UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO INSTITUTO DE QUÍMICA
Programa de Pós-Graduação em Química
Thiago Regis Longo Cesar da Paixão
Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-
Ambientes
São Paulo Data do Depósito na SPG:
31/08/2007
Thiago Regis Longo Cesar da Paixão
Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-
Ambientes
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Química (Química
Analítica)
Orientador: Prof. Dr. Mauro Bertotti
São Paulo 2007
Thiago Regis Longo Cesar da Paixão
Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas
em Micro-Ambientes.
Tese apresentada ao Instituto de Química da
Universidade de São Paulo para obtenção do
Título de Doutor em Química (Química
Analítica)
Aprovado em: ____________
Banca Examinadora Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________
Prof. Dr. __________________________________________________________
Instituição: ________________________________________________________
Assinatura: ________________________________________________________
Aos meus pais Silvia e Romeu, meus avós Ida, Miguel, Celina (In Memorian) e José, meus irmãos Victor e Beatriz e à minha eterna
companheira Juliana
Pela oportunidade de ter uma família tão especial
Dedico
Ao meu orientador Mauro Bertotti
Pela orientação, paciência, amizade e participação efetiva na minha formação
Dedico
AGRADECIMENTO(S)
Ao Prof. Dr. Lúcio Angnes, pela amizade, pela rica contribuição, principalmente no
exame de qualificação e pelos ensinamentos oferecidos durante a pós-graduação e o
desenvolver deste trabalho.
Ao Prof. Roberto Tokoro, pela amizade, convívio e conhecimentos transmitidos durante
o desenvolver deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Pedro Vitoriano de Oliveira, pela amizade e pelos ensinamentos
oferecidos.
À Prof. Dra. Silvia Helena Pires Serrano, pela amizade, por ter contribuído aceitando
participar do Exame de qualificação e pelos ensinamentos oferecidos.
À Prof. Dra. Marisa Helena Gennari de Medeiros pela amizade e por abrir as portas de
seu laboratório e permitiu que realizássemos trabalhos em conjunto.
À Prof. Dra. Bettina Malnic, por permitir a utilização e o uso de seu laboratório de
pesquisa para contribuir a este trabalho.
À Prof. Dra. Elisabeth de Oliveira, pela amizade e convivência durante o desenvolver
deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Fábio Rodrigo Piovezani Rocha, pela amizade, convivência e conversas
durante o desenvolver deste trabalho.
À Prof. Dra. Denise Freitas Siqueira Petri, por permitir a utilização e o uso de seu
laboratório de pesquisa para contribuir a este trabalho.
Aos demais docentes da Área de Química Analítica do IQ-USP, pela amizade e pelos
ensinamentos oferecidos.
A todos os docentes do IQ-USP pela sólida formação científica, que me permitiu
ingressar no programa de Pós-Graduação.
Aos técnicos Cristina, Nivaldo, Renato, Fernando, Vinícius e Roberto pelos constantes
auxílios.
Às funcionárias Lúcia e Luciana que sempre foram muito prestativas.
A todos os funcionários da Seção de Graduação, de Pós-Graduação e Assistência
Acadêmica, pela forma eficaz com que realizaram os seus trabalhos.
Aos amigos e ex-colegas (Alexandra, Audrei, Dennys, Fernanda, José Roberto, Luis,
Tiago, Vânia, Maiara e Denise) do Laboratório de Sensores Eletroquímicos e Métodos
Eletroanalíticos, pela amizade e pelos bons momentos.
Aos novos amigos e ingressantes (Juan e Roselyn) do Laboratório de Sensores
Eletroquímicos e Métodos Eletroanalíticos, sejam bem-vindos.
Aos amigos do LEEAA especialmente Cassiana, Paulo, Angerson, Danielle, Alexandre,
pela amizade e pelos bons momentos.
Ao meu segundo irmão, e eterno amigo, Rodrigo A. A. Munõz, pela amizade desde os
tempos de graduação.
Aos colegas e ex-colegas da pós-graduação pelas conversas e constantes ajudas (Renato,
Eduardo, Dosil, Camila, Lívea e Márcia).
À minha família, pela paciência, convivência, amizade e pela ajuda para que meus
sonhos pudessem ser realizados.
À Juliana, minha eterna companheira, pela paciência, apoio e carinho durante todos os
momentos desde que nos conhecemos.
Ao Goonies, o mais novo membro da família e fiel companheiro.
A todos que de alguma forma colaboraram no desenvolvimento deste trabalho.
À FAPESP (03/13757-0), CNPq, CAPES e Pró-Reitoria de Pós Graduação da USP pelo
suporte financeiro.
Muito Obrigado.
RESUMO
Paixão, T.R.L.C. Fabricação e Utilização de Microeletrodos para Determinações Amperométricas em Micro-Ambientes. 2007. 208p. Tese (Doutorado) - Programa de Pós-Graduação em Química (Química Analítica). Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Nesse trabalho são apresentados resultados sobre o desenvolvimento de
microeletrodos por desgaste eletroquímico de microfibras de dimensões da ordem de
100 µm de diferentes materiais (platina, ouro e fibra de carbono) visando à utilização
em micro-ambientes. Na grande maioria dos casos esse processo foi realizado utilizando
transformadores AC. Arranjo de microeletrodos construídos a partir de técnicas
litográficas também foram construídos.
A aplicabilidade de microeletrodos de Pt construídos por desgaste eletroquímico
foi avaliada para monitorar a concentração “in-situ” de ácido ascórbico em diferentes
frutas. O sensor foi capaz de avaliar a distribuição espacial da concentração de ácido
ascórbico "in-situ" em laranjas. A partir desses resultados, mapas para a concentração
de ácido ascórbico foram construídos. A correlação entre o estado de maturação e a
concentração de ácido ascorbico também foi observada a partir das medições realizadas
e concentrações maiores foram encontradas em frutas mais maduras. O arranjo de
microeletrodos foi utilizado para avaliar a concentração de iodato em amostra de sal de
cozinha utilizado pequenos volumes de amostra (500 µL).
Verificada a possibilidade de fabricação de microeletrodos de diferentes
geometrias e dimensões, estudos visando ao monitoramento e à detecção de DNA e
ácido ascórbico foram efetuados. Superfícies eletródicas modificadas com filmes de
óxido de rutênio hexacianoferrato (RuOHCF) foram utilizadas para a detecção
amperométrica de 2’-deoxiguanosina (dG) e ácido ascórbico por análise por injeção em
fluxo (FIA). O método para detecção de dG apresentou um resposta linear de 3,8 a 252
µmol L-1, com um limite de detecção de 94 nmol L-1. Aplicações em amostras de DNA
também foram realizadas, e os resultados para determinação da dG concordaram com os
obtidos pelo método padrão (HPLC). Estudos sobre o processo eletrocatalítico de
oxidação da dG em meio ácido em filmes de RuOHCF foram investigados utilizando
eletrodo rotativo.
Sobre esse mesma superfície modificada, o processo eletrocatalítico permitiu a
determinação de ácido ascórbico em pH = 6,9 a 0,0 V vs Ag/AgCl em FIA, com um
limite de detecção de 2,2 µmol L-1. Estudos sobre o processo eletrocatalítico de
oxidação do ácido ascórbico também foram avaliados com eletrodo rotativo. O método
foi aplicado para a determinação de ácido ascórbico em urina, obtendo-se bons valores
de recuperação (96 – 104 %). Microeletrodos contendo filmes eletrodepositados de
RuOHCF foram utilizados para monitorar o consumo de ácido ascórbico em 3
diferentes tipos de células neuronais (SH-SY5Y, células transfectadas com SOD
humana e mutante típica da doença de Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS)). Os
resultados do consumo de ácido ascórbico para essas células estão de acordo com os
níveis de estresse oxidativo induzido pela SOD mutante. Experimentos visando a
aplicabilidade de microeletrodos inseridos em células também foram efetuados.
Palavras-chave: microeletrodos, micro-ambientes, eletrodos modificados, DNA e
ácido ascórbico.
ABSTRACT
Paixão, T.R.L.C. Development of Microelectrodes for Amperometric Detection in Microenvironments. 2007. 208p. PhD Thesis - Graduate Program in Chemistry. Instituto de Química, Universidade de São Paulo, São Paulo.
Results on the development of microelectrodes fabricated by electrochemical
etching using fibers of different materials (platinum, gold and carbon fiber) and
dimensions (starting from 100 µm) for the application in micronenvironments are
presented. In almost all cases this procedure was carried out using AC transformer.
Array of microelectrodes were also fabricated by using litographic techniques.
The applicability of Pt microelectrodes fabricated by electrochemical etching
was evaluated in the in-situ monitoring of the ascorbic acid concentration in different
fruits. The sensor allowed spatial distribution of ascorbic acid concentration in oranges
to be found and concentration maps were constructed. A correlation between the
ripening stage and the ascorbic acid concentration was also observed from
electrochemical measurements, the ascorbic acid content being higher in mature fruits.
Studies on the detection of species involved in the oxidative stress process, such
as DNA and ascorbic acid, were also performed. Ruthenium oxide hexacyanoferrate
(RuOHCF) modified electrode surfaces were used as amperometric detectors for 2'-
deoxyguanosine (dG) and ascorbic acid determinations in FIA apparatus. The method
exhibited a linear response range to 2’-deoxyguanosine from 3.8 to 252 µmol L-1 dG
with detection limit of 94 nmol L-1. Applications in DNA samples were examined, and
the results for determination of 2'-deoxyguanosine were in good agreement with those
obtained by HPLC analysis. The dG electrocatalytic oxidation at a RuOHCF glassy
carbon (GC) modified electrode was investigated in acid medium by using rotating disc
electrode (RDE) voltammetry.
On this modified surface, the electrocatalytic process allowed the determination
of ascorbic acid to be performed at 0.0 V and pH = 6.9 with a limit of detection of 2.2
µmol L-1 in a flow injection configuration. The usefulness of the method was
demonstrated by an addition-recovery experiment with urine samples and the recovered
values were in the 96 to 104 % range. Investigations on the mechanism of the
electrocatalytic oxidation of ascorbic acid was also investigated at pH = 6.9 by using
RDE voltammetry. The RuOHCF carbon fiber modified microelectrode was used to
monitor the ascorbate uptake by control SH-SY5Y cells, and cells transfected with wild-
type Cu,Zn-Superoxide Dismutase (SOD) or with a mutant SOD (SOD G93A) typical
of familial Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS). Data on the rate of ascorbate uptake
by these cells were in agreement with the level of oxidative stress induced by the mutant
SOD. Attemps to use the microelectrodes inside single cells were also performed.
Keywords: microelectrode, microenvironments, modified electrode, DNA e ascorbic
acid.
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS κ: coeficiente de partição do substrato entre o filme e a solução
σ: desvio padrão
Γ: excesso superficial
ω: velocidade de rotação
ν: viscosidade cinemática
A: adenina
a: área
AC: do inglês, “Alternating Current”
ALS: do inglês, “Amyotrophic Lateral Sclerosis”
b0: concentração dos sítios eletrocatalíticos no filme
c ou cs: concentração do analito ou substrato
C: citosina
CoHCF: cobalto hexacianoferrato
D: coeficiente de difusão
dA: 2’ - desoxiadenosina
dC: 2’ - desoxicitidina
DC: do inglês, “Direct Current”
Dct: coeficiente de transporte de carga no filme
dG: 2’ - desoxiguanosina
dh-DNA: DNA dupla hélice
DMEM: do inglês, “Dulbecco's Modified Eagle's Medium”
DNA: do inglês, “Deoxyribonucleic Acid”
DSP: coeficiente de difusão do substrato no filme
dT: 2’ - desoxitimidina
E1/2: potencial de meia onda
ECS: eletrodo de calomelano saturado
Ep,a: potencial de pico anódico
Ep,c: potencial de pico catódico
EROs : espécies reativas de oxigênio
F: constante de Faraday
FeHCF: azul da Prússia ou ferro hexacianoferrato
fs-DNA: DNA fita simples
G: guanina
GC: do inglês, “Gas Chromatography”
GSH: glutationa reduzida
HOPGE: do inglês, “highly oriented pyrolytic graphite”
HPLC: do inglês, “High Performance Liquid Chromatography”
Ic: corrente capacitiva
Ik: corrente catalítica
IL: corrente limite
InHCF: índio hexacianoferrato
Ip: corrente de pico
IR: queda ôhmica
ITO: do inglês, “indium tin oxide”
jL: densidade da corrente limite
k: constante cinética do processo eletroquímico
k’ME: constante de velocidade do processo eletroquímico
L: espessura do filme
MEA: do inglês, “Microelectrode Array”
MEM: do inglês, “Minimum Essential Medium”
MHCF: metal hexacianoferrato
n : número de elétrons
PDDA: do inglês, “poly(diallydimethylammonium chloride)”
PDMA: do inglês, “polymer of N,N-dimethylaniline”
Q: carga
r : raio
RMS: do inglês, “root mean square”
RuHCF: rutênio hexacianoferrato
RuOHCF : óxido de rutênio hexacianoferrato
S: sensibilidade
SECM: do inglês, “Scanning Electrochemical Microscopy”
SFB: soro fetal bovino
SOD: Cu,Zn-superóxido dismutase
STM: do inglês, “Scanning Tunneling Microscopy”
T: temperatura
t: tempo
v: velocidade de varredura
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Geometria de microeletrodos e arranjo de microeletrodos usualmente
empregadas na literatura: microdisco (a), microanel (b), arranjo de microdiscos (c),
microbanda (d), microcilíndrico (e), microesfera (f), microhemisfério (g) e arranjo
interdigitado (h). ............................................................................................................... 1
Figura 2 – Estrutura das bases nitrogenadas do DNA. ................................................... 14
Figura 3 – Representação das estruturas moleculares de um nucleosídeo (A) e
nucleotídeo (B). .............................................................................................................. 14
Figura 4 – Representação esquemática de alguns processos de danos no DNA. O painel
a mostra a estrutura da 2’-desoxiguanosina no DNA. .................................................... 18
Figura 5 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico.
Eletrodos de grafite (A), Fibra de platina (B), Solução para a corrosão: CaCl2 saturada
(C) e solução não condutora: CCl4 (D)........................................................................... 35
Figura 6 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico das
fibras de Au (d = 100 µm). Fibra de ouro (A) e Eletrodo de platina (B). Solução para a
corrosão: HCl 4 mol L-1.................................................................................................. 36
Figura 7 – Esquema do processo de fabricação dos microeletrodos após desgaste
eletroquímico: (A) fibra com ponta afiada, (B) imersão da fibra no plastificante e (C)
processo de secagem do plastificante de borracha. ........................................................ 37
Figura 8 – Visão Lateral da matriz de microeletrodos. .................................................. 38
Figura 9 – “Design” completo do MEA (A), região central com 100 microeletrodos (B)
e “zoom” de 9 microeletrodos (C).................................................................................. 39
Figura 10 – Esquema da célula eletroquímica: eletrodo de referência (a), solução de
trabalho (b) e MEA (c). .................................................................................................. 40
Figura 11 – “Layout” e imagem do microeletrodo integrado......................................... 41
Figura 12 – Representação esquemática da célula de fluxo utilizada nos experimentos
em FIA: Eletrodo de Trabalho (A), Referência (B) e Auxiliar (Aço inox) (C).............. 44
Figura 13 – Micromanipulador utilizado nos experimentos utilizando os fibroblastos. 51
Figura 14 – Esquema do processo de desgaste eletroquímico da fibra de platina em
função do tempo (t). Pt4+ = ● e Cl- = o. .......................................................................... 53
Figura 15 – Sinal amperométrico registrado durante desgaste eletroquímico de fibra de
platina de diâmetro igual a 100 μm. Freqüência alternada de 60 Hz e potencial eficaz 5
V. Em (A) ocorreu o rompimento da fibra. ................................................................... 53
Figura 16 – As duas extremidades de uma fibra de platina que sofreu o processo de
corrosão. Extremidade superior (A) e extremidade inferior (B). Potencial eficaz
utilizado = 5 V. ............................................................................................................... 55
Figura 17 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um
processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz
de 5 V. ............................................................................................................................ 56
Figura 18 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um
processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz
de 10 V. .......................................................................................................................... 57
Figura 19 – Amperograma registrado durante o processo de desgaste eletroquímico da
fibra de ouro de diâmetro igual a 100 μm. Diferença de potencial entre os eletrodos =
1,7 V e solução para corrosão = HCl 4 mol L-1.............................................................. 59
Figura 20 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de ouro após processo de
desgaste eletroquímico. .................................................................................................. 59
Figura 21 – Fibra de platina desgastada eletroquimicamente antes (A) e após (B) a
selagem com plastificante de borracha........................................................................... 60
Figura 22 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K4Fe(CN)6 20 mol L-1 +
KCl 0,1 mol L-1. A e B referem-se a dois diferentes microeletrodos de platina (A) e ouro
(B) fabricados pelo processo de desgaste eletroquímico. Velocidade de varredura: 50
mV s-1. ............................................................................................................................ 61
Figura 23 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1
+ KCl 0,1 mol L-1. Microeletrodo de Pt 1 sem (A) e com (B) pré-tratamento (Como
descrito na parte experimental) e microeletrodo de platina 2 (C) após pré-tratamento.
Velocidade de varredura: 50 mV s-1. .............................................................................. 62
Figura 24 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 12,5 mmol
L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Microeletrodo de fibra de
carbono. .......................................................................................................................... 63
Figura 25 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1
+ KCl 0,1 mol L-1, utilizando 2 microeletrodos de Pt de áreas diferentes. Registros
realizados com (⎯⎯) e (- - -) sem o referência integrado. Em (- - -) utilizou-se
Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. . 64
Figura 26 – Microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado e ampliação da
ponta do eletrodo. ........................................................................................................... 65
Figura 27 – Microscopia eletrônica de varredura do dispositivo no qual a disposição do
eletrodo de ficou mais próxima da ponta do microeletrodo. .......................................... 66
Figura 28 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de isolamento da
microfibra de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Solução: Fenol 0,1 mol L-1 +
NaOH 1 mol L-1. Número de ciclos: 50. Na Figura estão representados os ciclos de 1 a
15 e o quinqüagésimo ciclo. ........................................................................................... 68
Figura 29 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 10 mmol L-1
+ KCl 0,1 mol L-1, utilizando microeletrodo recoberto com a camada polimérica.
Velocidade de varredura: 50 mV s-1. .............................................................................. 69
Figura 30 – Imagem antes (A) e após (B) a polarização dos microeletrodos em -1,5 V vs
Ag/AgCl. Eletrólito suporte: H2SO4 1 mol L-1. .............................................................. 71
Figura 31 – Voltamogramas registrados em solução contendo Fe(CN)63- 1 mmol L-1 +
KCl 1 mol L-1 de 2 microeletrodos interconectados (a). Os voltamogramas (b e c)
representam, cada, 25 microeletrodos interconectados. O voltamograma (d) foi
registrado com um grupo de 50 microeletrodos. Velocidade de varredura de 50 mV s-1.
........................................................................................................................................ 72
Figura 32 – Voltamogramas registrados em solução contendo 10 mmol L-1 de ácido
ascórbico. Eletrólito suporte: NaOH 0,1 mol L-1 (A), tampão fosfato pH = 7,0 (B),
Tampão Ac-/HAc pH = 5,6 (C) e HCl 0,01 mol L-1 (D). Microeletrodos de platina e
velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. .................................................................... 74
Figura 33 – Voltamogramas consecutivos registrados em solução de HCl 0,01 mol L-1 +
10 mmol L-1 de ácido ascórbico em dois diferentes eletrodos de platina: microeletrodos
(A, B) e macroeletrodos (C,D): 1º Ciclo (A,C) e 2º Ciclo (B,D). .................................. 75
Figura 34 – Voltamogramas lineares obtidos utilizando-se microeletrodo de platina a 50
mV s-1: suco de laranja antes (A) e após (B) 30 minutos da adição de cubos de pepino
(B). A Curva C foi obtida em tampão fosfato, pH = 7. .................................................. 76
Figura 35 – Voltamograma registrado “in-situ” em uma laranja utilizando microeletrodo
de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Imagem da posição do eletrodo na
laranja na foto acima....................................................................................................... 79
Figura 36 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas
registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor
na escala XY representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta
não madura e madura, respectivamente.......................................................................... 82
Figura 37 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas
registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor
na escala XZ representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta
não madura e madura, respectivamente.......................................................................... 83
Figura 38 – Voltamogramas lineares registrados “in-situ” em uma goiaba: no centro (A)
e próximo à casca (B). Microeletrodo utilizado: platina e velocidade de varredura de 50
mV s-1. ............................................................................................................................ 85
Figura 39 – Sinais amperométricos registrados pela injeção de 5 μL de amostra de
iodato 1 mmol L-1 à solução de trabalho (200 μL) colocada sobre o MEA (I- 100 mmol
L-1 + H2SO4 1 mmol L-1. Alíquotas foram injetadas em duas diferentes regiões: região
periférica (a) e na região central (b). No quadro apresenta-se a curva de calibração
obtida usando as correntes de estado estacionário.......................................................... 88
Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato (d) na
presença de guanina 0,2 mmol L-1 + dG 0,5 mmol L-1 (a), dGMP 0,5 mmol L-1 (b), dG
0,5 mmol L-1 (c). Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros
voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de
varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo. ............................................................. 89
Figura 41 – Reação do cloroacetaldeído com a dG e voltamogramas de pulso diferencial
registrados em tampão fosfato pH = 7,2 (a) contendo dG 0,4 mmol L-1 (b) e dG 0,4
mmol L-1 + cloroacetaldeído 60 mmol L-1 (c). Monitorou-se o progresso da reação após
19 horas (d) de incubação com cloroacetaldeído a 37ºC. Pré-tratamento da superfície do
eletrodo em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50
mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono
vítreo............................................................................................................................... 91
Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados para adições sucessivas de
eteno aduto em tampão fosfato pH = 7,2. Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por
180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso:
50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.......................... 92
Figura 43 – Reação paralela que pode ocorrer na formação do etenoaduto na célula. .. 94
Figura 44 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da
superfície de carbono vítreo com CoHCF em solução contendo K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1
+ CoCl2 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do
eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 15. ................................................................. 96
Figura 45 – Verificação da estabilidade do filme de CoHCF em NaCl 0,5 mol L-1.
Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2............................ 97
Figura 46 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da
superfície de carbono vítreo com InHCF em solução contendo InCl3 1 mmol L-1 +
K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de
varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 25. .............. 98
Figura 47 – Verificação da estabilidade do filme de InHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl
0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2...... 99
Figura 48 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da
superfície de carbono vítreo com RuHCF em solução contendo RuCl3 1 mmol L-1 +
K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de
varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 60. ............ 100
Figura 49 – Verificação da estabilidade do filme de RuHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl
0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.... 101
Figura 50 – Voltamogramas cíclicos registrados em carbono vítreo (A), e eletrodos
contendo filmes de CoHCF (B), RuHCF (C) e InHCF (D) na presença (−−−) e ausência
(- - -) de 1 mmol L-1 de dG. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: ver
respectiva modificação para cada eletrodo. Modificação realizada utilizando 15 ciclos.
...................................................................................................................................... 102
Figure 51 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura da superfície do carbono
vítreo (A) e modificada com o filme de RuHCF. Espectros utilizando espectroscopia de
difração de raio-X para uma superfície modificada com filmes de RuHCF (Γ = 7,80 x
10-9 mol cm-2)(- - -) e FeHCF (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2)(⎯). .................................... 104
Figura 52 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo modificado com filme de RuOHCF em
diferentes velocidades de varredura em eletrólito suporte 0,5 mol L-1 NaNO3 + 0,01 mol
L-1 HCl. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. O valor do potencial utilizado para obtenção do
gráfico de Ip contra v foi 0,93 V. .................................................................................. 105
Figura 53 – Estudos cronoamperométricos para o eletrodo modificado com RuOHCF
em diferentes valores de Γ: 1,81 (a), 4,47 (b) e 7,80 mol cm-2 (c). Degrau de potencial
de 0,0 a 1,2 V em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. A linha
tracejada corresponde à regressão linear dos dados coletados na região de tempos
curtos. ........................................................................................................................... 106
Figura 54 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo
modificado com RuOHCF (Γ = 8,12 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de
rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20
mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para
correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em
potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. ........................................................................... 109
Figura 55 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo
modificado com RuOHCF (Γ = 9,56 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de
rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20
mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para
correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em
diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. .......................................................... 110
Figura 56 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo
modificado com RuOHCF (Γ = 10,2 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de
rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20
mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para
correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em
diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. .......................................................... 111
Figura 57 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo
modificado com RuOHCF (Γ = 11,9 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de
rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20
mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para
correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em
diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. .......................................................... 112
Figura 58 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 +
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo
modificado com RuOHCF (Γ = 16,8 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de
rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20
mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para
correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em
diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V. .......................................................... 113
Figura 59 – Gráfico de IL vs ω1/2 em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol
L-1 + HCl 0,05 mol L-1 utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com
RuOHCF a diferentes velocidades de rotação utilizando diferentes valores de excesso
superficial: 8,12 x 10-10, 9,55 x 10-10, 10,3 x 10-10, 11,9 x 10-10, 16,8 x 10-10 mol cm2 .
Velocidade de varredura: 20 mV s-1. ............................................................................ 114
Figura 60 – Dependência de log k’ME em função do log Γ para processo de oxidação da
dG em filmes de RuOHCF. Condições experimentais: 1mmol L-1 de dG, eletrólito
suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Excesso superficial variando de 9,55 a
16,8 x 10-10 mol cm-2. ................................................................................................... 117
Figura 61 – Dependência dos valores de corrente, do termo cinético, medidos em ω-1/2 =
0 em função do excesso superficial. Condições experimentais descritas na Figura 58.118
Figura 62 – Voltamogramas cíclicos registrados em eletrólito suporte antes (- - -) e após
(⎯⎯) adição de dG (concentração final em solução = 2 mmol L-1) utilizando eletrodo
de carbono vítreo (A) e eletrodo de carbono vítreo modificado com FeHCF (B) (Γ =
2,21 x 10-8 mol cm-2). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3
0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. ................................................................................... 119
Figura 63 – Voltamogramas hidrodinâmicos para injeções de solução de dG 252 μmol
L-1 em eletrodo de carbono vítreo (▲) e modificado com filme de RuOHCF (■). Vazão:
0,55 mL min-1, volume de amostra: 60 μL e solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 +
HCl 0,05 mol L-1........................................................................................................... 122
Figura 64 – Influência da vazão (A, 0,26 (a), 0,55 (b), 0,70 (c), 1,1 (d), 1,6 (e) e 2,0 (f)
mL min-1) e volume de amostra (B, 50 (a), 100 (b), 150 (c), 200 (d), 250 (e) µL) para
repetidas injeções de dG 252 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de
RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e em (B) vazão de 0,50 mL min-1. Solução
carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ................................ 123
Figura 65 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de dG 38,5 μmol L-1
utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3
0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 1,6 mL min-1 e volume de amostra: 100 μL. E =
1,1 V. ............................................................................................................................ 124
Figura 66 – Sinais de corrente de pico para injeções de solução de dG com as seguintes
concentrações: 3,85 (a), 19,3 (b), 38,5 (c), 96,3 (d) e 252 (e) μmol L-1 e duas amostras
de DNA (s1 e s2). O quadro inserido na figura mostra a dependência da corrente de pico
medida em função da concentração de dG. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 +
HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ........................................................................................ 126
Figura 67 – Dependência da sensibilidade do eletrodo modificado com o tempo.
Velocidade do fluxo: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL, solução carregadora:
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. ..................................................... 127
Figura 68 – Comparação dos resultados obtidos pelos métodos proposto e HPLC para
análise de dG em 17 amostras de DNA. As linhas tracejadas representam o limite de 95
% de confiança. ............................................................................................................ 128
Figura 69 – Sexagésimo voltamograma cíclico registrado no processo de modificação
do eletrodo com o filme RuOHCF (A). Em (B) estão mostrados o último ciclo do
processo de verificação da estabilidade (a) e adições sucessivas de ácido ascórbico (b-f)
(concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1(f)). Em (C)
está mostrado o registro voltamétrico realizado em uma solução contendo 4,76 mmoL
L-1 de ácido ascórbico. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3
0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. ................................................................................... 131
Figura 70 – Primeiro (⎯⎯) e sexagésimo (- - -) voltamograma cíclico registrado em
tampão fosfato pH = 6,9 contendo RuCl3 1 mmol L-1 + Fe(CN)63- 1mmol L-1 usando
eletrodo de carbono vítreo. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. .............................. 133
Figura 71 – Voltamogramas cíclicos registrados utilizando eletrodo modificado de
RuOHCF na ausência (a) e presença de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de
0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1 (f)) e utilizando eletrodo limpo de
carbono vítreo em solução contendo 4,76 mol L-1 de ácido ascórbico (- - -). Eletrólito
suporte: Tampão fosfato pH = 6,9. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 5,30 x 10-9
mol cm-2........................................................................................................................ 134
Figura 72 – Voltamogramas hidrodinâmicos (A) registrados em tampão fosfato pH =
6,9 (a) e ácido ascórbico (b-f) 1 mmol L-1 usando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ =
2,79 x 10-9 mol cm-2) em diferentes velocidades de rotação: 0 (a), 100 (b), 400 (c), 900
(d), 1600 (e) e 2500 (f). Em B estão representados os gráficos de Levich para diferentes
valores de concentração de ácido ascórbico em solução tampão pH 6,9 : 1 (-), 2 (-), 3 (-
), 4 (-) e 5 mmol L-1(-). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. ...................................... 136
Figura 73 – Gráficos de Koutecký-Levich para os valores de corrente registrados na
Figura 16B. Mesmas condições experimentais da Figura 72. ...................................... 137
Figura 74 – Dependência do log k’ME contra log cs. Condições experimentais da Figura
72. ................................................................................................................................. 138
Figura 75 – Dependência do log k’ME contra log Γ. Os valores de excesso superficial
utilizado nos experimentos foram: 2,61, 7,82, 14,7 e 24,7 x 10-10 mol cm-2, demais
condições vide Figura 16. Concentração de ácido ascórbico: 1 mmol L-1. .................. 140
Figura 76 – Voltamograma hidrodinâmico para injeções de solução de ácido ascórbico 1
mmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo modificado com filme de RuOHCF. Vazão: 1,6
mL min-1, volume de amostra: 100 μL e solução carregadora: Tampão fosfato pH 6,9. Γ
= 5,22 x 10-9 mol cm-2................................................................................................... 143
Figura 77 – Influência da vazão (A) e volume de amostra (B) para repetidas injeções de
ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em
(A) utilizou-se alça de 100 μL e os seguintes valores de vazão: 0,26 (a), 0,70 (b), 1,1
(c), 1,6 (d), 2,0 (e), 2,5 (f), 2,6 (g) mL min-1. Em (B) a vazão utilizada foi 2,0 mL min-1
e as alças: 100 (a), 150 (b), 200 (c) e 250 (d) μL. Variou-se a solução carregadora:
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2. ............ 145
Figura 78 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de
RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a),
100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1. Solução carregadora: tampão fosfato pH
6,9. E = 0,0 (A) e 0,4 (B) V. Inserida em cada uma das figuras está a curva de
calibração para cada potencial de trabalho. .................................................................. 147
Figura 79 – Corrente de pico obtidas para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol
L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora:
NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150
μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.......................................................................... 149
Figura 80 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol
L-1 + glicose 2 mmol L-1 (a), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + nitrito 2 mmol L-1 (b), ácido
ascórbico 1 mmol L-1 + ácido úrico 2 mmol L-1 (c) e ácido ascórbico 1 mmol L-1 (d)
utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: tampão
fosfato pH = 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22
x 10-9 mol cm-2.............................................................................................................. 150
Figura 81 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de
RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a),
100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1 e duas amostras de urina (s1 e s2). Solução
carregadora: tampão fosfato pH 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL.
E = 0,0. ......................................................................................................................... 151
Figura 82 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação (A)
com RuOHCF da superfície de fibra carbono (r = 14,5 m) em solução contendo RuCl3 1
mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 e
verificação da estabilidade (B) em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol
L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Em C o voltamograma do eletrodo em
tampão fosfato (pH = 6,9). Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. .................................................... 155
Figura 83 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 2,3
μm) modificado com filme de RuOHCF em solução de tampão fosfato pH = 6,9 antes e
após a adição de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11 mmol L-1. O quadro inserido na
figura mostra as curvas de calibração obtidas em duas diferentes regiões das curvas
voltamétricas: 0,0 (A) e 0,2 (B) V. Velocidade de varredura: 100 mV s-1................... 157
Figura 84 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r =
14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF em MEM (A) e tampão fosfato pH = 6,9
(B). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. ........................... 158
Figura 85 – Sinais amperométricos (A) obtidos utilizando microeletrodo de fibra de
carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para injeções de glutaniona
(a) (concentração final de 0,5 mmol L-1) e ácido ascórbico (b-f) (concentração final
igual a 0,082 (b), 0,16 (c), 0,24 (d), 0,40 (e), 0,55 (f), 0,69 (g) mmol L-1) em MEM.
Sinais amperométricos (B) obtidos utilizando microeletrodo modificado com RuOHCF
para injeção de 100 μL de MEM concentrado (h)em tampão fosfato (6 mL). O painel C
representa a curva de calibração para adições sucessivas de ácido ascórbico em MEM. E
= 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8
mol cm-2........................................................................................................................ 159
Figura 86 – Sensibilidade do microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm)
modificado com filme de RuOHCF para curvas de calibração construídas na faixa de
0,5 – 1,5 mmol L-1 em meio MEM durante 120 horas. E = 0,0 V vs Ag/AgCl.
Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2. ................ 161
Figura 87 – Sinais amperométricos registrados utilizando microeletrodo de fibra de
carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF no meio de cultura contendo
0,5 mmol L-1 de glutationa + 0,2 mmol L-1 de ácido ascórbico sem e com as células. E =
0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos realizados sem agitação magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol
cm-2. .............................................................................................................................. 162
Figura 88 – Imagem obtida do fibroblasto utilizando microscópio invertido. ............. 164
Figura 89 – Imagem obtida utilizando microscópio invertido durante o processo de
formação dos fungos..................................................................................................... 165
Figura 90 – Imagem e registro voltamétrico no fibroblasto utilizando a técnica de pulso
diferencial. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 70 ms e velocidade de
varredura: 5 mV s. Eletrodo: Microeletrodo de Platina................................................ 166
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 – Procedimentos para desgaste eletroquímico de fibras de carbono. ................ 7
Tabela 2 – Trabalhos reportados na literatura para determinação de ácido ascórbico. .. 28
Tabela 3 – Composição do plastificante de borracha (PlastiFilm, QUIMATEC®). Fonte:
http://www.quimatic.com.br/fispqs/fispq_plast_film.pdf................................................ 37
Tabela 4 - Valores de adição e recuperação usando três diferentes sucos de laranja..... 77
Tabela 5 – Medidas de resistência, E1/2 e IL em diferentes posições do microeletrodo e
do eletrodo de referência inseridos na laranja. ............................................................... 80
Tabela 6 – Valores de corrente limite e concentração obtidos com o microeletrodo de Pt
em diferentes frutas. ....................................................................................................... 86
Tabela 7 – Valores de Dct1/2, b0 e Dct para diferentes valores de Γ e L (Espessura,
medida por elipsometria). ............................................................................................. 107
Tabela 8 – Equações que definem a constante de velocidade de processos heterogêneos
para eletrodos modificados, k’ME e ordem de k’ME contra L (ou Γ) e concentração
(Albery e Hillman, 1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al.,
2002)............................................................................................................................. 116
Tabela 9 – Valores de limite de detecção para determinação de dG na literatura........ 129
Tabela 10 – Valores de concentração encontrado em 4 diferentes amostras de urina
utilizando o método proposto ....................................................................................... 152
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................... 1
1.1. MICROELETRODOS............................................................................................................ 1
1.1.1. DEFINIÇÃO ....................................................................................................................... 1
1.1.2. MICROELETRODOS VOLTADOS PARA DETECÇÃO EM MICROAMBIENTES ......................... 9
1.2. ÁCIDOS NUCLEICOS ......................................................................................................... 13
1.2.1. DANOS NO DNA............................................................................................................. 16
1.3. ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA (ALS) ................................................................ 22
1.4. ÁCIDO ASCÓRBICO.......................................................................................................... 25
1.4.1. ÁCIDO ASCÓRBICO EM NEURÔNIOS ............................................................................... 29
2. OBJETIVO......................................................................................................................... 31
3. PARTE EXPERIMENTAL .............................................................................................. 32
3.1. REAGENTES...................................................................................................................... 32
3.2. INSTRUMENTAÇÃO .......................................................................................................... 33
3.3. PROCESSO DE FABRICAÇÃO DOS MICROELETRODOS.................................................... 34
3.3.1. DESGASTE ELETROQUÍMICO........................................................................................... 34
3.3.2. FABRICAÇÃO DA MATRIZ DE MICROELETRODOS (MEA, MICROELECTRODE ARRAY)
UTILIZANDO LITOGRAFIA. ........................................................................................................... 37
3.3.3. CONSTRUÇÃO DO MICROELETRODO INTEGRADO........................................................... 40
3.3.4. CONSTRUÇÃO DO MICROELETRODO: ISOLAMENTO COM POLÍMERO NÃO CONDUTOR... 41
3.4. PROCEDIMENTO DE POLIMENTO POTENCIODINÂMICO ................................................ 41
3.5. MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DOS ELETRODOS COM FILMES DE
HEXACIANOFERRATOS (HCF)................................................................................................... 42
3.6. CÉLULA DE PARA ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO .................................................... 43
3.7. AMOSTRAS DE DIFERENTES FRUTAS .............................................................................. 44
3.8. TRATAMENTO ENZIMÁTICO ........................................................................................... 45
3.9. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA.......................................................................... 45
3.10. PREPARAÇÃO DAS AMOSTRAS DE URINA...................................................................... 46
3.11. MÉTODO COULOMÉTRICO ............................................................................................ 46
3.12. MÉTODO CROMATOGRÁFICO ....................................................................................... 47
3.13. MICROSCOPIA ELETRÔNICA DE VARREDURA ............................................................. 47
3.14. ELIPSOMETRIA............................................................................................................... 48
3.15. CULTURA DE NEUROBLASTOMAS HUMANOS ............................................................... 48
3.16. AVALIAÇÃO DO CONSUMO DE ASCORBATO PELAS CÉLULAS SH-SY5Y UTILIZANDO
MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE ÓXIDO DE RUTÊNIO HEXACIANOFERRATO 49
3.17. MEDIDAS ELETROQUÍMICAS EM UMA ÚNICA CÉLULA ................................................ 50
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 52
4.1. FABRICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DOS MICROELETRODOS ........................................ 52
4.1.1. MICROELETRODOS FABRICADOS POR DESGASTE ELETROQUÍMICO ............................... 52
4.1.2. MICROELETRODOS FABRICADOS UTILIZANDO TÉCNICA LITOGRÁFICA ......................... 70
4.2. UTILIZAÇÃO DOS SENSORES FABRICADOS ..................................................................... 73
4.2.1. MONITORAMENTO “IN-SITU” DE ÁCIDO ASCÓRBICO EM FRUTAS .................................. 73
4.2.2. QUANTIFICAÇÃO DE IODATO EM SAL UTILIZANDO MATRIZ DE MICROELETRODOS (MEA)
86
4.3. ESTUDO DO COMPORTAMENTO ELETROQUÍMICO DE CONSTITUINTES DO DNA ........ 89
4.4. MODIFICAÇÃO DA SUPERFÍCIE DO ELETRODO .............................................................. 95
4.5. ESTUDO DAS PROPRIEDADES ELETROQUÍMICAS DO FILME DE RUHCF .................... 103
4.6. ESTUDO DA OXIDAÇÃO ELETROCATALÍTICA DA DG NA SUPERFÍCIE DO ELETRODO
MODIFICADO DE RUOHCF...................................................................................................... 108
4.7. OTIMIZAÇÃO E UTILIZAÇÃO DO ELETRODO MODIFICADO COM RUOHCF PARA
DETECÇÃO DE DG EM FLUXO EM AMOSTRAS HIDROLISADAS DE DNA. ............................... 121
4.8. ESTUDO DA OXIDAÇÃO ELETROCATALÍTICA DE ÁCIDO ASCÓRBICO NA SUPERFÍCIE DO
ELETRODO MODIFICADO DE RUOHCF .................................................................................. 130
4.9. OTIMIZAÇÃO DOS PARÂMETROS ANALÍTICOS EM FLUXO PARA DETECÇÃO DE ÁCIDO
ASCÓRBICO EM MEIO NEUTRO UTILIZANDO O ELETRODO MODIFICADO COM RUOHCF .. 142
4.10. DESENVOLVIMENTO DE METODOLOGIA PARA A DETERMINAÇÃO DE ASCORBATO EM
MEIO DE MEM E GLUTATIONA UTILIZANDO MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE
ÓXIDO DE RUTÊNIO HEXACIANOFERRATO ............................................................................. 153
4.11. DETERMINAÇÃO DO CONSUMO DE ASCORBATO PELAS CÉLULAS SH-SY5Y
UTILIZANDO MICROELETRODO MODIFICADO COM FILME DE ÓXIDO DE RUTÊNIO
HEXACIANOFERRATO .............................................................................................................. 161
4.12. ESTUDOS EM CÉLULAS ÚNICAS ................................................................................... 163
5. CONCLUSÃO.................................................................................................................. 167
6. PERSPECTIVAS FUTURAS ......................................................................................... 170
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS........................................................................... 171
Introdução 1
1. Introdução
1.1. Microeletrodos
1.1.1. Definição
Microeletrodos, muitas vezes chamados de ultramicroeletrodos, são sensores
químicos com dimensões micrométricas ou sub-micrométricas (Stulik, Amatore et al.,
2000). A Figura 1 mostra diferentes tipos de geometrias de microeletrodos e arranjos de
microeletrodos utilizados. Combinações de algumas dessas configurações para
fabricação de arranjo de microeletrodos também são encontradas na literatura.
(a) (b) (c) (d)
(e) (f) (g) (h)
Figura 1 – Geometria de microeletrodos e arranjo de microeletrodos usualmente empregadas na literatura: microdisco (a), microanel (b), arranjo de microdiscos (c), microbanda (d), microcilíndrico (e), microesfera (f), microhemisfério (g) e arranjo interdigitado (h).
Na definição do termo “microeletrodo”, não somente fatores como tamanho e
forma da superfície eletródica devem ser levados em consideração mas, adicionalmente,
parâmetros temporais da técnica eletroanalítica empregada que governam a espessura da
camada de difusão (Stulik, Amatore et al., 2000). Eletrodos de tamanho convencional (r
Introdução 2
= 10-4 m) podem, sob certas condições experimentais, responder como microeletrodo.
Entretando, para que esse comportamento seja mantido em outras condições
experimentais é necessário que o eletrodo apresente tamanho substancialmente menor (r
= 10-6 m) (Stulik, Amatore et al., 2000). Dessa forma, a definição de microeletrodo
como eletrodo de tamanho micrométrico é arbitrária. Nesse sentido, a definição de
microeletrodo pode ser mais abrangente (Stulik, Amatore et al., 2000) e referir-se a
qualquer eletrodo cujas dimensões, dentro de uma dada condição experimental, sejam
comparáveis ou menor que a camada de difusão, δ. Sob essas condições, um perfil de
estado estacionário ou pseudo estado estacionário (microeletrodos cilíndricos) é obtido.
Eletrodos com essa característica descrita acima apresentam um comportamento
eletroquímico diferenciado, com voltamogramas apresentando um perfil sigmoidal
referente ao estado estacionário. A obtenção do estado estacionário deve-se
predominantemente ao transporte de massa diferenciado nessas superfícies eletródicas,
em que prevalece a difusão radial.
No estado estacionário, a superfície do microeletrodo é envolvida por uma
camada de difusão hemisférica. Com isso, a resposta para a alteração de um valor de
potencial, de um valor onde j = 0, para um valor onde o processo eletroquímico é
controlado por difusão, pode ser descrito para um microeletrodo de disco por:
rnFDc
tcnFDjL ππ
42/12/1
2/1
+= (1)
onde, jL é definido como densidade de corrente no estado estacionário, n número de
elétrons, F constante de Faraday, D coeficiente de difusão da espécie eletroativa, c
concentração da espécie eletroativa no seio da solução, t tempo após a alteração para o
potencial onde o processo eletroquímico é governado por difusão e r raio do
microeletrodo. O primeiro termo da equação é idêntico ao definido para um degrau de
potencial para eletrodos de tamanho convencional, entretanto, o segundo termo é o que
Introdução 3
define a condição de estado estacionário. Nota-se pela análise da equação 1 que o
primeiro termo é dominante em tempos curtos, e o segundo em tempos longos. Além
disso, existe um meio termo, com relação ao tempo, onde a equação deve ser utilizada
na sua forma completa. Vale salientar que essas condições de contorno na equação 1 são
dependetes do raio do microeletrodo. Dessa forma, na condição de estado estacionário a
equação é descrita por:
rnFDcjL π
4= (2)
e a corrente como:
nFDcrI L 4= (3)
onde IL é definido como corrente no estado estacionário.
Uma vez definido o conceito de microeletrodos, é necessário entender as
vantagens que nos últimos vinte anos têm atraído tanto interesse de pesquisadores na
área de eletroanalítica para esse tipo de eletrodo. São elas (Adams, 1976; Wightman,
1981; Hepel e Osteryoung, 1982; Ewing, Bigelow et al., 1983; Bond, Fleischmann et
al., 1984a; b; Howell e Wightman, 1984b; a; Ghoroghchian, Sarfarazi et al., 1986;
White e Jorgenson, 1986; White, Stclaire et al., 1986; Baranski, 1987; Wightman e
Wipf, 1989; Stulik, Amatore et al., 2000):
- A corrente de estado estacionário para processos faradaicos é obtida em um curto
espaço de tempo;
- A razão corrente faradaica/corrente capacitiva, IF/IC, é aumentada, uma vez que a
corrente capacitiva decai proporcionalmente com a área do eletrodo, enquanto que a
corrente faradaica é proporcional aos parâmetros dimensionais do eletrodo;
- Baixa sensibilidade à queda ôhmica, IR, possibilitando estudos eletroquímicos de
sistemas redox em solventes com elevada resistência ou na ausência de eletrólito
Introdução 4
suporte (devido aos baixos valores de corrente medidos com microeletrodos, o produto
IR é desprezível para um amplo intervalo de valores de resistência);
- O potencial aplicado pode ser variado rapidamente, porque a corrente capacitiva é
minimizada;
- A razão sinal/ruído em condições de estado estacionário é melhorada quanto
comparada com eletrodos de tamanho convencional;
- Aumento do transporte de massa da espécie eletroativa para a superfície do eletrodo e,
conseqüentemente, pouca interferência de efeitos hidrodinâmicos sobre o sinal de
corrente;
- O pequeno tamanho dos eletrodos pode propiciar a sua utilização para a exploração de
domínios microscópicos (pequenos volumes de amostra).
Inicialmente as pesquisas sobre microeletrodos (Wightman, 1988) foram focadas
no desenvolvimento de métodos para construção de eletrodos de diferentes geometrias e
tamanhos. Hoje em dia (Wightman, 2006) esses métodos são relativamente bem
conhecidos, embora o interesse por novos métodos de fabricação ainda seja grande. A
fabricação de eletrodos micrométricos pode ser feita simplesmente selando microfibras
de carbono, ou outro metais (Au e Pt), dentro de um isolante apropriado (por exemplo,
vidro); alternativamente, técnicas litográficas (Kittlesen, White et al., 1984; White,
Kittlesen et al., 1984; Sanderson e Anderson, 1985; Thormann, Vandenbosch et al.,
1985; Bard, Crayston et al., 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick, Anderson et
al., 1986; Hepel e Osteryoung, 1986) podem ser utilizadas para a fabricação desses
microeletrodos para utilização em medidas de microscopia de forca atômica (Dobson,
Weaver et al., 2005), por exemplo. Métodos para a fabricação de eletrodos com
dimensões submicrométricas são menos comuns que aqueles devotados para eletrodos
micrométricos (Wightman, 2006), embora nos últimos anos esse tipo de fabricação
Introdução 5
tenha recebido mais atenção da comunidade científica (Powell, Woods et al., 2005;
Wang, Chen et al., 2005; Hermans e Wightman, 2006).
Uma das técnicas empregadas para a fabricação de eletrodos submicrométricos
de platina envolve o uso de fibras “Wollaston” (do inglês), que são fibras de platina
recobertas por uma camada de prata para aumentar o diâmetro e propiciar uma maior
facilidade de manipulação. Bond e colaboradores (Bond, Fleischmann et al., 1984a)
utilizaram fibras “Wollaston” encapsuladas em vidro por aquecimento, após remoção
da prata eletroquimicamente. A partir deste método, estes autores conseguiram fabricar
eletrodos de disco de platina da ordem de 0,5 μm. Contudo, o número de tentativas para
se obter um eletrodo desta magnitude foi muito alto. Eletrodos da ordem de 40Å foram
reportados na literatura (Sacharoff, Westervelt et al., 1985) utilizando-se o processo
descrito por Bond e colaboradores (Bond, Fleischmann et al., 1984a).
Itaya e colaboradores (Itaya, Abe et al., 1987) descreveram um processo para a
fabricação de microeletrodos submicrométricos baseado no afinamento eletroquímico
de fibras de platina comerciais utilizando mistura dos sais NaNO3 e NaCl (4:1) fundidos
e desgaste eletroquímico utilizando potencial AC (1-50 Hz, 2,5 V, tamanho final da
fibra menor que 100 nm), aplicado com a utilização de um potenciostato. Essa técnica
foi utilizada para a preparação de pontas de prova para STM (do inglês, “Scanning
Tunneling Microscopy”) (Muller e Tsong, 1969) e para o monitoramento do potencial
extracelular de células isoladas (Merrill e Ainswort.A, 1972). Outras soluções utilizadas
para a fabricação de pontas de prova para STM e/ou fabricação de microeletrodos de
platina são reportadas na literatura, como por exemplo: solução saturada de
CaCl2:H2O:HCl concentrado (Liu, Fan et al., 1986), solução saturada de nitrito (Slevin,
Gray et al., 1999; Conyers e White, 2000), ou utilização de um sistema bifásico de
CaCl2:H2O:HCl concentrado + CCl4 (Song, Pryds et al., 1993) ou tricloro acetato
Introdução 6
(Sorensen, Hvid et al., 1999). Após a obtenção destas microestruturas, um processo de
isolamento das mesmas é necessário. O processo de isolamento das fibras mais
comumente encontrado na literatura emprega resina epóxi (Sorensen, Hvid et al., 1999),
ou ainda, eletropolimerização a partir de monômeros como o alilfenol ou oxifenileno
(Meister e Potje-Kamloth, 1998).
Procedimentos para fabricação de eletrodos submicrométricos de outros
materiais como por exemplo, fibra de carbono, também são reportados na literatura.
Chen e Kucernak (Chen e Kucernak, 2002) utilizaram fibras de carbono com tamanho
inicial de 3,6 µm e desgaste eletroquímico utilizando potencial AC em solução de
NaOH 0,1 mol L-1. Os autores obtiveram, a partir desse processo, microeletrodos com
raio efetivo da ordem de 1 nm (entende-se por raio efetivo a soma do raio do
microeletrodo mais a espessura do isolante, que nesse caso consistiu em tinta
eletroforética). Vale salientar que esse valor é um dos menores reportados até o
momento. Outros métodos utilizando diferentes soluções para o desgaste eletroquímico
(Tabela 1) também foram citados na literatura.
Introdução 7
Tabela 1 – Procedimentos para desgaste eletroquímico de fibras de carbono.
Autores Soluções utilizadas no
desgaste
Condições experimentais
Chen e Kucernak (Chen e
Kucernak, 2002) e
Schulte e colaboradores
(Schulte e Chow, 1998) e
Wang e colaboradores
(Wang, Chen et al., 2005)
NaOH 0,01 mol L-1 50 Hz, 1 – 5,5 Vp-p
Zhang e colaboradores
(Zhang, Zhang et al.,
1996)
- Fluxo de íons argônio
Ewing e colaboradores
(Powell, Woods et al.,
2005)
- Chama de acetileno
Huang e colaboradores
(Huang, Pang et al., 2001)
- Chama de
butano/propano
Meulemans e
colaboradores
(Meulemans, Poulain et
al., 1986)
Solução saturada de nitrito
e TWEEN 40
50 Hz, 2 – 6 V
Armstrongjames e
colaboradores
(Armstrongjames, Fox et
al., 1980)
0,9 % de NaCl 10 Hz, 0,3 – 1,5 mA
Wipf e colaboradores (El-
Giar e Wipf, 2006)
K2Cr2O7 0,5 mmol L-1/
H2SO4 5 mol L-1
60 Hz, 3,0 – 25 Vrms
Entretanto, vale destacar que em muitos desses trabalhos utilizam-se técnicas de
custo elevado, como a litografia, geradores de função para aplicação do potencial AC e
fluxo de íons de argônio. Esse fato, somado a dificuldades na fabricação (manipulação
Introdução 8
das fibras de pequenos tamanhos) e selagem das microfibras dificulta a larga utilização
de microeletrodos na área de eletroanalítica.
Outra desvantagem da utilização dos microeletrodos diz respeito ao fato de que
as correntes obtidas durante os processos eletroquímicos são muito baixas. Desta forma,
para a medição da corrente são necessários equipamentos que possuam alta precisão.
Nos últimos anos, entretanto, circuitos que possuem elevada sensibilidade podem ser
construídos com facilidade, o que faz com que essa desvantagem não se torne um
grande empecilho para a utilização deste tipo de eletrodo. Outro recurso para a obtenção
de valores de corrente maiores utilizando microeletrodos pode ser utilizado, como por
exemplo, no caso de eletrodos que possuem pelo menos uma das dimensões na faixa
micrométrica (e as outras macrométricas), como é o caso de eletrodos de microbandas
ou microcilindros (Weisshaar, Tallman et al., 1981; Caudill, Howell et al., 1982;
Kittlesen, White et al., 1984; Sleszynski, Osteryoung et al., 1984; White, Kittlesen et
al., 1984; Sanderson e Anderson, 1985; Thormann, Vandenbosch et al., 1985; Bard,
Crayston et al., 1986; Belal e Anderson, 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick,
Anderson et al., 1986; Hepel e Osteryoung, 1986). Estes eletrodos apresentam algumas
das vantagens dos eletrodos de tamanho macroscópico, como por exemplo, alta
corrente, mas, além disso, apresentam o comportamento sigmoidal obtido com
microeletrodos. A magnificação dos sinais de corrente pode ser também obtida
utilizando um arranjo de microeletrodos (Thormann, Vandenbosch et al., 1985; Bard,
Crayston et al., 1986; Chidsey, Feldman et al., 1986; Fosdick, Anderson et al., 1986;
Shea e Bard, 1987), ver Figura 1.
Visto que métodos para a fabricação de microeletrodos constituem-se em etapa
aparentemente bem resolvida para alguns grupos de pesquisa, as atenções nessa área
Introdução 9
voltaram-se para o uso dos microeletrodos na exploração de domínios microscópicos,
especialmente sistemas biológicos, células únicas e/ou tecidos intactos.
1.1.2. Microeletrodos voltados para detecção em microambientes
O transporte de íons e moléculas é essencial para a manutenção da homeostease1
em sistemas biológicos. O pequeno tamanho dos microeletrodos permite medir o fluxo
em sítios específicos desde células únicas até tecidos intactos. Uma das primeiras
moléculas estudadas foi o O2. Oxigênio molecular pode ser monitorado por meio de
redução utilizando o eletrodo de Clark (Clark, Wolf et al., 1953). A miniaturização
deste dispositivo permite o monitoramento do fluxo de O2 com alta resolução espacial
(Sosna, Denuault et al., 2007). Essa técnica foi utilizada em suspensões de Escherichia
coli para examinar o efeito de íons Ag+ na respiração das bactérias (Holt e Bard, 2005).
Nesse estudo, os pesquisadores constataram que inicialmente os íons Ag+ aumentam as
taxas de respiração por desacoplarem a cadeia respiratória. Essas medidas foram
realizadas em meio extracelular.
Quando células estão sob estresse oxidativo, o fluxo de vários compostos se
ajusta para minimizar essa condição (Wightman, 2006). Por exemplo, menadiona é
tóxica para hepatócitos (células responsáveis pelas funções biológicas do fígado) uma
vez que, dentro das células, este composto regenera espécies reativas de oxigênio
(Mauzeroll, Bard et al., 2004).
Nas células, menadiona é metabolizada para o conjugado metadiona-S-
glutationa, que é removido da célula pela bomba dependente da adenosina-trifosfatase.
Essa bomba mediadora responsável pela remoção da metadiona-S-glutationa foi 1 Homeostease é a propriedade de um sistema aberto, em especial seres vivos, de regular o seu ambiente interno de modo a manter uma condição estável, mediante múltiplos ajustes de equilíbrio dinâmico controlados por mecanismos de regulação interrelacionados
Introdução 10
detectada em células unitárias e em colônias confluentes de células utilizando
microeletrodos acoplados a SECM (do inglês, “Scanning Electrochemical
Microscopy”). Danos oxidativos causam um aumento da geração de derivados de
superóxido e óxido nítrico, e essas espécies foram individualmente monitoradas em
células únicas com eletrodos de fibra de carbono platinizadas (Arbault, Sojic et al.,
2004). A formação de espécies reativas geradas por fibroblastos normais sob estresse
oxidativo é consideravelmente diferente do medido em fibroblastos cancerígenos. A
geração tardia de grandes quantidades de O2- e H2O2 e menores quantidades de NO• e
ONOO foi observada em comparação com fibroblastos normais.
Microeletrodos podem ser utilizados também para medições em tecidos intactos,
como, por exemplo, para fornecer informações sobre a liberação de drogas. Campos
elétricos aplicados através da pele podem afetar o transporte de drogas por dois
motivos: eles induzem o fluxo eletroosmótico para propelir espécies neutras e
carregadas, e induzem o transporte de massa iontoforético2 para modular o fluxo de
espécies carregadas. SECM foi utilizada para medir essas taxas de transporte na pele de
ratos sem pêlos (Bath, Scott et al., 2000; Bath, White et al., 2000).
SECM também foi utilizada para examinar o fluxo de O2 em diferentes
localizações na cartilagem bovina (Gonsalves, Barker et al., 2000). O microeletrodo foi
colocado a ~1 µm da superfície da amostra de cartilagem e imerso em solução. A
topografia da cartilagem foi examinada pelo monitoramento da oxidação do Ru(CN)64- ,
adicionado propositalmente como indicador à solução. O mapa topográfico da
cartilagem revelou depressões com diâmetros de 15 a 25 µm, atribuídas a condrócitos
(células presentes no tecido cartilaginoso), pois a distribuição era similar à observada
por força atômica e microscopia óptica. Experimentos para avaliar o fluxo de oxigênio 2 A iontoforese é a introdução de radicais químicos nos técidos, através de um campo elétrico ,produzido por uma corrente unidirencional. Durante essa introdução ocorrerá repulsão e atração iônica de acordo com a polaridade de cada eletrodo e assim sua interação com a membrana biológica.
Introdução 11
dessas áreas descritas anteriormente também foram realizados utilizando um
microeletrodo, como descrito anteriormente. As regiões com mais permeabilidade para
oxigênio foram localizadas, justamente, sobre a região celular.
Neurônios e outras células comunicam-se umas com as outras por meio da
secreção de pequenas moléculas. Essas moléculas são secretadas pelo mecanismo de
exocitose, segundo o qual uma célula eucariótica libera substâncias para o fluido
extracelular. Medidas com microeletrodos possibilitaram a evidência química direta do
processo de exocitose. Uma vez que o tamanho das fibras de carbono é similar ao
tamanho de muitas células, elas acabam sendo ferramentas interessantes para examinar
os eventos de secreção de compostos na superfície das células (Travis e Wightman,
1998). Utilizando-se um micromanipulador acoplado a um microscópio, o eletrodo pode
ser colocado em contato direto com a célula estudada para o monitoramento desses
compostos secretados. Adicionalmente, o microeletrodo é polarizado em um potencial
fixo e a corrente é monitorada ao longo do tempo. Com isso, qualquer mensageiro
químico com características eletroativas (dopamina, epinefrina, norepinefrina, 5-
hidrotriptofano e histamina) pode ser detectado a partir desse arranjo experimental.
Peptídeos contendo triptofano ou resíduos de tirosina são eletroativos, assim como o
óxido nítrico. Alternativamente, a modificação deliberada da superfície eletródica com
filmes de óxido de rutênio foi utilizada para a detecção amperométrica desses peptídeos
(Kennedy, Lan et al., 1996). Devido à detecção das moléculas secretadas ser realizada
em um espaço microscópico entre o eletrodo e a célula, todo material secretado é
oxidado, possibilitando uma análise quantitativa do número de moléculas secretadas por
vesícula (Wightman, Jankowski et al., 1991). Um método alternativo para promover a
identificação das espécies citadas anteriormente foi proposto utilizando voltametria
cíclica (Troyer e Wightman, 2002).
Introdução 12
Wightman e colaboradores (Cahill e Wightman, 1995) utilizam fibras de
carbono eletroquimicamente tratadas (utilizando um procedimento eletroquímico3
descrito por Gonon e colaboradores (Gonon, Fombarlet et al., 1981)) e não tratadas
próximas à membrana celular para estudar a secreção de ascorbato e catecolaminas em
células bovinas. O eletrodo modificado foi utilizado para a detecção de ascorbato a
+0,05 V vs ECS e o eletrodo não modificado para a detecção simultânea das
catecolaminas e do ascorbato a +0,65 V vs ECS.
Medidas invasivas, que visam acessar o interior das células, muitas vezes
utilizam-se da técnica de “patch-clamp” (Mosharov, Gong et al., 2003). “Patch-clamp”
é uma técnica eletrofisiológica utilizada para estudar canais iônicos em células. Essa
técnica consiste na inserção de uma pipeta de vidro no interior do ambiente celular e
aspiração do conteúdo intracelular para dentro da pipeta, permitindo estudos sobre o
transporte de íons pelos canais. Mosharov e colaboradores (Mosharov, Gong et al.,
2003) acoplaram dentro da pipeta, utilizada nas medidas de “patch-clamp”, um
microeletrodo para estudar os níveis citoplasmáticos dos mensageiros celulares.
Medidas intracelulares em célula neuronal de lesma do mar (Meulemans,
Poulain et al., 1986) (Aplysia californica), da ordem de 150 – 300 µm, foram realizadas
com eletrodos de fibra de carbono (0,5 – 2 µm). Esse microeletrodo foi utilizado para
monitorar a penetração de metronidazol (antibiótico), antipirina e ácido ascórbico em
função do tempo através da membrana celular. Microeletrodos de platina (Meulemans,
Poulain et al., 1987) também foram utilizados em células neuronais de lesma do mar
para estudar a penetração de serotonina pela membrana citoplasmática. Microeletrodos
de carbono (Chien, Wallingford et al., 1990), na forma de anel, construídos pela pirólise
3 Utilizou-se uma onda triangular (70 Hz) de 0 - 3 V, que foi aplicada por 7 s, seguida de polarização a +1,5 V por 7 s. Por final polarizou-se o sistema a 0 V por 30 minutos. Todo esse tratamento foi realizado em tampão fosfato
Introdução 13
do metano dentro de capilares de sílica, foram utilizados para avaliar o conteúdo
citoplasmático de células gigantes da espécie Planorbis corneus (Caracol).
1.2. Ácidos nucleicos
A partir da descoberta da eletroatividade dos ácidos nucléicos em 1960 (Palecek,
1960), surgiu o interesse da comunidade científica em aplicar técnicas eletroanalíticas
para o monitoramento desses compostos (Wang, Bollo et al., 1999). O campo de
pesquisa relativo à análise de ácidos nucléicos abre novas possibilidades para pesquisas
em eletroquímica, como por exemplo, a detecção de danos no DNA causados pela
interação com agentes químicos e físicos existentes no ambiente.
Em sua constituição o DNA apresenta subunidades que são os
desorribonucleotídeos. Um nucleotídeo consiste em uma base nitrogenada, uma ose e
um ou mais grupamentos fosfato. A ose em um desoxirribonucleotídeo é a
desoxirribose. As bases nitrogenadas podem ser divididas em derivados de purina e
pirimidina (Stryer, 1996). As purinas no DNA são a adenina (A) e a guanina (G), e as
pirimidinas são: a timina (T) e a citosina (C), Figura 2.
Introdução 14
N
N
NH
N
NH2
Adenina
N
NH
NH
N
NH2
O
Guanina
N
NH
NH2
O
Citosina
NH
NH
O
O
CH3
Timina
Figura 2 – Estrutura das bases nitrogenadas do DNA.
Um nucleosídeo (Figura 3A) consiste em uma purina ou pirimidina ligada a uma
ose. As quatro unidades nucleosídicas no DNA são chamadas desoxiadenosina (dA),
desoxiguanosina (dG), desoxitimidina (dT) e desoxicitidina (dC). A fosforilação dos
nucleosídeos leva à formação dos nucleotídeos (Figura 3B) e a ligação das
desoxirriboses pelos grupos fosfatos leva à formação do DNA (Stryer, 1996).
NOOH
OH
N
NHN
NH2
O
(A)
NOO
OH
OHOH
OP N
NHN
NH2
O
(B)
Figura 3 – Representação das estruturas moleculares de um nucleosídeo (A) e nucleotídeo (B).
Introdução 15
Na literatura são reportados estudos sobre o comportamento eletroquímico dos
monômeros que constituem os ácidos nucléicos em diferentes superfícies eletródicas
como grafite (Elving e Smith, 1960; Smith e Elving, 1962), ouro (Pang, Qi et al., 1995),
fibra de carbono (Brett, Brett et al., 1994), nanotubos de carbono (Wang, Kawde et al.,
2003; Wu, Fei et al., 2003), diamante dopado com boro (Prado, Flechsig et al., 2002),
grafite pirolítico (Wang, Palecek et al., 1996), pasta de carbono (Wang, Cai et al., 1995;
Wang, Chicharro et al., 1996; Wang, Rivas et al., 1996; Wang, Cai et al., 1997; Wang,
Fernandes et al., 1998) e óxido de irídio (Armistead e Thorp, 2001). Esses estudos
mostram que somente as bases nitrogenadas purínicas podem ser oxidadas sobre a
superfície do eletrodo de grafite. Estudos posteriores realizados por Dryhurst (Dryhurst,
1971; 1972) investigando a eletroatividade desses compostos ligados à ose
(desoxirribose) mostraram que seus nucleosídeos (dA e dG) são oxidados em potenciais
mais positivos do que as bases livres, demonstrando assim que a ligação da ose com a
base acarreta em um aumento de estabilidade do composto. Já o DNA desnaturado
apresenta dois picos de oxidação bem definidos e relacionados com a oxidação da
guanina e adenina, respectivamente, mais especificamente, a dG e dA (De-Los-Santos-
Alvarez, Lobo-Castanon et al., 2004). Dessa forma, se resíduos de guanina e adenina de
um ácido nucléico estiverem presentes em um mistura com DNA pode-se distinguir em
um experimento voltamétrico entre as bases livres e as ligadas ao DNA. O DNA nativo
(dupla hélice, dh-DNA) apresenta picos de oxidação menores do que o DNA
desnaturado (fita simples, fs-DNA) (Brabec e Dryhurst, 1978). Uma vez que as bases
nitrogenadas do DNA estão escondidas dentro da dupla hélice, a aproximação das
mesmas da superfície do eletrodo é dificultada. Além disso, na literatura vêm sendo
reportados resultados que indicam estreita relação entre a melhora do sinal analítico
com a adsorção e aumento da rugosidade da superfície eletródica (Brett, Brett et al.,
Introdução 16
1994; Cai, Rivas et al., 1996; Pang, Zhang et al., 1996; De-Los-Santos-Alvarez, Lobo-
Castanon et al., 2004).
Ácidos nucléicos são fortemente adsorvidos em eletrodos de grafite pirolítico e
pasta de carbono e, mais fracamente, em carbono vítreo (Pang, Zhang et al., 1996) e
grafite pirolítico com alta orientação (Brown, Allison et al., 1991; Cai, Rivas et al.,
1996) (do inglês, “highly oriented pyrolytic graphite” (HOPGE)). A eficiência de
adsorção pode ser aumentada evaporando-se sobre a superfície do eletrodo uma solução
contendo os ácidos nucléicos (Pang, Zhang et al., 1996) ou aplicando-se um potencial
positivo à superfície do eletrodo durante o processo de adsorção para ocorrer uma
atração eletrostática do DNA com a superfície do eletrodo (Brown, Allison et al., 1991;
Brett, Brett et al., 1994). Pré-tratamentos oxidativos da superfície eletródica aumentam
o caráter hidrofílico da mesma e, também, facilitam o processo de adsorção (Brown,
Allison et al., 1991; Brett, Brett et al., 1994; Pang, Zhang et al., 1996; Wang, Ju et al.,
2001).
Até o presente momento os sensores de DNA estão sendo desenvolvidos com o
intuito de se obter sensores para detecção do estado de hibridização do DNA e para a
detecção de danos no DNA (Palecek, 2002). Sendo essa tese voltada para a detecção de
lesões no DNA, os métodos de detecção do estado de hibridização não serão aqui
abordados.
1.2.1. Danos no DNA
Danos no DNA participam de rotas críticas na mutagenese, carcinogenese e no
envelhecimento (Marnett, 2000). Os eventos químicos que resultam em danos no DNA
são: hidrólise, oxidação e ataque eletrofílico. Essas reações ocorrem devido à exposição
Introdução 17
do DNA a agentes químicos e físicos do ambiente, como por exemplo, espécies
presentes em alimentos, ou podem ser causadas por processos metabólicos endógenos
(Marnett, 2000). A Figura 4 representa alguns dos possíveis danos no DNA.
Introdução 18
Figura 4 – Representação esquemática de alguns processos de danos no DNA. O painel a mostra a estrutura da 2’-desoxiguanosina no DNA.
Introdução 19
Dois diferentes métodos para detecção de danos no DNA vêm sendo reportados
na literatura (Palecek e Fojta, 2001; Fojta, 2002). Um deles está baseado na hidrólise do
DNA, e posterior separação cromatográfica por HPLC (Dizdaroglu, Jaruga et al., 2002)
(do inglês, “high-pressure liquid cromatography”), cromatografia gasosa (Dizdaroglu,
Jaruga et al., 2002) (GC, do inglês, “gas cromatography”), ou eletroforese capilar (Le,
Xing et al., 1998). A lesão é detectada “on-line” por diferentes métodos, como
espectrometria de massa (Dizdaroglu, Jaruga et al., 2002; Loureiro, Marques et al.,
2002), eletroquímico (Tarun e Rusling, 2005), fluorescência (Rogers, Apostol et al.,
2001) e radioativo (Phillips, Farmer et al., 2000).
O outro método preserva o DNA intacto, e o dano é investigado por técnicas de
imunoensaio, sedimentação, eletroforese em gel, ressonância plasmônica (Ciolkowski,
Fang et al., 2000), microbalança de cristal de quartzo (Wang, Jiang et al., 1999; Pope,
Allen et al., 2001) ou eletroquímicas. De modo geral, esses procedimentos estão
baseados na imobilização do DNA intacto na superfície do eletrodo (Mugweru e
Rusling, 2002). A reação do composto carcinogênico com o DNA imobilizado pode
romper a estrutura da dupla hélice, deixando os sítios de guanina mais acessíveis para a
oxidação. Dessa forma, um aumento do sinal de corrente causado pela oxidação dos
sítios de guanina é observado em comparação com a resposta antes da exposição do
eletrodo modificado ao agente carcinogênico. Em geral, esse tipo de dispositivo é
utilizado para avaliar agentes carcinogênicos ao DNA.
A voltametria de adsorção sobre eletrodos de mercúrio é uma das técnicas
utilizadas para a detecção de danos no DNA oriundos de ácidos fortes (Jelen, Fojta et
al., 1997), agentes metilantes (Jelen, Tomschik et al., 1997) e radicais hidroxil (Fojta e
Palecek, 1997; Fojta, Stankova et al., 1998). Danos no DNA solubilizado causados por
radiação ionizante também foram detectados utilizando eletrodo de mercúrio e
Introdução 20
voltametria de adsorção (Sequaris, Valenta et al., 1982; Sequaris e Valenta, 1987) e
cronoamperometria com DNA adsorvido sobre a superfície de carbono (Wang, Cai et
al., 1997). Ionômeros “Eastman” e Nafion® foram utilizados na fabricação de filmes de
dh-DNA sobre a superfície de grafite para detecção direta de danos no DNA (Mbindyo,
Zhou et al., 2000; Rusling, Zhou et al., 2000). Picos de oxidação apareceram após
exposição do filme incubado com óxido de estireno, que forma um aduto covalente com
a guanina e adenina. Contudo, a oxidação direta de DNA sobre a superfície eletródica
apresenta sinais analíticos não muito pronunciados para o processo de oxidação do dh-
DNA, como relatado anteriormente. Dessa forma, métodos envolvendo a modificação
deliberada da superfície eletródica podem aumentar a sensibilidade para guanina (ou
compostos derivados na mesma).
A oxidação eletrocatalítica utilizando metal de transição propício aumenta
significativamente o sinal analítico para a detecção do processo de oxidação do DNA
(Thorp, 1998). Thorp e colaboradores (Thorp, 1998) mostraram que um dos processos
mais efetivos para o processo de oxidação do DNA é a catálise utilizando Ru(bpy)32+, o
qual oxida, especificamente, sítios de guanina presentes no DNA, segundo o mecanismo
abaixo:
Ru(bpy)32+ Ru(bpy)3
3+ + e- (4)
Ru(bpy)33+ + DNA(guanina) → Ru(bpy)3
2+ + DNA(guaninaox) (5)
Ciclicamente Ru(bpy)33+ volta a Ru(bpy)3
2+ por uma etapa rápida (eq. 5),
propiciando uma corrente catalítica que resulta em um grande aumento de sinal quando
comparado àquele referente ao DNA na superfície do eletrodo limpo.
Mais recentemente, métodos baseados na oxidação eletrocatalítica da guanina
têm recebido muita atenção para a detecção de danos no DNA. Zhou e Rusling (Zhou e
Rusling, 2001) demonstraram as propriedades eletrocatalíticas do Ru(bpy)32+ na
Introdução 21
mediação do processo de oxidação da guanina sobre a superfície de grafite pirolítico
como um indicador de dano causado por óxido de estireno. Para isso, os autores
utilizaram um sensor construído alternando camadas de PDDA (do inglês,
“poly(diallydimethylammonium chloride)”) e dh-DNA. Utilizando esse procedimento,
foi possível detectar 0,1 % de dano nas bases do DNA. Napier and Thorp (Napier e
Thorp, 1997) modificaram a superfície de um ITO (do inglês, “indium tin oxide”) com
uma monocamada de ácido 1,12-dodecanodicarboxilíco, na qual o DNA é ligado via
carbodiimida. Na presença de Ru(bpy)32+ em solução pode-se então monitorar os danos
no DNA que foi exposto ao agente mutagênico. Pacey e colaboradores (Pacey, Puckett
et al., 2005) utilizaram um sensor construído eletrostaticamente camada por camada
utilizando Ru(II) terpiridina (carga positiva) e dh-DNA (carga negativa) para o
monitoramento de danos no DNA utilizando óxido de estireno. Wang e colaboradores
(Wang, Jiang et al., 2001) combiraram oxidação eletroquímica e análise em fluxo no
desenvolvimento de uma metodologia para análises rápidas de avaliação de danos no
DNA. O eletrodo utilizado foi carbono vítreo modificado com polipirrol.
Para análise de guanina em solução, El Maali e Wang (El-Maali e Wang, 2001)
utilizaram um filme insolúvel de um complexo de Ru(II)-tris(2,2’-bipiridina)dicloro. Os
autores obtiveram uma melhora significativa do sinal analítico para o processo de
oxidação dessa base purínica em relação ao sinal do eletrodo limpo na presença de
guanina.
Compostos carcinogênicos, como por exemplo, acetaldeído, podem reagir com o
grupamento amina exocíclico da dG (dG, Figura 4) no DNA formando uma base de
Schiff (Wang, Mcintee et al., 2000) ou ainda outros tipos de adutos como N2-
etildesoxiguanosina e 1,N2-propanodesoxiguanosina (Fang e Vaca, 1997; Matsuda,
Terashima et al., 1999; Hecht, Mcintee et al., 2001; Terashima, Matsuda et al., 2001)
Introdução 22
(Esquema 1). Como conseqüência dessa reação química, ocorre um decréscimo no
número de sítios de guanina na estrutura do DNA. Dessa forma, é possível estudar
danos na estrutura do DNA monitorando a quantidade de sítios de guanina, antes e após
a exposição do DNA a esses agentes carcinogênicos. Até o momento, a quantificação de
base, ou nucleosídeo, é realizada após procedimento de hidrólise seguido por um
método cromatográfico para a separação dos componentes do DNA.
NOOH
OH
N
NHN
NH2
O
CH3NOOH
OH
N
NHN
N
O
CH3
OH
NOOH
OH
N
NN
NH
OO
CH3 H
O
CH3 H
CH3NOOH
OH
N
NHN
NH
O
NaBH4
1,N2 - etildesoxiguanosina
1,N2 - propanodesoxiguanosina
Esquema 1.
1.3. Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS)
A degeneração motora chamada Esclerose Lateral Amiotrófica (ALS, do inglês,
“Amyotrophic lateral sclerosis”) é uma doença caracterizada pela degeneração
progressiva dos neurônios motores acarretando atrofia, paralisia e morte. A doença se
inicia pela paralisia de um membro de um lado específico e a morte acaba ocorrendo
por insuficiência respiratória, quando os neurônios responsáveis pelo movimento do
diafragma são atingidos. Uma vez que o início da doença ou os primeiros sintomas são
observados de maneira tardia (entre 50 e 60 anos), o paciente tem de 4 a 10 anos de vida
Introdução 23
após o diagnóstico. A doença atinge mais homens do que mulheres (na proporção de
3:2). Cinco mil novos casos de ALS são diagnosticados por ano nos EUA, e o total
mundial atinge 2,4 casos/100.000 habitantes por ano (Boillee, Vande Velde et al.,
2006). Não há ainda um tratamento efetivo para ALS. Hoje, existe somente um
medicamento aprovado (Riluzol), o qual aumenta a sobrevida do paciente, e diversos
tratamentos paliativos (Carri, Ferri et al., 2003). O uso de células tronco para
regeneração dos neurônios motores também vem sendo estudado na literatura (Silani,
Cova et al., 2004; Boillee, Vande Velde et al., 2006).
Diversos trabalhos na literatura têm demonstrado que a degeneração dos
neurônios motores proveniente da ALS é resultado de mecanismos complexos
envolvendo estresse oxidativo, excitotoxicidade por glutamato, formação de agregados
protéicos (Okado-Matsumoto e Fridovich, 2002), processos neuro-inflamatórios (Carri,
Ferri et al., 2003), disfunções mitocondriais e defeitos no transporte axonal (Boillee,
Vande Velde et al., 2006). Entretanto, ainda é difícil definir o que é causa, conseqüência
ou associação.
O glutamato é o principal neurotransmissor excitatório do sistema nervoso
central. Ele é liberado na fenda sináptica provocando um estímulo no neurônio pós-
sináptico, o qual é cessado pela remoção do glutamato por receptores específicos
(Watkins e Evans, 1981). Um acúmulo anormal de glutamato no fluído cerebro-espinhal
é observado em pacientes, devido à insuficiência na recaptação do glutamato (Rothstein,
Tsai et al., 1990). Esse acúmulo promove estresse oxidativo e ativação das enzimas
líticas que levam à morte celular (Lipton e Rosenberg, 1994). A insuficiência na
recaptação do glutamato ocorre devido a defeitos nas suas proteínas receptoras
(Rothstein, Martin et al., 1992). Estes defeitos podem ter sua origem em fatores
genéticos ou podem ser causados por lesões nas proteínas.
Introdução 24
A participação do estresse oxidativo nos estudos de ALS é evidenciada pela
presença de danos oxidativos em DNA, proteínas e lipídios nos tecidos de pacientes e
animais modelo da doença (Warita, Hayashi et al., 2001). Níveis aumentados de 8-oxo-
7,8-dihidro-2’-desoxiguanosina foram detectados na coluna espinhal de pacientes e no
fluído cérebro-espinhal, assim como 3-nitrotirosina, 4-hidroxinonenal, malondialdeído e
radicais ascorbato (Ferrante, Browne et al., 1997; Bogdanov, Brown et al., 2000; Lee,
Hyun et al., 2001; Warita, Hayashi et al., 2001; Ischiropoulos e Beckman, 2003;
Aguirre, Beal et al., 2005; Ihara, Nobukuni et al., 2005; Barber, Mead et al., 2006;
Mahoney, Kaczor et al., 2006; Tokuda, Ono et al., 2007).
Danos oxidativos em proteínas podem ser a causa e conseqüência do efeito
tóxico às células do glutamato, e podem causar lesões na mitocôndria que também
levam à morte celular por apoptose (morte celular programada) ou necrose (Beretta,
Sala et al., 2003).
Muitos antioxidantes, como a vitamina E, N-acetil cisteína, seleginina e catalase,
trouxeram benefícios aos modelos animais, mas infelizmente não houve sucesso nas
triagens em humanos (Goodall e Morrison, 2006). Outras espécies antioxidantes
(coenzima-Q e porfirinas de manganês (AEOL 10150)), que tiveram sucesso em
modelos animais, estão sendo testadas atualmente em humanos (Barber, Mead et al.,
2006). A ineficiência dos antioxidantes na melhora do quadro clínico de pacientes com
ALS não exclui a participação de espécies reativas de oxigênio (EROs) na patologia.
Estudos sobre a eficiência dos antioxidantes em atravessar a barreira hemato-encefálica
e atingir os neurônios devem ser feitos. Além disso, os resultados positivos com
antioxidantes são visíveis nos modelos animais. Entretanto esse tratamento é iniciado
em estágios iniciais da doença. Em humanos, isto não é possível devido à falta de
biomarcadores específicos para um estágio precoce da doença. O diagnóstico é feito de
Introdução 25
maneira tardia, quando a deficiência motora já é um dos sintomas (nesse estágio, 50 %
de seus neurônios motores do paciente já foram perdidos).
Dentre os casos familiares de ALS, os quais representam 10 % dos casos totais,
defeitos genéticos associados ao gene Sod 1 têm recebido maior atenção. Mutações
pontuais neste gene, o qual codifica a forma citosólica da enzima Cu,Zn-superóxido
dismutase (SOD), estão presentes em cerca de 20 % dos casos de familiares de ALS
(Carri, Ferri et al., 2003). Ainda não se sabe por que a forma mutante desta proteína
abundante e expressa em todos os tecidos é particularmente tóxica para os neurônios
motores, causando ALS. Estudos extensivos forneceram fortes evidências de que um
“ganho de função tóxica”, ao invés da perda da função enzimática normal da enzima, é
a causa da doença. Primeiramente, trata-se de um fenótipo dominante em humanos. A
maioria das formas mutantes apresenta atividade superóxido dismutásica normal.
Animais transgênicos sem o gene Sod 1, também não desenvolvem ALS, enquanto que
animais super expressando formas mutantes de SOD desenvolvem fenótipo muito
similar ao da doença (Goodall e Morrison, 2006). A mutação G93A é a mais estudada,
pois foi utilizada com sucesso na criação de camundongos transgênicos modelo de ALS
em 1994 (Gurney, Pu et al., 1994).
1.4. Ácido Ascórbico
Ácido ascórbico, um dos componentes da vitamina C, é conhecido pelas suas
propriedades redutoras, sendo consumido em ampla escala como agente antioxidante
em comida, bebidas e fármacos. O consumo de ácido ascórbico se faz necessário uma
vez que o fígado dos primatas não possui a enzima gulonolactona oxidase, a qual gera
ácido ascórbico a partir de ácido gulônico em outros animais (King, 1973). Os primatas
Introdução 26
possuem um sistema especial de captação de vitamina C no intestino, que será discutido
na seção 1.4.1.
Sabe-se que o ácido ascórbico também diminui a lesão oxidativa do DNA em
linfócitos de fumantes (Fraga, Motchnik et al., 1991), demonstrando assim a
importância do ácido ascórbico como agente antioxidante. Anormalidades envolvendo
os níveis de ácido ascórbico em fluidos biológicos são reportadas em pacientes
esquizofrênicos (Wilson e Guillan, 1969). Por essas razões, a determinação do ácido
ascórbico em fluidos biológicos para o diagnóstico em análises clínicas e bioquímicas é
de suma importância. Além disso, o monitoramento intracelular de ácido ascórbico
(utilizando como estímulo o aumento extracelular de ácido ascórbico), somado à
detecção de danos no DNA, pode elucidar como o ácido ascórbico age no processo de
inibição ou lesão do DNA.
Diferentes procedimentos e técnicas são reportados na literatura para a
determinação de ácido ascórbico, como por exemplo: cromatografia (Esteve, Farre et
al., 1995), eletroquímica (Strochkova, Turyan et al., 1997), espectrofotometria (Park,
Adams et al., 1972; Keedy e Vadgama, 1991) e titulação (Kumtatt e Leong, 1964).
Entretanto, os métodos eletroanalíticos apresentam vantagens frente aos
espectrofotométricos para determinações em amostras mais complexas devido à maior
seletividade e possibilidade de se trabalhar com amostras coloridas. Com relação aos
métodos cromatográficos, que já apresentam uma seletividade natural, as vantagens da
detecção eletroquímicas são o baixo custo, a simplicidade e o tempo de análise.
Na literatura (Strochkova, Turyan et al., 1997), métodos eletroanalíticos são
utilizados para detecção de ácido ascórbico em amostras complexas, como por exemplo,
urina. Nesse trabalho, os autores reportam a utilização de eletrodo rotativo para
detecção simultânea de ácido úrico e ácido ascórbico em urina. A análise de ácido úrico
Introdução 27
é feita em condições de diluição da amostra maiores que a de ácido ascórbico para
evitar a interferência do ácido ascórbico no processo de quantificação do ácido úrico.
Nessas condições, os autores obtiveram um limite de detecção para ácido ascórbico de 3
μmol L-1.
Muitas amostras apresentam uma composição complexa, o que pode resultar em
uma grande quantidade de substâncias interferentes. Devido a essas possíveis
interferências de matriz, a determinação de ácido ascórbico em condições de potencial
menos drásticas consiste em alternativa vantajosa. Para isso, muitos autores se utilizam
da modificação deliberada da superfície dos eletrodos (Kulys e Dcosta, 1991; Doherty,
Stanley et al., 1995; Li, Hu et al., 1996; Pournaghi-Azar e Razmi-Nerbin, 1998;
Shankaran e Narayanan, 1999; Cai, Xue et al., 2000; Florou, Prodromidis et al., 2000;
Turkusic, Milicevic et al., 2000; Karyakin, 2001; Bradshaw, Prenzler et al., 2002;
Malinauskas, Garjonyte et al., 2004; Roy, Saha et al., 2004; Pauliukaite, Ghica et al.,
2005; Fang, Jiao et al., 2006; Lin e Li, 2006) para diminuir a energia requerida para o
processo de oxidação do ácido ascórbico. Brett e colaboradores (Pauliukaite, Ghica et
al., 2005) utilizaram um filme de cobre hexacianoferrato para a detecção de ácido
ascórbico em diferentes matrizes (vinhos, chás e sucos). Foi observado um máximo de
corrente para o processo de oxidação do ácido ascórbico por volta de +0,4 V vs ECS.
Entretanto, tentando conferir maior seletividade ao sensor os autores sugeriram a
possibilidade de detecção do ácido ascórbico em um potencial de +0,05 V vs ECS, o
que torna a metodologia menos susceptível a possíveis interferências da matriz. Nessas
condições, os autores obtiveram um limite de detecção da ordem de 2,1 μmol L-1.
Outros trabalhos relacionados à determinação de ácido ascórbico em diferentes matrizes
estão mostrados na Tabela 2, assim como as condições de trabalho.
Introdução 28
Tabela 2 – Trabalhos reportados na literatura para determinação de ácido
ascórbico.
Trabalho Eletrodo Amostra Limite de detecção
/ μmol L-1
Potencial de Trabalho
(Pournaghi-Azar e Razmi-Nerbin, 1998)
Al/Níquel hexacianoferrato - - 0,44 V vs ECS
(Cai, Xue et
al., 2000)
GC/ Cobalto Hexacianoferrato
- - 0,6 V vs ECS
(Bradshaw,
Prenzler et al., 2002)
Hg Vinho 3,1 0,2 vs Ag/AgCl (3 M)
(Doherty, Stanley
et al., 1995)
GC/[Osmio(2,2-bipridil)2-(poli-4-
vinilpiridina)10Cl]Cl
- - 0,25 V vs ECS
(Roy, Saha et
al., 2004)
GC/N,N-dimetilanilina Suco - 0,35 V vs Ag/AgCl(sat.)
(Li, Hu et al., 1996)
Cobalto(II) Ftalocianina dopada com iodo
- - Potenciométrico
(Turkusic,
Milicevic et al., 2000)
Tinta de Carbono / MnO2 Fármacos 1,1 0,6 V vs Ag/AgCl(sat)
(Shankaran e
Narayanan, 1999)
GC/Cobre hexacianoferrato Fármacos - 0,2 V vs ECS
(Pauliukaite,
Ghica et al., 2005)
GC/Cobre hexacianoferrato Vinho, Chá e Sucos
2,1 0,05 V vs ECS
(Kulys e Dcosta, 1991)
Eletrodo impresso de grafite modificado com
tetracianoquinodimetano
Suco 23 0,05 V vs Ag/AgCl(sat.)
(Fang, Jiao et
al., 2006)
Monocamada de ferroceno tioglicolato sobre ouro
Urina 0,1 0,2 V vs ECS
Introdução 29
(Lin e Li, 2006)
Monocamada de 5-hidroxitriptofano sobre
carbono vítreo
Urina 4,2 0,17 V ECS
(Strochkova,
Turyan et al., 1997)
Eletrodo Rotativo de GC Urine 3,0 1,81 vs Ag/AgCl(sat.)
(Chen e Zu,
2007)
Pt / flúor-surfactante Urina 1,0 0,2 V vs ECS
(Zare, Nasiriza
deh et al., 2005)
Pasta de carbono modicada com tetrabromo-p-
benzoquinona
- 0,62 0,06 V vs ECS
(Salimi, Mamkhezri et al.,
2006)
Eletrodo de sol-gel carbono/cerâmica
Urina e Sangue
1,7 0,1 V vs ECS
(Khoo e Chen, 2002)
GC/azul de metileno Urina 0,005 0,24 V vs Ag/AgCl(sat.)
(Lin e Jin,
2005)
GC/monocamada de propionilcolina
Urina - 0,02 V vs ECS
(Matos, Augelli et al., 2000)
Arranjo de microeletrodos de ouro
Urina - 0,75 V vs Ag/AgCl(sat.)
1.4.1. Ácido Ascórbico em neurônios
O ascorbato (em pH fisiológico, o ânion monovalente ascorbato prevalece sobre
a forma protonada, ácido ascórbico.) pode atravessar membranas por difusão na forma
de um complexo de sódio. Este mecanismo contribui para boa parte da absorção no
intestino. A forma oxidada do ascorbato, o desidroascorbato é mais lipofílico do que o
ascorbato, permeando membranas com mais facilidade. O desidroascorbato pode ser
absorvido do lúmen intestinal e do sangue, e ser reduzido dentro das células. Ascorbato
e desidroascorbato também são captados por sistemas de transporte ativo. Na maioria
dos tecidos, a afinidade dos transportadores pelo desidroascorbato é maior do que pelo
Introdução 30
ascorbato. O desidroascorbato também é conduzido pelo transportador de glicose
GLUT-1 (Goldenberg e Schweinzer, 1994).
A diferenciação de células tem alguma influência no transporte de ascorbato
devido a mudanças nas atividades metabólicas e na disponibilidade de oxigênio.
Neutrófilos utilizam muito ascorbato para se proteger de conseqüências indesejáveis do
“burst” respiratório, e sua capacidade de acumular ascorbato aumenta muito durante a
ativação (Washko, Wang et al., 1993).
O ácido ascórbico é altamente concentrado em neurônios, o que indica um papel
desta vitamina na função neuronal e proteção antioxidante. Existe um gradiente de
concentração de ascorbato do sangue para os neurônios: 30-60 μM no sangue, 200-400
μM no fluído cerebroespinhal, ~1 mM no cérebro, até 10 mM em neurônios. O
ascorbato desempenha ainda outras diversas funções nos neurônios, como doador de
elétrons para a síntese de norepinefrina, neuromodulador do transporte de glutamato e
dopamina e proteção contra estresse oxidativo (May, Li et al., 2006). O ascorbato pode
ser oxidado por 1 ou 2 elétrons, e neutralizar EROs, incluindo radicais peroxil, hidroxil
e superóxido, oxigênio singlete e peroxinitritro (Halliwell, 1999).
Objetivo 31
2. Objetivo
Os objetivos deste trabalho são:
1) Desenvolver métodos de fabricação de eletrodos micrométricos e
submicrométricos de diferentes materiais;
2) Desenvolver metodologia para detecção de dG, visando o monitoramento de
de danos ao DNA;
3) Desenvolver metodologia para quantificação de ácido ascórbico em fluidos
biológicos;
4) Utilização dos microeletrodos desenvolvidos para monitoramento de ácido
ascórbico em microambientes (cultura de células e células únicas).
Parte Experimental 32
3. Parte Experimental
3.1. Reagentes
Todos os reagentes foram utilizados sem prévia purificação. As soluções de
trabalho foram preparadas pela dissolução dos reagentes sólidos ou diluição de soluções
concentradas com água desionizada, com exceção da guanina, obtida em sistema de
purificação Nanopure Infinity (Barnstead). Soluções de CaCl2, ácido ascórbico, etanol,
isopropanol, glicose, ácido úrico, NaNO2, KI e KIO3, KH2PO4, HCl, NaOH, Fenol,
RuCl3, CoCl2, NaNO3, K4[Fe(CN)]6, K3[Fe(CN)]6, guanina, desoxiguanosina e
desoxiguanosina monofosfato foram preparadas pela dissolução dos respectivos sais em
água desionizada e as soluções de ácidos inorgânicos foram preparadas pela diluição
dos respectivos ácidos concentrados. Todos os reagentes utilizados foram de
procedência Merck (Darmstadt, Alemanha) com exceção da guanina, dG e dGMP, que
foram adquiridos da Sigma (Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha). Nos
experimentos com DNA nativo utilizou-se DNA de timo de bezerro (Sigma-Aldrich
Chemie GmbH, Steinheim, Alemanha).
As soluções de guanina foram preparadas diariamente e dissolvidas em solução
de NaOH 0,1 mol L-1.
Solução padrão de índio(III) foi preparada por pesagem direta do índio metálico
fundido, 99.9%, p.a. fabricado na Alemanha, Dr. Theodor Schuchard & Co. Munchen e
dissolvido facilmente em ácido clorídrico. A solução estoque resultante apresentou CIn3+
= 0,02282 mol L-1 e CH+ = 0,67 mol L-1 (medida realizada utilizando eletrodo de vidro e
pHmetro marca Metrohm, modelo 713).
As soluções de eteno aduto foram preparadas reagindo dG com cloroacetaldeído,
como descrito por Sattsangi e colaboradores (Sattsangi, Leonard et al., 1977), com
Parte Experimental 33
algumas modificações. Foram adicionados 300 μL de uma solução de cloroacetaldeido
2 mol L-1 a uma solução contendo 0,04 mmol em 10 mL de tampão fosfato 0,1 mol L-1
(pH = 7,2). Essa mistura foi deixada sobre agitação por 4 dias a 37ºC, e o aduto
resultante foi purificado por HPLC.
3.2. Instrumentação
Foram utilizados um potenciostato portátil (Palmsens BV, Houten) e um
bipotenciostato da Autolab modelo PGSTAT30 (Eco Chimie), conectados a um palmtop
(HP modelo iPAQ) e a microcomputadores, respectivamente. Os experimentos foram
realizados, na grande maioria das vezes, em célula eletroquímica convencional e
sistema de 3 eletrodos. O eletrodo auxiliar utilizado foi um fio de platina e, como
referência, foi utilizado um eletrodo de Ag/AgCl saturado. Como eletrodos de trabalho
utilizaram-se microeletrodos e eletrodos de tamanho convencional, de diferentes
materiais (ouro, platina e carbono vítreo).
Estudos com eletrodo rotativo de carbono vítreo (r = 0,5613 cm) foram
realizados utilizando um sistema rotativo (AFMSRX, Pine Instrument Company)
conectado ao bipotenciostato da Autolab.
Para as centrifugações foram utilizadas as centrífugas refrigeradas, modelos
Centrifuge 5403 da Eppendorf (Hamburg, Alemanha) e Himac CR21E da Hitachi, além
da centrífuga não refrigerada Centrifuge 5415C, também da Eppendorf. As medidas de
absorbância foram feitas em espectrofotômetro modelo 2800 da Ciba-Corning (Sigma)
e os espectros de absorbância foram adquiridos em um espectrofotômetro Hitachi
U3000 (Tokyo, Japão).
Parte Experimental 34
As incubações em banho-maria foram feitas em banho modelo 144 da Fanen
(São Paulo, Brasil). As soluções foram autoclavadas em autoclave vertical modelo 415
da Fanem (São Paulo, Brasil). As células foram incubadas em uma estufa de CO2
Napco® modelo 5100 da Precision Scientific (Chicago, EUA) e manipuladas em fluxo
laminar com módulo para esterilização de ar equipado com luz UV da EACI/ENVIRCO
Environmental Air Control (Albuquerque, EUA).
3.3. Processo de fabricação dos microeletrodos
Duas diferentes técnicas foram utilizadas para a microfabricação dos eletrodos
micrométricos: desgaste eletroquímico e técnica litográfica.
3.3.1. Desgaste eletroquímico
O processo de afinamento das fibras de platina (Alfa Aesar) de diâmetro igual a
100 μm foi efetuado por desgaste eletroquímico utilizando um sistema bifásico que
consiste em solução saturada de CaCl2/acetona (1:1 em volume) (3 mL) – CCl4 (3 mL).
Acetona foi utilizada para controlar o tamanho das bolhas, uma vez que solventes
orgânicos solúveis em água provocam uma diminuição do tamanho das bolhas. Desta
maneira pode-se evitar um desgaste irregular da superfície da fibra pela adsorção de
bolhas na sua superfície (Libioulle, Houbion et al., 1995).
Utilizou-se um sistema que consiste em dois eletrodos para o desgaste
eletroquímico, Figura 5, fibra de platina e eletrodos de grafite, obtidos comercialmente.
Dois eletrodos de grafite foram utilizados de maneira a se obter uma distribuição mais
uniforme do potencial aplicado entre os eletrodos de grafite e a fibra de platina,
evitando assim uma corrosão irregular da fibra. Outro procedimento da literatura (Song,
Parte Experimental 35
Pryds et al., 1993) utiliza dois eletrodos de platina no processo, ao invés de grafite.
Entretanto, este resulta em perda de material eletródico, de maneira desnecessária,
durante o processo de desgaste da fibra de platina.
A AB
CD
Figura 5 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico. Eletrodos de grafite (A), Fibra de platina (B), Solução para a corrosão: CaCl2 saturada (C) e solução não condutora: CCl4 (D). Os eletrodos foram conectados a um transformador AC (60 Hz), de potencial
eficaz igual a 5 V, ao invés de programador universal acoplado a um potenciostato-
galvanostato (Itaya, Abe et al., 1987) ou geradores de função. Isto torna o custo muito
baixo pois dispensa-se a utilização de equipamento sofisticado. O final do processo de
corrosão ocorre quando a fibra se rompe na solução de CaCl2/acetona (15-16 minutos
após o inicio do processo), formando-se então duas extremidades “apontadas”. Na seção
de Resultados uma discussão mais detalhada sobre o processo de microfabricação será
efetuada.
Para a corrosão de eletrodos de Au (Alfa Aesar) foi utilizado um sistema de dois
eletrodos (fibras de ouro e platina (Woo, Kang et al., 2003)). Como solução para o
desgaste eletroquímico utilizou-se HCl 4 mol L-1. Aplicou-se uma diferença de
potencial DC entre os eletrodos de 1,7 V. A Figura 6 mostra uma representação
esquemática da célula eletroquímica utilizada.
Parte Experimental 36
AB
Figura 6 – Esquema da célula eletroquímica utilizada para o desgaste eletroquímico das fibras de Au (d = 100 µm). Fibra de ouro (A) e Eletrodo de platina (B). Solução para a corrosão: HCl 4 mol L-1.
As fibras de carbono (diâmetro = 10 μm, Thornel) foram desgastadas seguindo
procedimento da literatura (Chen e Kucernak, 2002). Basicamente, utilizou-se o arranjo
experimental da Figura 6, o qual foi conectado a um transformador AC (60 Hz) de
potencial eficaz igual a 5 V. Como solução para a corrosão utilizou-se NaOH 0,01 mol
L-1.
Por fim, todas as fibras produzidas pelo processo de desgaste eletroquímico
foram seladas pela imersão em um plastificante de borracha (PlastiFilm,
QUIMATEC®) e posteriormente deixadas com a ponta para cima até completa
secagem, segundo o esquema abaixo, Figura 7. Na Tabela 3 consta a composição do
plastificante de borracha. Entretanto, vale destacar que os microeletrodos de fibra de
carbono foram selados no vidro, devido à menor resistência mecânica das fibras.
Procedimentos adicionais utilizando filmes polimerizados a partir de fenol também
foram testados.
Parte Experimental 37
Tabela 3 – Composição do plastificante de borracha (PlastiFilm, QUIMATEC®).
Fonte: http://www.quimatic.com.br/fispqs/fispq_plast_film.pdf
Nome químico Concentração / %
Borracha Termoplástica 25 – 30
Tolueno 35 – 40
Mistura de Hidrocarbonetos:
Parafínicos, Olefínicos, Naftênicos e
Aromáticos
15 - 20
Pigmento 1,5 - 2
(A) (B) (C)
Figura 7 – Esquema do processo de fabricação dos microeletrodos após desgaste eletroquímico: (A) fibra com ponta afiada, (B) imersão da fibra no plastificante e (C) processo de secagem do plastificante de borracha.
3.3.2. Fabricação da matriz de microeletrodos (MEA, microelectrode array) utilizando litografia.
Este processo de fabricação está baseado em técnicas de litografia e foi realizado
em colaboração com o Laboratório de Microeletrônica da POLI/USP-SP. A Figura 8
apresenta uma visão lateral do dispositivo.
Parte Experimental 38
Figura 8 – Visão Lateral da matriz de microeletrodos. O processo de fabricação seguiu as seguintes etapas:
1) Substrato de partida: Silício.
2) Oxidação Térmica do Silício para SiO2, para isolamento total do substrato com as
posteriores superfície metálicas que serão depositadas a seguir.
3) Deposição por “sputtering” de uma camada de 100 nm de Ni/Cr e posteriomente
deposição de camda de 100 nm de Au. A deposição de Ni/Cr se faz necessária para
aumentar a aderência da camada de Au.
4) Construção da máscara ou layout e definição das trilhas metálicas.
5) Deposição do isolante.
6) Aquecimento do isolante por 450ºC por 1 hora para aumentar a resistência química
do isolante.
O design do MEA (do inglês, “microelectrode array”) desenvolvido está
ilustrado na Figura 9. Este contém 100 microeletrodos de ouro, de 20 x 20 μm,
espaçados de 100 μm entre eles, como mostrado na Figura 9A. A Figura 9B mostra o
layout completo do MEA, mostrando a distribuição radial dos contatos elétricos
externos individuais para cada eletrodo. A Figura 9C mostra uma imagem de uma
região do MEA registrada utilizando um microscópico.
IsolanteAu
Ni/Cr SiO2
Si
Microeletrodo
Parte Experimental 39
Figura 9 – “Design” completo do MEA (A), região central com 100 microeletrodos (B) e “zoom” de 9 microeletrodos (C).
Os estudos eletroquímicos utilizando o MEA foram realizados usando sistema
de 2 eletrodos. Ag/AgCl saturado foi utilizado como eletrodo de referência e os
microeletrodos de ouro como trabalho. Trabalhou-se com um volume de amostra da
Parte Experimental 40
ordem de 50 – 200 μL, colocada na região dos microeletrodos, Figura 9A. O eletrodo de
referência foi posicionado no topo da gota, como mostra a Figura 10.
Figura 10 – Esquema da célula eletroquímica: eletrodo de referência (a), solução de trabalho (b) e MEA (c).
Para a observação da superfície dos microeletrodos foi utilizado microscópio
óptico, Sony CCD-IRIS, modelo SSC-C370 acoplado a microcomputador para
aquisição das imagens.
3.3.3. Construção do microeletrodo integrado
A fibra de platina proveniente do processo de desgaste eletroquímico foi soldada
a um fio de cobre (0,2 mm de diâmetro e 9 cm de comprimento). Em seguida, a fibra foi
submetida ao processo de isolamento utilizando um plastificante de borracha
(PlastiFilm, QUIMATEC®) e deixada na posição vertical para a secagem e exposição
da ponta formada pelo processo de corrosão, durante 1 hora. Em uma etapa seguinte
depositou-se uma camada de cola de prata (Joint Metal Comércio LTDA) sobre a
Parte Experimental 41
camada polimérica não-condutora para a fabricação de um eletrodo de referência (quasi-
referência). O “layout” e uma imagem do eletrodo fabricado estão mostrados na figura
11.
Figura 11 – “Layout” e imagem do microeletrodo integrado.
3.3.4. Construção do microeletrodo: isolamento com polímero não condutor
Outra maneira de construção estudada foi o isolamento da fibra utilizando-se
fenol como monômero para formação de uma camada não condutora de polifenol. Para
isolamento da fibra utilizou-se solução de fenol 0,1 mol L-1 e NaOH 1 mol L-1. Os
eletrodos foram polarizados utilizando um programa de potencial de 0 – 1,0 V por 50
ciclos.
3.4. Procedimento de polimento potenciodinâmico
Os eletrodos de platina foram submetidos a um pré-tratamento empregando um
programa de perturbação do potencial com onda quadrada com amplitude de 0,0 a 1,8 V
e freqüência de 50 Hz, durante 3 minutos, em solução de H2SO4 0,05 mol L-1. Os
Parte Experimental 42
eletrodos de ouro foram pré-tratados em meio de HCl utilizando potencial DC igual a
1,7 V vs Ag/AgCl.
O valor de capacitância aparente para os microeletrodos foi determinado
segundo procedimento descrito na literatura (Wipf, Michael et al., 1989) e com este
pôde-se obter informação sobre a eficiência do processo de selagem da matriz de
microeletrodos.
3.5. Modificação da superfície dos eletrodos com filmes de
hexacianoferratos (HCF)
Antes da modificação, a superfície dos eletrodos de carbono vítreo foi polida em
Alumina (1 μm, Alfa Aeser, Ward Hill, MA) e, após isso, os eletrodos foram lavados
com água destilada. Uma vez polidos, os eletrodos foram colocados em aparelho de
ultrassom (Thornton, T14) por alguns minutos em água destilada. Os eletrodos foram
então submetidos a um programa de potencial em soluções apropriadas:
CoHCF: CoCl2 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1
+ NaCl 0,5 mol L-1
InHCF: InCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1
+ NaCl 0,5 mol L-1 + 0,01 mol L-1 HCl
RuOHCF: RuCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1
+ NaCl 0,5 mol L-1 + 0,05 mol L-1 HCl
FeHCF: FeCl3 2,5 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 2,5 mmol L-1
+ NaCl 0,5 mol L-1 + 0,01 mol L-1 HCl
Após modificação da superfície dos eletrodos, a estabilidade dos filmes foi
verificada em solução contendo somente eletrólito suporte, nas mesmas condições da
Parte Experimental 43
modificação. Quando não utilizados os eletrodos foram imersos em eletrólito suporte. O
excesso superficial (Γ) foi determinado medindo-se a carga a partir da área dos registros
voltamétricos, ou melhor, do último voltamograma da verificação da estabilidade
(processo redox do Ru(II)/Ru(III) ou Fe(II)/Fe(III), respectivamente, RuOHCF e
FeHCF).
3.6. Célula de para análise por injeção em fluxo
O sistema em fluxo consistiu em uma bomba peristáltica (Ismatec ISM 828),
uma válvula injetora comutadora e uma célula de acrílico na configuração wall-jet,
Figura 12.
Parte Experimental 44
A
B
C
Entrada doFluxo
Saída doFluxo
Figura 12 – Representação esquemática da célula de fluxo utilizada nos experimentos em FIA: Eletrodo de Trabalho (A), Referência (B) e Auxiliar (Aço inox) (C).
3.7. Amostras de diferentes frutas
Laranjas (Citrus sinensis), goiaba branca (Psidium guajava L.) e tomates
(Lycopersion esculentum) foram obtidos em supermercados locais. O grau de maturação
das laranjas foi avaliado pela coloração da casca: verde (não madura) e amarelo
alaranjado (madura). Todas as frutas foram armazenadas a 5 ºC.
Parte Experimental 45
3.8. Tratamento Enzimático
Para investigar possíveis interferências de matriz ao se utilizar o método
amperométrico para quantificação de ácido ascórbico no suco de laranja, a degradação
seletiva do ácido ascórbico foi realizada (De Donato, Pedrotti et al., 1999). Pepino
(Cucumbis sativus), é uma fonte natural de ascorbato oxidase. O pepino foi cortado em
pequenos pedaços (a pele foi removida previamente) e aproximadamente 1 g foi
adicionado a 10 mL do suco da laranja. A mistura foi deixada sob agitação magnética
por 15 minutos. Após isso, a solução foi filtrada, e os experimentos foram realizados
como filtrado.
3.9. Preparação das amostras de DNA
Um miligrama de DNA de timo de bezerro foi dissolvido em 1 mL de tampão
fosfato pH 7,4. Realizou-se então a precipitação do DNA adicionando-se um volume
apropriado de tampão HAc/Ac- 3 mol L-1 pH 5 e 1 mL de etanol. Essa suspensão foi
congelada a -20 ºC durante uma noite e centrifugada a 1000 g por 5 minutos a 4 ºC. O
“pellet” resultante foi lavado com 70 % de etanol e dissovido em 1 mL de água.
Adicionou-se ao DNA (200 μg) 4 μL de tampão ácido/acético acetato 1 mol L-1 (pH 5)
e, em seguida, procedeu-se à digestão do DNA adicionando-se 2 unidades da nuclease
P1 a 37 ºC por 30 minutos. 12 μL de tampão Tris/HCl (pH 7,4), 12 μL de tampão
fosfato e 12 unidades da fosfatase alcalina foram adicionados por mais 1 hora a 37 ºC.
O volume final foi ajustado para 200 μL com água. As enzimas foram precipitadas pela
adição de clorofórmio e as soluções resultantes foram utilizadas para a quantificação da
Parte Experimental 46
dG. O Esquema 2 mostra uma representação simplificada do procedimento de hidrólise
enzimática, descrito anteriormente.
Esquema 2.
3.10. Preparação das amostras de urina
As amostras de urina foram utilizadas sem tratamento prévio e logo após o
processo de coleta. Coletaram-se amostras de 3 diferentes indivíduos e estas foram
armazenadas em frascos esterilizados de 50 mL. O volume de amostra utilizado variou
de 100 a 500 μL (Volume final após diluição 10 mL).
3.11. Método coulométrico
A exatidão do método proposto para quantificação de ácido ascórbico no suco de
fruta foi avaliada utilizando o método coulométrico com eletrogeração de iodo (Paixão,
Matos et al., 2003). Um coulômetro da Metrohm modelo 211A foi empregado para
gerar o titulante. Um anodo (em forma de espiral) e um catodo (em forma de rede) de
Parte Experimental 47
platina foram utilizados no arranjo experimental. A solução de trabalho consistiu em 50
mL de mistura contendo HAc 1 mol L-1/Ac- 0,1 mol L-1 + KI 0,1 mol L-1, pH = 3,7.
Amido foi utilizado como indicador para visualização do ponto final da titulação.
3.12. Método cromatográfico
As análises comparativas por HPLC foram realizadas em um sistema HPLC da
Shimadzu (Shimadzu, Kyoto, Japan). O sistema inclui ainda duas bombas LC-6AD, um
auto injetor (SIL-10AVP), e um dispositivo SPD-M10AVP para leitura da absorbância.
Esse dispositivo é controlado por um comunicador SCL-10AVP e um software CLASS-
VP. Como coluna analítica utilizou-se uma coluna Luna C18 (2) (250 mm x 4,6 mm,
diametro interno: 5 μm) (Phenomenex, Torrance, CA). A eluição foi feita em modo
isocrático, com tampão fosfato 25 mmol L-1 e 8 % de methanol, a uma vazão de 1 mL
min-1 por 45 minutos, e a absorbância foi monitorada em 254 nm. A curva de calibração
foi preparada em uma faixa de dG que compreenderia as concentrações das amostras de
DNA hidrolisada.
3.13. Microscopia eletrônica de Varredura
A morfologia dos filmes de RuOHCF e FeHCF foi avaliada utilizando
microscopia eletrônica de varredura (MEV). Essas medidas foram realizadas utilizando
um microscópio da Cambridge (LEO Stereoscan 440) equipado com um espectrômetro
de energia dispersiva de raio-X, que determina a composição da região avaliada na
MEV. Utilizou-se para essas medidas um placa de carbono vítreo de 1 cm2 (Alfa Aesar,
Massachusetts, EUA).
Parte Experimental 48
3.14. Elipsometria
A espessura dos filmes de RuOHCF eletrodepositados sobre a superfície das
placas de carbono vítreo foi determinada por elipsometria. As medidas foram realizadas
utilizando um Elipsômetro (Ratzeburg, Alemanha) conforme procedimento descrito na
literatura (Fujimoto e Petri, 2001). A concentração dos sítios eletrocatalíticos no filme
de RuOHCF foi calculada usando a seguinte fórmula: b0 (mol cm-3) = Γ/L, onde Γ é o
excesso superficial (mol cm-2) e L a espessura do filme (cm) medida por elipsometria.
3.15. Cultura de neuroblastomas humanos
Neuroblastomas humanos (linhagem SH-SY5Y) não transformados e
expressando constitutivamente SOD humana nativa (SH-SY5Y/SOD WT) ou SOD
humana mutante G93A (SH-SY5Y/SOD G93A), foram fornecidos gentilmente pela
Profa. Dra. Maria Teresa Carrì da Universidade de Roma, Itália à Profa. Dra. Marisa
Helena Gennari de Medeiros. A transformação das células SH-SY5Y com SOD humana
nativa ou a mutante G93A foi realizada como descrito na literatura (Carri, Ferri et al.,
2003).
As células foram cultivadas em meio DEMEM / Nutriente HAM F12 (pH 7,4),
enriquecido com 15 % (v/v) de soro fetal bovino (SFB), penicilina (0,04 g/L), sulfato de
estreptomicina (0,1 g/L) e NaHCO3 (3,7 g/L). No meio contendo as células
transformadas adicionou-se ainda geneticina (0,2 g/L) para seleção (o plasmídio
pRc/CMV utilizado para inserir o gene da SOD contém um marcador de resistência à
neomicina, o qual confere resistência à geneticina em células eucarióticas). O meio de
Parte Experimental 49
cultura foi filtrado com filtro de 0,2 μm para eliminar fungos e bactérias. As células
foram incubadas em atmosfera de 5 % de CO2 / ar a 37ºC.
No início da cultura celular, a suspensão de células (1 mL) foi descongelada e
centrifugada a 1000 rpm por 2 min. No fluxo laminar estéril, o sobrenadante foi
descartado e o pellet ressuspendido em 1 mL do meio adequado. Após outra
centrifugação, o sobrenadante foi novamente descartado e o pellet ressuspendido em 1
mL de meio. A suspensão de células foi transferida para uma garrafa pequena de cultura
e mais 9 mL de meio foram adicionados.
Para o repique das células, o meio foi aspirado e as células lavadas duas vezes
com 5 mL de PBS-A (NaCl 137 mM; KCl 2,68 mM; KH2PO4 1,47 mM; Na2HPO4 8
mM) autoclavado. Em seguida, as células foram destacadas com 1,5 mL de tripsina 0,05
% (p/v) e após 2 min, 25 mL de meio foi adicionado e a suspensão transferida para uma
garrafa grande. Para o congelamento das células, 1 mL de dimetilsulfóxido (DMSO) foi
adicionado a 10 mL de meio nesta etapa e a suspensão de células foi dividida em 10
vials. Os vials ficaram 30 min no congelador, 24 h no freezer a -80ºC e foram estocados
em nitrogênio líquido.
3.16. Avaliação do consumo de ascorbato pelas células SH-SY5Y
utilizando microeletrodo modificado com filme de óxido de rutênio
hexacianoferrato
O consumo de ascorbato pelos 3 tipos celulares - SH-SY5Y, SH-SY5Y (SOD
WT), SH-SY5Y (SOD G93A) – foi acompanhado pelo decaimento da concentração de
ascorbato no meio de cultura por 3 h. Um dia antes das medidas, 106 células foram
plaqueadas em um poço de uma placa de 12 poços, em meio DMEM-HAM F12 com 15
Parte Experimental 50
% de SFB. Imediatamente antes das medidas, as células foram lavadas com PBS e
foram adicionados 2 mL de meio MEM (GibcoBRL, New York) incolor sem SFB, com
0,5 mM de glutationa reduzida (GSH) e 0,2 mM de ascorbato. Os experimentos foram
realizados com sistema de 3 eletrodos: fio de platina como eletrodo auxiliar, eletrodo de
Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência, e microeletrodo de carbono vítreo (r =
14,5 µm) modificado com filme de óxido de rutênio hexacianoferrato como eletrodo de
trabalho. Os três eletrodos foram mergulhados no meio de cultura sobre as células, à
temperatura ambiente. Para as medidas amperométricas utilizou-se o potenciostato
portátil da PalmSens (Palmsens BV, Houten, Holanda), conectado a um
microcomputador.
3.17. Medidas eletroquímicas em uma única célula
Antes da realização das medidas, o meio foi trocado por tampão fosfato (pH =
7,0). Utilizou-se como microambiente fibroblastos da espécie homonares humanus
linhagem IMR-90. Para visualização dos fibroblastos utilizou-se um microscópio
invertido Diaplot 300 da Nikon (Tokyo, Japão). Para acessar o interior das células com
o microeletrodo, utilizou-se um micromanipulador da Stoelting Co. modelo 55133,
Figura 13.
Parte Experimental 51
Figura 13 – Micromanipulador utilizado nos experimentos utilizando os fibroblastos.
Resultados e Discussão 52
4. Resultados e Discussão
4.1. Fabricação e caracterização dos microeletrodos
4.1.1. Microeletrodos fabricados por desgaste eletroquímico
O processo de corrosão do fio de platina é um processo demorado, pois a platina
é um metal nobre. Llopis e colaboradores (Llopis, 1968), em um artigo de revisão,
descrevem que o processo de oxidação anódica da platina em H2SO4 ou NaOH é
praticamente indetectável. Entretanto, em soluções contendo íons Cl- nota-se um
pequeno processo de desgaste da platina. Nesse processo ocorre a formação de íons
complexos de Pt(II)Cl42- ou Pt(II)Cl6
4-. Contudo, quando uma diferença de potencial
maior do que 1 V é aplicada à célula eletroquímica a corrente decai a zero, indicando
uma diminuição na velocidade do processo de corrosão. Isto ocorre devido à passivação
da superfície do eletrodo com formação de uma camada de óxido (Llopis, 1968).
Utilizando um potencial AC, ao contrário de um potencial DC, o processo de
corrosão da platina é então muito mais eficiente. O potencial alternado reverte o
processo de passivação da superfície, pois na fase negativa de potencial a camada de
óxido é dissolvida e, desta maneira, ocorre a limpeza da superfície do eletrodo para que
o mesmo possa ser oxidado na fase positiva de potencial. A Figura 14 mostra um
esquema do processo de corrosão durante a microfabricação do microeletrodo de
platina.
Resultados e Discussão 53
Figura 14 – Esquema do processo de desgaste eletroquímico da fibra de platina em função do tempo (t). Pt4+ = ● e Cl- = o. Durante o processo de microfabricação monitorou-se a corrente AC com o
auxílio de um multímetro conectado em série, Figura 15.
0 4 8 12 1660
80
100
120A
I / m
A (R
MS)
Tempo / min.
Figura 15 – Sinal amperométrico registrado durante desgaste eletroquímico de fibra de platina de diâmetro igual a 100 μm. Freqüência alternada de 60 Hz e potencial eficaz 5 V. Em (A) ocorreu o rompimento da fibra.
t
Resultados e Discussão 54
Nota-se na Figura 15 que inicialmente o processo de corrosão é lento
(aproximadamente 10 minutos). Contudo, assim que iniciado ocorre uma queda da
corrente, indicando a corrosão da fibra. Com o tempo a platina vai sendo consumida até
que ocorra o rompimento da fibra e aparecimento de duas fibras com extremidades
“apontadas”. Diferentes transformadores AC foram usados a fim de avaliar a influência
do potencial sobre o tempo de corrosão e a qualidade da fibra formada. Duas fibras
formadas a partir de um processo de corrosão, utilizando potencial eficaz de 5 V, são
mostradas na Figura 16.
Resultados e Discussão 55
A
B
Figura 16 – As duas extremidades de uma fibra de platina que sofreu o processo de corrosão. Extremidade superior (A) e extremidade inferior (B). Potencial eficaz utilizado = 5 V.
Na Figura 17 é mostrada a microscopia eletrônica de varredura para a
fibra de platina desgastada eletroquimicamente e na Figura 18 é apresentada uma fibra
Resultados e Discussão 56
que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de
potencial eficaz de 10 V.
Figura 17 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz de 5 V.
Resultados e Discussão 57
Figura 18 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de platina que sofreu um processo de desgaste eletroquímico utilizando-se um transformador de potencial eficaz de 10 V. Utilizando-se potenciais mais altos (10 V) o tempo de formação da
microestrutura diminuiu para 6 minutos quando comparado com o valor obtido a 5 V,
que foi de 15 a 16 minutos. Entretanto, nota-se que a estrutura apresentada na Figura 18
é muito mais irregular. Na literatura (Sorensen, Hvid et al., 1999), Andersen em um
comunicado privado sugere um segundo mecanismo que poderia ocorrer a altos valores
de potencial aplicado, acarretando em altas taxas de desgaste eletroquímico. Este
mecanismo está baseado no fato de que em potenciais maiores do que 1,23 V pode
ocorrer a eletrólise da água formando-se oxigênio, quando a fibra de platina atua como
ânodo, e hidrogênio, quando a mesma atua como cátodo. Esse hidrogênio formado no
eletrodo de platina pode difundir-se intersticialmente para o interior do eletrodo de
platina, assim como o oxigênio. Desta maneira, a combinação de oxigênio e hidrogênio
Resultados e Discussão 58
poderia levar à formação de microexplosões, que acarretariam em uma superfície com
mais imperfeições (Figura 18).
Com base nestes estudos preferiu-se utilizar o potencial eficaz de 5 V, uma vez
que este resulta em uma superfície com menos imperfeições quando comparada com a
fabricada com potencial eficaz de 10 V. Imperfeições na superfície causam problemas
de selagem e aumento na corrente capacitiva, levando a uma maior histerese nos
voltamogramas.
Microeletrodos de ouro também foram construídos utilizando a técnica de
desgaste eletroquímico. Diferentemente da platina, fibras de ouro apresentam uma
maior facilidade de corrosão uma vez que estas não apresentam processos de passivação
que influenciam a velocidade de corrosão, não necessitando assim de potencial AC.
Para tanto, utilizou-se uma solução de HCl 4 mol L-1 no processo de desgaste
eletroquímico. Nessas condições ocorre oxidação do ouro de acordo com a equação
química abaixo (Bard, 1975):
Au(s) + 2Cl- AuCl2- + e- Eº= 1,154 V (6)
A voltagem DC utilizada de 1,7 V é suficientemente elevada para que a reação
ocorra. Ao contrário da platina, a fibra de ouro é imersa 2 mm na solução e o final do
processo de desgaste eletroquímico só ocorre quando a corrente registrada for nula,
Figura 19. A Figura 20 mostra uma fibra de ouro fabricada pelo processo descrito
acima.
Resultados e Discussão 59
0 10 20 30 40 50 60 700
10
20
30
I / m
A
Tempo / s
Figura 19 – Amperograma registrado durante o processo de desgaste eletroquímico da fibra de ouro de diâmetro igual a 100 μm. Diferença de potencial entre os eletrodos = 1,7 V e solução para corrosão = HCl 4 mol L-1.
Figura 20 – Microscopia eletrônica de varredura da fibra de ouro após processo de desgaste eletroquímico.
Resultados e Discussão 60
Nota-se na Figura 20 que, como na platina, ocorre um afinamento da fibra.
Posteriormente ao processo de microfabricação dos eletrodos procedeu-se com o
processo de selagem, como descrito na parte experimental. A Figura 21 mostra uma
fibra de platina com a camada isolante (B) e para fins de comparação apresenta-se
também uma foto da fibra antes da etapa de selagem (A). Comparando-se as Figuras
21A e 21B pode-se observar um aumento do diâmetro da fibra na parte superior,
indicando assim o recobrimento dessa região com o plastificante.
(A) (B)
Figura 21 – Fibra de platina desgastada eletroquimicamente antes (A) e após (B) a selagem com plastificante de borracha.
Resultados e Discussão 61
As Figuras 22 e 23 mostram voltamogramas cíclicos registrados em ouro e
platina, respectivamente, após pré-tratamento. Na Figura 23 é mostrado um resultado
sem pré-tratamento para o eletrodo de platina.
0,0 0,2 0,4
0
100
200
300
400
500
B
A
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 22 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K4Fe(CN)6 20 mol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. A e B referem-se a dois diferentes microeletrodos de platina (A) e ouro (B) fabricados pelo processo de desgaste eletroquímico. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
Resultados e Discussão 62
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
C
BA
100 nA
E / V vs Ag/AgCl
Figura 23 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Microeletrodo de Pt 1 sem (A) e com (B) pré-tratamento (Como descrito na parte experimental) e microeletrodo de platina 2 (C) após pré-tratamento. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Nas Figuras 22 e 23 notam-se perfis voltamétricos (sigmoidais) típicos obtidos
utilizando microeletrodos, justificados pela difusão radial do material eletroativo para a
superfície do eletrodo. Em relação ao pré-tratamento, conclui-se que o mesmo é de
fundamental importância para a obtenção de voltamogramas com as características
desejadas.
A Figura 24 mostra o perfil voltamétrico para o microeletrodo de fibra de
carbono. Nesse experimento removeu-se, por polimento, a pequena parte da fibra
exposta após o processo de selagem. Esse procedimento foi utilizado para avaliar o raio
do microeletrodo. O raio obtido a partir da equação 3 e o valor de IL foi de 2,3 μm,
indicando a eficiência do processo de desgaste eletroquímico para a fibra de carbono.
Resultados e Discussão 63
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6-9
-6
-3
0I /
nA
E / V vs Ag/AgCl
Figura 24 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 12,5 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Microeletrodo de fibra de carbono.
Dando continuidade ao processo de fabricação dos microeletrodos para medidas
em ambientes microscópicos, tentou-se integrar um eletrodo quase-referência aos
microeletrodos construídos anteriormente, utilizando o plastificante de borracha e cola
de prata.
Inicialmente registraram-se voltamogramas a fim de comparar a resposta obtida
pelo eletrodo de “referência” proposto com a de um eletrodo de referência comercial,
Figura 25. Comparando os perfis voltamétricos obtidos nenhuma mudança significativa
pôde ser evidenciada no que diz respeito à corrente, observando-se apenas um
deslocamento do potencial de meia-onda (170 mV).
A capacitância aparente dos microeletrodos foi determinada segundo
procedimento descrito na literatura (Wipf, Michael et al., 1989), obtendo-se o valor de 5
Resultados e Discussão 64
μF cm-2. Este baixo valor de capacitância obtido demonstra a eficiência do processo de
selagem do microeletrodo.
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
E / V vs Ag/AgCl
100 nA
Figura 25 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 20 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1, utilizando 2 microeletrodos de Pt de áreas diferentes. Registros realizados com (⎯⎯) e (- - -) sem o referência integrado. Em (- - -) utilizou-se Ag/AgCl saturado como eletrodo de referência. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
O tempo de vida do eletrodo foi verificado medindo-se o sinal de corrente para
soluções de K3[Fe(CN)]6 1 mmol L-1, e após 2 semanas não foram observadas mudanças
no valor de corrente limite para o processo de redução do K3[Fe(CN)]6. Medidas
potenciométricas do eletrodo quasi-referência também foram realizadas contra eletrodo
padrão de Ag/AgCl, KCl saturado, e não se constatou alteração significativa do
potencial do eletrodo de referência integrado. Quando não utilizado, o eletrodo foi
armazenado a seco. A repetibilidade das respostas do sensor foi avaliada para 20
medidas de corrente em voltamogramas registrados em uma solução de K3[Fe(CN)6] 1
mmol L-1, obtendo-se um valor de 2,4 % de desvio padrão.
A Figura 26 mostra a microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado.
Resultados e Discussão 65
Figura 26 – Microscopia eletrônica de varredura do eletrodo integrado e ampliação da ponta do eletrodo. O aparecimento de uma região mais escura na Figura 26, região A, deve-se ao
acúmulo de cargas negativas provenientes do feixe de elétrons, o que indica uma região
não condutora (região recoberta pelo plastificante de borracha). Mais acima dessa região
tem-se uma parte mais clara que representa a camada de prata depositada sobre a
camada do polímero não condutor. Na região ampliada tem-se uma melhor visualização
da ponta do microeletrodo não recoberta pelo plastificante e responsável pela área
eletroativa do microeletrodo de platina. Nota-se que o tamanho do dispositivo, na região
mais próxima da região exposta da platina, é da ordem de 6 µm.
Novas tentativas para construir eletrodos em que o eletrodo de referência ficasse
mais próximo da ponta do microeletrodo foram realizadas. Filmes finos de plastificante
resultam em uma camada porosa do isolante. Com isso, para que a camada de prata
possa ser depositada sem resultar em problemas de curto-circuito entre o eletrodo de
trabalho e o de referência, um maior número de deposições de plastificante é requerido.
Esse aumento do número de deposições do plastificante resultou em um aumento
A
B
Resultados e Discussão 66
significativo do diâmetro do dispositivo, Figura 27, o que acarretaria em maior
dificuldade de introdução no interior de microambientes.
Entretanto, pode-se utilizar o dispositivo com o eletrodo de referência integrado
mais na parte superior, região B (Figura 26), ou ainda sem o eletrodo de referência
integrado (2 eletrodos independentes), sem acarretar em problemas nas medições de
corrente e na inserção do microeletrodo nos microambientes.
Figura 27 – Microscopia eletrônica de varredura do dispositivo no qual a disposição do eletrodo de ficou mais próxima da ponta do microeletrodo.
Devido ao aumento do tamanho deste dispositivo em relação ao apresentado na
Figura 26, novo procedimento foi testado para o isolamento das microfibras fabricadas a
partir do processo de corrosão eletroquímica. Testou-se então o isolamento da
microfibra por eletropolimerização do fenol sobre a superfície eletródica. O mecanismo
que resulta na formação de um polímero não condutor pode ser representado pelo
mecanismo exposto no esquema 3.
Resultados e Discussão 67
OH O-
O
O OH
OH
O
O OHO
OH
O
OH
O O-
O
O OHO
OH
H++
H++
O
n
n
OH
n
e-
Esquema 3.
O mecanismo de formação da camada polimérica é similar ao mecanismo de
formação do polipirrol. Em meio alcalino, o equilíbrio ácido-base do fenol é deslocado
para a formação do fenolato. O fenolato pode ser oxidado na superfície do eletrodo de
platina ao seu respectivo radical. Esse radical é adsorvido na superfície do eletrodo e
reage com o fenol presente na solução para a formação do dímero na forma para ou
orto. Entretanto, somente a forma para dá continuidade à formação do polímero, que
Resultados e Discussão 68
forma um radical ou reage com o radical fenolato. O progresso da etapa de isolamento
da fibra foi monitorado pelos registros voltamétricos, como demonstrado na Figura 28.
0,0 0,3 0,6 0,9
0
30
60
50
15
1
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 28 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de isolamento da microfibra de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Solução: Fenol 0,1 mol L-1 + NaOH 1 mol L-1. Número de ciclos: 50. Na Figura estão representados os ciclos de 1 a 15 e o quinqüagésimo ciclo.
O pico na região de aproximadamente 0,6 V ocorre somente nos primeiros ciclos
e, à medida que o processo de polimerização ocorre, a superfície da microfibra vai
sendo recoberta por inteiro e o sinal de corrente referente ao processo faradaico da
polimerização do fenol sobre a superfície eletródica diminui. Tipicamente a fibra é
polarizada por 50 ciclos na solução de fenol em meio alcalino.
Para que uma pequena região da superfície eletródica fique exposta para as
futuras medidas eletroquímicas é necessário que a camada isolante seja removida da
ponta do microeletrodo. Para isso, colocou-se a ponta da microfibra recoberta com a
camada do polímero dentro de uma solução contendo HCl 0,1 mol L-1 e polarizou-se a
Resultados e Discussão 69
mesma em -1,0 V. Esse potencial negativo leva à formação de H2, que quebra a camada
do isolante. Nota-se então que a camada do isolante é permeável ao próton, entretanto
espécies grandes são impedidas de alcançar a superfície eletródica. Registros
voltamétricos em solução contendo Ru(NH3)63+ ou Fe(CN)6
3- não resultaram em sinal
de corrente proveniente da redução destas espécies ao se trabalhar com o eletrodo
contendo a camada polimérica isolante. Um voltamograma registrado utilizando-se o
microeletrodo construído a partir desse procedimento (após a remoção de uma parte da
camada isolante) está apresentado na Figura 29.
0,0 0,2 0,4-200
-150
-100
-50
0
50
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 29 – Voltamogramas cíclicos registrados em solução de K3Fe(CN)6 10 mmol L-1 + KCl 0,1 mol L-1, utilizando microeletrodo recoberto com a camada polimérica. Velocidade de varredura: 50 mV s-1.
Em resumo, pôde-se verificar que microeletrodos da ordem de alguns
micrometros foram construídos utilizando diferentes materiais. Os processos de selagem
não resultaram em um aumento significativo do diâmetro do eletrodo. Aparentemente, o
processo de selagem por polimerização seria o mais adequado para medidas em células
individuais devido ao acréscimo nanométrico da espessura do isolante. Por outro lado,
se somente as pontas dos microeletrodos fossem introduzidas nos microambientes,
Resultados e Discussão 70
todos os procedimentos poderiam ser utilizados, com exceção do eletrodo integrado em
que o eletrodo de referência fica muito próximo da ponta do microeletrodo.
4.1.2. Microeletrodos fabricados utilizando técnica litográfica
Estudos preliminares foram realizados com o intuito de avaliar a conexão
elétrica entre os microeletrodos e os contatos elétricos das terminações das trilhas,
polarizando-se o conjunto de microeletrodos em -1,5 V vs Ag/AgCl em solução de
H2SO4 1 mol L-1. Durante o experimento a superfície dos microeletrodos foi monitorada
utilizando-se um microscópio óptico (descrito na parte experimental). A Figura 30
mostra imagens antes e após a polarização de um conjunto de microeletrodos (Figura 9,
Conjunto de 1-25). Observam-se bolhas de hidrogênio na superfície de 4 microeletrodos
nesse conjunto, indicando assim que os outros microeletrodos possivelmente perderam
ou não apresentam contato elétrico com os contatos externos. Foi observado nas outras
regiões que um grande número de eletrodos estava funcionando perfeitamente. Além
disso, esse procedimento foi utilizado com o intuito de limpeza da superfície dos
microeletrodos, uma vez que o polimento mecânico da superfície dos microeletrodos
não era possível.
Resultados e Discussão 71
A B Figura 30 – Imagem antes (A) e após (B) a polarização dos microeletrodos em -1,5 V vs Ag/AgCl. Eletrólito suporte: H2SO4 1 mol L-1.
A capacitância dos microeletrodos foi determinada (Wipf, Michael et al., 1989)
em uma solução de KCl 1 mol L-1 e o valor obtido foi de 29,7 μF cm-2. Esse valor
relativamente baixo de capacitância indica um bom processo de selagem entre os
eletrodos e a camada do isolante, sendo esse um fator importante na utilização desde
dispositivo para medidas utilizando velocidades de varredura muito altas.
O comportamento eletroquímico dos microeletrodos fabricados foi investigado
em experimentos voltamétricos utilizando solução de K3Fe(CN)6, Figura 31. A resposta
voltamétrica foi registrada a partir de dois microeletrodos interconectados, que foram
escolhidos utilizando-se o experimento da evolução de bolhas de hidrogênio conforme
mostrado na Figura 31. O perfil sigmoidal esperado para eletrodos onde a corrente é
governada por um processo de difusão radial foi observado, Figura 31a. A área
eletroquímica nesse caso foi calculada utilizando a equação 3. Foi considerado que a
corrente responsável pelo processo eletroquímico sobre a superfície dos microeletrodos
é a soma dos valores de corrente obtidos se os eletrodos fossem estudados de maneira
independente, o que é válido caso não ocorra sobreposição das camadas de difusão
individuais de cada microeletrodo. Vale salientar ainda que a equação de corrente limite
Resultados e Discussão 72
utilizada consiste em aproximação já que os microeletrodos utilizados não possuem
geometria circular e sim quadrática. Dessa maneira, utilizando-se o valor do coeficiente
de difusão (Adams, 1969) do Fe(CN)63- igual a 7,6 x 10-6 cm2 s-1, o raio calculado para
os 2 eletrodos interconectados foi de 19 μm, correspondendo em média a 9,5 μm para
cada eletrodo da matriz.
0,0 0,2 0,4 0,6
-16
-12
-8
-4
0
4
d
cb
a
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
0,0 0,2 0,4 0,6
-80
-40
0
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 31 – Voltamogramas registrados em solução contendo Fe(CN)63- 1 mmol L-1
+ KCl 1 mol L-1 de 2 microeletrodos interconectados (a). Os voltamogramas (b e c) representam, cada, 25 microeletrodos interconectados. O voltamograma (d) foi registrado com um grupo de 50 microeletrodos. Velocidade de varredura de 50 mV s-1. A Figura 31 mostra, também, os voltamogramas apresentados para outros
diferentes conjuntos de microeletrodos interconectados. Os voltamogramas
apresentados na Figura 31b e c foram obtidos utilizando-se diferentes conjuntos de 25
microeletrodos, sendo o perfil sigmoidal dos voltamogramas obtido em ambos os casos.
Comparando-se o valor calculado para os 2 microeletrodos na Figura 31a, chega-se a
um valor de 13 e 15 microeletrodos ativos em b e c, respectivamente. Interconectando
Resultados e Discussão 73
estes conjuntos de 25 microeletrodos entre si um novo voltamograma foi obtido, e a
soma dos valores de corrente limite, desses conjuntos separados, foi o valor obtido para
o conjunto de 50 microeletrodos interconectados. Esta observação indica que os
microeletrodos estão suficientemente separados, evitando assim, qualquer problema de
sobreposição das camadas de difusão individuais.
4.2. Utilização dos sensores fabricados
Uma vez que microeletrodos constituem-se em ferramenta de fundamental
importância para a exploração do domínio microscópico e para a detecção de analitos
em pequenos volumes de amostra, dois diferentes sistemas foram estudados para avaliar
o desempenho dos microeletrodos fabricados.
4.2.1. Monitoramento “in-situ” de ácido ascórbico em frutas
A determinação de vitaminas em frutas e fluidos biológicos geralmente é muito
demorada e os métodos apresentam custos relativamente altos (Varley e Gowenlock,
1976). A vitamina C, ácido ascórbico, pode ser eletroquimicamente oxidada com
relativa facilidade sobre superfícies de platina a ácido desidroascórbico. Com isso,
sensores eletroquímicos podem propiciar informações rápidas e baratas sobre a
quantidade de ácido ascórbico em frutas.
Inicialmente estudou-se o comportamento eletroquímico do ácido ascórbico
sobre a superfície do eletrodo de platina. A Figura 32 mostra voltamogramas cíclicos
registrados em 3 diferentes valores de pH para uma solução 10 mmol L-1 de ácido
Resultados e Discussão 74
ascórbico, utilizando-se microeletrodos de platina construídos a partir do processo de
desgaste eletroquímico e selagem com o plastificante, descrito na parte experimental.
Figura 32 – Voltamogramas registrados em solução contendo 10 mmol L-1 de ácido ascórbico. Eletrólito suporte: NaOH 0,1 mol L-1 (A), tampão fosfato pH = 7,0 (B), Tampão Ac-/HAc pH = 5,6 (C) e HCl 0,01 mol L-1 (D). Microeletrodos de platina e velocidade de varredura igual a 50 mV s-1. Nota-se que o potencial redox para o processo de oxidação anódica do ácido
ascórbico sobre o eletrodo de platina é dependente do pH uma vez que íons H+
participam do processo eletroquímico segundo a equação 7:
(7)
Analisando a equação 7, nota-se que o aumento do pH favorece o processo
anódico e esta conclusão é suportada pelos resultados mostrados na Figura 32. Vale
OHOH
O
OHOH
OOH
OHO
OO
O
+ 2H+ + 2e-
Resultados e Discussão 75
salientar ainda, como mais uma vantagem da utilização dos microeletrodos, a ausência
de problemas de envenenamento da superfície do eletrodo (Araki e Toma, 2002) e isto
pode ser observado ao se comparar voltamogramas sucessivos registrados, Figura 33.
Esse envenenamento é causado pelo produto da oxidação do ácido ascórbico e tem
efeito minimizado empregando-se microeletrodos, possivelmente devido à difusão mais
rápida da espécie gerada na superfície eletródica.
0,4 0,8 1,2
A, B100 nA
0,4 0,8 1,2
DC
E / V vs Ag/AgCl
100 μA
Figura 33 – Voltamogramas consecutivos registrados em solução de HCl 0,01 mol L-1 + 10 mmol L-1 de ácido ascórbico em dois diferentes eletrodos de platina: microeletrodos (A, B) e macroeletrodos (C,D): 1º Ciclo (A,C) e 2º Ciclo (B,D). Estudos com suco de laranja foram realizados a fim de investigar a eventual
presença de interferentes. Para isso, registraram-se voltamogramas cíclicos no suco de
laranja na ausência e na presença da enzima ascorbato oxidase, obtida a partir do pepino
(Figura 34).
Resultados e Discussão 76
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
20
40
60
CB
AI /
nA
E / V vs Ag/AgCl
Figura 34 – Voltamogramas lineares obtidos utilizando-se microeletrodo de platina a 50 mV s-1: suco de laranja antes (A) e após (B) 30 minutos da adição de cubos de pepino (B). A Curva C foi obtida em tampão fosfato, pH = 7. Nota-se em A que anteriormente à adição da enzima, um sinal referente a um
processo de oxidação inicia-se por volta de 0,3 V vs Ag/AgCl (pHlaranja entre 5 e 6),
região em que o ácido ascórbico se oxida nesta faixa de pH, Figura 32C. Em B nota-se a
ausência de processo eletroquímico, uma vez que na presença de ascorbato oxidase o
ácido ascórbico é degradado a ácido desidroascórbico, equação 8. Desta forma, pode-se
dizer que na região de trabalho estudada não existem espécies eletroativas que possam
vir a causar alguma interferência na determinação de ácido ascórbico. Estudos de adição
e recuperação no suco também foram realizados com a finalidade de observar possíveis
efeitos de interferência da matriz, Tabela 4. Valores de recuperação da ordem de 95 a
102% foram obtidos, reforçando assim a possibilidade de detecção de ácido ascórbico
utilizando o sensor proposto e a ausência de interferência de matriz no suco de laranja.
Resultados e Discussão 77
(8)
Tabela 4 - Valores de adição e recuperação usando três diferentes sucos de laranja.
Suco de laranja Ácido Ascórbico
/ mmol L-1
Valores de recuperação
/ %
Adicionado Encontrado
1 1,00 0,98 98
2 1,00 0,95 95
3 1,00 1,02 102
Wang e colaboradores (Wang e Lin, 2000) relataram a existência de pouca
informação sobre a capacidade anti-oxidante de frutas em diferentes estágios de
desenvolvimento. Além disso, esses autores observaram que o aumento do grau de
maturação de alguns frutos, tais como amora, morango e framboesa, aumenta a
capacidade anti-oxidante. Dosunmu e colaboradores (Dosunmu e Johnson, 1995)
verificaram o efeito da estocagem sobre a concentração do ácido ascórbico. Neves e
colaboradores (De Andrade, Diniz et al., 2002) também verificaram influência
semelhante do processo de maturação em 3 diferentes frutas (araçá, acerola e laranja).
Desta forma, a determinação de ácido ascórbico em frutos se mostra relevante pois pode
contribuir para um aproveitamento mais racional dos recursos naturais gerando
benefícios sociais e econômicos. Entretanto, os métodos utilizados para o
O H OH O
OH O H
OOH
OH O
OO
O
+ O 2 + 2 H 2 O ascorbatooxidase
2 2
Resultados e Discussão 78
monitoramento em frutas requerem uma manipulação prévia da amostra e extração do
suco. Métodos “in-situ” e sem destruição da amostra seriam de grande valia para a
avaliação destes parâmetros.
Aproveitando a possibilidade do uso de microeletrodos para minimizar a
manipulação da amostra, decidiu-se monitorar “in-situ” a distribuição de ácido
ascórbico na laranja. Utilizou-se um sistema de 2 eletrodos como descrito na parte
experimental e estes foram inseridos em diferentes regiões da laranja a fim de mapear as
diferenças na concentração de ácido ascórbico. A Figura 35 mostra um voltamograma
registrado “in-situ” na laranja e uma fotografia do conjunto de eletrodos inseridos em
uma das metades da laranja.
Resultados e Discussão 79
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
0
10
20
30
40
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 35 – Voltamograma registrado “in-situ” em uma laranja utilizando microeletrodo de platina. Velocidade de varredura: 50 mV s-1. Imagem da posição do eletrodo na laranja na foto acima. Estudos posteriores foram realizados para investigar a influência da queda
ôhmica sobre as medidas voltamétricas. Para isso, experimentos foram realizados
alterando a posição do eletrodo de referência em relação ao microeletrodo de platina. A
Resultados e Discussão 80
resistência entre as diferentes posições da laranja foi medida utilizando-se um
multímetro, e observou-se um aumento da resistência com o aumento da distância entre
os eletrodos, Tabela 5. Entretanto, os valores de corrente limite e E1/2 obtidos pelos
registros voltamétricos confirmaram que alterações na resistência não alteravam
significativamente os valores de IL e E1/2. Esse fato já era esperado, uma vez que os
efeitos de queda ôhmica são reduzidos em microeletrodos. Entretanto, as medidas
realizadas “in-situ” na fruta foram feitas pela inserção do eletrodo de trabalho e
referência bem próximos (1 mm).
Tabela 5 – Medidas de resistência, E1/2 e IL em diferentes posições do
microeletrodo e do eletrodo de referência inseridos na laranja.
Distância entre os eletrodos
na laranja
/ mm
Resistência
/ kΩ
E1/2*
/ mV
IL*
/ nA
1,0 25.2 (431 ± 9) (29,0 ± 0,9) 10,0 37,2 (438 ± 8) (27,5 ± 0,7)
19,0 48,2 (436 ± 8) (28,7 ± 0,8)
33,2 55,6 (437 ± 9) (27,3 ± 0,8)
57,0 76,2 (436 ± 8) (28,0 ± 0,8)
*As medidas foram realizadas em triplicata
Estudo de estabilidade do sensor foi realizado registrando-se 150 voltamogramas
consecutivos na laranja. O desvio padrão calculado para os valores de corrente limite foi
de 3 %, reiterando assim a ausência de eventuais problemas associados ao
envenenamento da superfície eletródica pela matriz.
A análise dos valores de E1/2 dos registros voltamétricos em diferentes laranjas
poderia fornecer informações sobre o estado de maturação da fruta. Valores de E1/2 de
370 mV e 465 mV foram obtidos para uma laranja madura e não madura,
Resultados e Discussão 81
respectivamente. Com o intuito de comparar as medidas, os experimentos foram
realizados inserindo-se o conjunto de eletrodos na mesma posição em ambas as frutas.
Levando em consideração que os valores de E1/2 são dependentes do pH para o processo
de oxidação do ácido ascórbico, pode utilizar os valores de E1/2 da Figura 32 para
converter os valores de potencial em pH. Dessa forma, os valores de pH para a fruta
madura e não madura foram respectivamente 5,9 e 4,7, indicando que a fruta madura é
menos ácida que a não madura.
Os valores de corrente de estado estacionário registrados em diferentes
concentrações de ácido ascórbico apresentaram uma dependência linear com a
concentração da espécie eletroativa na faixa de 1 a 10 mmol L-1 (I/10-7 A = 0,015 +
0,208 C/mmol L-1, coeficiente de correlação = 0,9995). Essa dependência linear da
corrente com a concentração foi utilizada para monitorar a concentração do ácido
ascórbico nas diferentes regiões da fruta.
A Figura 36 mostra a distribuição de ácido ascórbico em laranjas com diferentes
estágios de maturação. As medidas foram realizadas em triplicata e com
aproximadamente 5 mm de profundidade na laranja. O tipo do corte realizado na laranja
está ilustrado na Figura 36. Experimento similar foi realizado em duas outras laranjas,
mas nesses casos mudou-se o tipo do corte (Figura 37). A análise dos resultados das
Figura 36 e 37, leva às seguintes conclusões:
Resultados e Discussão 82
Figura 36 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor na escala XY representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta não madura e madura, respectivamente.
Resultados e Discussão 83
Figura 37 – Representação bidimensional da corrente limite em voltamogramas registrados a 50 mV s-1 com microeletrodos de platina em função da posição do sensor na escala XZ representada. A e B representam os gráficos bidimensionais para a fruta não madura e madura, respectivamente. 1. Os resultados indicam um decréscimo na concentração de ácido ascórbico da casca
para o centro da fruta. Esta observação vai ao encontro de estudos descritos na literatura
(Paul e Southgate, 1978), os quais demonstram que a concentração de ácido ascórbico
em maçãs e laranjas é maior nas proximidades da casca (Paul e Southgate, 1978). Uma
possível justificativa para explicar esse fenômeno deve-se ao fato de as células mais
jovens, capazes de produzir ácido ascórbico, estarem localizadas próximo da casca
(Bain, 1992). A Figura 37 mostra também que a concentração de ácido ascórbico é
menor próximo do pedúnculo da fruta (parte superior da fruta, Figura 37). Esse
Resultados e Discussão 84
resultado também foi observado em batatas (Han, Kozukue et al., 2004) e laranjas (De
Andrade, Diniz et al., 2002), entretanto, nenhuma justificativa para esse perfil de
concentração foi encontrada.
2. Uma diferença significativa nos valores de concentração de ácido ascórbico é
observada quando se comparam frutas em diferentes estágios de maturação. Na
literatura existe certo desentendimento sobre esse tópico (Davey, Van Montagu et al.,
2000). Entretanto, os resultados das Figura 36 e 37 confirmam uma estreita correlação
entre a quantidade de ácido ascórbico e o estágio de maturação da fruta. Esse resultado
demonstra o potencial deste tipo de sensor para o monitoramento do estágio de
maturação das frutas.
A quantidade de ácido ascórbico em outras frutas também foi avaliada utilizando
o microeletrodo "in-situ" na fruta. Na goiaba, Figura 38, o inverso foi observado com
relação à distribuição de ácido ascórbico no interior da fruta, contudo, até o momento
não foram encontradas informações que pudessem esclarecer esse fenômeno.
Adicionalmente, nota-se que a goiaba apresenta uma maior concentração de ácido
ascórbico que a laranja ao se comparar os valores de corrente entre as duas frutas.
Obviamente estas conclusões preliminares não levam em conta aspectos importantes
como a diferença na difusão do material eletroativo nas duas matrizes. Os resultados
para os valores de corrente limite obtidos em diferentes frutas são reportados na Tabela
6, além dos valores para a concentração de ácido ascórbico. Os maiores valores de
corrente foram encontrados para a goiaba. A partir da curva de calibração apresentada
anteriormente pode-se converter os valores de corrente limite em concentração na
laranja. Para isso, utilizou-se o valor de densidade de uma laranja 11.8ºBrix (Ramos e
Resultados e Discussão 85
Ibarz, 1998) que é 1,044 g cm-3. Esse valor foi necessário para converter os valores de
concentração para mg de ácido ascórbico por 100 g de laranja. Nota-se que os
resultados obtidos estão de acordo com os reportados na literatura (Paul e Southgate,
1978; Haag, Gutierrez et al., 1993).
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0-10
0
10
20
30
40
50
60
70
B
A
I / n
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 38 – Voltamogramas lineares registrados “in-situ” em uma goiaba: no centro (A) e próximo à casca (B). Microeletrodo utilizado: platina e velocidade de varredura de 50 mV s-1.
Resultados e Discussão 86
Tabela 6 – Valores de corrente limite e concentração obtidos com o microeletrodo
de Pt em diferentes frutas.
Fruta Corrente Limite “In-situ”
/ nA
Concentração / mg (100 g)-1
Laranja: 1 2 3 4 5
36,5 31,5 30,2 70,0 22,2
32,3 27,9 26,7 61,9 19,6
Tomate 5,2 - Goiaba 58,5 -
Valores da literatura para concentração de ácido ascórbico em diferentes frutas (Paul e Southgate, 1978; Haag, Gutierrez et al., 1993): Laranja: 30 – 90, tomate: 17 e goiaba: 100 – 430 mg (100 g)-1
Para verificar a exatidão da metodologia, a concentração de ácido ascórbico foi
determinada pelo método proposto e comparada pelo método coulométrico (Paixão,
Matos et al., 2003). Boa concordância entre os resultados obtidos pelo método proposto
(30.9 ± 0.9 mg de ácido ascórbico/ 100 g de suco de laranja) e pelo método
coulométrico (29 ± 1 mg de ácido ascórbico/ 100 g de suco de laranja) foi obtida,
reiterando a possibilidade de utilização do método proposto para o monitoramento de
ácido ascórbico em amostras de laranja.
4.2.2. Quantificação de iodato em sal utilizando matriz de microeletrodos (MEA)
Nosso grupo de pesquisa já havia utilizado microeletrodos para a determinação
de nitrito em amostras de saliva e de águas naturais usando um método indireto baseado
na oxidação química de iodeto em meio ácido e posterior monitoramento eletroquímico
do triiodeto formado (Bertotti e Pletcher, 1997; Mori e Bertotti, 1998). Método
semelhante foi desenvolvido nessa tese para o monitoramento de iodato em amostras de
sal de cozinha. Iodato oxida iodeto, segundo a seguinte reação:
Resultados e Discussão 87
IO3- + 8 I- + 6 H+ 3 I3
- + 3 H2O (9)
A Figura 39 mostra resultados amperométricos da adição de iodato a 200 μL de
solução de iodeto 0,1 mol L-1 na superfície do MEA polarizado a 0 V vs Ag/AgCl.
Durante injeções de soluções de iodato em duas diferentes regiões do MEA, ver Figura
38, nota-se uma mudança no perfil da corrente registrado no experimento. Picos mais
pronunciados são observados quando a injeção é realizada sobre os eletrodos (b),
provavelmente devido a uma maior quantidade de triiodeto disponível na superfície da
matriz de microeletrodos. Contudo, a corrente de estado estacionário é a mesma,
independentemente da posição em que a adição foi feita. Na Figura 39 apresenta-se a
curva analítica obtida, que demonstra a linearidade da resposta do sensor com a
concentração de iodato adicionado.
Resultados e Discussão 88
bb
aa
1 μA
B
A
0,00 0,02 0,04 0,06 0,08 0,10 0,120,0
0,4
0,8
1,2
CIO3- / mmol L-1
- I / μA
Figura 39 – Sinais amperométricos registrados pela injeção de 5 μL de amostra de iodato 1 mmol L-1 à solução de trabalho (200 μL) colocada sobre o MEA (I- 100 mmol L-1 + H2SO4 1 mmol L-1. Alíquotas foram injetadas em duas diferentes regiões: região periférica (a) e na região central (b). No quadro apresenta-se a curva de calibração obtida usando as correntes de estado estacionário.
b
a
Resultados e Discussão 89
O procedimento descrito anteriormente foi utilizado para a quantificação de
iodato em amostras de sal de cozinha, que contêm iodato para combater o
hipotireodismo. Devido à alta quantidade de NaCl na amostra, a curva de calibração foi
preparada na presença de NaCl 3 mol L-1 + KI 0,1 mol L-1. O resultado obtido para uma
amostra de sal comercial foi de (45 ± 3) mg de iodato / kg de sal, o que está de acordo
com a legislação brasileira (40 a 100 mg de iodato / kg de sal).
4.3. Estudo do comportamento eletroquímico de constituintes do DNA
Inicialmente o comportamento eletroquímico da base guanina livre e do
respectivo nucleosídeo e nucleotídeo foram avaliados utilizando eletrodo de carbono
vítreo de tamanho convencional, Figura 40.
0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 1,4
I = 0
I = 0I = 0I = 0 d
cb
a
E / V vs Ag/AgCl
3 μA
Figura 40 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato (d) na presença de guanina 0,2 mmol L-1 + dG 0,5 mmol L-1 (a), dGMP 0,5 mmol L-1 (b), dG 0,5 mmol L-1 (c). Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.
Resultados e Discussão 90
Nota-se a partir da Figura 40a que a base livre apresenta um potencial de
oxidação menos positivo (0,63 V) do que o seu respectivo nucleotídeo (Figura 40b) e
nucleosídeo (Figura 40c) (0,86 V). Essa estabilidade deve-se à adição da ose à base livre
(Dryhurst, 1971; 1972). Entretanto, nota-se que a adição de fosfato à dG para formação
da desoxiguanosina-5'-monofosfato (dGMP) não altera o potencial de pico em relação
ao nucleosídeo. O potencial de pré-tratamento de +1,4V foi utilizado para aumentar o
sinal analítico devido à adsorção dos analitos na superfície do eletrodo, como reportado
na literatura (Brett, Brett et al., 1994; Wang, Cai et al., 1998). O sinal de corrente não
aumenta bruscamente após a adição de guanina (Figura 40a) (a partir de 1,0 V) quando
compara-se com os outros 3 voltamogramas. Tal fato se deve à formação de um filme
proveniente da guanina durante o potencial de pré-tratamento aplicado, já reportado na
literatura (Da Silva e Serrano, 2003).
O DNA apresenta corrente de pico referente ao processo de oxidação da guanina
em potencial semelhante ao do seu respectivo nucleosídeo (De-Los-Santos-Alvarez,
Lobo-Castanon et al., 2004). Dessa forma, os estudos subseqüentes serão realizados
utilizando a dG (desoxiguanosina) como precursor e/ou avaliador do dano no DNA.
Como reportado anteriormente, o ataque do agente mutagênico formado na
peroxidação lipídica ocasiona a adição de dois carbonos no anel da base nitrogenada
(guanina) da dG, ver Figura 41. Esse tipo de ataque pode ser simulado a partir da
incubação da dG com cloroacetaldeído. Assim, avaliou-se o progresso da degradação da
dG com cloroacetaldeído durante o período de 19 horas, Figura 41.
Resultados e Discussão 91
Cl
O
NOOH
OH
N
NHN
NH2
O
NOOH
OH
N
NN
NH
O
OH2
ClH
+
0,4 0,8 1,2 1,6
d
c
ba
E / V vs Ag/AgCl
4 μA
Figura 41 – Reação do cloroacetaldeído com a dG e voltamogramas de pulso diferencial registrados em tampão fosfato pH = 7,2 (a) contendo dG 0,4 mmol L-1 (b) e dG 0,4 mmol L-1 + cloroacetaldeído 60 mmol L-1 (c). Monitorou-se o progresso da reação após 19 horas (d) de incubação com cloroacetaldeído a 37ºC. Pré-tratamento da superfície do eletrodo em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.
Na Figura 41 pode-se observar que o cloroacetaldeído não é eletroativo na janela
de potencial estudada (comparar curvas b e c), conseqüentemente os compostos
formados durante o período de incubação são provenientes da reação do
cloroacetaldeído com a dG. Após 19 horas de incubação nota-se o desaparecimento do
Resultados e Discussão 92
pico referente ao processo de oxidação da dG sobre a superfície do eletrodo de carbono
vítreo e o aparecimento de um processo faradaico na região de 1,2 V.
Com o intuito de confirmar que o pico em 1,2 V refere-se ao processo de
oxidação do eteno aduto, utilizou-se uma solução padrão de eteno aduto purificada por
HPLC, após o processo de síntese com cloroacetaldeido. A Figura 42 mostra adições
sucessivas de eteno aduto a uma solução de tampão fosfato pH = 7,2.
0,4 0,8 1,2 1,60
4
8
12
16
20
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,00
2
4
6
8
I / μ
A
Ceteno / mmol L-1
Figura 42 – Voltamogramas de pulso diferencial registrados para adições sucessivas de eteno aduto em tampão fosfato pH = 7,2. Pré-tratamento da superfície em +1,4 V por 180 s, antes dos registros voltamétricos. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 50 ms e velocidade de varredura 25 mV s-1. Eletrodo: Carbono vítreo.
A regressão linear da curva de calibração resultou em uma equação da reta cuja
expressão é I/µA = 0,027 + 9,27(C/mmol L-1) e faixa linear até 0,8 mmol L-1. Os limites
de detecção (3σ/S) e quantificação (10σ/S) foram respectivamente 25 e 83 µmol L-1. O
desvio de linearidade pode ser resultante de algum processo de adsorção na superfície
do eletrodo.
Resultados e Discussão 93
Nota-se que a adição de 2 carbonos, para formação do eteno aduto (ver Figura
40), no anel da guanina estabiliza ainda mais a dG, deslocando o potencial de oxidação
da mesma para 1,24 V em relação aos 0,86 V obtidos para a dG. Estes resultados são
concordantes com os obtidos no experimento de incubação da dG com cloroacetaldeido
(Figura 41). Entretanto, estudos sobre a formação de eteno adutos durante a peroxidação
lipídica realizados na literatura (Medeiros, Carvalho et al., 1995; Loureiro, Di Mascio et
al., 2002) mostram a formação de outros compostos, ver esquema 1 e Figura 43. Tal
fato pode inviabilizar a detecção desse tipo de lesão sem algum método de separação
prévia, pois não se sabe se os outros compostos formados são eletroativos nesta faixa de
potencial. Desta forma, uma possível maneira de detectar esse tipo de lesão consiste na
avaliação do sinal da dG, uma vez que este varia com o tempo como mostrado na Figura
41 ou ainda, como reportado na introdução, no caso de dh-DNA, com o monitoramento
do aparecimento dos sítios de guanina na estrutura do DNA.
Resultados e Discussão 94
Figura 43 – Reação paralela que pode ocorrer na formação do etenoaduto na célula.
OH
OH
HO
OCH3+
aduto
1, N2 -eteno - 2' - desoxiguanosina
NOOH
OH
N
NHN
NH2
O
OH
O
NOOH
OH
N
NHN
NH
O R
HOH
O
NOOH
OH
N
NN
NH
O R
NOOH
OH
N
NN
NH
O
OH
OH
NOOH
OH
N
NN
NH
O
CH3
OH
OH
O
NOOH
OH
N
NN
NH
O
CH3
OH2
OH2
O
HR
aduto 2
Resultados e Discussão 95
4.4. Modificação da superfície do eletrodo
Conforme reportado na literatura, o processo eletródico referente à dh-DNA
apresenta sinais faradaicos não muito pronunciados devido à estrutura do DNA.
Necessita-se, portanto, de estratégias para que o sinal seja amplificado. Essa etapa do
tese consistiu na obtenção de uma superfície modificada que apresentasse tais
propriedades eletrocatalíticas. Filmes de metais de transição hexacianoferrato (Koncki,
2002; De Tacconi, Rajeshwar et al., 2003; Ricci e Palleschi, 2005) com a seguinte
composição AhMk[Fe(CN)6]l.mH2O (h,k,l,m = coeficientes estequiométricos, A = metal
alcalino, M = metal de transição) foram testados. Esse tipo de filme vem sendo estudado
por apresentar características interessantes como propriedades eletrocatalíticas,
eletrocrômicas, troca iônica, sensibilidade a íons e fotomagnetismo (Abbaspour e
Mehrgardi, 2004). Entretanto, o estudo das propriedades eletrocatalíticas para o
monitoramento de bases nucleicas, nucleotídeos e nucleosídeos ainda é pouco
observado na literatura (Abbaspour e Mehrgardi, 2004).
Com o intuito de verificar as propriedades eletrocatalíticas de alguns filmes de
metal hexacianoferrato, diferentes tipos de filmes foram depositados em eletrodos de
carbono vítreo e avaliados frente ao processo de oxidação anódica da dG. Foram estes
cobalto, índio e rutênio hexacianoferrato, respectivamente, CoHCF, InHCF e RuHCF.
Inicialmente estudou-se o filme de CoHCF. O filme foi eletrodepositado
utilizando solução contendo CoCl2 e K3Fe(CN)6 em meio contendo 0,5 mol L-1 de
NaCl. A Figura 44 representa os voltamogramas cíclicos registrados durante a formação
do filme de CoHCF.
Resultados e Discussão 96
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-60
-30
0
30
60
90
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 44 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com CoHCF em solução contendo K3Fe(CN)6 1,0 mmol L-1 + CoCl2 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 15.
Nota-se que a cada ciclo de potencial o sinal de corrente aumenta, indicando a
formação de um filme depositado na superfície do eletrodo. O processo de formação do
filme em eletrólito contendo Na+ pode ser explicado pelas equações abaixo (Abbaspour
e Mehrgardi, 2004):
FeIII(CN)63- + e- FeII(CN)6
4- (10)
Co2+ + FeII(CN)64- + 2Na+ → Na2CoII[FeII(CN)6] (11)
Após o processo de modificação da superfície do eletrodo, a verificação da
estabilidade do filme foi efetuada em eletrólito suporte por mais 15 ciclos, Figura 45.
Resultados e Discussão 97
-0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-60
-30
0
30
60
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 45 – Verificação da estabilidade do filme de CoHCF em NaCl 0,5 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.
O voltamograma cíclico exibe um pico referente a um processo reversível, com
potencial formal (Eº’ = |Ep,a + Ep,c|/2) igual a 0,44 V, que pode ser atribuído à
transformação entre o Fe(II) e Fe(III) no filme de CoHCF (Gao, Wang et al., 1991; Gao,
Bobacka et al., 1993), ou melhor Na2Co(II)Fe(II)(CN)6/Na2Co(II)Fe(III)(CN)6.
Nota-se uma queda significativa do sinal de corrente quando investigada a
estabilidade do eletrodo modificado, comparado-se o primeiro e o último ciclo dos
experimentos voltamétricos (25%). Cataldi e colaboradores (Cataldi, De Benedetto et
al., 1999) reportam essa falta de estabilidade de filmes de CoHCF e demonstram que
problemas de repetibilidade do sinais analíticos foram encontrados utilizando esse tipo
de modificação da superfície eletródica.
Outro tipo de modificação realizada foi utilizando In3+ como metal de transição
para formação do filme de metal hexacianoferrato (MHCF), Figuras 46 e 47,
respectivamente, modificação e verificação da estabilidade.
Resultados e Discussão 98
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-15
0
15
30
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 46 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com InHCF em solução contendo InCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 25.
O processo de formação do filme de InHCF em eletrólito contendo Na+ pode ser
explicado pelas equações abaixo:
FeIII(CN)63- + e- FeII(CN)6
4- (12)
In3+ + FeII(CN)64- + Na+ → NaInIII[FeII(CN)6] (13)
Resultados e Discussão 99
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0
-15
0
15
30
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 47 – Verificação da estabilidade do filme de InHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,01 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.
O voltamograma cíclico exibe um pico referente a um processo reversível, com
potencial formal igual a 0,85 V, devido ao par redox Fe(II)/Fe(III) confinado no filme
de InHCF (Cataldi, De Benedetto et al., 1998).
A estabilidade do filme foi estudada e pode ser observada na Figura 47. Nota-se
uma queda menos significativa (8 %) de sinal de corrente (comparando o primeiro e
últimos ciclos) quando compara-se com os filmes de CoHCF.
Filmes de RuHCF também foram eletrodepositados na superfície do carbono
vítreo, Figura 48. A Figura 49 representa a avaliação da estabilidade do filme.
Resultados e Discussão 100
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
-120
-80
-40
0
40
80
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 48 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação da superfície de carbono vítreo com RuHCF em solução contendo RuCl3 1 mmol L-
1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. Número de ciclos: 60.
O processo de formação do filme de RuHCF é um pouco diferente dos anteriores
e foi proposto por Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) como sendo:
Ru3+ Ru4+ + e- (14)
Ru4+ + 4OH- → RuIVO2 + 2H2O (15)
RuIVO2 + FeIII(CN)63- + 3H+ → RuIVOH/FeIII(CN)6
3- + H2O (16)
FeIII(CN)63- + e- FeII(CN)6
4- (17)
Ru3+ + FeII(CN)64- + Na+ → NaRuIII[FeII(CN)6] (18)
Resultados e Discussão 101
0,0 0,6 1,2
-120
-80
-40
0
40
80
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 49 – Verificação da estabilidade do filme de RuHCF em NaCl 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Área do eletrodo: 0,0707 cm2.
Quatro pares redox podem ser observados no voltamograma, Figura 49, com
potenciais formais de -0,03, 0,83, 0,93 e 1,13 V. Esses processos são atribuídos na
literatura (Chen, Lu et al., 2005) aos seguintes pares redox [Ru(II)-O/Fe(II)-CN/Ru(III)-
O/Fe(II)-CN], [Ru(III)-NC-Fe(II)-CN/ Ru(III)-NC-Fe(III)-CN], [Ru(III)-O/Fe(II)-
CN/Ru(III)-O/Fe(III)-CN] e [Ru(III)-O/Fe(II)-CN/Ru(IV)-O/Fe(II)-CN] (Chen, Lu et
al., 2005).
Dessa forma podem ser propostas as seguintes reações eletródicas do filme de
RuHCF em eletrólito contendo Na+:
Na4RuIIO[FeII(CN)6] Na3RuIIIO[FeII(CN)6] + Na+ + e- (19)
Na2RuIII[FeII(CN)6] NaRuIII[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (20)
Na3RuIIIO[FeII(CN)6] Na2RuIII[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (21)
Resultados e Discussão 102
Na2RuIII[FeIII(CN)6] NaRuIV[FeIII(CN)6] + Na+ + e- (22)
A estabilidade do filme foi estudada e encontrou-se um valor menor do que 8 %,
valor obtido para eletrodos modificados com filmes de InHCF. Esse aumento de
estabilidade foi reportado por Cataldi e colaboradores após a incorporação de Ru em
filmes de CoHCF e InHCF e foi atribuído à inclusão de espécie Ru-O- na estrutura dos
filmes, conduzindo à formação de compostos binucleares via ligações de oxigênio
(Cataldi e De Benedetto, 1998; Cataldi, De Benedetto et al., 1999).
A Figura 50 mostra os sinais analíticos obtidos na presença e ausência de dG
para cada um dos eletrodos modificados. Todos os filmes foram preparados sob as
mesmas condições de ciclagem e área do eletrodo de carbono vítreo.
Figura 50 – Voltamogramas cíclicos registrados em carbono vítreo (A), e eletrodos contendo filmes de CoHCF (B), RuHCF (C) e InHCF (D) na presença (−−−) e ausência (- - -) de 1 mmol L-1 de dG. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: ver respectiva modificação para cada eletrodo. Modificação realizada utilizando 15 ciclos.
Resultados e Discussão 103
Comparando-se os diferentes tipos de filmes estudados, nota-se que somente o
filme de RuHCF apresenta propriedades eletrocatalíticas para o processo de oxidação da
dG, demonstrando assim a necessidade da existência do rutênio, na estrutura do filme.
Além disso, pode ser observado um aumento significativo do sinal de corrente na
presença de dG, quando comparado com o sinal obtido na superfície limpa do eletrodo
de carbono vítreo. Dessa forma, elegeu-se o filme de RuHCF para os futuros estudos
sobre a dG.
Vale salientar que a utilização desse filme em métodos analíticos foi pouco
explorada e o primeiro trabalho reportando aplicação analítica e procedimento de
fabricação do filme é de 2003 (Shaidarova, Ziganshina et al., 2003). Neste trabalho os
autores reportam metodologia analítica para a quantificação de cisteína, metionina e
cistina. Além disso, somente mais recentemente esse tipo de filme foi estudado (Chen,
Lu et al., 2005) e o comportamento de algumas espécies eletroativas foi reportado
(dopamina, epinefrina, norepinefrina, ácido ascórbico, etanol e isopropanol). Dessa
forma, o estudo do processo de oxidação da dG sobre superfícies recobertas com filmes
de RuHCF torna-se bastante atraente e promissor.
4.5. Estudo das propriedades eletroquímicas do filme de RuHCF
Inicialmente estudos de microscopia e espectrometria de energia dispersiva de
raio-X foram realizados para verificar o morfologia e composição do filme,
respectivamente, Figura 51.
Resultados e Discussão 104
Figure 51 – Imagens de microscopia eletrônica de varredura da superfície do carbono vítreo (A) e modificada com o filme de RuHCF. Espectros utilizando espectroscopia de difração de raio-X para uma superfície modificada com filmes de RuHCF (Γ = 7,80 x 10-9 mol cm-2)(- - -) e FeHCF (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2)(⎯).
Comparando-se os espectros de difração de raio-X, nota-se no filme de RuHCF a
presença de um pico de oxigênio que não é observado no filme de FeHCF. Dessa forma,
pode-se dizer que o filme de RuHCF apresenta oxigênio em sua composição. Com isso,
o filme de RuHCF passou a ser nomeado como óxido de rutênio(III) hexacianoferrato
(RuOHCF). Cataldi e colocaboradores (Cataldi e De Benedetto, 1998; Cataldi, De
Benedetto et al., 1999) demonstraram que filmes de CoHCF com Ru incorporado
apresentam uma maior estabilidade devido à formação de ligações Ru-O-Fe no filme,
corroborando assim os resultados aqui apresentados.
O efeito da velocidade de varredura no comportamento eletroquímico do filme
de RuOHCF foi estudado conforme mostra-se na Figura 52.
Energia / keV
Resultados e Discussão 105
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
-80
-60
-40
-20
0
20
40
60
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
0,00 0,05 0,100
20
40
60
I / μ
A
v / V s-1
Figura 52 – Voltamogramas cíclicos do eletrodo modificado com filme de RuOHCF em diferentes velocidades de varredura em eletrólito suporte 0,5 mol L-1 NaNO3 + 0,01 mol L-1 HCl. Área do eletrodo: 0,0707 cm2. O valor do potencial utilizado para obtenção do gráfico de Ip contra v foi 0,93 V.
A diferença entre os potenciais de pico para todos os quatro processos nas
diferentes velocidades de varredura foi da ordem 11 mV a 50 mV. A Figura 52 mostra
uma relação linear entre a corrente de pico (medida a 0,93 V) e a velocidade de
varredura, ao contrário do que é esperado quando o processo é controlado por difusão
da espécie eletroativa em solução. Esse tipo de comportamento é consistente com o de
eletrodos modificados que apresentam processo redox reversível, indicando assim que a
corrente de pico depende da quantidade de material adsorvido na superfície do eletrodo.
A relação entre a corrente de pico e a velocidade de varredura pode ser expressa pela
seguinte equação (Chen, Lu et al., 2005):
Ip = n2F2vaΓ/4RT (23),
Resultados e Discussão 106
onde Γ, v, a e Ip representam o excesso superficial, a velocidade de varredura, área do
eletrodo e corrente de pico, respectivamente. Estes estudos voltamétricos em diferentes
velocidade de varredura mostraram uma separação entre os picos do par Ru(II)/Ru(III)
próxima de zero, o que indica rápida propagação de carga. Estudos
cronoamperométricos em eletrólito suporte foram realizados para sustentar os resultados
dos estudos voltamétricos. A Figura 53 mostra a relação entre corrente e t-1/2 para filmes
de diferentes espessuras.
Figura 53 – Estudos cronoamperométricos para o eletrodo modificado com RuOHCF em diferentes valores de Γ: 1,81 (a), 4,47 (b) e 7,80 mol cm-2 (c). Degrau de potencial de 0,0 a 1,2 V em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. A linha tracejada corresponde à regressão linear dos dados coletados na região de tempos curtos.
Para tempos de experimento muito curtos o transporte de carga é proporcional a
(Dctt)1/2 de acordo com o modelo descrito pela equação de Cottrell, conforme
demonstra-se pelo gráfico de I versus t-1/2 na Figura 53. Entretanto, para tempos longos
ocorre um desvio da linearidade provavelmente porque a espessura da camada de
Resultados e Discussão 107
difusão relativa à propagação de elétrons torna-se comparável à do filme, observando-se
um comportamento difusional similar ao de células delgadas (do inglês, “thin-layer
cells”). Para filmes com um excesso superficial de 1,81, 4,47 e 7,80 mol cm-2
encontraram-se valores de Dct que variaram entre 2,7 x 10-11 e 1,9 x 10-11 cm2 s-1,
respectivamente (Tabela 7).
Tabela 7 – Valores de Dct1/2, b0 e Dct para diferentes valores de Γ e L (Espessura,
medida por elipsometria).
Γ x 109
/ mol cm-2
Espessura x
106
/ cm
bo x 103
/ mol cm-3
Dct1/2bo x 109
/ mol cm-2 s-1/2
Dct x 1011
/ cm2 s-1
1,81 3,95 0,458 2,37 2,69
4,47 5,99 0,746 3,89 2,72
7,80 7,17 1,09 4,73 1,89
Equação de Cottrell: 2/12/1
2/10
tDnFAbI ct
t π=
Esse pequeno decréscimo nos valores de Dct com a espessura pode ser explicado
pela dificuldade de compensação de carga pela difusão do contra-íon em filmes mais
espessos. Entretanto, esses resultados demonstram uma clara evidência de que não há
um limitação da etapa cinética devido ao transporte de carga no filme de RuOHCF. De
maneira a obter um resultado numérico que pudesse confirmar esse resultado, utilizou-
se a espessura do filme (calculada por experimentos elipsométricos) e os valores de Dct
da Tabela 7. De posse desses valores e utilizando a equação 24, a qual representa o
tempo para que os centros de Ru(III) incorporados no filme possam ser completamente
oxidados (Hogan e Forster, 1999),
Resultados e Discussão 108
ctDLtπ
2
= (24)
pode-se calcular para, por exemplo, o filme preparado com o excesso superficial de 1,81
x 10-9 mol cm-2, o tempo de 185 ms, demonstrando que o transporte de carga no filme
de RuOHCF é rápido.
4.6. Estudo da Oxidação eletrocatalítica da dG na superfície do eletrodo
modificado de RuOHCF.
Para investigar com mais profundidade o processo de oxidação eletrocatalítica
da dG na superfície do eletrodo modificado de RuOHCF utilizou-se voltametria com
eletrodo rotativo variando-se a velocidade de rotação do eletrodo e a espessura do filme.
A quantidade de material na superfície eletródica foi calculada utilizando a lei de
faraday (Γ = Q/nFa), onde Q representa a carga sobre o registro voltamétrico, C/mol, Γ
o excesso superficial, mol cm2, n o número de elétrons, F a constante de Faraday e a,
área do eletrodo, 0,9898 cm2. As Figura de 54 a 59 representam os estudos realizados
utilizando o eletrodo de rotativo de disco, variando-se a velocidade de rotação e
espessura do filme.
Resultados e Discussão 109
Figura 54 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 8,12 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.
Resultados e Discussão 110
Figura 55 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 9,56 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.
Resultados e Discussão 111
Figura 56 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 10,2 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.
Resultados e Discussão 112
Figura 57 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 11,9 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.
Resultados e Discussão 113
Figura 58 – Voltamogramas hidrodinâmicos em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1, utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF (Γ = 16,8 x 10-10 mol cm2) a diferentes velocidades de rotação: 100 (A), 400 (B), 900 (C), 1600 (D) e 2500 (E). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. O quadro inserido na figura representa o gráfico de Koutecký-Levich para correntes medidas em diferentes potenciais, obtidos a partir do registro voltamétrico em diferentes potenciais: 1,15, 1,18, 1,20 e 1,25 V.
Resultados e Discussão 114
0 4 8 12 160,0
0,2
0,4
0,6
I / m
A
ω1/2 / (rad s-1)1/2
Figura 59 – Gráfico de IL vs ω1/2 em solução contendo dG 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo modificado com RuOHCF a diferentes velocidades de rotação utilizando diferentes valores de excesso superficial: 8,12 x 10-10, 9,55 x 10-10, 10,3 x 10-10, 11,9 x 10-10, 16,8 x 10-10 mol cm2 . Velocidade de varredura: 20 mV s-1.
Nota-se que com o aumento da velocidade de rotação e da espessura do filme
(Figura 59), o valor de corrente limite para o processo de oxidação da dG na superfície
do eletrodo aumenta. Esse resultado indica que problemas referentes à difusão de
elétrons no filme e do substrato no filme e em solução não são as etapas determinantes
do processo eletródico. A altas velocidades de rotação nota-se um desvio da linearidade
nas diferentes superfícies modificadas, indicando a existência de um problema cinético
acoplado ao processo de transferência eletrônica. Essa etapa determinante do processo
eletródico pode estar relacionada com a reação entre os sítios catalíticos do filme e o
substrato.
Resultados e Discussão 115
A equação de Koutecký-Levich (Bard e Faulkner, 2000) correlaciona a
contribuição dos processos catalítico e difusional na corrente total do processo de
eletrodo, equação 25.
2/16/13/2lim 62,0
1'
11ων ssME cnFaDcnFakI −+= (25)
onde k’ME é constante de velocidade do processo eletroquímico, ((mol L-1)-1 s-1), cs a
concentração do substrato no âmago da solução, mol cm-2 e 0,62nFaD2/3ν-1/6csω1/2 é
dado pela equação de Levich (Bard e Faulkner, 2000). O fato de para todas as
espessuras do filme o gráfico de Koutecký-Levich interceptar o eixo y em um valor
positivo indica que o fator cinético está associado com a reação do material imobilizado
com o substrato. Outra informação que pode ser retirada dos gráficos de Koutecký-
Levich é o fato de a diferentes potenciais dos registros voltamétricos serem obtidas retas
paralelas, indicando que a reação é de primeira ordem para a dG (Pavez, Paez et al.,
2005).
Considerando a teoria de Albery e Hillman (Albery e Hillman, 1984; Ciszewski
e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al., 2002), existem 10 casos possíveis para
descrever o processo de mediação em eletrodos modificados, Tabela 8 e esquema 4.
Dessa forma, para investigar como os resultados se adequam a um determinado modelo
é necessário avaliar a ordem (x) do excesso superfícial em relação ao k’ME (k’ME = Γx).
Utilizando os valores de 1/ IL em ω-1/2 = 0, obtidos nos gráficos de Koutecky-Levich e a
equação de Koutecky-Levich representada na equação 25, é possível obter os valores de
k’ME. Com o intuito de investigar o mecanismo do processo eletródico construiu-se um
gráfico de log k’ME em função do excesso superficial, Figura 60.
Resultados e Discussão 116
Tabela 8 – Equações que definem a constante de velocidade de processos
heterogêneos para eletrodos modificados, k’ME e ordem de k’ME contra L (ou Γ) e
concentração (Albery e Hillman, 1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas,
Pereira et al., 2002).
Caso Expressão para k’ME Ordem de k’ME contra L (ou Γ)
Ordem de k’ME contra cs
Ets LDSPκ -1 0
Ek’E Ek 'κ 0 0
LEts LDSPκ -1 0
LEk
s
cto
ckDbκ
0 -1/2
LRZtets LD
LcbD SP
s
oct κ+ -1 -1
LSte s
oct
LcbD -1 -1
LSk SPoDkbκ 0 0
Ste s
oct
LcbD -1 -1
Sk’ obk ' 0 0
Lk Lkboκ 1 0
As notações definem o local onde a reação ocorre: L, no filme; LE, próximo da interface eletrodo|filme; LS, próximo da interface filme|solução; LRZ, em uma região intermediária do filme; S, na superfície do filme. Os termos em itálico k, k´ e k´E indicam, respectivamente, uma dependência cinética da reação dentro do filme, reação na interface filme|solução, reação na superfície do eletrodo. Os termos subscritos te e ts indicam uma limitação do transporte de carga (ou elétrons) e do substrato, respectivamente. Mais informações ver esquema 4.
Resultados e Discussão 117
Esquema 4. – Modelo e notações para eletrodos modificados. A e B representam
pares redox presentes no filme e Y o analito em solução, que é convertido para Z
após processo eletródico ou processo eletrocatalítico.
-9,05 -9,00 -8,95 -8,90 -8,85 -8,80 -8,75-2,55
-2,50
-2,45
-2,40
-2,35
-2,30
log
(k' M
E / c
m s
-1)
log (Γ / mol cm2)
Figura 60 – Dependência de log k’ME em função do log Γ para processo de oxidação da dG em filmes de RuOHCF. Condições experimentais: 1mmol L-1 de dG, eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Excesso superficial variando de 9,55 a 16,8 x 10-10 mol cm-2.
X
Z
X(aq) X
X(aqB +
Z(aq) A +
B
A
X(aq) B +
Z(aq) A +
k k´
Dct
k´E
Filme Solução Eletrodo
DSP e-
e-
Resultados e Discussão 118
O coeficiente angular obtido a partir de gráfico foi de 0,930. Este valor é muito
próximo do valor unitário e condiz com o caso Lk, Tabela 8. De acordo com esse
modelo, a reação ocorre ao longo de todo o filme, indicando uma máxima participação
dos centros catalíticos no processo de mediação e uma livre difusão do substrato no
filme. Conhecido o mecanismo do processo envolvendo a oxidação da dG, pode-se
calcular o valor da constante cinética do processo eletrocatalítico construindo-se um
gráfico de Ik (nFAκkΓcs, κ é o coeficiente de partição do substrato entre o filme e a
solução, usualmente utiliza-se o valor de κ = 1) em função do excesso superficial,
Figura 61.
0 2 4 6 8 10 12 14 160,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
I k / m
A
Γ / 10-10 mol cm-2
Figura 61 – Dependência dos valores de corrente, do termo cinético, medidos em ω-
1/2 = 0 em função do excesso superficial. Condições experimentais descritas na Figura 58.
Com o coeficiente angular da Figura 59 e o valor de n = 2 elétrons, calculado a
partir do coeficiente angular dos gráficos de Koutecky-Levich (considerando D = 3,3 x
Resultados e Discussão 119
10-6 cm2 s-1 (Langmaier, Samec et al., 2003) e ν = 0,01 cm2 s-1) pode-se então obter o
valor da constante cinética do processo de oxidação da dG no filme de RuOHCF,
calculado como 3,2 x 103 mol-1 L s-1 .
Para confirmar que a difusão do substrato no filme ocorre sem restrições,
substituiu-se o filme de RuOHCF por um filme de FeHCF, que não apresenta
propriedades eletrocatalíticas para o processo de oxidação da dG. A Figura 62 mostra
voltamogramas para o eletrodo modificado com FeHCF e para o eletrodo de carbono
vítreo na presença e ausência de dG.
-0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8 1,2 1,6
B
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 62 – Voltamogramas cíclicos registrados em eletrólito suporte antes (- - -) e após (⎯⎯) adição de dG (concentração final em solução = 2 mmol L-1) utilizando eletrodo de carbono vítreo (A) e eletrodo de carbono vítreo modificado com FeHCF (B) (Γ = 2,21 x 10-8 mol cm-2). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1.
Nota-se que o sinal de corrente obtido no eletrodo limpo para o processo em 1,1
V vs Ag/AgCl é muito próximo do obtido com o eletrodo modificado com FeHCF.
Dessa forma, e considerando que o filme de FeHCF apresenta uma morfologia próxima
Resultados e Discussão 120
ao filme de RuOHCF, pode-se dizer que o substrato difunde livremente no filme de
RuOHCF. Essa informação corrobora os resultados obtidos anteriormente, que indicam
um mecanismo Lk para o processo de mediação do filme de RuOHCF para o processo
de oxidação da dG.
A relação Dctbo/L (3,40 x 10-9 mol cm-2 s-1, para Γ = 1,81 x 10-9 mol cm-2) indica
o fluxo de carga. Esse valor é da mesma ordem de grandeza da relação calculada de
kΓcs (5,80 x 10-9 mol cm-2 s-1, para Γ = 1,81 x 10-9 mol cm-2), que indica o fluxo de
material devido ao processo eletrocatalítico. Caso Dctbo/L << kΓcs, o processo de
mediação ocorre na interface eletrodo|filme. Numa condição oposta, Dctbo/L >> kΓcs, a
reação ocorreria na interface filme|solução. Uma vez que o valor da relação de Dctbo/L é
muito próximo do encontrado pela relação kΓcs, confirma-se mais uma vez que o
processo de mediação ocorre ao longo de todo o filme e utilizando os sítios
eletrocatalíticos da maneira mais eficiente possível.
Levando em consideração que o processo de mediação ocorre ao longo de todo o
filme e considerando que 2 e- estão envolvidos no processo de oxidação da dG a 8-oxo-
desoxiguanosina, pôde-se propor o seguinte mecanismo para o processo de oxidação da
dG, Esquema 5.
Resultados e Discussão 121
NOOH
OH
N
NHN
NH2
OEl
ectro
de
Ru
Ru
III
IV
Filme de RuOHCF
e-
Solução
NOOH
OH
N
NHN
NH2
O
ON
OOH
OH
N
NHNH
NH2
O
ON
OOH
OH
N
NHNH
NH2
O
Perfil de concentração da desoxiguanosina
Con
cent
raçã
o de
deso
xigu
anos
ina
100 %
0 %
Esquema 5.
4.7. Otimização e utilização do eletrodo modificado com RuOHCF para
detecção de dG em fluxo em amostras hidrolisadas de DNA.
A Figura 63 mostra os voltamogramas hidrodinâmicos obtidos em sistema FIA
para injeções de solução de dG polarizando-se o eletrodo de carbono vítreo (▲) e
modificado com RuOHCF (■) em diferentes potenciais. Pode-se observar uma diferença
significativa das correntes comparando-se os sinais obtidos com os 2 eletrodos. A
antecipação do processo de oxidação e o aumento da corrente trabalhando-se com o
eletrodo modificado são atribuídos ao processo eletrocatalítico de oxidação da dG na
superfície modificada, como reportado anteriormente.
Resultados e Discussão 122
0,0 0,4 0,8 1,20
2
4
6
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 63 – Voltamogramas hidrodinâmicos para injeções de solução de dG 252 μmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo (▲) e modificado com filme de RuOHCF (■). Vazão: 0,55 mL min-1, volume de amostra: 60 μL e solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1.
A influência da espessura do filme foi investigada utilizando-se eletrodo rotativo
de disco. Os valores de corrente limite para o processo de oxidação da dG trabalhando-
se com filmes de RuOHCF de diferentes espessuras indicaram uma estreita correlação
entre os valores de corrente e a espessura do filme. Dessa forma, em experimentos
posteriores trabalhou-se com eletrodo modificado contendo 45,6 x 10-10 mol cm-2 de
RuOHCF.
A vazão do eletrólito suporte e o volume de amostra injetado também foram
investigados com o intuito de obter-se uma melhor sensibilidade para o método
analítico, respectivamente, Figuras 64A e 64B.
Resultados e Discussão 123
0 400 800 1200 1600
A fe
dc
b
a
Tempo / s
4 μA
0 400 800 1200
Bed
cb
a
Tempo / s
2 μA
Figura 64 – Influência da vazão (A, 0,26 (a), 0,55 (b), 0,70 (c), 1,1 (d), 1,6 (e) e 2,0 (f) mL min-1) e volume de amostra (B, 50 (a), 100 (b), 150 (c), 200 (d), 250 (e) µL) para repetidas injeções de dG 252 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e em (B) vazão de 0,50 mL min-1. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.
Resultados e Discussão 124
Um aumento do valor de corrente de pico foi obtido com o aumento da vazão até
1,6 mL min-1. A ausência de um aumento contínuo da corrente de pico com a vazão
indica uma limitação cinética associada ao processo de mediação. No que diz respeito
ao volume de amostra, alíquotas que variaram de 50 a 250 μL foram injetadas.
Variações não significativas foram observadas com relação à altura de pico para os
estudos relacionados ao volume da alça de amostragem. Assim sendo, o volume de 100
μL foi escolhido devido a uma pequena melhora na corrente de pico e menor gasto de
solução. Nessas condições experimentais a freqüência analítica encontrada foi de 230
injeções por hora.
A repetibilidade do método foi investigada injetando-se 18 alíquotas de solução
de dG 38,5 μmol L-1, obtendo-se um desvio padrão relativo de 4,0 %, Figura 65.
0 200 400 600 800
2 μA
Tempo / s
Figura 65 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de dG 38,5 μmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 1,6 mL min-1 e volume de amostra: 100 μL. E = 1,1 V.
Resultados e Discussão 125
Nas condições experimentais otimizadas, calibrou-se o sistema utilizando
soluções padrão de dG numa faixa de 3,85 até 252 μmol L-1. A Figura 66 mostra a
ausência de efeito memória no sistema, que pode ser atribuída ao pequeno volume de
amostra e à configuração do sistema wall-jet. O gráfico da corrente de pico em função
da concentração de dG fornece uma reta com a seguinte equação: (I/μA) = 0,06 + 0,05
(C/μmol L-1) com coeficiente de correlação de 0,9999. Os limites de detecção (3σ/S) e
quantificação (10σ/S) foram estimados em 94 e 313 nmol L-1 (ou 9,4 e 31,3 pmol,
levando em consideração o volume de amostra injetado), respectivamente. Essa pequena
quantidade de dG determinada pelo método proposto sugere a possibilidade da
utilização do eletrodo modificado para detecção de dG em tempo real durante processos
biológicos envolvendo danos do DNA em microambientes, como por exemplo, em
células isoladas.
Resultados e Discussão 126
0 400 800 1200 1600 2000
s2s1ab
c
d
e
d
cb
a
Tempo / s
4 μA
0 50 100 150 200 2500
4
8
120 5 10 15 20 25
n / nmol
I / μ
A
CdG / μmol L-1
Figura 66 – Sinais de corrente de pico para injeções de solução de dG com as seguintes concentrações: 3,85 (a), 19,3 (b), 38,5 (c), 96,3 (d) e 252 (e) μmol L-1 e duas amostras de DNA (s1 e s2). O quadro inserido na figura mostra a dependência da corrente de pico medida em função da concentração de dG. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.
A estabilidade do eletrodo modificado com RuOHCF foi analisada medindo-se
em diferentes horas, durante 1 dia, a sensibilidade do método, Figura 67. Entre os
experimentos, o eletrodo foi armazenado em eletrólito suporte à temperatura ambiente.
Resultados e Discussão 127
0 1 2 3 20 250,00
0,02
0,04Se
nsib
ilida
de / μA
μm
ol L
-1
Tempo / h
Figura 67 – Dependência da sensibilidade do eletrodo modificado com o tempo. Velocidade do fluxo: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL, solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V.
Nota-se variação pouco significativa na sensibilidade durante as 3 primeiras
horas de experimento pela análise da Figura 67. Uma diminuição mais significativa foi
observada após 24 horas (15 %), mas este fato não impede o uso do sensor pois um
novo processo de calibração do sistema pode ser efetuado.
Amostras reais de DNA de timo de bezerro obtidas após processo de hidrólise
foram analisadas por FIA e os resultados foram comparados com os obtidos pelo
método padrão (Loureiro, Marques et al., 2002), Figura 68. Os resultados foram
concordantes quando aplicado o método “t-student” com 95 % de confiança,
confirmando a ausência de possíveis espécies interferentes (outros nucleosídeos como
dT, dC e dA).
Resultados e Discussão 128
0 150 300 450 600 7500
150
300
450
600
750
HPL
C / μm
ol L
-1
Amperométrico / μmol L-1
Figura 68 – Comparação dos resultados obtidos pelos métodos proposto e HPLC para análise de dG em 17 amostras de DNA. As linhas tracejadas representam o limite de 95 % de confiança.
A Tabela 9 mostra uma lista de outros métodos descritos na literatura para a
determinação de bases livres, nucleosídeos, nucleotídeos e DNA, assim como as
características analíticas. Nota-se claramente que o limite de detecção do método
proposto é comparável com aqueles reportados nos outros trabalhos. Entretanto, em
muitos destes equipamentos caros ou a necessidade de pré-concentração da dG na
superfície do eletrodo acabam sendo obstáculos quando comparados com o método
proposto. Além disso, alguns métodos apresentados não são susceptíveis para análises
de rotina, devido à dificuldade de acoplamento ao sistema em fluxo. Vale ressaltar ainda
que, como mostrado anteriormente, limites de detecção menores podem ser alcançados
aumentando a quantidade de material imobilizado na superfície do eletrodo.
Resultados e Discussão 129
Tabela 9 – Valores de limite de detecção para determinação de dG na literatura.
Composto Técnicas de separação ou acumulação
Sistema de detecção Limite de detecção reportado
Limite de detecção / nmol L-1
ssDNA (El-Maali e Wang,
2001)
- Eletroquímico -GC/TBRuMCPE
24 ppb -
DNA completamente
hidrolisado (guanina)
(Kafil, Cheng et al., 1986)
HPLC Eletroquímico - GC 0,05 pmol* 2,5
Guanina (Abbaspour e Mehrgardi,
2004)
- Eletroquímico -GC/CoHCF
52 ppb 344
Guanina (Abbaspour, Mehrgardi et
al., 2004)
- Eletroquímico -GC/cobalto(II)
ftalocianina
85 ppb 562
Guanina (Huang, Zhang
et al., 2006)
Acumulação (4 min)
Eletroquímico –Eletrodo de pasta de carbono modificado
com Montmorillonita de sódio
20 nmol L-
1 20
Nucleosídeos (Lee, Jung et al.,
2004)
HPLC/GC MS 0,2 nmol mL-1 (LQ)
200 (LQ)
dGMétodo Proposto - Eletroquímico – GC/RuOHCF
94 nmol L-
1 94
Guanina (Wang, Xiao et
al., 2005)
- Eletroquímico -beta-CD/CNT/E
10 ng mL-1 66
Guanina (Yang, Liu et al., 2005)
- Quimioluminescência 1 x 10-7 g/mL
662
*volume de amostra = 20 μL; ssDNA =DNA fita dupla; TBRuMCPE = tris(2,2´-bipiridil)dicloro-rutênio(II); HPLC =
Cromatografia líquida de alta eficiência; CoHCF = cobalto hexacianoferrato; GC= cromatografia a gás; MS =
espectrometria de massa; LQ = limite de quantificação; beta-CD/CNT/E = eletrodo modificado com beta-ciclodextrin
incorporado em nanotubos de carbono.
Outra vantagem da metodologia proposta é o fato de utilizar-se dG como padrão,
ao invés de DNA o qual é utilizado nos ensaios de fluorescência e em outras
metodologias. Padrões confiáveis de DNA são difíceis de serem obtidos, ao contrário de
Resultados e Discussão 130
padrão de dG. Vantagem adicional do procedimento em FIA diz respeito ao tempo de
análise, muito menor do que o observado no caso dos métodos cromatográficos.
Metodologias que utilizam o DNA desnaturado (fita simples) (El-Maali e Wang, 2001)
são mais rápidas, uma vez que não requerem etapa inicial de tratamento do DNA.
Contudo, a finalidade desses procedimentos consiste exclusivamente na quantificação
de DNA e não na quantificação de dG em uma fita simples, como é o caso da
metodologia proposta. Além disso, a utilização de um procedimento de hidrólise brando
não resulta em danos químicos no DNA. Desta forma, erros analíticos durante estudos
de danos ao DNA (danos extras, não causados pelo agente carcinogênico estudado) são
minimizados.
4.8. Estudo da oxidação eletrocatalítica de ácido ascórbico na superfície do
eletrodo modificado de RuOHCF
Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) reportaram na literatura que o
filme de RuOHCF apresenta propriedade eletrocatalítica para alguns compostos, sendo
um deles o ácido ascórbico em pH = 1,5. A Figura 69 mostra os sinais voltamétricos
obtidos para adições sucessivas de ácido ascórbico utilizando o eletrodo modificado
com RuOHCF em eletrólito suporte (NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1). O sinal
voltamétrico obtido após a última adição de ácido ascórbico foi comparado com o
registro voltamétrico obtido utilizando eletrodo de carbono vítreo não modificado.
Resultados e Discussão 131
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
fe
dcb
a
C
B
A
E / V vs Ag/AgCl
60 μA
Figura 69 – Sexagésimo voltamograma cíclico registrado no processo de modificação do eletrodo com o filme RuOHCF (A). Em (B) estão mostrados o último ciclo do processo de verificação da estabilidade (a) e adições sucessivas de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1(f)). Em (C) está mostrado o registro voltamétrico realizado em uma solução contendo 4,76 mmoL L-1 de ácido ascórbico. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Eletrólito suporte: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Em A está representado o voltamograma cíclico do último ciclo de potencial do
processo da modificação (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2). Nota-se na Figura 69A picos bem
Resultados e Discussão 132
definidos referentes aos pares redox Ru(II)/Ru(III), Fe(II)/Fe(III) do ferricianeto de
potássio em solução, Fe(II)/Fe(III) e Ru(III)Ru(IV). Em B, está representado o último
ciclo do processo de verificação da estabilidade (obtido em eletrólito suporte), curva a,
onde se pode observar a ausência do par Fe(II)/Fe(III) do ferricianeto de potássio em
solução. Após a adição de ácido ascórbico no meio, curva b, nota-se o aparecimento de
um processo faradaico por volta de 378 mV vs Ag/AgCl, devido ao processo de
oxidação do ácido ascórbico. Adições sucessivas de ácido ascórbico resultaram em um
aumento linear da corrente de pico com a concentração. A regressão linear dos valores
de corrente de pico com a concentração resulta em uma reta com a seguinte equação,
(I/μA) = 0,45 + 12 (C/mM), coeficiente de correlação = 0,9998.
Comparando-se os voltamogramas para a última adição de ácido ascórbico para
o eletrodo modificado com RuOHCF e para o eletrodo limpo de carbono vítreo,
respectivamente, Figura 69B (curva f) e Figura 69C, nota-se que no eletrodo
modificado, ocorreu uma antecipação do sinal, de aproximadamente 322 mV vs
Ag/AgCl, indicando assim a ocorrência de um efeito eletrocatalítico para o processo de
oxidação do ácido ascórbico na superfície do eletrodo modificado. Trabalhos na
literatura relatam a possibilidade do par [Fe(CN)6]3-/4- catalisar o processo de oxidação
do ácido ascórbico, demonstrando assim a viabilidade desse mecanismo (Roy, Saha et
al., 2005). Chen e colaboradores (Chen, Lu et al., 2005) relataram que o processo de
oxidação do ácido ascórbico em pH 1,5 utilizando eletrodo de RuOHCF é devido ao par
redox [Ru(III)-NC-Fe(II)]/[Ru(III)-NC-Fe(III)] (Potencial formal: 0,57 V vs Ag/AgCl),
sugerindo que a mediação do processo redox é dada pelo par Fe(II)/(III) presente no
filme.
A aplicação do eletrodo modificado para a detecção de ácido ascórbico em
ambientes celulares requer a operação do sensor em meio com pH próximo de 7. Dessa
Resultados e Discussão 133
forma, pensou-se em realizar a modificação da superfície eletródica em pH = 6,9,
Figura 70.
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
-10
-5
0
5
10
15
20
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 70 – Primeiro (⎯⎯) e sexagésimo (- - -) voltamograma cíclico registrado em tampão fosfato pH = 6,9 contendo RuCl3 1 mmol L-1 + Fe(CN)6
3- 1mmol L-1 usando eletrodo de carbono vítreo. Velocidade de varredura: 100 mV s-1.
A partir da Figura 70 pode-se observar que em meio neutro a deposição do filme
na superfície do eletrodo não ocorre, impossibilitando assim a utilização desse tipo de
eletrodo em meio neutro. Pensou-se então em modificar a superfície eletródica em meio
ácido, verificar a estabilidade do eletrodo também nesse mesmo meio, e depois utilizar
o eletrodo modificado em meio neutro.
A Figura 71 mostra voltamogramas cíclicos registrados para adições sucessivas
de ácido ascórbico em tampão fosfato, pH = 6,9, para o eletrodo modificado em meio
ácido conforme procedimento descrito na parte experimental.
Resultados e Discussão 134
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
0
20
40
60
f
e
d
c
a
bI / μ
A
E / mV vs Ag/AgCl
Figura 71 – Voltamogramas cíclicos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF na ausência (a) e presença de ácido ascórbico (b-f) (concentração final de 0,990 (b), 1,96 (c), 2,91 (d), 3,85 (e) e 4,76 mmol L-1 (f)) e utilizando eletrodo limpo de carbono vítreo em solução contendo 4,76 mol L-1 de ácido ascórbico (- - -). Eletrólito suporte: Tampão fosfato pH = 6,9. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 5,30 x 10-9
mol cm-2.
Nota-se na Figura 71 um deslocamento de 338 mV nos potenciais de pico ao se
comparar os voltamogramos registrados com e sem filme para o processo de oxidação
do ácido ascórbico. As adições sucessivas de ácido ascórbico resultaram em uma reta
com a seguinte equação (I/μA) = 1,0 + 13 (C/mM), coeficiente de correlação = 0,9978.
Vale ressaltar que em ambos os casos, meio ácido e neutro, a sensibilidade do método e
a antecipação do potencial referente à corrente de pico para o eletrodo com e sem
modificação foram semelhantes. Entretanto, em meio neutro a detecção de ácido
ascórbico próximo do potencial de 0 V possibilita o desenvolvimento de uma
metodologia mais imune a interferências oriundas de outras substâncias presentes em
uma amostra real.
Resultados e Discussão 135
Observada a viabilidade de se utilizar o eletrodo de RuOHCF em meio neutro
para a detecção de ácido ascórbico, a próxima etapa envolveu o estudo do mecanismo
de mediação do processo de oxidação do ácido ascórbico sobre a superfície modificada.
Para isso, estudos utilizando eletrodo rotativo de carbono vítreo foram efetuados.
A Figura 72A mostra voltamogramas cíclicos em diferentes velocidades de
rotação utilizando o eletrodo modificado e na Figura 72B são apresentados os valores de
IL em função de w1/2 para diferentes concentrações de ácido ascórbico.
Resultados e Discussão 136
-0,2 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3
0,0
0,1
0,2
0,3
A fedc
b
a
I / m
A
E / V vs Ag/AgCl
0 4 8 12 160,0
0,2
0,4B
I / m
A
ω1/2 / (rad s-1)1/2
Figura 72 – Voltamogramas hidrodinâmicos (A) registrados em tampão fosfato pH = 6,9 (a) e ácido ascórbico (b-f) 1 mmol L-1 usando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 2,79 x 10-9 mol cm-2) em diferentes velocidades de rotação: 0 (a), 100 (b), 400 (c), 900 (d), 1600 (e) e 2500 (f). Em B estão representados os gráficos de Levich para diferentes valores de concentração de ácido ascórbico em solução tampão pH 6,9 : 1 (-), 2 (-), 3 (-), 4 (-) e 5 mmol L-1(-). Velocidade de varredura: 20 mV s-1. A altas velocidades de rotação nota-se um desvio da linearidade para todas as
concentração de ácido ascórbico, Figura 72B, indicando a existência de um problema
Resultados e Discussão 137
cinético ou de transporte do substrato, no filme, acoplado ao processo de transferência
eletrônica. Para descobrir qual etapa é a determinante da velocidade do processo
eletródico, novamente foi utilizada a teoria de Albery e Hillman (Albery e Hillman,
1984; Ciszewski e Milczarek, 1999; Vilas-Boas, Pereira et al., 2002).
A Figura 73 mostra os gráficos de Koutecký-Levich para os experimentos
realizados em diferentes concentrações de ácido ascórbico, Figura 72B.
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,350
4000
8000
12000
16000
1 / (
I / A
)
ω-1/2 / (rad s-1)-1/2
Figura 73 – Gráficos de Koutecký-Levich para os valores de corrente registrados na Figura 16B. Mesmas condições experimentais da Figura 72.
A partir dos valores do intercepto em w-1/2 = 0, n = 2 elétrons para o processo de
oxidação do ácido ascórbico (Rueda, Aldaz et al., 1978) e utilizando-se a equação 25, é
possível obter os valores de k’ME. De posse dos valores de k’ME, construiu-se um gráfico
de log k’ME em função de log cs para obter-se a ordem da concentração (cx) em relação
ao k’ME, Figura 74.
Resultados e Discussão 138
-3,0 -2,8 -2,6 -2,4 -2,2
-3,25
-3,20
-3,15
-3,10
log
(k' M
E / c
m s
-1)
log (cs / mol L-1)
Figura 74 – Dependência do log k’ME contra log cs. Condições experimentais da Figura 72.
Na Figura 74 duas regiões distintas podem ser observadas. Na primeira (até 2
mmol L-1 de ácido ascórbico) os valores de k’ME praticamente independem da
concentração de ácido ascórbico (coeficiente angular = -0,02413), enquanto na segunda
parte (acima de 2 mmol L-1 de ácido ascórbico), os valores de k’ME dependem da
concentração. O coeficiente angular encontrado na segunda região foi de -0,3943. De
posse desses valores e utilizando a tabela 8 pôde-se descobrir a expressão para k’ME e o
mecanismo de mediação do processo de oxidação do ácido ascórbico sobre a superfície
modificada de RuOHCF em meio neutro. O valor obtido na segunda parte é muito
próximo da ordem (cx) esperada de -1/2, que segundo a teoria de Albery and Hillman
tem relação com um mecanismo do tipo LEk (ver Tabela 8).
No mecanismo LEk a reação ocorre numa região finita na interface
eletrodo|filme. Nesse tipo de mecanismo a espécie eletroativa difunde-se facilmente
Resultados e Discussão 139
dentro do filme e, portanto, problemas de difusão do material dentro do filme não
consistem em uma das etapas limitantes do processo global. Em baixas concentrações
de ácido ascórbico, k'ME independe dos valores de concentração como mostrado
anteriormente, Figura 74. Com isso, sobram somente 6 casos possíveis para serem
considerados. Esse casos onde k'ME independe da concentração da espécie eletroativa
são: LSk, Lk, Ek´E, Sk´, LEts e Ets. O caso Ek´E foi descartado pois ele está associado a
processo que ocorre diretamente na superfície do eletrodo (ver esquema 4 e Tabela 8)
fato não observado na região de potencial estudada. Para decidir qual dos casos 5
restantes explicam os dados experimentais para o mecanismo de mediação do processo
de oxidação do ácido ascórbico em concentrações menores que 2 mmol L-1, novos
estudos foram realizados. Filmes com diferentes espessuras (2,61 – 24,7 mol cm-2)
foram preparados e, para cada eletrodo modificado com um determinado excesso
superficial, variou-se a velocidade de rotação em uma solução contendo tampão fosfato
pH = 6,9 e ácido ascórbico 1 mmol L-1. Após essa etapa, curvas de Koutecky-Levich
foram construídas e os valores de k'ME foram obtidos como mostrado anteriormente. A
partir dos valores de k'ME e espessura, construiu-se o gráfico de log k'ME em função de
log Γ, Figura 75.
Resultados e Discussão 140
-9,6 -9,4 -9,2 -9,0 -8,8 -8,6-4,0
-3,6
-3,2
-2,8
-2,4
-2,0
log
(k' M
E / c
m s
-1)
log (Γ/ mol cm2)
Figura 75 – Dependência do log k’ME contra log Γ. Os valores de excesso superficial utilizado nos experimentos foram: 2,61, 7,82, 14,7 e 24,7 x 10-10 mol cm-2, demais condições vide Figura 16. Concentração de ácido ascórbico: 1 mmol L-1.
Em baixas concentrações de ácido ascórbico o coeficiente angular da curva
construída na Figura 75 foi de -0,07362, praticamente 0. Dentre os mecanismos
apresentados na Tabela 8, os únicos onde k’ME independe da concentração do substrato
e da espessura do filme são os casos LSk e Sk´, segundo os quais a reação ocorre em
uma zona finita na interface filme|solução e na superfície do filme, respectivamente.
Dessa forma, para baixas concentrações de substrato a transferência de carga excede o
fluxo de substrato ao longo do filme e, com isso, a reação ocorre em região finita da
interface filme|solução ou na superfície do filme. A principio, a distinção entre os dois
possíveis casos poderia ser feita realizando-se experimentos envolvendo a variação de
k´ME em função de b0. Entretanto, para esse tipo de filme b0 depende simultaneamente
de L e Γ e, experimentalmente, não foi possível variar esses dois parâmetros
independentemente.
Resultados e Discussão 141
Supondo que o caso LSk é o que mais se aproxima do mecanismo de mediação
do processo de oxidação do ácido ascórbico, pode-se calcular o valor da constante
cinética do processo de mediação (k) a partir da equação de k’ME descrita, Tabela 8:
SPoME Dkbk κ=' (26)
O valor de k obtido para uma espessura de 2,47 x 10-9 mol cm-2 (b0 = 0,50 x 10-3
mol cm-3) foi de 18 mol-1 L1 s-1. Para isso, considerou-se o valor de 6,8 x 10-8 cm2 s-1
para o coeficiente de difusão do ácido ascórbico no filme. Esse valor foi o encontrado
na literatura para o coeficiente de difusão do ácido ascórbico em um filme de PDMA
(Roy, Saha et al., 2005). Para o cálculo da concentração de sítios eletroativos foi
utilizada a tabela 7 e o valor do excesso superficial acima reportado.
A partir do valor de k e demais valores obtidos a partir da tabela 7, obtiveram-se
os valores das relações Dctbo/L e kΓcs, respectivamente 3,4 x 10-9 e 3,25 x 10-11 mol
cm-2 s-1 (Γ = 1,81 x 10-9). Nota-se que o valor da relação Dctbo/L >> kΓcs, indicando
assim que a reação ocorre próximo ou na interface filme|solução, em concordância com
as premissas associadas aos casos LSk e Sk´. Considerando os dados até aqui obtidos,
um possível mecanismo para o processo eletrocatalítico de oxidação do ácido ascórbico
utilizando o eletrodo de RuOHCF está ilustrado no esquema 6, onde o mediador
consiste em composto contendo Ru(III) como átomo central.
Resultados e Discussão 142
Elet
rodo
Ru
Ru
II
III
Filme RuOHCF
e-
Solução
Perfil de concentração do ascorbato
conc
entra
ção
de
asco
rbat
o
100 %
0 %
O
OHO-
OH O
OHO
OHO-
OH O
OH
O
OO
OH O
OH O
OO
OH O
OH
Esquema 6.
4.9. Otimização dos parâmetros analíticos em fluxo para detecção de ácido
ascórbico em meio neutro utilizando o eletrodo modificado com
RuOHCF
Compreendido o mecanismo do processo eletrocatalítico, estudos foram
efetuados com o intuito de acoplar o eletrodo modificado a sistema de análise por
injeção em fluxo. Inicialmente investigou-se a influência da espessura do filme no sinal
de corrente do ácido ascórbico. Como era de se esperar, devido ao processo de
mediação ocorrer numa região finita na interface filme|solução, ou na superfície do
filme, a espessura do filme pouco altera o sinal de corrente do processo de oxidação do
ácido ascórbico. Entretanto, quando avaliada a faixa linear do sensor, observou-se que
para uma faixa de 1 a 8 mmol L-1 somente o filme de 60 ciclos apresentou uma
linearidade em toda a faixa estudada, possivelmente devido a um melhor recobrimento
da superfície eletródica. Dessa forma, os eletrodos modificados foram preparados
trabalhando-se com 60 ciclos de potencial.
Resultados e Discussão 143
A influência do potencial aplicado na corrente do processo de oxidação do ácido
ascórbico na superfície modificada também foi avaliada, Figura 76.
-0,2 0,0 0,2 0,40
3
6
9
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 76 – Voltamograma hidrodinâmico para injeções de solução de ácido ascórbico 1 mmol L-1 em eletrodo de carbono vítreo modificado com filme de RuOHCF. Vazão: 1,6 mL min-1, volume de amostra: 100 μL e solução carregadora: Tampão fosfato pH 6,9. Γ = 5,22 x 10-9
mol cm-2. A partir dos valores de corrente de pico obtidas injetando-se solução de ácido
ascórbico no sistema em fluxo, Figura 76, pode-se notar que o processo de oxidação do
ácido ascórbico na superfície modificada inicia-se a 0 V vs Ag/AgCl. Vale salientar que
estudos anteriores já demonstraram que o aparecimento do sinal de corrente do processo
de oxidação do ácido ascórbico no eletrodo de carbono vítreo só ocorre em potenciais
mais positivos, aproximadamente 300 mV. Essa antecipação do processo de oxidação
do ácido ascórbico deve-se ao processo eletrocatalítico no filme de RuOHCF, apontado
anteriormente. Objetivando obter uma melhor sensibilidade, os estudos a seguir foram
realizados em +0,4 V.
Resultados e Discussão 144
Estudos para investigar a influência da vazão e do volume de amostra na
corrente de pico do processo de oxidação do ácido ascórbico também foram realizados e
os resultados estão mostrados na Figura 77.
Resultados e Discussão 145
0 200 400 600 800
fed
cb
a
Tempo / s
4 μA
0 100 200 300 400
dcba
Tempo / s
4 μA
Figura 77 – Influência da vazão (A) e volume de amostra (B) para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Em (A) utilizou-se alça de 100 μL e os seguintes valores de vazão: 0,26 (a), 0,70 (b), 1,1 (c), 1,6 (d), 2,0 (e), 2,5 (f), 2,6 (g) mL min-1. Em (B) a vazão utilizada foi 2,0 mL min-1 e as alças: 100 (a), 150 (b), 200 (c) e 250 (d) μL. Variou-se a solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. E = 1,1 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.
A
B
Resultados e Discussão 146
Um aumento significativo do valor de corrente de pico foi obtido com o aumento
da vazão até 2,5 mL min-1. A ausência de um aumento contínuo da corrente de pico com
a vazão indica uma limitação cinética associada ao processo de mediação, como
observado anteriormente para a dG sobre o mesmo filme de RuOHCF. Tentando
minimizar problemas de linha base, que têm como conseqüência um aumento nos
limites de detecção (desvios padrão relativo maiores entre as medidas do branco),
utilizou-se o fluxo de 2,0 mL min-1 nos estudos subseqüentes. Com relação ao volume
de amostra, alíquotas que variaram de 100 a 250 μL foram injetadas. Variações não
significativas foram observadas com relação à altura de pico para os estudos sobre o
volume da alça de amostragem. Assim sendo, o volume de 150 μL foi escolhido devido
a uma pequena melhora na corrente de pico e menor gasto de solução. Nessas condições
experimentais a freqüência analítica encontrada foi de 385 injeções por hora.
Como observado anteriormente, o sinal referente ao processo de oxidação do
ácido ascórbico sobre o eletrodo modificado inicia-se em 0 V e medições neste
potencial podem acarretar em melhora na seletividade do sensor, mas com perda de
sensibilidade. Este fato é ilustrado na Figura 78, em que se apresentam duas curvas de
calibração, independentes, polarizando o eletrodo de trabalho em dois diferentes
potenciais, 0 e 0,4 V.
Resultados e Discussão 147
0 200 400 600 800 1000
e
d
cba
Tempo / s
0,4 μA
0 200 400 600 800 10000,0
0,2
0,4
0,6
0,8
AI /
μA
C / μmol L-1
0 200 400
e
dc
b
Tempo / s
4 μA
0 200 400 600 800 10000
4
8
12
B
I / μ
A
C / μmol L-1
Figura 78 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a), 100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1. Solução carregadora: tampão fosfato pH 6,9. E = 0,0 (A) e 0,4 (B) V. Inserida em cada uma das figuras está a curva de calibração para cada potencial de trabalho.
Resultados e Discussão 148
Nota-se da Figura 78 que os valores de corrente em B são maiores do que os
obtidos em A, respectivamente, 0,4 e 0 V. A regressão linear da corrente de pico para
cada um dos potenciais resultou nas seguintes equações de reta: (I/μA) = 0,0041 + 7,3 x
10-4 (C/μmol L-1), coeficiente de correlação = 0,9999, para um potencial de polarização
de 0 V, e (I/μA) = 0,71 + 0,011 (C/μmol L-1), coeficiente de correlação = 0,9987, para
um potencial de polarização de 0,4 V. Como já era de se esperar, a sensibilidade do
método é comprometida a 0 V, entretanto, a melhora em seletividade é significativa
nesse potencial. O limite de detecção (3σ/S) para cada um dos potenciais utilizados foi
de 2,2 e 0,14 μmol L-1, respectivamente 0 e 0,4 V. Dessa forma, em matrizes mais
complexas e concentrações não tão baixas de ácido ascórbico pode-se então explorar a
seletividade do sensor. Caso a análise requeira uma alta sensibilidade e o analito esteja
contido em uma matriz não muito complexa, pode-se utilizar o potencial de trabalho de
0,4 V. Nessa nova condição (0 V), que prima pela seletividade, a freqüência analítica foi
de 290 injeções por hora (Largura do pico1/2 = 8 s, c = 1000 μmol L-1), menor que a
obtida em 0,4 V (Largura do pico1/2 = 4,5 s, c = 1000 μmol L-1), possivelmente por não
se trabalhar em um valor de potencial onde a velocidade de transferência eletrônica é
máxima. Entretanto, o valor de freqüência analítica obtido ainda é satisfatório para
análises de rotina.
O desvio padrão (N = 10) para injeções consecutivas de ácido ascórbico 130
μmol L-1 foi de 2,0 % indicando uma boa repetibilidade do sensor, Figura 79. O tempo
de vida do eletrodo foi avaliado monitorando-se a sensibilidade do eletrodo para uma
curva de calibração construída de 100 – 1000 μmol L-1 durante o período de 24 horas.
Nesse intervalo, o eletrodo foi armazenado a seco e à temperatura ambiente. Os valores
obtidos para o tempo t = 0 e 24 horas foram, respectivamente, (0,0041 ± 0,0008) e
(0,0040 ± 0,0002) μA μmol-1L. Nota-se que a variação nos valores de sensibilidade é
Resultados e Discussão 149
muito pequena, confirmando assim a boa estabilidade do eletrodo quando armazenado a
seco.
02
46
810
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
Número da injeção
I / μ
A
Figura 79 – Corrente de pico obtidas para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.
Comprovada a viabilidade da aplicação do eletrodo modificado em um potencial
de trabalho de 0 V, pensou-se em utilizar o eletrodo modificado para a detecção de
ácido ascórbico em urina.
Da literatura (Massey, 2000; Fang, Jiao et al., 2006), sabe-se que determinados
compostos podem causar interferência na análise de ácido ascórbico em urina. Esses
compostos são: glicose, nitrito e ácido úrico. Com o intuito de avaliar a interferência
desses compostos no sinal de corrente do ácido ascórbico para o sensor proposto
Resultados e Discussão 150
polarizado em 0 V, o interferente + ácido ascórbico (concentração na razão de 2:1)
foram injetados em mistura, Figura 80.
0 100 200 300 400
dcba
Tempo / s
0,2 μA
Figura 80 – Sinais amperométricos para repetidas injeções de ácido ascórbico 1 mmol L-1 + glicose 2 mmol L-1 (a), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + nitrito 2 mmol L-1 (b), ácido ascórbico 1 mmol L-1 + ácido úrico 2 mmol L-1 (c) e ácido ascórbico 1 mmol L-1 (d) utilizando eletrodo modificado com filme de RuOHCF. Solução carregadora: tampão fosfato pH = 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0 V. Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2.
Na Figura 80 pode-se notar que glicose, ácido úrico e nitrito não interferem no
sinal de corrente do processo de oxidação do ácido ascórbico em concentração duas
vezes maior.
Injeções consecutivas de padrões e duas amostras de urina foram efetuadas no
sistema em fluxo. Nota-se da Figura 81 a ausência de efeito memória, que pode ser
atribuída novamente à configuração da célula em fluxo e à ausência de envenenamento
Resultados e Discussão 151
da superfície do eletrodo. A tabela 10 mostra os resultados obtidos para 4 amostras de
urina coletadas de 3 diferentes indivíduos.
0 400 800 1200 1600
s2s1 ab
c
d
ee
d
c
ba
Tempo / s
0,3 μA
Figura 81 – Sinais amperométricos registrados utilizando eletrodo modificado de RuOHCF (Γ = 5,22 x 10-9 mol cm-2) para injeções de solução de ácido ascórbico: 50 (a), 100 (b), 200 (c), 500 (d) e 1000 (e) μmol L-1 e duas amostras de urina (s1 e s2). Solução carregadora: tampão fosfato pH 6,9. Vazão: 2,0 mL min-1 e volume de amostra: 150 μL. E = 0,0.
Resultados e Discussão 152
Tabela 10 – Valores de concentração encontrado em 4 diferentes amostras de
urina utilizando o método proposto
Amostra Concentração de
ácido ascórbico*
/ mmol L-1
Ácido
ascórbico
adicionado
/ µmol L-1
Ácido ascórbico
encontrado*
/ mmol L-1
Recuperação
/ %
1 (1,64 ± 0,01) 500 (2,13 ± 0,02) 98
2 (2,1 ± 0,2) 500 (2,6 ± 0,1) 100
3 (3,42 ± 0,07) 500 (3,90 ± 0,05) 96
4 (0,98 ± 0,04) 500 (1,50 ± 0,04) 104
* Medidas realizadas em triplicata.
Na literatura (Kumtatt e Leong, 1964), valores na faixa de 57 – 4100 μmol L-1
são reportados para a concentração de ácido ascórbico na urina e estes limites abrangem
os valores obtidos utilizando o sensor proposto. A larga faixa reportada na literatura
(Sinha, Block et al., 1992) deve-se ao fato de que os níveis de ácido ascórbico nos
fluidos biológicos (sangue, urina) variam em função do estilo de vida da pessoa, à
saturação de ácido ascórbico, capacidade de armazenado do mesmo no organismo,
exercícios físicos, consumo de álcool, doenças, idade e consumo de fármacos. Vale
destacar que o sensor proposto não requer pré-tratamento da amostra de urina, somente
uma diluição da ordem de 12 a 100 para que o valor de concentração se ajuste à faixa
linear da curva de calibração, diferentemente de muitos métodos que utilizam processos
de precipitação de alguns interferentes com acetato de mercúrio e acetato de bário
(Emmerie e Van Eekelen, 1934; Van Eekelen e Emmerie, 1936; Van Eekelen e
Heinemann, 1938).
Resultados e Discussão 153
Os sensores com características mais próximas ao do sensor proposto operam em
potencial de 0,05 V vs ECS (Pauliukaite, Ghica et al., 2005) e 0,05 V vs Ag/AgCl
(Kulys e Dcosta, 1991) e apresentam, respectivamente, limites de detecção de 2,1 e 23
μmol L-1. Com isso, pode-se notar que o sensor proposto apresenta possibilidade de
detecção de ácido ascórbico em potencial mais negativo do que 0,05 V, conferindo
assim uma maior seletividade às determinações e com limite de detecção comparável ao
sensor reportado por Brett e colaboradores (Pauliukaite, Ghica et al., 2005).
A exatidão da metodologia foi testada por adição e recuperação. Às amostras de
urina adicionaram-se alíquotas de ácido ascórbico (concentração final = 500 μmol L-1) e
os valores de recuperação obtidos variaram entre 96 - 104 %, atestando assim a exatidão
do método desenvolvido.
4.10. Desenvolvimento de metodologia para a determinação de ascorbato
em meio de MEM e glutationa utilizando microeletrodo modificado com
filme de óxido de rutênio hexacianoferrato
As células SH-SY5Y são cultivadas em meio de cultura com pH próximo de 7,0,
qual contém os nutrientes necessários para a sobrevivência das mesmas. Estudos iniciais
visando à substituição do meio para tampão fosfato resultaram em problemas de
desprendimento das células que estavam aderidas no fundo do poço. Dessa forma, e
visando não alterar a composição do meio de cultura visto que isso poderia provocar
uma condição não ideal para o sistema celular, pensou-se em desenvolver metodologia
para quantificação do ácido ascórbico em meio de cultura (MEM) e glutationa. O uso da
glutaniona se faz necessário para prevenir a oxidação do ácido ascórbico pelo ar durante
os experimentos.
Resultados e Discussão 154
Um primeiro passo foi verificar o comportamento eletroquímico do
microeletrodo (r = 14,5 μm, fibra de carbono) durante o processo de modificação,
Figura 82.
Resultados e Discussão 155
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
C
B
A
100 nA
E / V vs Ag/AgCl
Figura 82 – Voltamogramas cíclicos registrados durante o processo de modificação (A) com RuOHCF da superfície de fibra carbono (r = 14,5 m) em solução contendo RuCl3 1 mmol L-1 + K3Fe(CN)6 1 mmol L-1 + NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1 e verificação da estabilidade (B) em solução contendo NaNO3 0,5 mol L-1 + HCl 0,05 mol L-1. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Em C o voltamograma do eletrodo em tampão fosfato (pH = 6,9). Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.
Resultados e Discussão 156
Durante o processo de modificação da superfície do eletrodo, três processos
redox bem definidos podem ser verificados em 0,0, 0,67 e 0,93 V vs Ag/Cl. A partir dos
voltamogramas registrados em B, pode-se observar uma boa estabilidade do sinal de
corrente para voltamogramas consecutivos obtidos somente em eletrólito suporte. Esse
comportamento indica uma imobilização satisfatória do filme na superfície do
microeletrodo. Comparado com o eletrodo de tamanho convencional, pode-se dizer que
a estabilidade do filme foi maior trabalhando-se com o microeletrodo. O voltamograma
registrado em C mostra o comportamento do microeletrodo modificado em tampão
fosfato e observam-se algumas mudanças no comportamento eletroquímico ao
trabalhar-se com eletrólito contendo fosfato em pH mais elevado.
Visando avaliar as propriedades eletrocatalíticas do microeletrodo modificado
com RuOHCF para o processo de oxidação do ácido ascórbico, registrou-se
voltamogramas consecutivos para injeções de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11
mmol L-1, Figura 83.
Resultados e Discussão 157
Figura 83 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 2,3 μm) modificado com filme de RuOHCF em solução de tampão fosfato pH = 6,9 antes e após a adição de ácido ascórbico na faixa de 0,60 a 11 mmol L-1. O quadro inserido na figura mostra as curvas de calibração obtidas em duas diferentes regiões das curvas voltamétricas: 0,0 (A) e 0,2 (B) V. Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Nota-se da Figura 83, que o sinal de oxidação para o ácido ascórbico inicia-se
por volta de -0,1 V. O mesmo comportamento eletroquímico foi observado ao se utilizar
o eletrodo de tamanho convencional, Figura 71, indicando assim que o tamanho do
eletrodo não influencia as nas propriedades eletrocatalíticas do filme de RuOHCF para o
processo de oxidação do ácido ascórbico. Além disso, como observado no eletrodo
convencional, é possível trabalhar em duas regiões de potencial, uma mais seletiva e
menos seletiva (A) e outra mais sensível e menos seletiva (B). Dessa forma, a utilização
do microeletrodo para quantificação a de ácido ascórbico a 0,0 V vs Ag/AgCl parece ser
promissora. Entretanto, as medidas no meio celular precisavam ser realizadas em meio
Resultados e Discussão 158
de MEM e glutationa e desta forma, avaliou-se o comportamento do microeletrodo
nesta condição, Figura 84.
-0,4 0,0 0,4 0,8 1,2
0,0
0,2
0,4
B
A
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 84 – Voltamogramas registrados com microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF em MEM (A) e tampão fosfato pH = 6,9 (B). Velocidade de varredura: 100 mV s-1. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.
Os voltamogramas da Figura 84 mostram que por volta de 0,0 V o
comportamento eletroquímico em ambos os meios é semelhante. Entretanto, em
potenciais mais positivos o valor de corrente em meio de cultura foi maior que em
tampão fosfato. Essa observação poderia indicar eventuais problemas de interferência
ao se trabalhar em valores de potencial mais positivos, eventualmente justificativas pela
composição do meio de cultura MEM ((CaCl2, MgSO4, KCl, NaHCO3, NaCl e
NaH2PO4, respectivamente, 1,80, 0,814, 5,33, 26,19, 117,24 e 1,01 mmol L-1),
aminoácidos (21 tipos), vitaminas (10 tipos), ribonucleosídeos, desoxiribonucleosídeos
e outros componentes (d-glicose, ácido lipoíco acid and piruvato de sódio), pH = 7,0 ±
Resultados e Discussão 159
0,5.) Entretanto, sabe-se da literatura que o comportamento dos filmes de metal
hexacianoferrato são muito sensíveis a alterações da força iônica do meio (De Tacconi,
Rajeshwar et al., 2003; Abbaspour e Mehrgardi, 2004). Com isso, pode-se dizer que
dois fatores poderiam justificar o aumento de corrente em potenciais mais positivos: a
alteração da força iônica e a composição do meio de cultura (guanina e dG). Com o
intuito de confirmar a seletividade do sensor a 0,0 V, realizou-se experimento
envolvendo a adição de meio de cultura em tampão fosfato, Figura 85.
0 300 600 900
0.0 0.2 0.4 0.60.0
0.1
0.2
0.3
h
g
f
e
d
c
ba
C
B
A-
+
-
+
0
0
Tempo / s
100 pA
I / n
A
CAA / mM
Figura 85 – Sinais amperométricos (A) obtidos utilizando microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para injeções de glutaniona (a) (concentração final de 0,5 mmol L-1) e ácido ascórbico (b-f) (concentração final igual a 0,082 (b), 0,16 (c), 0,24 (d), 0,40 (e), 0,55 (f), 0,69 (g) mmol L-1) em MEM. Sinais amperométricos (B) obtidos utilizando microeletrodo modificado com RuOHCF para injeção de 100 μL de MEM concentrado (h)em tampão fosfato (6 mL). O painel C representa a curva de calibração para adições sucessivas de ácido ascórbico em MEM. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.
Resultados e Discussão 160
Nota-se que a adição de MEM e glutationa não proporciona sinal faradaico,
evidenciando assim a ausência de interferência desses compostos utilizando o
microeletrodo modificado com RuOHCF em 0,0 V. A regressão linear dos valores de
corrente, obtidos a 0,0 V, para adições de ácido ascórbico resultou em um reta com a
seguinte equação (I/nA = 0,00797 + 0,401 (C/mmol L-1)), coeficiente de correlação =
0,9986. O limite de detecção (3σ/S) sob essas condições foi de 25 μmol L-1, mas valores
muito mais baixos podem ser obtidos a 0,2 V. Neurotransmissores são eletroativos
sobre a superfície modificada de RuOHCF (dopamina, epinefrina e norepinefrina, 0,54,
0,60 e 0,61 V, potenciais esses mais positivos do que o potencial de pico do ácido
ascórbico a pH = 1,5 (0,52 V) (Chen, Lu et al., 2005)). Nestas condições, interferência
resultante de eventual presença de neurotransmissores em amostras reais não deve
ocorrer ao se trabalhar em 0,0 V.
A estabilidade do sensor no meio de cultura foi avaliada durante uma semana
monitorando-se a sensibilidade por meio de uma curva de calibração na faixa de 0,5 a
1,5 mmol L-1 de ácido ascórbico, Figura 86. Quando não utilizado, o microeletrodo
modificado foi armazenado a seco e à temperatura ambiente. A sensibilidade do sensor
permaneceu estável durante as primeiras 24 horas. Um decréscimo de 10 % e 40 % foi
observado após 120 e 168 horas, respectivamente. Dessa foram, observa-se que o filme
permanece depositado e retém suas propriedades eletrocatalíticas por um período de 120
horas, evitando um constante processo de recalibração do dispositivo.
Resultados e Discussão 161
0 20 40 60 80 100 1200,0000
0,0001
0,0002
0,0003
0,0004Se
nsib
ilida
de / μA
mm
ol L
-1
Tempo / h
Figura 86 – Sensibilidade do microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF para curvas de calibração construídas na faixa de 0,5 – 1,5 mmol L-1 em meio MEM durante 120 horas. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos sob agitação com barra magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.
4.11. Determinação do consumo de ascorbato pelas células SH-SY5Y
utilizando microeletrodo modificado com filme de óxido de rutênio
hexacianoferrato
Verificada a viabilidade de detecção do ácido ascórbico no meio de cultura das
células, iniciaram-se os experimentos para monitorar o consumo de ascorbato por 3
tipos celulares - SH, WT (célula transfectada com SOD humana) e G93A. Adicionaram-
se ao meio de cultura 0,2 mmol L-1 de ascorbato e 0,5 mmol L-1 de glutationa. Os
valores de corrente foram convertidos à concentração de ascorbato no meio de cultura
utilizando a curva de calibração mostrada na seção anterior. A Figura 87 mostra o
Resultados e Discussão 162
decaimento da corrente no meio de cultura para os diferentes experimentos e para um
experimento controle sem as células.
Figura 87 – Sinais amperométricos registrados utilizando microeletrodo de fibra de carbono (r = 14,5 μm) modificado com filme de RuOHCF no meio de cultura contendo 0,5 mmol L-1 de glutationa + 0,2 mmol L-1 de ácido ascórbico sem e com as células. E = 0,0 V vs Ag/AgCl. Experimentos realizados sem agitação magnética. Γ = 2,0 x 10-8 mol cm-2.
Visto que o durante os experimentos realizados com o controle não se observou
decaimento do valor de corrente, pode-se concluir que a variação da concentração de
ascorbato no meio de cultura ocorre devido à absorção de ascorbato pelas células, e não
devido à oxidação pelo ar. Sabe-se que as células SH-SY5Y expressam receptores
funcionais de ascorbato (May, Li et al., 2006) e que a incubação das células SH com
ascorbato resulta em um consumo linear por até 1 h, sendo possível observar consumo
por até 18 h de incubação. A absorção de ascorbato atinge um valor máximo (7 mmol
Resultados e Discussão 163
L-1 intracelular) nas incubações com 0,2 mmol L-1 de ascorbato no meio de cultura,
razão pela qual esta concentração foi empregada nos experimentos.
Após 3 h de incubação, as células SH e WT consumiram cerca de 30 % do
ascorbato presente no meio, enquanto as células G93A consumiram cerca de 50 %.
Conclui-se que não houve diferença no consumo de ascorbato entre as células SH e WT,
entretanto, as células G93A consumiram aproximadamente o dobro de ascorbato - a
quantidade de células em cada poço foi normalizada por contagem (106) e dosagem de
proteína após os experimentos.
Sabe-se que o ascorbato é um importante anti-oxidante em neurônios, chegando
a atingir concentrações intracelulares de 10 mmol L-1 (Halliwell, 1999). As células
transfectadas com SOD G93A produzem maior quantidade de espécies reativas de
oxigênio do que as células controle (Beretta, Sala et al., 2003), e apresentam nível de
lesão em DNA e lipoperoxidação aumentados. Estes dados indicam que as células
G93A encontram-se em uma situação de estresse oxidativo, o que explicaria o maior
consumo de ascorbato.
4.12. Estudos em células únicas
Dando início aos primeiros estudos nos ambientes celulares, medições
preliminares foram realizadas utilizando eletrodos de platina com isolamento feito pelo
processo de revestimento com polímero não condutor (fenol).
A Figura 88 mostra o fibroblasto de estudo na qual é introduzido o
microeletrodo. Uma vez que o eletrodo integrado acarretou em aumento significativo do
diâmetro do dispositivo, os estudos realizados a seguir foram feitos utilizando 2
eletrodos: o de trabalho (microeletrodo) e o de referência colocados no meio de cultura.
Resultados e Discussão 164
Figura 88 – Imagem obtida do fibroblasto utilizando microscópio invertido.
O fibroblasto apresenta uma forma triangular e com um tamanho suficiente para
que um dispositivo do tamanho de alguns micrometros possa ser nele inserido no
mesmo.
Problemas iniciais durante a introdução dos microeletrodos nos ambientes
celulares foram encontrados devido à formação de fungos, como pode ser observado na
Figura 89. O eletrodo apresenta tamanho da ordem 1 μm e corresponde à região mais
escura na imagem. Em B nota-se que a formação de fungos causou a quebra do
eletrodo, como mostrado pela região mais escura na parte inferior da Figura 89B. O
problema da formação de fungos foi solucionado pela limpeza do eletrodo
anteriormente às medidas com soluçai de HNO3 concentrado. A Figura 90 mostra o
microeletrodo inserido dentro da região celular e um voltamograma de pulso diferencial
registrado neste microambiente.
Resultados e Discussão 165
(A) (B)
Figura 89 – Imagem obtida utilizando microscópio invertido durante o processo de formação dos fungos.
Resultados e Discussão 166
0,3 0,6 0,9 1,2
0
50
100
I / μ
A
E / V vs Ag/AgCl
Figura 90 – Imagem e registro voltamétrico no fibroblasto utilizando a técnica de pulso diferencial. Amplitude do pulso: 50 mV, largura do pulso: 70 ms e velocidade de varredura: 5 mV s. Eletrodo: Microeletrodo de Platina.
O fibroblasto empregado não tinha sofrido lesão do material genético e serviu
para estudos preliminares. Dos registros voltamétricos podem ser observados 3 picos
principais nas regiões de 0,38, 0,80 e 1,17 V. O pico em 0,80 V pode ser um indicativo
do processo de oxidação da dG na superfície do eletrodo de platina. Estudos futuros
serão realizados com eletrodo modificado com RuOHCF para verificar essa suposição.
Conclusão 167
5. Conclusão
O desenvolvimento de método alternativo para a fabricação de dispositivos de
platina, ouro e fibra de carbono de dimensões estruturalmente microscópicas com base
em processo simples e de baixo custo foi reportado. A construção de eletrodos
estruturalmente pequenos é de fundamental importância uma vez que estes dispositivos
serão a base para o monitoramento de espécies químicas em ambientes celulares, como
por exemplo, DNA e ácido ascórbico. Wightman e colaboradores (Ewing, Bigelow et
al., 1983) indicam que as dimensões desejadas para microeletrodos, quando utilizados
no monitoramento “in-vivo”, devem ser de 20 μm, em concordância com os protótipos
fabricados nessa tese. Os microeletrodos aqui apresentados foram testados de maneira
satisfatória para o monitoramento de ácido ascórbico em laranjas e no ambiente
extracelular de células neuronais.
Matrizes de microeletrodos também foram construídas com o intuito de
possibilitar uma maior gama de dispositivos para o monitoramento celular. A
construção desse tipo de dispositivo torna-se muito útil uma vez que pode-se amplificar
o sinal de corrente sem necessidade de instrumentação apropriada. A quantificação de
iodato em amostras de sal de cozinha a partir de medidas de corrente de estado
estacionário foram obtidas com o MEA. Além disso, a possibilidade de controle
individual de cada eletrodo torna-se um grande atrativo desse tipo de sensor uma vez
que o mesmo pode possibilitar a detecção simultânea de diferentes espécies.
Estudos sobre a eletroatividade do eteno aduto demonstraram resposta em uma
região muito positiva de potencial, tornando-se um problema para a detecção em
microambientes. Dessa forma, optou-se por monitor as lesões do DNA a partir do
monitoramento da dG. Com o intuito de atribuir características mais seletivas e
Conclusão 168
sensíveis ao dispositivo, estudos de modificação da superfície do eletrodo foram
realizados utilizando filmes de hexacianoferratos. De todos os filmes estudados,
somente o filme de RuOHCF demonstrou propriedades eletrocatalíticas para o processo
de oxidação da dG, assim como no caso do ácido ascórbico.
Estudos eletroquímicos foram realizados com o intuito de estudar o processo de
oxidação de ambos os compostos (dG e ácido ascórbico) no eletrodo modificado com
RuOHCF. No caso do processo de oxidação da dG sobre o eletrodo modificado em
meio ácido, o mecanismo encontrado foi do tipo Lk. Neste caso, uma máxima utilização
dos sítios catalíticos do filme é prevista. Já para o processo de oxidação do ácido
ascórbico em pH = 6,9, encontraram-se dois tipos de mecanismos, LEk e LSk (ou Sk´),
respectivamente, para concentrações maiores e menores que 2 mmol L-1.
Comparando-se esses eletrodos modificados com a metodologia utilizando
Ru(bpy)33+ em solução e DNA imobilizado na superfície do eletrodo, o sensor proposto
tem algumas vantagens como a possibilidade de catálise heterogênea. Essa característica
possibilita a detecção “in-situ”, uma vez que a introdução de determinados agentes para
promover a mediação torna-se inviável. Comparado com os eletrodos camada por
camada (catalisador + DNA), o sensor desenvolvido nessa tese viabilizaria
investigações sobre o DNA livre em solução. Adicionalmente, a maior facilidade na
preparação e o baixo custo são aspectos a serem também destacados.
O filme de RuOHCF foi utilizado no desenvolvimento de metodologia analítica
para a quantificação de dG em amostras de DNA hidrolisadas. A melhoria do processo
de transferência eletrônica permitiu um aumento significativo da sensibilidade.
Excelentes parâmetros analíticos foram alcançados usando FIA combinado com
detecção eletroquímica. A ampla faixa linear, baixo limite de detecção (94 nmol L-1),
Conclusão 169
alta freqüência analítica e relativa estabilidade são parâmetros analíticos significativos
para a detecção de dG.
Para a quantificação de ácido ascórbico em pH = 6,9 em sistema FIA, o sensor
foi polarizado em 0,4 V obtendo-se limite de detecção de 140 nmol L-1 nas condições
ótimas de trabalho. Observou-se a possibilidade de detecção de ácido ascórbico em 0 V
com um limite de detecção de 2,2 μmmol L-1, sendo esse suficiente para a quantificação
de ácido ascórbico em amostras reais e com alta seletividade quando comparado com os
outros métodos propostos na literatura (Tabela 2). A viabilidade da metodologia
proposta foi verificada para quantificação de ácido ascórbico em urina.
Em função da aplicabilidade do filme de RuOHCF para a quantificação de ácido
ascórbico em pH = 6,9, microeletrodos de fibra de carbono modificados com RuOHCF
foram utilizados para o monitoramento do consumo de ácido ascórbico em diferentes
células de neuroblastomas. O estudo sobre o consumo de ascorbato pelas células
transfectadas com SOD G93A trouxe evidências de que a SOD mutante induz uma
situação de estresse oxidativo nos neuroblastomas e que o ascorbato é um antioxidante
muito importante no combate do processo de estresse oxidativo.
Perspectivas Futuras 170
6. Perspectivas Futuras
Para o monitoramento amperométrico “in-vivo” de espécies químicas de
interesse em células individuais, alguns obstáculos devem ser ultrapassados. Problemas
relacionados com a inserção de microeletrodos de platina em fibroblastos demonstraram
a necessidade de esterilização em meio fortemente ácido para minimizar a formação de
fungos. No caso dos eletrodos modificados com filmes de RuOHCF, este procedimento
não poderá ser utilizado por causa da possível dissolução do filme. Dessa forma,
estudos futuros devem focalizar procedimentos para esterilização do eletrodo
modificado sem alterar as propriedades eletrocatalíticas do filme de RuOHCF.
Etapa posterior visa à inserção do sensor em ambientes celulares (fibroblastos ou
células neuronais) de maneira a não destruir a membrana celular e não interferir nos
processos bioquímicos. Nessa etapa, estudos utilizando outras configurações de
microeletrodos (disco, cônico) e diferentes modos de inserção no ambiente celular serão
realizados com o intuito de minimizar erros analíticos, como por exemplo,
contaminação da célula e alteração do metabolismo devido à introdução do eletrodo ao
processo de eletrólise.
Referências Bibliográficas 171
7. Referências Bibliográficas
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Zare, H. R., N. Nasirizadeh e M. M. Ardakani. Electrochemical Properties of a
Tetrabromo-p-Benzoquinone Modified Carbon Paste Electrode. Application to the
Simultaneous Determination of Ascorbic Acid, Dopamine and Uric Acid. Journal of
Electroanalytical Chemistry, v.577, n.1, Mar, p.25-33. 2005.
Zhang, X. J., W. M. Zhang, X. Y. Zhou e B. Ogorevc. Fabrication, Characterization,
and Potential Application of Carbon Fiber Cone Nanometer-Size Electrodes. Analytical
Chemistry, v.68, n.19, Oct, p.3338-3343. 1996.
Zhou, L. P. e J. F. Rusling. Detection of Chemically Induced DNA Damage in Layered
Films by Catalytic Square Wave Voltammetry Using Ru(Bpy)(3)(2+). Analytical
Chemistry, v.73, n.20, Oct, p.4780-4786. 2001.
Súmula Curricular
SÚMULA CURRICULAR
DADOS PESSOAIS Nome: Thiago Regis Longo Cesar da Paixão
Local e data de nascimento: São Paulo, 14/03/1980
EDUCAÇÃO Colégio Meninópolis, São Paulo, 1997.
Instituto de Química - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002.
Graduação (Bacharel em Química)
Instituto de Química - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2002.
Graduação (Bacharel em Química - Opção Industrial)
Instituto de Química - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2007.
Graduação (Licenciatura em Química)
Instituto de Química - Universidade de São Paulo, São Paulo, 2004.
Mestrado em Química (Área: Química Analítica)
OCUPAÇÃO Bolsista de Doutorado, FAPESP (03/13757-0), 30/09/2007 PUBLICAÇÕES (Artigos Completos e Resumos em Congressos)
Artigos completos publicados em periódicos
1. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Electrocatalytic oxidation of
deoxyguanosine on a glassy carbon electrode modified with a ruthenium oxide
hexacyanoferrate film. Electrochimica Acta, Kidlington, Oxford, v. 52, p. 2181-
2188, 2007.
Súmula Curricular
2. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. Determination of
nitrate in mineral water and sausage samples by using a renewable in situ copper
modified electrode. Talanta (Oxford), Amsterdam, Netherlands, v. 71, p. 186-
191, 2007.
3. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. The use of a copper
microelectrode to measure the ethanol content in gasohol samples. Fuel
(Guildford), v. 86, p. 1185-1191, 2007.
4. PEDROSA, V. A.; PAIXÃO, T. R. L. C.; Freire, R. S.; BERTOTTI, M. Studies
on the electrochemical behavior of a cystine self-assembled monolayer modified
electrode using ferrocyanide as a probe. Journal of Electroanalytical Chemistry,
v. 602, p. 149-155, 2007.
5. SALLES, M. O.; PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Hydrogen peroxide
monitoring in photo-Fenton reactions by using a metal hexacyanoferrate
modified electrode. International Journal of Electrochemical Science, v. 2, p.
248-256, 2007.
6. PAIXÃO, T. R. L. C.; GARCIA, C. C. M.; MEDEIROS, M. H. G.; BERTOTTI,
M. Flow injection amperometric detection of 2'-deoxyguanosine at a ruthenium
oxide hexacyanoferrate modified electrode. Analytical Chemistry (Washington),
v. 79, p. 5392-5398, 2007.
7. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M.; RICHTER, E. M.; BRITO-NETO, J. G.
A. Fabrication of a new generator-collector electrochemical micro-device:
Characterization and applications. Electrochemistry Communications, New
York, NY, v. 8, p. 9-14, 2006.
8. LOWINSOHN, D.; PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M.;
RAMIREZ-FERNANDEZ, F. J.; PERES, H. E. M.; FERREIRA, T. L. Design
Súmula Curricular
and fabrication of a microelectrode array for iodate quantification in small
sample volumes. Sensors and Actuators. B, Chemical, Lausanne, Switzerland, v.
113, p. 80-87, 2006.
9. PAIXÃO, T. R. L. C.; PONZIO, E. A.; TORRESI, R. M.; BERTOTTI, M.
EQCM behavior of copper anodes in alkaline medium and characterization of
the electrocatalysis of ethanol oxidation by Cu(III) . Journal of the Brazilian
Chemical Society, São Paulo, Brazil, v. 17, p. 374-381, 2006.
10. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; BERTOTTI, M. Use of an
electrochemically etched platinum microelectrode for ascorbic acid mapping in
oranges. Journal of Agricultural and Food Chemistry, Washington, USA, v. 54,
p. 3072-3077, 2006.
11. PAIXÃO, T. R. L. C.; RICHTER, E. M.; BRITO-NETO, J. G. A.; BERTOTTI,
M. The use of a new twin-electrode thin-layer cell to the study of homogeneous
processes coupled to electrode reactions. Journal of Electroanalytical Chemistry,
Laussane, Switzerland, v. 596, p. 101-108, 2006.
12. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Development of a breath alcohol sensor
using a copper electrode in an alkaline medium. Electrochimica Acta, Laussane,
Switzerland, v. 571, p. 101-109, 2004.
13. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Design and
characterisation of a thin-layered dual-band electrochemical cell. Electrochimica
Acta, v. 48, n. 6, p. 691-698, 2003.
14. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Diffusion layer titration
of dipyrone in pharmaceuticals at a dual-band electrochemical cell. Talanta
(Oxford), v. 61, n. 5, p. 725-732, 2003.
Súmula Curricular
15. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Development of a dual-
band amperometric detector for determination of ascorbic acid and glucose.
Electroanalysis (New York), v. 15, n. 23-24, p. 1884-1889, 2003.
16. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Use of
electrochemically pretreated glassy carbon electrodes as pH sensors in
potentiometric titrations. Sensors and Actuators. B, Chemical, v. 87, n. 1, p. 41-
46, 2002.
17. PAIXÃO, T. R. L. C.; CORBO, D.; BERTOTTI, M. Amperometric
determination of ethanol in beverages at copper electrodes in alkaline medium.
Analytica Chimica Acta, v. 472, n. 1-2, p. 123-131, 2002.
18. PAIXÃO, T. R. L. C.; ROCHA, J. R. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M.
Anodic oxidation of nitrite at a molybdenum oxide layer. Electroanalysis (New
York), v. 13, n. 2, p. 155-160, 2001.
Trabalhos completos publicados em anais de congressos
1. PAIXÃO, T. R. L. C.; GARCIA, C. C. M.; MEDEIROS, M. H. G.; BERTOTTI,
M. Otimização dos parâmetros analíticos para a determinação de 2'-
desoxiguanosina em fluxo utilizando eletrodo modificado com RuOHCF. In:
XVI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2007, Águas de
Lindóia - SP. XVI Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2007.
2. PAIXÃO, T. R. L. C.; MEDEIROS, M. H. G. ; BERTOTTI, M. Fabricação de
um eletrodo integrado visando o monitoramento de etenoautos "in-vivo". In: XV
Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2005, Londrina - PR.
XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2005.
Súmula Curricular
3. PAIXÃO, T. R. L. C.; CARDOSO, J. L.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de
método analítico para quantificação de nitrato utilizando eletrodo de cobre
modificado in-situ. In: XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e
Eletroanalítica, 2005, Londrina - PR. XV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica
e Eletroanalítica, 2005.
4. LOWINSOHN, D. ; PERES, H. E. M.; LOSMINSKY, L.; PAIXÃO, T. R. L. C.;
FERREIRA, T. L.; RAMIREZ-FERNANDEZ, F. J.; BERTOTTI, M. Matriz de
microeletrodos de ouro: caracterização e modificação da superfície por óxidos
de molibdênio. In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica,
2004, Teresópolis - RJ. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e
Eletroanalítica, 2004.
5. PAIXÃO, T. R. L. C.; PONZIO, E. A.; TORRESI, R. M.; BERTOTTI, M.
Estudo eletroquímico do eletrodo de cobre em meio alcalino na presença e
ausência de etanol utilizando microbalança eletroquímica de cristal de quartzo.
In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004,
Teresópolis - RJ. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica,
2004.
6. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de sensor para
determinação de etanol em gasolina utilizando eletrodo de cobre em meio
alcalino. In: XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004,
Teresópolis. XIV Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e Eletroanalítica, 2004.
7. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Determinação simultânea de ácido
ascórbico e glicose em formulações farmacêuticas utilizando eletrodo de CD
com duas bandas. In: XIII Simpósio Brasileiro de Eletroquímica e
Súmula Curricular
Eletroanalítica, 2002, Araraquara - São Paulo. XIII Simpósio Brasileiro de
Eletroquímica e Eletroanalítica, 2002.
Resumos publicados em anais de congressos
1. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Electrocatalytical oxidation of guanine
and guanosine at a ruthenium hexacyanoferrate (RUHCF) film modifed
electrode. In: 57th Annual Meeting of the International Society of
Electrochemistry, 2006, Edinburgh. 57th Annual Meeting of the International
Society of Electrochemistry, 2006.
2. PAIXÃO, T. R. L. C.; JESUS, D. P.; BERTOTTI, M. Fabricação de
microeletrodos de platina por corrosão eletroquímica usando potencial alternado
de transformadores AC. In: 28 Reunião Anual da Sociedade Brasileira de
Química - SBQ, 2005, Poços de Caldas - MG. 28 Reunião Anual da Sociedade
Brasileira de Química - SBQ, 2005.
3. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Distribuição e
quantificação de ácido ascórbico in-situ em frutas utilizando microeletrodo de
Pt. In: 13º Encontro Nacional de Química Analítica / 1º Congresso Ibero-
Americano de Química Analítica, 2005, Niterói. 13º Encontro Nacional de
Química Analítica / 1º Congresso Ibero-Americano de Química Analítica, 2005.
4. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; BERTOTTI, M. Comportamento
eletroquímico do lactato em eletrodo de cobre. In: XXXVI Congresso
latinoamericano de Química e 27a Reunião anual da Sociedade Brasileira de
Química, 2004, Salvador, 2004.
Súmula Curricular
5. PAIXÃO, T. R. L. C.; BERTOTTI, M. Anodic oxidation of copper electrodes:
toward the development of a breath alcohol sensor. In: 54th Annual Meeting of
the International Society of Electrochemistry, 2003, São Pedro - São Paulo. 54th
Annual Meeting of the International Society of Electrochemistry, 2003.
6. PAIXÃO, T. R. L. C.; MATOS, R. C.; BERTOTTI, M. Desenvolvimento de
célula em fluxo de camada delgada a partir de CD's graváveis: sistema gerador-
coletor e quantificação de dipirona. In: 26a Reunião Anual da SBQ, 2003, Poços
de Caldas - Minas Gerais, 2003.
7. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOWINSOHN, D.; PEREIRA, A. C.; BERTOTTI, M.
Uso de microeletrodos de platina como sensor amperométrico de ácido
ascórbico em frutas. In: 26a Reunião Anual da SBQ., 2003, Poços de Caldas -
MG. 26a Reunião Anual da SBQ, 2003.
8. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L.; BERTOTTI, M. Utilização de eletrodo
de carbo no vítreo pré-tratado como sensor de pH. In: 25a Reunião Anual da
SBQ, 2002, Poços de Caldas. 25a Reunião Anual da SBQ, 2002.
9. PAIXÃO, T. R. L. C.; LOSMINSKY, L; ROCHA, J. R. C.; BERTOTTI, M.
Oxidação do nitrito em eletrodo modificado: desenvolvimento de método
analítico para determinação em embutidos. In: 23a Reunião Anual da SBQ,
2000, Poços de Caldas. 23a Reunião Anual da SBQ, 2000.