UNIVERSIDADE DE LISBOA
INSTITUTO SUPERIOR TÉCNICO
Caraterização de Corantes Sintéticos com Interesse Histórico
por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência Associada à
Espectrometria de Massa Tandem
Ana Maria da Cruz Dias
Dissertação para Obtenção do Grau de Mestre em
Química
Orientador: Doutora Maria Conceição Monteiro André Oliveira
Júri
Presidente: Presidente: Doutora Maria Matilde Soares Duarte Marques
Vogais: Doutora Maria Rosário Beja Figueiredo Gonzaga Bronze
Doutora Maria Conceição Monteiro André Oliveira
Dezembro 2014
i
Agradecimentos
Em primeiro lugar gostaria de agradecer á minha orientadora, a Doutora Maria da Conceição
Oliveira, pela transmissão de conhecimentos, pelas conversas, a disponibilidade, incentivo,
pelo contínuo apoio neste trabalho e amizade ao longo desta caminhada.
Ao Doutor Joaquim Marçalo pela sua disponibilidade e ajuda.
Aos meus pais e irmãos, que sempre estiveram do meu lado nos bons e maus momentos.
Gostaria de agradecer á minha mãe e á minha irmã o apoio, o incentivo, a paciência, a
compreensão que sempre me deram.
Gostaria de agradecer ao meu namorado que este sempre ao meu lado nesta etapa pela
paciência e incentivo.
Gostaria de agradecer a todos os colegas do grupo VII, do Centro de Química Estrutural do
IST, em especial á Sara Sousa, Joana Bernardo, Ivânia Cabrita e Ana Godinho pela paciência,
ajuda, incentivo, apoio e amizade.
A Catarina Sousa do grupo II e ao Rogério Chay do grupo V, do Centro de Química Estrutural
do IST, pelo incentivo, ajuda, apoio e amizade.
A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para este trabalho, os meus sinceros
agradecimentos.
ii
Abreviaturas
AC Antes de Cristo
ac Corrente alternada
APCI Ionização química a pressão atmosférica
API Ionização à pressão atmosférica
CI Ionização Química
CID Dissociação induzida por colisão
CRM Modelo de carga residual
DAD Detetor de arranjo de díodos
EI
Ionização Electrónica
ESI Ionização electrospray
FAB Bombardeamento rápido de átomos
FTICR Ressonância ciclotrónica de iões com transformada de Fourrier
GC Cromatografia gasosa
HPLC Cromatografia Líquida de alta Eficiência
HPLC-DAD-MS Cromatografia Líquida de alta eficiência acoplada a um detector de
arranjo de díodos e espectrometria de massa
HPLC-DAD-MS/MS Cromatografia Líquida de alta eficiência acoplada a um detetor de
arranjo de díodos e espectrometria de massa tandem
HPLC-DAD-MSn Cromatografia Líquida de alta eficiência acoplada a um detetor de
arranjo de díodos e espectrometria de massa tandem
HRMS Espectrometria Massa de alta Resolução
iii
IEM Modelo de evaporação do ião
JCE Journal Chemical Education
MALDI Ionização/Dessorção de matriz assistida
MS Espectrometria de massa
MS/MS Espectrometria de massa tandem
m/z Razão massa/carga
NI Ião negativo
NSI Ionização nanopray
QIT Armadilha de iões quadrupolar
QqQ Triplo quadrupólo
RF Radio frequência
RI Índice de refração
RMN Ressonância magnética e nuclear
TFA Ácido trifluoroacético
TOF Tempo de vôo
TIC Cromatograma iónico total
UV-vis Ultravioleta visível
2D Bidimensional
3D Tridimensional
iv
Resumo
Durante cerca de 4000 anos, o Homem usou corantes extraídos de fontes naturais.
Mas, a descoberta da malva, por William Henry Perkin em 1856, impulsionou a síntese de
novos corantes sintéticos. No final do século XIX, os corantes naturais foram substituídos pelos
sintéticos que, além de excelentes propriedades tintoriais, apresentavam uma variada paleta de
cores e eram economicamente muito mais acessíveis.
Na primeira parte do trabalho, procedeu-se à caracterização por HPLC-DAD-MSn
de corantes com interesse histórico extraídos das fibras de amostras do J. Chem. Ed., 1926, 3,
976. O trabalho envolveu a aplicação de métodos de extração e a otimização de métodos de
separação cromatográfica adequados a cada família de corante. Cada corante foi caraterizado
com base no tempo de retenção, espectro de UV-Vis e espectro de massa de iões produto.
A segunda parte do trabalho, envolveu o estudo por HPLC-DAD-MSn de cerca de 35
selos Penny Lilac (1867-1901), e de amostras históricas de sais de mauveína atribuídas a
Henry Perkin e Henrich Caro. Os resultados demonstraram que as amostras históricas eram
distinguíveis com base nos cromóforos da mauveína presentes na sua composição. As
amostras de Perkin contêm mauveína A e mauveína B, enquanto que a de Caro tem
maioritariamente pseudo-mauveína. Da comparação entre os sais de malva e os extratos dos
selos concluiu-se que os selos SG107 a 109 tinham sido impressos com malva de Perkin, e o
selo SG 106 com malva de Caro. Mas, a maioria dos selos analisados, foram impressos com
ácido carmínico, embora as suas cores de impressão sejam semelhantes à da malva.
Palavras Chave: HPLC-DAD-MSn, Corantes Sintéticos, Mauveína, Perkin, Selos Penny Lilac
v
Abstract
For about 4000 years, man has used dyes obtained from natural sources. But the
discovery of mauve dye, by William Henry Perkin in 1856, has impelled the synthesis of new
synthetic dyes. In the late nineteenth century, natural dyes were replaced by synthetic ones,
that in addition to excellent dyeing properties, showed a varied palette of colors and were
economically much more accessible.
The first part of the work deals with the characterization by HPLC-DAD-MSn of synthetic
dyes with historical interest, extracted from fibers of the J. Chem. Ed., 1926, 3, 976. The study,
involved the application of extraction and the optimization of chromatographic separation
methods appropriate for each dye family. Each dye was fully characterized on the basis of its
retention time, UV-vis spectrum and product ions mass spectrum.
The second part of the work presents the study by HPLC-DAD-MSn of about 35 stamps
Penny Lilac (1867–1901), and historical samples of mauveine salts, attributed to Henry Perkin
and Henrich Caro. The results demonstrated that historical samples were distinguished on the
basis of the mauveine chromophores present in their composition. The samples prepared by
Perkin contain mauveine A and mauveine B, whereas the Caro´s sample have mainly pseudo-
mauveine. A comparison between the mauve salts and the extracts of stamps allowed to
conclude that stamps SG 107, 108 and 109 were printed with mauve prepared by Perkin, and
the stamp SG 106 contained mauve from Caro. But, mostly of the stamps analyzed were
printed with carminic acid, although their printing colors seems to be mauve.
Keywords: HPLC-DAD-MSn, synthetic dyes, mauveine, Perkin, Penny Lilac Stamps
vi
Índice
Agradecimentos i
Abreviaturas ii
Resumo iv
Abstract v
Lista de figuras viii
Lista de tabelas xi
Capítulo I: Introdução 1
1.1– Corantes 2
1.1.2 – Corante malva 5
1.1.2.1 – Uma perspectiva histórica 5
1.1.2.2 – Estrutura da malva 6
1.1.2.3 – Selos postais 8
1.2 – Métodos analiticos 9
1.2.1 – Cromatografia Líquida de Alta Eficiência 9
1.2.2 – Espectrometria de massa 10
1.2.2.1 – Ionização por Electrospray (ESI) 11
1.2.2.2 – Analisador de massa de armadilha quadrupolar (QIT) 13
1.2.2.3 – Detetor 14
1.2.2.4 – Espectrometria de massa tandem MS/MS 14
1.2.3 – LC-MS 15
Capítulo II: Parte experimental 17
2.1 – Reagentes 18
2.2 – Equipamento 19
2.3 – Preparação das amostras 19
2.3.1 – Solução 0.2 M de ácido oxálico 19
2.3.2 – Solução de TFA 2 M 19
2.4 – Amostras e métodos de extração 19
2.4.1 – Amostras têxteis 19
2.4.2 – Amostras históricas 20
2.4.3 – Selos postais 20
2.5 – Condições de análise 20
2.5.1 – HPLC-DAD-MSn 20
Capítulo III: Apresentação, tratamento e discussão dos resultados 22
3.1 – Amostras do Journal Chemical Education 23
3.1.1 – Corantes nitro 23
3.1.2 – Corantes azo (monoazo e diazo) 24
3.1.3 – Corantes metano (triaril e difenil) 28
3.1.4 – Corantes azina e xanteno 35
3.1.5 – Corantes antraquinona 37
vii
3.2 – Identificação de malvas em selos Penny Lilac (1867 – 1901) 39
3.2.1 – Caraterização de amostras de malva históricas 39
3.2.2 – Caraterização de selos Penny Lilac 45
Capítulo IV: Conclusão 54
Bibliografia 57
Anexos
viii
Lista de figuras
Figura 1.1: Representação da estrutura da benzidina. 4
Figura 1.2: Caracterização estrutural dos produtos isolados a partir das amostras de malva.
Adaptada de. [6]
7
Figura 1.3: Representação esquemática dos componentes básicos de um espectrómetro de
massa. 10
Figura 1.4: Representação esquemática da interface electrospray (ESI). 12
Figura 1.5: Representação de um analisador do tipo armadilha de iões quadrupolar. 13
Figura 1.6: Representação do multiplicador de eletrões. 14
Figura 3.1: Esquema de fragmentação proposto e espectro de massa MS2 do ácido pícrico. 24
Figura 3.2: Padrões de fragmentação dos compostos azo através da ligação –N=N-. 25
Figura 3.3: Espectro de massa MS2 do vermelho cochonilha A e respectiva proposta de
fragmentação. 26
Figura 3.4: Espectro de massa MS2 e esquema de fragmentação proposto para o amaranto.27
Figura 3.5: Esquema de fragmentação proposto e espectro de massa MS2 da Crocein Scarlet.
28
Figura 3.6: Espectro de massa MS2 e esquema de fragmentação proposto da auramina. 29
Figura 3.7: Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MSn (n=2-4) do Patent
Blue V. 31
Figura 3.8: Espectro MS do Light Green SF Yellowish. 31
Figura 3.9: Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MS2, MS
3 e MS
4 do ião
mono carregado do Light Green SF Yellowish. 32
Figura 3.10: : Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MS2, MS
3 e MS
4 do
ião duplamente carregado do Light Green SF Yellowish. 33
ix
Figura 3.11: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 do Formilo Violeta S4B. 35
Figura 3.12: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 da safranina T. 36
Figura 3.13: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 da rodamina B. 37
Figura 3.14: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 do vermelho Turquia. 38
Figura 3.15: Cromatogramas de HPLC-DAD das amostras históricas dos sais de mauveína a
550 nm para ScM1: Museu da Ciência 1; ScM2: Museu da Ciência 2; ScM3: Museu da Ciência
3; ScM4: Museu da Ciência 4; MS1M1: Museu da Ciência e Indústria Manchester 1; CM:
Museu Chandler; MS1M2: Museu da Ciência e Indústria Manchester; DM-Caro: Museu
Deutsches. 40
Figura 3.16: Cromatograma de HPLC-DAD e cromatogramas de tadem ESI(+) e espectros de
massa MS2 da amostra ScM1 do Museu da Ciência. Os maiores compostos identificados
correspondem ao número de picos: 1 – m/z377, isómero C25; 2 – m/z391, Mauveína A; 3 – m/z
405, mauveína B2; 4 e 5 – m/z 405, mauveína B3 e B4; 6 – m//z 405, mauveína B; 7 e 8 – m/z,
mauveína C e C1; 9 – m/z 433, mauveína D. 41
Figura 3.17: Cromatogramas de HPLC das amostras históricas dos sais de mauveína a 550
nm ScM4 e DM-Caro, e da amostra de malva do JCE. 45
Figura 3.18: Dois selos postais (esquerda Penny Lilac, SG 170-SG 174), e a direita (o selo SG
107 de seis pences) com os respetivos extratos numa solução de metanol. 47
Figura 3.19: Cromatograma de HPLC-DAD, cromatogramas de massa tandem ESI(+) e
espectro de massa MS2 da amostra de selo postal SG 109. Os compostos identificados
correspondem ao pico: 1 – m/z 377, isómeres C25; 2 – m/z 391, mauveína A; 3 e 4 – m/z 405,
mauveína B3 e B4; 5 – m/z 405, mauveína B; 6 – m/z 419, mauveína C; 7 – m/z 433, mauveína
D. 48
Figura 3.20: Cromatograma de HPLC-DAD, cromatograma de massa tandem ESI(+) e
espectro de massa MS2 da amostra de selo postal SG 106. Os compostos identificados
correspondem ao pico: 1 – m/z 363, pseudo mauveína; 2 – m/z 377, isómeros C25; 3 –m/z 391,
mauveína A; 4 – m/z 405, mauveína B. 49
Figura 3.21: Dois selos postais analisados: à esquerda o selo SG 109, impresso com malva de
Perkin; e à direita o SG 106 impresso com malva de Caro. 50
x
Figura 3.22: Cromatograma de HPLC-DAD e o cromatograma tandem ESI(-) e o espectro de
massa MS2 da amostra do selo postal (SG 170-174). O pico com m/z 491 corresponde ao ácido
carmínico desprotonado. 50
xi
Lista de Tabelas
Tabela 2.1: Reagentes utilizados e suas características. 18
Tabela 3.1: Análise por HPLC-DAD-MS das diferentes malvas encontradas nas amostras
históricas (analisada anteriormente na ref.[6]
) e a partir de uma amostra sintetizada por Heinrich
Caro (do Museu Deutsches). 44
Tabela 3.2: : Análise por HPLC-DAD-MS/MS dos diferentes tipos de malva (dado em %)
encontrados nos selos Victoria LiLac. 46
Tabela 3.3: Dados de HPLC-DAD-MS/MS dos corantes violeta de Hofmann´s e o corante
natural cochenilha. 52
Anexos
Tabela 1: Tabela 1: Base de dados dos corantes sintéticos extraídos de fibras pertencentes a
um artigo do Journal of Chemical Education, 1926, 3: 9, 973-1007. A1
Tabela 2: Comentários sobre a rotulagem e origem das amostras. A9
Tabela 3: Selos Postais (35) analisados por HPLC-DAD-MS/MS. A11
Capítulo I
Introdução
2
1.1– Corantes
“The total number of dyes discovered is more than three Millions and some 27,000 had been
marketed and about two new ones are appearing each week. Now, it is 2013. Numbers are
certainly much more. Around 34,500 dyes and pigments are listed under 11,570 Color Index
Generic Names in fourth edition of Color Index International of SDC & AATCC” [1]
Durante mais de 4000 anos, os corantes utilizados pelo Homem foram obtidos a partir
de fontes naturais, como plantas, árvores, líquenes e alguns insetos. Estes corantes eram
utilizados para adorno pessoal, decorar objetos, fazer pinturas e sobretudo tingir têxteis com o
qual cobriam o corpo e decoravam as habitações. È de 2600 AC, o primeiro registo conhecido
da utilização de corantes naturais na China. De entre a vasta gama de produtos utilizados,
houve algumas fontes tintureiras que pelo facto de originarem cores belas e persistentes
atingiram grande valor económico, fazendo a sua posse a fortuna de impérios, e sendo
utilizados apenas por imperadores e altos dignatários da igreja.
O indigo (corante azul), um corante natural obtido á partir da planta Indigofera
Suffruticosa é um dos mais antigos e muito utilizado atualmente no tingimento dos jeans. Este
corante foi o ponto de partida na produção do primeiro corante sintético, o ácido pícrico
(corante amarelo), descoberto em 1771 por Woulfe a partir da reação do indigo e ácido nítrico,
sendo usado no tingimento da seda e lã. [1-5]
Outros corantes foram descobertos e utilizados,
tais como a aurina, murexide, anilina negra, alguns corantes azuis, violetas e vermelhos
preparados por Friedrich Runge (1795 – 1867), mas não possuíam boas propriedades de
tingimento, como solidez à lavagem e à luz, apenas eram compostos com propriedades
tintoriais, sem valor comercial. [2-5]
Em 1850, August Wilhelm von Hofmann investigador e professor no Royal College of
Chemistry em Londres, começou por estudar os produtos derivados do alcatrão de carvão, pois
este era uma fonte de compostos orgânicos facilmente recolhidos por destilação. Com os
conhecimentos que possuía na área, iniciou, nessa época, uma investigação nesses
compostos fazendo uma substituição orgânica dos radicais com amónia, o que levou à
discriminação entre bases orgânicas primárias, secundárias e terciárias, isto é, à descoberta
das aminas. [3]
Hofmann tinha o dom de encorajar e puxar pela imaginação de todos os seus alunos,
entre eles William Henry Perkin, que começou a investigar a síntese da quinina. Para esse
efeito usou a anilina e tratou-a com dicromato de potássio, obtendo um precipitado preto. Mas,
curiosamente quando efetuava a lavagem com metanol do recipiente em que realizou a reação
conseguiu isolar uma cor a que chamou “mauve”. Verificando que esta descoberta poderia ter
importância comercial patenteou-o como corante, surgindo assim em 1856 o primeiro corante
sintético, a malva ou púrpura de anilina. [3-5]
Esta descoberta impulsionou a procura por novos corantes sintéticos e os compostos
derivados do alcatrão de carvão foram utilizados como matéria-prima de interesse científico e
3
isolados, entre eles, o benzeno do qual naquela época não se tinha nenhum conhecimento,
inclusive da sua estrutura. Ensaios em laboratório, levaram à conversão do benzeno noutros
compostos, tais como a anilina e o nitrobenzeno. Antes disto a anilina era produzida à partir do
indigo por destilação. Outras descobertas foram feitas muito rapidamente, e em 1859 a
Safranina T (Safranine T), um cor-de-rosa vivo foi posto no mercado. [3]
Como Perkin obteve a
malva por oxidação com dicromato de potássio da anilina e toluidina, ambas aminas
aromáticas, pensou-se que o uso de outros agentes oxidantes poderia causar variações na
natureza do produto.
Em 1859, Verguin obteve um corante vermelho azulado ao qual chamou de magenta,
sendo este o primeiro corante de trifenilmetano, em que três anéis de benzeno estão todos
ligados por um átomo de carbono. Este grupo de compostos era facilmente modificado pela
substituição dos hidrogénios por outros grupos, como os alquil, ou retirando grupos, como as
aminas. [3]
Em 1883, foi descoberto outro corante, a auramina, conhecido como corante de
difenilmetano. [3]
Quimicamente, todos estes corantes eram sais básicos, e ficaram conhecidos
por corantes básicos. De belas tonalidades brilhantes, mas pouco persistentes à luz, foram
praticamente só usados no tingimento da seda.
Em 1866, Peter Greiss começou a fazer reações de aminas com ácido nítrico para
observar o seu comportamento, tendo obtido resultados idênticos aos de Perkin e outros
cientistas. Mas ele continuou os seus estudos e observou que em meio ácido, o ácido nítrico
ataca o grupo aromático na amina, ocorrendo a deslocação de dois átomos de hidrogénio e a
adição de um átomo de azoto, ambos com um radical ácido, que deve estar presente,
formando o composto diazonium, que quando seco era extremamente explosivo, e em solução
entrava em decomposição, especialmente se aquecido, dando origem aos fenóis. [3]
As reações
de diazotação eram difíceis de controlar, por isso para serem produzidas satisfatoriamente
tinham de ser efetuadas em condições climáticas muito frias, uma vez que o gelo ainda não era
produzido. [5]
A diazotação e o acoplamento são as reações básicas da síntese de todos os corantes
azo. O primeiro corante azo, foi produzido em 1865, por reação do ácido nítrico com meta-
fenilo-diamina e chamou-se Manchester Brown. Novos desenvolvimentos neste campo, só
foram possíveis com o aparecimento de novos compostos orgânicos. E, em 1876, é lançada no
mercado, uma cor laranja-acastanhada, a que foi dado o nome de crisoidina. Até esta altura
todos os corantes produzidos eram básicos, mas, ainda em 1876, a firma Poirrier em St. Denis
põe no mercado o primeiro corante azo ácido, o alaranjado II (Orange II). Estes corantes de
grande qualidade, apresentavam cores muito brilhantes, devido à presença de ácidos
sulfónicos. [3]
Em 1878, aparece no mercado um corante ácido vermelho, o Fast Red A, de elevada
qualidade. Começou, assim, a “guerra” entre corantes naturais e corantes sintéticos. O início
deste conflito, já tinha na realidade sido iniciado em 1869, quando a alizarina artificial começou
a ser comercializada, por esta ser quimicamente muito semelhante ao corante natural. Muitos
corantes sintéticos têm a mesma tonalidade que os corantes naturais, mas possuem uma
4
estrutura completamente diferente. O progresso na síntese dos corantes levou à produção de
isómeros, com estruturas semelhantes, mas com os grupos substituintes (os grupos sulfónicos)
em posições diferentes na molécula. Descobriu-se, assim, a possibilidade de formação de
corantes com tonalidades diferentes, e nessa série é produzido um corante vermelho idêntico
ao corante natural cochonilha, a que foi dado o nome de vermelho cochonilha A. [3]
Todos os corantes azo sulfonados eram laranja e vermelhos e os corantes básicos,
eram azuis, violetas e verdes. Este facto levou os cientistas a tentar converter os corantes
básicos em corantes ácidos solúveis em água, por sulfonação. Surgiram, assim, os corantes
ácidos trifenilmetano, [3]
corantes azuis e violetas de grande qualidade, produzidos para serem
usados como corantes azo no tingimento da lã. Por exemplo, o ácido magenta foi produzido
por sulfonação direta do magenta em 1877, havendo outros em que sulfonação ocorre num
substituinte ligado ao azoto, como o formilo de violeta SB4 (Formyl Violet S4B). Em 1888 são
introduzidos, pela Meister, Lucius e Brunning, dois corantes azuis de elevada qualidade, o
Patent Blue A e V, cujas estruturas diferiam apenas no tipo de substituintes ligados ao grupo
amina.
Todos os corantes sintéticos produzidos até esta altura eram usados no tingimento da
seda e lã, pois quando utilizados no tingimento do algodão não se obtinha a mesma tonalidade,
a não ser que se usa-se um mordente.[3]
O mordente é um ião metálico como o Al3+
e Cr3+
, que
é adicionado ao banho de tingimento e faz a ligação entre o corante e a fibra, isto é, prepara a
fibra para fixar o corante. Este tipo de corantes que necessitam de mordente são conhecidos
como corantes mordente.
Em 1884, Boettiger descobriu que a presença do núcleo de benzidina ( figura 1.1), num
corante azo conferia propriedades ao corante de tingir o algodão num banho neutro ou
fracamente básico, sem necessitar de mordente ou sal para ocorrer a fixação à fibra. O
primeiro corante reconhecido como corante direto foi o Vermelho Congo (Congo Red). [2]
NH2H2N
Figura 1.1: Representação da estrutura da benzidina
Adolph von Baeyer interessou-se pela química orgânica dos corantes e deve-se-lhe a
descoberta do indigo, e em 1871, a partir da interação entre o anidrido ftálico e fenóis,
descobriu a fluoresceína, um corante amarelado pouco interessante mas com interesse para a
fluorescência. A partir destes estudos, Caro, em 1874, produziu a eosina, um “belo mas fugidio”
corante. Mas o desenvolvimento deste grupo de corantes data depois de 1887, quando se
descobriu ser possível produzir corantes ftaleína pela substituição dos fenóis amino e do
anidrido ftálico, levando assim a uma nova classe de corantes, os corantes xanteno[3]
, como a
Rodamina B, de tonalidade verde-avermelhada característica.
5
O progresso no fabrico dos corantes sintéticos e da química orgânica foi sempre um
crescimento conjunto, entre o melhoramento nos métodos de controlo das reações orgânicas e
os avanços na compreensão da natureza dos compostos obtidos nestas reações. [3]
O vermelho Turquia (Turkey Red) também conhecido como alizarina, foi sempre
considerado o melhor de todos os corantes, extraordinariamente rápido e de bonito tons claros.
Tinha contudo um problema, era de difícil aplicação. Os químicos voltaram a sua atenção para
o problema, e em 1868, Liebermann e Graebe apresentaram a estrutura da alizarina e
demonstraram que o vermelho Turquia era a cor produzida quando a alizarina era aplicada
num mordente de Al3+
. Em 1869, o corante alizarina era produzido sinteticamente a partir do
antraceno, e a extração a partir da planta garança entrou em declínio.[3]
Embora a química dos
compostos de alizarina fosse bastante complexa, Bohn, Friederich Bayer e Schmit
conseguiram produzir alguns corantes seus derivados, como por exemplo a Alizarin Saphirol B
e Alizarin Indigo Blue S.
O indigo foi o outro corante que despertou a atenção dos químicos, mas a sua
compreensão mostrou-se um processo muito mais complexo do que o da alizarina. Bayer
devotou 20 anos de estudos ao indigo, antes de a sua constituição ser estabelecida, e embora
tenha completado o seu trabalho em 1884, o indigo sintético só foi lançado no mercado em
1894 devido à descoberta do agente condensante adequado para converter a fenil glicina em
indoxil, que por oxidação dá origem ao indigo. [3]
Bohn, após os trabalhos com a alizarina, centrou-se no indigo pois achava que era
possível produzir um derivado do antraceno correspondente ao indigo. Para tal, usou a beta-
amino-antraquinona e fundiu-a com potássio, obtendo um composto que se fosse tratado com
um agente redutor originava compostos azuis muito resistentes, a que deu o nome de
idantrenos, derivado do indigo e do antraceno.[3]
Estes compostos são conhecidos como
corantes de cuba, pois são insolúveis, mas podem ser transformados numa forma solúvel,
chamada “leuco” e assim conseguir tingir a fibra.
1.1.2 – Corante malva
1.1.2.1 – Uma perspetiva histórica
A descoberta do corante malva em 1856, por Perkin foi um marco, um icon na história
dos corantes sintéticos que impulsionou a indústria dos corantes e da química orgânica, pois é
considerado o primeiro corante sintético. [3-6]
A síntese da mauveína ocorreu por acaso, quando Perkin nas férias da Páscoa em
1856, no seu laboratório improvisado em casa, tentava fazer a síntese da quinina, e de modo a
efetuar esta síntese usou sulfato de anilina (obtido do alcatrão de carvão) e tratou-a com
dicromato de potássio obtendo um precipitado negro, mas ao fazer a lavagem do recipiente
onde efetuou a síntese, com metanol, observou a existência de uma solução de cor púrpura, a
que chamou malva. Com a ajuda do seu irmão Thomas Dix Perkin, no jardim da sua casa
melhorou a produção e isolou a mauveína, verificando a sua importância comercial como
6
corante ao tingir um bocado de tecido de seda. [4-6]
Este corante também foi chamado de outros
nomes como anilina púrpura (1857), púrpura de Tyrian (1858), corante malva (1859). [4,5]
Obteve o contacto de Robert Puller de uma tinturaria muito respeitada, J Pullar & Sons,
Mill Street Dye Works, UK e mandou-lhe umas amostras de seda tingida para saber a sua
opinião. Robert Puller, respondeu-lhe, dizendo “ nunca ter visto uma cor com uma tão grande
solidez à lavagem e à luz e que era a cor que as classes mais altas desejavam”. [5]
Perkin patenteou a sua descoberta nesse mesmo ano, com a designação de “mauve”,
tendo-lhe sido concedida a 23 de Agosto de 1856 e selada a 20 de Fevereiro de 1857.[4-6]
Construiu uma fábrica com o seu irmão Thomas Dix Perkin e começou a produção da
mauveína em pequena escala. Mas a procura e crescimento público deu-se quando a cor foi
adotada pela Rainha Victoria de Inglaterra, que usou um vestido tingido com mauveína no
casamento da sua filha em 1858, e pela Imperatriz Eugénie, esposa de Napoleão III, em
França.[4-6]
Contudo o seu interesse comercial entrou em declínio, mesmo antes de Perkin vender
a sua fábrica em 1873, pois o auge deste corante durou mais ou menos sete anos (1857-1864).
Durante esse período viu-se outro uso para a mauveína, pois além do tingimento de tecidos, foi
usada na produção de tintas de impressão, aplicação que durou até ao final do reinado da
Rainha Victoria (1837-1901).
E, quando a elegante rainha Victoria usou um vestido cor de “mauve” na grande
exposição mundial de 1862, um selo postal cor de malva de um centavo “a mauve penny
stamp” foi posto a circular pelo Royal Post Office of Great Britain. [4-6]
1.1.2.2 – Estrutura da malva
A procura pela estrutura molecular da malva, começou com o próprio Perkin que,
através da análise elementar, conseguiu observar a presença de toluidina. Definiu a fórmula
empírica da mauveína como C27H24N4, e que esta era o principal constituinte do corante malva.
Mais tarde descobriu que a toluidina e derivados da anilina (xilenos) dão corantes com cores
semelhantes. Tentou efetuar a síntese com a anilina pura e obteve uma cor diferente e deu-lhe
o nome de pseudomalva, com fórmula C24H20N4. Perkin publicou vários artigos sobre a
constituição química da mauveína, e na sua última comunicação definiu “ that mauveine was a
mixture of pseudo-mauveine (C24) and of a trimethylated homologue (C27)”, e que havia “two
different products, namely, a blue shade of mauve prepared from aniline, containing little
toluidine, and a red shade from an aniline containing large quantities of toluidine”.[5]
Perkin
conseguiu determinar a fórmula molecular da mauveína, mas não a sua estrutura molecular.
Só em 1994, Otto Meth-Cohn e Mandy Smith, após análise de duas amostras históricas
de sais de mauveína, uma amostra produzida na fábrica por Perkin e pertencente aos Arquivos
Zeneca at Blackley (Manchester) e outra do Museu Britânico (Londres), demonstraram que os
dois principais cromóferos da malva eram a mauveína A e B, C26 e C27 (Figura 1.2). Estas
amostras foram novamente analisadas recentemente por HPLC-MS e foi possível separar e
identificar vários homólogos metilados da mauveína. Com o isolamento destes dois compostos
7
foi possível determinar as suas estruturas recorrendo a ensaios de HRMS e RMN. Na Figura
1.2 apresenta-se a caracterização dos produtos isolados a partir de amostras de malva. [6]
NH2
NH2H2N
N
N
H2N NH
Malva B
N
N
H2N NH
N
N
NHH2NN
N
H2N NH
N
N
NHH2N
Malva A Malva B2
Malva C
Pseudo - MalvaMalva C25a
N
H2N NH
Malva C25b
N
N
H2N NH
N
C26
C27
C27
C28
C24C25
C25
Figura 1.2: Caracterização estrutural dos produtos isolados a partir das amostras de malva.
Adaptada de [6]
O composto A (C26) contém duas moléculas de anilina, uma molécula de p-toluidina e
uma molécula de o-toluidina, enquanto que o composto B (C27) contém uma molécula de
anilina e duas moléculas de o-toluidina e uma molécula de p-toluidina. Mais tarde também foi
possível identificar os picos mais pequenos visualizados na cromatografia como sendo
análogos do composto A e B, pela utilização da anilina, o-toluidina e p-toluidina como materiais
de partida. Estes dados, tal como os dados obtidos por Otto Meth-Cohn e Mandy Smit,
contradizem a fórmula empírica da mauveína definida por Perkin, devendo a sua fórmula C27,
estar relacionada com a mauveína B ou um isómero. [5,7]
Como Perkin já tinha verificado e os químicos modernos comprovaram, a estrutura do
corante malva é dependente da presença da o-toluidina e p-toluidina que são mais reativos que
8
a anilina no processo de acoplamento oxidativo na produção de mauveína, por isso não é um
composto puro, mas sim uma mistura de anilina e toluidinas. [5-7]
1.1.2.3 - Selos Postais [8]
A indústria dos corantes sintéticos foi impulsionada pela descoberta da malva por
Perkin, pois a sua aplicação no tingimento de tecidos de algodão não era bem sucedido, dado
ser necessário a aplicação de um fixador (mordente) apropriado. Contudo, este problema foi
superado em 1860, pois na exposição internacional em Londres existiam telas, produtos
tingidos e impressos com este corante sintético.
Devido à Guerra Civil Americana que precipitou a procura por algodão, este tornou-se
um produto escasso, por isso tornou-se necessário procurar novos produtos para a aplicação
dos corantes. A Roberts, Dale & Co de Manchester considerada a mais progressiva empresa
de impressão inglesa, começou a investigar formas de impressão em papel, pois a impressão
em papel não era como a impressão em materiais têxteis, e esta não possuía um especialista
em impressão em papel.
Em meados de 1860, dados os esforços do químico Heinrich Caro na Roberts, Dale &
Co e Hugo Muller, na empresa de papel de Thomas De La Rue & Co em Londres, aplicar os
corantes sintéticos passaram a ser usados no tingimento em papel, principalmente em selos
postais.
Dado isto, Thomas De La Rue & Co tornou-se um dos maiores fornecedores de selos
postais do governo Britânico e os primeiros a imprimir selos com corantes sintéticos. [5]
No ano
de 1860 esta era a linha de negócio da empresa e o uso de muitos corantes como a cochonilha
(corante natural) extraída de insetos era usada na impressão.
Nesta época, a rainha Victoria, monarca do Império Britânico, tornou-se a face dos
selos postais. Com a associação de Caro e Muller à empresa de papel Thomas De La Rue &
Co, há dados que indicam que nos selos chamados de “ Penny Lilac”, a impressão tenha sido
feita com corante malva produzido por Caro. Contudo não existem referências da aplicação da
malva feita por Perkin em selos postais. Além disso, segundo Reinhardt e Travis nos selos
“Penny Lilac” também foram usados outros corantes sintéticos, como os violetas de Hofmann.
[8]
Neste trabalho pretende-se demonstrar baseado na análise química de corantes de
fibras do artigo Journal Chemical Education, 1926 e a análise de amostras de históricas de
malva de diferentes origens, que o corante malva sintetizado na fábrica de Perkin foi usado
como fonte tintureira na impressão de selos postais “penny lilac” do período vitoriano. Para
estes estudos recorreu-se à espectrometria de massa tandem com ionização por electrospray
acoplada à cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC-MS/MS)
9
1.2- Métodos analíticos
1.2.1– Cromatografia Liquida de Alta Eficiência[10,11]
A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) é um método de separação dos
componentes de uma mistura, que envolve a sua distribuição por duas fases, uma fase móvel
que elui através de uma fase estacionária. È um método largamente utilizado na análise
qualitativa e quantitativa dos componentes de misturas. Torna-se pertinente saber que a
abreviatura HPLC deriva da designação inglesa High Performance Liquid Chromatography.
Um sistema de HPLC é constituído normalmente por um sistema de distribuição de
solvente (reservatórios de solventes e bomba), uma válvula de injeção da amostra, uma
coluna, um detetor e um sistema de controlo e de aquisição de dados. Alguns equipamentos
contêm ainda um forno de modo a controlar a temperatura da coluna. No HPLC, são utilizadas
colunas de enchimento, vulgarmente de aço inoxidável que possuem enchimento com
partículas entre 3 a 20 µm. As colunas analíticas usuais têm 3 a 30 cm de comprimento e de 2
a 5 mm de diâmetro e, por terem um custo elevado, são por vezes utilizadas pré-colunas com a
mesma fase estacionária, para proteger a coluna de possíveis impurezas presentes na amostra
que possam diminuir o seu tempo de vida.
No HPLC, a amostra dissolvida normalmente na fase móvel (eluente) é transportada,
ao longo dos diversos componentes do sistema cromatográfico, por uma ou mais bombas que
asseguram a passagem controlada da mesma. Os componentes da amostra são separados de
acordo com a sua interação com a fase estacionária (coluna com diferente empacotamento) e
a fase móvel, estabelecendo-se equilíbrios sucessivos de distribuição dos componentes entre a
fase móvel e estacionária. Considerando a existência de uma interação diferente dos
componentes da amostra com as duas fases, estas vão deslocar-se a diferentes velocidades
ao longo da coluna. Os componentes com maior afinidade pela fase estacionária vão ficar
retidos na coluna, isto é, vão ter um tempo de retenção maior, enquanto que os compostos
com maior afinidade pela fase móvel vão ser eluídos mais rapidamente, apresentando tempos
de retenção menores.
As bombas devem manter o fluxo do eluente constante, sem oscilações na pressão ou
fluxo e ser constituída por material que seja compatível com a vasta diversidade de solventes.
Os solventes em HPLC devem ser de elevada pureza e não conter resíduos sólidos, devem ser
desoxigenados antes da sua utilização, pois as bolhas de ar no sistema cromatográfico podem
causar variações na pressão do sistema e perturbações no sinal do detetor. O seu
desarejamento pode ser efectuado por um desarejador colocado logo a seguir aos solventes de
eluição, utilizar um banho de ultra-sons, ou por deslocamento de gases recorrendo a um fluxo
de gás inerte. No caso de se ter tampões como eluentes, estes devem ser filtrados num
sistema próprio, para evitar a formação de sais no interior do sistema e deste modo bloqueá-
lo. A eluição pode ser realizada mantendo a composição do eluente (eluição isocrática), ou
variando a sua composição (eluição por gradiente).
10
Após a eluição da amostra o detetor apresenta uma resposta que permite identificar e
quantificar o composto a partir dos dados registados no cromatograma (tempo de retenção e
área do pico). Mas para identificar um determinado composto numa matriz complexa, primeiro
tem de se realizar um ensaio com o composto padrão que se quer identificar ou quantificar
nesta, exatamente nas mesmas condições, pois se houver alterações nos solventes de eluição
ou no gradiente, os resultados obtidos vão ser diferentes. Para se obter uma largura ou altura
de pico adequada, podem se fazer ajustes nos parâmetros ou trocar a coluna de modo a
melhorar a deteção e a sensibilidade do método de análise.
Existem vários tipos de detetores que podem ser usados em HPLC. Os detetores mais
comuns são os de absorção de radiação ultra violeta e visível (UV-Vis), índice de refração (RI),
fluorescência, eletroquímico e espectrometria de massa (MS).
1.2.2- Espectrometria de massa
A espectrometria de massa (MS) é uma técnica analítica usada para obter informação
qualitativa, massa molecular, características estruturais de compostos, sua composição e se for
o caso, das proporções isotópicas de átomos na amostra bem característicos (presença de Cl,
Br, S, entre outros), e quantitativamente no caso de se pretender quantificar um analito numa
matriz complexa. É definida como a passagem dos analitos da fase condensada para a fase
gasosa seguida da sua ionização e separação de acordo com a razão m/z.[12]
Um espectrómetro de massas é constituído por três componentes básicos: a fonte de
iões, o analisador e o detetor. De uma forma resumida pode dizer-se que a amostra é
introduzida na fonte de iões onde o analito é transferido para a fase gasosa e ionizado. De
seguida os iões são direcionados para o analisador onde os iões vão ser separados de acordo
com a sua razão m/z, e posteriormente transferidos para o detetor onde a corrente iónica é
transformada em sinal elétrico, que é transmitido a um computador que processa os dados e
gera o espectro de massa, um gráfico, em que o eixo das ordenadas apresenta a intensidade
relativa (%) do sinal e no eixo das abcissas a razão m/z. De forma a tornar possível a livre
circulação dos iões no seu percurso, até atingirem o detetor, sem colidirem/interagirem entre si
ou com outras espécies, o espectrómetro de massa é mantido em alto vácuo (10-5
a 10-10
Torr).
[12]
Figura 1.3: Representação esquemática dos componentes básicos de um espectrómetro de
massa.
11
O alcance e a utilidade do método de espectrometria de massa são determinados pelo
método de ionização e pelo tipo de analisador. Dentro das técnicas de ionização, as mais
comuns são a ionização electrónica (EI, a ionização química (CI), a ionização por desadsorção
laser assistida por matriz (MALDI) e a ionização por electrospray (ESI). A escolha da fonte de
ionização vai depender das características físico-químicas do composto a analisar, como a
sua polaridade e estabilidade térmica. Também existem vários tipos de analisador, sendo os
mais vulgares, o triplo quadrupólo (QqQ), as armadilhas de iões lineares (LIT e quadrupolares
(QIT), os de tempos de voo (TOF), os de ressonância ciclotrónica de iões com transformada de
Fourier (FTICR) e o orbitrap. Estes tem diferentes características (poderes de resolução,
sensibilidade e intervalos de massa), por isso a escolha por um deles também vai depender do
tipo de analito e do tipo de análise que se pretende efetuar.
Neste trabalho, utilizou-se um espectrómetro de massa com uma fonte de ionização
por electrospray e com um analisador de armadilha de iões quadrupolar (QIT).
1.2.2.1- Ionização por Electrospray (ESI)
Em 1968, M. Dole apresenta pela primeira vez a técnica de electrospray para transferir
iões da fase líquida para a fase gasosa, baseada no principio de nebulização descrito pelo
físico J. Zeleny, em 1917. Contudo, os grandes avanços desta técnica ocorreram a partir de
1983, quando J. Fenn a usou na análise de macromoléculas. Fenn e seus colaboradores,
demonstraram que esta fonte poderia ser útil na análise de péptidos e proteínas, dado ter a
capacidade de produzir iões multiplamente carregados, reduzindo assim a razão massa/carga
do ião e tornando possível a análise de compostos de elevada massa molecular.[12]
O principio do ESI baseia-se na aplicação de um campo elétrico elevado (± 2-5 kV) à
solução que contém a amostra e é bombada a um fluxo baixo (1-20 µlmin-1
) através da agulha
de electrospray (capilar metálico). O campo elétrico, obtido pela aplicação de uma diferença de
potencial entre a agulha e um contra elétrodo (shield), separados por 0.3 – 2 cm, vai induzir a
acumulação de cargas na superfície da gota localizada na ponta da agulha, que sofre uma
deformação, formando-se o chamado cone de Taylor. Quando a densidade de carga na
superfície da gota aumenta e a repulsão entre as gotas carregadas supera a tensão superficial
do líquido, há uma libertação de gotas mais pequenas (formação do spray) com uma
densidade de carga elevada, conhecida como explosão de Coulomb. [9,10]
Posteriormente estas
gotas passam por um processo de evaporação de solvente (desolvatação) que é favorecido
pela contra corrente de um gás de secagem inerte (azoto). A evaporação de solvente pela gota
aumenta a densidade da carga nesta, até que as forças de repulsão superam a densidade
superficial ocorrendo a libertação de gotas ainda mais pequenas. Este processo ocorre até que
a gota atinja um diâmetro de 0.1µm. [12,13]
Durante este processo ocorre a formação dos iões na
fase gasosa que são focalizados para o analisador.
12
Figura 1.4: Representação esquemática da interface electrospray ((ESI)
Contudo, o mecanismo de formação dos iões na fase gasosa, não está completamente
compreendido. Existem dois modelos propostos que tentam explicar essa formação, o modelo
de carga residual (CRM) proposto por Dole em 1968, em que considera que a evaporação
consecutiva de solvente e a explosão de Coulomb leva a formação de gotas com um raio de
aproximadamente 1 nm e possui apenas uma molécula de analito.[12]
O outro modelo proposto
por Iribarne e Thomson, considera que repetidas evaporações de solvente e a explosão de
Coulomb, leva a que o raio da gota tenha 10 nm e possua cerca de 70 cargas, ocorrendo assim
a emissão dos iões diretamente destas gotas mais pequenas e altamente carregadas. Segundo
este modelo, a gota não sofre rutura, mas pode emitir iões para a fase gasosa, Este modelo
aplicado sobretudo a pequenas moléculas, é conhecido por modelo de evaporação do ião
(IEM). [12]
Como a ESI é aplicada a amostras em solução, a possibilidade de acoplamento com
técnicas de separação, como a cromatografia líquida, revelou-se fundamental na análise de
amostras biológicas. Por se tratar de uma técnica de ionização “suave”, a fragmentação do
composto a analisar é nula ou reduzida durante o processo de ionização. Além disso o ESI é
uma técnica que opera à pressão atmosférica. O aparecimento das técnicas API (ionização à
pressão atmosférica) provocou um grande avanço na análise de amostras pouco voláteis e
termolábeis, conduzindo a um aumento do limite prático de ionização para valores de massa na
ordem dos 150 a 200 kDa, com uma elevada eficiência de ionização. A ionização por ESI é
sensível à concentração do analito, mas não à quantidade de amostra que é introduzida na
fonte e o facto de se ter um fluxo baixo, há um aumento na sensibilidade, pois aumenta a
concentração do analito no solvente de eluição. [12-14]
Os analitos a ser introduzidos em solução
devem estar diluídos em solventes orgânicos de baixo ponto de ebulição (como água, metanol
e acetonitrilo) e ser estáveis a baixas concentrações. [15
13
1.2.2.2 – Analisador de massa de armadilha quadrupolar (QIT)
O analisador de massa é o coração da espectrometria de massa, pois é responsável
pela separação dos iões de acordo com a sua razão m/z. [12]
Os analisadores de massa do tipo armadilha de iões (ion trap) podem ser de dois tipos,
armadilhas lineares ou 2D, e armadilhas quadrupolares ou 3D. Neste trabalho vamos dar
enfâse à armadilha quadrupolar ou tridimensional, que consiste em três elétrodos, o elétrodo
de entrada, um elétrodo hiperbólico (anel) e o elétrodo de saída, separados por separadores
de quartzo. Estes elétrodos juntos formam um campo elétrico hiperbólico onde é possível
armazenar os iões provenientes da amostra a analisar. Existe um buraco nos elétrodos de
entrada e saída, que permite aos iões entrar na armadilha, e sair para o detetor. O elétrodo
anel situa-se no meio dos dois elétrodos de entrada e saída[16-18]
como se pode observar na
figura 1.5.
Figura 1.5: Representação de um analisador do tipo armadilha de iões quadrupolar.
Os iões produzidos na fonte são transferidos pelo capilar de transferência para um
sistema de lentes que focaliza o feixe de iões no elétrodo de entrada da armadilha. Um
potencial de RF e ac constante é aplicado ao elétrodo de anel e vai formar um campo de
potencial quadrupolar 3-D dentro da armadilha. Este campo vai aprisionar os iões numa
trajetória oscilante e estável, sendo esta dependente do potencial aplicado e da razão m/z dos
iões. Durante a deteção, o potencial de RF aplicado aos elétrodos é aumentado, tornando a
trajetória dos iões instável, e estes vão sendo ejetados de acordo com a sua razão m/z na
direção do elétrodo de saída para o dínodo de conversão e depois para o multiplicador de iões.
[16]
Estes analisadores apresentam elevada sensibilidade, boa resolução e permitem a
realização de experiências de espectrometria de massa de multiestágios.
14
1.2.2.3 – Detetor
O detetor é responsável por converter o feixe de iões no sinal elétrico que depois é
processado pelo sistema de aquisição de dados, o computador.
O detetor mais utilizado no espectrómetro de massa com analisador QIT é o
multiplicador de electrões. Os iões são convertidos em eletrões através do dínodo sendo
depois esses eletrões direcionados para o multiplicador de eletrões. Esses eletrões ao
atingirem a superfície interna do multiplicador levam á geração de mais eletrões, isto porque o
multiplicador é curvo. O sinal dos electrões é recolhido e transferido para um amplificador que
está dentro do tubo de vácuo diretamente a seguir ao multiplicador, onde o sinal vai ser
aumentado exponencialmente, e finalmente transferido ao computador. [12,16]
Figura 1.6: Representação do multiplicador de electrões.
1.2.2.4 – Espectrometria de massa tandem MS/MS
Quando se deseja obter informação estrutural ou aumentar a selectividade de métodos
quantitativos por espectrometria de massa, a fragmentação passa a ser desejada.
Os ensaios de espectrometria de massa MS/MS podem ser concebidos de dois modos
distintos, isto é, pode ser efectuada em espaço, pelo acoplamento de dois analisadores
fisicamente diferentes, ou em tempo, pela realização de uma sequência de eventos no mesmo
dispositivo, isto é, ocorre em condições controladas dentro do próprio analisador.
Qualquer análise por espectrometria de massa tandem MS/MS envolve três etapas
distintas: seleção, fragmentação e análise de massa dos iões produto. A experiência consiste
em isolar um ião com uma determinada razão m/z, o ião percursor, fragmentá-lo por acção de
colisões energéticas com um gás inerte (hélio ou argon), e analisar e separar os iões produto
de acordo com a sua razão m/z. [19]
Numa armadilha de iões, o ião precursor é isolado, ocorrendo assim um aumento do
sinal. Este ião percursor é fragmentado em iões produto por dissociações induzidas por colisão
(CID), pois este vai colidir com átomos de hélio (gás inerte) introduzido na armadilha de iões.
Embora estas colisões envolvem pequenas energias, a energia cinética do ião vai aumentar a
vai ser transformada em energia interna vibrational, aumentando assim a orbita hiperbólica dos
iões, e levando a uma quebra das ligações químicas, isto é, ocorre a fragmentação do ião e a
formação dos iões produto. Se o ião tiver uma única carga, os iões formados vão possuir uma
razão m/z inferior ao ião percursor, mas no caso de iões multiplamente carregados os iões
produto podem ser observados em todo o intervalo de massa, isto é, podem se observar iões
produto com razões m/z superiores a razão m/z do ião precursor selecionado. [19]
15
Uma das vantagens das armadilhas de iões (IT e FTICR) é a possibilidade de realizar
múltiplas fragmentações (MSn)
dentro do mesmo analisador, tendo-se sequências separadas
em tempo. [12]
Podem-se efectuar vários processos de isolamento e fragmentação dos iões,
resultando numa série de espectros MSn, em que “n” representa o número de espectros obtidos
e (n-1) representa as vezes que o ciclo de isolamento e fragmentação foi realizado.[12]
O número máximo de passos (n) neste tipo de instrumentos é geralmente 7 ou 8,
apesar de teóricamente ir até 10 e a propagação de iões transmitidos ser elevada, mas em
cada passo a massa dos fragmentos torna-se cada vez mais baixa.
1.2.3 - LC-MS
A espectrometria de massa pode ser acoplada a outros métodos de análise, como a
cromatografia líquida (LC) e a cromatografia gasosa (GC), entre outros.
Neste trabalho será apenas apresentada a cromatografia líquida acoplada a
espectrometria de massa (LC-MS), que foi a técnica utilizada neste trabalho, dado ser
considerada uma técnica analítica adequada à análise de uma grande diversidade de
moléculas, misturas complexas e análise de isómeros.
O método de LC por si só, não consegue identificar todos os compostos numa mistura,
a não ser que se tenha uma análise dos padrões, mas mesmo assim existem compostos
diferentes que possuem o mesmo tempo de retenção, enquanto que a espectrometria de
massa não consegue separar os compostos numa mistura, mas uma vez estes separados, tem
a capacidade de os identificar. Logo o acoplamento destes dois métodos, permite separar,
identificar e quantificar os compostos numa mistura, devido à combinação das características
de cada um dos métodos.
Uma das maiores dificuldades nesta combinação foi a diferença entre as condições de
funcionamento da cromatografia líquida e da espectrometria de massa, dado que o fluxo da
fase móvel do cromatógrafo é elevado, e normalmente incompatível com o sistema com as
condições de vácuo do espectrómetro de massa (na ordem 10-3
a 10-6
Pa). Apresenta também
algumas limitações, como a velocidade de separação dos compostos, resolução do pico, o
tamanho do sistema e custo e na impossibilidade de detetar e resolver moléculas muito
grandes. [20]
Mas devido á descoberta das interfaces à pressão atmosférica (como ESI, APCI, entre
outras) passou a ser possível acoplar as duas técnicas. Mas existem alguns parâmetros que
afetam a estabilidade do spray como a tensão superficial, a constante dielétrica, a viscosidade,
a condutividade e a velocidade de fluxo do solvente. O spray possui estabilidade numa variada
gama de solventes (voláteis), mesmo com misturas complexas e com velocidades de fluxo
baixas, pois se o fluxo for elevado a amostra não consegue ser toda vaporizada e acaba por
condensar na fonte. Por isso, normalmente no LC-MS usa-se fluxos baixos e colunas pequenas
(15 cm) com um poro de 3 a 5 µm, para garantir uma determinada pressão no sistema e assim
ocorrer a separação da amostra e esta ser totalmente ionizada na fonte de electrospray. [20]
16
Em determinadas situações a informação obtida por LC-MS, nomeadamente os tempos
de retenção e a informação retirada do espectro de massa são insuficientes para identificar
todos os componentes presentes na amostra, sendo necessário obter mais informação sobre a
molécula alvo, que não é possível por uma simples análise de massa. Recorre-se por isso a
ensaios LC/MS/MS, podendo assim estimar-se a estrutura dos iões produto formados e
analisar os intervalos de massa isotópica dos iões produzidos se for o caso disso.[20]
Hoje em dia, a técnica de LC-MS á aplicada a análise de amostras provenientes de
áreas muito diversas, como amostras ambientais, polímeros sintéticos, produtos farmacêuticos
(medicamentos e seus metabolitos), amostras de artefactos históricos e produtos naturais,
permitindo obter tanto informação qualitativa como quantitativa. Em síntese, é usado para
análise de qualquer mistura de compostos complexos, em que o HPLC é a técnica escolhida
para a separação e o espectrómetro de massa fornece a seletividade e sensibilidade para dar
informações qualitativas ou estruturais que não podem ser obtidas por outros detetores.
Capítulo II
Parte Experimental
18
Neste capítulo estão descritos os reagentes utilizados na realização do trabalho, bem
como a instrumentação usada e as condições experimentais aplicadas para o método
aplicado.
2.1 – Reagentes
Os reagentes utilizados foram de elevada pureza, sendo o ácido oxálico e o TFA
preparados para uma concentração mais baixa (0.2M e 2M, respetivamente), os restantes
foram utilizados sem nenhum tratamento prévio.
Tabela 2.1: Reagentes utilizados e suas características.
Fórmula
Molecular
Massa
Molecular
Marca Grau de
Pureza
Frases de
risco
Frases de
segurança
Metanol
CH3OH
31.99
Fisher
Scientific
99.9%
11-
23/24/25-
39
7-16-
36/37-45
Acetonitrilo
CH3CN
41.00
Fisher
Scientific
99.9%
11-
20/21/22-
36
16-36/37
Ácido
Fórmico
CH2O2 46.03 Agros
Organics
98% 10//35 23/26/45
Ácido
oxálico
anidro
C2H2O4
90.03
BDH
98%
21/22
24/25
Ácido
clorídrico
HCl
36.46
Carlo Erba
37%
35-
36/37/38
1/2-9-23-
26-36/37-
39-45-60
Acetona C3H6O 58.08 Sigma
Aldrich
99.8% 11-36-66-
67
9-16-26-46
TFA CCl3COOH 163.4 Alfa Aesar 99% 35 1/2-26-
36/37/39-
45-60-61
19
2.2 - Equipamento e Material
- Balança analítica – Mettler AT 201 (±0.00001g).
- Banho de ultra-sons – Bandelin Sonorex.
- Aparelho de filtração de solventes – Millipore equipado com filtros de membrana de acetato
de celulose de 0.20 µm.
- Aparelho de purificação de água – Millipore de Simplicity Simpak 2, R=18MΩ, USA.
- Placa de aquecimento e agitação – VWR Advance; VMS – C4.
- Material volumétrico de classe A.
- Material de vidro diverso.
2.3 - Preparação de soluções
2.3.1 – Solução 0.2 M de ácido oxálico
Pesou-se uma pequena quantidade de ácido oxálico anidro (0.45008g) e dissolveu-se
para um balão volumétrico de 25 mL, perfazendo o seu volume com água desionizada.
2.3.2 – Solução de TFA 2M
Para preparar 10 mL de solução de TFA 2M retirou-se 1.5 mL de TFA e perfez-se o
volume com água ultra-pura (Millipore).
2.4 - Amostras e métodos de extração
2.4.1 – Amostras Têxteis
As fibras de têxteis com interesse histórico foram obtidas a partir de amostras que
integram um artigo publicado por R. E. de Rose “Growth of the Dyestuffs Industry: The
Application of Science to Art”, Journal of Chemical Education, 1926, 3: 9, 973-1007,
pertencente à Biblioteca do Departamento de Química da Universidade de Coimbra.
Diferentes tipos de extração foram efetuadas nas fibras antes da análise por HPLC-
DAD-MSn: a) CH3OH:H2O (1:1 v/v); b) HCl (37%) / CH3OH - 300µL de metanol e uma gota de
HCl; c) TFA (2M). Para cada família efetuou-se um método de extração diferente, para quebrar
as ligações corante-fibra. Uma pequena amostra de fibra foi extraída com 100 µl da solução de
extração escolhida em eppendorfs de 1.5 mL durante 30 min, a 60˚C num banho de água com
agitação constante. Depois da extração, cada solução de extrato foi seca num sistema de
vácuo, e os resíduos sólidos restantes foram reconstituídos com 50 µL CH3OH/H2O (4:1, v/v )
antes da análise por HPLC-DAD-MS, exceto as amostras que foram extraídas com CH3OH:H2O
(1:1 v/v) que foram injetadas diretamente.
20
2.4.2 – Amostras Históricas
As amostras históricas de sais mauveína foram cedidas pelo: Museu da Ciência,
Londres (UK) (ScM 1-4), Museu da Ciência e Indústria, Manchester (UK) (MS1M1,2), Museu
Chandler, Chandler, Arizona (USA) (CM); Museu Deutsches, Munique (Alemanha) (DM –
Caro; esta amostra é conhecida por ter sido sintetizada por Heinrich Caro).
As soluções padrão das amostras históricas (0.15 mg) foram preparadas em metanol e
alíquotas de cada solução foram dissolvidas em CH3OH /H2O (4:1) e analisadas por HPLC-
DAD-MS/MS.
A malva é constituída por cromóforos, a “pseudo mauveína” e “mauveína” A, B, C, que
está presente em várias proporções dependendo do método de síntese.
Foram preparadas soluções metanólicas de fuchsina (CI 42510, violeta de Hofmann's),
violeta de metilo (CI 42535) e violeta de cristal (CI 42555) a partir do corante em pó. Foi
também preparado um extrato de cochonilha em água a partir de amostras de insetos Kerrie
spp. Todas as soluções foram analisados por HPLC-DAD-MS/MS.
2.4.3 – Selos Postais
A maioria dos selos postais foram obtidos a partir da firma Arthur Ryan & Co. Richmond
(UK). Alguns exemplares Penny Lilacs foram adquiridos na Net COLLECTOR Philatelic
Heritage, Haverfordwest (UK). Os selos foram convenientemente identificados usando a sua
Stanley Gibbons, (SG), número de catálogo. Uma pequena amostra de selo (cerca 1-2mg) foi
extraída com uma solução de 100µL de 0.2M ácido oxálico/CH3OH/Acetona/H2O (1:3:3:4,
v/v/v/v) em eppendorfs de 1.5mL durante 30min, a 60˚C num banho de água com agitação
constante. Depois da extração, cada solução de extrato foi seca num sistema de vácuo, e os
resíduos sólidos restantes foram reconstituídos com 50µL CH3OH/H2O (4:1, v/v ) antes da
análise por HPLC-DAD-MS.
2.5 – Condições de análise
2.5.1 – HPLC-DAD-MSn
As análises do corante extraído das fibras e dos selos foram realizados num sistema
LC-MS constituído por um amostrador automático ProStar 410, duas bombas cromatográficas
210-LC, num detetor de matriz de díodos ProStar335 e um espectrómetro de massa com
armadilha de iões 500-MS, equipado com uma fonte de iões ESI ( Varian, Inc., Palo Alto, CA,
EUA). A aquisição e processamento de dados foi realizada utilizando o software Varian MS
Control 6.9.6. Uma amostra (20 µL) foi injetada na coluna através de um injetor Rheodyne com
um loop de 100 µL, no modo de injeção µL pickup. As separações foram realizadas a
temperatura controlada de 30 ˚C, usando uma coluna Polaris C18 A (150mm x 2mm, 5µm;
Varian). A fase móvel consiste em 0.8% (v/v) ácido fórmico em água (A) e metanol (B).
O seguinte gradiente foi utilizado para a análise das amostras: 0-2 min isocrático 15%
B, 2-8 min linear 50% B, 8-25 min linear 75% B, 25-30 min linear 90% B e 30-40 min isocrático
21
15% B, a um fluxo de 200 µLmin-1
. Os picos cromatográficos foram monitorizados a diferentes
comprimentos de onda nas amostras retiradas do JCE, devido a variedade de cores
apresentadas na zona do visível; as amostras históricas e os selos postais foram monitorizados
a 550 nm.
Dependendo do tipo de corante, assim foi usada ionização ESI em modo positivo ou
negativo. Os parâmetros instrumentais foram otimizados para a amostra ScM1: voltagem do
spray de ionização ±5.0 kV, voltagem do capilar, 20 V e RF, 80%. O azoto foi utilizado como
gás de nebulização e secagem, nas pressões de 50 psi e 31 psi, respetivamente, a
temperatura do gás de secagem foi de 350 ˚C. O espectro de MS/MS foram obtidos com uma
janela de isolamento de 2 Da, os valores de energia de excitação variaram entre 0.9 a 3.4 V e o
tempo de excitação de 10 ms.
Capítulo III
Apresentação, tratamento de discussão dos resultados
23
Neste capítulo são apresentados os resultados HPLC-DAD-MS e HPLC-DAD-MSn dos
ensaios dos extratos das fibras retiradas das amostras do Journal Chemical Education [3]
, das
amostras históricas de sais de malva provenientes de vários Museus e das amostras dos selos
postais ingleses que cobrem o período 1847-1901 e apresentam, em comum, uma cor púrpura.
3.1 – Amostras do Journal Chemical Education[3]
Os corantes foram agrupados por famílias e a extração efetuada também de acordo
com a família. De facto verificou-se necessário utilizar métodos diferentes de extração, pois
nem sempre o método de extração empregue era o mais adequado para extrair, isto é retirar o
corante de fibra. Cada tipo de corante estabelece uma ligação única com a fibra na qual está
aplicado, e quanto mais forte for a ligação corante-fibra, mais difícil é quebrar estas ligações,
logo é necessário usar métodos de extração mais agressivos.
Para a família dos corantes nitro, azo (monoazo e diazo) e metano (difenil e triaril)
utilizou-se o método de extração com MeOH:H2O (1:1, v/v). A solução obtida foi centrifugada e
diretamente analisada por LC-MS, sem ser necessário efetuar secagem. Na família dos
corantes xanteno e azina utilizou-se o método de extração mais agressivo, com 300 µL de
metanol e uma gota de ácido clorídrico; na família dos corantes antraquinona a extração foi
efetuada com uma solução de TFA 2 M. As soluções obtidas com as duas últimas extrações
foram levadas à secura, em linhas de vácuo, e reconstituídas como descrito na parte
experimental.
Os corantes estudados possuem caraterísticas diferentes, dado pertencerem a famílias
diferentes e possuírem na sua estrutura diferentes grupos funcionais. Todos os extratos
analisados foram eficientemente separados com um gradiente binário constituído por água
acidulada 0.8% de ácido fórmico e metanol. A análise por HPLC foi efetuada ao comprimento
de onda de absorção máxima para cada corante, na região do UV-visível, e a análise de massa
foi realizada em modo negativo (molécula com capacidade de doar protões) e em modo
positivo (molécula com capacidade de aceitar protões).
3.1.1 - Corantes nitro
O cromatograma HPLC-DAD-MS do extrato de ácido pícrico mostrou um pico a
tr= 13.01 min, e um máximo de absorção a um comprimento de onda de 359 nm (região do UV-
vis amarela). O espectro de ESI-MS em modo negativo deste corante nitro exibe um ião a
m/z 228 atribuído á molécula desprotonada [M-H]-.
O ião precursor m/z 228 foi isolado e traçado o espectro MS/MS. O ácido pícrico
apresenta um padrão de fragmentação característico da presença do grupo nitro [2]
: perda de
NO e NO2 que originam, respetivamente, iões a m/z 198 e 182. Observa-se ainda uma
clivagem associada com a presença do grupo nitro e hidroxilo na molécula, que leva à
formação do ião m/z 154, atribuído à perda consecutiva de NO2 e CO. Na figura 3.1
apresenta-se o espectro MS2
bem como a proposta de fragmentação para o ácido pícrico.
24
O-
N+
O
O-
N+
-O O
N+
O-
O
O-
N+
O
O-N+
O-
O
O•
C•
O-
N+
O
O-N+
O-
O
C•
N+
O-
O-N+
O
m/z 228
m/z 182m/z 198
m/z 154
- (NO.)- (NO
2
.)
- (CO+ NO2 )
Figura 3.1: Esquema de fragmentação proposto e espectro de massa MS2 do ácido pícrico.
3.1.2 - Corantes Azo (monoazo e diazo)
Foram analisados sete corantes azo (Tabela 1, anexo) entre os quais existem dois
isómeros estruturais, o amaranto e o vermelho cochenilha A. Nos cromatogramas HPLC-DAD
estes corantes foram detetados a tempos de retenção de 7.05 min e 8.13 min, respetivamente.
Como se pode ver pela tabela 1, em anexo, os corantes azo estudados apresentam tempos de
retenção muito distintos desde 7.05 min (amaranto) até 25.14 min (Fast Red A). Como os
compostos têm estruturas moleculares diversas, a sua afinidade para a coluna vai ser
diferente; os compostos com tempo de retenção mais longo são os que têm maior afinidade
com a coluna e vice-versa.
Os corantes azo estão, normalmente, na forma de sal (sódio), e devido à sua
instabilidade estão dissociados em iões RSO3- e Na
+. A maioria destes corantes possui mais do
que um grupo sulfónico na sua estrutura molecular, e o espectro de ESI-MS em modo negativo
exibe iões típicos do tipo [M+(x+y)H-yNa]x-.
[22]
Os corantes monoazo, como o alaranjado II (Orange II) e Crocein Scarlet, apresentam
no espectro ESI-MS um ião correspondente a [M-Na]-, os di-sulfonados como o vermelho
25
Congo mostram picos a [M-2Na+H]-, e os tri-sulfonados, como o vermelho cochenilha A e o
amaranto apresentam iões correspondentes a [M-3Na+2H]- (ver tabela 1 em anexo). Este tipo
de corantes contêm na estrutura vários átomos de azoto, e o valor m/z a que aparecem estes
picos pode dar informação acerca do número de átomos de azoto presentes na sua estrutura.
Nos elementos encontrados nos compostos orgânicos, existe uma correspondência
entre os elementos de massa isotópica mais abundante e a sua valência, pois ou são ambos
numerados pares ou ambos numerados ímpares, sendo o azoto a única exceção. De acordo
com a regra do azoto [21]
, um composto que contenha um número par de átomos de azoto ou
nenhum azoto na sua estrutura, o ião molecular (OE+.) aparecerá a um valor m/z par de massa
molecular. Se o composto tem um número ímpar de átomos de azoto, o ião molecular terá um
número ímpar de massa molecular. No caso de moléculas ionizadas por ESI a regra inverte
dado que se formam espécies (EE+). Quando estes iões são dissociados, ocorre também a
formação de iões produto (EE+) com perda de uma molécula neutra.
Os compostos azo apresentam fragmentações características nos espectros ESI-MS2,
nomeadamente iões produto correspondentes à perda dos grupos sulfónicos (-SO2 e/ou SO3) a
partir de [M+(x+y)H-yNa]x-. Estes azo-compostos contêm na sua estrutura o grupo funcional
R-NN-R’, em que R e R´ são normalmente grupos alquilo, podendo ocorrer um equilíbrio
entre a forma hidrazona e a forma azo, como exemplificado na figura 3.2. [2]
Assim, a
dissociação do ião precursor pode envolver quebra da ligação NH-N ou da ligação C-N. Estes
processos de fragmentação levam, normalmente, à formação de iões produto radicalares, isto
é, há formação de espécies OE+., e consequentemente há inversão da regra do azoto.
Figura 3.2: Padrões de fragmentação dos compostos azo através da ligação –N=N-.
A análise MSn foi fundamental na caracterização molecular dos corantes, pois permitiu
uma caraterização específica para cada um, como no caso dos dois isómeros azo analisados,
que apresentaram tempos de retenção muito próximos, espectros de UV-visível similares, e no
espectro de full scan (MS) ambos os corantes apresentaram um pico base a m/z 537 atribuído
à espécie [M-3Na+2H]-.
A análise de massa tandem (MS/MS) revelou distintos padrões de fragmentação para
cada um dos corantes. O espectro de massa MS2
do vermelho cochonilha A, apresentou o ião
a m/z 509 como pico base do espectro, porque há a possibilidade de saída de CO e/ou N2.
26
Só por ensaios de massa exacta, é que de facto é possível comprovar se ocorrem as duas
fragmentações e qual é a mais favorável. Os iões a m/z 473, 457, 429 formados,
respetivamente, por perda de SO2, SO3, SO3+N2 e dois iões produto radicalares, m/z 376 e 302
que correspondem, respetivamente à perda SO3+SO3H•
e C10H7N2O3S•. Na figura 3.3
apresenta-se o espectro MS2 da cochonilha bem como a proposta de fragmentação.
S
HO
O
O N
N
S
S O-O
OOHO
HO
O
N
N
S
S O-O
OOHO
O
O
m/z 457
HO N
N
S
S O-O
OOHO
O
O
m/z 473
N
N
C
S O-O
O
O
m/z 376
S
O
HO
O
HO
S
S
O
OH
O
O-O
O
O
S
S
O
OH
O
O-O
O
m/z 509
m/z 429
- (S
O2)
- (SO3)
- (SO3+N2
)
- (SO
3 H+S
O3 )
- (N
2 o
u C
O)
C
S
S O-O
OOHO
HO
O
m/z 302
- (C
10H
7N
2O
3S
)
m/z 537
OU
S
HO
O
O NH
N
S
S O-O
OOHO
O
m/z 509
Figura 3.3: Espectro de massa MS2 do vermelho cochonilha A e respectiva proposta de
fragmentação.
O ião precursor m/z 537 gerado a partir do amaranto originou no espectro MS2 (figura
3.4) produtos a m/z 519, 509, 473, 457, 429, 317, 302 e 234 atribuídos, respetivamente, à
perda de H2O, N2, SO2, SO3, N2+SO3, C10H6NO3S•, C10H7N2O3S
• e C10H7O7S2
•,de acordo com o
proposto no esquema da figura 3.4.
27
N N
HO
HO3S
SO3H
S
O
O
O-
317473
457
519
234
302 - (H2O)
- (SO3)
- (SO2)
- (C10H6NO3S )
- (C10H7N2O3S )
- (C10H7O7S2)
509
- (N2)
Figura 3.4: Espectro de massa MS2 e esquema de fragmentação proposto para o amaranto.
Os espectros de massa MS2 de ambos os corantes apresentam fragmentos idênticos,
embora com intensidade relativa diferente, exceto, no caso do ião m/z 519 que só é observado
no espectro do amaranto, e foi atribuído à perda de uma molécula de H2O. Com efeito, o
amaranto possui um grupo funcional –SO3H na posição adjacente ao grupo hidroxilo, havendo
assim a possibilidade de abstração de um protão e saída de uma molécula de H2O e impede a
saída de CO.
A crisoidina foi o único corante azo, desta série, analisado em modo positivo devido a
ausência de grupos sulfónicos e à presença de grupos amina na sua estrutura. O espectro
ESI-MS em modo positivo exibiu um pico a m/z 213 correspondente à molécula protonada
[M+H]+. No espectro MS/MS observaram-se quatro iões fragmentos a m/z 196, 185, 168 e 121
que correspondem à perda de NH3 (amónia), N2 (azoto), N2+NH3 e C6H6N•, respetivamente. A
perda de C6H6N• ocorre por clivagem da ligação N=N.
O vermelho Congo e o Crocein Scarlet são ambos corantes diazo, pois possuem duas
ligações N=N, sendo o primeiro conhecido como corante direto.
O espectro ESI-MS em modo negativo, do vermelho Congo exibe como pico base a
m/z 651 o ião [M-2Na+H]-. O espectro MS
2 exibe iões produto característicos da família azo,
nomeadamente, iões a m/z 623, 587, 571, 543, 416 e 235 correspondentes à perda de N2, SO2,
SO3, N2+SO3, C10H7N2O3S• e C12H16N4O3S, respetivamente.
O Crocein Scarlet apresentou no espectro ESI(-)/MS um pico base a m/z 511 atribuído
ao ião [M-2Na+H]-. Este ião precursor foi isolado e sujeito a CID originando iões a m/z 483,
431, 403 302 correspondentes à perda de N2, SO3, N2+SO3 e C12H9N4•, respetivamente, como
se pode observar no espectro de massa MS2 e proposta de fragmentação apresentados na
figura 3.5.
28
N N
HO
N
SO3-
HO3S
N N N
O
SO3-
HO3S
- (N2)
N N
O
N
-O3S
N
- (S
O3)
N N
O
-O3S
- (N 2
+SO 3)
C
O
SO3-
HO3S
- (C12 H
9 N4 )
m/z 483
m/z 302
m/z 431
m/z 403
Figura 3.5: Esquema de fragmentação proposto e espectro de massa MS2 da Crocein Scarlet.
Como se pode verificar pela tabela 1 em anexo todos os corantes azo apresentam
fragmentos formados por perda de N2; e aqueles que possuem grupos sulfato perdem SO3 e
em alguns casos verifica-se a perda de SO2, tal como a clivagem da ligação azo (N=N) que é
caraterística deste tipo de compostos.
3.1.3 - Corantes Metano (Triaril e difenil)
Os corantes triarilmetano e difenilmetano (Tabela 1, anexo) são usualmente misturas,
de que é exemplo o metilo violeta. As condições cromatográficas escolhidas separaram
eficientemente os vários cromóforos, permitindo a sua identificação e caracterização estrutural.
Os cromóforos que possuem um maior número de grupos metilo como o metil violeta e cristal
violeta revelam uma maior afinidade com a fase orgânica (MeOH) e foram eluídos a tempos de
retenção elevados (tr=20.87 min e tr=20.55 min, respetivamente).
Os corantes metano são, usualmente, produzidos na forma de cloretos de triarilmetano
e difenilmetano, por isso em solução encontram-se dissociados e são analisados em modo
positivo, se na sua estrutura estiverem presentes grupos metilo, mas outros, são analisados em
modo negativo devido à presença de sais sulfato na sua estrutura. Em modo positivo os
29
corantes metano exibem um catião molecular [M]+
como pico base, enquanto que em modo
negativo é identificado um pico correspondente ao ião [M-2Na]-.
A auramina, o único corante difenilmetano analisado, apresenta em modo ESI positivo
um catião a m/z 268 ([M]+), que origina iões fragmento observados a m/z 253, 148, 122 e 107,
atribuídos à perda de •CH3, C8H10N
•, C9H10N2 e C10H13N2
, respetivamente, como se pode
observar pelo esquema de fragmentação proposto e espectro de massa MS2 da figura 3.6
Figura 3.6: Espectro de massa MS2 e esquema de fragmentação proposto da auramina.
Os corantes trifenilmetanos Patent blue V, Patent blue A, Light green SF yellowish,
Formilo violeta S4B e Guinea Green, foram analisados em modo ESI negativo devido à
presença de grupos sulfónicos na sua estrutura. O espectro massa exibe um ião [M-2Na]-,
caraterístico deste tipo de corantes.
O espectro de massa do Patent blue V apresentou um ião a m/z 559 ([M-2Na]-), que no
espectro MS2 mostrou apenas o fragmento m/z 479 formado por perda de SO3. Este ião
produto foi isolado e fragmentado e, no espectro MS3
foram identificados os iões fragmento
m/z 451, 435 e 399 formados por perda de C2H2 ou CO, C2H4+CH4 e SO3, respetivamente.
Com o objetivo de obter mais informação estrutural, procedeu-se ao ensaio MS4 do ião produto
m/z 435 que originou fragmentos a m/z 391, 355 e 311 que correspondem à perda de CO+CH4,
SO3 e SO3+CO+CH4, respetivamente. Na figura 3.7 apresenta-se os espectros de iões
30
fragmento MS2, MS
3 e MS
4 bem como uma proposta de fragmentação para o Patent
Blue V.
31
Figura 3.7: Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MSn
(n=2-4) do Patent
Blue V.
O Patent blue A, que apresenta na sua estrutura grupos fenilo, apresentou um ião a
m/z 683 ([M-2Na]-) no espectro de full scan, e iões fragmento MS
2 a m/z 603 resultante da
perda de SO3, e m/z 577, 512 e 497 resultantes das perdas conjugadas de SO3+C2H2,
SO3+C7H7 e SO3+
C7H7+CH3, respetivamente.
O espectro de massa do corante Light Green SF Yellowish (figura 3.8), apresentou dois
picos, um pico pouco intenso a m/z 769 correspondente ao ião mono carregado [M-2Na]-, e um
pico mais intenso (pico base do espectro) a m/z 373, que com base na distribuição isotópica foi
atribuído à espécie duplamente carregada [M-3Na]2-
. Como já foi referido anteriormente na
ionização por ESI há a possibilidade de formar iões multicarregados, desde que a molécula
tenha local para adquirir duas ou mais cargas, como se verifica neste caso.
Figura 3.8: Espectro MS do Light Green SF Yellowish.
O espectro MS2 do ião m/z 769 apresentou a perda característica de 64 u (-SO2) com
formação do fragmento ião a m/z 705, que se fragmentou posteriormente com formação do ião
m/z 511 por perda de C7H7SO3Na. No último estágio dos ensaios de fragmentação (MS4),
isolou-se o produto m/z 511 e obtiveram-se fragmentos com m/z 484, 469, 261 e 170
resultantes, respetivamente, da perda de •C2H3, C2H4N
•, C15H13NO+
•C2H3 e C15H13NO+C8H8N
•.
32
Na figura 3.9 apresenta-se o esquema de fragmentação proposto e os espectros de MS2, MS
3
e MS4 deste composto.
Figura 3.9: Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MS2, MS
3 e MS
4 do ião
mono carregado do Light Green SF Yellowish.
Procedeu-se também ao estudo da fragmentação da espécie duplamente carregada
m/z 373. No espectro MS2, este ião mostrou apenas um fragmento resultante da perda de uma
molécula de SO2 que foi atribuído a um ião produto duplamente carregado detetado a m/z 341.
33
Este ião deu origem a iões fragmento mono carregados: um par de iões a m/z 512 e 170
associados à clivagem da ligação N-C; dois produtos a m/z 479 e 170 correspondentes à perda
de •CH3. O ião a m/z 479 foi isolado e fragmentado e deu origem aos fragmentos m/z 453, 427
e 170 formados por perda do radical C2H6N•, C7H6SO3 e C22H19N2O
•, respetivamente, de
acordo com o esquema de fragmentação proposto e espectros MS2, MS
3, e MS
4 apresentados
na figura 3.10.
Figura 3.10: Esquema de fragmentação proposto e espectros de massa MS
2, MS
3 e MS
4 do
ião duplamente carregado do Light Green SF Yellowish.
34
Com base na fórmula molecular C41H44N3NaO6S2 (MM= 761,93 gmol-1) descrita no JCE
para o corante Formilo Violeta S4B era esperado, no espectro ESI(-)/MS, um pico a m/z 738
correspondente ao ião [M-Na]-. No cromatograma HPLC-DAD-MS do extrato Formilo Violeta
S4B traçado a = 550 nm e adquirido no modo ESI negativo identificou-se apenas um pico a
tr=16.12 min, que no espectro de massa mostrou um ião a m/z 682, que foi atribuído a um ião
[(M-Na-(C2H4)2]-, com base em ensaios MS/MS. O espectro MS
2 (figura 3.11) do ião precursor
m/z 682 apresentou iões produto a m/z 668, 651, 602, 561 e 510 correspondentes à perda de
•CH3, CH3NH2, SO3, C2H4+C6H7N e C7H8SO3, respetivamente, conforme se apresenta no
esquema de fragmentação da figura 3.11. Estes resultados indicam que o corante usado no
tingimento da amostra de tecido do JCE não corresponde ao Formilo Violeta S4B, mas sim a
um composto com uma estrutura e tonalidade semelhante.
35
Figura 3.11: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 do Formilo Violeta S4B.
De acordo com o descrito no JCE, o corante Guinea Green tem uma fórmula molecular
C37H35N2NaO6S2 a que corresponde uma MM= 690,80 gmol-1
, sendo esperado no espectro
ESI(-)/MS um ião a m/z 667 ([M-Na]-). Contudo, o cromatograma HPLC-DAD-MS do extrato da
fibra do livro, mostrou um pico maioritário a tr=12,85 min, e um pequeno pico a tr=12,11 min, a
que correspondem a iões com m/z 571 e 543, respetivamente. Foram traçados os espectros de
MS/MS destes iões, mas os resultados obtidos não foram conclusivos, e não foi possível
propor uma estrutura para o corante usado no tingimento da fibra.
O metil violeta é composto por vários cromóforos eluídos com diferentes tempos de
retenção. O espectro de ESI exibe o catião molecular [M]+ para cada um dos crómoforos (iões
com m/z 330, tr=16.64 min (cromóforo 1), m/z 344, tr=18.09 min (cromóforo 2), m/z 354,
tr=19.53 min (cromóforo 3) e m/z 372, tr= 20.87 min (cromóforo 4). Os iões fragmento típicos
são a perda dos grupos metilo, fragmento m/z 315 para o crómoforo 1, e no caso do crómoforo
3, observa-se também a perda do anel aromático com um grupo amina (ião m/z 251). O
cromóforo 4 que corresponde ao composto completamente metilado do metil violeta tem a
mesma estrutura molecular do cristal violeta. Mas o seu espectro de MS2 mostra um padrão
diferente de fragmentação; o cristal violeta possui um fragmento com m/z 328, que
corresponde à perda de C2H5N que o metil violeta não possui na fragmentação do seu
crómoforo 4.
3.1.4 - Corantes Azina e Xanteno
Foram analisados três corantes desta família: a malva, a safranina T e a rodamina B,
conforme se mostra na Tabela 1, anexo
Os corantes azina existem na forma de sal de cloreto, logo no espectro de ESI-MS em
modo positivo observa-se como pico característico, o catião molecular [M]+ ou [M-Cl]
+.
O espectro em modo positivo ESI-MS para a safranina T apresenta o catião molecular
[M-Cl]+
a m/z 315, e dado conter na sua estrutura grupos amina e metil, apresenta iões
fragmento caraterísticos a m/z 300, 299 e 298 formados por perda de CH3, CH4, NH3,
respetivamente. O ião radical m/z 238 resulta da perda do anel aromático C6H5, presente na
36
estrutura molecular, como se pode observar pelo esquema de fragmentação e o espectro de
massa MS2 na figura 3.12.
N
N
H2N NH2
CH3H3C
N
N
CH3C
NH2H2NN
N
H3C CH3
NH2H2N
N
N
H2C
NHH2N m/z 300
m/z 299
- ( CH3 )
- (CH
4 )
- ( C
6H6)
m/z 238 N
N
HN
CH2H3C
- (N
H 3)
m/z 298
Figura 3.12: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 da safranina T.
O corante malva é uma mistura complexa de vários cromóforos (a mauveína), contendo
todos o núcleo 7-amino-5-fenil-3-(fenilamino)-fenazina-5-ium com diferentes números de
grupos metilo na sua estrutura molecular. O corante malva extraído da fibra do JCE, foi
analisado por LC-MS e detetou-se a presença de 5 cromóforos, dois dos quais não estão
descritos na literatura, respetivamente, iões m/z 509 e 523 a tr=13.14 13.51 min, não sendo
possível caraterizá-los. Os outros três cromóforos são descritos na literatura [6]
e foi possível
atribuir o pico 1 à pseudo mauveína ([M]+, m/z 363), pico 2 – mauveína C25a e C25b ([M]
+, m/z
377) e pico 3 – mauveína A ([M]+, m/z 391) (ver tabela 1 em anexo).
Estes três cromóforos têm padrões de fragmentação característicos, como se pode
verificar pela tabela 1 em anexo. O ião precursor m/z 363, pseudo-mauveína (C24H19N4)+,
apresenta iões fragmentos a m/z 336, 285 e 270 que correspondem à perda de HCN, C6H6 e
C6H7N, respetivamente. O ião m/z 377 conhecido como mauveína C25a (C25H21N4)+, possui
como fragmentos os iões m/z 362, 361, 360, 299, 285 e 284, formados por perda de CH3, CH4,
NH3, C6H6, C6H5N e C6H6N respetivamente. Este é o cromóforo maioritário, sendo o de maior
37
contribuição para a cor total do corante malva usado para tingir a amostra do JCE. O ião m/z
391 atribuído à mauveína A (C26H23N4)+, apresenta como principais fragmentos os iões m/z
376, 375, 374 formados por perda de CH3, CH4 e NH3, o ião m/z 313 correspondente à perda
de C6H6 e os iões m/z 285 e 284 resultantes da perda do radical C7H8N e do neutro C7H9N,
respetivamente.
Um extrato da fibra da rodamina B foi também analisado por HPLC-DAD-MS. Este
corante de cor característica vermelho azulado possui um catião molecular [M]+ a m/z 443; a
análise dos iões fragmento MS2 exibe o efeito dos grupos etilo pela típica perda de C2H5 (ião
m/z 413), perda de CO2 (ião m/z 399) também caraterística deste tipo de corantes, devido à
presença de grupos carboxílico na sua estrutura, e perda de C4H6+C2H4 que origina o
fragmento m/z 385, de acordo com o publicado na literatura [2]
, e como se pode observar pela
figura 3.13 onde se apresenta o esquema de fragmentação e o espectro MS2 deste corante.
Figura 3.13: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 da rodamina B.
3.1.5 - Corantes antraquinona
O vermelho Turquia é um corante que pertence á família das antraquinonas e na sua
estrutura observa-se a presença de grupos hidroxilo e carbonilo. Na análise por LC-MS verifica-
se que o tempo de retenção é elevado (tr=17.10 min), o que nos leva a dizer que o composto é
pouco polar, apesar da presença dos grupos hidroxilo, o que se pode dever à presença dos
grupos carbonilo que tornam a molécula menos polar.
Verifica-se também que o vermelho Turquia possui o ião percursor [M-H]- com m/z 239.
No espectro ESI-MS/MS, dado a presença dos grupos carbonilo, observa-se a perda de CO
(28u) e CO+CO (56u), que levam aos iões produto m/z 221 e 183, respetivamente. Na figura
3.14 apresenta-se o esquema de fragmentação e o espectro de massa MS2.
ON
COOH
N
CH3
H3CCH3
CH3
- (C 2
H 6)
399
- (CO2)
413
385
- (C2H6+C2H4)
38
Figura 3.14: Esquema de fragmentação e espectro de massa MS2 do vermelho Turquia.
O-
O
O
O
211
- (CO)
183
- (CO+CO)
39
3.2 – Identificação de mauveínas em selos Penny Lilac (1867 – 1901)
A descoberta da malva por Perkin, a história da sua manufatura e utilização tem sido
objeto de vários estudos históricos.[8]
A aplicação da malva na estampagem de selos foi
sempre objeto de controvérsia, pois se há referências [5]
de que a malva preparada por Perkin
foi usada na impressão de selos durante o período de 1856-1877, há outros autores que
defendem que os selos cor lilás desse período foram impressos com outros corantes,
nomeadamente com violetas de Hoffmann, outros corantes também descobertos nessa época,
e ou cochenilha. [8]
O objetivo deste trabalho foi comprovar que há selos penny lilac impressos na Grã-
Bretanha no período 1856-1877 que foram realmente impressos com malva preparada por
Perkin. Para isso, analisaram-se por HPLC-DAD-MS/MS várias amostras históricas de sais de
mauveína cujos resultados foram comparados com os resultados obtidos na análise de cerca
de 35 selos penny lilac.
3.2.1 – Caraterização das amostras históricas de sais de mauveína
Neste trabalho foram analisadas oito amostras históricas de sais de mauveína: quatro
provenientes do Museu da Ciência, Londres (UK) (ScM1-4), duas pertencentes ao Museu da
Ciência e Indústria, Manchester (UK) (MS1M1,2), uma do Museu Chandler, Chandler Arizona
(USA) (CM) e uma amostra cedida pelo Museu Deutsches, Munique (Alemanha) (DM-Caro).
Estas amostras datam de um período entre 1857-1881 e detalhes sobre a sua proveniência
estão descritos na tabela 2 em anexo.
As soluções das amostras preparadas como descrito na parte experimental foram
analisadas por HPLC-DAD-MS2, e monitorizadas ao comprimento de onda (λ) de 550 nm.
Como se pode observar pelos cromatogramas da figura 3.15 as amostras ScM1, ScM2, ScM3,
ScM4, MS1M1 e CM apresentam um perfil cromatográfico semelhante, apresentando picos
maioritários a Tr=17.9 min e 22.10 min, que foram atribuídos à mauveína A (C26) e mauveína B
(C27). Os picos minoritários que eluem a Tr = 16.1 e 19.0 min correspondem à mauveína C25
(C25a+C25b+C25c); os picos a Tr = 15.1, 19.7 e 20.7 min a vários isómeros da mauveína B C27
(B2+B3+B4), os picos a Tr = 22.9 e 23.1 min aos isómeros (C+C1) da mauveína C28 e o pico a
Tr = 24 min foi atribuído à mauveína D. A atribuição dos picos foi feita com base nos dados
MS/MS e por comparação com dados da literatura.[6]
A intensidade relativa entre os vários
cromóforos difere de amostra para amostra, havendo contudo algumas amostras em que a
diferença entre essas intensidades não é tão significativa como noutras.
As amostras históricas de mauveína MS1M2 e DM-Caro apresentam um perfil
cromatográfico completamente diferente das amostras anteriores, como se pode ver pela figura
3.15 em que o pico maioritário apresenta um Tr = 14.7 min, e foi atribuído à pseudo-mauveína
(C24), e os picos minoritários a tr = 16.1; 19.0min e Tr = 17.9min pertencem a mauveína C25 e
mauveína A C26, respetivamente.
40
Figura 3.15: Cromatogramas de HPLC-DAD das amostras históricas dos sais de mauveína a
550 nm para ScM1: Museu da Ciência 1; ScM2: Museu da Ciência 2; ScM3: Museu da Ciência
3; ScM4: Museu da Ciência 4; MS1M1: Museu da Ciência e Indústria Manchester 1; CM:
Museu Chandler; MS1M2: Museu da Ciência e Indústria Manchester; DM-Caro: Museu
Deutsches.
O método HPLC-DAD permitiu caracterizar os diferentes isómeros da mauveína de
acordo com os seus tempos de retenção, e medir a intensidade relativa de cada pico
cromatográfico. Mas para complementar a informação foram feitos ensaios HPLC-DAD-MS/MS
e os cromóforos da malva presentes nas amostras históricas foram atribuídos com base na sua
razão m/z e respetivos padrões de fragmentação. Na figura 3.16 apresenta-se o cromatograma
HPLC-DAD-MS/MS, e os respetivos espectros de massa MS2 para a amostra ScM1 do Museu
da Ciência.
41
Figura 3.16: Cromatograma de HPLC-DAD e cromatogramas de tadem ESI(+) e espectros de
massa MS2 da amostra ScM1 do Museu da Ciência. Os maiores compostos identificados
correspondem ao número de picos: 1 – m/z 377, isómero C25; 2 – m/z 391, Mauveína A; 3 –
m/z 405, mauveína B2; 4 e 5 – m/z 405, mauveína B3 e B4; 6 – m//z 405, mauveína B; 7 e 8 –
m/z 419, mauveína C e C1; 9 – m/z 433, mauveína D.
Como já foi referido, o método analítico permitiu uma separação eficiente dos
diferentes isómeros da mauveína possibilitando a caracterização por MS e MS/MS de cada um
dos isómeros dos vários cromóforos que constituem a malva. Como se pode observar pelo
cromatograma iónico os picos 3, 4, 5 e 6 possuem o mesmo ião percursor a m/z 405 e os
espectros de MS2 são idênticos, o que varia é a intensidade relativa de cada um dos iões
produto. O mesmo acontece com os picos 7 e 8 a m/z 419. Esta análise foi importante porque
permitiu distinguir as amostras SCM1-4, MS1M1 e CM das amostras MS1MS2 e DM-Caro.
Com efeito, os cromóforos mauveína maioritários no primeiro conjunto de amostras são
diferentes dos identificados nas outras duas amostras históricas. Este resultado permite afirmar
42
que estas duas últimas amostras não tiveram o mesmo processo de síntese que as anteriores,
pois o pico mais intenso no cromatograma a tr = 14.7 min atribuído à pseudo-mauveína, não é
detetado nos cromatogramas das outras amostras.
Desta análise pode concluir-se que todos os sais de mauveína que foram sintetizados e
purificados por Perkin são na verdade misturas complexas de 13 compostos diferentes, todos
contendo como núcleo 7-amino-5-fenil-3-(fenilamina)-fenazina-5-ium (ver figura 1.2).
Mas várias amostras históricas identificaram-se um composto C24 sem grupos metilo
(pseudo mauveína), três isómeros mono-metilados C25 denominados C25a, C25b e C25c, um
composto dimetilado C26, quatro isómeros trimetilados B, B2, B3, B4 e um composto
pentametilado D. A identificação deste último composto (D), mostra que a anilina comercial
utilizada por Perkin não possuía só toluidinas, mas também anilinas metiladas (xilidinas).
A partir dos cromatogramas HPLC-DAD analisados a = 550 nm, mediram-se as áreas
de cada pico cromatográfico atribuído a cada um dos isómero que constituem as diferentes
amostras históricas, e construiu-se a tabela 3.1. Da análise desses dados calculou-se a razão
entre a mauveína A (C26) / mauveína B (C27) para cada amostra analisada.
Os resultados mostram que a distribuição dos compostos de mauveína entre os sais
ScM1- 4, MS1M1 e CM não apresenta grandes diferenças, sendo os dois cromóforos
mauveína A (C26) e mauveína B (C27), os que contribuem com a maior percentagem para a
cor total do composto; os o cromóforos C25 (C25a+ C25c) contribuem com aproximadamente
5%, os cromóforos C27 (B2+B3+B4) embora sejam minoritários, contribuem com
aproximadamente 25% da cor total, assim como a mauveína A (C26) e a mauveína B (C27). Já
a mauveína D a sua contribuição é muito pequena aproximadamente 1% na amostra ScM1 e
2.3% na amostra ScM3, enquanto que nas outras é quase inexistente.
Nos sais MS1M2 (Schunk) e DM-Caro, a maior contribuição para a cor total,
aproximadamente 60% provem da pseudo mauveína (C24), enquanto que os cromóforos
mauveína C25 e mauveína A (C26) contribuem respetivamente com aproximadamente 35% e
6%, para a cor total do composto.
As amostras foram agrupadas de acordo com a razão entre a mauveína A (C26) /
mauveína B (C27): as amostras (ScM2,ScM4 e MS1M1) apresentam razões semelhantes
tendo como compostos maioritários os isómeros C27 isto é, contêm maioritariamente mauveina
B; as amostras ScM1, ScM3 e CM têm como principal cromóforo a mauveína A (isómero C26);
as amostras MS1M2 e DM-Caro são maioritariamente constituídas por pseudo-mauveína.
É importante salientar que a amostra denominada de “original” do Museu da Ciência
(ScM1) e a amostra do Museu Chandler (CM) apresentam uma constituição semelhante. Esta
semelhança poderá apoiar a hipótese de que a mauveína oferecida por Perkin a Charles
Chandler aquando da sua visita a NovaYork na altura do Jubileu, seja do mesmo lote que a
“original” (ScM1). Nas amostras MS1M2 (Schunk) e DM-Caro, foi encontrada uma impressão
digital ligeiramente diferente, o maior cromóforo púrpura observado foi a pseudo mauveína,
C24 (60%), juntamente com três derivados mono metilados (C25a, C25b e C25c, (36%)), nos
43
cromóforos minoritários verificou-se uma proporção diferente entre a mauveína A (6%) e a
mauveína B2+B3+B4 (2%), e nenhuma evidência de mauveína B, C ou D.
As amostras MS1M2 e DM-Caro embora preparadas com um processo de síntese
semelhante ao que Perkin desenvolveu na produção da mauveína, na sua síntese foi usado
maiores quantidades de anilina e pequenas quantidades de toluidinas, pois este é o processo
que leva á formação maioritária de pseudo mauveína.
A amostra DM-Caro, cuja síntese é atribuída a Caro, deve ter sido preparada usando
como agente oxidante o cloreto de cobre enquanto que Perkin usava o dicromato de potássio,
sendo considerados os melhores agentes oxidantes na síntese da mauveína.[23]
A mauveína
produzida por Perkin e Caro são bem distintas, isto é, possuem perfis diferentes, impressão
digital diferente, por isso são facilmente distinguidas quando uma análise deste tipo é efetuada.
44
Tabela 3.1: Análise por HPLC-DAD-MS das diferentes mauveínas encontradas nas amostras históricas (analisada anteriormente na ref.[6]
) e a partir de uma
amostra sintetizada por Heinrich Caro (do Museu Deutsches).
C24 Pseudo
Mauveína
C25 Mauveína C25
(C25a+C25b+C25c)
C26 Mauveína
A
C27 Mauveína B
C27 Mauveína B (B2+B3+B4)
C28 Mauveína
C
Mauveína D
(C26/C27)a (C26/C27)
Ref. [6]
(m/z 363) Tr=14.7min
(m/z 377) Tr=16.1; 19.0min
(m/z 391) Tr=17.9min
(m/z 405) Tr=22.10min
(m/z 405) Tr=15.1; 19.7; 20.7min
(m/z 419) Tr=22.9; 23.1
(m/z 433) Tr=24.1
ScM1 0.28 4.59 37.08 17.13 20.91 19.39 0.62 1.4 1.3 ScM2 0.05 2.21 23.25 21.50 27.90 25.09 0.00 0.7 0.8 ScM3 0.56 4.11 ScM1 0.28 22.82 12.23 2.21 1.7 1.8 ScM4 0.13 1.58 ScM2 0.05 25.08 15.75 0.00 0.7 0.8 MS1M1 0.04 0.14 22.57 26.19 21.46 29.59 0.01 0.7 0.8 CM 0.00 0.92 37.22 23.19 19.96 18.72 0.00 1.2 1.4 MS1M2 (Schunk)
51.71 35.32 9.00 0.21 3.75 0.01 0.00 (3.4) b
DM-Caro 56.11 35.70 6.14 0.13 1.91 0.01 0.00 (4.5) -
a Estes dados foram corrigidos de acordo com o processo descrito na ref.
[6] considerando os fatores de correção 0.6 para a mauveína A; 0.8 para a mauveína B; 0.9 para a mauveína B2, e
mauveína C25 1.0 (neste trabalho). b No trabalho anterior não se reportou este valor, devido à pequena quantidade de mauveína B; na realidade no trabalho da ref.
[6], as mauveínas com menos de
2% não eram consideradas. No presente trabalho fomos capazes de descriminar as frações com um limite inferior a 0.5%.
45
Estando as amostras históricas caracterizadas considerou-se importante comparar o
extrato da fibra da amostra de malva retirada do JCE com essas amostras, para tentar
perceber se tinha sido produzida segundo o procedimento utilizado por Perkin ou Caro. Como
se pode observar na figura 3.17 pelos cromatogramas de HPLC-DAD das amostras históricas
ScM4 do Museu da Ciência e DM-Caro do Museu Deutsches e da amostra do JCE, esta última
possui um perfil cromatográfico distinto, apresentando um pico maioritário a tr=16.1 min, que
por MS/MS foi atribuído ao cromóforo mauveína C25 (m/z 377). Concluiu-se que a amostra do
JCE foi tingida com um corante malva produzido provavelmente mais tarde, segundo um
processo de síntese em que as proporções entre a anilina e toluidina eram diferentes das
usadas por Perkin e Caro e em que outro agente oxidante pode ter sido utilizado.
Figura 3.17: Cromatogramas de HPLC das amostras históricas dos sais de mauveína a 550
nm ScM4 e DM-Caro, e da amostra de malva do JCE.
3.2.2 – Caraterização dos selos Penny Lilac
Neste trabalho foram analisados cerca de 35 selos postais da Grã-Bretanha, do
período 1867-1901, entre os quais alguns exemplares da série designada de Penny Llilac.
Todas as amostras de selos foram extraídas de acordo com o procedimento descrito na
parte experimental e na sua análise usou-se a mesma metodologia HPLC-DAD-MS aplicada ao
estudo das amostras de sais de malva históricas, tendo-se contudo adquirido os
cromatogramas iónicos não apenas no modo ESI positivo, mas também no modo ESI negativo.
46
Tabela 3.2: Análise por HPLC-DAD-MS/MS dos diferentes tipos de mauveína (dado em %) encontrados nos selos Victoria LiLac.
C24 Pseudo
mauveína
C25 Mauveína
C25[b]
C26 Mauveína
A
C27 Mauveína
B
C27 Mauveína
B[c]
C28 Mauveína
C[d]
Mauveína D
Cochonilhal[e]
(C26/C27)[f] Origem da
Mauveína Data
m/z tr[min]
363 14.7
377 16.1, 19.0
391 17.9
405 22.10
405 15.1,
19.7, 20.7
419 22.9, 23.1
433 24.1
491 11.0
SG 109 0.00 3.10 34.42 27.89 27.28 6.76 0.55 0.00 0.9 Perkin 1867-1880
SG 108 0.00 3.25 30.29 11.43 31.20 22.88 0.96 0.00 1.0 Perkin 1867-1880
SG 107 0.00 25.15 41.46 8.20 23.50 1.68 0.00 0.00 1.9 Perkin 1867-1880
SG 106 34.15 40.21 22.37 2.34 0.94 0.00 0.00 0.00 9.4 Caro 1867-1880
SG 109(2) 0.00 7.15 51.47 4.30 37.08 0.00 0.00 0.00 1.8 Perkin 1867-1880
SG 170-174
0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 100 0.00 _ 1881-1901
[a] Devido ao baixo sinal dos cromóforos da mauveína nas amostras extraídas dos selos, a atribuição dos isómeros foi baseada nos dados de MS/MS (ver figuras3.20;3.21). [b] C25a+C25b. [c]
B2+B3+B4. [d] C+C1. [e] Ácido carmínico. [f] Estes dados foram corrigidos de acordo com o processo descrito na ref.[6]
considerando os fatores de correção 0.6 para a mauveína A; 0.8 para a
maauveína B; 0.9 para a mauveína B2, B3 e B4; para a pseudo mauveína e mauveínaC25 o fator é 1.0 (neste trabalho).
47
Só apenas em quatro selos foi detetado o perfil cromatográfico característico da malva,
como se observa na tabela 3.2, que sumariza os resultados da análise HPLC-DAD-MS/MS dos
diferentes cromóforos de mauveína, de acordo com a sua razão m/z, tempo de retenção e
intensidade relativa (percentagem), identificados nos 4 selos postais SG106-109 do período
Vitoriano, 1867-1880. Estes selos foram definitivamente impressos com malva. Todos os outros
selos que também apresentavam uma cor púrpura mostraram o ácido carmínico como principal
composto corante. É interessante notar que embora estes selos exibam uma cor púrpura, muito
próxima da dos selos que foram impressos com mauveína, quando se procedeu à extração do
corante do selo, e se reconstituí o extrato seco com metanol, verificou-se que apresentavam
uma cor diferente dos outros 4 extratos, uma cor vermelho pálido, característica do ácido
carmínico como se pode ver na figura 3.18. Isto mostra que o tingimento dos selos do período
em estudo, era ainda usado o corante natural cochenilha, e que na impressão eram criadas
condições de tingimento capazes de mimetizar a cor púrpura da mauveína com ácido
carmínico.
Figura 3.18: Dois selos postais (esquerda Penny Lilac, SG 170-SG 174), e a direita (o selo SG
107 de seis pences) com os respetivos extratos numa solução de metanol.
A primeira evidência clara de que o corante malva foi usado na coloração de selos
postais do período vitoriano foi apresentada neste trabalho [9]
, como se comprova por
comparação das tabelas 3.1 e 3.2.
Da análise das tabelas, concluiu-se que no selo postal SG 106 o cromóforo mais
abundante era a pseudo mauveína, C24 (22%), tendo os outros componentes uma contribuição
menor. Já nos selos SG 107 – SG 109, os componentes presentes com maior contribuição
eram a mauveína A, C26 (entre 22 e 51%) e a mauveína B, C27 (entre 30 e 55%), os outros
componentes como a mauveína C28, a mauveína C25 e a mauveína D têm uma contribuição
menor, abaixo de 10% na cor do composto. Contudo, o selo SG 108 tem aproximadamente
13% de mauveína C na sua cor total, e o selo SG 107 possui aproximadamente 25% de
mauveína C25 na sua cor total como se pode verificar pelos dados da tabela 3.2.
A caracterização dos selos foi feita por ESI em modo positivo, os cromatogramas
tandem e os espectros de massa MS/MS claramente identificam os principais cromóforos da
mauveína como se pode verificar nas figuras 3.19 e 3.20, para o selo SG 109 e SG 106,
respetivamente.
48
Pela figura 3.19 que mostra o cromatograma de HPLC-DAD, os cromatogramas iónicos
de massa tandem ESI(+) e o espectro de massa MS2 da amostra do selo postal SG 109,
observa-se que os picos numerados de 1 a 7 possuem o mesmo tempo de retenção,
correspondem aos mesmos cromóforos (respetivamente aos iões moleculares m/z 377, 391,
405, 419 e 433) e apresentam o mesmo padrão de fragmentação da amostra ScM1 do Museu
da Ciência (figura 3.16), tendo os selos SG 107 – SG 109 apresentado um perfil LC-MS
idêntico.
Figura 3.19: Cromatograma de HPLC-DAD, cromatogramas de massa tandem ESI(+) e
espectro de massa MS2 da amostra de selo postal SG 109. Os compostos identificados
correspondem ao pico: 1 – m/z 377, isómeres C25; 2 – m/z 391, mauveína A; 3 e 4 – m/z 405,
mauveína B3 e B4; 5 – m/z 405, mauveína B; 6 – m/z 419, mauveína C; 7 – m/z 433, mauveína
D.
Os cromatogramas HPLC-DAD-MS/MS para o extrato do selo SG 106 (figura 3.20)
mostram um perfil diferente do anterior. Os espectro de massa MS2 mostraram que o pico 1 a
tr=14.7 min, possui uma razão m/z 363 e os outros três picos 2 a 4 mostraram iões moleculares
com m/z 377, 391 e 405, com tr=16.1; 19.0 e 22.10 min, respetivamente. Este selo tem um
49
perfil muito semelhante ao das amostras históricas de mauveína (MS1M2 (Schunk) e DM-
Caro), mas a intensidade dos picos cromatográficos varia ligeiramente.
Figura 3.20: Cromatograma de HPLC-DAD, cromatograma de massa tandem ESI(+) e
espectro de massa MS2 da amostra de selo postal SG 106. Os compostos identificados
correspondem ao pico: 1 – m/z 363, pseudo mauveína; 2 – m/z 377, isómeros C25; 3 –m/z 391,
mauveína A; 4 – m/z 405, mauveína B.
Como se pode observar pela tabela 3.1 e pela figura 3.20, o traço da estrutura da
mauveína de Caro é a presença de uma elevada quantidade de pseudo mauveína C24,
enquanto a mauveína de Perkin é a ausência de pseudo mauveína C24, como se pode ver
pela figura 3.19.
Os dados obtidos neste trabalho indicam claramente que o selo SG 108 (datado de
1867-1880), SG 107 e SG 109 foram impressos com malva obtida pelo processo sintético
usado por Perkin, ao passo que o selo SG 106 foi impresso a partir de material produzido pelo
o processo sintético de Caro.
A figura 3.21 apresenta-se o selo SG 109 impresso com malva produzida pelo
processo de Perkin e o selo SG 106 impresso com a malva produzida segundo o processo
definido por Caro.
50
Figura 3.21: Dois selos postais analisados: à esquerda o selo SG 109, impresso com malva de
Perkin; e à direita o SG 106 impresso com malva de Caro.
Com já foi anteriormente referido, nos selos Penny Lilac SG 170-174 foi observado um
único pico quando a deteção espectrofotométrica a 496 nm foi utilizada. Os cromatogramas
MS/MS (TIC, o modo NI apresentados na figura 3.22), mostram um pico a tr= 11,1 min a que
corresponde um ião com m/z 491 que foi identificado como sendo a molécula desprotonada do
ácido carmínico (modo de ionização negativo). O seu padrão de fragmentação de acordo com
a literatura [24]
, apresenta perda de uma molécula de CO2, característica da presença de um
grupo ácido, que origina o ião fragmento m/z 447; e os outros iões fragmento a m/z 429, 357 e
327 que correspondem à perda de CO2+H2O, C3H3O4 e a molécula de glicose, respetivamente.
O que é surpreendente, foi não se ter detetado malva em nenhum dos selos Penny Lilac
analisados. Dos selos analisados sabia-se a partir dos carimbos postais que havia selos de
1886, 1898, 1900 e 1901, mas não foi encontrada vestígios de malva em qualquer desses
selos.
Figura 3.22: Cromatograma de HPLC-DAD e o cromatograma tandem ESI(-) e o espectro de
massa MS2 da amostra do selo postal (SG 170-174). O pico com m/z 491 corresponde ao ácido
carmínico desprotonado.
Da literatura [8]
havia evidência que na impressão dos selos Penny Lilac poderiam ter
sido também usados os corantes, denominados à época, derivados de Hofmann (fucsina,
metilo violeta, cristal violeta). Foram obtidas amostras destes corantes, e as soluções foram
51
analisadas por HPLC-DAD-MS/MS, nas mesmas condições experimentais utilizadas
anteriormente em todas as amostras (tabela 3.3). Nos cromatogramas de LC-MS, estes
corantes aparecem claramente a diferentes tempos de retenção quando comparados com os
sinais obtidos com os selos e as amostras históricas de malva. Observou-se que a fucsina e o
violeta de metilo contêm vários cromóforos que são eluídos em diferentes tempos de retenção.
Os iões extraídos dos cromatogramas iónicos na amostra de fucsina exibem um ião [M]+ para
cada cromóforo, iões com m/z 288 (composto 1), m/z 302 (composto 2), m/z 316 (composto 3)
e m/z 330 (composto 4) com tempos de retenção entre 11.4 min e 13.7 min. Para o violeta de
metilo os picos foram encontrados a m/z 330 (composto 1), m/z 344 (composto 2), m/z 358
(composto 3) e m/z 372 (composto 4) eluídos entre 15.9 min e 19.6 min. O cristal violeta
apresenta um único composto com m/z 372 e o tempo de retenção 19.7 min como se pode
observar pela tabela 3.3.
Os resultados permitiram concluir que no lote de selos analisados não foram usados
derivados de Hoffman para a impressão dos mesmos, mas apenas cochenilha como já foi
concluído.
Na análise do selo SG 200, que apresentava duas cores, sendo a cor da base do selo
uma tonalidade esverdeada diferente dos selos analisados até então, foram extraídos 2
pedaços de selo, um de cada uma das cores, e realizaram-se duas análises distintas. A análise
do extrato de cor verde identificou a presença de um composto natural, o flavonol rutina
(O-ramnosóide-glicosóide), que apresenta uma molécula desprotonada [M-H]- a m/z 609; o
espectro MS2 do ião precursor m/z 609 mostrou dois fragmentos a m/z 463 e m/z 301
correspondentes à perda consecutiva de um resíduo da ramnose e um resíduo da glicose,
respetivamente. A perda destas duas unidades de açúcar levaram a uma aglicona com m/z
301. A confirmação de que a aglicona era uma quercetina foi efetuada com base no espectro
MS3 traçado para o ião produto m/z 301 proveniente do ião precursor m/z 609. O espectro
apresentou fragmentos com m/z 179, 151 e 121 atribuídos, respetivamente, aos iões 1,2
A0-,
1,2A-
CO e 1,2
B-, que são os iões diagnóstico da quercetina [24]
. Na análise HPLC-DAD no extrato de
cor vermelha separaram-se dois compostos que absorviam a 514 nm, e que foram identificados
por MS e MS/MS, o Ponceau 2R e o Orange G. O Ponceau 2R possui um ião com m/z 453 e
como fragmento caraterísticos os iões m/z 355 e 302 que corresponde à perda de SO3 e
C8H9N2, respetivamente. O Orange G possui um ião com m/z 327 e no espectro MS/MS
apresenta iões fragmento a m/z 235 e m/z 207 que correspondem à perda de N2+SO2 e
C6H5N2O, respetivamente.
52
Tabela 3.3: Dados de HPLC-DAD-MS/MS dos corantes violeta de Hofmann´s e o corante
natural cochenilha.
Composto
HPLC-DAD
Tr (min)
Estrutura
λmax
(nm)
MW
(g/mol)
Fragmentos MSn
m/z (% abundância relativa), (perda
do fragmento neutro, espécies
possíveis)
CI 42510
Fucsina
1 – 11.39
2 - 12.15
3 – 12.92
4 – 13.72
NH2
Z
H2N
X
NH2
Y
Cl- X=H; Y=H; Z=H
X=CH3; Y=H; Z=H
X=CH3; Y=CH3; Z=H
X=CH3; Y=CH3; Z=CH3
1 – 543
2 – 546
3 – 548
4 – 551
323.83
337.87
351.89
365.91
MS
(1) m/z 288 [M]+
(2) m/z 302 [M]+
(3) m/z 316 [M]+
(4) m/z 330 [M]+
MS2
288 273 (8) (-15, CH3)
195 (100) (-93, C6H7N)
168 (6) (-120, C7H8N2)
302 287 (10) (-15, CH3)
209 (100) (- 93, C6H7N)
195 (46) (-107, C7H9N)
316 301 (26) (-15, CH3)
223 (40) (-93, C6H7N)
209 (100) (-107, C7H9N)
330 315 (8) (-15, CH3)
223 (100) (-107, C7H9N)
208 (12) (-122,
C7H9N+CH3)
CI 42535
Metil
Violeta
1 – 15.89
2 – 17.07
3 – 18.34
4 – 19.59
1 – 567
2 – 574
3 – 582
4 – 590
379.94
393.97
MS
(1) m/z 330 [M]+
(2) m/z 344 [M]+
(3) m/z 358 [M]+
(4) m/z 372 [M]+
MS2
330 315 (8) (-15, CH3)
223 (100) (-107, C7H9N)
208 (12) (-122,
C7H9N+CH3)
344 → 329 (60) (-15, CH3)
→ 328 (40) (- 16, CH4)
→ 237 (28) (-107, C7H9N)
→ 223 (14) (-121, C7H9N2)
53
358 → 343 (50) (-15, CH3)
→ 342 (45) (-16, CH4)
→ 251 (13) (-107, C7H9N)
→ 237 (10) (-121, C7H9N2)
372 → 357 (76) (-15, CH3)
→ 256 (75) (-16, CH4)
→ 251 (20) (-121, C7H9N2)
→ 208 (12) (122, C7H9N+CH3)
CI 42555
Cristal
violeta
1 – 19.64
1 - 590 407.98 MS
m/z 372 [M]+
MS2
372 → 357 (76) (-15, CH3)
→ 356 (60) (-16, CH4)
→ 251 (12) (-121, C7H9N2)
→ 208 (6) (-122, C7H9N+CH3)
Cochenilha
1 – 11.10
1 - 469 492.38 MS
Ácido carmínico
m/z 491 [M-H]-
MS2
491 447 (100) (-44, CO2)
→ 429 (60) (-62, CO2+H2O)
→ 357, 0.3X (20) (-90, C3O3H4)
→ 327 (12) (-164, C6H12O5)
Capítulo IV
Conclusão
55
A utilização de água acidulada com 0.8% de ácido fórmico e metanol como solventes
de eluição permitiu a separação de várias famílias de corantes com diferentes estruturas, como
também a separação dos crómoforos de metil violeta e da mauveína e a análise subsequente
por espectrometria de massa.
Todas as amostras analisadas foram identificadas e caraterizadas pelo seu tempo de
retenção, espectro de UV-vis e padrões de fragmentação que são caraterísticos de cada
composto. A combinação de ambos os detetores, DAD e MS foram fundamentais para a sua
caracterização, dado que muitos corantes possuem estruturas e espectros de UV-vis
semelhantes, a espectrometria de massa é extremamente importante para identificar as
amostras.
Os corantes analisados por HPLC-DAD-MSn revelam padrões de fragmentação
caraterísticos relacionados com a presença de grupos funcionais específicos na sua estrutura
molecular, como grupos carboxílicos, hidroxilos, sulfato, nitro e amina, que podem contribuir
para identificar a família química do corante.
Os corantes com grupos nitro apresentam como fragmentação caraterística a perda
dos radicais NO e NO2.
Os corantes azo, a maioria dos quais, possuem iões sulfato na sua composição,
apresentam perdas associadas ao grupo sulfato (- 64 u, SO2 e -80 u, SO3). Nos espectros de
massa tandem observa-se também a perda de N2, por rearranjo do grupo azo, e outros
fragmentos provenientes da clivagem das ligações N=N e C-N. Estes corantes estão na forma
de sais de sódio, e nos espectros de massa ESI no modo negativo exibem séries de iões
negativos [M-xH]x- e respetivos adutos sodiados, como [M-2Na+H]
-, etc, no geral iões do tipo
[M-(x+y)Na+yH]x-.
Os corantes difenil e triaril metano possuem como fragmentação caraterística a perda
de um anel aromático, e perdas CH3 e CH4 associadas à presença de grupos metilo. Os que
existem na forma de sais de sulfato, apresentam também os fragmentos associados às perdas
do grupo sulfato, já descritos anteriormente.
Os corantes azina e xanteno também apresentam caraterísticas de fragmentação
semelhantes aos corantes triaril metano, pois perdem iões CH3, CH4 e um anel aromático; os
que contêm como grupo funcional o ácido carboxílico, exibem perdas de 44 u devidas à saída
de CO2.
A última família estudada, os corantes antraquinona, caracterizam-se por perdas de
28 u (CO), e encurtam o anel em menos uma molécula de carbono.
O corante malva pode ser definido como uma mistura complexa de vários cromóforos
que contém o núcleo 7-amino-5-fenil-3-(fenilamino)-fenazina-5-ium com diferentes números de
grupos metilo na sua estrutura. Dependendo da proporção dos reagentes de partida (anilina e
toluidina) assim se obtêm diferentes percentagens dos cromóforos presentes na sua
composição, originando compostos com cores muito semelhantes.
Todas as amostras históricas de sais de mauveína foram identificadas e caracterizadas
por HPLC-DAD-MSn, com base no tempo de retenção e padrão de fragmentação. A partir das
56
áreas dos picos cromatográficos calcularam-se as percentagens relativas de cada cromóforo
nas várias amostras, e determinou-se a razão entre os cromóforos mauveína A e B. Com base
nesta razão foi possível discriminar as várias amostras em função do método de síntese.
A comparação entre os cromatogramas das amostras históricas de malva e da amostra
do JCE, mostrou que a última, embora contenha os mesmos cromóforos, tem um perfil
cromatográfico distinto das amostras históricas. O cromóforo com maior contribuição para a cor
do corante é a mauveína C25, o que nos leva a propor que na sua síntese, a proporção de
reagentes de partida e/ou o reagente oxidante, eram diferentes dos usados na síntese dos
corantes históricos.
Na última parte do trabalho foi apresentada a análise de selos Penny Lilac dos finais do
século XIX, sendo o objetivo provar que o corante malva do tempo de Perkin tinha sido usado
na impressão desses selos. O objetivo foi alcançado, pois provou-se que 4 dos selos
apresentavam o perfil cromatográfico da malva, e foi ainda possível concluir que na impressão
de 3 selos (SG 107 – SG 109), tinha sido usada malva da manufatura de Perkin, mas que
noutro selo (SG 106) a malva usada tinha a impressão digital da malva de Caro. Na grande
maioria dos restantes selos, embora apresentem à vista uma cor púrpura, identificou-se ácido
carmínico nos seus extratos. Concluiu-se que estes selos tinham sido impressos com o corante
natural cochenilha, tendo sido usado um processo que imitava a cor púrpura. No conjunto de
selos analisados, não foram detetados violetas de Hoffmann, não sendo possível corroborar a
nota histórica de que estes corantes foram utilizados na época 1886-1901.
Este, foi o primeiro trabalho analítico que envolveu o estudo de selos Penny Lilac, e a
identificação do corante malva em quatro selos foi uma contribuição importante para o debate
histórico sobre a utilização da malva na impressão de selos durante a vida de Perkin.
Os corantes analisados neste trabalho são considerados os primeiros corantes
sintéticos, e nesse contexto têm interesse na análise de artefactos históricos. Quando se
trabalha com peças históricas a quantidade de amostra disponível é muito pequena (caso dos
selos). Por isso, a caracterização dos extratos exige o recurso a técnicas analíticas de elevada
sensibilidade e especificidade. O trabalho aqui apresentado mostra que o recurso a
metodologias HPLC-DAD-MS/MS são fundamentais para a identificação e caracterização de
corantes sintéticos em amostras provenientes de objetos com interesse histórico.
57
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58
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Anexos
A1
Tabela 1: Base de dados dos corantes sintéticos extraídos de fibras pertencentes a um artigo do Journal of Chemical Education, 1926, 3: 9, 973-1007.
Composto Estrutura Cromatograma (tr, min)
Espectro UV-vis
(max, nm)
MM (g/mol)
Fragmentos MSn
m/z (% abundância relativa) (espécies possíveis)
Nitro
Ácido pícrico
OH
NO2O2N
NO2 200 300 400 500
0,0
1,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
229.10 MS
m/z 228 [M-H]-
MS2
228 198 (100) (-30, NO)
182 (18) (-46, NO2)
154 (7) (-74, NO2+CO)
Monoazo
Crisoidina
N N
H2N
NH2.HCl
200 300 400 500 600
0,0
1,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
212.25 MS
m/z 213 [M+H]+
MS2
213 196 (80) (-17, NH3)
185 (5) (-28, N2)
168 (40) (-45, N2 + NH3)
121 (100) (-92, C6H6N)
Alaranjado II N N
HO
NaO3S
200 300 400 500 600
0,0
1,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
350.32 MS m/z 327 [M-Na]
-
MS2
327 299 (4) (-28, N2)
263 (5) (-64, SO2)
247 (8) (-80, SO3)
171(100) (-156, C6H4SO3)
492
461
359
A2
Fast Red A N N
HO
NaO3S
400.38 MS m/z 377 [M-Na]
-
MS2
377 297 (25) (-80, SO3)
269 (4) (-108, N2+SO3)
221 (100) (-156, C10H6NO)
143 (15) (-234, C10H6SO3+N2)
Amaranto N N
HO
NaO3S
SO3Na
SO3Na
200 400 600
0,0
1,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
604.47 MS m/z 537 [M-3Na+2H]
-
MS2
537 519 (30) (-18, H2O)
509 (2) (-28, N2)
473 (100) (-64, SO2)
457 (15) (-80, SO3)
429 (10) (-108,N2+SO3)
317 (60) (-222, C10H6NO3S)
302 (8) (-235, C10H7N2O3S)
234 (15) (-303, C10H7O7S2)
Vermelho cochenilha
A
N N
HO
NaO3S
NaO3S
SO3Na
200 400 600
0,0
2,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
604.47 MS m/z 537 [M-3Na+2H]
-
MS2
537 509 (100) (-28, N2 ou CO)
473 (8) (-64,SO2)
457 (10) (-80,SO3)
429 (30) (-108, N2+SO3)
376 (10) (-161,SO3+ SO3H)
302 (5) (-235, C10H7N2O3S)
509
521
A3
Diazo
Vermelho Congo
N
SO3Na
NH2
N N N
NH2
SO3Na
200 300 400 500 600
0,0
0,7
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
696.66 MS m/z 651 [M-2Na+H]
-
MS2
651 623 (5) (-28, N2) → 587 (8) (-64, SO2)
571 (100) (-80, SO3) → 543 (15) (-108, N2+SO3)
→ 416 (15) (-235, C10H7N2O3S)
→ 235 (10) (-416, C22H16N4O3S)
Crocein Scarlet
N N
HO
N
SO3Na
NaO3S
N
200 400 600
0,00
1,25
Inte
nsi
ty (
a.u
.)
Wavelength (nm)
556.48 MS m/z 511 [M-2Na+H]
-
MS2
511 483 (75) (-28, N2)
431 (20) (-80, SO3)
403 (10) (-108, N2+SO3)
302 (100) (-209, C12H9N4)
Difenilmetano
Auramina C N(CH3)2(H3C)2N
NH
200 400 600
0,00
0,12
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
303.83 MS m/z 268 [M]
+
MS2
268 253 (5) (-15, CH3)
148 (100) (-120, C8H10N)
122 (25) (-146, C8H12N2)
107 (50) (-161, C10H13N2)
517
501
374
441
A4
Trifenilmetano
Verde Malaquite
C
N(CH3)2Cl(H3C)2N
200 400 600
0
3
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
329.46 MS m/z [M]
+
MS2
329 314 (70) (-15, CH3)
313 (30) (-16, CH4)
285 (50) (-44, N(CH3)2) → 284 (40) (-45, NH(CH3)2)
251 (100) (-78,C6H6)
208 (40) (-121, C8H11N) → 165 (20) (-164, C2H5N+C8H11N)
Patent Blue V SO3Na
OH
NaO3S
(C2H5)2N N(C2H5)2
200 300 400 500 600 700
0
3
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
605.65 MS m/z 559 [M-2Na]
-
MS2
559 479 (100) (-80, SO3) MS
3
479 451 (5) (-28, C2H4 ou CO)
435 (100) (-44, C2H4+CH4)
399 (7) (-80, SO3)
MS4
435 391 (100) (-44, CO+CH4)
355 (20) (-80, SO3)
311 (9) (-124, SO3+CO+CH4)
Patent Blue A
C
N N
SO3Na
OH
NaO3S
729.79 MS m/z 683 [M-2Na]
-
MS2
683 603 (100) (-80, SO3)
577 (50) (-106, SO3+C2H2)
512 (5) (-171, SO3+•C7H7)
497 (25) (-186, SO3+•C7H7+
•CH3)
630
616
A5
Light Green SF Yellowish
C
NC
2 H5 C
H2
NC
2 H5 C
H2
SO3NaSO3Na
SO3Na
200 300 400 500 600 700
0,0
2,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
815.84 MS m/z 769 [M-2Na]
-
MS2
769 705 (30) (-64, SO2) MS
3
705 511 (50) (-194, C7H7SO3Na) MS
4
511 484 (15) (-27, C2H3)
469 (7) (-42, C2H4N)
261 (7) (-250, C15H13NO+C2H3)
170 (25) (-341, C15H13NO+C8H8N
MS
m/z 373 [M-3Na]2-
MS2
373 341 [C37H34N2O7S2]2-
(50) (-64, SO2) MS
3
341 512 (20) (C30H28N2O4S)+ 170 (5) (C7H6SO3)
479 (28)(C29H25N2O4S)+106 (50)(C7H6O) (-79, CH3)
MS4
479 453 (4) (-44,C2H6N)
327 (5) (-170, C7H6SO3)
170 (28) (-327, C22H19N2O)
Formilo violeta S4B
783.93 MS m/z 682 [M-2Na-(C2H4)2]
-
MS2
682 668 (15) (-15, CH3)
651 (100) (-31, CH5N)
602 (65) (-80, SO3)
561 (10) (-121, C2H4+C6H7N)
510 (45) (-172, C7H8SO3)
631
A6
Guinea Green
C
NC
2 H5 C
H2
NC
2 H5 C
H2
SO3NaSO3Na
713.79 MS m/z 571 m/z 543
Metil Violeta
X=H, Y=H, Z=H
X=CH3, Y=H, Z=H
X=CH3, Y=CH3, Z=H
X=CH3, Y=CH3, Z=CH3
1 – 16.64 2 – 18.09 3 – 19.53 4 – 20.87
200 300 400 500 600 700
0,0
0,1
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
379.94
393.97
MS m/z 330[M]
+
m/z 344[M]+
m/z 358[M]+
m/z 372[M]+
MS2
330 315 (8) (-15, CH3)
223 (100) (-107, C7H9N)
208 (12) (-122, C7H9N+CH3)
344 329 (60) (-15, CH3)
328 (40) (-16, CH4)
237 (28) (-107, C7H9N)
223 (14) (-121, C7H9N2)
358 343 (50) (-15, CH3)
342 (45) (-16, CH4)
251 (13) (-107, C7H9N)
237 (10) (-121,C7H9N2)
372 357 (76) (-15, CH3)
356 (75) (-16, CH4)
251 (20) (-121, C7H9N2)
208 (12) (-122, C7H9N+CH3)
588
A7
Cristal Violeta
200 300 400 500 600 700
0,00
0,35
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelength (nm)
407.98 MS m/z 372 [M]
+
MS2
372 357 (76) (-15, CH3)
356 (60) (-16, CH4)
251 (12) (-121, C7H9N2)
208 (6) (-122, C7H9N+CH3)
Azina
Safranina T
N
N
H3C CH3
NH2H2N
Cl-
200 300 400 500 600
0
1
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
350.84 MS m/z 315 [M-Cl]
+
MS2
315 300 (13) (-15, CH3)
299 (7) (-16, CH4)
298 (25) (-17, NH3)
238 (6) (-77, C6H5) Malva
Mauveína A: X=CH3, Y=CH3, Z=H, W=H
Mauveína B:
X=CH3, Y=CH3, Z=CH3, W=H
Mauveína C:
X=CH3, Y=CH3, Z=CH3, W=CH3
Mauveína C25a
X=H, Y=CH3, Z=H, W=H
1 – 15.2
2 – 16.1
3 – 17.9
200 300 400 500 600 700
0,000
0,012
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
363.2
377.2
391.2
MS m/z 363 [M]
+
m/z 377 [M]+
MS2
363 346 (35) (-17, NH3)
285 (100) (-78, C6H6)
270 (70) (-93, C6H7N)
377 362 (35) (-15, •CH3)
361 (60) (-16, CH4)
360 (30) (-17, NH3)
299 (100) (-78, C6H6)
284 (75) (-93, C6H7N)
271 (8) (-107, •C7H8N)
530
547
592
A8
Rodamina B
ON
COOH
N
CH3
H3CCH3
CH3
Cl-
200 300 400 500 600 700
0,0
1,6
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
477.04 MS m/z 443 [M]
+
MS2
443 413 (15) (-30, C2H6)
399 (100) (-44, CO2)
385 (5) (-58, C2H6+C2H4)
Antraquinona
Vermelho da Turquia
OH
OH
O
O 200 300 400 500 600
0,0
2,5
Inte
nsity (
a.u
.)
Wavelenght (nm)
240.20 MS m/z 239 [M-H]-
MS2
239 211 (100) (-28, CO)
183 (5) (56, CO+CO)
391 376 (50) (-15, •CH3)
375 (100) (-16, CH4)
374 (5) (-17, NH3)
313 (3) (-78, C6H6)
285 (5) (-107, •C7H8N)
284 (15) (-108, C7H9N)
Xanteno
557
434
A9
Tabela 2: Comentários sobre a rotulagem e origem das amostras.
Identificação Fonte Comentários PJT Morris*
Museu da Ciência 1
ScM1
Museu da Ciência
(1952-175),
anteriormente no
Imperial College
Esta amostra foi proveniente do Imperial
College e tem um rótulo que diz “Malva
Original preparada por Sir William Henry
Perkin em 1856”
Museu da Ciência 2
ScM2
Museu da Ciência
(1947-115/1)
Esta amostra de sal de malva (não
especificada) foi doada ao museu por Miss A
F Perkin in 1947.
Museu da Ciência 3
ScM3
Museu da Ciência
(1947-115/2)
Esta amostra de hidrocloreto de malva foi
doada ao museu por Miss A F Perkin em
1947.
Museu da Ciência 4
ScM4
Museu da Ciência
(1947-115/3)
Esta amostra de acetato de malva foi doada
ao museu por Miss A F Perkin in 1947.
Manchester 1
MS1M1
Museu da Ciência e da
indústria em
Manchester,
antigamente nos
arquivos dos Corantes
ICI, Blackley,
Manchester
Esta amostra foi dada pelo ramo Kirkpatrick
da família Perkin ao ICI e posteriormente
transferida para o museu. Tem um selo da
fábrica quebrado na rolha e parece vir à
partir do trabalho em Greenford Green de
Perkin & Sons. Ele é rotulado de “Crude de
acetato de malva”. Ele foi datado e arquivado
nos Corantes ICI em 1862, mas esta data
pode não estar correta.
Manchester 2
MS1M2
Museu da Ciência e
Indústria em
Manchester
[A] “amostra de malva da coleção Schunck,
apenas rotulado 'malva C27 H24 N4'. A
caligrafia parece-se com outras amostras da
coleção e provavelmente foi escrita por
Schunck ou pelo seu assistente”.
Comunicação pessoal de Jenny Wetton,
então curador da Ciência em Manchester,
10 Maio 2006. Edward Schunck (1820-1903)
foi um investigador químico, independente
A10
em Manchester que trabalhou principalmente
em corantes naturais.
Columbia
CM
Museu Chandler,
Universidade da
Columbia, Cidade de
Nova York
Esta amostra foi dada ao Professor Charles
Chandler por W. H. Perkin durante a sua
visita a Nova York em outubro de 1906.
Museu Deutsches
DM - Caro
Museu Deutsches, em
Munique (Alemanha)
Esta amostra é conhecida por ter sido
sintetizada por Heinrich Caro, em que no
procedimento de síntese utilizava como
agente oxidante o cloreto de cobre.
*PJTMorris é Investigador Coordenador das “ Collections Unit of the Science Museum, UK”.
A11
Tabela 3: Selos Postais (35) analisados por HPLC-DAD-MS/MS.
Stanley Gibbons catalogou o número
dado em negrito; para as amostras
nominalmente duplicadas, um subscrito
indica o número da nossa amostra
duplicada
Composto
(comentário)
Datas
Datas da produção genérica são de
um catálogo de Mark
Sargent GB Stamps, Hornchurch,
UK.
http://www.stampsforsale.co.uk/co de/queen_victoria_great_british_st
amps.asp?t=40.
Em alguns casos a data da última
produção está disponível a partir do
carimbo postal, estas datas são
mostradas em itálico
SG 109 Six Pence
Malva
Malva
(Padrão idêntico ao encontrado
nas amostras do Museu da
Ciência)
1867-80
SG 108
Six Pence
Malva
Malva
(Padrão idêntico ao encontrado
nas amostras do Museu da
Ciência)
1867-80
SG107
Six pence Malva
Malva
(Padrão idêntico ao encontrado
nas amostras do Museu da
Ciência)
1867-80
SG 105 Six pence
Malva
Não identificado
1867-80
SG 104
Six pence
Malva
Provavelmente ácido carmínico
1867-80
SG 106
Six pence Malva
Malva
(Padrão idêntico ao encontrado na
amostra Caro, do Museu
Deutsche)
1867-80
A12
SG 109(2) Six pence
Malva
Malva
(Padrão idêntico ao encontrado
nas amostras do Museu da
Ciência)
1867-80
SG (170-174)(3)
1900 Carimbo Postal 00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-1900
SG (170-174)(9)
1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-1900
SG (170-174)(11) 1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-1900
SG (170-174)(13) 1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-1900
SG (170-174)(19)
1900 Carimbo Postal 00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-98
SG (170-174)(21)
1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-86
SG (170-174)(23)
1900 Carimbo Postal 00 Penny Lilac
Ácido carmínico
1881-1901
SG (170-174)(28) 1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido Carmínico
1881-1901
SG (170-174)(29) 1900 Carimbo Postal
00 Penny Lilac
Ácido Carmínico
1881-1901
SG 58
Ácido Carmínico
1847-54
SG 69
Não identificado
1855-57
A13
SG 83
Não identificado
1862-64
SG 141(1) 2 1/2d. Malva
Placa 5
Não identificado
1873-80
SG 141(2)
2 1/2d. Malva
Placa 9
Não identificado
1873-80
SG 162
Ácido carmínico
1880-83
SG 171(1)
Ácido carmínico
1881
SG 171(2)
--- 1881-85
SG 173
Ácido carmínico
1881-1901
SG 174
Ácido carmínico
1881-1901
SG 159 3d
Ácido carmínico
1880-83
SG 178
Ácido carmínico
1880-84
SG 188
Ácido carmínico
1880-84
SG 197
Não identificado
1887-1900
SG 198
Ácido carmínico
1887-1900
SG 200
Verde
Flavonol
Rutina (O-Rhm-Glc)
(λ max 352 nm,
1887-1900
A14
[M-H]- m/z 609)
Vermelho
Mistura de dois
Corantes sintéticos
Ponceau 2R (CI 16150)
λ max 514 nm,
[M-H]- m/z 453
MS2 355 (-80, SO3)
302 (-133, C8H9N2)
Orange G (CI 15970)
λ max 514 nm,
[M-H]- m/z 327
MS2 357 (-90, N2+SO2)
207 (-120, C6H5N2O)
SG 201
Mistura de ácido carmínico com
um flavonoide (não identificado)
1887-1900
SG 202
-
1887-1900
SG 210
Ácido carmínico (parte interior
lilás)
1887-1900
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