BRUNO DE OLIVEIRA HOLANDA CAVALCANTE
FUNÇÕES DOS RNAs DE CADEIA CURTA COM ÊNFASE NA
REPRODUÇÃO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária da Universidade de Brasília para
obtenção do grau de Médico Veterinário.
BRASÍLIA
DEZEMBRO/2014
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
BRUNO DE OLIVEIRA HOLANDA CAVALCANTE
FUNÇÕES DOS RNAs DE CADEIA CURTA COM ÊNFASE NA REPRODUÇÃO
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária da Universidade de Brasília para
obtenção do grau de Médico Veterinário.
Orientador: Prof. Dr. Ivo Pivato
BRASÍLIA
DEZEMBRO/2014
UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
FACULDADE DE AGRONOMIA E MEDICINA VETERINÁRIA
Cessão de direitos
Nome do Autor: Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante
Título da Monografia de Conclusão de Curso:
Ano: 2014.
Cessão de Direitos
Nome do Autor: Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante
Título da Monografia de Conclusão de Curso: Funções dos RNAs de cadeia
curta com ênfase na reprodução
Ano: 2014
É concedida a Universidade de Brasília permissão para reproduzir cópias desta
monografia e para emprestar ou vender tais cópias somente para propósitos
acadêmicos e científicos. O autor reserva-se a outros direitos de publicação e
nenhuma parte desta monografia pode ser reproduzida sem a autorização por
escrito do autor.
Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante
CAVALCANTE, Bruno de Oliveira Holanda
Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução /
Bruno de Oliveira Holanda Cavalcante; Orientação de Ivo Pivato - Brasília,
2014.
29p.: il.
Monografia – Universidade de Brasília/Faculdade de Agronomia e Medicina
Veterinária, 2014.
1. Espermatozoide 2. Função 3. Macho 4. microRNA I. PIVATO, I. II.
Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução
Agradecimentos
Antes de tudo agradeço a Deus, pela vida, pela inteligência e por tudo que
ele me proporciona em todos os dias da minha vida.
Aos meus pais, que confiaram em mim e torceram para que eu
alcançasse meus sonhos. Agradeço por tudo que fizeram ou deixaram de fazer
para que eu pudesse estar hoje onde estou.
Aos meus amigos, obrigado por me ouvirem e me darem em horas
específicas a força sem a qual eu não seria capaz de terminar essa importante
etapa da minha vida.
Agradeço as EMBRAPA CTZL e CENARGEN por terem me dado a
oportunidade única de fazer coisas que até então não foram possíveis durante a
graduação, uma mistura de teoria e pratica que eu levarei para sempre comigo e
com certeza farão de mim um profissional mais qualificado.
A todos meus professores, em especial a professora Márcia de Aguiar
Ferreira, obrigado por me ouvir e por compartilhar suas experiências e
conhecimentos sem os quais eu não seria a pessoa que sou hoje. Tenha certeza
que vou levar sempre comigo tudo que me foi ensinado.
Ao meu orientador, Professor Ivo Pivato, obrigado pela oportunidade, pelo
aprendizado, dedicação, confiança e pela ajuda em tudo que foi preciso.
Por ultimo, porém não menos importante quero agradecer a todos os
animais. Pequenos, grandes, de estimação e produção todos foram, são e serão
fundamentais em nossos estudos, pesquisas e descobertas. Companheiros e
amigos, eles são os responsáveis pela realização deste sonho. Muitas vezes
doaram suas vidas para que pudéssemos aprender mais a cada dia, desde as
aulas de anatomia, cirurgia até as de reprodução, sem eles a profissão de
veterinário não existiria e a vida seria triste.
“No fim tudo dá certo, e se não deu certo
é porque ainda não chegou ao fim.”
(Fernando Sabino)
LISTA DE ABREVIAÇÕES, ABREVIATURAS E SIGLAS
1. 3' UTR - região não traduzida 3’
2. ATP - adenosina trifosfato
3. C. elegans - Caenorhabditis elegans
4. DNA - ácido desoxirribonucleico
5. miRISC - complexo de silenciamento mediado por miRNA
6. miRNAs - microRNAs
7. mRNAs - RNAs mensageiros
8. primiRNA - miRNA primordial
9. RNAse - Ribonuclease
10. stRNA - pequenos RNAs temporais
11. ZP - Zona Pelúcida
12. CTZL- Centro de Transferência de Tecnologias em Raças Zebuínas com
Aptidão Leiteira
13. Embrapa - Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
14. IATF - Inseminação artificial em tempo fixo
15. OPU - “Ovum pick-up” - Aspiração Folicular
16. PIV - Produção in vitro
17. TE – Transferência de embrião
18. TETF – Transferência de embrião em tempo fixo
19. TN - Transferência Nuclear
20. TNCS - Transferência Nuclear de Células Somáticas
21. SOV – Superovulação
RESUMO
CAVALCANTE, B. O. H. Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na
reprodução. Small-chain RNAs Functions with emphasis on reproduction. 2014.
29 p. Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária - Faculdade de
Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília, Brasília, DF.
A presença de microRNAs em espermatozoides levantou diversos
questionamentos a respeito da contribuição destes para o desenvolvimento
embrionário. O espermatozoide, considerado até então apenas como um
transportador do genoma do macho, começou a ser estudado visando descobrir
se esses pequenos RNAs presentes e com funções diversas em outros seres
vivos possuiria atributos diferentes. Ainda existem muitas dúvidas quanto às
funções dos microRNAs presentes nos espermatozoides. Descobertas recentes
apontam que essas moléculas têm alguma função no início do desenvolvimento
embrionário, como no crescimento e na diferenciação celular ou ainda que
possam indicar a qualidade da espermatogênese. Embora envolvidos na
mediação da herança epigenética em camundongos, os seus papéis na
fertilização e no desenvolvimento embrionário inicial permanecem
desconhecidos, mais estudos são necessários para defini-los.
Palavras-chave: espermatozoide, função, macho, microRNA.
ABSTRACT
CAVALCANTE, B. O. H. Smalk-chain RNAs Functions, with emphasis on
reproduction. Funções dos RNAs de cadeia curta com ênfase na reprodução.
2014. 29 p. Monografia de conclusão do Curso de Medicina Veterinária -
Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária da Universidade de Brasília,
Brasília, DF.
The presence of microRNAs in sperm brought several questions regarding their
contribution to embryonic development. The spermatozoon until then considered
only as a carrier of the male genome began to be studied to find out if this small
RNA present with diverse functions in living beings would possess other
attributes. There are still many questions about the roles of microRNAs in
spermatozoa. Findings indicate that these molecules have some function in early
embryonic development, such as cell growth and differentiation or that may
indicate the quality of spermatogenesis. Although involved in mediating
epigenetic inheritance in mice, their roles in fertilization and early embryo
development remain unknown, further studies are needed to define them.
Keywords: spermatozoon, function, male, microRNA.
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................ 11
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ........................................................................... 12
2.1. CONCEITOS ............................................................................................. 12
2.1.1. Transcrição ..................................................................................... 12
2.1.2. RNA-polimerase eucarióticas ......................................................... 13
2.1.3. Tradução ......................................................................................... 13
2.2. HISTÓRICO .............................................................................................. 13
2.3. miRNA ....................................................................................................... 14
2.4. FUNÇÕES ................................................................................................. 17
2.5. RNAs EM ESPERMATOZOIDES .............................................................. 18
2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ...................................................................... 19
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ............................................................... 20
4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO ............................................................................ 25
4.1. INTRODUÇÃO .......................................................................................... 25
4.2. INDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO ............................................................. 26
4.3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS ............................................................. 26
4.4. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE O ESTÁGIO ................................... 29
11
1. INTRODUÇÃO
O estudo dos microRNAs (miRNA) é bastante novo e pouco se sabe
sobre suas funções especificas. Muito se supõe sobre essas funções uma vez
que se sabe em quais locais eles se encontram. A partir desses conhecimentos
algumas hipóteses são lançadas.
Hoje são conhecidos centenas de miRNAs, mas poucos têm suas
funções específicas descritas na literatura.
Sobre o miRNA sabe-se: como ele se forma, iniciando no núcleo celular
e terminando no silenciamento dos RNAs mensageiros (mRNA) de seus genes
alvo, e como ele atua, silenciando, degradando ou deadenilando o mRNA de
seu gene alvo fazendo com que esse mRNA não codifique a proteína que
deveria codificar.
Sabe-se também que ele age de alguma forma nos processos
biológicos, incluindo o controle do ciclo celular, crescimento e diferenciação
celular, apoptose, desenvolvimento do embrião entre outros. Por esse motivo
supõe-se que eles tenham função no controle desses eventos-chave do
desenvolvimento.
Segundo previsões matemáticas muitos genes humanos são possíveis
alvos da ação desses miRNAs.
Essa revisão visa descrever a importâncias dos miRNAs presentes nos
espermatozoides e sua possível função na fecundação e no desenvolvimento
embrionário.
12
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Os espermatozoides se formam devido a um processo chamado de
espermatogênese no qual as células germinativas sofrem divisões celulares
contínuas e modificações de desenvolvimento. O processo se inicia na periferia
e segue em direção à luz do túbulo seminífero. Os espermatozoides atuam de
forma imprescindível na fecundação, atuam na camada do cumulus,
principalmente pela ação da hialuronidase; na zona pelúcida (ZP), onde o
conteúdo acrossômico é liberado, e na membrana plasmática do ovócito,
começando com a ligação à membrana do ovócito e concluindo com a fusão
entre a membrana do espermatozoide e a do ovócito (EVANS, 2002). Para que
isto ocorra, o espermatozoide fecundante precisa sofrer a capacitação
espermática um processo complexo no qual vai ocorrer a desestabilização da
bicamada fosfolipídica causada por mudança ou remoção de componentes,
sem essas modificações ele é incapaz de fecundar o ovócito (HAFEZ E
HAFEZ, 2004). Durante a fertilização, o espermatozoide contribui mais do que
com apenas o genoma paterno para o zigoto resultante. Os espermatozoides
contribuem com fatores solúveis os quais ativam o ovócito, promovem o
recomeço da meiose além de promover a formação dos pronúcleos
(SAUNDERS et al., 2002). Os espermatozoides contribuem também com
centríolos (SIMERLY et al., 1995) e com ácidos ribonucleicos (RNAs), incluindo
RNAs mensageiros (mRNAs) e microRNAs (miRNAs) (OSTERMEIER et al.,
2004).
2.1. CONCEITOS
2.1.1. Transcrição
Os RNAs de todos os tipos são transcritos de um filamento-molde de
DNA, catalisados por diversas enzimas referidas como RNA-polimerases. A
sequência de nucleotídeos do RNA é complementar à do filamento molde de
DNA, exceto ao substituir timina por uracila. Promotores são regiões de
reconhecimento e interação entre a RNA-polimerase e o DNA que sinaliza o
13
começo da transcrição. Essa síntese de um RNA complementar a partir de um
DNA que é denominada transcrição (DE ROBERTIS; HIB, 2006).
2.1.2. RNA-polimerase
Três tipos de RNA-polimerases diferentes são produzidos por
organismos eucariotas. RNA-polimerase I, localizada no nucléolo, sintetiza
apenas RNA-ribossômico. A polimerase II é encontrada no nucleoplasma e
sintetiza RNA pré-mensageiro. A polimerase III, localizada no nucleoplasma,
sintetiza RNA de transferência. A função básica do RNA é o transporte de
mensagem do DNA para o citoplasma, onde serão sintetizadas as cadeias
polipeptídicas (DE ROBERTIS; HIB, 2006).
2.1.3. Tradução
A tradução é o processo de síntese ou fabricação de proteínas
(construção da cadeia de aminoácidos). Para a fabricação das proteínas é
necessário que os ribossomos decodifiquem a mensagem contida na molécula
de mRNA (RNA mensageiro) para uma cadeia de aminoácidos. A
decodificação está baseada em trincas de nucleotídeos (códons), que são
usados para especificar o aminoácido. A correspondência entre uma trinca de
nucleotídeos e um aminoácido é chamada de código genético (DE ROBERTIS;
HIB, 2006).
2.2. HISTÓRICO
O estudo dos microRNAs datam de 1993. O primeiro miRNA foi
descoberto por Victor Ambros, Rosalind Lee e Rhonda Feinbaum durante um
estudo do gene lin-4, que era conhecido por controlar o tempo do
desenvolvimento larval de Caenorhabditis elegans (C. elegans) reprimindo o
gene lin-14. Quando isolaram o gene lin-4, eles descobriram que, em vez de
produzir um mRNA que codifica uma proteína, produzia RNAs não-codificantes
de cadeias curtas, um dos quais era um RNA com 22 nucleotídeos que
14
continham sequências parcialmente complementares à várias sequências da
região não traduzida 3’ (3' UTR) do mRNA do gene lin-14. Sugeriram que essa
complementaridade inibia a tradução do mRNA de lin-14 na proteína LIN-14.
Na época, pensaram que o pequeno RNA do lin-4 seria uma idiossincrasia do
nematóide (LEE et al., 1993).
Somente em 2000, um segundo pequeno RNA foi caracterizado: RNA
let-7, que reprime lin-41 para promover uma transição mais lenta no
desenvolvimento de C. elegans. Logo foi encontrado que o RNA let-7 se
conservava em muitas espécies, levando à sugestão de que o RNA let-7 e
"pequenos RNAs temporais (stRNA)" adicionais poderiam regular o tempo de
desenvolvimento em diversos animais, incluindo seres humanos (REINHART et
al., 2000).
Um ano mais tarde, os RNAs lin-4 e let-7 foram encontrados fazendo
parte de uma grande classe de pequenos RNAs presentes em C. elegans,
Drosophila e células humanas (LAGOS-QUINTANA et al., 2001).
Os muitos RNAs recém-descobertos dessa classe se assemelhavam a
lin-4 e let-7, porém seus padrões de expressão eram geralmente incompatíveis
com um papel na regulação do tempo de desenvolvimento, o que sugere que a
maioria atuaria em outros tipos de vias regulatórias. Neste ponto, os
pesquisadores começaram a usar o termo "microRNA" para se referir a esta
classe de pequenos RNAs regulatórios (LAU et al., 2001).
Pesquisas mais recentes demonstraram que a expressão do miRNA
miR-181 em células progenitoras hematopoiéticas leva a um aumento na
diferenciação linfoide (linhagem B) (CHEN et al., 2004) e que o miRNA
muscular específico miR-133 é fundamental durante a diferenciação dos
mioblastos (BOUTZ, 2007).
2.3. miRNA
Os miRNAs são RNAs de cadeia curta não codificante de 19-24
nucleotídeos encontrados em plantas, animais, e alguns vírus. São conhecidos
por regular os genes nas suas regiões não traduzidas 3' (UTRs 3') de uma
forma imperfeita e são codificados pelo DNA nuclear. O crescente
conhecimento sobre os mecanismos dos miRNAs e sua participação em muitos
15
processos de regulação pós-transcricional (interferindo com a tradução do
mRNA ao silenciar o gene) os torna candidatos interessantes para o controle
de transcritos maternos no embrião inicial (AMBROS, 2004; BORCHERTET et
al., 2006; STEITZ, 2009; JIANG et al., 2009).
A primeira estrutura expressa é um miRNA primordial (primiRNA),
transcrito no núcleo e clivado pelo complexo microprocessador, um arranjo de
enzimas tipo ribonuclease (RNase) III, Drosha-DGCR8 e Dicer. O precursor
miRNA (pré-miRNA) produzido por esta clivagem é uma molécula de cadeia
dupla em forma de grampo de cabelo, que é exportado para o citoplasma. O
pré-miRNA é adicionalmente clivado pela Dicer, para que o miRNA de cadeia
dupla bidirecional (Figura 1) perca uma parte da fita (5’) que é descartada e a
cadeia restante (3’) é o miRNA maduro, ele será integrado no complexo de
silenciamento mediado pelo miRNA (miRISC) e induzido pelo RNA a atuar
como um modelo para reconhecimento do mRNA alvo e regular a sua
expressão. Juntamente com miRISC, os miRNAs direcionam a tradução direta
ou promovem o processo de deadenilação dos mRNAs (Figura 1)
(FILIPOWICZ et al., 2008).
Na última década, centenas de miRNAs foram identificados em células
de mamíferos. 30% dos genes humanos estão previstos matematicamente
para serem alvos dos miRNA (LEWIS et al., 2005). As evidências sugerem que
os miRNAs desempenham papéis críticos em vários processos biológicos,
incluindo o controle do ciclo celular, crescimento e diferenciação celular, a
apoptose, o desenvolvimento do embrião e assim por diante (JIANG et al.,
2009).
Embora envolvidos na mediação da herança epigenética em
camundongos, os seus papéis na fertilização e/ou no desenvolvimento
embrionário inicial, permanecem desconhecidos (RASSOULZADEGAN et al.,
2006).
Estudos em peixes-zebra têm mostrado forte expressão de miRNAs
durante e após a segmentação embrionária e a maioria destes miRNAs
mostram uma delicada especificidade por certos tecidos (WIENHOLDS et al.,
2005).
Outros estudos sugerem um papel para os miRNAs na organogênese
em ratos (JOGLEKAR et al., 2007; WILLIAMS et al., 2007; YI et al., 2009).
16
Figura 1 - Ilustração demonstrando o mecanismo de transcrição processamento e ação regulatória dos microRNAs (SRIVASTAVA, 2009).
17
2.4. FUNÇÕES
Desde a descoberta de miRNAs em vertebrados tornou-se claro que
esta família de RNAs é essencial para o desenvolvimento do organismo
vertebrado (HARFE, 2005).
Evidências acumuladas demonstram que os miRNAs são fundamentais
no controle de eventos-chave do desenvolvimento; no entanto, o papel
especifico dos miRNA no desenvolvimento de partes específicas do organismo
é controversa (YANG et al., 2008).
As alterações dinâmicas na expressão de miRNAs em embriões em fase
inicial pré-implantação e o aumento da síntese de miRNAs após o estágio de
duas células em embriões de camundongo sugerem que miRNAs têm um
papel funcional nesse período pré-implantação (TANG et al., 2007;
VISWANATHAN et al., 2009).
Esta evidência é sustentada pelas observações de ovócitos de
camundongos sem a presença da enzima Dicer. Eles têm uma quantidade
mínima de miRNA e seus zigotos resultantes não passam do primeiro estágio
da clivagem. Os embriões sem a enzima Dicer paterna transportando apenas a
Dicer materna morrem no dia 7,5 do desenvolvimento (BERNSTEIN et al.,
2003).
As células tronco embrionárias expressam relativamente poucos
miRNAs, um conjunto de miRNAs específicos de células tronco embrionárias
que são reprimidos após a formação do corpo embrionário também tem sido
descrito. A noção de que estas alterações de expressão de miRNA são
funcionalmente importantes é suportada pela observação de que a inativação
genética da via de biogênese de miRNA quase anula a capacidade das células
tronco embrionárias de se diferenciar adequadamente. Portanto, a regulação
positiva de miRNAs na diferenciação provavelmente é essencial para o
silenciamento da maquinaria de auto-renovação das células tronco
embrionárias e/ou o estabelecimento de programas de transcrição de linhagens
específicas (VISWANATHAN et al., 2009).
18
2.5. RNAs EM ESPERMATOZOIDES
Existem hipóteses de que o RNA dos espermatozoides pode ter função
nos eventos pós-fecundação. O espermatozoide fecundante leva mRNA para o
ovócito e que esse RNA permanece intacto por pelo menos até três horas após
a fecundação (OSTERMEIER et al., 2004). Alguns mRNAs detectados na
célula espermática e no zigoto estão ausentes nos ovócitos não fecundados.
Portanto, os RNAs do espermatozoide que são levados para o ovócito podem
estar envolvidos no desenvolvimento embrionário inicial (MILLER, 2007).
O papel exato dos RNAs do espermatozoide permanece desconhecido.
Acredita-se que possa estar relacionado com a regulação da expressão de
genes do início do desenvolvimento embrionário, epigenética e a condensação
da cromatina do espermatozoide. Sabe-se que indivíduos de alta e baixa
fertilidade possuem tipos e quantidade de transcritos diferentes, sugerindo que
a presença desses transcritos possa no futuro ser utilizada para avaliar o
potencial de fertilidade de uma amostra de sêmen (LALANCETTE et al., 2008).
Mais recentemente, foi comprovado que os espermatozoides de bovinos
também apresentam uma grande quantidade de miRNAs e que há maior
concentração desses transcritos em touros de baixa fertilidade, quando
comparados com touros de alta fertilidade, no entanto, apenas alguns (sete)
miRNAs foram significativamente expressos diferenciadamente, sugerindo que
os miRNAs influenciam a fertilidade. Porém, entre os sete miRNAs
identificados, não havia nenhum com anotações publicadas. Portanto, no
presente momento, as suas funções são desconhecidas (GOVINDARAJU et
al., 2012).
Os maiores níveis de expressão dos miRNAs em touros de baixa
fertilidade pode significar que miRNAs podem atuar inativando a regulação da
expressão de genes cujos produtos desempenham papéis importantes na
fecundação e desenvolvimento embrionário inicial. Um exemplo, recentemente
descoberto desse fato, são os miRNAs espermáticos envolvidos na primeira
clivagem em camundongos (LIU et al., 2012).
19
2.6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
Pouco se sabe sobre a função dos miRNAs, por ser um assunto muito
novo a literatura é escassa quanto a suas funções especificas, supõe-se muitas
funções para eles devido a sua presença em certos locais e ausência em
outros. Sua presença em grande quantidade é provavelmente um empecilho à
fertilidade, ao desenvolvimento embrionário e ao controle da expressão gênica.
Mais estudos são necessários para que realmente se compreendam as
funções exercidas por esse componente tão especializado. A descoberta da
função dos miRNAs do espermatozoide no desenvolvimento embrionário inicial
poderá tornar a sua presença e quantidade um potencial indicador de
fertilidade, tanto em animais quanto em humanos.
20
3. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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25
4. RELATÓRIO DE ESTÁGIO
4.1. INTRODUÇÃO
O estágio de caráter obrigatório para conclusão do curso de Medicina
Veterinária na Universidade de Brasília (UnB) foi realizado em duas etapas
sendo a primeira realizada no Centro de Transferência de Tecnologias de
Raças Zebuínas com Aptidão Leiteira (CTZL) no período de 1 de setembro a
23 de outubro e a segunda na Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
(CENARGEN) com início em 27 de outubro e término em 9 de dezembro de
2014.
A criação do CTZL, localizado no Núcleo Rural Ponte Alta, no Gama
(DF), teve iniciativa conjunta das Unidades Cerrados (Planaltina – DF), Gado
de Leite (Juiz de Fora – MG) e Recursos Genéticos e Biotecnologia (Brasília –
DF). Recebeu apoio do Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento,
Ministério do Desenvolvimento Agrário, Ministério da Ciência e Tecnologia,
Emater-DF, CNPq, Associação Brasileira dos Criadores de Zebu (ABCZ) e
Associações de Criadores de Raças Zebuínas Leiteiras (Gir, Guzerá, Indubrasil
e Sindi).
Melhorar a qualidade do rebanho brasileiro, criar um selo de qualidade
para identificar germoplasma zebuíno trabalhado e oferecer treinamento a
agricultores, extensionistas e estudantes são alguns dos objetivos que
justificam a criação do CTZL.
Em 1974, a Embrapa criou o Centro Nacional de Recursos Genéticos
(CENARGEN) e atualmente seu nome é Embrapa Recursos Genéticos e
Biotecnologia. Devido ao estímulo das Nações Unidas em estabelecer uma
rede mundial de Centros para Conservação de Recursos Genéticos, em
regiões consideradas de alta variabilidade genética.
A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tem atuado fortemente
no intercâmbio e quarentena de germoplasma vegetal e animal, garantindo a
continuidade dos programas de melhoramento genético da Embrapa.
A Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia tem, ao longo dos anos,
atuado no cenário nacional e internacional de forma a "Viabilizar soluções de
26
pesquisa, desenvolvimento e inovação em recursos genéticos para a
sustentabilidade da agropecuária brasileira", o que se tornou a sua missão.
A área de reprodução animal e biotecnologia da reprodução foram
escolhidas com objetivo de aprofundar os conhecimentos adquiridos durante o
período da graduação, além de participar do manejo sanitário e clínico dos
animais, rotina do laboratório e da fazenda.
4.2. IDENTIFICAÇÃO DO ESTÁGIO
PRIMEIRA ETAPA
Local: CTZL (EMBRAPA CERRADOS)
Supervisor de estágio: Dr. Carlos Frederico Martins
Período de estágio: 01 de Setembro de 2014 a 23 de Outubro de 2014.
SEGUNDA ETAPA
Local: Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia
Supervisor de estágio: Dr. Maurício Machain Franco
Período de estágio: 27 de Outubro de 2014 a 09 de dezembro de 2014.
4.3. ATIVIDADES DESENVOLVIDAS
PRIMEIRA ETAPA
Na primeira etapa do estágio tive a oportunidade de fazer palpação retal
para avaliação do útero e ovários em busca de saber a fase do ciclo estral ou
se havia gestação ou não. No útero, observa-se o tamanho, simetria dos
cornos uterinos, consistência, contratilidade e eventuais conteúdos. No ovário é
interessante ver a posição, tamanho, consistência superficial se há presença
de cisto, folículos e corpo lúteo para verificar a fase do ciclo reprodutivo.
Além da palpação pude fazer diagnóstico de gestação em vacas por
ultrassonografia (emissão de ultrassom e captação de ecos). Essa técnica é
27
um meio complementar ao exame clínico, possibilitando o registro de imagens
para serem utilizadas em laudos ou atestados clínicos.
Acompanhei também a aspiração de cistos foliculares, isso foi feito como
forma de tratamento de vacas que não emprenhavam, juntamente com a
colocação de um implante de progesterona. A técnica usada foi a mesma da
aspiração folicular guiada por ultrassom na qual uma agulha é acoplada na
ponta da sonda (transdutor) e ela fica ligada a uma bomba de vácuo.
Pude acompanhar a inovulação de embriões, para sua realização o
técnico deve ter experiência e habilidade, pois erros podem gerar taxas mais
baixas de sucesso. Essa biotécnica consiste na transferência de embriões
retirados do útero de fêmeas doadoras ou de embriões produzidos in vitro, para
o útero de receptoras para que se complete a gestação.
Acompanhei a visita de uma técnica governamental que foi fazer os
exames clínicos de febre aftosa à procura de: a) febre alta de até 41°C; b)
vesículas e bolhas íntegras na boca; c) queda brusca na produção de leite
precedendo os primeiros sinais clínicos; d) salivação e claudicação; e) erosões
secundárias vermelho-vivas, úmidas e sem sangramento, com ou sem depósito
de fibrina, nas regiões do focinho, narinas, boca, banda coronária (coroa) dos
cascos, espaço interdigital, tetos e úbere; f) morte súbita em animais muito
jovens causada por miocardite hiperaguda.
Também pude acompanhar a biopsia e cultivo de células, essa técnica é
uma possibilidade para preservar o germoplasma de animais mortos. Consiste
no isolamento, cultivo e criopreservação de fibroblastos ou células do tecido
adiposo (adipócitos). Essas células podem servir para caracterizações
moleculares e também para multiplicação animal pela técnica de transferência
nuclear (clonagem).
Acompanhei também o manejo do gado fora da área de biotecnologias.
Foi possível acompanhar a fabricação de ração, a distribuição dessa ração,
silagem e sal mineral diariamente, também pude observar e ajudar na
implantação de um novo método de pastejo na propriedade, o pastejo
rotacionado. A nutrição é muito importante, pois o animal vai parar suas
atividades reprodutivas em caso de falta de comida.
Por fim, diariamente, acompanhei a ordenha das vacas as quais
passaram pelos processos anteriormente citados e tiveram resultados
28
positivos, os bezerros. Os zebuínos são animais que a ordenha é feita de forma
diferente, pois as vacas não soltam o leite sem que o bezerro esteja perto,
portanto para se ordenhar uma vaca zebuína é preciso deixar o bezerro perto
delas para que haja o estímulo sensorial e de tato (bezerro ou ordenhadeira
mecânica) para que ela comece a liberar o leite. A ordenha lá é feita de forma
mecanizada no sistema de fila indiana por ser o único que permite a presença
do bezerro ao pé e os princípios das boas práticas de higiene na ordenha como
o pré e o pós-dipping são respeitados.
SEGUNDA ETAPA
Na segunda etapa do estágio, aprendi sobre a lavagem e esterilização
de materiais de laboratório.
Tive a oportunidade de fazer palpação retal para avaliação do útero e
ovários em busca de saber a fase do ciclo estral.
Acompanhei a aspiração folicular guiada por ultrassom para a coleta de
ovócitos diretamente dos ovários de vacas vivas. Bezerras pré-púberes
induzidas à puberdade com protocolos hormonais tiveram seus ovócitos
avaliados, a técnica utilizada na aspiração folicular dessas bezerras foi
adaptada de ovinos devido ao tamanho dos animais. Em vez de ser feita por
ultrassonografia ela é feita por laparoscopia. Também foi feita a aspiração
folicular em ovários de abatedouro utilizando seringas e agulhas hipodérmicas.
Esses ovócitos foram encaminhados para o laboratório e com o uso de uma
lupa, os ovócitos foram procurados, recuperados e classificados. Depois disso
eles foram maturados in vitro. Após essa maturação esse ovócito pode ser
usado para continuar a produção in vitro de embriões ou para a transferência
nuclear. Caso ele vá ser usado na produção in vitro de embriões é preciso
fazer então a capacitação dos espermatozoides que serão usados, a
fertilização in vitro e o cultivo in vitro até o estádio de blastocisto e após isso
escolhe-se entre a transferência ou criopreservação. É possível com essa
técnica aumentar o número de bezerros que uma vaca pode ter por ano de 1
para 40 ou mais o que leva uma vaca de alto valor zootécnico a ter muitas crias
por anos fazendo com que as características maternas sejam prevalentes em
vez das paternas como acontece na inseminação artificial.
29
Acompanhei também a inovulação de embriões oriundos de
transferência nuclear, o exame ultrassonográfico em bezerras para avaliar a
resposta do organismo ao tratamento feito com hormônios sexuais e pude fazer
pipetas de manipulação de ovócitos e embriões a partir de capilares de
microhematócritos além de acompanhar a fabricação de micropipetas para
transferência nuclear.
Quadro 1- Atividades desenvolvidas durante o estágio obrigatório
Atividade Repetições
Ecografia retal 7
Lavagem e esterilização de materiais de laboratório 3
Aspiração folicular de bezerras e vacas 10
Produção in vitro de Embriões 2
Produção de pipetas de manipulação de ovócitos e embriões 2
Transferência de Embrião 5
Palpação retal 5
Clínica 3
Rotina da fazenda 25
Aspiração folicular de ovários de abatedouro 2
Avaliação da dinâmica folicular de bezerras 5
Manipulação hormonal em bezerras 5
Diagnóstico de gestação em vacas 3
4.4. CONSIDERAÇÕES FINAIS SOBRE O ESTÁGIO:
Devido ao período de seca não foi possível ter muitas atividades
laboratoriais e de campo, no entanto pude aprender um pouco mais sobre as
biotecnologias da reprodução animal. O estágio na Embrapa foi de enorme
valia, pois, além de ser um centro de pesquisa de referência internacional,
possibilitou uma importante experiência para minha formação, já que muitos
procedimentos aprendidos em sala de aula foram acompanhados e explicados
novamente e feitos por mim para aperfeiçoamento dessas habilidades.