperitonealmente solução de Dipirona (10mg/kg). Após a recuperação da
anestesia, 20 animais foram colocados em caixas individuais e receberam livre
acesso a água e ração durante 14 dias.
3.3.3 Remoção dos fragmentos de esponjas
Os implantes de esponjas foram retirados no 14º dia após a cirurgia. Para
remoção dos implantes, os animais foram submetidos à eutanásia com
aprofundamento da anestesia com Cetamina e Xylazina. Os discos de esponjas
foram dissecados, removidos e pesados. Cinco fragmentos de cada grupo foram
macerados em 0,5ml de solução salina para determinação dos níveis de
hemoglobina com indicativo da neovascularização. Uma amostra de cada grupo foi
congelada em substância criopreservadora (CryoGlueSlee Medical GmbH,
Alemanha) para posterior confecção de cortes histológicos (8µm) em criostato
(SleeCriostat MEV).
3.4 Dosagem de hemoglobina
Para a avaliação do processo de neovascularização foi medida o conteúdo de
hemoglobina dos implantes (esponjas) pelo método de Drabkin, com a utilização do
Kit para determinação de Hemoglobina (Labtest, São Paulo, Brasil. ref. 47 – MS
10009010028). A concentração da hemoglobina foi determinada pela leitura
espectrofotométrica em 540nm (Unicam 5625 UV/VIS Spectrometer).
3.5 Análises Histológicas
3.5.1 Determinação de Colágeno
A determinação do colágeno nas esponjas tratadas ou não com o extrato da
Ilex paraguariensis foi realizada por meio da coloração Tricrômico de Masson,
conforme descrito por Masson em 1929 (MOLINARO, 2010).
Resumidamente, as lâminas com os cortes histológicos foram mantidas em
solução de Bouinpor 1 hora na estufa a 60ºC. A solução de Bouin consiste de uma
mistura homogênea dos componentes: Solução saturada de ácido pícrico (75 ml),
formaldeído puro (25 ml) e ácido acético glacial (5 ml). Após 1 hora as peças
cirúrgicas foram lavadas em água corrente (5 min) até retirar todo o amarelo deixado
pela solução de Bouin. Na sequência lavou-se novamente com água destilada (5
min) e as laminas foram imersas na solução de Hematoxilina Férrica de Wigert (A e
B) por 10 min. A solução Hematoxilina Férrica Wigert (A) consiste na mistura de
hematoxilina pó (1g) com álcool 95% (100 ml) e a solução Hematoxilina Férrica
Wigert (B) consiste em uma solução aquosa de Cloreto Férrico a 29% (4 ml), Água
Destilada (95 ml) e Ácido Clorídrico Concentrado (1 ml). Após a mistura homogênea
da solução Hematoxilina Férrica Wigert (A e B) as peças foram lavadas em água
corrente (5 min) e em água destilada (5 min), seguida da imersão em fucsina ácida
(Escarlate de Biebrich) (5 min). Novamente foi realizado o procedimento de lavagem
em água corrente (5 min), e em água destilada (5 min). Após as laminas foram
colocadas na solução de Ácido Fosfotúgênico 5% e Ácido Fosfomolídico a 5% (15
min). As laminas foram lavadas novamente e imersas em Azul de Anilina (5 – 10
min). Finalmente foi feita a lavagem do material em água destilada (5 min) e
posteriormente em solução aquosa de Ácido Acético Glacial 1% (3 – 5 min) seguido
de lavagem em água destilada (5 min).
Após a coloração, as amostras foram analisadas por meio de software de
análise de imagens associado a uma câmera digital e um microscópio óptico
(1000X). Em cada lâmina foram aliados 5 campos. As imagens capturadas foram
analisadas usando o software ImageJ ( Rasband , WS ,ImageJ , US
NationalInstitutes da Saúde, Bethesda,Maryland , EUA , http://imagej.nih.gov/ij/ ,
1997-2012),com plugins específicos (Color Deconvolution , GabrieleLandini e 3D
Color Inspector, Kai Uwe Barthel ).
3.5.2. Analise Histológica do Infiltrado Inflamatório e Neovascularização
A partir das esponjas, foram confeccionadas três lâminas por grupo
experimental. As lâminas foram coradas em Panótico Rápido e avaliadas em
microscópio óptico (1000X). Foram avaliados cinco campos por lâmina, com a
contagem do número de vasos e infiltrado inflamatório (neutrófilos e mononucleares)
por campo.
3.6 Análise Estatística
Os resultados estão apresentados como médias ± E.P.M (erro padrão da
média). A comparação entre os grupos foi realizada através do teste de Bonferroni.
Quando comparado os demais grupos foi usado a análise de variância (ANOVA).
Todos os dados analisados foram submetidos ao teste de normalidade. Os
resultados foram considerados significativos para p˂0,05. Para a análise estatística
foi utilizado o programa Assistat.
4 RESULTADOS
4.1 Resultados referentes do 1º ao 14º dia de implantação das esponjas.
Os implantes esponjosos nas diferentes concentrações foram bem tolerados
pelos animais, não apresentando sinais de infecção ou rejeição no local do implante
durante o período experimental de 14 dias. A matriz esponjosa tornou-se
gradualmente mais aderida aos tecidos adjacentes, à figura 10 comprova esta ação.
No exame in situ a matriz esponjosa implantada mostrou um indicativo da presença
de vasos sanguíneos nos implantes durante o período experimental estudado.
Figura 10–Matriz esponjosa, apresentando alterações vasculares visíveis ao 14º dia. (A) Salina; (B)
5% de extrato de erva mate; (C) 10% de extrato de erva mate; (D) 30% de extrato de erva mate.
4.2 Peso médio das esponjas
Ao propor o uso da matriz esponjosa como forma de avaliar a
neovascularização, foi analisado o peso úmido das esponjas, resultando na
observação de que o peso úmido dos implantes dos animais do grupo salina foi
significativamente superior quando comparado aos grupos de 5%, 10% e 30%. O
grupo com 10% de extrato hexânico de erva mate foi superior quando comparado
aos grupos de 5% e 30% com extrato hexânico de erva mate. Em uma análise
morfométrica da matriz esponjosa foi evidenciado um aumento ao longo do período
de 14 dias de implantação nos diferentes grupos analisados (Figura 11).
Figura 11–Avaliação do peso dos implantes de esponjas. O peso das esponjas foi determinado antes do implante e 14 dias após no mento da retirada. Resultados expressos em mg. *p<0,05 quando comparado aos respectivos grupos controles tratados com salina. #p<0,05 quando comparado ao grupo tratado como extrato hexanico da erva-mate 10%. (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).
4.3 Avaliação da hemoglobina
A mensuração do conteúdo de hemoglobina nos implantes proporciona um
índice bem validado de neovascularização (CASTRO, 2012). Esta característica foi
utilizada como indicativo de neovascularização na matriz esponjosa dos diferentes
grupos do experimento, no qual a dosagem do conteúdo de hemoglobina pelo
método de Drabkin é uma medida indireta da formação de vasos sanguíneos. O teor
da hemoglobina em todos os grupos avaliados apresentou um aumento considerável
(Figura 12). Os grupos com 5%, 10% e 30% de extrato hexânico de erva mate nos
implantes de esponjas apresentaram um aumento, quando comparados ao grupo
salina. Os implantes com 30% de extrato hexânico de erva mate não mostrou um
aumento significativo quando comparado aos grupos com 10% de extrato hexânico
de erva mate.
Figura 12 – Determinação dos níveis de hemoglobina como indicativo da neovascularização nos implantes de esponja em camundongos. A neovascularização foi avaliada através da concentração de hemoglobina nos implantes após 14 dias. Os resultados estão expressos em Absorbância em 540nm. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado com salina. (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).
4.4 Avaliação histológica dos discos de esponja
4.4.1 Avaliação do Infiltrado Inflamatório e Neovascularização
Através da análise do infiltrado inflamatório, após a coloração por
Hematoxilina-Eosina (HE), presente no tecido fibrovascular dos implantes, foi
observada a presença das células inflamatórias (Figura 13), dos quais o grupo salina
apresentou uma menor concentração do número de células inflamatórias quando
comparada aos grupos com concentrações com 10% e 30% de extrato hexânico de
erva mate. Ao comparar o grupo de 5% de extrato hexânico de erva mate pode-se
verificar uma menor concentração de células inflamatórias evidenciando uma
diferença significativa quando comparado ao grupo com 30% de extrato hexânico de
erva mate, o que mostra uma maior quantidade de infiltrados inflamatórios (Figura
14).
Figura 13 – Avaliação do Infiltrado Inflamatório nos implantes de esponjas em camundongos. O infiltrado inflamatório foi avaliado em cortes histológicos feitos a partir dos implantes de esponjas retirados no 14ºdia. Foram avaliados 3 cortes por grupo e 6 sessões por corte ( 1000X; HE). Os resultados estão expressos como número de células. *p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado com salina. #p<0,05 quando comparado ao grupo controle tratado como extrato 30% (ANOVA seguida de pós teste de Bonferroni; media ± EPM).
Figura 14 – Avaliação histológica do Infiltrado Inflamatório nos implantes de esponjas em camundongos. Aumento 400X (coloração HE). Microscópio Zeiss Axiovert. O estroma fibrovascular no grupo salina e nos grupos com concentrações diferentes de extrato hexânico de erva mate (5%, 10% e 30%) evidenciam a presença de células no meio do tecido conjuntivo frouxo da matriz extracelular. O grupo com 30% de extrato hexânico de erva mate, mostrou uma maior quantidade de células no período de 14 dias com a matriz esponjosa.
4.4.2 Avaliação do colágeno
Com o método do Tricômico de Masson, o citoplasma, queratina e fibras
intercelulares apresentaram coloração vermelha, enquanto os núcleos foram
corados em preto. Fibras colágenas e muco foram evidenciados pela coloração azul.
Similar ao observado nas análises da neovascularização e infiltrado inflamatório, a
presença de colágeno nas esponjas tratadas com o extrato de erva mate nas
concentrações de 10 e 30% foi maior em relação ao grupo tratado com salina, como
está demonstrado no histograma de análises de cores referentes a cada grupo, no
qual se observa aumento na área (cor azul) representativa das fibras de colágeno
nos cortes histológicos (Figura 15).
Figura 15 – Avaliação histológica da presença de colágeno nos implantes de esponjas em camundongos. Aumento 400X (coloração Tricômico de Masson). Microscópio Zeiss Axiovert. Os histogramas representam a intensidade de cores referentes à presença de células (vermelho) e colágeno (azul).
5 DISCUSSÃO
Dentro da pesquisa científica, diferentes estudos utilizando extratos vegetais
vêm sendo realizados, o que comprova a relevância dessa análise, uma vez que o
efeito do extrato de erva mate usado para auxiliar na formação de novos vasos não
foi totalmente especificada, o que aponta para uma oportunidade de investigação
acadêmica.
O estudo apresentado mostra o desenvolvimento do processo de
neovascularização induzido por esponja de poliéster-poliuretano em camundongos
fêmeas da linhagem C57 Black 6, sendo um modelo frequentemente utilizado em
investigações in vivo a partir de diferentes parâmetros.
Considerando que grandes partes dos estudos biológicos realizados com a
Ilex paraguariensis, mostram os principais compostos fitoquímicos encontrados
nesse vegetal, procurou-se investigar os efeitos do extrato hexânico de erva mate na
formação de novos vasos sanguíneos.
Tem sido relatado na literatura que as propriedades estimulantes da erva
mate estão relacionadas à presença de metilxantinas, destacando a cafeína e a
teobromina que atualmente é considerada o estimulante mais utilizado em
alimentos, bebidas e medicamentos.
Os efeitos relacionados as metilxantinas são descritos como estimulantes do
sistema nervoso central e cardiorrespiratório, analgésico, relaxante da musculatura
lisa (CUNHA, 2011; GOMES, 2012; COLPO, 2012). Esta relação pode ser alterada
dependendo da forma de cultivo e da época na qual a folha será colhida, sendo esta,
uma abordagem para estudos complementares. Sob esta ótica, a cafeína apresenta
ação no sistema nervoso central aumentando as funções psíquicas melhorando a
atividade mental, acelerando o metabolismo basal e consumo de oxigênio pelos
tecidos, estimulando a termogênese e a oxidação de gordura (GOMES, 2012).
Em relação aos compostos fenólicos da erva mate, podemos destacar a
capacidade para realizar atividade antioxidante pelo sequestro de radicais livres,
dentre eles, os derivados do óxido nítrico, o que pode acelerar a cicatrização de
feridas cutâneas (MOURA, 2009).
Diferentes efeitos benéficos da erva mate têm sido identificados na
comunidade científica, proteção contra o dano no DNA (MIRANDA et al., 2008),
atividade vasodilatadora (SOUZA, 2009), efeito termogênico (GOMES, 2012).
Quanto à ingestão da infusão da erva mate é possível destacar uma
importante fonte de minerais essenciais e vitaminas (CARMO, 2007). Na medicina
popular a Ilex paraguariensis tem sido utilizada no combate à fadiga, digestão e
doenças hepáticas (BARLETTE, 2011).
Embora os efeitos da Ilex paraguariensis já tenham sido avaliados em
diferentes estudos, não encontramos na literatura qualquer trabalho que investigou
os componentes (recrutamento celular, neovascularização e deposição de matriz
extracelular) da angiogênese inflamatória.
No entanto, já está bem descrito na literatura que o uso de matriz esponjosa
de poliéster-poliuretano, é capaz de induzir uma resposta inflamatória de forma local
ou temporal. O modelo de implante permite analisar uma gama de mediadores
químicos da inflamação, fatores de crescimento, além do perfil e a dinâmica da
migração celular e o reparo tecidual na matriz esponjosa (ANDRADE et al, 1987;
COSTA, 2012).
A primeira etapa da abordagem experimental utilizada neste estudo consistiu
na avaliação da capacidade do extrato hexânico de erva mate na formação de novos
vasos, induzidos pela implantação da matriz esponjosa. O resultado mostrou um
crescimento fibrovascular localizado, permitindo visualizar a presença de achados
vasculares após o 14º dia de implantação. Um dos aspectos possíveis para que
ocorresse a neovascularização pode estar associado à reação inflamatória local em
decorrência do processo cirúrgico para a implantação ou, ainda, pela presença da
matriz esponjosa durante o período do experimento.
Nos grupos de animais que receberam concentrações de 5%, 10% e 30% do
extrato hexânico de erva mate e no grupo salina, foi evidenciada a presença de
vasos sanguíneos após o período de 14 dias da implantação das matrizes
esponjosas. Os resultados obtidos, são consistentes com o pensamento que, ao
fazer uso de matriz esponjosa de poliéster-poliuretano, podemos induzir uma
resposta inflamatória, uma vez que no período estipulado já existem alterações
histomorfológicas suficientes para serem observadas e analisadas.
Os poros da matriz esponjosa implantadas foram ocupados por tecido
fibrovascular novo preenchendo os implantes do grupo salina e daqueles com
diferentes concentrações de extrato hexânico de erva mate. O peso úmido dos
implantes mostrou diferença em relação aos grupos, entretanto, o grupo salina
apresentou um aumento no peso após os 14 dias de implantação o que leva ao
pensamento que os grupos com variadas concentrações de extrato hexânico de erva
mate estavam mais leves. Outro achado importante foi que o grupo com 10% de
extrato hexânico de erva mate apresentou um aumento do peso em relação aos
grupos com 5% e 30% do extrato hexânico de erva mate.
As evidências são consideráveis ao se tratar do processo de angiogênese em
condições fisiológicas e patológicas (CASTRO, 2012; COSTA, 2012). Vários estudos
investigaram a resposta inflamatória do hospedeiro, a reação ao corpo estranho e a
neovascularização de materiais implantados em vários tecidos animais (CASTRO,
2012), porém, estudos comparativos desse processo fazendo o uso do extrato
hexânico de erva mate em diferentes concentrações não foram discutidos ainda na
literatura.
Através de eventos celulares, o processo de angiogênese é controlado pela
interação entre os inibidores e ativadores que formam um equilíbrio apropriado
iniciando e mantendo esse processo. Destacam-se nesse processo as citocinas,
incluindo os fatores de crescimento e as quimiocinas (importantes marcadores
inflamatórios), capazes de regular diretamente o recrutamento e ativação de células
endoteliais (BRITO, 2007). Considerando o uso de extrato hexânico de erva mate
como um estímulo angiogênico, mostrou um efeito no processo de
neovascularização, provocando a migração de células inflamatórias.
Ferrara (2000) e Lima (2012) descreveram que o VEGF é uma citocina
importante, envolvida na angiogênese, no qual é produzida por células endoteliais,
fibroblastos, células musculares lisas e pela maioria das células inflamatórias
(macrófagos, linfócitos, neutrófilos e eosinófilos).
Para verificar a resposta angiogênica da aplicação extrato hexânico de erva
matena matriz esponjosa, outro método foi utilizado, a quantificação do teor de
hemoglobina contida em cada implante. Os resultados mostraram que as matrizes
esponjosas apresentaram um aumento considerável em todos os grupos estudados,
sendo um indicativo para o aumento da neovascularização.
Podemos ressaltar que a vasodilatação ocorre em condições inflamatórias
que resulta em um aumento do fluxo sanguíneo que, por sua vez, leva à formação
de novos vasos (CASTRO, 2012), assim, os resultados evidenciados confirmam um
aumento da quantidade de sangue local realizado pela dosagem de hemoglobina na
matriz esponjosa.
Ao analisar o grupo com concentração de 30% de extrato hexânico de erva
mate, o conteúdo de hemoglobina foi diferenciado quando comparado ao grupo
salina. Em relação ao grupo com concentração de 5% de extrato hexânico de erva
mate o conteúdo de hemoglobina foi significativamente menor quando comparado
ao grupo com 10% de extrato hexânico de erva mate.
Os resultados evidenciaram uma diferença estatística na quantidade de
infiltrados inflamatórios presente nas esponjas com tecido fibrovascular formado.
Entre os grupos salina e os grupos que receberam as diferentes concentrações do
extrato hexânico de erva mate a indicação da ação de células inflamatórias foi
confirmada pela presença do número de células, a qual foi predominante no grupo
com 30% de extrato hexânico de erva mate.
O estudo possibilitou verificar a indução de uma reação inflamatória, através
de um corpo estranho e, consequentemente, verificou-se a presença de um tecido
de granulação composto por novos vasos sanguíneos e o aumento das células
inflamatórias. Portanto, destacamos um bom achado para o estudo da angiogênese
inflamatória (ANDRADE et al.,1987).
A deposição de colágeno está ligada ao reparo do tecido lesionado, estudos
demonstram que as fibras da área cicatricial são chamadas de colágeno tipo I e
colágeno tipo II. (MOURA, 2009). A análise da deposição de colágeno foi avaliada
pelo método histológico do Tricrômico de Masson, evidenciando a presença
aumentada da deposição de colágeno no período de experimento. Esse método
proporciona visualizar e analisar quantitativamente as fibras colágenas do tecido
conjuntivo conferindo a coloração azul a todas (PASINI, et al., 2014).
Diante desses resultados, podemos sugerir que o extrato de erva mate
influenciou em uma série de eventos biológicos, bioquímicos e histológicos, nos
quais o modelo experimental de matriz esponjosa com extrato hexânico de erva
mate induziu à formação de tecido fibrovascular e, consequentemente, levou ao
processo de neovascularização. Durante o trabalho, foi avaliado o efeito do extrato
hexânico de erva mate no processo da angiogênese inflamatória, evidenciando um
efeito positivo no processo de neovascularização.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
O modelo de matriz esponjosa se mostrou eficaz na avaliação do processo de
neovascularização na linhagem de camundongo utilizada, uma vez que induziu a
formação de tecido fibrovascular proliferativo e permitiu a determinação da cinética
da formação de novos vasos.
Neste estudo procurou-se mostrar uma combinação de metodologias para
avaliar a formação de novos vasos induzida por uma matriz esponjosa com extrato
de erva mate em diferentes concentrações.
Os resultados deste estudo evidenciam os efeitos positivos da Ilex
paraguariensis no processo de angiogênese inflamatória induzida por matriz
esponjosa o que permitiu avaliar as presenças de neovascularização e de infiltrados
inflamatórios nos diferentes grupos estudados.
Os achados no teor de hemoglobina e na avaliação histológica confirmam que
o extrato hexânico de erva mate contribuiu para o processo de neovascularização
nos quatros grupos usados no experimento.
Podemos sugerir que a Ilex paraguariensis mostrou um efeito interessante
sobre a angiogênese em concentração de 30% de extrato hexânico de erva mate,
propondo um novo modelo experimental para a avaliação do processo de
neovascularização induzida por matriz esponjosa.
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