UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ORGÂNICA E INORGÂNICA
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
KIRLEY MARQUES CANUTO
Tese submetida à Coordenação do Curso de Pós-Graduação em Química Orgânica, como requisito parcial, para a obtenção do Título de Doutor.
Fortaleza-Ceará
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
i2007
Este trabalho científico foi realizado sob a orientação do Prof. Edilberto Rocha Silveira, no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, da Universidade Federal do Ceará.
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“Onde estiver vosso tesouro, Aí estará também vosso coração.” Mt 6, 21
À Deus, em quem deposito a confiança de conduzir-me sempre por caminhos de felicidade. À minha mãe Dagmar (in memorian), ainda “viva” em minha memória. Aos meus pais, pelos referenciais cristãos e por terem priorizado minha educação. Aos irmãos, amigos e familiares, por compartilharem solidariamente a alegria das vitórias e o dissabor dos insucessos. À Carol, minha maior conquista e credora do meu amor, carinho e respeito.
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AGRADECIMENTOS
Neste momento sublime da carreira acadêmica, gostaria de expressar o meu apreço por todos aqueles que contribuíram, mesmo que modestamente, para a obtenção deste título de Doutor, pois se hoje posso orgulhar-me deste feito, é porque encontrei pessoas dotadas de sensibilidade para compreender o desafio, disposição para colaborar e confiança no meu potencial para concretizar este projeto. No entanto, certas pessoas se notabilizaram por suas relevantes e despretensiosas cooperações, por isso terão seus nomes merecidamente mencionados, como forma de perpetuar suas valiosas participações. Meu grato reconhecimento:
Ao Prof. Edilberto Rocha Silveira, pesquisador obstinado e perfeccionista, pelo seu esmero e dedicação na transmissão de conhecimentos científicos agregados a valores éticos (elementos fundamentais para uma boa qualificação profissional) e pelas oportunidades concedidas para meu aperfeiçoamento acadêmico, as quais têm me permitido acessar novos campos de estudo. “Espero corresponder às suas expectativas.”
À Profª. Otília Deusdênia P. Cavalcante, pela sua disposição em cooperar e propor novos desafios, possibilitando o aprimoramento técnico e o enriquecimento curricular. “Obrigado pelos toques de classe nas sugestões e intervenções.”
Aos professores Profª. Mary Anne Souza Lima, Profª Telma Leda G. Lemos e Prof. Francisco José Queiroz Monte, sempre solícitos quando precisei de auxílio material ou teórico para a viabilização de algum experimento. “Tentarei retribuir-lhes quando solicitado.”
Aos professores Profª. Maria Conceição Oliveira Ferreira, Profª. Gilvandete Maria Pinheiro Santiago, Prof. Marcos Carlos de Matos e Prof. Manoel Andrade Neto por terem introduzido, didaticamente, fundamentos teóricos essenciais para um bom rendimento acadêmico. “Comprometo-me a difundir e compartilhar os conhecimentos adquiridos onde estiver.”
Ao amigo Dr. Daniel Esdras de A. Uchoa, por ter me treinado e repassado parte de seu know-how em duas importantes técnicas analíticas (HPLC e RMN), além das orientações extras, permitindo-me realizar minha pesquisa com um relativo grau de independência. “Espero ser útil quando precisar de mim.”
Aos amigos Prof. Dr. Fco. Geraldo Barbosa, Prof. Dr. José Galberto M. da Costa, Dr. Adriano Nunes Cunha, Profª. Dra. Regina Cláudia M. Dourado, Profª. Dra. Nirla Romero, Profª. Dra. Nilce Gramosa, Prof. José Hélder Filgueiras Jr., por terem me ensinado muito sobre suas experiências em Química de Produtos Naturais, durante o período de Graduação e Pós-Graduação, cujo aprendizado acelerou o amadurecimento da minha formação científica. “Sou grato pelas informações que produziram atalhos, e pelo apoio emocional que fortaleceu-me durante a caminhada.”
Ao Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, pelo cultivo e beneficiamento primário das plantas jovens de A. cearensis, atividades árduas que lhe exigiam grande dedicação de tempo e esforço físico, mas que não lhe deixavam abater, semeando alegria e energia para o trabalho. “Meu franco reconhecimento pela profícua parceria, a qual certamente atenua sua dor crônica de colher fracassos futebolísticos.”
À Prof. Luzia Kalyne de A. Moreira Leal, pela realização de um incontável número de testes farmacológicos (extratos e substâncias puras de A. cearensis), cujos resultados da pesquisa me renderam uma parcela significativa da minha produção científica. “Que sua obstinação científica gere novos projetos em conjunto.”
Aos professores Prof. Carlos Roque D. Correia (UNICAMP) e Prof Norberto Peporini (USP- Ribeirão Preto), pela realização de espectros de massas, imprescindíveis para a elucidação estrutural das substâncias isoladas inéditas na literatura.
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Ao colega de Pós-Graduação João Carlos, pela presteza na realização dos espectros de massa (baixa resolução).
Às agências de fomento à pesquisa (CAPES, CNPq, FUNCAP, FINEP), ao Banco do Nordeste e à Selachii por terem viabilizado financeiramente o estudo, através de recursos para custeio de materiais de consumo, viagens para congressos e aquisição de equipamentos e produtos para melhoria da infra-estrutura laboratorial. Ao CNPq, pela bolsa concedida desde o período de Iniciação Científica, sem a qual não teria condições de dedicar-me e persistir na carreira científica.
Aos companheiros de laboratório e Pós-graduação, dos quais guardo lembranças memoráveis pelas boas relações de amizade, cujo convívio salutar tornava as jornadas de trabalho mais agradáveis e menos cansativas: Francigláuber, Maria Conceição (“Lobinha”), Hélcio, Rosa Virgínia, Mônica, Flávio, Lincoln Davi, Gizelle, Grazielle, Sammy, Fátima, Renata Paiva, Renata Mendonça, Arthur, Jackson, Jefferson, Alexandre Praxedes, Alexandre Oliveira, Érica, Rogério, Fábio (“El Larvagol”), Leopoldina, Juliana (“Juju”). E sobretudo aos amigos de “boa cepa” Jacqueline, Cláudio e Henrique, com os quais compartilhava sucessos e infortúnios.
Aos funcionários da UFC (Raimunda -“Mundinha”, Aurilana-“Lana”, Sr. Paulo, Célia e Orlando) e terceirizados (Rogério, Sr. Raimundo, Paula e Cícero), pessoas cordiais e bem-humoradas, pela qualidade nos préstimos de seus serviços.
A todos, meu eterno obrigado e pedido de desculpas pelas gozações, nem sempre bem compreendidas. “Faz parte.”
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SUMÁRIO
LISTA DE SIGLAS...................................................................................................................X LISTA DE FIGURAS...............................................................................................................XI LISTA DE TABELAS...........................................................................................................XVI LISTA DE FLUXOGRAMAS.............................................................................................XVII LISTAS DE QUADROS ....................................................................................................XVIII LISTA DE GRÁFICOS......................................................................................................XVIII RESUMOS.............................................................................................................................XIX ABSTRACT............................................................................................................................XX CAPÍTULO I INTRODUÇÃO ...............................................................................................1 CAPÍTULO II CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS...............................................................6 2.1 Família Leguminosae Papilionoideae (Fabaceae).....................................................6 2.2 Considerações botânicas sobre a espécie Amburana cearensis A.C. SMITH .........7 Referências....................................................................................................................12 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA CAPÍTULO III- BIFLAVONÓIDES....................................................................................13 3.1 Características Fundamentais e Relevância............................................................13 3.2 Ressonância magnética nuclear de 13C...................................................................16
3.2.1 Subclasses de biflavonóides.................................................................................16 3.2.2 Aspectos Estereoquímicos....................................................................................50 3.2.3 Metilação e Acetilação.........................................................................................54 3.2.4 Glicosilação..........................................................................................................54 3.2.5 Conectividade.......................................................................................................54 3.2.6 Sulfatação.............................................................................................................55 3.2.7 Biflavonóides atípicos..........................................................................................55
3.3 Atividade biológica.................................................................................................57 Referências....................................................................................................................60
CAPÍTULO IV- VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA..............................69
4.1. Seletividade............................................................................................................69 4.2. Linearidade............................................................................................................69 4.3. Sensibilidade..........................................................................................................69 4.4. Precisão..................................................................................................................69 4.5. Limite de Detecção (LD).......................................................................................70 4.6. Limite de Quantificação (LQ)................................................................................71 4.7. Exatidão.................................................................................................................71 Referências....................................................................................................................71
RESULTADOS E DISCUSSÃO CAPÍTULO V- DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL ........................................................72
5.1. Amburanina A (ACCE-5)......................................................................................72 5.2. Amburanina B (ACCE-6)......................................................................................84
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5.3. Amburosídio A (ACS-7)........................................................................................95 5.4. Acetato de 6”-amburosila- (ACS-8)....................................................................100 5.5. Protocatecuato de 6”-amburosila (ACS-9)..........................................................108 5.6. Ferulato de 6”-amburosila (ACS-10)...................................................................117 5.7. Vanilato de 6”-amburosila (ACS-11) .................................................................127 5.8. Sinapato de 6”-amburosila (ACS-12) .................................................................134 5.9. Galato de 6”-amburosila (ACS-2) ......................................................................143 5.10. Amburosídio B (ACPa-6) .................................................................................154 5.11. Ácido (E)-o-cumárico glicosilado (ACPa-7) ....................................................162 5.12. Ácido (Z)-o-cumárico glicosilado (ACX-1) .....................................................171 5.13. Formononetina (ACCE-9) .................................................................................180 5.14. Aiapina (ACPa-4) .............................................................................................187 5.15. 6-hidroxi-cumarina (ACS-5) .............................................................................192 5.16. Protocatecuato de- 6-cumarila (ACCE-8) .........................................................199 5.17. Ácido protocatecuico (ACCE-2) .......................................................................209 5.18. Ácido vanílico (ACCE-4) .................................................................................213 5.19. Ácido p-hidroxi-benzóico (ACPa-5) .................................................................218 5.20. Ácido (E)-o-cumárico (ACS-6) ........................................................................221 5.21. Quercetina (ACCE-1) .......................................................................................225 5.22. Isocampferídio (ACCE-7) .................................................................................229 5.23. Cumarina (ACS-1 e ACPa-2) ...........................................................................233 Referências..................................................................................................................237
CAPÍTULO VI- PROPOSTA BIOGENÉTICA DE FORMAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS ISOLADAS DE A. CEARENSIS.........................................................................................239
6.1. Amburosídios.......................................................................................................242 6.2. Cumarinas............................................................................................................242 6.3. Flavonóides..........................................................................................................243 6.4. Isoflavonóides......................................................................................................246 Referências..................................................................................................................246
CAPÍTULO VII- VALIDAÇÀO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO......................247
7.1. Validação.............................................................................................................247 7.2. Doseamento..........................................................................................................251
CAPÍTULO VIII- BREVE ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DO ESTUDO INTERDISCIPLINAR DE A. cearensis .............................................................................264
8.1. Avaliação da atividade farmacológica dos extratos etanólicos de espécimens jovens......................................................................................................................................264
8.2. Avaliação da atividade farmacológica de substâncias isoladas de A. cearensis..267 Referências..................................................................................................................269
CAPÍTULO IX- ATIVIDADE ALELOPÁTICA .............................................................270
9.1. Alelopatia.............................................................................................................270 9.2. Atividade alelopática do extrato aquoso das sementes de A. cearensis...............270 Referências..................................................................................................................271
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CAPÍTULO X PARTE EXPERIMENTAL ......................................................................272 10.1. ESTUDO QUÍMICO DOS CONSTITUINTES DE A. CEARENSIS................272 10.1.1. MATERIAL BOTÂNICO..............................................................................272 10.1.2. METODOLOGIA AGRONÔMICA..............................................................272 10.1.3 Métodos cromatográficos................................................................................273 10.1.3.1. Cromatografia de adsorção.........................................................................273 10.1.3.2. Cromatografia de exclusão..........................................................................273 10.1.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE≈ HPLC) .......................274 10.1.3.4. Extração em Fase Sólida (EFS ≈ SPE) .......................................................274 10.1.4. Métodos espectroscópicos..............................................................................274 10.1.4.1. Espectroscopia na região do infravermelho (IV) .......................................274 10.1.4.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e de
Carbono-13 (RMN 13C) ..........................................................................................................274 10.1.4.3. Espectrometria de massa (EM) ...................................................................274 10.1.5. Métodos físicos...............................................................................................276 10.1.5.1. Determinação do ponto de fusão (pf) .........................................................276 10.1.5.2 Determinação da rotação óptica (α)............................................................277 10.1.6. Estudo Fitoquímico da casca do caule de A. cearensis...................................277 10.1.6.1. Obtenção do extrato etanólico da casca do caule (ACCE1) ........................277 10.1.6.2. Partição líquido-líquido do extrato etanólico ACCE1..................................277 10.1.6.3. Fracionamento de ACCEAM1.....................................................................278 10.1.6.4. Cromatografia em sílica de ACCE1AM/CA ...............................................278 10.1.6.5. Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACCE1AM/CA(24-31)- Isolamento
de ACCE-1 (quercetina) .......................................................................................................279 10.1.6.6. Isolamento de ACCE-2 ACCE- 3 e ACCE-4 (ácido protocatecuico,
amburosídio A e ácido vanílico) ..........................................................................................279 10.1.6.7. Isolamento de ACCE-5 (Amburanina A) ..................................................279 10.1.6.8. Isolamento de ACCE-6 (Amburanina B) ..................................................279 10.1.6.9. Obtenção e partição de ACCE2....................................................................281 10.1.6.10. Fracionamento de ACCE2AM...................................................................282 10.1.6.11. Cromatografia em sílica de ACCE2AM/CA..............................................282 10.1.6.12. Isolamento de ACCE-7 e ACCE-8 (protocatecuato de 6-cumarila e
isocampferídio) .....................................................................................................................282 10.1.6.13. Isolamento de ACCE-9 (formononetina).................................................282 10.1.7. Estudo Fitoquímico das Sementes de A. cearensis 10.1.7.1. Obtenção dos extrato etanólico das sementes (ACS)- Isolamento de ACS-1
(cumarina)..............................................................................................................................283 10.1.7.2. Partição do extrato etanólico ACSE............................................................283 10.1.7.3.Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACSEA..........................................284 10.1.7.4. Isolamento de ACS-2 (galato de amburosila)............................................285 10.1.7.5. Cromatografia em sílica de ACSEA(2-11)(11-18)-Isolamento de ACS-3 e
ACS-4......................................................................................................................................286 10.1.7.6. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-5 e ACS-6 (6-hidroxi-cumarina
e ácido (E)-o-cumárico)........................................................................................................286 10.1.7.7. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-(7-12).......................................287 10.1.8.Obtenção dos extratos etanólicos dos xilopódios e das partes aéreas de plantas
cultivadas (ACX e ACPA)......................................................................................................290 10.1.8.1. Partição do extrato etanólico E7-ACX.........................................................290 10.1.8.2. Fracionamento de ACXQ.............................................................................292
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10.1.8.3. Separação por HPLC de ACXQ/B- Isolamento de ACX-1 (ác. (E)-o-cumárico glicosilado) ....... .....................................................................................................293
10.1.8.4. Tratamento cromatográfico de E7-ACXAM- Isolamento de ACX-2 (amburanina B) ....................................................................................................................293
10.1.8.5. Partição do extrato etanólico E7-ACPa.......................................................294 10.1.8.6. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD....................................................295 10.1.8.7. Cromatografia em Sephadex LH-20 de E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g)- Isolamento
de ACPa-1 (ácido vanílico)....................................................................................................295 10.1.8.8. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD(4-6)-Isolamento de ACPA-2-4
(cumarina, e aiapina)............................................................................................................296 10.1.8.9. Isolamento de ACPa- 5 e ACPa-6 (ácido p-hidroxi benzóico e amburosídio
B).............................................................................................................................................296 10.1.8.10. Fracionamento de E7-ACPaQ....................................................................296 10.1.8.11. Purificação por HPLC- Isolamento de E7-ACPa-7 (ácido (E)-o-cumárico
glicosilado)..............................................................................................................................297 10.2. Validação do método de quantificação de 4 substâncias presentes nos extratos de
Amburana cearensis................................................................................................................299 10.2.1. Preparo das Soluções......................................................................................299 10.2.2. Condições analíticas........................................................................................300
CAPÍTULO XI- CONCLUSÃO..........................................................................................302
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LISTA DE SIGLAS ABNT- Associação Brasileira de Normas Técnicas
ANVISA- Agência Nacional de Vigilância Sanitária
CAPES- Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CCD- Cromatogragia de Camada Delgada
CNPq- Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
COSY- Correlation Spectroscopy
COX- Cicloxigenase
CPD- Composite Pulse Decoupling
CV- Coeficiente de Variação
DAD- Diode-array Detector
DEPT- Distortionless Enhancement by Polarization Transfer
DMSO- Dimetilsulfóxido
EM- Espectrometria de Massas
FUNCAP- Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico
GABA- Ácido γ-aminobutírico
HMBC- Heteronuclear Multiple Bond Correlation
HMQC- Heteronuclear Multiple-Quantum Coherence
HPLC- High Performance Liquid Chromatoghraphy
HSQC- Heteronuclear Single Quantum Correlation
IDH- Índice de Deficiência de Hidrogênio
IE- Impacto Eletrônico
IES- Ionização por Electrospray
INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia, Normalização e Qualidade Industrial
IUPAC- International Union of Pure and Applied Chemistry
IV- Infravermelho
LD- Limite de Detecção
LQ- Limite de Quantificação
NOESY- Nuclear Overhauser Enhancement Spectroscopy
PAL- Phenylalanine Ammonia Lyase
PLP- Pyridoxal 5’-phosphate
RMN- Ressonância Magnética Nuclear
SAM- S-adenosil-metionina
SPE- Solid Phase Extraction
TC- Temperatura de coalescência
tR- Tempo de retenção
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LISTA DE FIGURAS
Figura 1- Fotos digitais das formas exploradas comercialmente de A. cearensis, com fins medicinais: casca (à dir.) e xarope (à esq.).................................................................................4 Figura 2– Mapa de distribuição de espécimens de A. cearensis na América do Sul.................8 Figura 3- Fotos digitais de diferentes partes de A. cearensis: (A) sementes, (B e C) flores, (D e E) frutos, (F) galhos...............................................................................................................10 Figura 4- Fotos digitais de um espécimem adulto silvestre de A. cearensis: estação chuvosa (esq.) e período de estiagem (dir.).............................................................................................10 Figura 5- Fotos digitais de A. cearensis cultivada: canteiro (esq.) e espécimens colhidos aos 6 meses de desensvolvimento (dir.).............................................................................................11 Figura 6- Fotos de Dipterix odorata (esq.) e Commiphora leptophloeos (dir.).......................11 Figura 7- Estruturas químicas da biflavona amentoflavona, numeradas sob duas formas......15 Figura 8- Espectros de RMN 13C de GB-1 (148) registrados em diferentes temperaturas e solventes, obtidos num espectrômetro Bruker (HAN et al., 2005)...........................................53 Figura 9- Espectro de absorção na região de infravermelho de ACCE-5................................77 Figura 10- Espectro de RMN 1H de ACCE-5 (DMSO-d6, 500 MHz).....................................77 Figura 11- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5.........................78 Figura 12- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)........................78 Figura 13- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)..................79 Figura 14- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5.......................79 Figura 14a- Expansão da região δ 5,5-7,5 x 95,0-133.............................................................80 Figura 15- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5........................80 Figura 15a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 6,4-7,6 x 112-131; (II) δ 9,0-13,4 x 153-172; (III) δ 9,0-13,4 x 103-120..............................................................................81 Figura 15b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 5,5-7,5 x 95,0-133; (II) δ 5,8-7,4 x 152-171............................................................................................................................82 Figura 16- Espectro de massa de ACCE-5 (Ionização por Impacto Eletrônico).....................83 Figura 17- Espectro RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5......................83 Figura 18- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-6.............................89 Figura 19- Espectro de RMN 1H de ACCE-6 (DMSO-d6, 500 MHz).....................................89 Figura 20- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-6.........................90 Figura 21- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)........................90 Figura 22- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)..................91 Figura 23- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6.......................91 Figura 24- Espectro de massa de ACCE-6 (Ionização por Impacto Eletrônico).....................92 Figura 25- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6........................92 Figura 25a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 5,5-7,6 x 77-108; (II) δ 11,5-13,6 x 89-110; (III) δ 6,4-8,4 x 111-135..................................................................................93 Figura 25b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 11,4-13,4 x 160-169; (II) δ 5,7-8,4 x 126-172......................................................................................................................94 Figura 26- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) de ACS-7...........................................98 Figura 27- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7...................................98 Figura 28- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7...........................99 Figura 29- Espectro de RMN 1H de ACS-8 (CD3OD, 500 MHz).........................................103 Figura 30- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz).............................104 Figura 30a- Expansão da região δ 98-125 do espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-8........104 Figura 31- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)......................105
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xiFigura 32- Espectro de massa de ACS-8 (Ionização por Electron-spray).............................105
Figura 33- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8.............................106 Figura 33a- Expansões do espectro HSQC de ACS-8: (I) δ 3,3-5,4 x 62-81; (II) δ 6,7-7,5 x 114-133...................................................................................................................................106 Figura 34- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8............................107 Figura 34a- Expansões do espectro HMBC de ACS-8: (I) δ 6,7-7,5 x 115-135; (II) δ 6,7-7,5 x 143-162................................................................................................................................107 Figura 35- Espectro de RMN 1H de ACS-9 (CD3OD, 500 MHz).........................................112 Figura 36- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-9........................112 Figura 36a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 6,5-7,7..............................................................112 Figura 37- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-9 (MeOD, 125 MHz)..............................113 Figura 38- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-9 (CD3OD, 125 MHz).......................113 Figura 39- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9.............................114 Figura 39a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 104-134............................................................114 Figura 40- Espectro de massa de ACS-9 (Ionização por Electron-spray).............................114 Figura 41- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9............................115 Figura 41a- Expansões do espectro HMBC de ACS-9: (I) δ 6,6-7,7 x 143-163; (II) δ 4,3-7,5 x 164-173................................................................................................................................116 Figura 42- Espectro de RMN 1H de ACS-10 (CD3OD, 500 MHz).......................................121 Figura 43- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-8.............................122 Figura 43a- Expansão da região δ 6,2-7,7 x 6,2-7,7..............................................................121 Figura 44- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)...........................122 Figura 44a- Expansão da região δ 108-135 do espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)................................................................................................................122 Figura 45- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz).....................123 Figura 46- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10...........................123 Figura 46a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 110-135............................................................123 Figura 47- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10..........................124 Figura 47a- Expansões do espectro HMBC de ACS-10: (I) δ 6,7-7,5 x 142-162; (II) δ 6,3-7,8 x 120-136; (III) δ 6,9-8,0 x 108-121......................................................................................125 Figura 48- Espectro de massa de ACS-10 (Ionização por Electron-spray)...........................126 Figura 49- Espectro de RMN 1H de ACS-11 (CD3OD, 500 MHz).......................................130 Figura 50- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz)...........................130 Figura 50a- Expansão da região δ 102-135...........................................................................130 Figura 51- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz).....................131 Figura 52- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-11...........................131 Figura 53- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11...........................132 Figura 53a- Expansão da região δ 6,5-7,7 x 6,5-7,7..............................................................132 Figura 54- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11..........................132 Figura 54a- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 4,2-7,8 x 173-165; (II) δ 6,7-7,7 x 142-156................................................................................................................................133 Figura 55- Espectro de RMN 1H de ACS-12 (CD3OD, 500 MHz).......................................138 Figura 55a- Expansões do espectro de RMN 1H de ACS-12: (I) δ 6,3-7,8; (II) δ 63,1-5,3..138 Figura 56- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12...........................139 Figura 56a- Expansão da região δ 6,3-7,7 x 6,3-7,7..............................................................139 Figura 57- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz)...........................139 Figura 58- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz).....................140 Figura 59- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12...........................140 Figura 59a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 106-132............................................................140 Figura 60- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-12..........................141 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
xii
Figura 60a- Expansão da região δ 4,3-7,8 x 165-173............................................................141 Figura 60b- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,5 x 137-160; (II) δ 6,4-7,7 x 114-135..........................................................................................................................142 Figura 61- Espectro de RMN 1H de ACS-2 (CD3OD, 500 MHz).........................................149 Figura 61a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACS-2: (I) δ 3,1-5,3..............................149 Figura 62- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-2.............................150 Figura 63- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-2 (CD3OD, 125 MHz).............................150 Figura 64- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz)........................................151 Figura 65- Espectro de massa de ACS-2 (Ionização por Electron-spray).............................151 Figura 66- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2.............................152 Figura 67- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2............................152 Figura 67a- Expansão da região δ 6,7-7,5 x 153-172............................................................153 Figura 68- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-6.............................158 Figura 69- Espectro de RMN 1H de ACPa-6 (CD3OD, 500 MHz).......................................158 Figura 70- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)...........................159 Figura 71- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz).....................159 Figura 72- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6...........................160 Figura 73- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6..........................160 Figura 74- Espectro de RMN 1H de ACPa-7 (CD3OD), 500 MHz)......................................166 Figura 74a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACPa-7 da região de: (I) δ 3,2-4,0........166 Figura 75- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACPa-7...........................167 Figura 76- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-7 (MeOD, 125 MHz)............................167 Figura 77- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-7 (CD3OD, 125 MHz).....................168 Figura 78- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7...........................168 Figura 79- Espectro de massa de ACPa-7 (Impacto eletrônico)............................................169 Figura 80- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-7.............................169 Figura 81- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7..........................170 Figura 81a- Expansão da região δ 6,3-8,4 x 124-144............................................................170 Figura 82- Espectro de RMN 1H de ACX-1 (CD3OD, 500 MHz).........................................175 Figura 83- Espectro RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACX-1.............................175 Figura 84- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACX-1 (CD3OD, 125 MHz)............................176 Figura 85- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACX-1......................176 Figura 86- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1.............................177 Figura 87- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1...........................177 Figura 87a- Expansão do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,8 x 110-145..................178 Figura 88- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACX-1..............................178 Figura 89- Espectro de massa de ACX-1 (Impacto Eletrônico)............................................179 Figura 90- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)...........................183 Figura 91- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz).................183 Figura 92- Espectro de RMN 1H de ACCE-9 (C5D5N, 500 MHz)........................................184 Figura 93- Espectro RMN-HSQC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9............................185 Figura 93a- Expansão do espectro HSQC de ACCE-9: δ 7,0-8,5 x 100-133........................185 Figura 94- Espectro RMN-HMBC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9...........................186 Figura 95- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-4.............................189 Figura 96- Espectro de RMN 1H de ACPa-4 (CDCl3, 500 MHz).........................................189 Figura 97- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz).............................190 Figura 98- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz).......................190 Figura 99- Espectro de massa de ACPa-4 (Impacto Eletrônico)...........................................191 Figura 100- Espectro de RMN 1H de ACS-5 (CD3COCD3, 500 MHz).................................195
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
xiiiFigura 101- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)....................195
Figura 102- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)..............196 Figura 103- Espectro RMN-HSQC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5....................196 Figura 104- Espectro de massa de ACS-5 (Impacto Eletrônico)...........................................197 Figura 105- Espectro RMN-HMBC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5...................197 Figura 106- Espectro de RMN 13C (CPD) de umbeliferona (CD3COCD3, 125 MHz)..........198 Figura 107- Cromatograma de HPLC de 6-hidroxi-cumarina (254 nm)...............................198 Figura 108- Cromatograma de HPLC de umbeliferona (7-hidroxi-cumarina: 254 nm)........198 Figura 109- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-8..........................203 Figura 110- Espectro de RMN 1H de ACCE-8 (DMSO-d6, 500 MHz).................................203 Figura 111- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8.....................204 Figura 112- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)....................204 Figura 113- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)..............205 Figura 114- Espectro de RMN 13C (gated) de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)...................205 Figura 115- Espectro de massa de ACCE-8 (Impacto Eletrônico)........................................206 Figura 116- Espectro RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8.....................206 Figura 116a- Expansão da região δ 6,4-7,5 x 113-124..........................................................206 Figura 117- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8....................207 Figura 117a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-8: (I) δ 6,9-8,1 x 140-157; (II) δ 6,4-8,2 x 113-132..........................................................................................................................208 Figura 118- Espectro RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8..................208 Figura 119- Espectro de RMN 13C (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2...................................211 Figura 120- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2..................211 Figura 121- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-2....................................212 Figura 122- Espectro de absorção na região do IV de ACCE-4 (pastilha de KBr)...............215 Figura 123- Espectro de RMN 1H de ACCE-4 (CD3OD, 500 MHz)....................................215 Figura 124- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)........................216 Figura 125- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)..................216 Figura 126- Espectro de massa de ACCE-4 (Impacto Eletrônico)........................................217 Figura 127- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear (HMBC) de ACCE-4......217 Figura 128- Espectro de RMN 1H de ACPa-5 (CD3OD, 500 MHz).....................................219 Figura 129- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz).........................219 Figura 130- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz)...................220 Figura 131- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz)...........................223 Figura 132- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz).....................223 Figura 133- Espectro de absorção na região do IV de ACS-6...............................................224 Figura 134- Espectro de RMN 1H de ACS-6 (CD3OD, 500 MHz).......................................224 Figura 135- Espectro de RMN 1H de ACCE-1 (500 MHz, DMSO-d6).................................227 Figura 136- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6)....................227 Figura 137- Espectro RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-1.....................228 Figura 138- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-7....................................231 Figura 139- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7..........................231 Figura 140- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7..................232 Figura 141- Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de ACS-1.........................................235 Figura 142- Espectro de RMN 13C-CPD (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1.................................235 Figura 143- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1.........................236 Figura 144- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da casca do caule (ACCE)- sohxlet.....256 Figura 145- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (9 m)....256 Figura 146- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (9 m)..256 Figura 147- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (7 m)....257 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
xiv
Figura 148- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (7 m)..257 Figura 149- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (4 m)....257 Figura 150- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (4 m)..258 Figura 151- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (2 m)....258 Figura 152- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (2 m)..258 Figura 153- Cromatograma de HPLC do ácido p-hidroxi-benzóico......................................260 Figura 154- Cromatograma de HPLC do ácido cumárico.....................................................260 Figura 155- Cromatograma de HPLC do ácido (Z)-cumárico glicosilado.............................260 Figura 156- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-cumárico glicosilado............................261 Figura 157- Cromatograma de HPLC da aiapina..................................................................261 Figura 158- Cromatograma de HPLC da cumarina...............................................................261 Figura 159- Cromatograma de HPLC do ácido vanílico.......................................................262 Figura 160- Cromatograma de HPLC do Amburosídio B.....................................................262 Figura 161- Cromatograma de HPLC do Amburosídio A.....................................................262 Figura 162- Cromatograma de HPLC do ácido protocatecuico.............................................263 Figura 163- Detalhe das plântulas normais (esq.), anormais (centro) e sementes não germinadas (dir.) observadas no bioensaio com ext. aquoso das sementes de cumaru..........271 Figura 164- Cromatograma de HPLC da fração ACCE1AM/CA(24-31)(19-33)(5-12)........280 Figura 165- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(13-17)....................287 Figura 166- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)....................288 Figura 167- Cromatograma de HPLC do pico 4 da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)....288 Figura 168- Cromatograma de HPLC da fração ACXQ(3)B................................................293 Figura 169- Cromatograma de HPLC da fração E7-ACPaQ(7)(2-3)....................................297 Figura 170- Cromatograma dos quatro padrões (conc.= 60 µg/mL) utilizados na validação de amostras de A. cearensis: A- ácido protocatecuico, B- ácido vanílico, C- cumarina e D- amburosídio A.........................................................................................................................301
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xv
LISTA DE TABELAS
Tabela 1- Relação dos biflavonóides descritos na literatura, contendo os tipos de conectividade, as fontes botânicas, os solventes empregados para obtenção dos espectros de RMN e as referências correspondentes....................................................................................46 Tabela 2- Relação das atividades biológicas demonstradas por biflavonóides.......................59 Tabela 3- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e floretina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989)...............................76 Tabela 4- Dados de RMN 13C de ACCE-5 e ACCE-6.............................................................87 Tabela 5- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e campferol, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).............................88 Tabela 6- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio A, registrado na literatura (BRAVO et al., 1999)................................................97 Tabela 7- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................102 Tabela 8- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................111 Tabela 9- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-10 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................120 Tabela 10- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-11 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................129 Tabela 11- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-12 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................137 Tabela 12- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-2 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................146 Tabela 13- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-8, 10 e 11 e substâncias análogas (192-194) isoladas de Ilex litsaefolia .....................................................................................147 Tabela 14- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio B, registrados na literatura ................................................................................157 Tabela 15- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................165 Tabela 16- Dados de RMN 1H e 13C de ACX-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................174 Tabela 17- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de formononetina, registrados na literatura.................................................................................182 Tabela 18- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aiapina, registrados na literatura ..........................................................................................................188 Tabela 19- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, registrados na literatura ............................................................................194 Tabela 20- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-5 com dois registros de deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, encontrados na literatura................194 Tabela 21- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.....................................................................................202
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xvi
Tabela 22- Dados de RMN 13C de ACCE-2 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido protocatecuico, registrados na literatura ...........................................................210 Tabela 23- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido vanílico, registrados na literatura ...........................................................................................214 Tabela 24- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido p-hidroxi-benzóico, registrados na literatura .............................................................................218 Tabela 25- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido (E)-o-cumárico, registrados na literatura..........................................................................................222 Tabela 26- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de quercetina, registrados na literatura ..........................................................................................................226 Tabela 27- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de isocampferídio, registrados na literatura ................................................................................230
Tabela 28- Dados de RMN 13C de ACS-1 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de cumarina, registrados na literatura ....................................................................................234
Tabela 29- Equações e coef. de correlação das retas dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ác. protocatecuico, ác. vanílico, cumarina e amburosídio A.............................248 Tabela 30- Parâmetros de desempenho analítico dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A.........................250 Tabela 31- Concentração dos quatro principais constituintes químicos detectados em diferentes extratos de A. cearensis, expressos em relação à massa de extrato e de material botânico...................................................................................................................................255 Tabela 32- Relação das substâncias químicas identificadas, segundo seus tempos de retenção registrados em análises por HPLC, nos extratos de A. cearensis: planta adulta (casca do caule) e espécimens jovens (xilopódio e parte aérea)........................................................................259 Tabela 33- Acompanhamento mensal das massas (g) e dos rendimentos (%) dos extratos etanólicos da parte aérea e do xilopódio de A. cearensis........................................................291
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1- Concentração dos quatro constituintes majoritários em extratos etanólicos das cascas do caule de A. cearensis, obtidos por maceração e soxhlet.........................................251 Gráfico 2- Concentrações de ácido vanílico e cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis (valores expressos em relação à massa de extrato e à biomassa)................................................................................................................................252 Gráfico 3- Concentração de ácido vanílico em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................253 Gráfico 4- Concentração de cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................253 Gráfico 5- Concentração de amburosídio A em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento...........................................................254
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LISTA DE QUADROS
Quadro 1- Esqueletos básicos das diferentes subclasses de flavonóides.................................14 Quadro 2- Estruturas de flavonóides farmacologicamente ativos...........................................58 Quadro 3- Proposta biogenética de formação de ácidos fenólicos simples e aminoácidos aromáticos...............................................................................................................................240 Quadro 4- Proposta biogenética de formação de amburosídios e derivados dos ácido benzóico e cinâmico................................................................................................................241 Quadro 5- Proposta biogenética de formação de ác. cumáricos glicosilados e cumarinas....243 Quadro 6- Proposta biogenética de formação de flavonóis e biflavonóides..........................244 Quadro 7- Proposta mecanística de formação da amburanina A...........................................245 Quadro 8- Proposta biogenética de formação da isoflavona formononetina.........................246
LISTA DE FLUXOGRAMAS
Fluxograma 1- Partição líquido-líquido do extrato etanólico das cascas do caule de A. cearensis..................................................................................................................................278 Fluxograma 2- Metodologia de Isolamento de 6 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis. ..............................................................................................281 Fluxograma 3- Metodologia de Isolamento de 3 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis. ..............................................................................................283 Fluxograma 4- Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das sementes de A. cearensis. Isolamento de ACS-1. ............................................................................................................284 Fluxograma 5- Partição do extrato etanólico das sementes de A. cearensis.........................285 Fluxograma 6- Metodologia de isolamento das 9 substâncias obtidas do extrato etanólico das sementes de A. cearensis. .......................................................................................................289 Fluxograma 7- Partição do extrato etanólico do xilopódio da planta jovem (7 meses) de A. cearensis. ...............................................................................................................................292 Fluxograma 8- Metodologia de isolamento de duas substâncias isoladas do xilopódio das plantas jovens de A. cearensis (7 meses)................................................................................294 Fluxograma 9- Partição do extrato etanólico da parte aérea da planta jovem (7 meses) de A. cearensis..................................................................................................................................295 Fluxograma 10- Metodologia de isolamento das 7 substâncias isoladas da parte aérea das plantas jovens de A. cearensis (7 meses)................................................................................298
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RESUMO
Amburana cearensis A.C. Smith (sin. Torresea cearensis Fr. All) é uma árvore típica da caatinga nordestina, popularmente conhecida como imburana-de-cheiro ou cumaru, caracterizada por sua casca vermelho-pardacenta e odor peculiar agradável, atribuído à cumarina. Apresenta relevante importância econômica, sobretudo na carpintaria e perfumaria, e inestimável valor medicinal (propriedades terapêuticas contra afecções respiratórias cientificamente comprovadas), todavia esta espécie sofre ameaça de extinção devido ao extrativismo predatório. Em virtude da necessidade de elaboração de um modelo de exploração auto-sustentável de A. cearensis, foi proposto um estudo integrado Química-Agronomia-Farmacologia. Este trabalho relata a abordagem fitoquímica da pesquisa interdisciplinar, visando o isolamento, a purificação e a caracterização estrutural de novos constituintes químicos da planta adulta (silvestre), bem como a identificação e a quantificação de compostos químicos já conhecidos, considerados biomarcadores, em espécimens jovens de diferentes meses de desenvolvimento (cultivados). As investigações químicas da planta silvestre de A. cearensis foram realizadas com os extratos etanólicos da casca do caule, coletadas no município de Quixeramobim-CE, e das sementes, adquiridas no comércio de Fortaleza-CE. Os extratos etanólicos foram submetidos a partições líquido-líquido, cromatografias convencionais (adsorção-gel de sílica e exclusão- gel de dextrana) e modernas (HPLC-fase reversa), resultando no isolamento e identificação de: A. Cumarinas- 6-hidroxi-cumarina e protocatecuato de 6-cumarila; B. Ácidos fenólicos- ácido vanílico e ácido (E)-o-cumárico; C. Flavonóides- quercetina, formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B; Amburosídios- amburosídio A, ferulato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”-amburosila, galato de 6”-amburosila, acetato de 6”-amburosila, sinapato de 6”-amburosila e vanilato de 6”-amburosila. Os espécimens cultivados de A. cearensis, divididos em parte aérea e xilopódio, foram extraídos com etanol e submetidos a uma metodologia química semelhante à adotada para a planta silvestre. Da parte aérea foram obtidos cumarina, aiapina, amburanina B, isocampferídio, ácido vanílico e ácido (E)-o-cumárico glicosilado, enquanto que do xilopódio foram isolados ácido p-hidroxi-benzóico, ácido (Z)-o-cumárico glicosilado e amburosídio B. As substâncias químicas isoladas tiveram suas estruturas elucidadas por métodos físicos (ponto de fusão e rotação óptica) e espectrométricos (Espectrometria na região do Infravermelho, Espectrometria de Massa e Ressonância Magnética Nuclear de 1H e 13C, incluindo técnicas uni e bidimensionais), além de comparação com dados da literatura. Os extratos etanólicos da planta silvestre (casca do caule) e de espécimens cultivados (parte aérea e xilopódio) foram quimicamente comparados através de análises por HPLC, empregando-se método cromatográfico validado (linearidade, precisão, exatidão, fator de recuperação aceitáveis) e utilizando-se padrões de ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A, obtidos em estudos anteriores. Amburosídio A foi o constituinte majoritário do extrato da planta silvestre. Nos espécimens jovens, ácido vanílico e cumarina revezaram-se como principais componentes, dependendo da parte e da idade da planta estudada.
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ABSTRACT
Amburana cearensis A.C. Smith is a typical tree of the northeastern Brazil flora designated “caatinga”. It is popularly known either as “imburana-de-cheiro” or “cumaru” and characterized by its red-gray bark of peculiar and pleasant smell due to coumarin. Despite A. cearensis relevant economical (particularly for carpentry and perfumery) and medicinal importance (therapeutic properties against respiratory affections scientifically proved), it is one of the plant species treated of extinction due to predatory extractivism. Taking in account the necessity of elaborating a sustainable plan of exploitation it was suggested an integrated study covering the chemical, agronomical and pharmacological aspects of A. cearensis. This work reports the phytochemical component of the interdisciplinary study pursuing the isolation, purification and structure characterization of new secondary metabolites of the wild adult plant, as well as the identification and quantification of the already known chemicals, considered the plant biomarkers, from young cultivated specimens at different developmental stages. The chemical investigation of adult wild plants was performed with the ethanol extract from barks of A. cearensis collected at Quixeramobim County, Ceará state, and the hexane extract of seeds purchased from herbal stores at Fortaleza. The ethanol extracts were submitted to liquid-liquid partition, conventional (silica gel adsorption and gel exclusion with dextran) and modern (HPLC) chromatography leading to the isolation and characterization of: A. Coumarins 6-hydroxy-coumarin, 6-coumaryl protocatechuate, acid; B. Phenol Acids- vanillic acid, o-coumaric; C. Flavonoids- quercetin, formononetin, amburanin A and B; Amburosídes- amburoside A, 6”-amburosyl-ferulate, 6”-amburosyl-protocatechuate, 6”-amburosyl-galate, 6”-amburosyl-acetate, 6”-amburosyl-sinapate and 6”-amburosyl-vanillate. The cultivated specimens, separated in aerial part and xylopode, were extracted with ethanol and submitted to the same methodology employed for the wild plant. From the aerial part were isolated coumarin, ayapin, amburanin B, isokaempferide, vanillic acid, (E)-o-coumaric acid glucoside, while from the xylopode were isolated p-hydroxy-benzoic acid, (Z)-o-coumaric acid glucoside and amburoside B. All chemical substances had their structures elucidated through physical (mp and optical rotation) and spectroscopical methods (IR, MS and NMR, including uni and bidimensional techniques) and comparison to the literature wherever the case. The ethanol extracts from either wild or cultivated (aerial part and xylopode) plants were compared by HPLC through a validated chromatographic method (acceptable linearity, precision, accuracy and recovering factor) using as standard the protocatechuic acid, vanillic acid, coumarin and amburoside A, obtained from the previous studies. Amburoside A was the major component of wild plant, while coumarin and vanilic acid take turns as the principal metabolites of cultivated young plants depending on the plant part and plant age.
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I. INTRODUÇÃO
Amburana cearensis A.C. Smith (sin. Torresea cearensis Fr. All), pertencente à
família das Leguminoseae Papilionoideae (Fabaceae), é uma árvore frondosa, típica da
caatinga nordestina, especialmente do Ceará, onde é conhecida como imburana-de-cheiro,
cerejeira e cumaru. Embora nativa do sertão nordestino, A. cearensis pode ser encontrada em
praticamente toda América do Sul (do Peru à Argentina), juntamente com a outra
representante do gênero, Amburana acreana, presente principalmente no sudoeste da Floresta
Amazônica. A. cearensis pode atingir até 15 m de altura e 50 cm de diâmetro, caracterizando-
se por possuir flores brancas, vagem achatada e escura, além da casca aromática com odor
peculiar de cumarina. Suas sementes são escuras, aladas e exalam também um forte cheiro de
cumarina (semelhante à baunilha) (CARVALHO, 1994).
Do ponto-de-vista econômico, A. cearensis apresenta valiosa importância comercial
dado às suas várias aplicações, particularmente empregada em carpintaria e perfumaria.
Comercializada com o nome de cerejeira-do-nordeste, sua madeira é utilizada na fabricação
de móveis, portas, e caixotaria devido à sua reconhecida durabilidade. As sementes servem
como aromatizantes e repelentes de insetos para roupas e estantes (MAIA, 2004). Aquino et
al. (2005) propõem a aplicação do pó da madeira em tonéis de aguardente de cana-de-açúcar
com o objetivo de acelerar o processo de maturação da bebida, devido à riqueza de compostos
fenólicos. Na medicina popular, a casca do caule é utilizada na preparação de "lambedôs"
caseiros para o tratamento de doenças respiratórias. Industrialmente, a forma farmacêutica
disponível é o xarope de cumaru o qual é produzido pelo Programa Farmácias Vivas,
Farmácia-Escola/UFC e empresas privadas como a Selachii e Bionatus (MATOS, 2002).
Em virtude do difundido uso de A. cearensis para fins terapêuticos, tornou-se
indispensável a realização de estudos científicos que justificassem a sua indicação para o
tratamento de afecções respiratórias. Assim, desde o início dos anos 90, são realizados testes
farmacológicos visando à determinação das propriedades terapêuticas desta planta. Através de
ensaios pré-clínicos, foram comprovadas as atividades broncodilatadora, analgésica,
antiinflamatória do extrato hidroalcoólico das cascas do caule de A. cearensis, o qual
demonstrou ser isento de toxicidade, em doses terapêuticas, garantindo eficácia e segurança
ao seu uso no tratamento de asma, bronquite, gripes e resfriados (LEAL et al., 1997 e 2003).
Ao passo que se avançavam as pesquisas farmacológicas, paralelamente, surgiu a
necessidade de se conhecer melhor a química desta espécie, até então limitada à cumarina,
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isocampferídio e alguns poucos compostos químicos (3,4-dimetoxi-cinamato de metila,
afrormosina, 7-hidroxi-8,4’-dimetoxi-isoflavona, 24-metilenocicloartanol, β-sitosterol e 6-
hidroxi-cumarina), sendo a primeira apontada a priori como única responsável pelas
propriedades biológicas descritas (BASTOS, 1983).
Deste modo, a fim de se descobrir os supostos princípios ativos de A. cearensis, foi
proposta a realização de um estudo químico, concomitante aos ensaios farmacológicos,
visando o isolamento, purificação e a caracterização estrutural de substâncias químicas
presentes na casca do caule e sementes, devido ao emprego medicinal destas partes botânicas.
A casca do caule, coletada no município de Quixeramobim-CE, e as sementes, adquiridas no
comércio de Fortaleza-CE foram pulverizadas e submetidas à extração com etanol,
separadamente. Cromatografias convencional, gel de sílica ou dextrana, e moderna (HPLC-
fase reversa), foram adotadas para o isolamento e purificação das substâncias, sendo suas
estruturas químicas elucidadas por métodos físicos (ponto de fusão e rotação óptica) e
espectrométricos (Espectroscopia na região do Infravermelho, Ressonância Magnética
Nuclear de 1H e 13C e Espectrometria de Massa), além de comparação com dados da
literatura.
A investigação química da casca do caule de A. cearensis resultou no isolamento
de 7 substâncias: amburosídio A, protocatecuato de 6-cumarila, ácido vanílico, quercetina,
formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B. A prospecção das sementes revelou a
presença de 9 substâncias: 6-hidroxi-cumarina, ácido (E)-o-cumárico, ácido vanílico, e seis
amburosídios (C-H), acetato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”- amburosila, ferulato de
6”-amburosila, galato de 6”-amburosila, vanilato de 6”-amburosila e sinapato de 6”-
amburosila.
A abundante ocorrência de flavonóides descrita para A. cearensis motivou a
realização de um levantamento bibliográfico sobre a ocorrência botânica, tipos estruturais e
atividades biológicas exibidas por biflavonóides. Esta revisão propiciou ainda a construção de
um banco de dados de RMN 13C de biflavonóides, representando uma atualização do livro
“Carbon-13 of Flavonoids”- (Autor: AGRAWAL, P.K. Editora: Elsevier. Ano: 1989),
principal fonte de consulta de dados espectroscópicos desta classe química.
O êxito alcançado nas pesquisas químicas e farmacológicas do extrato de A.
cearensis e seus constituintes intensificou o uso medicinal desta planta, tanto a nível caseiro
como pela produção de seu fitoterápico, em escala industrial (Fig. 1, p. 4). Esta crescente
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demanda no emprego da casca do caule de A. cearensis tem provocado uma séria ameaça para
a existência da espécie num futuro não muito distante, visto que a mesma já é classificada
como espécie em perigo de extinção (HILTON-TAYLOR, 2000 apud RAMOS et al., 2004).
A fim de evitar possíveis conseqüências nefastas do extrativismo predatório de A.
cearensis, foi desenvolvido um projeto de pesquisa interdisciplinar Agronomia-Química-
Farmacologia visando à proposição de um modelo de exploração racional e auto-sustentável
de A. cearensis. Desta iniciativa surgiu a proposta de substituição da planta adulta silvestre
por espécimens jovens, cultivados sob parâmetros agronômicos controlados, de forma a
conciliar a preservação da espécie e o seu uso comercial, sobretudo pelo mercado
farmacêutico. Além de que a produção de mudas poderia ser utilizada no reflorestamento de
áreas degradadas. Faz-se míster salientar que a idéia da troca da planta silvestre pela cultivada
foi inicialmente aventada pelo Prof. Francisco José de Abreu Matos, a exemplo do que foi
idealizado para Myracrodruon urundeuva (aroeira-do-sertão) no seu livro sobre implantação
do programa Farmácias Vivas (MATOS, 2002).
Este estudo integrado e multidisciplinar, financiado pelo Banco do Nordeste, CNPq,
CAPES e pela FUNCAP, constou de três fases:
Fase 1 (agronomia)- germinação de sementes e produção de plantas jovens, realizada pelo
Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, no Departamento de Fitotecnia-UFC.
Fase 2 (química)- no Departamento de Química Orgânica e Inorgânica, foram efetuados a
preparação e fracionamento dos extratos etanólicos das plantas jovens; quantificação dos
teores de substâncias químicas comuns aos extratos da planta silvestre e da planta cultivada
(ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A); e isolamento e
caracterização estrutural de substâncias presentes nos extratos das plantas jovens: amburanina
B, isocampferídio, aiapina, amburosídio B, ácido p-hidroxi-benzóico, ácido (E)-o-cumárico
glicosilado e o seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico glicosilado.
Fase 3 (farmacologia)- avaliação farmacológica comparativa entre o extrato da planta
silvestre e os extratos das plantas cultivadas em diferentes estágios de crescimento, realizada
pela Profª. Luzia Kalyne de Almeida Moreira Leal, no Departamento de Farmacologia-UFC.
Em virtude da falta de padronização crônica dos fitoterápicos nacionais, a pesquisa
contemplou ainda o desenvolvimento de um método de análise química qualitativa e
quantitativa para extratos e produtos comerciais de A. cearensis, como mecanismo de garantia
de qualidade e atoxicidade dos mesmos, em doses terapêuticas. Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
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Além disso, A. cearensis teve seu potencial bio-herbicida investigado num ensaio de
inibição da germinação de alface, efetuado pelo Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra. O
extrato aquoso das sementes, dotado de atividade alelopática, foi quimicamente caracterizado
(BEZERRA et al., 2001).
O presente trabalho, confeccionado segundo as normas preconizadas pela ABNT
(Associação Brasileira de Normas Técnicas), é composto por onze capítulos: Introdução
(cap. I), Considerações Botânicas- Família Leguminoseae Papilionoideae e a Espécie A.
cearensis (cap. II), Revisão Bibliográfica- Biflavonóides (cap. III), Validação de
Metodologia Analítica (cap. IV), Resultados e Discussão: Determinação Estrutural (cap V),
Proposta Biogenética de Formação das Substâncias Isoladas (cap. VI), Validação de Método
Cromatográfico (cap VII), Breve Abordagem Farmacológica do Estudo Interdisciplinar de A.
cearensis (cap. VIII) e Atividade Alelopática (cap. IX), Parte Experimental (cap. X) e
Conclusão (cap. XI).
Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira
Figura 1- Fotos digitais das formas exploradas comercialmente de A. cearensis, com fins medicinais: casca (à dir.) e xarope (à esq.)
OBJETIVOS DO ESTUDO QUÍMICO DE A. CEARENSIS
• Continuação do estudo fitoquímico das cascas do caule e sementes;
• Avaliação química comparativa dos extratos etanólicos de A. cearensis (planta
silvestre e cultivada);
• Validação de método cromatográfico para doseamento de 4 constituintes de extratos
de A. cearensis;
• Análise quantitativa e caracterização química dos extratos de plantas jovens
farmacologicamente ativos.
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REFERÊNCIAS
AQUINO, F. W. B.; RODRIGUES, S.; NASCIMENTO, R. F.; CASIMIRO, A. R. S. Phenolic compounds in imburana (Amburana cearensis) powder extracts. Eur. Food Res. Technol., v. 221, p. 739-745, 2005.
BASTOS, C. R. V. Contribuição ao conhecimento químico de Torresea cearensis (Fr. All.) Departamento de Química Orgânica e Inorgânica. Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 1983.
BEZERRA, A. M. E.; CANUTO, K. M.; SILVEIRA, E. R; FREITAS, J. B. S.; MEDEIROS-FILHO, S. Efeito do extrato aquoso das sementes de cumaru na germinação de alface. Hortic. Bras., v. 19, n. 2, p. 243, 2001.
CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: EMBRAPA, 1994, 640 p.
HILTON-TAYLOR, C. 2000 IUCN Red List of Threatned Species. IUCN, Cambridge-UK, 2000.
LEAL, L. K. A. M; MATOS, M. E.; MATOS, F. J. A.; RIBEIRO, R. A.; FERREIRA, F. V.; VIANA, G. S. B. Antinociceptive and antiedematogenic effects of the hydroalcoholic extract and coumarin from Torresea cearensis Fr. All. Phytomedicine, v. 4, n. 3, p. 221-227, 1997.
LEAL, L. K. A. M; OLIVEIRA, F. G.; FONTENELE, J. B.; FERREIRA, M. A. D.; VIANA, G. S. B. Toxicological study of hydroalcoholic extract from Amburana cearensis in rats. Pharmac. Biol., v. 41, n. 4, p. 308-314, 2003.
MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. São Paulo: D & Z Editora, 2004. 413 p.
MATOS, F. J. A. Farmácias vivas: sistema de utilização de plantas medicinais projetado para pequenas comunidades. 4ª ed., Fortaleza: Editora UFC, 2002. 267 p.
RAMOS, K. M. O.; FELFILI, J. M.; FAGG, C. W.; SOUSA-SILVA, J. C.; FRANCO, A. C. Desenvolvimento inicial e repartição de biomassa de Amburana cearensis (All.) A. C. Smith, em diferentes condições de sombreamento. Acta. Bot. Bras., v. 18, n. 2, p. 351-358, 2004.
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II. CONSIDERAÇÕES BOTÂNICAS
2.1. Considerações botânicas sobre a família Leguminoseae papilionoideae (Fabaceae)
A família Leguminoseae, também denominada Fabaceae, é caracterizada pelo fruto
na forma de vagem, sendo composta por cerca de 740 gêneros inseridos em três subfamílias,
facilmente distinguíveis por caracteres vegetativos:
• Mimosoideae- apresenta folhas bipinadas e glândulas, suas flores são actinomórficas;
• Caesalpinoideae- apresenta folhas paripinadas, sem glândulas, suas flores são
variáveis;
• Papilionoideae- apresenta folhas imparipinadas e flores zigomórficas
Leguminoseae Papilionoideae é a mais numerosa das subfamílias, detendo
aproximadamente 500 gêneros e mais de 10.000 espécies divididas em 31 tribos. Seus
representantes estão distribuídos em todo o globo terrestre, majoritariamente nos trópicos
americanos e africanos (RIBEIRO et al., 1999). Esta subfamília é tida como a mais evoluída,
sendo ainda caracterizada pela prefloração imbricado-descendente da corola e a posição
infletida do eixo radícula-hipocótilo, em relação aos cotilédones (BARROSO, 1991). As
espécies apresentam folhas compostas, alternas, raramente opostas (somente Platymiscium e
Taralea), com um pulvino na base do pecíolo e um pulvínulo para cada folíolo. Geralmente,
apresentam estípulas na base das folhas e estipelas entre os folíolos. Os folíolos podem ser
opostos, subopostos ou alternos de margem inteira. Possuem um folíolo terminal, isto é, são
imparipinadas. Exsudação vermelha é comum, mas rara nas outras duas subfamílias
(RIBEIRO et al., 1999).
A inflorescência pode ser racemo ou panícula, normalmente portando brácteas e
bractéolas. As flores são bissexuais, zigomórficas, com cinco sépalas unidas (RIBEIRO,
1999). A corola possui de uma a cinco pétalas livres, formando um arranjo papilionáceo, ou
seja, semelhante a uma borboleta, sendo considerado o tipo mais evoluído. Há uma pétala
superior chamada de estandarte ou vexilo, o qual pode ser oblongo, reniforme ou orbicular.
As pétalas laterais são denominadas alas e as inferiores são as carenas (BARROSO, 1991).
As flores típicas são lilases e bem vistosas à luz ultravioleta, são providas de néctar e
pólen como recompensa para os visitantes. Há um só carpelo, o ovário é súpero, podendo
haver mais de um óvulo.
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Por tratar-se de uma leguminosa, o fruto é uma vagem com uma ou mais sementes,
podendo ser deiscente ou não. A superfície pode ser glabra ou pubescente, até urticante. O
fruto pode ser espesso ou achatado, seco ou carnoso, sendo, às vezes, alado.
As sementes e frutos de muitos gêneros são fontes nutricionais ricas em
carboidratos, proteínas e vitaminas, como é caso do feijão, da soja e da ervilha. As madeiras
de espécies de Dipteryx, Hymenolobium e Dalbergia são empregadas na construção civil e na
marcenaria (RIBEIRO et al., 1999).
2.2. Considerações botânicas sobre Amburana cearensis A.C. Smith
O táxon Amburana é formado por apenas duas espécies, A. acreana Ducke e A.
cearensis A.C. Smith, as quais possuem grande importância econômica e medicinal.
Enquanto que a primeira espécie apresenta-se na forma arborescente de alto fuste, ocorrendo
em matas altas e fechadas, A. cearensis assume a forma arbustiva de fuste curto,
predominando em formações vegetais tropicais a subtropicais secas (CARVALHO, 1994).
Nativa do sertão nordestino, A. cearensis é encontrada ainda nos Estados de Minas
Gerais, Espírito Santo, Tocantins e da Região Centro-Oeste. Contudo, a outra espécie do
gênero, A. acreana, tem sua distribuição restrita ao sudoeste da floresta amazônica (Rondônia,
Acre e Amazonas) (LORENZI, 1992). Há registros de sua ocorrência em outros países:
Argentina (norte), Bolívia (sul), Paraguai e Peru (nordeste) (LEITE, 2005). A figura 2 mostra
o mapa de distribuição da espécie na América do Sul (Fig 2, p. 8).
De acordo com Pio Corrêa (1984), A. cearensis pode ser descrita como:
Árvore regular, até 15 m de altura e 50 cm de diâmetro; casca grossa, suberosa, gordurosa, aromática, vermelho-pardacenta e que se desprende em finas lâminas; ramos novos cilíndricos; folhas alternas, irregularmente pinadas, composta de 11-15 folíolos alternos, peciolados, ovados, arredondados no ápice e na base, inteiros, nervura dorsal saliente; flores brancacentas ou branco-amareladas, ou amarelo-pálido, aromáticas, pequenas, dispostas em racimos axilares, multiflorida; ovário longo-estipitado; fruto vagem achatada, escura, quase preta, contendo uma semente alada e rugosa. Fornece madeira de alburno branco-acinzentado e cerne amarelo-castanho, normalmente avermelhado e com tons verde-azeitona, assetinada, raios e poros fracamente visíveis.
Carvalho (1994) descreve A. cearensis como árvore caducifólia que demonstra
certas particularidades dependendo do habitat. Na Caatinga, seu porte é de 3-10 m de altura e
a copa é achatada e curta, todavia na Floresta Pluvial Tropical, esta planta pode atingir até 40
m, sendo sua copa alta, larga e umbeliforme (Fig 3, p. 10).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
7
Figura 2– Mapa de distribuição de espécimens de A. cearensis na América do Sul: 1. Nordeste (BRA); 2. Sudeste (BRA); 3 e 4. Centro-Sul (BRA); 5. Oeste (BRA, ARG e PAR) e 6. Oeste (BRA, BOL e PER). (LEITE, 2005).
A. cearensis recebe diferentes designações populares em diversas localidades:
ambaurana (SP), baru (SE), cumaru-do-ceará, cumaru-das-caatingas (MG), imburana-de-
cheiro (CE, BA, PE, RN e SE), louro-ingá, umburana (BA, RN), angelim (MS), cerejeira-
rajada, cumaré (CE, BA, PE, RN e PB), roble criollo (ARG), tumi (BOL) e palo trébol (PAR).
(CARVALHO, 1994).
No Nordeste, o período de floração de A. cearensis ocorre no início da estação seca,
entre maio e julho, e a frutificação se dá de agosto a outubro, após a perda de suas folhas
(MAIA, 2004) (Fig 4, p. 10). A floração e a frutificação são observadas após 10 anos de
plantio. No Brasil, os espécimens são encontrados numa faixa de altitude entre 20-800 m, em
regiões nas quais o índice pluviométrico e a temperatura média anual podem variar de 500-
1700 mm e 19-29 °C, respectivamente. Mesmo sendo uma espécie heliófila, A. cearensis
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
8
cresce favoravelmente em níveis de sombra acima de 56%, em sua fase inicial de
desenvolvimento (CARVALHO, 1994).
As plântulas de A. cearensis desenvolvem uma hipertrofia subterrânea, denominada
xilopódio, que contribui para reserva de água e nutrientes necessários para o desenvolvimento
da espécie, nos primeiros anos de vida (LIMA, 1989). Cunha e Ferreira (2003) confirmam que
a tuberosidade da raiz constitui-se numa estratégia adaptativa, a qual dota a planta de um alto
poder de rebrotamento, em caso de dano à parte aérea. O xilopódio apresenta-se carnoso,
napiforme e de coloração vermelha. Aos 9 meses, o tubérculo atinge 3 cm de diâmetro e emite
numerosas raízes fibrosas, longas e finas (CARVALHO, 1994) (Fig. 5, p. 11).
A. cearensis é freqüentemente confundida com a espécie Dipteryx odorata devido à
denominação popular comum cumaru, além de ser equivocadamente classificada como
pertencente aos gêneros Pterodon ou Stryphnodendron (PIO CORRÊA, 1984). Já o termo
imburana costuma provocar iguais equívocos na identificação, por se referir também à
Commiphora leptophloeos (Burseraceae), conhecida comumente como imburana-de-espinho
(MAIA, 2004) (Fig. 6, p. 11).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
9
Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira
A D
E
B C
F
Figura 3- Fotos digitais de diferentes partes de A. cearensis: (A) sementes, (B e C) flores, (D e E) frutos, (F) galhos. Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira
Figura 4- Fotos digitais de um espécimem adulto silvestre de A. cearensis: estação chuvosa (à esq.) e período de estiagem (à dir.)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
10
Fotos: Prof. Edilberto R. Silveira
Figura 5- Fotos digitais de A. cearensis cultivada: canteiro (à esq.) e espécimens colhidos aos 6 meses de desensvolvimento (à dir.)
Extraído de MAIA, 2004
Figura 6- Fotos de Dipterix odorata (à esq.) e Commiphora leptophloeos (à dir.).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
11
REFERÊNCIAS
BARROSO, G. M. Sistemática de angiospermas do Brasil. Viçosa: Imprensa Universitária-Universidade Federal de Viçosa, v. 3, 1991.
CARVALHO, P. E. R. Espécies florestais brasileiras: recomendações silviculturais, potencialidades e uso da madeira. Brasília: EMBRAPA, 1994.
CUNHA, M. C. L.; FERREIRA, R. A. Aspectos morfológicos da semente e do desenvolvimento da planta jovem de Amburana cearensis A.C. Smith - Cumaru - Leguminosae Papilionoideae. Rev. Bras. Sementes, v. 25, n. 2, p. 89-96, 2003.
LEITE, E. J. State-of-knowledge of Amburana cearensis (Fr. Allem.) A. C. Smith (Leguminosae: Papilionoideae) for genetic conservation in Brazil. J. Nat. Conservat., v. 13, p. 49-65, 2005.
LIMA, D. A. Plantas das caatingas. Rio de Janeiro: Academia Brasileira de Ciências, 1989. 243 p.
LORENZI, H. Árvores brasileiras: manual de identificação e cultivo de plantas arbóreas nativas do Brasil. Nova Odessa: Instituto Plantarum, 1992.
MAIA, G. N. Caatinga: árvores e arbustos e suas utilidades. São Paulo: D & Z Editora, 2004. 413 p.
PIO-CORRÊA, M. Dicionário de plantas úteis do Brasil e das exóticas cultivadas. Brasília: Ministério da Agricultura, 1984.
RIBEIRO, J. E. L. S.; HOPKINS, M. J. G.; VICENTINI, A.; SOTHERS, C. A.; COSTA, M. A. S.; BRITO, J. M.; SOUZA, M. A. D.; MARTINS, L. H. P.; LOHMANN, L. G.; ASSUNÇÃO, P. A. C. L.; PEREIRA, E. C.; SILVA, C. F.; MESQUITA, M. R.; PROCÓPIO, L. C. Flora da Reserva Ducke: guia de identificação das plantas vasculares de uma floresta de terra-firme na Amazônia Central. Manaus: INPA, 1999. 816 p.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
12
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA III. BIFLAVONÓIDES 3.1. Características fundamentais e Relevância
Os flavonóides figuram entre as classes de substâncias químicas de maior ocorrência
botânica, sendo contabilizados em números superiores a seis mil exemplares (HARBORNE e
WILLIAMS, 2000). Sua estrutura química é facilmente reconhecida pela presença de um
esqueleto aromático C6-C3-C6, um anel cromano (anel benzênico-A + anel heteronuclear-C)
ligado a um anel benzênico (anel B) (ROBBERS et al., 1997). Fisicamente, apresentam-se
geralmente como sólidos amarelos, justificando o emprego do termo grego flavus, porém são
encontrados também com coloração vermelha, azul e até mesmo incolor (SIMÕES et al.,
1999).
Biossinteticamente, os flavonóides são obtidos pela convergência de duas vias
biogenéticas formadas a partir da acetil-CoA e do ácido chiquímico, as quais geram
respectivamente os duas unidades fundamentais para a origem dos flavonóides: malonil-CoA
(3 moléculas) e p-cumaroil-CoA (ROBBERS et al., 1997).
Nas plantas, os flavonóides assumem importantes papéis fisiológicos como: defesa
contra insetos e microorganismos, proteção contra raios ultravioleta, ação alelopática, inibição
de enzimas e atração de agentes polinizadores, entre outros (HARBORNE e WILLIAMS,
2000).
Sob o ponto de vista econômico, os flavonóides despertam grande interesse
comercial por parte das indústrias alimentícias, corantes e sobretudo farmacêutica, devido às
suas comprovadas atividades farmacológicas: antiinflamatória, antioxidante, antitumoral,
antiviral, etc (HARBORNE e WILLIAMS, 2000).
As inúmeras possibilidades de arranjos estruturais, em virtude dos diferentes padrões
de oxigenação, metilação, glicosilação e dimerização dos flavonóides resultam numa gama
elevada de compostos flavonoídicos, os quais podem ser classificados nas seguintes
categorias: aurona, chalcona, flavana, flavanol, flavanona, flavanonol, flavona, flavonol,
isoflavona e antociano (Quadro 1, p. 14).
1. Auronóide- composto derivado da 2-benzilidenocumaranona, o qual pode exibir
estereoquímica (E) ou (Z).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
13
2. Chalconóide- composto formado pelo núcleo fundamental 1,3-diarilpropano, o qual pode
ser carbonilado, olefínico ou hidroxilado.
3. Flavana-estrutura química contendo uma fenila ligada ao anel benzopirano, na posição 2.
4. Flavanol- flavana hidroxilada na posição 3.
5. Flavanona (di-hidro-flavona)- flavonóide cetônico com carbonila na posição 4.
6. Flavanonol (di-hidro-flavonol)- flavanona hidroxilada na posição 3.
7. Flavona- anel heterocíclico com carbonila α,β-insaturada.
8. Flavonol- flavona hidroxilada na posição 3.
9. Isoflavonóide- flavonóide portando a fenila posicionada no carbono 3.
10. Antociano- flavonóide catiônico, cuja carga positiva se encontra posicionada no oxigênio
do anel heterocíclico.
Quadro 1- Esqueletos básicos das diferentes subclasses de flavonóides
Auronóide (1) Chalconóide (2) Flavana (3)
Flavanol (4) Flavanona (5)
Flavanonol (6) Flavona (7)
Flavonol (8) Antociano (10)Isoflavonóide (9)
O
O
23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
45
O
OH
236
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
O
23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
O
OH
23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
O
OH
23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'23
45
6
7
89
101'
2'
3'
4'
5'
6'
O
O
O+
23
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'
5'
6'
O
2
3
4
5
6 1
1'
2'
3'4'
5'
6'
α
β
β'
O
O
23
45
6
7
89
10
1' 2'
3'
4'5'
6'
AA
BB
CC
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
14
Os biflavonóides são espécies diméricas formadas por monômeros idênticos ou
distintos, os quais podem ainda ser mistos quanto à categoria das unidades e podem
apresentar vários tipos de conectividades entre si. A possiblidade de atropisomerismo
(estereoisomeria de eixo) entre os monômeros também contribui para a diversidade de
estruturas biflavonoídicas (SIMÕES et al., 1999).
Estima-se que a quantidade de biflavonóides seja superior a duzentas substâncias,
dispersas principalmente entre as plantas gimnospermas e angiospermas, das quais se
destacam as famílias Guttiferae, Ochnaceae e Anacardiaceae. Entre os gêneros, os
biflavonóides são abundantes nas espécies de Selaginella (Selaginellaceae), Calycopteris
(Combretaceae), Daphne (Thymelaeaceae), Lophira e Ochna (Ochnaceae) (BARBOSA,
2003).
A nomenclatura dos biflavonóides é feita de modo análogo a dos flavonóides
monoméricos, obedecendo a mesma ordem de numeração. No entanto, há duas possibilidades
de denominação dos anéis aromáticos: na primeira, as unidades são referidas através de
algarismos romanos (I e II), na segunda, a estrutura é subdividida em dois conjuntos de anéis
(1- A, B e C; 2- D, E e F). As posições são diferenciadas apenas pelo acréscimo de linhas
sobrescritas (”). Os carbonos 9 e 10 também podem ser chamados 8a e 4a, respectivamente
(SIMÕES et al., 1999).
O
O
O
O
OH
OH
CH3
OH O
OH
2
3
45
6
7
89
10
1'
2'
3'
4'5'
6'
2''3''
4''
5''6''
7''8''
9''
10''
1'''
2'''
3'''
4'''
5'''
6'''
A C
B
D
E
FO
O
O
OOH
OH
OHOH
OH
I-2
I-3
I-4I-5
I-6I-7
I-8I-9
I-10
I-1'
I-2'
I-3'
I-4'
I-5'
I-6'
II-2II-3
II-4
II-5II-6
II-7II-8
II-9
II-10
II-1'
II-2'
II-3'
II-4'
II-5'
II-6'
H
Figura 7- Estruturas químicas da biflavona amentoflavona, numeradas sob duas formas
Os biflavonóides são substâncias polares, solúveis em solventes hidrofílicos
(metanol, DMSO, piridina), por isso suas metodologias de isolamento, em geral, requerem a
aplicação de cromatografias de adsorção de fase reversa (octadecilsilano, ciano) e de exclusão
(Sephadex LH-20) (SIMÕES et al., 1999).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
15
3.2. Ressonância Magnética Nuclear de 13C Tendo em vista que o livro intitulado “Carbon-13 of Flavonoids” (AGRAWAL,
1989), uma das fontes bibliográficas mais completas de dados de RMN 13C de biflavonóides,
encontrava-se bastante defasado quanto à descoberta de dezenas de novos exemplares da
classe, foi efetuada uma minuciosa revisão bibliográfica de biflavonóides, visando uma
atualização dos dados espectroscópicos de 13C das novas entidades químicas desta classe.
O Scifinder, uma base de dados que reúne informações registradas no Chemical
Abstracts, foi a ferramenta de pesquisa empregada para catalogar os 188 biflavonóides
naturais, de origem vegetal, descritos na literatura no período de 1988-2006, resultando num
banco de dados cujos deslocamentos químicos estão localizados juntos aos respectivos
carbonos, existentes em cada estrutura química. É válido ressaltar que, no levantamento, não
constam biflavonóides inéditos cujos dados de RMN 13C não estavam disponibilizados nas
publicações correspondentes ou ainda de títulos cuja aquisicão tornou-se impraticável ou
inacessível, em virtude da parca distribuição do periódico. Além disso, foram incluídos
também biflavonóides conhecidos cujos dados não haviam sido descritos entre os 69
biflavonóides da referência supra-citada.
Na tabela 1 (p. 46), foram listados os números correspondentes às estruturas
biflavonoídicas, as quais foram divididas em subclasses (Quadro 1, p. 14) e classificadas por
tipo de conectividade, juntamente com o nome da espécie botânica da qual foi obtida a
substância, a referência consultada e o solvente deuterado utilizado no experimento.
A seguir são apresentados os deslocamentos químicos de RMN 13C característicos
de cada subclasse de flavonóides e comentados os possíveis efeitos de (des)blindagem que
justificam os valores encontrados. Esta discussão foi baseada no livro “Carbon-13 of
Flavonoids” (AGRAWAL, 1989)
3.2.1. Subclasses de biflavonóides
a. Aurona
A absorção da carbonila (C-4) é registrada geralmente entre δ 185-178. Os carbonos
C-2 (monohidrogenado e exocíclico- δC-2 148-145) e C-3 (não-hidrogenado- δC-3 113-105) são
carbonos olefínicos, os quais apresentam uma significativa diferença de deslocamento
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
16
químico devido à oxigenação do C-3 e à conjugação do oxigênio com a dupla-ligação,
aumentando a densidade eletrônica do C-2 (proteção).
H
109,9
145,5
179,0166,8
97,6
167,4
90,2158,1
102,9
122,4
115,8
145,7 147,5
120,8127,3
109,5
145,9180,1
165,8
108,7165,2
90,5
158,1
102,9
123,7
117,5145,5
147,5
115,8124,0
O
OH
O
OH OH
OH
O
OO
OH
OH OH
Biauronóide
165
103,8162,5
119
12
153,2
OH
OH
127,0131,4
116,2
160,5114,7
,7
,3
134,3
194,1
118,7
144,8
132,9
132,3
5,1
165,0
103,0113,8
166,6
108,3
133,2
39,9
29,9
OH
OHO
OH O
OH
205,6
116,4
Bichalconóide
b. Chalcona
Todos os sinais de uma chalcona são observados entre δ 195-90, sendo a carbonila
facilmente identificada pela absorção entre δ 195-187. O sinal do carbono C-β em δ 147-136
para um carbono sp2 não-funcionalizado é justificado pelo efeito mesomérico retirador da
carbonila. O sinal de C-α aparece em δ 129-116, como não é um valor de δ característico, sua
atribuição é feita sob auxílio do espectro de HMBC. Nas di-hidrochalconas (chalcanona), a
absorção da carbonila se dá em torno de δ 207-203, porque não ocorre blindagem da ligação
dupla como ocorre nas chalconas. Os deslocamentos químicos dos carbonos C- α e C-β,
ambos metilênicos, são observados numa região compatível com a de carbonos sp3: δ 47-39 e
32-29, respectivamente.
c. Flavana
O anel heteronuclear de uma flavana é desprovido de carbonila, logo os sinais
associados aos carbonos C-2, C-3 e C-4 são todos de carbonos sp3 (δC-2 79-74; δC-3 31-29 e
δC-4 26-19). O efeito indutivo retirador do oxigênio, elemento entre os mais eletronegativos,
justifica o maior deslocamento químico para C-2.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
17
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH78,166,0
29,2100,2
157,9
96,3
158,0
96,3 157,6132,3116,2 145,2
145,4
120,0
125,2
82,368,4
27,4101,2
156,996,3
155,2
108,1 153,3132,5
114,9
146,1
146,1116,0
119,9
Biflavanol
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OCH3
OH
OCH3
128,5
126,1
140,8
73,937,6
58,9
105,1
152,0
109,1
152,7136,7
151,1
70,9
33,3
137,3132,0
184,4
105,0
171,286,9 56,7
61,4
60,9
54,5140,7
125,8
128,5128,0
105,6
Biflavana
d. Flavanol
Em virtude de sua hidroxilação, o C-3 (δ 70-65) de um flavanol torna-se nitidamente
desblindado, quando comparado ao carbono correlato de uma flavana. Contudo, seu
deslocamento químico ainda mostra-se inferior (∆δ= 12-15) ao exibido por C-2 (δ 82-77), em
virtude deste último carbono, também monoxigenado, sofrer maior influência dos efeitos α e
β de desproteção do anel B. O carbono metilênico (C-4) apresenta um sutil incremento no seu
deslocamento químico (δ 33-24), em relação ao C-4 da flavana (δ 26-19), em razão do efeito
β de desproteção da hidroxila .
e. Flavanona
Tendo em vista que as flavanonas possuem o anel C saturado e um grupo cetona
postado na posição 4, os deslocamentos químicos característicos deste tipo de flavonóides são
atribuídos ao carbono oximetínico (C-2: δ 80-71), ao carbono metilênico (C-3: δ 47-39), e à
carbonila (C-4: δ 198-186). No entanto, a absorção de C-2 depende de substituintes presentes
nas posições 2’ e 6’ (anel B). Sendo o anel B não substituído nestas posições, a absorção fica
em torno de δ 79, enquanto que C-2’ ou C-6’ oxigenados, C-2 se torna mais blindado (δ 75)
em razão de um efeito γ de proteção, exercido pelos oxigênios. A absorção da carbonila sofre
forte desblindagem por uma hidroxila posicionada no C-5, devido à possibilidade de
quelação.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
18
H
O
O
OCH3
OCH3
OH
H3CO
OCH3
O
O
OCH3
OH
H3CO
OCH3
89,0
89,0
78,2
78,2
200,4162,9
104,9
161,3
92,3 158,5
102,7
102,7
122,7
130,3
114,5
162,2
200,5163,8
98,1
164,8
102,6156,7
121,7
108,8
146,4152,7
111,8
119,7
56,0
56,2
55,5
56,3
56,4
56,0
55,3
Biflavanonol
105,7
OO
OO
O
OH
OCH3
H3CO
OCH3
60,4
59,986,2
194,6
109,2131,7
111,6
166,7
165,9
132,7
86,4
200,1
109,3164,9
97,3
167,5
99,4166,0
122,5
129,2
114,6
160,7
56,3
55,5
158,5
116,0
129,6
56,2
Biflavanona
f. Flavanonol
A hidroxilação na posição 3 produz uma desblindagem no carbono C-3 (∆δ +30),
mas também no carbono C-2 (∆δ +5), em relação a uma flavanona. O deslocamento químico
da carbonila permanece praticamente inalterado.
g. Flavona
A dupla-ligação entre os carbonos C-2 e C-3 provoca um incremento significativo
nos valores de deslocamento químico destes carbonos (∆δ +86 e + 64, respectivamente),
quando comparados aos registrados para flavanona. C-3 apresenta absorção compatível com a
de carbono sp2 (δ 113-102), todavia C-2 em razão de ser oxigenado exibe maior desblindagem
(δ 166-157). Como a carbonila se torna α,β-insaturada, percebe-se uma blindagem em relação
ao C-4 de uma flavanona (∆δ -13), atribuída ao efeito mesomérico doador, produzido pela
conjugação com o enol-éter (C-4: δ 183-175).
O
OOH
OH
OH
OCH3
O
OOH
OH
OCH3
OH
146,3135,7
176,3
158,4
97,8
162,1
104,5 153,8
102,9
30,7
123,6
129,2
113,9
160,3 55,3
Biflavonol
102,
O
O
OH
OH
OHO
O
OH
OH
OH
OH
OH
166,5
106,4
181,7
161,1
98,6
163,7
93,0157,2
9
124,0
118,7
144,3
148,3
114,6
120,5
163,8
102,4
181,1
160,398,3
161,4
103,5 154,3
103,2
121,7
113,5
145,7149,4
115,5
118,9
Biflavona
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
19
h. Flavonol
A introdução de uma hidroxila no carbono C-3 afeta sensivelmente as absorções de
C-2 (∆δ +17) e C-3 (∆δ +32) e apenas levemente C-4 (∆δ +5), em relação aos deslocamentos
químicos observados para uma flavona. Entretanto, até mesmo no carbono C-9 observa-se o
efeito da hidroxilação (∆δ -5).
i. Isoflavona
Os deslocamentos químicos dos carbonos C-2 e C-3 são particularmente afetados
pela troca da posição de ligação da fenila: δ 155-150 e 126-122, respectivamente. Isto é, os
carbonos sofrem efeitos opostos, (∆δC2 +10 e ∆δC3 -10). A absorção da carbonila (C-4) não se
altera (δ 181-174), a menos que exista uma hidroxila no carbono C-2’, a qual pode provocar
uma desblidagem (∆δC4 +3), decorrente da possível formação de ponte de hidrogênio
intramolecular entre a hidroxila e a carbonila. No entanto, a técnica de RMN 13C- DEPT135
permite a identificação inequívoca de uma isoflavona através da exibição de um sinal em δ
155-150, associado a carbono sp2 oxigenado e hidrogenado (C-2).
111,5
61,0
194,7
165,3
97,3
167,1
95,9160,9
100,9 116,3
161,499,2
156,6
110,5128,1
156,3
122,1
181,9163,6
100,0
165,2
94,5
159,0
105,9
110,7
157,8
104,8
160,6
120,3
132,7
O
OH
OH
O
OHOH
O O
OH
OH
O
OH
Bi-isoflavonóide
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
20
Auronóide-flavanol
OO
OH
OH
OH
OHOO
OH
OH
82,286,5
28,8102,7
163,2
91,1
160,7
103,8
153,3
130,9
129,0
116,0
158,192,7 95,9
197,2
104,6
158,6
97,2169,9
91,3
173,6
125,4130,2
116,0
159,1
OO
OH
OH
OH
OHOO
OH
OH
82,168,5
28,9102,9
163,1
91,1
160,7
104,1
153,2
130,8
128,7
115,9
158,092,4 96,2
196,7
104,6
158,6
97,7170,1
91,2
173,6
125,5130,1
116,1
159,1
1 2
Auronóide-flavanona 114,5
10897,5
90,5122,0
179,1167,0
167,5
158,2
102,9
123,7
115,9
145,5147,4
145,9
78,5
42
104
94,5
114,5
115,5
118
196,3
101,6161,6164,6
161,1
145,2
145,8
O
OOH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH OH
145,2
178,9166,8
97,6
167,4
90,2158,1
102,9
122,4
115,9
145,7 146,3120,7
127,4
109,9
106,1
196,3
78,4
42,2
161,6164,6
94,5
161,1
101,6
129,5
114,3
145,2
145,8
115,3
117,9
O
O
OH OH
OH
OH
O
OOH
OH
OH OH
3 4
Biauronóide
O
O
OCH3
O OCH3
O
H3CO OCH3
OCH3
H3CO
OCH3
91,3
197,5158,5
92,2
169,2
88,3174,5
106,2
41,6
127,2
132,2
113,4
158,4
55,2
55,6
56,2
109,7
194,4
160,1
89,4
169,4103,4
171,6
105,3
40,852,6
125,6
132,1
113,9158,9
56,3
56,6 56,7
O
O
OCH3
O OCH3
O
H3CO OCH3
OCH3
H3CO
OCH3
91,1
197,7158,5
92,2
169,1
88,3174,4
106,4
41,4
126,9
132,2
113,4
158,4
55,5
56,1
56,4
110,0
194,3
160,2
89,5
169,3103,7
172,0
105,4
40,952,8
125,7
132,1
113,9158,9
56,6
56,6 56,7 5 6
109,9
145,5
179,0166,8
97,6
167,4
90,2158,1
102,9
122,4
115,8
145,7 147,5
120,8127,3
109,5
145,9180,1
165,8
108,7165,2
90,5
158,1
102,9
123,7
117,5145,5
147,5
115,8124,0
O
OH
O
OH OH
OH
O
OOH
OH
OH OH
7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
21
Bichalconóide
133,5128,3
1115,6
157,2
86,160,8
83,955,7
36,9 204,0114,9
166,7
103,4
165,7
130,6
130,9116,1
156,5
OOH
O
OH
OH
OH
OH
OH
119,1158,9
130,9
158,0
108,3
133,9
117,2157,1
103,8
159,4
107,9130,3
81,855,5
84,057,0
203,7 197,7130,2
132,0
116,0
163,0
114,7
166,4103,3
165,7
108,8 134,7
O
O
OHOH
O
OH
OH
OH
OH
129,8
129,5
115,4
157,9
8 9
131,0129,0
116,0
158,4
84,956,1
83,957,3
202,3 203,4114,1
166,9
103,4
166,5
114,4
166,1103,1
165,8
108,7 134,4
O
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
129,7
129,6
115,2
157,8
109,0
134,2
129,2130,1
116,2
159,0
85,051,8
85,051,8
191,6 191,6115,2
164,2
103,4
165,4
115,2
164,2103,4
165,4
111,3 129,9
O
O
OH
O
OH
OH
OH
OH
OH
129,2130,1
116,2
159,0
111,3
129,9
10 11
O
O OH
OH
OH
OCH3
OH
OH
OCH3
OH
162,7
115,9
132,7130,7
197,6144,6
126,4113,3
146,6142,5
147,1133,135,8
199,0
128,9132,9
116,1
163,750,5
123,2
127,8
147,0
139,7
146,6
120,1
111,4
60,6
60,4
114,6
167,5
103,9
166,7
108,8133,2
192,8
119,3
144,8
129,3
126,9
132,1
132,1
158,9111,0
113,8
165,7104,1
163,2
109,7
134,7 201,4
57,6
88,6129,3
128,7
116,5158,9
OH
OH
OH O
O
O
OH
OH
12 13
129,3
126,9132,1
158,9111,0
132,1
119,3
144,8
192,8
114,7
167,7
103,9
166,7
108,8
133,2
57,688,6
201,4
113,8
165,6
104,0163,2
109,7
134,7
129,3
128,7
116,5158,9
OH
O
OO
OH
OH
OH
OH
137,9
120,7129,7
153,0111,6
126,6
40,5
30,9
204,8
113,8
165,5
103,5
165,5
108,7
133,6
156,5
114,4
196,4
114,4
166,5
103,5166,5
109,1
136,5
121,7
130,1
116,5159,9OH
O
OO
OH
OH
OH
OH 14 15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
22
O
O
OH O
OH
OOH
OH
H
129,3126,9
132,1
158,9111,0
132,1
144,8
119,3
192,8
114,7167,7
103,9
166,7
108,8
133,2129,3
128,7
116,5
158,9
88,6
57,6
201,4
113,8165,6
104,0
163,2
109,7
134,7
134,4
125,7127,2
159,1110,0
130,2
40,2
29,5
204,7
113,8
165,1
103,5
166,4
108,7
133,5
87,057,8
201,5
113,6
166,1
103,8
167,2
109,5
134,6
132,5
128,4
116,2158,4
OH
O
OO
OH
OH
OH
OH 16 17
114,3
167,5103,7
165,6
109,0
133,2
128,2
132,6
110,0163,9
128,9126,3
134,4
127,6
116,0157,8
116,8
157,9
103,2159,2
107,9
130,2
145,3
117,7
192,4
88,7
56,9
81,156,8
OH
OOH
OH O OCH3
OH
OH
O
O
OH O
OH
OOH
OH
OH
H
129,4128,7
132,0
163,7111,3
133,4
144,9
119,2
192,8
114,5167,5
103,7
165,7
108,1
133,4127,5
129,3
115,5
158,4
96,7
91,1200,8
112,8167,5
103,1
165,5
108,1
136,8
18 19
127,7
131,6
116,9161,1
145,1123,0
190,6 102,5155,0 115,4
167,199,7158,6
121,7
129,3
116,7
159,5
153,5113,7 196,7
115,4 166,2
103,3
166,3109,1
136,8
O
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
OH
O
OH
O
OH
OHO
OH
OH
OH
132,1129,5
115,9
156,4
30,4
45,0
203,0
101,7
158,0
111,5166,1
99,4
165,7121,3
129,1 116,5
159,3153,3
113,3
196,5 115,3
166,1
103,3
166,1
109,0
136,5
20 21
153,2
136,7113,6
195,7
115,3
158,7
115,9
166,2
103,3
166,3
109,1
121,7
129,2 116,7
159,5O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH O
OH
H
167,0
154,9
155,0
101,5190,6
123,0
145,1
125,7
131,6
116,1
166,1
OH OCH3 OH
O
OH OCH3
OH
40,0
27,3
37,2
29,5
43,1123,2
155,9
99,7
157,5
120,8130,1
138,3
132,0
116,2
163,6
124,8
159,6
99,8
157,3
107,5
131,1130,1
130,0
115,7
155,1
202,1
55,6 55,7
22 23
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
23
127,0131,4
116,2
160,5114,7
165,7
103,8162,5
119,3
134,3
194,1
118,7
144,8
132,9
132,3
125,1
153,2
165,0
103,0113,8
166,6
108,3
133,2
39,9
29,9
OH
OHO
OH
OH
O
OH
OH
205,6
116,4
Bichalconóide
144,0
152,8
118,2
128,4
128,4122,6
117,2
143,2
192,4
165,6
103,7
167,3
108,8
114,2
130,9
160,9
117,2
129,8
129,8 143,2
117,2
192,4
114,2165,7
103,7
167,3
108,8131,5 OH
OHO
O
OH
OOH
OH
24 25
127,0131,4
116,2
160,6114,2
166,4
103,7163,1
116,2
134,3
192,6
117,9
144,9
127,2
132,3
126,2
158,4
167,1
103,2114,0
165,1
108,2
132,9
118,1
144,7
OH
OHO
OH
OH
O
OH
OH
192,4
130,7
116,9
O
OH
OH
O
OH
OHO
OH
129,3
130,9
116,2
161,5
165,2
103,2113,9
166,7
108,3
132,9
192,2
119,2
143,9
129,3131,5
116,2
160,6113,5
163,9
104,9157,7
134,9
124,6
192,3
117,7
145,4
26 27
O
OH
H3CO
O
OH
OHO
OH
129,4
130,9
116,0
161,5
167,3
103,5113,4
167,2
109,2
132,7
191,7
119,5
143,4
126,6131,7
116,4
161,4113,5
164,6
101,8159,4
135,5
124,1
192,4
117,3
145,8
56,2
O
OH
H3CO
O
OCH3
OHO
OH
129,4
130,7
115,8
158,6
166,6
101,1113,9
166,1
107,7
130,9
191,5
118,6
143,8
128,9130,3
116,0
160,9113,0
164,6
101,5158,8
135,1
122,8
191,5
117,4
144,9
55,6 56,2
28 29
O
OH
H3CO
O
OH
OH
OOH
114,5
132,2
101,2
166,6
116,2
128,4
162,4130,9
192,5
118,3
144,7
127,1131,0
116,3
160,4109,9
166,6
105,4166,6
137,2
123,2
189,8
118,5
143,0
56,6 107,5
166,6
O
O
CH3
CH3
O
OH
OH
CH3
OH O
OH
H
H
76,842,0
38,3
52,3 29,0
30,5
29,2
135,6
116,4115,6
154,3
208,5 112,4163,9
108,9
161,4
109,4
130,9
16,7
32,3
76,1
27,1
128,5
131,0
158,3
128,7113,5
163,9115,7
160,5109,6
129,7
192,4
118,4
144,4
27,3
30 31
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
24
Biflavana 128,0
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OCH3
OH
OCH3
128,5
126,1
140,8
73,937,6
58,9
105,1
152,0
109,1
152,7136,7
151,1
70,9
33,3
137,3132,0
184,4
105,0
171,286,9 56,7
61,4
60,9
54,5140,7
125,8
128,5128,0
105,6
Biflavana
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OH
OH
OCH3
OCH3
127,9
128,4
126,2
140,6
72,938,6
56,9
101,6
151,6
104,3
148,2130,5
149,7
70,6
32,2
138,2139,1
181,0
131,4
158,687,1 60,4
61,2
53,1141,1
126,2
128,5126,2
103,2
60,2
32 33
OO
O
O
OHH3CO
H3CO
OH
OCH3
H3CO
128,0
128,6
126,1
140,5
73,937,6
59,0
104,2
152,1
108,6
152,2136,5
151,6
76,5
36,6
58,6 115,9 43,2
109,185,2
166,1139,4
126,2
128,5
128,4
60,9
61,2
54,6
51,4
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OH
H3CO
OCH3
OCH3
128,0
128,5
126,2
141,1
73,737,5
66,9
99,4
151,7
104,1
148,2139,5
151,0
70,8
33,1
137,5132,1
181,6
131,3
157,987,6 61,7
61,0
53,6140,5
125,8
128,6128,0
56,1
61,0
103,3
34 35
OO
OCH3
OCH3
O
OCH3
OCH3
OCH3
O
OH
74,137,7
59,0
152,1
109,4
152,6140,0
151,2
105,1
140,8
126,2
128,6
128,0
71,0
33,4
138,2136,8
159,088,4
104,4
132,0
61,4
61,0
61,0
61,6
54,3140,8
125,9
128,6
128,1
O
O
OCH3
O
O
OH
OCH3
H3CO
OCH3
OCH3
128,0
128,4
126,1
140,7
73,133,1
67,0
105,0
149,9
105,4
148,3128,0
148,6
70,6
31,7
138,8140,1
180,8
131,1
158,286,1 60,5
61,6
52,7140,7
126,4
128,4128,0
103,3
55,9
60,5
36 37
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
25
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OH
H3CO
OCH3
OCH3
127,9
128,3
126,2
140,6
73,334,0
66,6
98,5
151,7
104,2
148,9130,7
149,8
70,7
32,2
138,4139,2
180,9
131,2
158,987,1 60,4
61,3
53,1140,8
126,4
128,3126,4
103,1
55,2
60,2
OO
OCH3
OCH3
O
OCH3
OCH3
OCH3
O
H3CO
73,735,5
66,7
151,1
108,8
152,4139,9
152,0
102,1
140,8
125,7
128,3
128,5
70,7
33,4
137,4
181,4
136,4
158,988,3
103,5
131,9
61,5
60,8
60,8
61,3
54,2140,9
126,1
128,4
128,5
56,2
38 39
OO
O
O
OHH3CO
H3CO
OH
OCH3
OCH3
H3CO
128,0
128,4
126,2
140,7
74,137,6
58,3
104,2
152,2
108,6
151,0136,7
151,9
76,6
36,6
58,9 113,9
193,7
84,2
108,087,7
164,8139,4
126,0
128,5
128,4
60,9
61,3
54,8
53,5
62,1
OO
O
O
OHH3CO
H3CO
OH
OCH3
OCH3
H3CO
128,0
128,6
126,1
140,5
73,937,6
59,0
104,3
151,2
109,6
152,2136,8
151,7
76,6
36,8
59,2 113,7
192,9
78,6
108,986,1
166,7139,4
126,0
128,6
128,0
60,9
61,4
55,7
51,7
59,4
40 41
OO
O
O
OHH3CO
H3CO
OCH3
OCH3
OCH3
H3CO
128,0
128,5
126,1
140,6
74,037,6
58,6
104,1
152,3
108,9
151,0136,7
151,7
76,4
35,1
66,2 111,6
191,5
84,1
107,887,3
166,1139,6
125,8
128,6
128,3
60,9
61,2
54,7
53,4
62,1
57,0
74,0
37,7
59,0
151,4
109,9
152,2136,9
151,7
104,6
140,6
126,2
128,6
128,4
76,4
34,5
66,7
190,9
79,3
109,685,9
167,9
111,7
139,7126,1
128,7
128,4
OH3CO
OCH3
OCH3
OOCH3
O
OHH3CO
H3COO
61,4
61,0
56,9
59,8
52,255,6
42 43
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
26
74,0
34,6
67,5
151,9
109,4
152,3136,7
151,9
102,6
140,9
126,1
128,6
128,3
76,3
34,5
66,7
191,2
79,2
109,286,2
168,2
111,4
139,8126,3
128,7
128,1
OH3CO
OCH3
OCH3
OOCH3
O
OCH3H3CO
H3COO
56,7
61,4
61,0
59,7
51,955,7
44 Biflavanol
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH78,166,0
29,2100,2
157,9
96,3
158,0
96,3 157,6132,3116,2 145,2
145,4
120,0
125,2
82,368,4
27,4101,2
156,996,3
155,2
108,1153,3
132,5
114,9
146,1
146,1116,0
119,9
O
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH78,065,8
29,399,8
157,7
96,0
157,7
96,2 157,3131,7115,8 145,5
145,0
119,9
125,2
79,466,7
28,9100,5
156,996,3
154,9
108,1153,6
131,9
115,0
145,0
145,5116,0
119,6
45 46
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
22,3
25,761,4
62,3
70,3
71,073,7
74,0
74,5
75,2
76,5
76,977,2
77,2
76,9
79,5
94,8
96,1
96,4
99,0
100,7
102,7
103,0
107,8
113,1
114,7116,3
120,5119,6
124,2
144,2
144,6 145,4
145,6
153,9
154,0
155,7
155,9
157,0
157,3
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH76,0
69,975,0
113,6122,9
110,3
133,1
145,8144,5
131,1
115,5
145,1
145,1
116,7
119,8
47 48
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
79,5
67,2
74,0115,1119,3
109,6
132,7
74,670,0
76,0123,2112,9
109,6
133,3
44,4
72,981,3
106,8
114,2
119,5123,7
128,5
129,8138,9 150,0
153,5
160,3
64,5
68,974,2
106,3112,4
114,4
129,4
129,7
136,3
137,5149,2
155,5
160,3
O
CH3COO
CH3COO
H3COOCH3
OCH3
O
OCH3
H3CO
OCOCH3
OCH3
49 50
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
27
45,6
74,681,5
106,4
114,0
119,3124,9
128,5
129,8138,6 149,9
153,5
160,6
65,2
68,876,0
107,2113,9
114,2
129,1
129,6
136,8
137,5149,8
155,2
159,9
O
CH3COO
CH3COO
H3COOCH3
OCH3
O
OCH3
H3CO
OCOCH3
OCH3
42,9
73,5
74,7
107,1
114,1
114,4
115,4125,4
128,5
130,0138,9 150,3
153,3
160,3
64,5
67,874,2
108,2111,3
129,4
129,1
140,0
137,8151,1
155,0
160,1
O
CH3COO
CH3COO
H3COOCH3
OCH3
O
OCH3
H3CO
OCOCH3
OCH3
51 52
36,9
77,7
80,7
105,5
113,8
119,0124,1
128,5
132,3138,6 149,0
153,4
160,4
65,6
68,775,8
111,0114,1
115,1
129,2
130,1
136,8
137,5149,7
155,2
159,8
O
CH3COOCH3COO
H3COOCH3
OCH3
O
OCH3
H3CO
OCH3
OCH3
53 Biflavanona
OO
OHO
O
OH
OCH3
H3CO
OCH3
60,4
59,986,2
194,6
109,2131,7
111,6
166,7
105,7165,9
132,7
86,4
200,1
109,3164,9
97,3
167,5
99,4166,0
122,5
129,2
114,6
160,7
56,3
55,5
158,5
116,0
129,6
56,2
OO
OHO
O
OH
OCH3
H3CO
OCH3
OH
59,2
59,284,5
198,2
108,6164,6
96,6
166,4
99,3165,6
132,0
84,5
198,2
108,6 164,6
96,6
166,4
99,3165,6
122,5
129,2
114,6
160,7
55,7
55,3
155,6
115,3
128,3
55,3
54 55
7743
96
95
114,5
116,5
7942103,5
94,5
114,5
115,5
118
196,3161,6
164,6
161,1
101,6
129,5 145,2145,8
O
OH
OOH
OHOH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
O
O
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH
H
H196,7
196,848,282,4
164,4
96,1
168,5
97,4
165,5
102,7
130,8
129,0115,2
159,8
48,282,4
165,5
96,1
168,5
97,4
164,3
102,8
130,2
130,8
116,6 162,1
55,9
56 57
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
28
O
O
O
O
OCH3
OH
OH
OH
OH
OH
H
H196,0
198,550,882,9
165,1
96,4
168,3
97,1
165,4
103,8
130,2
128,6114,7
158,6
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165,1
96,0
168,2
97,1
163,3
105,0
130,1
128,5
116,3 161,3
55,7
162,095,0
166,3
96,0
163,6101,4
196,5
47,381,2
128,0
128,7
114,6
157,5
162,6
95,2101,4
165,1
101,4
159,6 78,0
195,6
130,8
126,8
113,6
158,9
55,1
42,6
O
O
OCH3
OH
OH
O
OOH
OH
OH
58 59
78,542,1
196,2
163,595,8
166,6
101,8
127,0
125,6
155,0
115,7
130,2
162,995,0 128,8
O
OH
OH
O
OH
OOH
OH O
OH
79,3
43,5
196,9
103,2166,396,9
167,4
95,9 164,1 132,3
121,5
142,8
150,5118,4
125,5
164,4
105,1
183,1
105,4 163,499,9
165,0
94,8158,8
126,0
129,1162,1
117,5
OOH
OH O
OH
O
O
O
OH
OH 60 61
79,5
43,5
197,4
103,7165,095,6
168,3
94,6 164,0 132,0
121,0
143,6
150,5118,2
124,956,2
79,4
43,5
196,9
103,2 165,396,9
167,4
95,9164,2
134,0
129,0159,2
117,4
OH3CO
OH O
OH
O
O
O
OH
OH
78,7
42,4
196,9101,8
160,1
95,6
166,8
95,9 160,1 129,0
128,0
115,1
128,0
121,0
157,7
77,9
41,5
196,5102,0160,1
102,0
164,7
95,1 160,1
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127,3
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Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
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71 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
30
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CH3
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28,6
123,1
129,2116,8
162,0
OOCH3
CH3
O
OH
OH
O
OH
OOH
H3CO
96 97
165,1103,7
183,1
104,8163,4
99,8
164,8
94,8158,9
122,4
132,0
124,0
161,9
112,3
129,3
56,3
165,0104,7
183,6
105,4156,9
106,0
157,6 105,7
155,0
116,0129,2
79,2
28,5
28,6
123,1
129,0
116,8
161,7
OOCH3
CH3
O
OH
OH
O
OCH3
OOH
OH
O O
O
CH3
CH3
OH
OCH
O
OOH
H3CO
OH
165,6
104,5
183,5
106,3163,3
99,0
166,8
93,5 159,0123,4
132,8
120,8
160,5
117,7
129,1
165,1
104,6
183,0
106,0157,3
106,5
158,2104,7
155,6
116,2129,6
79,4
28,7
28,9
124,5
129,2
115,6
164,0
56,6
56,2
98 99
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
33
165,4
104,4
183,2
105,6163,5
100,0
165,2
95,0 159,1123,4 121,9
160,5
117,7
128,8
19,0
132,8
165,1
103,8
183,7
105,3160,4
110,9
162,6105,3
154,8
123,5
129,3
116,9
162,0
77,1
148,2
30,0
110,8
O
OOH
OH
OH
CH2
CH3OH
O
OOH
OH
OH
O O
O
CH3
CH3
OH
OH
O
OOH
H3CO
OCH3
165,3
104,0
183,5
106,2163,4
99,0
166,9
93,6 159,0123,4
132,3
122,7
162,1
112,6
129,4
165,3
104,0
183,8
105,8157,1
106,3
157,9105,1
155,2
116,2129,5
79,4
28,7
28,9
124,2
129,3
117,1
162,2
56,7
56,6
100 101
163,1
104,8
182,5
105,0161,1
99,9
166,1
94,7157,7 125,1
124,8121,4
118,8
154,7 144,4
116,5
161,0128,4
125,8
163,4105,0
182,5
104,7161,1
99,9
166,1
94,7157,4
OO
OH
OH
OH O
O
OH
OH
O
162,9
104,9
182,4
104,1162,7
99,5
165,8
94,7158,2 124,7
125,3121,2
113,6
154,9143,3
161,3
55,1
116,2128,5
125,3
163,3105,1
182,4
104,1162,9
99,5
165,9
94,7158,2O
OH
OH
O
O
O
OCH3
OH
OH O
102 103
163,5
103,7
161,9109,2
166,494,5
158,0
104,2
121,1161,3
116,2
128,9
182,8
91,7
24,9
71,2
25,7
26,1
116,1
157,5
97,5
163,9102,8
181,8
161,593,5
120,9128,5
161,3
104,1
164,2
O O
OH
OHO
O
O
OH
OCH3
CH3
OH
163,1
103,9
181,7
161,3
98,9
162,2
94,0 157,1
103,8
124,1
128,3
115,3
161,4
O
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
164,2
102,6182,1
153,1
124,7 157,3
104,1
121,1
128,5
116,0
160,6
94,6
153,7
104 105
O
O
O
O
OH
OH
O
OH
OH OH163,3
103,7
181,6
161,2
99,2
162,9
94,0 157,2
103,6
124,6
128,0
115,5
161,4
164,2102,8
181,7
156,9
98,9157,7
120,7 148,9
104,0
121,1128,4
115,8
160,9
O
O
H3CO
OH O
O
OH O
O
OH
H163,5
161,6
165,4
157,9
104,2
124,6161,2
104,498,2
92,9
128,8
115,7
163,5
181,8
157,4156,9121,4
149,1
103,1
120,9
161,4
103,1
99,4
128,2
116,1
56,2
106 107
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
34
O
O
H3CO
OH O
O
OH O
O
OCH3
H163,5
182,1
161,6
165,4
157,9
104,2
124,6161,2
104,498,2
92,9
128,8
115,7
163,1
181,8
157,4156,9121,4
149,1
103,1
120,8
162,1
103,1
99,4
128,1
114,6
55,8
56,2
O
O
O
O
OH
OCH3
H3CO
OH
OH
OH
164,4
103,7181,2 159,5
102,8166,7
94,1157,2
104,3
121,2
128,3
116,2
161,7
163,6
103,7182,5161,2
102,5
163,2
95,5154,2
102,2
120,9
128,3116,2
162,2
56,5
56,5
108 109
O
O
OCH3
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
165,0
105,6
183,5161,8
162,9
95,0158,6
104,6
123,6
129,1
124,5 56,1
164,2
164,7
105,2
183,2
161,7
103,9
156,6
104,0
103,9
128,9
116,8
161,8
104,6162,9 100,1
O
O
OCH3
OH
OH
O
OCH3
O
OH
OH
163,5
103,9
182,5160,199,7
162,8
94,0157,2
104,1
123,4
128,8
123,5
56,0163,7
163,3
103,7
182,3
161,1
99,899,2
155,3
104,0
123,4
128,3
123,5
163,556,0
110 111
OO
O
OH
OH OCH3
OH
H3CO
O
OH
163,2
102,2
181,6161,2
107,5
170,396,2
157,2
102,2
121,8
128,8116,4
159,1163,2
102,7
182,2
161,4
101,5
169,6
102,5
154,8
101,7
122,0
128,5
116,1
160,7
56,5
56,5
182,4
163,9 162,6
161,4
161,2
155,2
128,1
121,5116,2
104,1
103,0 98,9
182,4
163,5
163,0
162,6
161,4
155,1
128,3
123,1114,9
104,2103,798,9
98,7
98,7
55,9
O
O OH
OH
OHO
OH O
OH
OCH3
112 113
99,8
76,469,6
77,0
60,6
73,2
163,0103,7
160,9
98,8
163,0
98,8 154,9
103,8
124,1160,2
116,6
127,7
182,1
O
O
O
OH
OH
OOH
OHOH
OH
O
OOH
OH
OH
163,5
102,6
182,1160,9
98,9
163,5
98,6154,8
103,7
121,3
128,0
115,8
161,1
99,8
76,4
77,0
60,6
73,2
162,9103,6
160,8
98,8
162,9
98,8 154,9
103,6
124,0160,2
116,6
127,6
182,0
69,5
O
O
O
OH
OH
OOH
OHOH
OH
O
OOH
OH
OH
163,5
102,6
182,0160,8
98,9
163,5
98,6154,8
103,6
121,1
127,9
115,8
161,0
114 115
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
35
Biflavonol
O
O
OH
O
OCH3
OH
OH
OO
OHOH
OH
OHOO
O OH
OH
OO
CH3
OH
OH
OO
OH
OHOH
OH
114,6 114,6
130,9 130,9160,9 161,1126,3 126,3
157,1157,1
134,2134,2
179,1 179,0
105,9 105,6161,5 161,5
98,5 98,5
164,6 164,6
93,493,4158,5 158,5
103,1
74,3
75,7
67,1
76,670,1
100,9
70,8 70,6 72,4
68,6 16,4104,0
71,573,6
73,9
68,2
65,9
100,4
69,971,572,5
16,6 68,2
116
O
OOH
OH
OH
OCH3
O
OOH
OH
OCH3
OH
146,3135,7
176,3
158,4
97,8
162,1
104,5 153,8
102,9
30,7
123,6
129,2
113,9
160,3 55,3
117 Bi-isoflavona
111,5
61,0
194,7
165,3
97,3
167,1
95,9160,9
100,9 116,3
161,499,2
156,6
110,5128,1
156,3
122,1
181,9163,6
100,0
165,2
94,5
159,0
105,9
110,7
157,8
104,8
160,6
120,3
132,7
O
OH
OH
O
OHOH
O O
OH
OH
O
OH
118 Chalcona-flavana
OH O
OH
OCH3
OH
OH
43,137,2
29,4
78,8
31,3
25,7
113,6
129,2126,3
154,6
103,8154,0
134,4157,9
116,0
128,3123,2
159,4
99,7
157,3
107,4
130,9
138,1
129,9
115,4
155,8
55,6
OH O
OH
OCH3
OH OH
43,037,0
29,4
70,6
35,9
30,5
113,2
129,6126,1
154,6
103,3155,7
130,8
156,5
115,8131,7
123,2
159,4
99,7
157,3
107,4
130,9
138,2
115,4
155,8
55,6
37,9
129,8
119 120
OH OOH
H3CO
OH
OCH3
OH
43,237,2
29,4
78,6
31,4
25,4
113,7
129,3126,3
154,8
103,7154,6
136,5148,5
112,5
118,4
147,4
114,2123,2
159,6
99,7
157,4
107,5
131,0
138,1
130,0
115,6
155,9
55,6
56,4
121 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
36
Chalcona-flavanona
154,8113,2
197,1
103,3
156,3
116,1
166,3
103,4
166,3
109,1
136,7
121,7
129,6
116,6159,5
163,5
99,4
157,7
188,2
129,1158,6
131,0
115,4
116,1
80,9
45,0OH
O
OOH
OH O
O
O
OH
H
OH
OH O
O
OH
OH
OH
O
114,5
167,5
103,8
165,6
108,8133,1
192,8
118,4
145,1
124,8
133,8
130,3158,5
116,7
130,4
115,2
164,4
103,7
165,4
111,4
130,1
191,4
55,983,9
127,6 129,8
115,8
158,8
122 123
OH
OH O
OH
O
O
OH O
OH
H
107,9
132,4
113,7
166,8
103,0
164,8
191,0
117,6144,2
126,8
129,8
115,8
157,9123,1
133,4
157,7
115,0
129,2
129,1
82,5
54,3
197,0 102,2
163,5
95,0
166,496,2
164,8
107,9
132,4
113,6
166,9
103,5
164,7
191,8
117,7144,1
126,8
129,8
115,8
157,8122,8
133,4
157,8
115,0
129,2
128,982,7
54,3
197,6 102,8
163,2
95,6
166,4
97,0
165,8
OH
OH
OH O
OH
O
O
OH OOH
OOHOH
OH
100,3 77,1 61,6
70,276,8
73,6
124 125
Chalcona-flavonol
OH
OOH
CH3
H3CO
OOH
OH O
OCH3
156,1
140,2
179,8
162,6
101,1
163,2
107,9
155,7
105,7
18,8
124,6
130,7
114,8
162,1
143,5129,8
126,8
31,847,5
207,2
110,1161,7
114,3165,3
109,0
163,29,4
61,0
60,9
130,0
OH
OOH
CH3
H3CO
OOH
OH O
OH
OCH3
146,8
136,7
176,9
160,1
98,9
162,1
106,2
155,1
104,6
17,5
124,6
130,7
114,8
162,1
142,7129,2
126,7
31,447,3
207,3
108,9
159,2
112,8164,4
110,5
160,49,2
55,861,1
129,3
126 127
OH
O
O
OHH3CO
CH3
OH
OH
OH O
OCH3
155,1139,6
165,4
101,2
161,3
108,0 154,9
103,7
18,6
131,1
129,4
130,2
132,5
133,8
130,2114,7
30,9
47,7
207,7
110,0161,0
114,4164,9
106,3
163,08,7
60,3
60,4
178,9
O
OOH
OH
OH
OCH3
OH
OOH
H3CO
CH3
146,4135,7
176,3
158,3
97,9
161,8
105,5 153,7
103,0
30,3
123,5
129,5
113,8
160,3 55,3
141,5128,3
125,9
46,2
206,3
108,9158,3
112,3
163,5
108,2
159,0
60,1
9,2
30,3
128 129
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
37
OH
O
O
OHOCH3
H3CO
CH3
OH
OH
OH O
OH
146,9136,9
176,9
160,3
98,9
162,0
106,9 155,1
104,6
17,4
124,5
130,2
114,8
162,0 55,7
133,2
130,1115,9
30,6
47,7
207,6
108,9159,3
112,7164,4
110,5
160,89,1
61,0
OH
O
O
OHOCH3
H3CO
CH3
OH
OH
OH O
OCH3
155,0138,7
178,7
165,0
101,3
161,3
108,2 154,8
103,4
18,8
124,8
131,0
114,7
161,0 55,4
134,0
130,2115,9
31,0
47,7
207,7
110,2162,3
114,7163,0
105,4
163,08,7
60,2
60,3
130 131
Flavana-Flavanonol
78,030,4
20,1105,2
154,3
92,1
158,1
108,3
159,7
133,8
127,9
116,2
159,9118,782,4
194,4
100,1
161,2
95,8
OO
OO
OH
OH
OH
OH
OHOH
163,4
97,5
165,5
126,4
129,8115,8
168,4
77,929,3
20,4105,6
154,4
92,2
158,1
108,5
159,7
133,2
128,4
116,1
159,9118,982,2
194,4
100,1
161,1
95,8
OO
OO
OH
OH
OH
OH
OHOH
163,3
97,5
165,4
126,4
129,8115,9
168,4
132 133
OO
O
H3CO
O
O
OCH3
H3CO
OCH3H3CO
78,428,9
17,5112,2
187,3
101,9
167,984,9 167,5
132,2
126,2113,5
163,3
90,779,9
184,7
102,2
162,6 94,3
160,3
94,0158,9
123,6129,1
113,7
158,1 56,4
56,0
55,3
55,3Artificialmente metilados
OO
O
H3CO
O
O
OCH3
H3CO
OCH3H3CO
78,327,9
17,2112,8102,0
168,184,9 167,4
131,7
126,3113,7
163,2
91,079,9
184,6
102,1
163,2 94,0
162,3
93,9159,0
123,7128,9
113,7
157,9 56,4
55,9
55,3
55,5
134 135
OO
O
OH
OH
OH
O
OH
OHOH
78,0
30,4
20,1105,2
154,392,1
158,1
108,3
159,7
133,8
127,9116,2
159,9
118,782,4
194,6
100,1
161,2
95,8163,4
97,5
165,5
126,4
129,8115,8
168,4
OO
O
OH
OH
OH
O
OH
OHOH
77,9
29,3
20,4105,6
154,492,2
158,2
108,5
159,7
133,2
128,4116,2
159,9
118,982,2
194,4
100,1
161,1
95,8163,3
97,5
165,4
126,4
129,8
168,4
115,9
136 137
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
38
Flavana-flavona
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
76,5
29,018,9
100,4155,8
94,9
154,2
98,9 154,2 132,2
127,1114,8
156,7
162,0
113,3181,6
103,3
161,8
98,5
164,093,3
157,3
123,9
129,8114,9
159,4
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
76,4
29,318,7
100,6156,0
95,0
153,9
98,8 155,0 132,6
127,0115,1
156,9
162,1
113,3181,8
103,5
162,1
98,7
164,493,5
157,6
124,0
130,3115,2
159,9
138 139
Flavanol-Flavanonol
OO
O
OH
O
O
OH
OH
OH
OHOH
82,366,6
27,0109,6
186,9
100,8
169,185,3 157,2
128,3
127,7114,8
158,5
90,280,0
191,1
100,2
163,8 97,3
168,1
96,5160,6
122,4130,2
115,0
158,6
OO
O
OH
O
O
OH
OH
OH
OHOH
82,165,3
25,5109,9
187,0
101,1
169,184,9 157,2
128,2
127,8114,9
157,9
90,780,3
191,0
99,6
163,397,1
167,8
96,1160,8
122,3130,1
114,9
158,7
140 141
82,268,1
28,7103,9
159,9
92,5
161,4
108,0
153,4
131,1
129,1
116,1
158,3118,982,2
194,5
100,0
165,5
97,6
OO
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
168,4
95,7
163,4
126,4
129,8115,9
159,9
82,367,7
28,9104,3
159,9
92,4
161,3
108,1
153,7
130,8
129,6
116,0
158,4118,882,2
194,1
100,1
165,4
97,5
OO
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
168,3
95,8
163,3
126,4
129,8115,9
159,8
142 143
Flavanol-flavona
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
80,8
66,427,2
99,2156,2
95,3
153,8
98,7 154,4 130,4
128,3114,8
157,0
162,5
113,4182,0
103,5
162,1
98,7
164,393,5
157,6
124,0
130,4115,1
159,7
O
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
80,8
66,627,7
99,0155,6
95,0
152,6
98,3 154,9 129,9
127,9114,5
156,5
161,6
112,8181,2
103,0
161,5
98,7
164,693,4
157,2
123,7
129,9114,9
159,5
144 145
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
39
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
27,5
66,380,7
93,8
95,2
98,9
99,0
99,4102,0
112,8
114,6
114,8
123,9
128,0
129,9
130,1
153,5
154,2
155,8
156,7
156,7
157,6
159,4
161,4161,6
181,0
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
28,1
66,880,9
93,9
95,1
98,7
99,5
99,0102,4
112,5
114,6
114,9
123,9
128,0
129,9
130,1
152,7
155,0
155,7
156,7
156,7
157,5
159,7
161,0161,5
180,8
146 147
Flavanona-Flavanonol
81,247,3
195,9101,1163,3
95,8
165,9
95,5162,4 127,9
128,1
114,5
157,2
159,5101,2
164,4
94,6161,7
82,471,7
127,2
128,3
114,5
157,2
99,8
196,6
O
OH
OH
OH O
OH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH80,047,3
196,4
104,0164,597,5
163,0
98,5 165,0 128,0
126,5
116,0
158,0
80,070,2
196,8
105,5164,0
97,8
164,0
165,5102,0 128,0
128,5
115,1
158,0
148 149
O
O
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
79,645,2
194,5
105,7160,297,5
160,7
96,6 162,7 125,9
126,9
115,8
155,7
80,870,0
106,0161,7
97,8
164,6
164,4101,2 126,1
124,4
142,8
158,0
118,4
118,4
O
O
OH
OCH3
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
82,747,3
197,4
105,5166,4
101,3
164,6
101,8 163,7 129,8
128,8
114,8
157,7
82,770,1
196,5
106,0163,1
97,8
162,7
162,4105,7 126,7
128,8
140,5146,2
114,8
111,8
55,6
150 151
84,147,3
163,0
96,3
166,6
95,2162,4
101,2
127,3158,0
115,0
129,4
196,8
160,4
96,3
81,471,9
197,8
162,4
99,9
163,8
127,9107,0
145,9
133,8
101,2
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
83,447,1
163,0
96,3
166,6
95,2162,4
101,5
127,5158,0
115,2
128,8
196,8
160,4
96,3
81,772,2
197,8
162,4
100,4
163,8
101,5
127,9107,0
145,9
133,8
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
152 153
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
40
O
O
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
H
164,096,0
167,7
97,0
164,7101,4
197,9
73,1
83,9
132,1
130,3
116,9
159,4 143,2122,3
130,4
126,3
117,8
150,6
83,8
73,0
197,9
101,4
164,7
97,0
167,796,0
164,0
154 Flavanona-flavona
O
OH
OH
OOH
OH
O
OOH
OH
OH
OH166,7
106,2
181,3161,2
98,6
163,8
93,3157,3
103,3
124,0
120,2
144,2148,2
113,8
119,9
78,1
42,3
195,9162,6
95,7
162,6
104,2 160,0
101,5
129,3
113,9
144,9145,2
115,1
117,1
O
O
OH
OH
OHO
O
OH
OH
OH
OH
OH
77,1
44,5
196,0
163,6
95,6
166,5
94,7163,1
101,5
129,4
118,4
143,6
145,2
114,8
117,1
163,6
102,5
182,0
160,398,5
161,7
103,8 154,9
102,1
121,7
113,6
145,6149,6
115,6
118,6
155 156
O
O
O OH
OH
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH102,6
48,7
194,3
160,8
94,5
164,3
104,1 156,7
100,2
129,4
119,6144,7
145,3
113,7119,9
108,6
168,0
182,0
158,2
98,5
162,4
103,8154,8
103,1
126,4
118,3144,4
146,7
113,1117,4
OH
O
O OH
OH
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
O200,0
55,3
195,2
162,2
95,0
165,3
105,1 149,3
100,5
132,1
120,9144,7
145,8
114,5122,5
109,0
168,4
182,3
160,0
98,5
162,5
104,1155,1
103,7
127,1
118,3144,4
147,0
113,6117,4
157
166,896,2
163,9
95,2
162,9101,5
195,5
128,6
128,5
114,2
157,1
80,948,5
104,4
157,7
102,5
159,8105,2
154,5
182,1
164,1
102,5
120,6
129,0
116,1
161,5
129,0
OHO3SO
OH O
OHOOH
OH O
OH
166,696,3
164,0
95,4
163,0101,6
195,6
128,5
128,7
114,4
157,3
81,148,7
104,3
157,7
102,5
160,0105,3
154,5
182,1
164,2
102,6
121,0
113,6
145,8
150,0116,3
119,7
OHO3SO
OH O
OH
OHOOH
OH O
OH
158 159
78,5
42,0
196,3
163,9
95,7
166,6
94,9162,9
101,7
128,6 130,1
126,6
155,4
115,7
127,1
181,6
163,4
102,8
161,498,8
164,0
93,9157,3
103,7
120,6
129,8
124,9
159,3
116,4
127,2
O O
OHO
OH
O
OH
OH
OH
OH
94,6
164,7
99,5
161,8104,3
182,2
103,9
163,9
122,7
121,2
125,3
118,4
153,8
142,9
116,3
158,4128,8
132,8
78,6
42,4
196,8
102,3 163,4
96,6
167,1
95,6163,3O
O
OH
OH
O
O
O
OH
OH
OH
160 161
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
41
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
OHH3CO
163,6
104,4
182,6104,6
162,3
99,8
164,7
94,9158,2
123,1
121,8143,2
154,3118,7
125,7
79,142,9
197,5
103,5
164,095,6
168,3
94,7
163,6
133,0
129,2
116,6
158,9
56,8
79,4
43,4
197,3
103,7165,195,5
168,8
94,6 163,9 132,1
121,5
142,7
150,6118,4
125,556,0
164,4
105,0
183,0
105,3 163,399,8
164,9
94,8158,8
125,9
129,1162,1
117,4OH3CO
OH O
OH
O
O
O
OH
OH
162 163
79,542,8
197,2
104,5163,199,5
166,1
94,7161,7 130,7
115,8114,4
118,8
129,1
159,1
159,496,4
157,695,7
165,2
128,9164,5103,3
116,6
162,0
106,4
182,9
122,2O
OH
OH
OH O
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OH O
78,8
42,1
196,3
163,1
95,7
166,6
94,9163,0
101,8
127,5
120,7
145,0
148,6112,2
121,4
163,5
102,6181,6
159,0110,3
156,2
94,0
121,4
128,3
115,9
161,0
163,0
102,6
164 165
163,7103,6
181,9
161,1
98,2
165,2
92,7157,3
104,8
122,1
130,4
122,7
160,9
111,7
127,9
55,8
56,1
78,3
41,9
196,6
160,9
105,4164,3
94,5161,9
101,5
128,9
128,4
115,2
157,8
O
O
OH
OH
OHO
OCH3
OOH
H3CO
163,6103,7
181,9
161,1
98,1
165,2
92,7157,3
104,7
122,2
130,2
122,4
160,8
111,7
128,056,0
78,6
41,9
197,1
159,6
106,1165,0
91,5162,9
102,3
128,7
128,4
115,2
157,856,3
O
O
OH
H3CO
OHO
OCH3
OOH
H3CO
166 167
80,842,3
196,6
102,1168,098,4
168,2
98,0164,5 128,6
132,1
121,2157,5127,3
118,8
158,8105,9
163,7100,4
161,6
128,2163,1103,2
114,4
162,5
103,4
183,4
124,0
56,7
O
OCH3
OH
OH O
O
O
OH
OH
OH
78,6
42,1
196,7
102,5163,1
94,6
167,3
93,6162,9 128,5
131,2
118,6155,9
115,4
127,855,7
105,7
162,695,3
161,0 104,0
153,4 163,9
102,3
182,3
121,2
128,3
115,7
161,1
56,2
OH3CO
OH O
OHO
O
OH
H3CO
OH
168 169
O
O
OOH
OH
OH
O
OHOH
OH
OH
78,2
42,1
195,3
163,195,5
166,2
94,7 162,6
101,6
128,6
120,9
119,2145,1
143,9
112,8
163,4
102,1
181,6
160,598,4
161,4
104,5
154,2
103,5
121,3
127,7
115,4
160,0
78,6
42,3
196,7
102,5163,1
94,6
167,3
93,7162,8 129,6
131,3
111,1
128,155,9
55,6
120,6
157,3
162,298,6
104,5
160,4 103,6
154,4 163,7
102,8
182,1
121,4
128,4
115,8
161,1
OOH
OH O
OHO
O
OCH3
H3CO
OH
170 171 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
42
O
O
OOH
OH
OH
O
OHOH
OH
OH
OH
78,2
42,1
195,4
163,195,5
166,2
94,7 162,6
101,6
128,5
120,8
119,2145,1
143,9
112,8
163,6
102,1
181,5
160,098,4
161,5104,6
154,2
103,5
121,8
118,4
115,4
149,1
113,5
145,2
78,5
42,2
196,6
102,4163,2
94,6
167,2
93,6162,8 129,7
131,3
120,5
157,2
111,0
128,0
162,595,4
55,8
56,2
55,5
105,5
161,1 103,9
153,5 163,8
102,4
182,3
121,3
128,3
115,8
161,2
OH3CO
OH O
OHO
O
OCH3
H3CO
OH
172 173
181,9
163,1
103,8
124,1
128,4
115,1
160,8
157,3
103,7161,198,2
165,2
92,756,1
160,1
122,5
92,5160,1 153,9
102,6
197,5
79,0
41,9
128,7
128,4
115,2
157,856,7
O
OH
OOH
H3CO
O
O
O
H3CO
OH
79,1
42,0
197,7
157,8
122,5160,1
92,5153,9
102,6
128,6
128,5
115,2
160,256,7
O
OH
O
H3CO
OHO
O
OOH
OH163,1
103,9
161,4
98,9
164,3
94,0157,3
103,8
124,2
128,4
115,0
160,8
174 175
163,0
79,2
43,4
196,2
106,3153,9
126,6
159,1
91,9154,7
132,9
129,0
115,5
159,156,6
165,1
103,8102,5
162,2
105,0166,2
95,0161,3
121,9128,6
7,6
116,9
O
OOH
CH3
OH
O
O
OOH
H3CO
OH
176 Flavanona-Flavonol
80,947,6
163,2
95,9
166,1
94,7162,3
102,5
127,7156,8
114,1
127,4
153,5
97,6
195,3 146,6134,6
175,2
159,1
99,7
161,2
121,1128,5
114,8
158,5
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
OH
OH101,3
OOH
OH O
OH
OH
OH
O
OH
OH
OH O
80,9
47,7
195,5
163,3
95,9
166,1
94,8162,4
128,8
127,6
114,2
156,9
146,5134,7
175,2
159,1
97,5
163,3
101,3 153,6121,5
114,7
144,5147,1
115,0
115,1
177 178
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
43
Flavanona-isoflavana
O O
O
OCH3
CH3
O
OH
CH3
CH3
OH
OH
OH
CH3
CH3
H
H
H
113,263,4
189,0
128,3124,6
164,0
103,4159,9
112,2
129,3
128,0
128,5
156,6115,5
125,5
28,2
122,9
133,1
17,8
25,9
28,6
122,7
133,4
17,7
25,8
111,293,550,4
131,9
111,6 159,4
106,8
152,3113,1
118,3 159,3
111,3158,4
110,2
123,
3
22,8
122,7 131,8
17,7
25,8
179 Flavanonol-Flavona
O
O
OH O
OH
OH
O
O
OOH
OH
H
158,894,8
165,1
99,7
163,7105,0
182,9
105,2
164,7
130,5
129,1
117,4
162,1 142,3122,4
130,4
126,9
118,0
150,6
83,7
73,0
197,6
101,5
164,7
97,2
168,296,0
164,0
83,385,5
198,0
103,0167,5
97,0
164,2
96,0165,3
130,4
131,0
124,1162,0128,2
116,7
159,2
110,1
128,0
108,3
165,1
164,8
115,9
104,4106,8
158,6
183,0
130,0
124,0O
OH O
OHO
O
OH
OH
OH
OH
180 181
164,8
103,3
182,2
104,5162,6
98,8
163,5
93,8157,7 122,1
131,7
116,5
127,4
120,3155,1
104,8
163,996,4
160,8 100,9
163,4 83,272,2
197,8
122,1
129,1
114,9
158,0
OOH
OH O
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
182 Flavona-Flavonol
163,9103,9
182,0161,1
98,0
165,2
92,7157,4
105,0
122,5 122,1160,9
111,8
128,4
56,1
55,9
131,0
164,2
103,8
182,2
161,0
98,2
160,1
105,9 153,6
104,8
121,0128,2
116,1
160,6
99,7
73,076,769,7
77,2
60,6 OOH
OHOH
OH
O O
O
OH
OH
O
O
OCH3
OH
OH
H3CO
99,7 162,7103,6
161,3
99,7
160,2
94,7157,7
102,4
123,0
131,3
120,6159,8
111,4
127,976,769,5
77,1
60,6
73,3
181,2
55,8
163,6
103,3 182,3
160,9
98,0
160,8
105,2153,6
104,9
122,6
127,9
114,6
162,4
55,5
OH
O
O
H3CO
OH
OOH
OHOH
OH
O
O
OCH3
OH
OH
O
183 184
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
44
O
O
OCH3
OH
H3CO
OH
O O
OCH3
OH
OHO
164,6
103,6
183,0104,9
153,3
132,2
153,695,2
158,3122,1
129,3
116,8
162,0
164,6103,2
182,9
104,9153,3
132,2153,6
95,1
158,3
122,4
111,0
148,9
151,6
116,6
121,2
60,8
60,8
56,8
O
O
OCH3
OH
H3CO
OCH3
O O
OCH3
H3CO
OHO
164,6
104,4
183,4106,1
152,5
130,7
153,593,8
155,4124,2
128,4
114,9
163,0
164,5104,1
183,3
106,1152,5
130,7153,5
93,7
155,3
123,9
109,2
149,7
152,7
111,6
120,5
61,3
61,4
56,5
55,9
185 186
Flavona-isoflavona 111,9
58,8
193,3
165,2
97,5
167,0
96,3160,5
101,0 117,5
160,998,5
157,2
110,1128,2
O O
OH
OH
O
OH
O
OH
OH
O
OH
OH
155,2
122,0
182,2
163,3
100,1
163,2
105,3160,1 104,4
159,9
108,1
132,8
106,2
110,3
157,8
159,2
100,0 165,1
94,9164,4
156,1
117,0
122,2
106,0
156,0
181,0
122,0127,2
O
OH
O
OH
OO
O
OH
OH
OH
165,0
105,1
183,0
105,2162,9
99,8
163,1
94,8 158,9 129,0
131,0
144,8149,1129,1
116,0
187 188
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
45
Tabela 1- Relação dos biflavonóides descritos na literatura, contendo os tipos de conectividade (conectiv.), as fontes botânicas (espécie), os solventes empregados para obtenção dos espectros de RMN e as referências correspondentes.
Biflavonóide Conectiv. Espécie Solvente Referência
Daphne odora 1-2 CD COCD TANIGUCHI et al, 1996 (3→8) 3 3
Pilotrichella flexilis 3 CD SOCD BRINKMEIER et al, 2000 (2’→6) 3 3
Cycas beddomei 4 CD COCD RANI et al, 1998 (3’→6) 3 3
Berchemia zeyheri 5-6 CDCl BEKKER et al, 2000 (3→9) 3
Aulacomnium palustre 7 CD SOCD HAHN et al, 1995 (5→5’) 3 3
Lophira lanceolata 8 CD COCD TIH et al, 1988 (α→α) 3 3
Ochna macrocalyx 9 CD COCD TANG et al, 2003 3 3
Lophira lanceolata 10-11 CD COCD TIH et al, 1990 3 3
Glycyrrhiza uralens 12 MeOD BAI et al, 2003
Lophira lanceolata 13 CD COCD TIH et al, 1989 (α→3) 3 3
Ochna afzelii 14-15 CD COCD PEGNYEMB et al, 2001 3 3
Ochna calodendron 16 CD COCD MESSANGA et al, 1994 3 3
Ochna afzelii 17 CD COCD PEGNYEMB et al, 2001 3 3
Lophira alata 18 CD COCD MURAKAMI et al, 1992 3 3
Ochna calodendron 19 CD COCD MESSANGA et al, 1994 3 3
Ochna calodendron 20-21 CD COCD MESSANGA et al, 1994 (α→5’) 3 3
Ouratea flava 22 CD COCD MBING et al, 2003 3 3
Dracaena cinnabari 23 MeOD MASAOUD et al, 1995 (β→3’)
Rhus pyroides 24 CD COCD MDEE et al, 2003 (3→3’) 3 3
25 (3→4) Luxemburgia octandra CD COCD CARVALHO et al, 2004 3 3
26 (3→5’) Rhus pyroides 3 3
27-28 3 3
29
(4→5’)
CD COCD MDEE et al, 2003
Rhus pyroides CD COCD MDEE et al, 2003
Rhus pyroides CDCl MASESANE et al, 2000 3
Rhus pyroides 30 CD COCD MDEE et al, 2003 (4’→5’) 3 3
Dorstenia prorepens 31 CDCl ABEGAZ et al, 2002 3
Calycopteris floribunda 32 CDCl MAYER, 2004 3
Calycopteris floribunda 33 CD SOCD WALL et al, 1994 3 3
Calycopteris floribunda 34-35 CDCl MAYER, 2004 3
Calycopteris floribunda 36 CDCl MAYER et al, 1999 3
37-38 Calycopteris floribunda CDCl3 WALL et al, 1994
39 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999
40 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER, 2004
41 Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999
42 Calycopteris floribunda 3 MAYER, 2004
43-44
(6→8)
Calycopteris floribunda CDCl3 MAYER et al, 1999
CDCl
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
46
Biflavonóide Conectiv Espécie Solvente Referência
45-46 Vitis vinifera MeOD FOO et al, 1998
47
(2’→8)
Potentilla viscosa CD3COCD3 ZHANG et al, 1998
48-49 (4→4) Acacia melanoxylon CD3COCD3 FOO, 1989
50-53 (4→5) Acacia galpinii C6D6 BENNIE et al, 2002
54-55 (2→2) Ochna macrocalyx CD3COCD3 TANG et al, 2003
56 (2’→6) Pilotrichella flexilis CD3SOCD3 BRINKMEIER et al, 2000
57-58 (3→3) Wikstroemia indica MeOD NUNOME et al, 2004
59 (3→8) Garcinia livingstonei MeOD MBWAMBO et al, 2006
60 (3’→3’) Pilotrichella cuspidata CD3SOCD3 SEEGER et al, 1992
61 Ochna obtusata CD3COCD3 RAO et al, 1997
62
(3’→4’)
Ochna beddomei CD3COCD3 JAYAPRAKASAM et al, 2000
63 (3’→6) Schinus tebenthefolus MeOD KASSEM et al, 2004
64-65 (3’→7) Quintinia acutifolia CD3COCD3 ARYASENA, 2004
66 (3’→8) Lophira lanceolata CD3COCD3 TIH et al, 1989B
67 Cycas beddomei CD3COCD3 RANI et al, 1998
68
(4’→6)
Cycas beddomei CD3COCD3 JAYAPRAKASAM et al,2000b
69 (2→8) Vahlia capensis CD3COCD3 MAJINDA et al, 1997
70 (2’→4’) Pseudotsuga menzitsii MeOD FOO et al, 1992
71 (6→8) Ouratea multiflora CDCl3 FELICIO et al, 2001
72-73 (2’→6) Plagiomnium undulatum CD3SOCD3 RAMPENDAHL et al, 1996
74 Mnium hornum CD3SOCD3 BRINKMAIER et al, 1999
75
(2’→8)
Philonotis fontana CD3SOCD3 GEIGER et al, 1989
76-77 Aristolochia ridicula CD3SOCD3 MACHADO et al, 2005
78-79
(3→6)
Stephania tetrandai CDCl3 SI et al, 2001
80 (3’→3’) Homolothecium lutescens CD3SOCD3 SEEGER et al, 1993
81 Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000
82 Selaginella willdenowii CD3SOCD3 SILVA et al, 1995
83 Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005
84 Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000
85 Dysoxylum lenticellare CD3SOCD3 HE et al, 1996
86 Selaginella willdenowii CD3SOCD3 SILVA et al, 1995
87 Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005
88
(3’→6)
Rhytidiadelphus squarrosus CD3SOCD3 SEEGER et al, 1990
89 Selaginella willdenowii CD3SOCD3 SILVA et al, 1995
90 Caesalpinia pyramidalis CD3COCD3 BAHIA et al, 2005
91 Bartramia stricta CD3SOCD3 GEIGER et al, 1995
92
(3’→8)
Plagiomnium cuspidatum MeOD ANHUT et al, 1989
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
47
Biflavonóide Conectiv. Espécie Solvente Referência
93-94 Araucaria angustifolia MeOD FONSECA et al, 2000
95 Calophyllum inophylloide C5D5N GOH, 1992
96 Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 1997
97-98 Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 2001
99-101
(3’→8)
Calophyllum venulosum CD3COCD3 CAO et al, 1997
102-103 Lonicera japonica C5D5N KUMAR et al, 2005
104
(4’→4’)
Origanum syriacum CD3SOCD3 EL-DESOKY et al, 2004
105-106 Lanaria lanata CD3SOCD3 DORA et al, 1991
107-108
(4’→8)
Ouratea semiserrata CD3SOCD3 VELANDIA et al, 2002
109 (6→6) Ouratea spectabilis CD3SOCD3 FELICIO et al, 1995
110 (6→8) Ouratea nigroviolacea CD3COCD3 MBING et al, 2006
111 (6→8) Ouratea nigroviolacea CD3SOCD3 MBING et al, 2006
112 (6→8) Ouratea spectabilis CD3SOCD3 FELICIO et al, 1995
113 Cupressocyparis leylandii CD3SOCD3 K.-BARANOWSKA et al, 1999
114-115
(8→8)
Juniperus communis CD3SOCD3 INATOMI et al, 2005
116 (7→7) Chimarris turbinata MeOD CARDOSO et al, 2005
117 (8→8) Pentagramma triangularis CD3SOCD3 ROITMAN et al, 1993
118 Lupinus albus MeOD SAKASAI et al, 2000
119-121
(β→6)
Dracaena cinnabarii MeOD MASAOUD et al 1995
122 (α→6) Ouratea flava CD3COCD3 MBING et al, 2003
123 Lophira lanceolata CD3COCD3 TIH et al, 1989
124-125
(3→3)
Ochna integerrima CD3COCD3 KAEWAMATAWONG et al, 2002
126-127 Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1994
128 Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1997
129 Pentagramma triangularis CD3SOCD3 ROITMAN et al, 1993
130-131
(3’→8)
Pentagramma triangularis CD3COCD3 IINUMA et al, 1997
132-133 Daphne odora CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1996
134-135
(2→8)
Daphne acutiloba CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1998
136-137 Daphne odora CD3COCD3 BABA et al, 1995
138-139
(3→8)
Wikstroemia sikokiana CD3SOCD3 BABA et al, 1994
140-141 Daphne genkwa CD3SOCD3 BABA et al, 1993
142-143
(2→8)
Daphne odora CD3COCD3 TANIGUCHI et al, 1996
144-145 Wikstroemia sikokiana CD3SOCD3 BABA et al, 1994
146-147 Stellera chamaejasme CD3SOCD3 FENG et al, 2003
148 Garcinia kola CD3SOCD3 HAN et al, 2005
149-151 Garcinia kola CD3SOCD3 KAPADIA et al, 1994
152-153
(3→8)
Gnidia involucrata CD3SOCD3 FERRARI et al, 2003
154 (3’→4’) Ouratea sulcata CD3COCD3 PEGNYEMB et al, 2005
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
48
Biflavonóide Conectiv Espécie Solvente Referência
155 (2’→8) Mnium hornum CD3SOCD3 BRINKMAIER et al, 1999
156 (2’→8) Philonotis fontana CD3SOCD3 GEIGER et al, 1989
157 (2’→8) Bartramia pomiformis CD3COCD3 SEEGER et al, 1991
158-159 (3→8) Rheedia acuminata CD3SOCD3 LI et al, 2002
160 (3’→3’) Homalothecium lutescens CD3SOCD3 SEEGER et al, 1993
161 Luxemburgia nobilis MeOD OLIVEIRA et al, 2002
162 Ochna integerrima CD3SOCD3 LIKHITWITAYAWUID, 2001
163
(3’→4’)
Ochna obtusata CD3COCD3 RAO et al, 1997
164 Caesalpinia pyramidalis CD3COCD3 BAHIA et al, 2005
165 Plagiomnium undulatum CD3SOCD3 RAMPENDAHL et al, 1996
166-167
(3’→6)
Selaginella delicatula CD3SOCD3 LIN et al, 2000
168 Cycas beddomei CD3COCD3 DAS et al, 2005
169 Amentotaxus yunnanensis CD3SOCD3 LI et al, 2003
170 Bartramia pomiformis CD3COCD3 SEEGER et al, 1991
171 Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005
172 Plagiomnium cuspidatum MeOD ANHUT et al, 1989
173-174
(3’→8)
Selaginella delicatula CD3SOCD3 CHEN et al, 2005
175 Selaginella willdenowii CD3SOCD3 SILVA et al, 1995
176
(4’→6)
Cephalotaxus wilsoniana C5D5N KUO et al, 2002
177 Garcinia kola CD3SOCD3 TERASHIMA et al, 1995
178
(3→8)
Calophyllum panciflorum CD3SOCD3 ITO et al, 1999
179 (3→4) Glycyrrhiza glabra CD3COCD3 LI et al, 2000
180 (3’→4’) Ouratea sulcata CD3COCD3 PEGNYEMB et al, 2005
181 (3’→7) Lophira alata CD3COCD3 TIH et al, 2006
182 Aristolochia contorta CD3COCD3 YU et al, 2005
183-184
(3’→8)
Ginkgo biloba CD3SOCD3 HYUN et al, 2005
185-186 (7→7) Lippia alba CD3COCD3 BARBOSA et al, 2005
187 (3→8) Lupinus albus MeOD SAKASAI et al, 2000
188 (3→7) Lophira alata CD3COCD3 TIH et al, 2006
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
49
3.2.2 Aspectos Estereoquímicos
Atropisomerismo
O espectro de RMN 13C de um biflavonóide costuma provocar dubiedade na sua
interpretação devido ao elevado número de sinais, levando quase sempre o espectroscopista a
suspeitar de que a amostra é uma mistura de flavonóides monoméricos. Evidentemente que
um simples experimento de espectrometria de massa seria suficiente para dirimir esta dúvida.
Entretanto, a análise se torna substancialmente complexa quando ocorre pareamento dos
sinais, em virtude da presença de atropisômeros.
Atropisômeros (grego: a= não; tropos= giro, rotação) são estereoisômeros
conformacionais cuja quiralidade é atribuída ao impedimento na rotação em torno de uma
ligação simples, devido à existência de grupos volumosos. Os exemplos clássicos são as
bifenilas. Em 1983, M. Oki definiu arbitrariamente as condições de atropisomerismo:
isômeros separáveis com meia-vida de pelo menos 1000 s (16,7 min), não importando o valor
da barreira energética, a qual varia com a temperatura (ELIEL et al., 1994).
O atropisomerismo em biflavonóides é bem freqüente em estruturas cujas unidades
estão interligadas através dos carbonos C-3→ C-8” (Ex.: estruturas 59, 129-139, 144-153,
158-159, 177-178 e 187), tão comum que passou a ser característico para este tipo de
biflavonóide (HAN et al., 2005), muito embora este fenômeno também seja observado em
estruturas conectadas pelos carbonos (C-8→ C-8”) (Ex.: 114 e 115) (INATOMI et al., 2005).
162,095,0
166,3
96,0
163,6101,4
196,5
47,381,2
128,0
128,7
114,6
157,5
162,6
95,2101,4
165,1
101,4
159,6 78,0
195,6
130,8
126,8
113,6
158,9
55,1
42,6
O
O
OCH3
OH
OH
O
OOH
OH
OH
C-3C-8"
59
Em geral, um experimento realizado sob aquecimento a 90 °C simplifica o espectro
devido ao desaparecimento das linhas espectrais duplicadas, facilitando a elucidação
estrutural. Em alguns casos, como o da garcianina (177), os experimentos são efetuados a
150 °C (TERASHIMA et al., 1995).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
50
HAN et al (2005) realizaram um monitoramento do comportamento rotamérico por
espectroscopia de RMN 13C de uma amostra do biflavonóide GB-1 (148), obtido de Garcinia
kola, em diferentes temperaturas (-50, -30, 21, 23 e 90 °C). À temperatura ambiente (21 e 23
°C), foram observados sinais pareados referentes à mistura de rotâmeros. Entretanto, em
extremos térmicos (-50 e 90 °C) foi constatada a existência de apenas um conjunto de sinais.
Este estudo, denominado de RMN dinâmica, foi desenvolvido com diferentes solventes
deuterados (DMSO, piridina e acetona), sendo em todos observado o mesmo comportamento
(Fig 8, p. 53).
Estudos de RMN dinâmica permitem uma boa compreensão sobre a restrição na
rotação da ligação entre os anéis C-I (C-3) e A-II (C-8”), originado do impedimento estérico
de substituintes aromáticos, os quais restrigem a rotação em torno desta ligação. Desta forma,
à temperatura ambiente coexiste um par de confôrmeros, em razão da lenta interconversão
causada pela elevada barreira energética, resultando num espectro de RMN mais complexo,
cujos sinais aparecem dobrados. Entretanto, à medida que se eleva a temperatura, observa-se
que os sinais duplos tendem a se aproximar (alargamento dos picos), coalescerem (pico único
alargado) e por último obtem-se um sinal simples cuja absorção corresponde a uma freqüência
central às duas existentes anteriormente. Isto acontece porque o aquecimento acelera a
velocidade de interconversão, fazendo com que seja superada mais facilmente a barreira
energética, favorencendo a formação exclusiva de um dos confôrmeros. O resfriamento pode,
em certos casos, gerar preferencialmente o confôrmero mais estável, implicando igualmente
numa simplificação do espectro de RMN. Este tipo de investigação pode ser feita tanto para 1H como para 13C, todavia como a faixa de deslocamento químico deste último é mais ampla,
a temperatura de coalescência (TC) ocorre em temperaturas mais altas. Além disso a
temperatura de coalescência é dependente da freqüência de análise do espectrômetro: quanto
maior a freqüência do aparelho, maior será TC (FRIEBOLIN, 1991).
Da espécie Juniperus communis, foi isolado e purificado pela primeira vez um par
de atropisômeros (P e M-114 e 115) de fonte natural, os quais mostraram estabilidade em
DMSO, mesmo submetidos a aquecimento a 50 °C (INATOMI et al., 2005).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
51
Estereoquímica E/Z
A configuração da dupla ligação de uma aurona pode ser determinada através do
deslocamento químico do carbono C-α, conforme o raciocínio aplicado por Geiger e
Markham (1992) para definição da estereoquímica Z para campylopusaurona, uma aurona-
flavanona isolada de Campylopus clavatus. Segundo estes autores, um deslocamento químico
de δ 109,9 é compatível com C-α pertencente à dupla ligação com configuração Z. Ao
contrário, o deslocamento químico previsto seria ao menos 10 ppm mais desblindado, devido
aos fatores estéricos.
O
O
OH
OH
OH
OH
O
OOH
OH
OH
OH
Campylopusaurona
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
52
Figura 8- Espectros de RMN 13C de GB-1 (148) registrados em diferentes temperaturas e solventes, obtidos num espectrômetro Bruker (HAN et al., 2005). Observação: os parâmetros de aquisição e processamento dos experimentos não foram divulgados.
Extraído do artigo “Complete NMR assignments of the antibacterial biflavonoid GB1 from Garcinia kola.” Chem. Pharm. Bull., v. 53, n. 8, p. 1034-1036, 2005.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
53
3.2.3 Metilação e Acetilação
Em virtude da alta polaridade dos biflavonóides, durante muito tempo os artifícios
utilizados para o isolamento e a caracterização destes compostos foram a metilação ou a
acetilação das hidroxilas fenólicas.
A acetilação de bichalconas isoladas de Dracaena cinnabari (23 e 119-121)
produziu fortes efeitos de blindagem no carbono ipso e de desblindagem nos carbonos orto e
para, da ordem de 4 -7 ppm (MASAOUD et al., 1995).
3.2.4 Glicosilação Biflavonóides glicosilados são tipos estruturais de ocorrência muito rara, existindo
poucos relatos sobre a existência de heterosídeos naturais: chimarrosídeo (116)- Chimarris
turbinata (CARDOSO et al., 2005), (P) e (M) –cupressuflavona-4’-O-β-glicosídeo (114 e
115)- Juniperus communis (INATOMI et al., 2005), ginkgetina e isoginkgetina-7-O-β-
glicosídeo - Ginkgo biloba (183 e 184) (HYUN et al., 2005), 6’”-hidroxilofirona B-4’”-O-β-
glicosídeo (125) - Ochna integerrima (KAEWAMATAWONG et al., 2002) e procianidina B-
3, 3’-O-β-glicosídeo - Potentilla viscosa (47) (ZHANG et al., 1998). No sítio de glicosilação
do chimarrosídeo, localizado no C-3 do fragmento de campferol, foram evidenciadas as
desblindagens do C-2 (∆δ +9) e C-4 (∆δ +2) e a blindagem do C-3 (∆δ -3), em relação aos
valores encontrados para a aglicona (CARDOSO et al., 2005).
3.2.5 Conectividade
É sabido que a técnica de RMN bidimensional HMBC, quase sempre, fornece
inequivocamente a informação da conectividade entre as unidades flavonoídicas, entretanto
um simples espectro de RMN 13C-CPD pode ser útil também para proposição da interligação.
Como os carbonos C-6 e C-8 não substituídos, em biflavonóides 5,7-dioxigenados,
apresentam absorções entre δ 90-100, deslocamentos químicos com incrementos de 6,0-9,6
ppm (CHARI, 1977 apud SI et al., 2001), são indícios de que a conexão entre os monômeros
se faz através destes carbonos, respectivamente. Desta forma, Si et al. previram a
conectividade de biflavonóides isolados de Stephania tetranda (SI et al., 2001).
Além disso, a conectividade pode ser muitas vezes determinada pelo conhecimento
prévio do tipo de ligação dos biflavonóides relatados no gênero da espécie estudada.
Geralmente, espécies de Selaginella possuem biflavonóides interligados por carbonos C-
3’→C-6 ou C-8” (81-84, 89, 166-167, 173-174) (LIN et al.,1999).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
54
3.2.6 Sulfatação
O espectro de RMN 13C de um biflavonóide sulfatado é muito similar ao de um
análogo não-sulfatado, sendo quase superponíveis. No entanto, a identificação de um grupo
sulfato é tranquilamente possível devido aos significativos efeitos do grupo aniônico sobre os
carbonos ipso, orto e para. Morelloflavona-7-sulfato (158) e volkensiflavona-7-sulfato (159)
exibiram diferenças de deslocamentos químicos no carbono ipso (∆δ -6), orto (∆δ +4) e para
(∆δ +2) em relação aos seus congêneres hidroxilados no carbono C-7 (Li et al., 2002).
3.2.7 Biflavonóides atípicos
166,896,2
163,9
95,2
162,9101,5
195,5
128,6
128,5
114,2
157,1
80,948,5
104,4
157,7
102,5
159,8105,2
154,5
182,1
164,1
102,5
120,6
129,0
116,1
161,5
129,0
OHO3SO
OH O
OHOOH
OH O
OH
158
As bartramiaflavonas (91 e 157), biflavonóides isolados do musgo Bartramia
pomiformis e B. stricta, chamam a atenção dos pesquisadores pela sua estrutura macrocíclica,
inédita na natureza, a qual sob aquecimento a 250 °C ou solução fervente de H2SO4 20%,
converte-se numa forma acetal (SEEGER et al., 1991).
O
O
O OH
OH
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OH
OH
O
O OH
OH
O
OH
OH
OH
OH OH
OH
OBartramiaflavona
157
As calycopteronas (32-44) exibem esqueleto original devido à existência de uma
carbonila no anel A, implicando em perda de aromaticidade, e conectividade entre os
monômeros por meio de um anel tetra-hidrofurano. Propriedades citotóxicas são atribuídas a Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
55
estas biflavanas, descritas apenas em Calycopteris floribunda (Combretaceae) (WALL et al.,
1994). Substâncias semelhantes somente são encontradas na espécie Daphne genkwa
(Thymelaeaceae), as quais recebem a denominação de genkwanóis (140-143), todavia estes
últimos são biflavonóides mistos (flavana + flavanonol) (BABA et al., 1993).
H
O
O
OCH3
O
O
OCH3
OCH3
O
OCH3OO
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OHOH
Calycopterona32
Genkwanol 142
A
A
B
B
C
C
Comumente, os biflavonóides são interligados através de ligações diretamente entre
os carbonos aromáticos (C-C) ou ligações éter (C-O-C). No entanto, há sete compostos (117 e
126-131), obtidos exclusivamente de Pentagramma triangularis (Pteridaceae), conectados por
ponte metilênica (IINUMA et al., 1994 e 1997; ROITMAN et al., 1993).
Identificado em Glycyrrhiza glabra (Fabaceae), a licoagrodina (179) é um
biflavonóide de estrutura química singular em razão da presença de dois anéis tetra-
hidrofuranos e três grupos isoprenilas (Li et al., 2000).
OH
OH
O
O
OHH3CO
CH3
OH
OH O
OCH3
O O
O
OCH3
CH3
O
OH
CH3
CH3
OH
OH
OH
CH3
CH3
H
H
H
Flavonóide metilênico (128) Licoagrodina (179)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
56
3.3. Atividade Biológica
Os biflavonóides são substâncias reconhecidamente de alto valor farmacológico,
conforme se pode verificar através da abundância de relatos de atividades biológicas
atribuídas aos mesmos (Tab. 2, p. 59).
Dentre os biflavonóides farmacologicamente ativos, merecem destaque a
amentoflavona, agathisflavona, ginkgetina, hinokiflavona, robustaflavona, rhusflavanona e
GB-1 (Quadro 2, p. 58), em razão do expressivo número de trabalhos científicos que
demonstram suas atividades farmacológicas.
A amentoflavona e agathisflavona apresentaram afinidade por receptores
GABAA/benzodiazepínicos, sendo fortes candidatos para o controle da epilepsia
(SVENNINGSEN et al., 2006). Atividades antivirais foram determinadas para os compostos
amentoflavona, agatisflavona, rhusflavanona e robustaflavona, em ensaios frente aos vírus
Myxovirus influenzae (gripe), Herpes simplex (LIN et al., 1999) e HIV (LIN et al., 1997). A
ação antiinflamatória da ginkgetina foi demonstrada por meio do seu mecanismo de inibição
da fosfolipase A2 e cicloxigenase-2 (COX-2), representando uma alternativa promissora para
o tratamento de dermatites crônicas (LIM et al., 2006).
Os efeitos antiaterogênico (ADARAMOYE et al., 2005) e antioxidante (FAROMBI;
NWAOKEAFOR, 2005) exibidos por GB-1 (148) sugerem eficácia deste biflavonóide na
prevenção de distúrbios cardiovasculares. GB-1 mostrou atividade antibacteriana contra cepas
de Staphylococcus aureus resistente à meticilina (HAN et al., 2005), enquanto que seu
derivado permetilado foi eficaz contra Mycobacterium tuberculosis, bactéria causadora da
tuberculose (LIN et al., 2001).
O potencial antineoplásico destes biflavonóides e análogos já foi avaliado com
sucesso, em testes de citotoxicidade frente a linhas de células tumorais (CHEN et al., 2005),
(LIN et al., 2000), (SILVA et al., 1995), (LIN et al., 1989) e mediante ensaios de inibição da
enzima DNA topoisomerase (GRYNBERG et al., 2002).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
57
Quadro 2- Estruturas de flavonóides farmacologicamente ativos
O
O
O
ORO
OH
OHOH
OH
R
R= H- AmentoflavonaR= OCH3- Ginkgetina
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
Agathisflavona
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
Cupressuflavona
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
OH
OH
Hinokiflavona
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
OH
Robustaflavona
O
OH
OH
OH O
OH
O
O
OH
OH
OH
GB-1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
58
Tabela 2- Relação das atividades biológicas demonstradas por biflavonóides.
Atividade Biológica Referência Antiaterogênica ADARAMOYE et al, 2005
Antibacteriana PEGNYEMB et al, 2005
HAN et al, 2005
TANG et al, 2003
MAJINDA et al, 1997
VERDI et al, 2004
BASILE et al, 1999
Anticonvulsivante SVENNINGSEN et al, 2006
Antifúngica K.-BARANOWSKA et al, 1999
Anti-HIV LIN et al, Y. 1997
Antiinflamatória SELVAM et al, 2004
LIM et al, 2006
Antimalárica NUNOME et al, 2004
WENIGER et al, 2004
WENIGER et al, 2006
Antiosteoporose LEE et al, 2006
Antioxidante YAMAGUCHI et al, 2005
FAROMBI et al, 2005
Antituberculose LIN, Y et al. 2001
Antitumoral ITO et al, 1999
MURAKAMI et al, 1992
Antiviral LIN, Y et al, 1999
Citotóxica TANG et al, 2003
LIN, L.C et al, 2000
MAYER et al, 1999
SILVA et al, 1995
WALL et al, 1994
KUO et al, 2000
KUO et al, 2002
LIN, Y. et al1989
Inibidor de aflatoxina FELICIO et al, 2001
Inibidor da aldose -redutase FELÍCIOet al, 1995
Inibidor da DNA-topoisomerase OLIVEIRA et al, 2005
GRYNBERG et al, 2002
Leishmanicida WENIGER et al, 2004
WENIGER et al, 2006
Tripanocida MBWAMBO et al, 2006
WENIGER et al, 2006
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68
4. VALIDAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA
Validação é o processo de certificação da credibilidade de um método analítico,
tendo como finalidade a obtenção de evidência documentada de que o mesmo realiza a tarefa
para o qual é indicado. A validação representa uma ferramenta imprescindível para o controle
de qualidade de produtos industrializados ou in natura, para os quais espera-se que estejam
em conformidade com a legislação e atendendo aos desejos e exigências do consumidor.
Desta forma, faz-se necessária a adoção de metodologias analíticas que permitam a
comparabilidade e rastreabilidade dos produtos e a confiabilidade dos resultados das
medições, levando-se em consideração custo e praticidade (LEITE, 2002).
A validação requer a avaliação dos seguintes parâmetros: seletividade, linearidade,
precisão, sensibilidade, limite de quantificação e detecção e exatidão (RIBANI et al., 2004).
4.1. Seletividade
A seletividade é a capacidade de um método analítico de propiciar a separação e a
detecção das substâncias de interresse, mesmo na presença de interferentes. Assim sendo, em
cromatografia, um pico deve corresponder a um único componente sob investigação (RIBANI
et al., 2004).
4.2. Linearidade
Um método apresenta linearidade quando produz respostas diretamente
proporcionais às concentrações da substância em análise. Essa relação é observada através da
construção de uma curva de calibração, a partir das áreas dos sinais e suas respectivas
concentrações, sendo necessários no mínimo 5 pontos (não incluindo o ponto zero na curva).
A curva gerada pode ser descrita por uma equação do tipo y= ax + b (RIBANI et al., 2004).
4.3. Sensibilidade
A sensibilidade significa a capacidade do método de discriminar amostras contendo
teores de analito próximos. Entre dois métodos, o mais sensível é aquele que possui a curva
de calibração com maior inclinação (LEITE, 2002).
4.4. Precisão
A precisão é a avaliação do grau de dispersão dos resultados obtidos entre ensaios
independentes e repetidos de uma mesma amostra. Sua aferição é feita através da
determinação do desvio padrão absoluto (σ) ou de sua estimativa (s), em razão do pequeno
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
69
número de medições. Além disso, há a possibilidade de “s” ser expresso em termos
percentuais, desvio padrão relativo (RSD%), também denominado de coeficiente de variação
(CV).
( )1
2
−
−= ∑
nxx
s i RSD (%) ou 100×=xsCV
Na validação de métodos, a precisão pode ser analisada em três níveis:
repetitividade, precisão intermediária e reprodutibilidade.
• Repetitividade (INMETRO) ou repetibilidade (ANVISA)- concordância entre os
resultados de medições sucessivas de um mesmo método, realizadas sob as mesmas condições
analíticas (procedimento, analista, instrumento, local), em um curto período. As medições da
repetitividade são efetuadas a partir da mesma amostra, mas em preparações diferentes, sendo
também denominada de precisão intra-ensaio ou intra-corrida. Entretanto, é comum a
confusão com outro termo adotado em validação: a precisão instrumental, a qual é medida
pela determinação do “s” das respostas de injeções repetitivas de uma mesma preparação (≥
10) (RIBANI et al., 2004).
• Precisão intermediária- é a avaliação das variações percebidas de um dia de análise em
relação a outro ou resultantes da troca de um analista, visando à garantia de que o método
funciona satisfatoriamente, no laboratório.
• Reprodutibilidade- concordância entre os resultados das medições de uma mesma
amostra efetuadas sob condições variadas (mudança de laboratório) A IUPAC recomenda que
as análises sejam reproduzidas em pelo menos cinco laboratórios.
4.5. Limite de Detecção (LD)
Representa a menor concentração da substância de interesse que pode ser detectada,
mas não necessariamente quantificada. Na prática, é determinado como sendo a concentração
que produz um sinal equivalente a três vezes o nível do ruído produzido por uma solução-
controle (“branco” analítico) ou estimado por parâmetros da curva analítica (RIBANI et al.,
2004).
LD= 3,3 x s / S
Onde: s- estimativa do desvio padrão da resposta ou coeficiente linear da reta e S- inclinação
da curva analítica.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
70
4.6. Limite de Quantificação (LQ)
O limite de quantificação (LQ) refere-se ao menor valor de concentração
determinado para a substância de interesse, respeitando-se a precisão e a exatidão do método
(LEITE, 2004). A determinação do LQ pode ser feita através da relação sinal-ruído
(influenciável por condições experimentais) e parâmetros da curva analítica (estatisticamente
mais confiável) (RIBANI et al., 2004).
LQ= 10 x s / S
Onde: s- estimativa do desvio padrão da resposta ou coeficiente linear da reta e S-
inclinação da curva analítica.
4.7. Exatidão
A exatidão corresponde ao grau de concordância entre os resultados individuais
encontrados em um determinado ensaio e um valor de referência, aceito como verdadeiro. A
avaliação da exatidão pode ser realizada através do uso de material de referência, comparação
de métodos, ensaios de recuperação e adição de padrão. As determinações são efetuadas em
três níveis de concentração (baixo, médio e alto), estando sempre associadas a valores de
precisão (RIBANI et al., 2004).
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RIBANI, M.; BOTTOLI, C. B. G.; COLLINS, C. H.; JARDIM, I. C. S. F.; MELO, L. F. C.
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780, 2004.
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71
5. DETERMINAÇÃO ESTRUTURAL
5.1. Amburanina A (ACCE-5)
Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 da fração ACCE1AM, obtida por
partição líquido-liquido do extrato etanólico das cascas do caule de A. cearensis, forneceu 61
mg de um sólido amorfo amarelo (pf. > 300 °C; [α]25D = -3,2°, MeOH, c 0,05), denominado
ACCE-5 (ítem 10.1.6.7, p. 278).
O espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 9, p. 77) mostrou uma
banda larga em 3335 cm-1, correspondente à deformação axial de ligação O-H, caracterizando
a presença de hidroxila; absorção em 1641 cm-1 relativa à deformação axial C=O,
evidenciando a existência de carbonila; bandas esqueletais em 1512 e 1440 cm-1 de C=Carom.;
absorção em 1252 e 1171 cm-1 referentes às deformações axiais C-O e bandas em 955 e 829
cm-1 relacionadas à deformação angular Carom-H.
O espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 10, p. 77) mostrou quatro
dupletos em δ 7,25; 7,02; 6,72 e 6,62 (2H, J = 8,4 e 8,7 Hz), compatíveis com dois sistemas
aromáticos para-dissubstituídos. Dupletos em δ 5,95 (H-6) e 5,86 (H-8) (1H, J = 2,0 Hz)
foram associados a hidrogênios meta-posicionados. Foram exibidos dois sinais como tripletos
em δ 3,29 (H-α) e 2,87 (H-β) (2H, J = 7,7 Hz) e ainda sete sinais simples em δ 13,17; 11,70;
9,77; 9,17; 6,51; 5,96 (1H) e δ 11,02 (2H). O espectro gs-COSY (Fig. 11, p. 78) permitiu
distinguir os hidrogênios pertencentes a cada anel benzênico para-dissubstituído, através dos
acoplamentos entre os sinais δ 7,25 (H-2’,6’) e 6,72 (H-3’,5’) (J = 8,4 Hz), bem como entre
os sinais em δ 7,02 (H-2”’,6”’) e 6,62 (H-3”’,5”’) (J = 8,7 Hz).
No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 12, p. 78) foram
observadas 26 linhas espectrais, quatro das quais, δ 130,0 (C-2”’,6”’); 129,3 (C-2’,6’); 115,9
(C-3”’,5”’) e 115,6 (C-3’,5’), visivelmente mais intensas, foram associadas a carbonos
quimicamente equivalentes de anéis benzênicos para-substituídos, totalizando 30 carbonos.
Dois sinais em δ 203,7 (C-β’) e 192,2 (C-4) foram atribuídos a carbonilas não-conjugadas
(cetona ou aldeído), sugerindo a existência de duas unidades flavonoídicas. Além disso, oito
sinais em δ 167,7 (C-7); 166,7 (C-4”); 164,0 (C-2”); 163,5 (C-5); 162,2 (C-6”); 161,3 (C-9);
159,5 (C-4’) e 156,4 (C-4”’) foram relacionados a carbonos sp2 oxigenados. Como nenhum
destes carbonos apresentava deslocamento químico no intervalo 144 ≤ δC ≤ 148, deduziu-se
que a estrutura não possuia carbonos oxigenados orto-posicionados.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
72
O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 13, p. 79) revelou a
existência de dois carbonos metilênicos, ao exibir os sinais em δ 45,3 (C-α) e 30,3 (C-β) com
amplitude negativa, em oposição às sete linhas espectrais de carbonos mono-hidrogenados: os
quatro sinais mais intensos, além dos sinais em δ 98,5 (C-5”); 97,5 (C-6) e 95,5 (C-8). Os
carbonos não-hidrogenados, reconhecidos por subtração dos espectros obtidos pelas duas
técnicas de RMN 13C, foram relacionados aos deslocamentos químicos em δ 131,8 (C-1”’);
124,5 (C-1’); 118,6 (C-2); 108,4 (C-3”); 101,9 (C-1”); 99,4 (C-10) e 80,5 (C-3), além
daqueles referentes aos oito carbonos sp2 oxigenados. A ausência dos sinais em δ 203,7 (C-β’)
e 192,7 (C-4) no DEPT135 confirma que estas absorções são referentes a carbonilas de
cetonas.
A tabela 3 (p. 76) apresenta os deslocamentos químicos de 1H e 13C, correlacionando
os hidrogênios aos seus respectivos carbonos, a partir de informações extraídas do espectro
HMQC (Fig. 14, p. 79), através do qual se pôde notar que o singleto em δ 5,96 (H-5”) foi o
único dos sinais simples a apresentar correlação com um sinal de carbono, δ 98,5 (C-5”). Em
virtude da presença de carbonos aromáticos oxigenados, os demais singletos foram atribuídos
a hidroxilas fenólicas, as quais tiveram suas posições determinadas através do espectro
HMBC (Fig. 15, p. 80), segundo correlações dispostas na mesma tabela.
ACCE-5 apresentou o pico do íon molecular com m/z 558,4983 (calculado m/z
558,4891) no espectro de massa de alta resolução (EM-IE, Fig. 16, p. 83), correspondente à
fórmula molecular C30H22O11 (IDH=20), compatível com um esqueleto de biflavonóide
composto por um fragmento de flavanonol e outro di-hidrochalconoídico.
O espectro HMBC forneceu evidências de uma unidade de flavanonol, através das
correlações entre os hidrogênios em δ 7,25 (H-2’,6’), pertencentes a um dos sistemas para-
substituído, com o sinal de carbono sp3 dioxigenado em δ 118,6 (C-2), o qual se encontrava
correlacionado ao hidrogênio hidroxílico do carbono HO-C-3 (δ 6,51). Este mesmo
hidrogênio mostrou-se acoplado com o carbono carbonílico em δ 192,2 (C-4). O anel A do
flavanonol foi identificado por meio das correlações entre o dupleto em δ 5,86 (H-8) com os
sinais de carbonos aromáticos oxigenados em δC 167,7 (C-7) e 161,3 (C-9), o dupleto em δ
5,95 (H-6) com o sinal de carbono aromático oxigenado em δ 163,5 (C-5) e ambos os
dupletos com o sinal de carbono não hidrogenado em δ 99,4 (C-10).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
73
A presença de um fragmento di-hidrochalconoídico foi evidenciada pelos
acoplamentos a longa distância dos hidrogênios metilênicos (δ 3,29 e 2,87; CH2-α e CH2-β)
com a carbonila mais desblindada (δC-β’ 203,7; C-β’). Tal hipótese foi reforçada através das
correlações dos hidrogênios de um dos sistemas para-substituídos (δ 7,02; H-2’”,6’”) com o
carbono metilênico na posição β à carbonila (δ 30,3; C-β’). Também foi importante a
correlação do sinal da hidroxila em δ 13,17 (HO-C-6”) com os sinais de carbonos aromáticos
em δC 101,9 (C-1”); 98,5 (C-5”) e os carbonos aromáticos oxigenados em δC 162,2 (C6”) e
166,7 (C-4”), sendo este último através de um acoplamento em “W” (4J). O acoplamento
entre o H-5” (δ 5,96) com o C-4” (δ 166,7) também foi observado.
Os dois fragmentos que formam a estrutura biflavonoídica de ACCE-5
correspondem aos resíduos dos flavonóides aromadendrina (189) e floretina (190)
(AGRAWAL, 1989), cujos deslocamentos químicos de RMN 13C apresentam um alto grau de
concordância com os registrados para ACCE-5 (Tab. 3, p. 76). No entanto, restando ainda
uma insaturação para completar o IDH calculado, foi sugerida a formação de um anel di-
hidrofurânico entre os carbonos C-2 (δ 118,6) e C-3 (δ 80,5) do fragmento aromadendrina
com os carbonos C-3” (δ 108,4) e C-4” (δ 166,7) do fragmento floretina. O indício que apoiou
esta hipótese foi o acoplamento em “W” (4J) entre o H-5” (δ 5,96), pertencente ao fragmento
da di-hidrochalcona floretina com o C-3 (δC-3 80,5), membro do fragmento do flavanonol
aromadendrina.
A estrutura química de ACCE-5, inédita na literatura, mostrou-se nitidamente
semelhante às estruturas exibidas pelas dafnodorinas (132, 133, 142, 143) (BABA et al.,
1995) (136 e 137) (TANIGUCHI et al., 1996), substâncias isoladas de Daphne odora. ACCE-
5 foi denominada amburanina A (2”,3,4’,4”’,5,6”,7-heptahidroxi-2-O-4”:3-3”-flavanona-
dihidrochalcona).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
74
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
75
O
O
OH
OH
OH
OH
189OOH
OHOH
OH
190
101,9
98,5
162,2
203,7
45,3
118,680,5
192,2
163,5
97,5
167,7
95,5161,3
99,4
124,5
129,3
115,6
159,5
164,0
108,4
166,7
30,3
131,8
130,0
115,9156,4
O O
OOH
OH
OH
OOH
OH
OH
OH
13,175,95
5,867,25
5,96
6,72
7,02
6,629,17
6,5111,02
9,77
3,29
O O
OO
O
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
2,87
11,02
11,70
2
456
7
89
103
3'
4'
5'
6' 2'
1'
1"2"
3"
4"5"
6"
1"'2"'
5"'6"'
3"'
4"'
αβ
β'
Tabela 3- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HMQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e floretina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).
# C
Aromadendrina- Floretina♣ δC (ppm)
ACCE-5 δC (ppm) DMSO-d6
HMQC* δH (ppm)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
2 85,0 118,6 7,25; 6,51 3 73,7 80,5 6,51 (5,96) 4 198,4 192,2 6,51 5 165,3 163,5 5,95 6 97,5 97,5 5,95 (1H, d, 2,0 Hz) 5,86 7 168,8 167,7 5,86 8 96,4 95,5 5,86 (1H, d, 2,0 Hz) 5,95 9 164,6 161,3 5,86 10 101,9 99,4 5,95; 5,86 1' 129,4 124,5 6,72
2', 6' 130,4 129,3 7,25 (2H, d, 8,7 Hz) 3', 5' 116,3 115,6 6,72 (2H, d, 8,7 Hz) 9,77
4' 159,2 159,5 9,77 1" 105,3 101,9 13,17 2" 166,0 164,0 11,70 3" 95,7 108,4 6,51 4" 165,8 166,7 5,96; 5,86 (13,17) 5" 95,7 98,5 5,96 (1H, s) 13,17 6" 166,0 162,2 13,17 β' 206,5 203,7 3,29 2,87 α 47,1 45,3 3,29 (2H, t, 7,7 Hz) 2,87 β 31,4 30,3 2,87 (2H, t, 7,7 Hz) 7,02
1'" 134,0 131,8 2,87 3,29 2'", 6'" 130,2 130,0 7,02 (2H, d, 8,4 Hz) 2,87 3'", 5'" 116,1 115,9 6,62 (2H, d, 8,4 Hz) 9,17
4'" 156,2 156,4 7,01 HO-C3 6,51 HO-C5 11,02 HO-C7 11,02 HO-C2” 11,70 HO-C6” 13,17 HO-C4’ 9,77 HO-C4”’ 9,17 ♣CD3OD
*(int., multip, JH,H)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
76
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
77
Figura 9- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-5 (pastilhas de KBr)
Figura 10- Espectro de RMN 1H de ACCE-5 (DMSO-d6, 500 MHz)
13,175,95
5,867,25
5,96
6,72
7,02
6,629,17
6,5111,02
9,77
3,29
O O
OO
O
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
2,87
11,02
11,70
2
456
7
89
103
3'
4'
5'
6' 2'
1'
1"2"
3"
4"5"
6"
1"'2"'
5"'6"'
3"'
4"'
αβ
β'
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
78
Figura 11- Espectro de RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5
Figura 12- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
79
Figura 13- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-5 (DMSO-d6, 125 MHz)
Figura 14- Espectro de RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
80
Figura 14a- Expansão da região δ 5,5-7,5 x 95,0-133 do espectro HMQC.
Figura 15- Espectro de RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-5
18
25
2223
11
16
7
26
17
19
9
28
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
81
Figura 15a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 6,4-7,6 x 112-131; (II) δ 9,0-13,4 x 153-172; (III) δ 9,0-13,4 x 103-120.
21
20
4 30
O O
OOH
OH
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
1
2
3
31
5
6
7
89
10
11 12
13
15
17
18
19
20
2122
23
14
16
24
25
2627
28
4
29
30
29
34
15 6
12
10
24
8
27
5 14
3
13
2 1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
82
Figura 15b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-5: (I) δ 5,5-7,5 x 95,0-133; (II) δ 5,8-7,4 x 152-171.
O O
OOH
OH
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
OH
1
2
3
31
5
6
7
89
10
11 12
13
15
17
18
19
20
2122
23
14
16
24
25
2627
28
4
29
30
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
83
Figura 16- Espectro de massa de ACCE-5 (Ionização por Impacto Eletrônico)
Figura 17- Espectro de RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-5
5.2. Amburanina B (ACCE-6)
A fração ACCE1AM, sólido marrom originado da partição líquido-líquido do extrato
etanólico das cascas do caule, foi submetida a cromatografias de adsorção e exclusão e
purificada em HPLC (fase reversa), resultando na obtenção de um sólido amarelo (23 mg)
com tR = 8,82 min, sendo denominado ACCE-6 (pf. > 300° C; [α]25D = +4,0°- MeOH, c 0.05)
(ítem 10.1.6.8, p. 278).
A notória similaridade observada entre os espectros de IV (Fig. 18, p. 89) de ACCE-
5 e ACCE-6 sinalizou a uma estreita semelhança estrutural entre eles, confirmada pela
identificação dos mesmos grupos funcionais: hidroxila (3433 cm-1), carbonila (1640 cm-1),
anel aromático (1517 e 1473 cm-1) e carbonos oxigenados de fenol, enol-éter e álcool (1329,
1258 e 1168 cm-1).
O espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, (Fig. 19, p. 89) de ACCE-6
apresentou um par de dupletos em δ 5,95 (H-6) e 5,92 (H-8) (1H, J = 2,0 Hz), associados a
hidrogênios meta-posicionados, um conjunto de dupletos em δ 8,16; 7,28; 6,94 e 6,79 (2H,
J = 8,7 Hz), relacionados a dois sistemas aromáticos para-dissubstituídos, e um conjunto de
singletos em δ 13,30; 11,80; 10,20, 9,78; 9,66; 6,96 e 6,71, cujas integrações foram estimadas
como equivalentes a um hidrogênio, cada sinal. Os dupletos com Jorto foram agrupados
segundo acoplamentos observados no espectro COSY (Fig. 20, p. 90), permitindo
correlacionar os sinais de hidrogênio correspondentes a cada anel benzênico: δ 8,16 (H-
2”’,6”’) com 6,94 (H-3”’,5”’) e δ 7,28 (H-2’,6’) com 6,79 (H-3’,5’). O espectro de RMN 1H
de ACCE-6 demonstrou uma visível semelhança com o obtido para ACCE-5, exceto pela
ausência dos hidrogênios metilênicos em δ 3,29 e 2,87.
O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 21, p. 90) de ACCE-6
também exibiu 26 linhas espectrais, sendo quatro delas mais intensas do que as demais: δ
131,0 (C-2”’,6”’); 129,2 (C-2’,6’); 116,3 (C-3”’,5”’) e 115,7 (C-3’,5’). No entanto, a faixa de
deslocamento químico tornou-se mais estreita (δ 191,8-80,8), devido à inexistência de
carbonos metilênicos e o deslocamento do sinal referente à carbonila, δ 203,7 para 177,1 (C-
4”), compatível com carbonila de cetona conjugada.
Desta forma, o espectro de DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 22, p. 91) tornou-
se mais simples (somente sinais com amplitude positiva), fazendo-se útil apenas para a
distinção entre os carbonos mono-hidrogenados daqueles não-hidrogenados, tendo passado a
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
84
contar com dois carbonos sp2 a mais, δ 148,3 (C-2”) e 136,9 (C-3”), sendo ao menos um deles
oxigenado.
Salvo o singleto em δ 6,71 (H-6”) que se correlacionou com o sinal de carbono em δ
95,6 (C-6”), o espectro de RMN-HMQC de ACCE-6 (Fig. 23, p. 91), tal qual o de ACCE-5,
não mostrou qualquer correlação envolvendo os sinais de carbono e os demais singletos,
sugerindo corresponderem a hidroxilas.
A fórmula molecular C30H18O12 para ACCE-6 foi obtida a partir do íon molecular
com m/z 570,5736 (calculado m/z 570,4567) no espectro de masssa de alta resolução (EM-IE,
Fig. 24, p. 92), correspondente a um Índice de Deficiência de Hidrogênio com duas
insaturações a mais do que a calculada para ACCE-5.
Tendo em vista que as diferenças estruturais entre ACCE-6 e ACCE-5 foram
resultantes de divergências verificadas no fragmento chalconoídico, foi proposta uma
estrutura biflavonoídica, na qual flavanonol (aromadendrina) se encontrava ligado a um
flavonol. Esta hipótese foi justificada através de uma suposta ciclização seguida de oxidação
do aducto floretina, o qual foi convertido num resíduo de campferol (vide proposta
biogenética, p. 244), ou resultante da condensação de duas moléculas de campferol,
atendendo às seguintes evidências espectroscópicas: aumento do IDH, aparecimento de
carbonos sp2 oxigenados e a presença de carbonila conjugada.
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 25, p. 92) corrobora com a proposição estrutural à
medida que revela importantes acoplamentos a longa distância (Tab. 5, p. 88), entre eles, o
acoplamento existente entre os hidrogênios H-2”’,6”’ (δ 8,16) e o carbono C-2” (δ 148,3),
através do qual se pôde inferir a substituição do carbono metilênico (δ 30,3; C-β), existente
em ACCE-5, por um carbono sp2 oxigenado.
É válido atentar para as maiores desblindagens sentidas pelos núcleos de hidrogênios
H-2”’,6”’e HO-C-4”’ em ACCE-6 (δ 8,16; H-2”’,6”’ e δ 10,20; OH-4”’) quando comparados
aos de ACCE-5 (δ- 7,01; H-2”’,6”’e δ 9,17; OH-4”’), resultantes do efeito mesomérico
retirador da carbonila C-4” (conjugada com a dupla ligação α,β) exercido sobre o anel
aromático que suporta estes hidrogênios, nas posições orto e para, respectivamente.
Além disso, os dados de deslocamento químico de 13C do campferol descritos na
literatura foram bem parecidos com os valores encontrados para ACCE-6 (AGRAWAL,
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
85
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
86
1989), exceto aqueles referentes aos carbonos (C-2, C-4, C-5” e C-10”) situados próximos à
junção dos dois fragmentos.
Em alusão à espécie botânica da qual foi isolada, a estrutura química inédita de
ACCE-6 foi denominada amburanina B (3,3”,4’,4”’,5,5”,7-heptahidroxi-2-O-7”:3-8”-
flavanona-flavona).
O
O
OH
OH
OH
OH
191
O O
OOH
OH
OH
OO
OH
OH
OH
OH
118,780,8
191,8164,3
97,8168,4
96,0 161,3
99,6
124,5
129,2
115,7
159,6
106,1152,1
106,9
165,795,6
164,7
177,1
122,2
131,0
116,3160,4
148,3136,9
5,95
5,927,28
6,79
6,71
8,16
6,94
11,80
9,80
6,96
10,20
13,30
9,66
O O
OO
O
OH
OO
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
1023
45
67
8
9
1'2'
3'
4'5'
6'
2" 3"4"
5"
6"7"
8"9" 10"
1"'
2"'
3"'4"'
5"'
6"'
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
87
Tabela 4- Dados de RMN 13C de ACCE-5 e ACCE-6.
# C
ACCE-5 δC (ppm)-DMSO-d6
# C
ACCE-6 δC (ppm)-DMSO-d6
2 118,6 2 118,7 3 80,5 3 80,8 4 192,2 4 191,8 5 163,5 5 164,3 6 97,5 6 97,8 7 167,7 7 168,4 8 95,5 8 96,0 9 161,3 9 161,3 10 99,4 10 99,6 1' 124,5 1' 124,5
2', 6' 129,3 2', 6' 129,2 3', 5' 115,6 3', 5' 115,7
4' 159,5 4' 159,6 1" 101,9 2" 148,3 2" 164,0 3" 136,9 3" 108,4 4" 177,1 4" 166,7 5" 164,7 5" 98,5 6" 95,6 6" 162,2 7” 165,7 β' 203,7 8” 106,9 α 45,3 9” 152,1 β 30,3 10” 106,1
1'" 131,8 1'" 122,2 2'", 6'" 130,0 2'", 6'" 131,0 3'", 5'" 115,9 3'", 5'" 116,3
4'" 156,4 4'" 160,4 HO-C3 HO-C3 HO-C5 HO-C5 HO-C7 HO-C7 HO-C2” HO-C4’ HO-C6” HO-C3” HO-C4’ HO-C5” HO-C4”’ HO-C4”’
Tabela 5- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HMQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aromadendrina e campferol, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).
# C
Aromadendrina- Campferol♣ δC (ppm)
ACCE-6 δC (ppm)
HMQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
2 85,0 118,7 7,28 3 73,7 80,8 6,96 4 198,4 191,8 6,51 5 165,3 164,3 6 97,5 97,8 5,95 (1H, d, 2,0 Hz) 11,80 7 168,8 168,4 5,95 8 96,4 96,0 5,92 (1H, d, 2,0 Hz) 5,95 9 164,6 161,3 5,92
10 101,9 99,6 5,92; 11,80 1' 129,4 124,5 6,72
2', 6' 130,4 129,2 7,28 (2H, d, 8,7 Hz) 3', 5' 116,3 115,7 6,79 (2H, d, 8,7 Hz) 9,78
4' 159,2 159,6 9,78; 6,79 2" 146,8 148,3 8,16 3" 135,6 136,9 4" 175,9 177,1 5" 160,7 164,7 13,30 6" 98,2 95,6 6,71 (1H, s) 13,30 7” 163,9 165,7 6,71 8” 93,5 106,9 9” 156,2 152,1
10” 103,1 106,1 13,30 1'" 121,7 122,2 6,94
2'", 6'" 129,3 131,0 8,16 (2H, d, 8,7 Hz) 3'", 5'" 115,3 116,3 6,94 (2H, d, 8,7 Hz) 10,20
4'" 159,0 160,4 8,16 HO-C3 6,96 HO-C5 11,80 HO-C7 9,80 HO-C4’ HO-C3” 9,66 HO-C5” 13,30 HO-C4”’ 10,20 ♣CD3OD
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
88
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
89
Figura 18- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-6 (pastilha de KBr)
Figura 19- Espectro de RMN 1H de ACCE-6 (DMSO-d6, 500 MHz)
5,95
5,927,28
6,79
6,71
8,16
6,94
11,80
9,80
6,96
10,20
13,30
9,66
O O
OO
O
OH
OO
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
1023
45
67
8
9
1'2'
3'
4'5'
6'
2" 3"4"
5"
6"7"
8"9" 10"
1"'
2"'
3"'4"'
5"'
6"'
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
90
Figura 20- Espectro RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-6
Figura 21- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
91
Figura 22- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-6 (DMSO-d6, 125 MHz)
Figura 23- Espectro RMN-HMQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
92
Figura 24- Espectro de massa de ACCE-6 (Ionização por Impacto Eletrônico)
Figura 25- Espectro RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-6
19
9
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
93
Figura 25a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 5,5-7,6 x 77-108; (II) δ 11,5-13,6 x 89-110; (III) δ 6,4-8,4 x 111-135.
O O
OO
O
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
OH
1
2
3 4
5
6
7
89
10
11
12
1315
17
1819
20
21
14
16
23
22
2411 24
18
7
15
6
22
16
13 12
3
17 4
20
23
10
21
8
14 5
1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
94
Figura 25b- Expansões do espectro HMBC de ACCE-6: (I) δ 11,4-13,4 x 160-169; (II) δ 5,7-8,4 x 126-172.
O O
OO
O
OH
O
O
O
O
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
O
OH
1
2
3 4
5
6
7
89
10
11
12
1315
17
1819
20
21
14
16
23
22
24
Amburosídios
Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 da fração ACSEA, gerada pela
partição H2O/AcOEt do extrato etanólico das sementes, conduziram à obtenção de um sólido
marrom denominado ACSEA(2-11)(11-18)(18-20), o qual foi injetado em HPLC (fase
reversa), resultando na separação de 5 picos: pico 1 (tR = 6,65 min, ACS-7), pico 2 (tR = 9,36
min, ACS-8), pico 3 (tR = 11,06 min, ACS-9), pico 4 (tR = 12,50 min) e pico 5 (tR = 13,57
min, ACS-10). O pico 4 foi reinjetado e desdobrado em dois novos picos: pico 4.1. (tR = 11,69
min, ACS-11) e pico 4.2 (tR = 13,54 min, ACS-12). Este conjunto de picos foi caracterizado
como uma série de amburosídios e identificados como sendo os amburosídios A, C-H.
5.3. Amburosídio A (ACS-7)
A coleta do pico 1 da separação por HPLC forneceu um sólido rosado intitulado
ACS-7 (p.f. 197,8-199,1 °C; [α]20D = -6,8° MeOH, c 0,05) (ítem 10.1.6.6, p. 278).
O espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz, Fig. 26, p. 98) de ACS-7 apresentou
dois sinais duplos em δ 7,37 (2H, d, J = 8,5 Hz) em δ 7,11 (2H, d, J = 8,5 Hz), associados a
hidrogênios aromáticos pertencentes a um sistema para-substituído; um singleto em δ 5,22
(2H, s), atribuído a hidrogênios homotópicos de éster benzílico; sinais numa região
característica de hidrogênios de açúcar (δ 4,93-3,37), bem como um sistema ABX formado
pelos sinais em δ 7,44 (1H, d, J = 2,0 Hz), δ 7,40 (1H, dd, J = 8,2 e 2,0 Hz) e em δ 6,80 (1H,
d, J = 8,2 Hz).
No espectro de RMN 13C-CPD de ACS-7 (75 MHz, CD3OD, Fig. 27, p. 98), foram
exibidas dezoito linhas espectrais, sendo uma delas atribuídas a carbonila de éster (δ 168,3, C-
7’), três foram associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,1 (C-4); 151,9 (C-4’);
146,3 (C-3’). O espectro de RMN 13C-DEPT135 (75 MHz, CD3OD, Fig. 28, p. 99) revelou a
presença de dez carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade foi relacionada a carbonos
aromáticos: δ 130,8 (C-2,6); 123,8 (C-6’); 117,9 (C-3,5); 116,0 (C-5’); e 117,6 (C-2’). O
restante foi associado a carbonos de hexose, δ 102,3 (C-1”); 78,2 (C-5”); 78,1 (C-3”); 75,0
(C-2”) e 71,5 (C-4”) e 62,6 (C-6”), atribuídos como pertencentes a um resíduo de glicose,
além de uma absorção em δ 67,3 (C-7), relacionada a carbonos metilênico oxigenado. As
demais absorções de 13C em δ 131,8 (C-1) e 122,7 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135,
foram reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não-hidrogenados.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
95
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
96
A fórmula molecular C20H22O10, deduzida dos dados de RMN, foi compatível com a
estrutura de um glicosídio di-aromático, identificado como sendo o amburosídio A (lit.: p.f.
195-197 °C; [α]20D = -39°, MeOH, c 0,76), confirmada por co-cromatografia com uma
amostra autêntica em CCD e comparação com espectros de RMN 1H e 13C (CD3OD)
(BRAVO et al., 1999) (Tab. 6, p. 97). O amburosídio A (protocatecuato de 4-O-β-D-
glicopiranosil-benzila) já havia sido isolado das cascas do caule de A. cearensis (BRAVO et
al., 1999; CANUTO et al., 2006).
131,9
130,8
117,9
159,1
67,2
122,8168,3
117,6
146,3151,9
116,0
123,8
102,3
75,078,1 71,5
62,6
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH78,2
7,37
7,11
4,93
7,44
6,80
7,40 5,22
3,463,48
3,70
3,37
3,443,90
1
23
4
567
1'2'
3'4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"6"
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OHH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
Tabela 6- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio A, registrado na literatura (BRAVO et al., 1999).
# C
Amburosídio AδC (ppm) CD3OD
ACS-7 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
1 131,7 131,9 2,6 130,7 130,8 7,37 (2H, d, 8,5 Hz) 3,5 117,7 117,9 7,11 (2H, d, 8,5 Hz) 4 158,9 159,1 7 67,0 67,2 5,22 (2H, s) 1’ 122,6 122,8 2’ 117,4 117,6 7,44 (1H, d, 2,0 Hz) 3’ 146,1 146,3 4’ 151,7 151,9 5’ 115,9 116,0 6,80 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,7 123,8 7,40 (1H, dd, 8,2; 2,0 Hz) 7’ 168,1 168,3 1” 102,1 102,3 4,93 (1H, d, 6,5 Hz)) 2” 74,8 75,0 3,46 (1H, m) 3” 77,9 78,1 3,48 (1H, td) 4” 71,3 71,5 3,37 (1H, m) 5” 78,0 78,2 3,44 (1H, m) 6” 62,4 62,6 3,90 (1H,m); 3,70 (1H, m)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
97
Figura 26- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 300 MHz) de ACS-7
Figura 27- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
98
Figura 28- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 75 MHz) de ACS-7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
99
5.4. Acetato de 6”-amburosila- (ACS-8)
O pico 2 (tR = 9,36 min) apresentou-se como um sólido marrom (pf. 110,2-114,3 °C;
[α]25D= -34°, MeOH, c 0,22), denominado de ACS-8 (ítem 10.1.7.7, p. 286). No espectro de
RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 29, p. 103) de ACS-8, foi caracterizada a presença de um
anel aromático para-dissubstituído [δ 7,37 (H-2,6) e 7,08 (H-3,5); 2H, d, J = 8,6 Hz), um anel
aromático trissubstituído [(δ 7,43; 1H, d, J = 2,1 Hz, H-2’); (7,41; 1H, dd, J = 8,4 e 2,1 Hz, H-
6’), (6,79; 1H, d, J = 8,4 Hz, H-5’)], um grupo oximetilênico (δ 5,23; 2H, s, H-7), um resíduo
de açúcar (δ 4,91-3,39) e um grupo acetila (δ 2,02; 3H, s, H-2”’).
Vinte linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8 (125
MHz, CD3OD, Fig. 30, p. 104), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de éster, δ 172,9 (C-
1”’) e 168,3 (C-7’) e três associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,0 (C-4); 151,9
(C-4’) e 146,3 (C-3’).
O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (125 MHz, CD3OD, Fig. 31, p. 105)
revelou a presença de dez sinais atribuídos a carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade
foi relacionada a carbonos aromáticos: δ 130,8 (C-2,6); 123,9 (C-6’); 118,0 (C-3,5); 117,6 (C-
2’); 116,1 (C-5’). O restante foi associado a carbonos glicosídicos, δ 102,3 (C-1”); 78,0 (C-
3”); 75,6 (C-5”); 75,0 (C-2”) e 72,0 (C-4”), juntamente com o carbono metilênico oxigenado
em δ 67,2 64,8 (C-6”). A absorção em δ 20,9 (C-2”’) ratificou a existência de uma metila. As
absorções de 13C, δ 132,1 (C-1) e 122,9 (C-1’), ausentes no espectro DEPT 135, foram
reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não hidrogenados.
No espectro de massa de ACS-8 (EM-IES, Fig. 32, p. 105) foi detectado o íon
[M+Na]+ em m/z 487,1322, correspondente à fórmula molecular C22H24O11. O IDH, calculado
como sendo igual a onze, sugere que as insaturações correspondem a três anéis (dois
benzênicos e um glicosídico) e a duas carbonilas.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 33, p. 106) forneceu as correlações dos
hidrogênios ligados diretamente aos seus carbonos, permitindo atribuir as absorções
pertencentes a cada sistema aromático e à unidade de açúcar (Tab. 7, p. 102).
O espectro RMN-HMBC (Fig. 34, p. 107) demonstrou a posição de ligação do
grupo acetila com o resíduo de glicose, através das correlações entre os hidrogênios metílicos
H-2”’ (δ 2,02) com o carbono C-6” (δ 64,8), e entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δ 4,39
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
100
e 4,24) com o carbono carbonílico C-2”’ (δ 172,9).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
101
ACS-8 foi identificada como sendo protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-
acetilglicopiranosil)-benzila também denominada amburosídio D. Esta substância inédita
corresponde a um derivado acetilado do amburosídio A, glicosídio fenólico já isolado das
cascas do caule desta mesma espécie (BRAVO et al., 1999).
132,1
130,8
118,0
159,0
67,2
122,9 168,3117,6
146,3151,9
116,1
123,9
102,3
75,078,0
72,0
75,6
64,8
20,9172,9
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
7,37
7,08
4,91
7,43
6,79
7,41 5,23
3,46
3,47
4,39
3,39
3,64 4,241
23
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
2"'
1"'
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
2,02
Tabela 7- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-8 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 132,1 5,23 7,08 2,6 130,8 7,37 (2H, d, 8,6 Hz) 5,23 3,5 118,0 7,08 (2H, d, 8,6 Hz) 4 159,0 7,08 7,37 7 67,2 5,23 (2H, s) 7,37 1’ 122,9 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,1 Hz) 7,41 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,4 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,4 e 2,1 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; (6,79); 5,23 1” 102,3 4,91 (1H, d, 7,4 Hz) 2” 75,0 3,46 (1H, m) 3” 78,0 3,47 (1H, td) 3,46; 3,39 4” 72,0 3,39 (1H, m) 4,39; 3,46 5” 75,6 3,64 (1H, m) 4,24 6” 64,8 4,39 (1H, d); 4,24 (1H, dd) 3,39; 2,02 1”’ 172,9 2,02 4,39; 4,24 2”’ 20,9 2,02 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
102
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
103
Figura 29- Espectro de RMN 1H de ACS-8 (CD3OD, 500 MHz)
7,37
7,08
4,91
7,43
6,79
7,41 5,23
3,46
3,47
4,39
3,39
3,64 4,241
23
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
2"'
1"'
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
2,02
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
104
Figura 30- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 30a- Expansão da região δ 98-125 do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-8
132,1
130,8
118,0
159,0
67,2
122,9 168,3117,6
146,3151,9
116,1
123,9
102,3
75,078,0
72,0
75,6
64,8
20,9172,9
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
105
Figura 31- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-8 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 32- Espectro de massa de ACS-8 (Ionização por Electrospray)
311.1169
377.1289
416.3467
487.1322
200 300 400 500 600 m/z0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
5x10Intens.
12ACS-p2.d: +MS, 100%=223607
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
106
Figura 33- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8
Figura 33a- Expansões do espectro HSQC de ACS-8: (I) δ 3,3-5,4 x 62-81; (II) δ 6,7-7,5 x 114-133.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
107
Figura 34- Espectro RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-8
Figura 34a- Expansões do espectro HMBC de ACS-8: (I) δ 6,7-7,5 x 115-135; (II) δ 6,7-7,5 x 143-162.
4
3
14 12
2
1
1
2
3
45
67
8
910
11 12
1314 15O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
16
11
6
10
8
5,7
13
16 9 15
5.5. Protocatecuato de 6”-amburosila (ACS-9)
Denominado ACS-9 (ítem 10.1.7.7, p. 286), o pico 3 (tR = 11,06 min) correspondeu
a um sólido marrom (pf. 126,1-129,0 °C; [α]25D = -26°, MeOH, c 0,12) cujo espectro de RMN
1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 35, p. 112) mostrou um conjunto de sinais na faixa de δ 4,92-
3,50, associados a hidrogênios glicosídicos, um singleto em δ 5,18 (2H, H-1), atribuído a
hidrogênios de carbono oximetilênico. No espectro COSY (Fig. 36, p. 112), foram
observadas correlações entre os sinais na região de aromáticos formando dois sistemas ABX
[I-δ 7,43 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,41 (dd, J = 8,1 Hz; J = 2,0 Hz, H-6’) e 6,79 (d, J = 8,1 Hz,
H-5’); II-7,47 (d, J = 2,0 Hz, H-2”’), 7,45 (dd, J = 8,2 Hz; J= 2,0 Hz, H-6”’) e 6,83 (d, J = 8,2
Hz, H-5”’)], todos os sinais com integração para um hidrogênio, e um sistema AA’BB’ [δ
7,26 (H-2,6) e 7,06 (H-3,5) (2H, d, J = 8,6 Hz].
No espectro de RMN 13C de ACS-9 (CPD-125 MHz, CD3OD, Fig. 37, p. 113)
foram observadas 25 absorções, duas das quais associadas a carbonilas de éster, δ 168,3 (C-
7’) e 168,2 (C-7”’), e cinco relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 158,9 (C-4);
152,0 (C-4”’); 151,9 (C-4’); 146,4 (C-3”’) e 146,3 (C-3’), sendo os dois últimos
deslocamentos químicos característicos de catecóis (FRIEBOLIN, 1991). O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, MeOD, Fig. 38, p. 113) exibiu 13 linhas espectrais atribuídas a
carbonos mono-hidrogenados, das quais oito foram relacionadas a carbonos aromáticos (δ
130,9; 124,0; 123,9; 118,0; 117,8; 117,6; 116,6 e 116,0) e cinco foram consideradas como
pertencentes a carbonos oxigenados sp3: δ 102,3 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,8 (C-5”); 75,0 (C-2”)
e 72,1 (C-4”). Outras duas linhas espectrais foram associadas a carbonos oximetilênicos δ
67,2 (C-7) e 65,0 (C-6”). Subtração dos espectros de RMN 13C- CPD e DEPT135 permitiu
associar as absorções em δ 131,9 (C-1); 122,8 (C-1’) e 122,7 (C-1”’) a carbonos aromáticos
não-hidrogenados. Através da comparação dos dados de RMN 13C do fragmento de açúcar
com os descritos na literatura, foi possível confirmar a existência do resíduo de glicose na
estrutura (BREITMAIER, 1974).
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 39, p. 114) revelou as correlações dos hidrogênios
ligados diretamente a seus respectivos carbonos, como o sinal de hidrogênio em δ 5,18 (H-7)
com o sinal de carbono metilênico oxigenado em δ 67,2 (C-7) e o dupleto em δ 4,92 (H-1”’)
com a absorção do carbono anomérico em δ 102,3 (C-1”), permitindo também atribuir os
sinais de hidrogênios pertencentes a cada anel aromático (Tab. 8, p. 111).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
108
A fórmula molecular C27H26O13 foi deduzida através dos picos dos adutos
moleculares [M+Na]+ com m/z 581,1386 e [M+K]+ com m/z 597,1115, observados no
espectro de massas EM-IES (Fig. 40, p. 114), sendo compatível com uma estrutura formada
pelos grupamentos identificados por RMN: três anéis aromáticos (um para-dissubstituído e
dois catecóis), dois grupos ésteres, um carbono oximetilênico e uma glicose.
A presença de um fragmento benziloxi foi constatada a partir das correlações entre
os hidrogênios aromáticos H-2,6 (δH 7,26) com o carbono oximetilênico (C-7) e
reciprocamente entre os hidrogênios oximetilênicos H-7 (δH 5,18) com os carbonos
aromáticos C-2,6 (δC 130,9), e C-1 (δC 131,9), verificados no espectro de RMN-HMBC (Fig.
41, p. 115).
As correlações entre os hidrogênios do grupo catecol H-2’ e H-6’ (δH 7,43 e 7,41)
com a carbonila C-7’ (δC 168,3) e os acoplamentos entre hidrogênios catecólicos H-2”’ e H-
6”’ (δ 7,47 e 7,45) com a carbonila C-7”’ (δC 168,2) revelaram a existência de dois
fragmentos protocatecuoílas (3,4-di-hidroxi-benzoil). Esterificações envolvendo os
fragmentos protocatecuoílas com o fragmento benziloxi e o resíduo de glicose (na posição 6”)
foram deduzidas através das correlações entre os hidrogênios metilênicos H-7 (δH 5,18) com a
carbonila C-7’ (δC 168,3) e entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δH 4,63 e 4,38) com a
carbonila C-7”’ (δC 168,2), respectivamente. Por fim, o acoplamento entre o hidrogênio
anomérico H-1” (δH 4,92) e o carbono aromático oxigenado C-4 (δC 158,9) forneceu
evidência irrefutável da ligação heterosídica entre o fragmento benziloxi e o resíduo de
glicose, na posição1.
A estrutura química de ACS-9 não tem precedentes de registro na literatura,
justificando a designação comum de amburosídio E [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-
protocatecuoilglicopiranosil)-benzila].
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
109
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
110
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HHH
H
7,26
7,06
4,92
7,43
6,79
7,41 5,18
3,50
3,514,63
3,45
3,734,38
7,47
1
23
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'
2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'7,456,83
132,0
130,8
118,1
159,0
67,1
122,8168,3117,6
146,3151,9
116,0123,8
102,4
75,078,1
72,0
75,7
64,7
122,7
168,2
117,8
146,4
152,0O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
116,6
124,0
Tabela 8- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-9 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 131,9 5,18 7,06 2,6 130,9 7,26 (2H, d, 8,6 Hz) 7,06 5,18 3,5 118,0 7,06 (2H, d, 8,6 Hz) 7,26 4 158,9 7,06 7,26; 4,92 7 67,2 5,18 (2H, s) 7,26 1’ 122,8 7,43 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,0 Hz) 7,41 3’ 146,3 6,79 4’ 151,9 7,43; 7,41 5’ 116,0 6,79 (1H, d, 8,1 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, d, 8,1; 2,0 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; 5,18; (6,79) 1” 102,3 4,92 (1H, d, 7,4) 3,50 3,77 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,45 4,38 4” 72,1 3,45 (1H, m) 4,63; 4,38 5” 75,8 3,77 (1H, m) 4,92; 3,77 6” 65,0 4,63 (1H, m); 4,38 (1H, m) 3,45; 3,77 1”’ 122,7 6,83 2”’ 117,8 7,47 (1H, d, 2,0 Hz) 7,45 3”’ 146,4 6,83 4”’ 152,0 7,47; 7,45 5”’ 116,6 6,83 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 124,0 7,45 (1H, d, 8,2; 2,0 Hz) 7,47 7”’ 168,2 7,47; 7,45 4,63; 4,38; (6,83)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
111
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
112
Figura 35- Espectro de RMN 1H de ACS-9 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 36- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-9.
Figura 36a- Expansão da região δ6,7-7,7 x 6,5-7,7
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HHH
H
7,26
7,06
4,92
7,43
6,79
7,41 5,18
3,50
3,514,63
3,45
3,734,38
7,47
1
23
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'
2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'7,456,83
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
113
Figura 37- Espectro de RMN 13C (CPD) de ACS-9 (MeOD, 125 MHz)
Figura 38- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-9 (CD3OD, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
114
Figura 39- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9
Figura 40- Espectro de massa de ACS-9 (Ionização por Electrospray)
299.0809
329.0934 349.1898
365.1627393.2179
416.3436
444.3760
487.1301503.1048
517.1296
533.1161
581.1386597.1115
300 350 400 450 500 550 600 m/z0
1
2
3
4
5
4x10Intens.
13acs-p3.d: +MS, 100%=48536
Figura 39a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 104-134
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115
Figura 41- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-9
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
16
18
O
OH
OH
H
H
H
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
17
19
20
2122
10
6
118
13
15
17 4
18
16
19
22
1
2
14
12
3 21
5
7
9
15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
116
Figura 41a- Expansões do espectro HMBC de ACS-9: (I) δ 6,6-7,7 x 143-163; (II) δ 4,3-7,5 x 164-173.
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
16
18
O
OH
OH
H
H
H
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
17
19
20
2122
5.6. Ferulato de 6”-amburosila (ACS-10)
Um sólido marrom (pf. 108,7-112,2 °C; [α]25D = -33° MeOH, c 0,60) denominado
ACS-10 (ítem 10.1.7.7, p. 286), foi isolado por HPLC a partir da fração ACSEA(2-11)(11-
18)(18-20), resultante de sucessivas cromatografias gravitacionais da fração acetato de etila
do extrato etanólico das sementes, tendo sido o último pico a ser coletado (tR = 13,57 min).
O espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 42, p. 121) de ACS-10 apresentou
um par de dupletos em δ 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’) (1H, J = 16,0 Hz), referentes a
hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, outro par de dupletos em δ 7,28 (H-2,6) e
7,07 (H-3,5) (2H, J = 8,7 Hz), característicos de anel benzênico para-dissubstituído, dois
singletos agudos em δ 5,09 (2H, H-7) e 3,86 (3H, H-3”’), sendo este último compatível com
hidrogênios metoxílicos, enquanto que o mais desblindado foi relacionado a hidrogênios
ligados a carbono oxigenado. Foram ainda observados um conjunto de sinais numa região
característica de hidrogênios de açúcar (δ 4,90-3,43) e duas tríades de sinais, atribuídos a
hidrogênios pertencentes a anéis aromáticos 1,2,4-trissubstituídos: (A) δ 7,40; 7,37 e 6,77- (B)
δ 7,16; 7,04 e 6,79, assim reunidos após análise do espectro COSY (Fig. 43, p. 121) .
Vinte oito linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD (125
MHz, CD3OD, Fig. 44, p. 122), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de ésteres, δ 169,1
(H-9”’) e 168,2 (C-7’) e cinco associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ 158,9 (C-4); 151,9 (C-
4’); 150,8 (C-4”’); 149,5 (C-3”’) e 146,3 (C-3’).
O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACS-10 (125 MHz, CD3OD, Fig. 45, p. 123)
revelou a presença de quinze carbonos mono-hidrogenados, dos quais dez foram relacionados
a carbonos sp2 (δ 147,3; 130,9; 124,4; 123,9; 118,0; 117,6; 116,6; 116,0; 115,4 e 111,8) e o
restante foi associado a carbonos sp3 oxigenados: δ 102,3 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,7 (C-5”);
75,0 (C-2”) e 72,0 (C-4”), confirmando uma estrutura heterosídica, tendo o carbono em δ
102,3 como provável carbono anomérico (C-1”). Absorções em δ 67,2 (C-7) e 64,7 (C-6”)
foram atribuídas a carbonos metilênicos oxigenados, já a absorção em δ 56,6 (4”’-OMe)
ratificou a existência de uma metoxila. As demais absorções de 13C em δ 131,9 (C-1); 127,8
(C-1”’) e 122,8 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135, foram reconhecidas como sendo de
carbonos aromáticos não-hidrogenados.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 46, p. 123) mostrou correlações dos sinais de
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
117
hidrogênios olefínicos em δH 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’) com os sinais de carbono em δC
147,2 (C-7”’) e 115,4 (C-8”’), respectivamente, sugerindo que a olefina estivesse conjugada a
uma das carbonilas, devido às significativas diferenças de deslocamentos químicos
homonucleares (∆δH7”’,8”’ = 1,24 e ∆δC7”’,8”’ = 31,8). A correlação entre as absorções δ 5,09 (H-
7) e δ 67,2 (C-7) elucidou o caráter oxigenado do carbono metilênico, formando
possivelmente um grupo éster. A atribuição feita ao carbono anomérico foi corroborada pela
correlação entre as absorções em δ 4,90 (H-1”) e 102,3 (C-1”), sendo sua configuração
determinada como β através da constante de acoplamento JH,H = 7,4 Hz. O açúcar foi
identificado como glicose, após comparação dos seus dados de RMN 13C com os registrados
na literatura (BREITMAIER, 1974).
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 47, p. 124), através dos acoplamentos
heteronucleares a longa distância (2J e 3J), forneceu as informações necessárias para a
conexão de cada fragmento identificado (Tab. 9, p. 120): três anéis fenólicos (um para-
dissubstituído e outros dois 1,2,4-trissubstituídos, sendo um deles metoxilado), dois grupos
ésteres, um carbono oximetilênico, uma carbonila α,β-insaturada e um fragmento de glicose,
resultando na fórmula molecular C30H30O13, a qual foi ratificada pela presença dos picos dos
adutos moleculares [M+Na]+ m/z 621,1726 e [M+K]+ m/z 637,1472, no espectro de massa de
ACS-10 (EM-IES, Fig. 48, p. 126).
A correlação entre o singleto em δH 5,09 (H-7) com o sinal de carbono em δC 168,2
(C-7’) reforçou a existência de um grupo éster ligado a um dos anéis fenólicos
trissubstituídos, conforme evidências obtidas pelas correlações entre as absorções em δH 7,40
e 7,37 (H-2’,6’) com δC 168,2 (C-7’). Correlações entre o singleto em δH 5,09 (H-7) com os
sinais de carbonos aromáticos em δC 131,9 (C-1) e 130,9 (C-2,6), bem como o acoplamento
entre os hidrogênios aromáticos em δH 7,28 (H-2,6) com o carbono metilênico em δC 67,2 (C-
7) justificaram a ligação do anel benzênico para-dissubstituído à porção oximetilênica do
éster.
Os sinais de hidrogênios olefínicos em δH 7,61 (H-7”’) e 6,37 (H-8”’)
correlacionaram-se com a carbonila em δC 169,1 (C-9”’), corroborando com a presença de
uma carbonila α,β-insaturada. As correlações envolvendo os hidrogênios olefínicos H-7”’ e
H-8”’ (δH 7,61e 6,37) e o hidrogênio aromático H-5”’ (δH 6,79) com o carbono aromático
não-hidrogenado C-1”’ (δC 127,8), além das correlações dos hidrogênios aromáticos H-2”’ e
H-6”’ (δH 7,16 e 7,04) com o carbono olefínico C-7”’ (δC 147,2) revelaram a existência de um
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
118fragmento cinamoíla. Como a metoxila foi posicinada no C-3”’, devido ao acoplamento entre
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
119
os hidrogênios metílicos H-3”’ (δ 3,86) e este carbono aromático C-3”’ (δ 149,5), o fragmento
cinamoíla foi caracterizado precisamente como sendo feruloíla.
O acoplamento entre o hidrogênio anomérico H-1” (δ 4,90) com o carbono
oxigenado do anel aromático para-dissubstituído C-4 (δ 158,9) definiu um dos pontos de
ligação do resíduo de açúcar (glicose) com uma das agliconas, uma vez que também foram
observadas correlações entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δ 4,52 e 4,38) e a carbonila do
fragmento feruloíla C-9”’ (δ 169,1), justificando o desblindagem destes mesmos hidrogênios.
A substância ACS-10 é nova na literatura, merecendo a denominação trivial de
amburosídio F [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-feruloilglicopiranosil)-benzila].
131,9
130,9
118,0
158,9
67,2
122,8168,2117,6
146,3151,9
116,0
123,9
102,3
75,078,1
72,0
75,7
64,7
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
147,2
115,4
169,1
127,8
111,8
149,5
116,6150,8
124,4
56,6
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H
H
HH
HH
7,28
7,07
4,90
7,40
6,77
7,37 5,09
3,50
3,514,52
3,43
3,76 4,38
6,37
7,61
7,16
6,79
7,041
2
3
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"6"
1"'2"'
3"'
4"'
5"'
6"' 7"'8"'
9"'
3,86
Tabela 9- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-10 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-10 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
1 131,9 7,07 2,6 130,9 7,28 (2H, d, 8,7 Hz) 5,09 3,5 118,0 7,07 (2H, d, 8,7 Hz) 7,28 4 158,9 7,07 7,28; 4,90 7 67,2 5,09 (2H, s) 7,28 1’ 122,8 6,77 2’ 117,6 7,40 (1H, d, 2,0 Hz) 7,37 3’ 146,3 7,40 6,77 4’ 151,9 7,40; 7,37 5’ 116,0 6,77 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,9 7,37 (1H, dd, 8,2 e 2,0 Hz) 7,40 7’ 168,2 5,09 7,40; 7,37 1” 102,3 4,90 (1H, d, 7,4) 3,50 3,76 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,50; 3,43 4,38 4” 72,0 3,43 (1H, m) 3,76 4,38; 3,50 5” 75,7 3,76 (1H, m) 3,43 6” 64,7 4,52 (1H, d); 4,38 (1H, dd) 1”’ 127,8 7,61 6,79; 6,37 2”’ 111,8 7,16 (1H, d, 1,8 Hz) 7,61; 7,04 3”’ 149,5 6,79; 3,86 4”’ 150,8 7,16; 7,04 5”’ 116,6 6,79 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 124,4 7,04 (1H, dd, 8,2 e 1,8 Hz) 7,61; 7,16 7”’ 147,2 7,61 (1H, d, 16,0 Hz) 7,16; 7,04 8”’ 115,4 6,37 (1H, d, 16,0 Hz) 7,61 9”’ 169,1 6,37
3”’-OMe 56,6 3,86 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
120
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
121
Figura 42- Espectro de RMN 1H de ACS-10 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 43- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-8
Figura 43a- Expansão da região δ 6,2-7,7 x 6,2-7,7
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH 3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H
H
HH
HH
7,28
7,07
4,90
7,40
6,77
7,37 5,09
3,50
3,514,52
3,43
3,76 4,38
6,37
7,61
7,16
6,79
7,041
2
3
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"6"
1"'2"'
3"'
4"'
5"'
6"' 7"'8"'
9"'
3,86
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
122
Figura 44- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 44a- Expansão da região δ 108-135 do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
123
Figura 45- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-10 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 46- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10
Figura 46a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 110-135
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
124
Figura 47- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-10
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H
H
HH
HH
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
1617
1920
21
22
23
24
2518
10
8
24
14
13
91516 5
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
125
Figura 47a- Expansões do espectro HMBC de ACS-10: (I) δ 6,7-7,5 x 142-162; (II) δ 6,3-7,8 x 120-136; (III) δ 6,9-8,0 x 108-121.
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H
H
HH
HH
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
1617
1920
21
22
23
24
2518
6
17
11
19
25
4 20
22 23
12
18
3
1
2
21
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
126
Figura 48- Espectro de massa de ACS-10 (Ionização por Electrospray)
203.0568244.2663267.1892
288.2934
316.3247
339.1140
360.3538
377.1073
416.3440
444.3762
463.3113 510.3311 544.3949 569.3204
591.1615
621.1726
637.1472
200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 m/z0
1
2
3
4
5
4x10Intens.
14ACS-p5.d: +MS, 100%=51173
5.7. Vanilato de 6”-amburosila (ACS-11)
A reinjeção do quarto pico (tR = 12,50 min) da separação por HPLC de ACSEA(2-
11)(11-18)(18-20), fração oriunda do extrato etanólico das sementes de A. cearensis, permitiu
o isolamento do pico 4.1 (tR = 11,69 min), o qual apresentou-se como um sólido marrom com
pf. 102,6-106,9 °C e [α]25D = -27°, MeOH, c 0,22, sendo denominado ACS-11 (ítem 10.1.7.7,
p. 286).
Os espectros de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 49, p. 130) e 13C (125 MHz,
CD3OD, Fig. 50 e 51, p. 130 e 131) de ACS-11 mostraram-se nitidamente muito semelhantes
aos espectros exibidos por ACS-9, exceto pela existência de sinais em δH 3,83 (3H, s, 3”’-
OMe) e em δC 56,7 (3”’-OMe), os quais foram atribuídos a uma metoxila.
O espectro de RMN-COSY (Fig. 52, p. 131) permitiu a identificação de dois
sistemas aromáticos ABX [I-δ 7,43 (d, J = 2,0 Hz, H-2’), 7,41 (dd, J = 8,2 Hz; J = 2,0 Hz, H-
6’) e 6,79 (d, J = 8,2 Hz, H-5’); II-7,59 (dd, J = 8,2 Hz; J = 1,8 Hz, H-6”’), 7,54 (d, J = 1,8
Hz, 2”’) e 6,87 (d, J = 8,2 Hz, H-5”’)] e um sistema AA’BB’ (δ 7,21 e 7,05-2H, d, J = 8,6 Hz,
H-2,6 e H-3,5).
Através do espectro de RMN-HSQC (Fig. 53, p. 132), foi possível correlacionar os
hidrogênios pertencentes a cada anel aromático com seus respectivos carbonos (Tab. 10, p.
129), bem como confirmar a presença de glicose na estrutura, a partir dos acoplamentos entre
os hidrogênios osídicos (δH 4,93-3,44) e os carbonos sp3 oxigenados: 102,4 (C-1”); 78,1 (C-
3”); 75,8 (C-5”); 75,0 (C-2”); 72,2 (C-4”) e 65,2 (C-6”). A correlação do singleto em δH 5,17
(2H, s, H-7) com o sinal de carbono em δC 67,2 (C-7) ratificou a existência de um grupo
oximetilênico.
A metoxila foi posicionada no carbono C-3”’, em virtude da correlação observada,
no espectro HMBC (Fig. 54, p. 132), entre os hidrogênios metoxílicos (δH 3,83) e o carbono
aromático C-3”’ (δC 148,9).
Intitulada amburosídio G [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-vaniloilglicopiranosil)-
benzila], ACS-11 representa um registro novo para a literatura científica.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
127
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
128
131,9
130,7
117,9
158,9
67,2
122,8168,3117,6
146,3151,9
116,1
123,9
102,4
75,078,1
72,2
75,8
65,2
122,6
168,0
114,0
148,9
153,2O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OCH3
OH
116,2
125,4
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OCH3
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HHH
H
7,21
7,05
4,90
7,43
6,79
7,41 5,17
3,50
3,51
4,68
3,44
3,784,40
7,54
1
23
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'7,596,87
Tabela 10- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-11 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-11 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 131,9 5,17 2,6 130,7 7,21 (2H, d, 8,6 Hz) 7,05 5,17 3,5 117,9 7,05 (2H, d, 8,6 Hz) 7,21 4 158,9 7,05 7,21; 4,93 7 67,2 5,17 (2H, s) 7,21 1’ 122,8 7,43 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 2,0 Hz) 7,41; 6,79 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,43; 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,2 e 2,0 Hz) 7’ 168,3 5,17 7,43; 7,41; (6,79) 1” 102,4 4,93 (1H, d, 7,4 Hz) 2” 75,0 3,50 (1H, m) 3,49 3” 78,1 3,51 (1H, td) 3,47; 3,45 4” 72,2 3,44 (1H, m) 5” 75,8 3,78 (1H, m) 4,40 6” 65,2 4,68 (1H, m); 4,40 (1H, m) 1”’ 122,6 7,54 6,87 2”’ 114,0 7,54 (1H, d, 1,8 Hz) 7,59 3”’ 148,9 7,54 6,87; 3,83 4”’ 153,2 6,87 7,59; 7,54 5”’ 116,2 6,87 (1H, d, 8,2 Hz) 6”’ 125,4 7,59 (1H, dd, 8,2 e 1,8 Hz) 7”’ 168,0 7,59; 7,54; (6,87); 4,68
3”’-OMe 56,7 3,83 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
129
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OCH3
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HHH
H
7,21
7,05
4,90
7,43
6,79
7,41 5,17
3,50
3,51
4,68
3,44
3,784,40
7,54
1
23
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'7,596,87
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
130
Figura 49- Espectro de RMN 1H de ACS-11 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 50- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 50a- Expansão da região δ 102-135
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
131
Figura 51- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-11 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 52- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-11
Figura 52a- Expansão da região δ 6,5-7,7 x 6,5-7,7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
132
Figura 53- Espectro RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11
Figura 54- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-11
10
6 11 8
20
1314 12
Figura 53a- Expansão da região δ 6,7-7,7 x 102-132
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
133
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
16
18
O
OH
OCH3
H
H
H
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
17
19
20
21
22
Figura 54a- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 4,2-7,8 x 173-165; (II) δ 6,7-7,7 x 142-156.
4
17 19
1
2
18 16
3
22
21
5,7 9
15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
134
C,H
140), foram feitas as atribuições dos sinais de carbonos hidrogenados pertencentes a cada anel
5.8. Sinapato de 6”-amburosila (ACS-12)
O pico 4.2 (tR = 13,54 min), obtido na segunda tentativa de isolamento dos
componentes coletados no quarto pico do cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-
11)(11-18)(18-20), rendeu um sólido marrom (pf. 126,9-131,4 °C; [α]25D = -27°, MeOH, c
0,20), intitulado ACS-12 (ítem 10.1.7.7, p. 286).
No espectro de RMN 1H de ACS-12 (500 MHz, CD3OD, Fig. 55, p. 138), foram
observados sinais na região de hidrogênios glicosídicos (δ 4,93-3,45), um singleto em δ 5,10
(2H, s, H-7), relacionado a hidrogênio oximetilênico, um par de dupletos em δ 7,30 e 7,08
(2H, J = 8,6 Hz, H-2,6 e H-3,5), compatíveis com um anel benzênico para-dissubstituído, e
uma tríade de sinais em δ 7,39 (H-2’); 7,36 (H-6’) e 6,76 (H-5’), atribuídos a hidrogênios
pertencentes a anel benzênico 1,2,4-trissubstituído, sendo todos os sinais característicos de um
amburosídio. O espectro COSY (Fig. 56, p. 139) ratificou o padrão de substituição. Em
virtude da presença de um par de dupletos em δ 7,62 e 6,42 (1H, J = 15,9 Hz, H-7”’ e H-8”’),
referentes a hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, juntamente com o singleto em δ
6,90 (2H, s, H-2”’,6”’), associado a hidrogênios de anel aromático tetrassubstituído, e δ 3,86
(6H, s, 3”’,5”’-OMe), compatível com hidrogênios metoxílicos, foi sugerida uma estrutura de
um derivado dimetoxi-cinâmico do amburosídio.
Vinte seis linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACS-
12 (125 MHz, CD3OD, Fig. 57, p. 139), sendo duas delas atribuídas a carbonilas de ésteres (δ
169,0, C-9”’ e 168,2, C-7’) e outras cinco foram associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ
159,0 (C-4); 151,9 (C-4’); 149,7 (C-3”’,5”’) 146,3 (C-3’) e 140,0 (C-4”’), sendo esta última
absorção característica de carbono aromático oxigenado de derivados do floroglucinol
(FRIEBOLIN, 1991). O sinal em δ 57,1 (C-3”’,5”’) foi atribuído a metoxila. Os sinais em δ
102,4 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,7 (C-5”); 75,0 (C-2”); 72,0 (C-4”) e 64,7 (C-6”) foram
associados ao resíduo de glicose. O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig.
58, p. 140) mostrou apenas dois carbonos metilênicos (δ 67,1, C-7 e 64,7, C-6”), dos quais o
mais desblindado foi relacionado ao carbono oximetilênico ligado ao anel para-dissubstituído
(benziloxi). Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135 revelou as linhas
espectrais relativas aos carbonos aromáticos não-hidrogenados: δ 132,0 (C-1); 126,8 (C-1”’) e
122,8 (C-1’).
Através das correlações existentes no espectro de RMN-HSQC (1J ) (Fig. 59, p.
aromático: anel para-dissubstituído (δC 130,7 e 117,9); anel 1,2,4-trissubstituído (δC 123,9;
117,6 e 116,1) e anel tetrassubstituído (δC 107,2). As correlações dos dupletos em δH 7,62 (H-
7”’) e 6,42 (H-8”’) com os sinais de carbono em δC 147,5 (C-7”’) e 115,9 (C-8”’),
respectivamente, corroboraram a presença de uma olefina.
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 60, p. 141) corroborou a existência de um
fragmento cinâmico, ao revelar os acoplamentos dos hidrogênios olefínicos H-7”’ e H-8”’
com a carbonila C-9”’ (δC 169,0) e com os carbonos aromáticos C-1”’ (δC 126,8) e C-2”’,6”’
(δC 107,2).
As substituições do fragmento cinâmico nas posições 1”’, 3”’, 4”’ e 5” foram
justificadas pelas correlações entre os hidrogênios aromáticos H-2”’,6”’ (δH 6,90) com o
carbono olefínico C-7”’ (δC 147,5) e com os carbonos aromáticos C-1”’ (δC 126,8), C-3”’,5”’
(δC 149,7) e 4”’ (δC 140,0), sendo este padrão de substituição reforçado pela presença de um
singleto no espectro de RMN 1H, com integração para dois hidrogênios (Tab. 11, p. 137).
As metoxilas foram posicionadas nos carbonos C-3”’,5”’ devido à correlação do
singleto agudo em δH 3,86 com o sinal de carbono em δC 149,7, resultando na caracterização
estrutural do fragmento cinâmico sinapoíla.
A evidência do fragmento sinapoíla ligado ao resíduo de glicose, na posição 6”, foi
fornecida pelas correlações entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (δH 4,51 e 4,40) e a
carbonila C-9”’ (δ 169,0).
ACS-12, denominada amburosídio H [protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-
sinapoilglicopiranosil)-benzila] é uma substância química original, pela primeira vez relatada
na literatura.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
135
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
136
132,0
130,8
118,1
159,0
67,1
122,8168,2117,6
146,3151,9
116,0123,8
102,4
75,078,1
72,0
75,7
64,7
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H3CO 147,5
115,9
169,0
126,8
107,2
149,7
140,0
57,1
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H3CO
H
HH
HH
7,30
7,08
4,93
7,39
6,76
7,36 5,10
3,47
3,49
4,51
3,45
3,73 4,40
6,42
7,62
6,903,86
1
2
3
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'
8"'
9"'
Tabela 11- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-12 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-12 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 132,0 5,10 7,30 2,6 130,8 7,30 (2H, d, 8,6 Hz) 7,08 5,10 3,5 118,1 7,08 (2H, d, 8,6 Hz) 7,30 4 159,0 7,08 7,30; 4,93 7 67,1 5,10 (2H, s) 6,76 1’ 122,8 7,36 2’ 117,6 7,39 (1H, d, 1,9 Hz) 7,39 3’ 146,3 6,76 7,39; 7,36 4’ 151,9 7,36 5’ 116,1 6,76 (1H, d, 8,2 Hz) 7,39 6’ 123,8 7,36 (1H, dd, 8,2 e 1,9 Hz) 7,39; 7,36; 5,10; 4,51 7’ 168,2 1” 102,4 4,93 (1H, d, 7,4) 2” 75,0 3,47 (1H, m) 3,49 3” 78,1 3,49 (1H, td) 3,47; 3,45 4” 72,0 3,45 (1H, m) 5” 75,7 3,73 (1H, m) 4,40 6” 64,7 4,51 (1H, m); 4,40 (1H, m) 1”’ 126,8 7,62 6,90; 6,42
2”’,6”’ 107,2 6,90 (2H, s) (7,62) 3”’,5”’ 149,7 6,90 3,86
4”’ 140,0 6,90 7”’ 147,5 7,62 (1H, d, 15,9 Hz) 6,90 8”’ 115,9 6,42 (1H, d, 15,9 Hz) 7,62 9”’ 169,0 6,42 7,62; 4,51; 4,40
3”’,5”’-OMe 57,1 3,86 (6H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
137
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
138
Figura 55- Espectro de RMN 1H de ACS-12 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 55a- Expansões do espectro de RMN 1H de ACS-12: (I) δ 6,3-7,8; (II) δ 63,1-5,3
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H3CO
H
HH
HH
7,30
7,08
4,93
7,39
6,76
7,36 5,10
3,47
3,49
4,51
3,45
3,73 4,40
6,42
7,62
6,903,86
1
2
3
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'
2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'
8"'
9"'
Figura 56a- Expansão da região δ 6,3-7,7 x 6,3-7,7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
139
Figura 56- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12
Figura 57- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz)
132,0
130,8
118,1
159,0
67,1
122,8168,2117,6
146,3151,9
116,0123,8
102,4
75,078,1
72,0
75,7
64,7
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H3CO 147,5
115,9
169,0
126,8
107,2
149,7
140,0
56,6
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
140
Figura 58- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-12 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 59- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-12
Figura 59a- Expansão da região δ 6,3-7,5 x 106-132
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
141
Figura 60- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-12
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H3CO
H
HH
HH
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
1617
18
19
20
21
22
23
24
25
10
21
8
13
24Figura 60a- Expansão da região δ 4,3-7,8 x 165-173
5 7
16
9
15
14
4
3
25 12
20
22
23
1
2
19 18
6
11
17
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
142
Figura 60b- Expansões do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,5 x 137-160; (II) δ 6,4-7,7 x 114-135.
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OCH3
H
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
H
H3CO
H
HH
HH
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
1617
18
19
20
21
22
23
24
25
5.9. Galato de 6”-amburosila (ACS-2)
Separações cromatográficas em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE da fração
acetato de etila do extrato etanólico das sementes (ACSEA) forneceram um sólido marrom
viscoso (pf. 193,2-197,8 °C; [α]25D = -44°, MeOH, c 0,19), designado ACS-2 (ítem 10.1.7.4,
p. 284).
No espectro de RMN 1H de ACS-2 (500 MHz, CD3OD, Fig. 61, p. 149), foram
observados dupletos em δ 7,29 e 7,06 (2H, d, J = 8,6 Hz, H-2,6 e H-3,5), correspondentes a
um sistema de spin AA’BB’, e um conjunto de sinais em δ 7,43 (1H, d, J = 1,7 Hz, H-2’);
7,41 (1H, dd, J = 8,0 e 1,7 Hz, H-6’) e 6,79 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-5’), referentes a um sistema
de spin ABX, cujas correlações homonucleares foram devidamente ratificadas pelo espectro
COSY (Fig. 62, p. 150). Sinais na faixa de δ 4,90-3,45 foram atribuídos a hidrogênios
osídicos, todavia a presença de duplos dupletos em δ 4,60 (1H, H-6”) e 4,40 (1H, H-6”)
sugeriram um açúcar esterificado através da hidroxila metilênica. Foram encontrados
singletos correspondentes a dois hidrogênios em δ 7,10 (2H, H-2”’,6”’), sugerindo a presença
de um anel aromático tetrassubstituído e simétrico, e em δ 5,19 (2H, H-7), referente a
hidrogênios ligados a carbono oxigenado.
O espectro de RMN 13C-CPD de ACS-2 (125 MHz, CD3OD, Fig. 63, p. 150)
mostrou 23 linhas espectrais, sendo duas delas coincidentemente com os mesmos
deslocamentos químicos (δ 168,3, C-7’ e C-7”’), atribuídas supostamente a carbonilas de
ésteres. Quatro linhas espectrais foram inicialmente associadas a carbonos aromáticos
oxigenados, δ 159,0 (C-4); 151,9 (C-4’); 146,7 (C-3”’,5”’) e 146,3 (C-3’), das quais as duas
últimas foram características de carbonos pertencentes a anéis orto-oxigenados.
O espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-2 (125 MHz, CD3OD, Fig. 64, p. 151)
apresentou onze absorções atribuídas a carbonos monohidrogenados, sendo seis relacionadas
a carbonos sp2 (δ 130,9; 123,9; 117,9; 117,6; 116,1 e 110,4). As outras cinco absorções,
atribuídas a carbonos sp3 oxigenados δ 102,4 (C-1”); 78,1 (C-3”); 75,8 (C-5”); 75,1 (C-2”) e
72,0 (C-4”), juntamente com uma das duas absorções atribuídas a carbonos metilênicos
oxigenados, δ 67,3 (C-7) e 65,0 (C-6”), foram compatíveis com um fragmento de açúcar. As
absorções em δ 140,1 (C-4”’); 131,9 (C-1); 122,8 (C-1’) e 121,6 (C-1”’), inexistentes no
espectro DEPT135, foram relacionadas a carbonos aromáticos não-hidrogenados. Além disso,
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
143
a atribuição da absorção em δ 140,1 foi retificada, passando a ser associada a um carbono
oxigenado, a fim de atender à evidência de existência de um anel aromático tetrassubstituído.
O pico do íon molecular cationizado [M+Na]+ m/z 597,1356, observado no espectro
de massa de ACS-2 (EM-IES, Fig. 65, p. 151), permitiu a dedução da fórmula molecular
C27H26O14, cuja diferença em relação à formula apresentada por ACS-9 foi de apenas um
oxigênio, sugerindo um análogo estrutural com um dos fragmentos protocatecoíla convertido
em galoíla.
A análise do espectro de RMN-HMBC (Fig. 67, p. 152) permitiu a caracterização do
fragmento galoíla através das correlações entre o singleto em δ 7,10 (H-2”’,6”’) e os sinais
dos carbonos aromáticos em δC 121,6 (C-1”’); 146,7 (C-3”’,5”’), 140,1 (C-4”’) e a carbonila
em δC 168,3 (C-7”’). Os acoplamentos entre os hidrogênios glicosídicos H-6” (4,60 e 4,40) e
a carbonila C-7”’ (δC 168,3) corroboraram a hipótese da glicose se encontrar esterificada com
o fragmento galoíla. A presença de outro éster na estrutura foi justificada pelas correlações
verificadas entre os hidrogênios oximetilênicos H-7 (δH 5,19) e os hidrogênios aromáticos
H-2’ (δH 7,43) e H-6’ (δH 7,41) com a carbonila C-7’ (δC 168,3), pertencente ao fragmento
protocatecoíla (Tab. 12, p. 146).
As correlações entre o dupleto em δH 7,29 (H-2,6) com o sinal de carbono
oximetilênico em δC 67,3 (C-7), e o singleto em δH 5,19 (H-7) com o sinal de carbono
aromático em δC 130,9 (C-2,6) definiram a ligação do anel benziloxi com o fragmento
protocatecoíla.
A ligação heterosídica entre o anel benzênico para-dissubstituído e a glicose foi
demonstrada através do acoplamento do hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,90) com o carbono
aromático oxigenado C-4 (δC 159,0).
O ineditismo de ACS-2 garantiu-lhe a denominação trivial amburosídio C
[protocatecuato de 4-O-β-D-(6”-O-galoilglicopiranosil)-benzila].
Os amburosídios são quimicamente muito semelhantes aos litseaefolosidios (192-
194), glicosídios fenólicos isolados de Ilex litsaefolia (Aquifoliaceae), diferindo apenas pela
existência de uma hidroxila no fragmento benziloxi (C-3), implicando em diferenças
significativas de deslocamento químico nos carbonos deste anel aromático, em razão dos
efeitos eletrônicos exercidos pelo oxigênio adicional (efeito mesomérico doador- C-2, C-4 e
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
144
C-6 e indutivo retirador- C-3), além de afetar a absorção do carbono glicosídico C-2”,
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
145
possivelmente devido à formação de ponte de H intramolecular (ZHANG et al., 2005) (Tab.
13, p. 147).
131,9
130,9
117,9
159,0
67,3
122,8168,3117,6
146,3151,9
116,1123,9
102,4
75,178,1
72,0
75,8
65,0
121,6
168,3
110,4
146,7
140,1O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
OH
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HH OH
7,29
7,06
4,90
7,43
6,79
7,41 5,17
3,49
3,494,60
3,45
3,764,40
7,10
1
2
34
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2" 3"4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'
Tabela 12- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-2 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACS-2 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
1 131,9 7,29 2,6 130,9 7,29 (2H, d, 8,6 Hz) 7,06 5,19 3,5 117,9 7,06 (2H, d, 8,6 Hz) 7,29 4 159,0 7,06 7,29; 4,90 7 67,3 5,19 (2H, s) 7,29 1’ 122,8 6,79 2’ 117,6 7,43 (1H, d, 1,7 Hz) 7,41 3’ 146,3 7,43 6,79 4’ 151,9 6,79 7,41 5’ 116,1 6,79 (1H, d, 8,0 Hz) 6’ 123,9 7,41 (1H, dd, 8,0; 1,7 Hz) 7,43 7’ 168,3 7,43; 7,41; 5,19 1” 102,4 4,90 (1H, s, 7,4 Hz) 2” 75,1 3,49 (1H, m) 3” 78,1 3,49 (1H, m) 4,40 3,49 4” 72,0 3,45 (1H, m) 3,76 5” 75,8 3,76 (1H, td) 3,45 6” 65,0 4,60 (1H, m); 4,40 (1H, m) 3,76 1”’ 121,6 7,10
2”’,6”’ 110,4 7,10 (2H, s) 3”’, 5”’ 146,7 7,10
4”’ 140,1 7,10 7”’ 168,3 7,10; 4,60; 4,40
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
146
Tabela 13- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-8, 10 e 11 e substâncias análogas (192-194) isoladas de Ilex litsaefolia (ZHANG et al., 2005).
# C
192 δC (ppm)
ACS-8 δC (ppm)
193 δC (ppm)
ACS-10 δC (ppm)
194 δC (ppm)
ACS-11 δC (ppm)
1 132,2 132,1 132,0 131,9 131,9 131,9 2 115,8 130,8 115,7 130,9 115,7 130,7 3 147,1 118,0 147,0 118,0 146,9 117,9 4 145,1 159,0 145,1 158,9 145,1 158,9 5 117,3 118,0 117,2 118,0 117,1 117,9 6 119,4 130,8 119,6 130,9 119,3 130,7 7 65,7 67,2 65,7 67,2 65,7 67,2 1’ 121,2 122,9 121,1 122,8 121,1 122,8 2’ 112,2 117,6 112,1 117,6 112,1 117,6 3’ 147,4 146,3 147,3 146,3 147,4 146,3 4’ 151,6 151,9 151,5 151,9 151,7 151,9 5’ 114,6 116,1 114,5 116,0 114,6 116,1 6’ 123,7 123,9 123,7 123,9 123,7 123,9 7’ 166,5 168,3 166,5 168,2 166,5 168,3 1” 102,6 102,3 102,5 102,3 102,5 102,4 2” 73,4 75,0 73,4 75,0 73,4 75,0 3” 76,0 78,0 76,1 78,1 76,1 78,1 4” 70,2 72,0 70,4 72,0 70,6 72,2 5” 74,1 75,6 74,4 75,7 74,4 75,8 6” 63,3 64,8 63,2 64,7 63,6 65,2 1”’ 171,3 172,9 126,3 127,8 121,0 122,6 2”’ 19,3 20,9 113,7 111,8 112,4 114,0 3”’ - 148,3 149,5 147,4 148,9 4”’ - 145,5 150,8 151,5 153,2 5”’ - 115,1 116,6 114,6 116,2 6”’ - 121,7 124,4 123,9 125,4 7”’ - 145,9 147,2 166,4 168,0 8”’ - 113,5 115,4 - 9”’ - 167,5 169,1 -
3’-OMe 55,0 55,0 55,0 3”’-OMe - - 56,6 55,1 56,7
Todas as substâncias foram solubilizadas em CD3OD
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
147
1
2
3
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
2"'
1"'
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
O
OCH3
OH
192
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
OH
1
2
3
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'
6'
7'
1"
2"3"
4"
5" 6"
1"'
2"'
3"'
4"'
5"'
6"' 7"'
8"'
9"'
193
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
O
O
OCH3
OH
OH
1
23
4
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'
194
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
148
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
149
Figura 61- Espectro de RMN 1H de ACS-2 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 61a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACS-2: (I) δ 3,1-5,3
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
H
HHOH
7,29
7,06
4,90
7,43
6,79
7,41 5,17
3,49
3,494,60
3,45
3,764,40
7,10
1
2
34
567
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2" 3"4"
5"
6"
1"'2"'
3"'
4"'5"'
6"' 7"'
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
150
Figura 62- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACS-2
Figura 63- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-2 (CD3OD, 125 MHz)
131,9
130,9
117,9
159,0
67,3
122,8168,3117,6
146,3151,9
116,1123,9
102,4
75,178,1
72,0
75,8
65,2
121,6
168,3
110,4
146,7
140,1O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
O
O
OH
OH
OH
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
151
Figura 64- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 65- Espectro de massa de ACS-2 (Ionização por Electrospray)
288.2930
416.3466
463.3117
507.3399551.3680
597.1356
639.4223
683.4515
727.4774
771.5040
100 200 300 400 500 600 700 800 900 m/z0
1
2
3
4
4x10Intens.
11ACS-gal.d: +MS, 100%=39744
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
152
Figura 66- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2
Figura 67- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACS-2
10
6 8
18
11 13
9 15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
153
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14
15
16
18
O
OH
OH
H
OH
H
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
17
4 17
1
23
14
5, 7
12
16
Figura 67a- Expansão da região δ 6,7-7,5 x 153-172
5.10. Amburosídio B (ACPa-6)
Um sólido marron resinoso (p.f. 132,6-135,4 °C; [α]25D = -35°, c 1,0, MeOH),
intitulado ACPa-6 (ítem 10.1.8.9, p. 295), foi isolado da fração acetato de etila (E7- ACPaA),
gerada pelo particionamento do extrato etanólico da parte aérea de espécimens jovens, através
de tratamento cromatográfico em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE.
O espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 68, p. 158) mostrou uma
banda larga em 3403 cm-1, correspondente à deformação axial da ligação O-H, caracterizando
a presença de hidroxila; absorções intensas em 3065 e 2992 cm-1, referentes a deformação
axial C-H, absorção em 1705 cm-1 relativa à deformação axial C=O, evidenciando a existência
de carbonila de éster; bandas esqueletais em 1603 e 1515 cm-1 de C=Carom.; absorção em 1285,
1225 e 1073 cm-1 referentes às deformações axiais C-O.
ACPa-6 apresentou em seu espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 69, p.
158): dupletos em δ 7,37 (H-2,6) e 7,10 (H-3,5) (2H, d, J = 8,5 Hz), correspondentes a um
anel aromático para-dissubstituído, sinais em δ 7,55 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-6’); 7,53 (1H, dd,
J = 8,2 e 2,0 Hz, H-2’) e 6,81 (1H, d, J = 8,2 Hz, H-5’), referentes a um anel aromático
trissubstituído, um singleto em δ 5,24 (2H, s, H-7), referente a hidrogênios ligados a carbono
oxigenado. Um conjunto de sinais na faixa de δ 4,93-3,45 foi atribuído a hidrogênios osídicos,
exceto um singleto em δ 3,72 (3H, s, 3’-OMe), o qual foi compatível com hidrogênios
metoxílicos.
Dezenove linhas espectrais foram exibidas no espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-
6 (125 MHz, CD3OD, Fig. 70, p. 159), sendo uma delas atribuídas a carbonila de éster (δ
168,0, C-7’) e três associadas a carbonos aromáticos oxigenados: δ 159,1 (C-4); 153,0 (C-4’)
e 148,8 (C-3’).
O espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 71, p. 159) revelou a
presença de dez carbonos mono-hidrogenados, dos quais metade foi relacionada a carbonos
aromáticos: δ 130,9 (C-2,6); 125,2 (C-6’); 117,9 (C-3,5); 116,1 (C-5’); e 113,6 (C-2’). O
restante foi associado a carbonos osídicos, δ 102,3 (C-1”); 78,2 (C-5”); 78,0 (C-3”); 75,0 (C-
2”) e 71,5 (C-4”), juntamente com um dos dois carbonos metilênicos oxigenados, δ 67,3 (C-7)
e 62,6 (C-6”). A absorção em δ 56,6 (3’-OMe) ratificou a existência de uma metoxila. As
demais absorções de 13C em δ 131,8 (C-1) e 122,7 (C-1’), ausentes no espectro DEPT135,
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
154
foram reconhecidas como pertencentes a carbonos aromáticos não-hidrogenados.
A fórmula molecular C21H24O10, fornecida pelos dados de RMN, foi compatível com
a estrutura de um glicosídio di-aromático monometilado.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 72, p. 160) revelou os carbonos correspondentes a
cada um dos anéis benzênicos, a partir dos acoplamentos 1J com cada um dos hidrogênios
aromáticos (Tab. 14, p. 157).
A correlação entre o hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,93) e o carbono aromático C-
4 (δC 159,1), registrada no espectro de RMN-HMBC (Fig. 73, p. 160), permitiu identificar a
posição da ligação heterosídica. A existência de um fragmento benzílico foi demonstrada
através dos acoplamentos entre os hidrogênios metilênicos H-7 (δH 5,24) com os carbonos
aromáticos C-1 (δC 131,8) e C-2,6 (δC 130,9), mas também entre os hidrogênios aromáticos
H-2,6 (δH 7,37) e o carbono metilênico C-7 (δC 67,3).
Os dois anéis aromáticos foram ligados através de um grupo éster, devido às
correlações dos hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,53) e H-6’ (δH 7,55) e os hidrogênios
metilênicos H-7 (δH 5,24) com a carbonila C-7’ (δC 168,0). A correlação entre os hidrogênios
metoxílicos (δH 3,72) com o carbono aromático C-3’ (δC 148,8) justificou a posição da
metoxila no carbono 3’ do anel benzênico trissubstituído.
ACPa-6 (lit.: p.f. 130-132 °C) já havia sido identificado nas cascas do caule de A.
cearensis, tendo recebido a denominação comum de amburosídio B (vanilato de 4-O-β-D-
glicopiranosil-benzila) (BRAVO et al., 1999).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
155
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
156
131,8
130,9
117,9
159,1
67,3
122,7
168,0113,6
148,8153,0
116,1
125,2
102,3
75,078,0
71,5
78,2
62,6
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
OH
56,6
7,37
7,10
4,93
7,53
6,81
7,55 5,24
3,45
3,47
3,70
3,39
3,42 3,861
23
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"6"
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
OHH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
3,72
Tabela 14- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de amburosídio B, registrados na literatura (BRAVO et al, 1999).
# C
Amburosídio B δC (ppm) CD3OD
ACPa-6 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
1 130,7 131,8 5,24 7,10 2,6 130,0 130,9 7,37 (2H, d, 8,5 Hz) 5,24 3,5 116,9 117,9 7,10 (2H, d, 8,5 Hz) 7,37 4 157,5 159,1 7,10 7,37 7 66,4 67,3 5,24 (2H, s) 7,37 1’ 121,7 122,7 7,53 6,81 2’ 112,6 113,6 7,53 (1H, d, 2,0 Hz) 7,55 3’ 147,4 148,8 7,53 3,72; 6,81 4’ 151,3 153,0 6,81 7,55; 7,53 5’ 114,9 116,1 6,81 (1H, d, 8,2 Hz) 6’ 124,4 125,2 7,55 (1H, dd, 8,2; 2,0 Hz) 7,53 7’ 167,1 168,0 7,55; 7,53; 5,24 1” 101,0 102,3 4,93 (1H, d, 7,4 Hz) 3,45 2” 73,6 75,0 3,45 (1H, m) 3,47 3” 76,7 78,0 3,47 (1H, td) 3,39 4” 70,1 71,5 3,39 (1H, m) 3,47 3,86; 3,70 5” 76,5 78,2 3,42 (1H, m) 3,70 6” 61,8 62,6 3,86; 3,70 (1H, m)
3’-OMe 56,1 56,6 3,72 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
157
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
158
Figura 68- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-6 (pastilha de KBr)
Figura 69- Espectro de RMN 1H de ACPa-6 (CD3OD, 500 MHz)
7,37
7,10
4,93
7,53
6,81
7,55 5,24
3,45
3,47
3,70
3,39
3,42 3,861
23
4
5
67
1'2'
3'
4'
5'6'
7'
1"
2"3"
4"
5"6"
O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
OHH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
3,72
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
159
Figura 70- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 71- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-6 (CD3OD, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
160
Figura 72- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6
Figura 73- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-6
10
6
11
4 3
5,7
14 12
1 2
8
9
13
15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
161
1
2
3
45
67
8
910
11 12
13
14O
O
H3CO
OH
O OOH
OHOH
OHH
H
H
H
H
H
H
H
HH H
H
HH
15
15
5.11. Ácido (E)-o-cumárico glicosilado (ACPa-7)
Cromatografias em Sephadex LH-20 e em cartucho de SPE da fração E7-ACPaQ
(fração aquosa do extrato etanólico da parte aérea de espécimens de 7 meses de cultivo)
permitiram o isolamento de um sólido marrom (tR = 7,20 min), o qual foi purificado por
HPLC, resultando na obtenção de 24 mg de um sólido branco (pf. 234,6-236,1 °C; [α]25D =
-61,7°, MeOH, c 0,78), designado ACPa-7 (ítem 10.1.8.11, p. 296).
O espectro de RMN 1H de ACPa-7 (500 MHz, CD3OD, Fig. 74, p. 166) demonstrou
a presença de dois dupletos em δ 8,12 e 6,52 (1H, J = 16,2 Hz, H-7 e H-8), associados a
hidrogênios olefínicos com estereoquímica trans, um sistema de dois dupletos em δ 7,61 e
7,24 (1H, J = 7,9 Hz, H-6 e H-3, não acoplados) e dois tripletos em δ 7,37 e 7,05 (1H, J = 7,9
Hz, H-4 e H-5), característico de anel aromático orto-dissubstituído, além de um conjunto de
sinais numa faixa de deslocamento químico típica de açúcar (δ 5,00-3,43). No espectro de
RMN-COSY (Fig. 75, p. 167), estes acoplamentos foram ratificados.
Quinze absorções foram observadas no espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz,
CD3OD, (Fig. 76, p. 167), das quais nove foram relacionadas a carbonos sp2 (171,2; 157,6;
141,6; 133,0; 129,0; 125,5; 123,7; 119,7 e 117,1), sendo uma possivelmente pertencente à
carbonila de ácido ou éster (δC-9 171,2) e uma referente a carbono aromático oxigenado (δC-2
157,6). As outras seis absorções foram associadas a carbonos sp3 oxigenados, δ 102,5 (C-1’);
78,4 (C-5’); 78,3 (C-3’); 75,0 (C-2’); 71,4 (C-4’) e 62,6 (C-6’), compatíveis com os
deslocamentos químicos de glicose, relatados na literatura.
A comparação do espectro de RMN 13C-CPD com o espectro DEPT135 (125 MHz,
CD3OD, Fig. 77, p. 168) revelou a diferença de três linhas espectrais, δ 171,2 (C-9), 157,6
(C-2) e 125,5 (C-1), as quais foram relacionadas a carbonos sp2 não-hidrogenados. No
espectro DEPT135, todas as linhas espectrais foram associadas a carbonos mono-
hidrogenados, exceto a absorção em δ 62,6 (C-6’), atribuída a carbono metilênico.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 78, p. 168) permitiu correlacionar os hidrogênios
olefínicos H-7 e H-8 (δH 8,12 e 6,52) diretamente ligados aos seus respectivos carbonos (δC
141,6 e 119,7), sugerindo a presença de uma olefina adjacente à carbonila devido às
significativas diferenças de deslocamentos químicos, provocadas pelo efeito mesomérico
retirador da carbonila. As atribuições dos sinais de hidrogênios e carbonos aromáticos foram
baseadas nas correlações observadas no espectro HSQC, todavia a multiplicidade e os
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
162
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
163
deslocamentos químicos, considerando principalmente os efeitos de blindagem do carbono
oxigenado, foram decisivos para os inequívocos assinalamentos.
O espectro de massa de ACPa-7 (EM-IE, Fig. 79, p. 169) apresentou o pico íon-
molecular apenas detectável (m/z 326) e fragmentos com m/z resultantes de quebras
seqüenciais sofridas pela aglicona: 164 (perda de glicose), 146 (desidratação do ácido o-
cumárico, seguida de lactonização) e 118 (pico base, descarbonilação).
Os dados de RMN e EM forneceram a composição elementar C15H18O8,
correspondendo supostamente a um glicosídio cinâmico, o qual poderia ser referente a um
éster de glicose (orto-hidroxi-cinamato de glicosila, I) ou um ácido cinâmico orto-glicosilado
(II).
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 81, p. 170) demonstrou indubitavelmente a
ligação da porção etilênica ao anel aromático através de diversas correlações como:
acoplamentos do hidrogênios aromáticos H-3 (δH 7,24; 4J) e H-6 (δH 7,61) com o carbono
olefínico C-7 (δC 141,6), acoplamentos dos hidrogênios olefínicos H-7 (δH 8,12) e H-8 (δH
6,52) com o carbono ipso C-1 (δC 125,5), além dos acoplamentos do hidrogênio H-6 (δH 7,61)
com os carbonos aromáticos C-2 (δC 157,6) e C-6 (δC 129,0) (Tab. 15, p. 165).
A existência de uma carbonila α,β-insaturada foi ratificada através das correlações
entre os hidrogênios olefínicos H-7 (δH 8,12) e H-8 (δH 6,52) com a carbonila (δC 171,2),
observadas no espectro HMBC.
A correlação do hidrogênio anomérico H-1’ (δH 5,00) com o carbono aromático
oxigenado C-2 (δC 157,6) foi a prova insofismável de que a estrutura de ACPa-7 correspondia
à proposta II, ou seja, o ác. (E)-cumárico glicosilado, substância nova no gênero.
O OOH
OHOH
OH
CO2H
1
2
34
5
6
7
8
9
1'
2'3'
4'
5'
6'
1
2
34
5
6
7
89 1'
2'3'
4'
5' 6'OOH
OHOH
OH
OH
OO
I II
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
164
O OOH
OHOH
OH
HH
CO2H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
1
2
34
5
6
7
8
9
1'
2'3'
4'
5'
6'
7,24
7,37
7,05
7,61
8,12 6,52
5,00
3,57
3,49
3,43
3,463,89
3,71
O OOH
OHOH
OH
CO2H
119,7
157,6
117,1
133,0
123,7
129,0
141,6
125,5
171,2
102,5
75,078,3
71,4
78,4 62,6
Tabela 15- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-7 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACPa-7 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 125,5 6,97; 5,97 2 157,6 7,24 8,12; 7,61; 7,37; 5,00 3 117,1 7,24 (1H, d, 7,9 Hz) 7,37 7,05 4 133,0 7,37 (1H, t, 7,9 Hz) 7,24; 7,05 7,61 5 123,7 7,05 (1H, t, 7,9 Hz) 7,37 7,24 6 129,0 7,61 (1H, d, 7,9 Hz) 7,05 8,12; 7,37 7 141,6 8,12 (1H, d, 16,2 Hz) 6,52 7,61; (7,24) 8 119,7 6,52 (1H, d, 16,2 Hz) 8,12 9 171,2 6,52 7,31 1’ 102,5 5,00 (1H, d, 7,8 Hz) 3,49 2’ 75,0 3,57 (1H, m) 3’ 78,3 3,49 (1H, td) 4,94 4’ 71,4 3,43 (1H, m) 5’ 78,4 3,46 (1H, m) 3,46 6’ 62,6 3,89 (1H, m); 3,71 (1H, m)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
165
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
166
Figura 74- Espectro de RMN 1H de ACPa-7 (CD3OD), 500 MHz)
Figura 74a- Expansão do espectro de RMN 1H de ACPa-7 da região de: (I) δ 3,2-4,0.
O OOH
OHOH
OH
HH
CO2H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
1
2
34
5
6
7
8
9
1'
2'3'
4'
5'
6'
7,24
7,37
7,05
7,61
8,12 6,52
5,00
3,57
3,49
3,43
3,463,89
3,71
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
167
Figura 75- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACPa-7
Figura 76- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-7 (MeOD, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
168
Figura 77- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-7 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 78- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
169
Figura 79- Espectro de massa de ACPa-7 (Impacto Eletrônico)
Figura 80- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-7(pastilha de KBr)
1 8
6
3
7
2
13 4
9
5
10
11
12
Figura 81a- Expansão da região δ 6,3-8,4 x 124-144
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
170
Figura 81- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACPa-7
O OOH
OHOH
OH
HH
CO2H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
12 3
45
6
7
8
910
11
1213
5.12. Ácido (Z)-o-cumárico glicosilado (ACX-1)
A fração butanólica, originada de cromatografia em Sephadex LH-20 e partição
líquido-líquido do extrato etanólico do xilopódio, rendeu um sólido resinoso amarelo (ítem
10.1.8.3, p. 292) denominado ACX-1 (pf. 98,7-100,0 °C; [α]25D= -43°, MeOH, c 0,32), após
separação obtida por HPLC (fase reversa- tR = 7,87 min).
A análise do espectro de RMN 1H de ACX-1 (500 MHz, CD3OD, Fig. 82, p. 175)
permitiu a identificação de um anel aromático orto-dissubstituído, devido à presença de um
sistema de dois dupletos em δ 7,53 e 7,19 (1H, J = 7,9 Hz, H-6 e H-3; não-acoplados) e dois
tripletos em δ 7,30 e 6,97 (1H, J = 7,9 Hz, H-4 e H-5), um grupo etilênico com
estereoquímica cis [δ 7,31 e 5,97 (1H, d, J = 12,5 Hz, H-7 e H-8)], e um açúcar, justificado
pela existência de um conjunto de sinais na faixa de δ 4,94-3,40. Todos acoplamentos 1H, 1H
foram constatados no espectro de RMN-COSY (Fig. 83, p. 175)
O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 84, p. 176) apresentou
quinze linhas espectrais, cujos deslocamentos químicos foram muito próximos aos observados
para ACPa-7, sendo idênticos os valores atribuídos ao resíduo de glicose: δ 102,7 (C-1’); 78,3
(C-5’); 78,2 (C-3’); 75,0 (C-2’); 71,4 (C-4’) e 62,6 (C-6’). As absorções da aglicona foram
relacionadas a nove carbonos sp2, das quais uma foi atribuída à carbonila de éster ou ácido (δ
170,4, C-9).
As outras oito absorções foram determinadas utilizando-se o espectro de RMN-
HSQC (Fig. 86, p. 177), o qual permitiu identificar os quatro carbonos aromáticos
hidrogenados, δ 116,6 (C-3); 131,5 (C-4); 122,9 (C-5) e 131,7 (C-6), e os dois carbonos
olefínicos, δ 139,7 (C-7) e 121,4 (C-8), a partir das correlações diretas com seus respectivos
hidrogênios δ 7,19 (H-3); 7,30 (H-4); 6,97 (H-5); 7,53 (H-6); 7,31 (H-7) e 6,52 (H-8). Os
sinais em δC 156,7 (C-2) e 126,9 (C-1), desprovidos de correlação, foram atribuídos a
carbonos aromáticos não hidrogenados, sendo o mais desprotegido associado a carbono
oxigenado (Tab. 16, p. 174).
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 87, p. 177) mostrou as correlações dos sinais de
hidrogênios olefínicos em δ 7,31 (H-7) e δ 6,52 (H-8) com o sinal da carbonila em δ 170,4
(C-9), evidenciando a presença de uma carbonila α,β-insaturada. A olefina foi conectada ao
anel aromático devido às correlações entre os sinais de hidrogênios olefínicos em δ 7,31 (H-7)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
171
e 6,52 (H-8) com os sinais de carbonos aromáticos em δ 126,9 (C-1), 156,7 (C-2) 131,7 (C-
6), e entre o sinal de hidrogênio aromático em δ 7,53 (H-6) e o sinal de carbono olefínico em
δ 139,7 (C-7). O acoplamento do hidrogênio anomérico H-1” (δH 4,94) com o carbono
aromático C-2 (δC 156,7) revelou a ligação heterosídica entre a glicose e o anel aromático, na
posição orto.
Em virtude da nítida semelhança encontrada entre os dados espectrais de IV (Fig.
88, p. 178) e EM (Fig. 89, p. 179), inclusive resultando na mesma fórmula molecular
C15H18O8, ACX-1 e ACPa-7 foram considerados estereoisômeros, os quais foram distintos
apenas pela configuração da ligação dupla (E e Z, respectivamente), fornecida pela constante
de acoplamento dos hidrogênios olefínicos. Seus espectros de EM apresentam o mesmo
padrão de fragmentação e os de IV exibem absorções semelhantes, sendo a identificação por
estas técnicas inconclusiva. Comparação com dados de RMN 13C disponíveis da literatura
confirmou a proposta estrutural (Vasange et al, 1997)
Os deslocamentos químicos de RMN 1H dos hidrogênios olefínicos de ACPa-7 e
ACX-1, obtidos experimentalmente, foram muito parecidos com os calculados para os
estereoisômeros, segundo a equação de predição de Pascual-Meier-Simon: δH= 5,25 + δgem +
δcis + δtrans, adotando-se como substituintes uma carboxila e um grupo fenila. Através desta
equação, obteve-se a ratificação de que os hidrogênios olefínicos numa configuração E são
mais desblindados do que aqueles com estereoquímica Z, devido aos menores efeitos estéricos
(SILVERSTEIN, 1994).
aH
Hb
OH
O aH
O
OH
Hb
(E) (Z)
Isômero (E) Isômero (Z)
δH = 5,25 + δgem + δcis + δtrans δH = 5,25 + δgem + δcis + δtrans
δHa = 5,25 + 1,35 + 1,35 + 0,0= 7,95 δHa = 5,25 + 1,35 + 0,0 + 0,74= 7,34
δHb = 5,25 + 1,0 + 0,37 + 0,0= 6,62 δHb = 5,25 + 1,00 + 0,0 - 0,10= 6,15
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
172
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
173
Os estereoisômeros do ácido o-cumárico glicosilado são possivelmente os
precursores da cumarina, um dos constituintes majoritários de A. cearensis. É sabido que
ácidos do tipo 2-hidroxi-cinâmico podem sofrer isomerização, ou seja, o esteroisômero (E)
pode se converter na forma menos estável (Z), quando exposto à radiação UV. Embora seja
geralmente desfavorável, este processo se desenvolve bem em sistemas completamente
conjugados, pois a absorção de energia luminosa pela ligação dupla promove a transição de
um életron do orbital π para um estado de mais alta energia (π* anti-ligante), transformando-a
temporariamente em ligação simples, a qual possui livre rotação, resultando na formação do
isômero (Z), após dissipação da energia recebida. O isômero (Z) pode sofrer uma lactonização
enzimática e dar origem à cumarina (DEWICK, 2001).
A biossíntese da cumarina pode ocorrer a partir das agliconas ou dos heterosídios de
ambos os estereoisômeros, porque a lactonização pode ser precedida de hidrólise enzimática
do glicosídio. Em espécies de Melilotus alba (Fabaceae) atribui-se a presença de cumarina à
hidrólise enzimática seguida de lactonização dos glicosídios induzidas por danos aos tecidos
da planta durante sua coleta e processamento (DEWICK, 2001).
O OOH
OHOH
OH
CO2H126,9
156,7
116,6
131,5
122,9
131,7
139,7
121,4170,4
102,7
75,078,2
71,4
78,3 62,6
O OOH
OHOH
OH
CO2HH
H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
1
2
34
5
6
7
89
1'
2'3'
4'
5'
6'
7,19
7,30
6,97
7,53
7,31
5,97
4,94
3,46
3,49
3,40
3,433,87
3,70
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
174
1.
Esquema 1- Biossíntese da cumarina a partir dos estereoisômeros do ácido o-cumárico glicosilado.
Tabela 16- Dados de RMN 1H e 13C de ACX-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACX-1 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J/(4J)
1 126,9 7,31 6,97; 5,97 2 156,7 7,19 7,53; 7,31; 5,97 (4J); 4,943 116,6 7,19 (1H, d, 7,9 Hz) (7,53); (7,31); 7,30 4 131,5 7,30 (1H, t, 7,9 Hz) 7,19 5 122,9 6,97 (1H, t, 7,9 Hz) 7,19 6 131,7 7,53 (1H, d, 7,9 Hz) 7,30; (7,19); 6,97; (5,97) 7 139,7 7,31 (1H, d, 12,5 Hz) 5,97 7,53 8 121,4 5,97 (1H, d, 12,5 Hz) 7,31 9 170,4 5,97 7,31 1’ 102,7 4,94 (1H, d, 7,4 Hz) 3,49 2’ 75,0 3,49 (1H, m) 4,94 3’ 78,2 3,46 (1H, td) 4,94 4’ 71,4 3,40 (1H, m) 3,43 5’ 78,3 3,43 (1H, m) 3,46 6’ 62,6 3,87 (1H, d); 3,70 (1H, dd)
2.
UDP-glicoseO
OH
OHOH
O
OH
CO2H
CO2H
OH
CO2HOHO O
Luz
hv
O O
Enzima
OOH
OHOH
O
OH
CO2H
OOH
OHOH
O
OH
CO2H
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
175
Figura 82- Espectro de RMN 1H de ACX-1 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 83- Espectro de RMN-COSY (CD3OD, 500 x 500 MHz) de ACX-1
O OOH
OHOH
OH
CO2HH
H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
1
2
34
5
6
7
89
1'
2'3'
4'
5'
6'
7,19
7,30
6,97
7,53
7,31
5,97
4,94
3,46
3,49
3,40
3,433,87
3,70
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
176
Figura 84- Espectro de RMN 13C-CPD de ACX-1 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 85- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACX-1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
177
Figura 86- Espectro de RMN-HSQC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1
Figura 87- Espectro de RMN-HMBC (CD3OD, 125 x 500 MHz) de ACX-1
4
7 2
13 11 10
1 3
12
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
178
Figura 87a- Expansão do espectro HMBC de ACS-11: (I) δ 6,7-7,8 x 110-145.
Figura 88- Espectro de absorção na região do infravermelho (pastilha de KBr) de ACX-1
4
7
5 8
9
6
O OOH
OHOH
OH
CO2HH
H
H
H
H
HH
H
H
H
H
H
H
1 234
56
7
8
9
10
1112
13
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
179
Figura 89- Espectro de massa de ACX-1 (Impacto Eletrônico)
5.13. Formononetina (ACCE-9)
A fração metanólica ACCE1AM, obtida por partição líquido-líquido do extrato
etanólico das cascas do caule (ACCE), foi submetida a cromatografias em gel de sílica e
Sephadex LH-20, resultando num precipitado amarelado, que ao ser filtrado e tratado com
MeOH, converteu-se num sólido branco puro (p.f. 240,2-242,9 °C), chamado de ACCE-9
(ítem 10.1.6.13, p. 281).
O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, C5D5N, Fig. 90, p. 183) de ACCE-9 exibiu
catorze linhas espectrais, sendo todas atribuídas a carbonos sp2 (δ 176,2; 164,6; 160,5; 159,1;
153,3; 131,3; 128,7; 125,9; 125,1; 118,4; 116,4; 114,7 e 103,6), exceto a absorção em δ 55,7
(4’-OMe), relacionada a carbono sp3 oxigenado. A absorção em δ 176,2 (C-4) foi associada à
carbonila de cetona conjugada e os sinais em δ 164,6 (C-7); 160,5 (C-4’); 159,1 (C-9) e 153,3
(C-2) foram associados a carbonos sp2 oxigenados.
O espectro RMN 13C-DEPT135 de ACCE-9 (125 MHz, C5D5N, Fig. 91, p. 183)
exibiu sete linhas espectrais, das quais seis relacionadas a carbonos mono-hidrogenados
(δ 153,3; 131,3; 128,7; 116,4; 114,7 e 103,6) e uma pertencente à metoxila (δ 55,7).
Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135 permitiu a identificação dos carbonos
sp2 não-hidrogenados e não-funcionalizados: δ 125,9 (C-1’); 125,1 (C-3) e 118,4 (C-10).
Considerando-se a existência de 16 carbonos, foi sugerida uma estrutura com esqueleto
C6-C3-C6.
O espectro de RMN 1H de ACCE-9 (500 MHz, C5D5N, Fig. 92, p. 184) mostrou um
conjunto de sinais em δ 8,47 (1H, d, J = 8,8 Hz, H-5); 7,26 (1H, dd, J = 8,8 e 2,2 Hz, H-6) e
7,15 (1H, d, J = 2,2 Hz, H-8), referentes a um sistema aromático de spin ABX, dois dupletos
em δ 7,80 e 7,10 (2H, J = 8,8 Hz, H-2’,6’ e H-3’,5’), compatíveis com um sistema aromático
de spin AA’BB’, um sinal simples e agudo em δ 3,71 (3H, s, 4’-OMe), relacionado a
hidrogênios metoxílicos e um singleto em δ 8,18, característico de hidrogênio olefínico de
isoflavona.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 93, p. 185) reforçou a presença de um anel
benzênico para-dissubstituído, através das correlações entre os dupletos em δH 7,80 (H-2’,6’)
e 7,10 (H-3’,5’) e as absorções de carbono em δC 131,3 (C-2’,6’) e 114,7 (C-3’,5’),
justificando a maior intensidade dos seus sinais. A fórmula molecular obtida foi C16H12O4,
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
180
compatível com estruturas de isoflavonas dissubstituídas por uma hidroxila e uma metoxila.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
181
A proposta estrutural de uma isoflavona foi justificada pelo acoplamento do
hidrogênio olefínico H-2 (δH 8,18) com o carbono olefínico oxigenado C-2 (δC 153,3),
observado no espectro HSQC, mas também pelos acoplamentos à longa distância (espectro
HMBC) do mesmo hidrogênio olefínico (H-2) com o carbono olefínico C-3 (δC 125,1) e com
a carbonila C-4 (δC 176,2) (Tab. 17, p. 182).
A metoxila foi posicionada no anel benzênico para-dissubstituído devido ao
acoplamento 3J, observado no espectro de RMN-HMBC (Fig. 94, p. 186), entre os
hidrogênios metoxílicos (δH 3,71) e o carbono aromático C-4’ (δC 160,5).
Quanto ao posicionamento da hidroxila no anel A (trissubstituído), ela poderia
ocupar as posições 6 ou 7, pois em ambas as proposições, o padrão de multiplicidade dos
sinais de hidrogênio seria mantido.
aromático H-5 (δH 8,47) e a carbonila C-4 (δC 176,2), foi determinante para a definição da
posição da hidroxila, no carbono C-7. Além disso, a absorção em δC 103,6 (C-8) é
perfeitamente compatível com o deslocamento químico de um carbono posicionado entre dois
carbonos aromáticos oxigenados, em virtude da significativa blindagem oferecida pelo efeito
mesomérico doador dos oxigênios, orto a este carbono (FRIEBOLIN, 1991).
A formononetina é um conhecido fitoestrógeno encontrado na soja, sendo apontada
como um de seus componentes alergênicos (PARK et al., 2005). Além disso, exibe atividade
giardicida in vitro cinco vezes mais potente do que a do metronidazol, umas das drogas-
referência (KHAN et al, 2000).
O
OOCH3
OH H
H
H
H
H
H
1'
2
3
456
7
89
102'
3'4'5'
6'
8,18
8,47
7,26
7,15
3,717,80
7,10
O
OOCH3
OH153,3
125,1
176,2
128,7
116,4
164,6
103,6159,1
118,4125,9
131,3114,7
160,5
55,7
No entanto, o acoplamento registrado no espectro HMBC, entre o hidrogênio 8,47
H
OH
H
H O
O
128,7
116,4
164,6
118,4
159,1
103,6
7,15
7,26
8,47H
H
H
OH O
O128,7
116,4
164,6
118,4
159,1103,6
7,26
7,15
Tabela 17- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-9 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de formononetina, registrados na literatura (JHA et al., 1980).
# C
Formonetina δC (ppm)
CDCl3/DMSO
ACCE-9 δC (ppm)
C5D5N
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
2 152,7 153,3 8,18 (1H, s) 3 123,6 125,1 8,18 4 174,9 176,2 8,47; 8,18 5 127,3 128,7 8,47 (1H, d, 8,8 Hz) 6 115,1 116,4 7,26 (1H, dd, 8,8 Hz e 2,2) 7,15 7 162,7 164,6 8,47 8 102,2 103,6 7,15 (1H, d, 2,2 Hz) 7,26 9 157,7 159,1 7,15 8,47; 8,18 10 116,8 118,4 7,15 1’ 124,4 125,9 8,18; 7,10
2’,6’ 130,0 131,3 7,80 (2H, d, 8,8 Hz) 3’,5’ 113,6 114,7 7,10 (2H, d, 8,8 Hz)
4’ 159,1 160,5 7,10 7,80; 3,71 4’-OMe - 55,7 3,71 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
182
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
183
Figura 90- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)
Figura 91- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de de ACCE-9 (C5D5N, 125 MHz)
O
OOCH3
OH H
H
H
H
H
H
1'
2
3
456
7
89
102'
3'4'5'
6'
8,18
8,47
7,26
7,15
3,717,80
7,10
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
184
Figura 92- Espectro de RMN 1H de ACCE-9 (C5D5N, 500 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
185
Figura 93- Espectro de RMN-HSQC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9
Figura 93a- Expansão do espectro HSQC de ACCE-9: δ 7,0-8,5 x 100-133
6
10
5
11 1618
917
1
1415 13
7 82
4
Figura 94- Espectro de RMN-H
OH
H
2
4
57
8
11
3
Aspectos Químicos do Estudo Interdiscipli
12
3
MBC (C5D5N, 125 x 500 MHz) de ACCE-9
O
OOCH3
H
H
H
H
H
1
69
10
1213
14
15
16 17
18
nar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith 186
5.14. Aiapina (ACPa-4)
Cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20 permitiram a obtenção de cristais
incolores (62,5 mg; p.f. 221-224 °C), denominados ACPa-4 (ítem 10.1.8.8, p. 295), a partir
da fração acetato de etila (E7- ACPaA), resultante da partição H2O/AcOEt do extrato
etanólico da parte aérea de espécimens jovens.
Submetido à análise espectroscópica na região do infravermelho (Fig. 95, p. 189),
ACPa-4 exibiu bandas esqueletais em 1682, 1579 e 1498 cm-1, referentes a deformações
axiais C=Carom, absorções em 1256 e 1224 cm-1, associadas a deformações axiais C-O, bandas
em 940, 881 e 836 cm-1, relacionadas a deformações angulares Carom-H. Absorção em 1705
cm-1 foi atribuída a uma deformação axial C=O, característica de carbonila conjugada.
O espectro de RMN 1H de ACPa-4 (500 MHz, CDCl3, Fig. 96, p. 189) exibiu um
par de dupletos em δ 7,58 e 6,28 (1H, d, J = 9,5 Hz, H-4 e H-3), associados a hidrogênios
olefínicos com configuração cis, característicos de compostos cumarínicos, dois singletos,
coincidentes, em δ 6,83 (2H, s, H-5 e H-8), relacionados a hidrogênios aromáticos isolados e
um singleto em δ 6,08 (2H, s, 6,7-OCH2O), atribuído à presença de um grupo metilenodioxi.
No espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-4 (125 MHz, CDCl3, Fig. 97, p. 190) foram
visualizados dez sinais, dos quais um foi compatível com carbonila de lactona α,β-insaturada
(δ 161,4, C-2), três foram atribuídos a carbonos aromáticos oxigenados, δ 151,5 (C-7); 151,5
(C-10) e 145,1 (C-6) e dois foram relacionados a carbonos olefínicos, δ 143,7 (C-4) e 113,6
(C-3). Tendo em vista que a absorção em δ 102,6 (6,7-OCH2O) foi a única com amplitude
negativa, no espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (125 MHz, CDCl3, Fig. 98, p. 190),
este sinal foi atribuído ao carbono metilênico dioxigenado, enquanto que as linhas espectrais
em δ 105,2 (C-5) e 98,6 (C-8) foram associadas a carbonos aromáticos hidrogenados. O sinal
de carbono em δ 112,9 (C-9), presente apenas no espectro CPD, foi relacionado a um carbono
aromático não-hidrogenado.
O espectro de massa (Fig. 99, p. 191) forneceu o pico íon molecular com m/z 190, a
partir da qual se deduziu a fórmula molecular obtida C10H6O4, correspondente à estrutura de
uma cumarina dissubstituída por um grupo metilenodioxi, nas posições 6 e 7, devido à
ausência de acoplamento entre os hidrogênios aromáticos. As atribuições dos sinais δC 105,2
(C-5) e 98,6 (C-8) foram baseadas na análise dos efeitos eletrônicos dos substituintes do anel
benzênico, os quais exercem uma maior blindagem no carbono localizado entre dois átomos
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
187
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
188
de oxigênio (C-8). Comparação com dados de RMN, já publicados para a cumarina aiapina
(lit. 221-223 °C), confirmou a estrutura proposta (DEBENEDETTI et al., 1998) (Tab. 18).
Isolada pela primeira vez de Eupatorium ayapana (Asteraceae), a aiapina já foi
também descrita em outras espécies da mesma família (Helianthus annus, Artemisia apiacea,
Pterocaulon virgatum e P. polystachyum) (MAES et al., 2005), sendo considerada uma
fitoalexina em razão de sua propriedade fungitóxica (PRATS et al., 2006).
Tabela 18- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de aiapina, registrados na literatura (DEBENEDETTI et al., 1998).
# C
Aiapina δC (ppm)
CDCl3
ACPa-4 δC (ppm)
CDCl3
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
113,6
98,6
145,1
151,5151,5
161,4
143,7
102,6
105,2112,9
O
O
O O
2 161,2 161,4 3 113,4 113,6 6,28 (1H,d, 9,5 Hz) 4 143,4 143,7 7,58 (1H,d, 9,5 Hz) 5 105,0 105,2 6,83 (1H, s) 6 143,4 145,1 7 151,3 151,5 8 98,4 98,6 6,83 (1H, s) 9 112,7 112,9 10 149,4 151,5
6,7-OCH2O 102,3 102,6 6,08 (2H, s)
6,28
7,586,83
6,08
O
O
O O
H
H H
H
2
3
456
78
10
9
6,83
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
189
Figura 95- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACPa-4 (pastilha de KBr)
Figura 96- Espectro de RMN 1H de ACPa-4 (CDCl3, 500 MHz)
6,28
7,586,83
6,08
O
O
O O
H
H H
H
2
3
456
78
8a
4a
6,83
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
190
Figura 97- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz)
Figura 98- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-4 (CDCl3, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
191
Figura 99- Espectro de massa de ACPa-4 (Impacto Eletrônico)
5.15. 6-hidroxi-cumarina (ACS-5)
ACS-5, um sólido branco (5 mg; pf. 221,7-222,9 °C, tR = 10,30 min), foi isolado
através de separação em HPLC da fração acetato de etila (ACSEA) do extrato etanólico das
sementes (ítem 10.1.7.6, p. 285), previamente cromatografada em Sephadex LH-20 e gel de
sílica.
O espectro de RMN 1H (500 MHz, CD3COCD3, Fig. 100, p. 195) de ACS-5 exibiu
um sistema de spin ABX [δ 7,19 (1H, d, J = 8,9 Hz, H-8); 7,10 (1H, dd, J = 8,9 e 2,7 Hz, H-7)
e 7,06 (1H, d, J = 2,7 Hz, H-5)] e um par de dupletos em δ 7,86 e 6,36 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4
e H-3), associados a hidrogênios olefínicos com estereoquímica cis, característicos de
compostos cumarínicos.
No espectro de RMN 13C-CPD de ACS-5 (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 101, p. 195)
foram observados nove sinais, dos quais um foi compatível com carbonila de lactona α,β-
insaturada (δ 161,0, C-2) e dois foram atribuídos a carbonos aromáticos oxigenados (δ 154,8,
C-6 e 148,8, C-10). No espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 102, p.
196), os cinco sinais existentes foram referentes a carbonos sp2 monohidrogenados: δ 144,4
(C-4); 120,6 (C-7); 118,2 (C-8); 117,6 (C-3) e 113,6 (C-5). Comparação dos espectros de
RMN 13C-CPD e DEPT135 permitiu relacionar a outra absorção em δ 120,6 (C-9) a carbono
não-hidrogenado e não-funcionalizado.
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 103, p. 196) revelou as absorções correspondentes
à olefina, através dos acoplamentos entre os dupletos em δH 7,86 (H-4) e 6,36 (H-3) com os
sinais de carbono em δC 144,4 (H-4) e 117,6 (H-3), respectivamente. Além disso, os sinais de
carbonos aromáticos em δC 120,6 (H-7); 118,2 (H-8) e 113,6 (H-5) foram correlacionados
com seus respectivos sinais de hidrogênio em δH 7,10 (H-7); 7,19 (H-8) e 7,06 (H-5) (Tab.
19, p. 194).
Segundo o espectro de massa (EM-IE, Fig. 104, p. 197), ACS-5 possui uma massa
molecular de 162 Da, compatível com a fórmula molecular C9H6O3 correspondendo à
estrutura de uma cumarina monohidroxilada, na posição 6 ou 7 (umbeliferona), em virtude da
presença de um sistema ABX. Além do pico íon-molecular (m/z 162), somente um fragmento
com m/z 134, resultante da descarbonilação cumarínica, pareceu significativo.
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 105, p. 197) exibiu as correlações do sinal de
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
192
hidrogênio em δ 7,86 (H-4) com o sinal de carbono em δ 113,6 (C-5, 3J) e o acoplamento do
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
193
duplo dupleto em δ 7,10 (H-7) com o sinal de carbono em δ 148,8 (C-10, 3J), justificando a
escolha pela proposta I, em detrimento da proposta II cujos acoplamentos seriam ambos
hipoteticamente 4J. Ainda que acoplamentos em “W” sejam observados em compostos
cumarínicos. Além disso, absorções em torno de δC 162-163 e δC 102-103, ausentes no
espectro de ACS-5, são características para os carbonos C-7 e C-8, respectivamente, em
derivados da umbeliferona. No carbono oxigenado há uma desblindagem adicional devido à
conjugação com a carbonila, enquanto que no outro carbono, a proteção ocorre em virtude do
forte efeito mesomérico doador exercido pelos átomos de oxigênio orto a este carbono
(POUCHERT, 1993). O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3COCD3, Fig. 106, p.
198) de uma amostra autêntica de umbeliferona ratifica estas inferições.
Em termos cromatográficos, a 6-hidroxi-cumarina também apresenta
comportamento diferente da umbeliferona (lit. 230-233 °C), conforme pode ser constatado
pelos tempos de retenção nos respectivos cromatogramas de HPLC (Fig. 107 e 108, p.198):
11,7 e 13,10 min.
6-hidroxi-cumarina já foi isolada da parte aérea de Bidens parviflora-Asteraceae
(TOMMASI et al., 1992), das raízes de Paeonia suffruticosa- Paeoniaceae (Wu et al., 2002) e
Hydrangea chinensis-Hydrangeaceae (KHALIL et al, 2003), nesta última espécie foi
identificada também umbeliferona, nas folhas (Tab. 19, p. 194).
Biossinteticamente, as substituições em cumarinas (incluindo hidroxilação) ocorrem
preferencialmente na posição 7, resultando na formação da umbeliferona, devido ao precursor
comum a esta classe de compostos: o ácido p-cumárico, gerado a partir da desaminação da
tirosina ou hidroxilação do ácido cinâmico (ROBBERS, 1997).
Embora as cumarinas 6-monoxigenadas sejam raras na natureza, sendo a ocorrência
delas restritas a um reduzido número de espécies, os dados espectroscópicos obtidos
forneceram evidências incontestáveis de sua existência, mesmo levando a uma proposta
estrutural contraditória à preconizada pela teoria biogenética.
O O
OH
H H
H
H
H O OOH
H
H
H
H
H113,6
154,8
118,2
120,6
120,6148,8
120,6
120,6154,8
113,6
118,2
148,8
I II
6,36
7,867,06
7,19
7,10
7,10
7,19
7,06
6,36
7,86
Tabela 19- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, registrados na literatura (GOTTLIEB, 1979). # C
6-OH-cum δC (ppm)
CD3COCD3
ACS-5 δC (ppm)
CD3COCD3
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
2 162,7 161,0 6,36 7,86 3 116,5 117,6 6,36 (1H, d, 9,6 Hz) 7,86 4 144,7 144,4 7,86 (1H, d, 9,6 Hz) 7,06 5 112,8 113,6 7,06 (1H, d, 2,7 Hz) 7,86; 7,10 6 154,4 154,8 7,06 7,19 7 120,7 120,6 7,10 (1H, dd, 8,9 e 2,7 Hz) 7,19; 7,06 8 117,9 118,2 7,19 (1H, d, 8,9 Hz) 9 119,9 120,6 7,06 6,36 10 147,9 148,8 7,86; 7,19; 7,10;7,06
Tabela 20- Comparação dos dados de RMN 13C de ACS-5 com dois registros de deslocamentos químicos de 13C de 6-hidroxi-cumarina, encontrados na literatura (GOTTLIEB, 1979 e KHALIL et al., 2003).
# C
6-hidroxi-cumarina* δC (ppm)
CDCl3+CD3OD (2:1)
ACS-5 δC (ppm)
CD3COCD3
6-hidroxi-cumarina♣ δC (ppm) C5D5N
Umbeliferona δC (ppm)
CD3COCD3 2 162,7 161,0 160,6 161,2 3 116,5 117,6 115,4 112,9 4 144,7 144,4 144,2 144,8 5 112,8 113,6 112,3 130,5 6 154,4 154,8 154,5 113,9 7 120,7 120,6 119,8 162,1 8 117,9 118,2 117,2 103,4 9 119,9 120,6 120,2 113,0 10 147,9 148,8 147,8 157,1
* GOTTLIEB, 1979. ♣KHALIL et al., 2003
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
194
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
195
Figura 100- Espectro de RMN 1H de ACS-5 (CD3COCD3, 500 MHz)
Figura 101- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)
O O
OH
148,8120,6
118,2
154,8
113,6120,6
161,0
117,6
144,4
O O
OH
H H
H
H
H
6,36
7,867,06
7,19
7,10
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
196
Figura 102- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-5 (CD3COCD3, 125 MHz)
Figura 103- Espectro de RMN-HSQC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
197
Figura 104- Espectro de massa de ACS-5 (Impacto Eletrônico)
Figura 105- Espectro de RMN-HMBC (CD3COCD3, 125 x 500 MHz) de ACS-5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
1112 13
O O
OH
H H
H
H
H
10 4
2
12 6
3
1
13 11
9
8
14 7
5
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
198
Figura 106- Espectro de RMN 13C-CPD de umbeliferona (CD3COCD3, 125 MHz)
Figura 107- Cromatograma de HPLC de 6-hidroxi-cumarina (254 nm)
Figura 108- Cromatograma de HPLC de umbeliferona (7-hidroxi-cumarina: 254 nm)
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
13,10
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
11,70
O OOH 157,1
162,1
103,4
113,9
130,5113,0
161,2
112,9
144,8
5.16. Protocatecuato de- 6-cumarila (ACCE-8)
Sucessivas separações (3x) em Sephadex LH-20 da fração ACCE2AM/CA, obtida
por partições e cromatografias em gel de sílica do extrato etanólico das cascas do caule,
conduziram ao isolamento de um sólido vermelho (pf. 257,6-258,3 °C), chamado de ACCE-8
(ítem 10.1.6.12, p. 281).
Análise do espectro de absorção na região do infravermelho (Fig. 109, p. 203)
conduziu à identificação dos seguintes grupos funcionais: I- hidroxila, devido a uma banda
larga em 3315 cm-1; II- carbonila, evidenciada pela absorção em 1699 cm-1; III- anel
aromático, caracterizado pelas bandas esqueletais em 1609, 1565, 1519 e 1440 cm-1
(deformação axial C=Carom.) e absorções em 936 e 826 cm-1 (deformação angular Carom-H),
IV- carbonos oxigenados, reconhecidos através das absorções em 1305, 1259, 1224 e 1179
cm-1.
No espectro de RMN 1H de ACCE-8 (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 110, p. 203), foram
observados dois dupletos δ 8,02 e 6,49 (1H, d, J = 9,6 Hz, H-4 e H-3), típicos de hidrogênios
olefínicos de cumarina, e dois sistemas de spin ABX: A-[δ 7,40 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-8); 7,25
(1H, dd, J = 9,0 e 2,9 Hz, H-7) e 7,21 (1H, d, J = 2,9 Hz, H-5)] e B-[δ 7,69 (1H, dd, J = 8,5 e
2,0 Hz, H-6’); 7,48 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-2’) e 7,06 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-5’)], diferenciados
após análise do espectro COSY (Fig. 111, p. 204).
O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 112, p. 204) apresentou
dezesseis linhas espectrais, sendo duas atribuídas a carbonilas de éster e de lactona (δ 166,6,
C-7’ e 160,0, C-2). No espectro RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 113, p. 205),
foram registradas oito linhas espectrais: δ 143,8 (C-4); 127,4 (C-6’); 122,3 (C-2’); 121,3 (C-
7); 117,7 (C-8); 117,1 (C-5’); 116,8 (C-3) e 114,6 (C-5), as quais foram relacionadas a
carbonos sp2 monohidrogenados. Subtração dos espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135
permitiu a identificação de sete carbonos não-hidrogenados: δ 153,6 (C-6); 153,5 (C-4’);
149,0 (C-10); 142,6 (C-3’); 122,3 (C-1’) e 119,5 (C-9), sendo as quatro primeiras absorções
referentes a carbonos aromáticos oxigenados. Através do espectro de RMN 13C-GATED (Fig.
114, p. 205), constatou-se que a absorção em δ 122,3 (C-1’ e C-2’) correspondia a dois
carbonos, um CH e outro não-hidrogenado. O CH apresentou-se como um duplo dupleto
(1JC,H= 122,0 Hz; 3JC,H= 7,2 Hz, C-2’) e o carbono não-hidrogenado exibiu-se na forma de um
dupleto (3JC,H = 7,2 Hz, C-1’).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
199
Os dados de RMN permitiram a dedução da fórmula molecular C16H10O6,
condizente com a massa molecular de 298 Da, obtida pelo espectro de massa (EM-IE, Fig.
115, p. 206), sugerindo uma cumarina esterificada, na posição 6 ou 7, com um fragmento
protocatecuoíla, o qual foi proposto devido às evidências de presença de um anel aromático
1,3,4-trissubstituído, provavelmente di-hidroxilado, e a existência de uma carbonila de éster
na estrutura. Além disso, o ácido protocatecuico já havia sido isolado de A. cearensis. No
espectro de EM-IE de ACCE-8 foram detectados picos com m/z: 298 (pico íon-molecular),
254 (eliminação de CO2 da lactona), 146 (perda do fragmento de protocatecuato do composto
original) e 118 (descarbonilação do cátion cumarínico).
O espectro de RMN-HSQC (Fig. 116, p. 206) revelou os carbonos referentes a cada
anel benzênico, a partir de suas correlações com os hidrogênios pertencentes a cada sistema
aromático (Tab. 21, p. 202). Os carbonos olefínicos foram correlacionados com seus
hidrogênios, conforme os acoplamentos observados entre os sinais de carbono em δC 143,8
(C-4) e 116,8 (C-3) e os dupletos em δH 8,02 (C-4) e 6,49 (C-3), respectivamente.
O espectro de RMN-HMBC (Fig. 117, p. 207) permitiu a caracterização do
esqueleto cumarínico, por meio de correlações como as dos hidrogênios olefínicos H-3 (δH
6,49) e H-4 (δH 8,02) com a carbonila lactônica C-2 (δC 160,0), ou através dos acoplamentos
dos hidrogênios aromáticos H-5 (δH 7,21), H-7 (δH 7,25) e H-8 (δH 7,40) e hidrogênios
olefínicos H-3 (δH 6,49) e H-4 (δH 8,02) com os carbonos aromáticos C-9 (δC 119,5) e C-10
(δC 149,0).
A existência do fragmento protocatecuoíla foi ratificada pelas correlações dos
hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,48), H-5’ (δH 7,06) e H-6’ (δH 7,69) com os carbonos
aromáticos não hidrogenados C-1’ (δC 122,3), C-3’ (δC 142,6) e C-4’ (δC 153,5), mas também
pelos acoplamentos dos hidrogênios aromáticos H-2’ (δH 7,48) e H-6’ (δH 7,69) com o
carbono carbonílico C-7’ (δC 166,6).
As correlações dos sinais de hidrogênio em δH 8,02 e 7,21 com os sinais de carbono
em δC 114,6 e 143,8 (3J), respectivamente, e a correlação do duplo dupleto em δH 7,25 com o
sinal de carbono em δC 149,0 (3J) foram determinantes para a escolha da proposta de
substituição da cumarina, na posição 6 (I), já que na posição 7 (II), estes acoplamentos seriam
hipoteticamente 4J.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
200
114,6 143,8
7,21
7,25
8,02
O O
RO
H H
H
H
H
I
149,0
7,21
7,25
8,02
O O
H H
H
H
RO
H
II
143,8
149,0114,6
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
201
O espectro de RMN-NOESY (Fig. 118) corroborou a proposta I, ao mostrar o
acoplamento homonuclear dipolar entre os dupletos em δH 8,02 (H-4) e 7,21 (H-5).
A estrutura química de ACCE-8, reconhecida como protocatecuato de 6-cumarila, é
inédita na literatura.
O O
O
O
OH
OH114,6
153,6
121,3
119,5
117,7149,0
153,5
166,6
116,8122,3
142,6
160,0
143,8
117,1
122,3
127,4
7,21
7,257,40
6,49
8,02
23
45
67
8
4a
8a O O
H H
H
H
RO
H
II
7,21
7,257,40
6,498,02
23
45
67
8
4a
8a O O
RO
H H
H
H
H
I
7,69
7,48
7,21
7,25
7,40
7,06
6,49
8,02
O O
O
H H
H
H
HO
OH
OH
H
H
H
1'
2'
3'4'
5'
6'
7'
23
45
67
8
4a
8a
Tabela 21- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-8 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e HMBC.
# C
ACCE-8 δC (ppm) DMSO-d6
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
HMBC 2J
HMBC 3J
2 160,0 6,49 8,02 3 116,8 6,49 (1H, d, 9,6 Hz) 4 143,8 8,02 (1H, d, 9,6 Hz) 7,21 5 114,6 7,21 (1H, d, 2,9 Hz) 8,02 7,25 6 153,6 7,25; 7,21 7,40 7 121,3 7,25 (1H, dd, 9,0 Hz; 2,9 Hz) 7,21 8 117,7 7,40 (1H, d, 9,0 Hz) 9 119,5 8,02 7,40; 6,49 10 149,0 7,40 8,02; 7,25; 721, 1’ 122,3 7,69; 7,48 7,06 2’ 122,3 7,48 (1H, d, 2,0 Hz) 7,69 3’ 142,6 7,48 7,06 4’ 153,5 7,06 7,69; 7,48 5’ 117,1 7,06 (1H, d, 8,5 Hz) 6’ 127,4 7,69 (1H, dd, 8,5 Hz; 2,0 Hz) 7,48 7’ 166,6 7,69; 7,48
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
202
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
203
Figura 109- Espectro de absorção na região do infravermelho de ACCE-8 (pastilha de KBr)
Figura 110- Espectro de RMN 1H de ACCE-8 (DMSO-d6, 500 MHz)
7,69
7,48
7,21
7,25
7,40
7,06
6,49
8,02
O O
O
H H
H
H
HO
OH
OH
H
H
H
1'
2'
3'4'
5'
6'
7'
23
45
67
8
4a
8a
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
204
Figura 111- Espectro de RMN-COSY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8
Figura 112- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
205
Figura 113- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)
Figura 114- Espectro de RMN 13C-GATED de ACCE-8 (DMSO-d6, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
206
Figura 115- Espectro de massa de ACCE-8 (Impacto Eletrônico)
Figura 116- Espectro de RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8
Figura 116a- Expansão da região δ 6,4-7,5 x 113-124
1
3
4
2
6
17
5
23
Aspectos Químicos do Estudo cearensis A.C. Smith
207
Figura 117- Espectro de RMN-HMBC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-8
O O
O
H H
H
H
HO
OH
OH
H
H
H
1238 9
10
1112
13
1718
22
252627
Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana
O O
O
H H
H
H
HO
OH
OH
H
H
H
4
5
6
7
14 15
16
192021
23
24
26
9
21
13
10 15
27 19
16
12
8 22
11 1
3 14
18 24 7 20
6
25
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
208
Figura 117a- Expansões do espectro HMBC de ACCE-8: (I) δ 6,9-8,1 x 140-157; (II) δ 6,4-8,2 x 113-132.
Figura 118- Espectro de RMN-NOESY (DMSO-d6, 500 x 500 MHz) de ACCE-8
H-5 H-4
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
209
5.17. Ácido protocatecuico (ACCE-2)
Tratamentos cromatográficos sucessivos em gel de sílica e Sephadex LH-20 da
fração acetato de etila, obtida de partição do extrato etanólico das cascas do caule de A.
cearensis, conduziram ao isolamento de cristais aciculares amarelos (p.f. 199,2-200,7 °C), os
quais foram denominados ACCE-4 (ítem 10.1.6.6, p. 278).
No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 119, p. 211) foram
registradas oito linhas espectrais, sendo uma atribuída a carbonila de éster ou de ácido (δ
170,3, C-7) e duas relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados (δ 151,5 C-4 e 146,0, C-3).
Os carbonos hidrogenados foram identificados através da análise do espectro de RMN 13C-
DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 120, p. 211), no qual foram visualizados apenas três
sinais, todos referentes a carbonos aromáticos hidrogenados (δ 123,9 C-2; 117,7 C-6; 115,7
C-5). A absorção em δ 123,0 (C-1), ausente no espectro DEPT135, foi atribuída a carbono
aromático não-hidrogenado.
O espectro de RMN 1H de ACCE-4 (500 MHz, CD3OD, Fig. 121, p. 212)
apresentou um sinal múltiplo em δ 7,46-7,43, correspondentes a dois hidrogênios, os quais,
juntamente com um dupleto em δ 6,81 (1H, J = 8,7 Hz, H-5), foram associados a um anel
benzênico trissubstituído.
A fórmula molecular C7H6O4, deduzida a partir da análise dos espectros de RMN,
sugeriram a estrutura de um derivado do ácido benzóico trissubstituído, o qual foi identificado
como sendo o ácido protocatecuico após comparação com dados RMN 13C disponíveis na
literatura (POUCHERT, 1993) (Tab. 22, p. 210).
CO2H
OH
OH
123,0
123,9
146,0
151,5
115,7
117,7
170,3CO2H
OH
OH
H
H
H1
23
4
56
7
6,81
7,43
Tabela 22- Dados de RMN 13C de ACCE-2 e comparação com deslocamentos químicos de 13C do ácido protocatecuico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).
# C
Ác. protocatecuicoδC (ppm) DMSO-d6
ACCE-2 δC (ppm) CD3OD
1 121,6 123,0 2 121,9 123,9 3 144,7 146,0 4 149,9 151,5 5 115,1 115,7 6 116,5 117,7 7 167,2 170,3
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
210
Figura 119- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2
Figura 120- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-2
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
211
Figura 121- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-2
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
212
5.18. Ácido vanílico (ACCE-4)
Gerada através de partições líquido-líquido do extrato etanólico das cascas do caule,
ACCEAM foi submetida a cromatografias em gel de sílica e Sephadex LH-20, obtendo-se um
sólido marrom escuro (f14-15), que após recristalização em CHCl3/AcOEt 50%, foi
convertido em cristais amarelados (p.f. 204,9-205,8 °C), designados ACCE-4 (ítem 10.1.6.6,
p. 278). Esta mesma substância também foi isolada da fração acetato de etila do extrato
etanólico das sementes.
Os grupos funcionais presentes na estrutura de ACCE-4 foram caracterizados pelas
freqüências das bandas observadas no espectro de absorção na região do infravermelho (Fig.
122, p. 215): 3484 cm-1 (hidroxila), 1683 cm-1 (carbonila conjugada), 1598, 1523 e 1434 cm-1
(anel aromático), e 1280, 1238, 1205 e 1111 cm-1 (carbonos oxigenados).
O espectro de RMN 1H de ACCE-4 (500 MHz, CD3OD, Fig. 123, p. 215)
apresentou um sinal múltiplo em δ 7,57- 7,54, correspondentes a dois hidrogênios, os quais,
juntamente com um dupleto em δ 6,83 (1H, J = 8,7 Hz, H-5), foram associados a um anel
benzênico trissubstituído, além de um singleto agudo em δ 3,89 (3H, s, 3-OMe), relacionado a
hidrogênios metoxílicos .
No espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 124, p. 216) foram
registradas oito linhas espectrais, sendo uma atribuída a carbonila de éster ou de ácido (δ
170,2, C-7) e duas relacionadas a carbonos aromáticos oxigenados (δ 152,8 C-4 e 148,8, C-3).
Os carbonos hidrogenados foram identificados através de análise do espectro de RMN 13C-
DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig. 125, p. 216), no qual foram visualizados quatro sinais:
três referentes a carbonos aromáticos hidrogenados (δ 125,4, C-6; 116,0, C-4 e 114,0, C-2) e
um associado à presença de metoxila (δ 56,5, 3-OMe). A absorção em δ 123,2 (C-1), ausente
no espectro DEPT135, foi atribuída a carbono aromático não-hidrogenado.
O espectro de massa de ACCE-4 (EM-IE, Fig. 126, p. 217) exibiu fragmentos com
m/z 168 (pico íon molecular), 153 (desmetilação), 138 (perda de formaldeído da molécula
original) e 121 (desidratação). A partir da composição elementar C8H8O4, fornecida pelo pico
íon-molecular, foram sugeridos três análogos metilados do ácido protocatecuico: um éster (I)
e dois éteres metílicos, sendo um alquilado na posição 3 (II) e outro na posição 4 (III).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
213
OH
OCH3
OHO
OCH3
OH
OHO
OH
OH
OCH3O
148,8 148,8 148,83,89
3,89
3,89
I II III
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
214
O espectro HMBC (Fig. 127) mostrou o acoplamento entre os hidrogênios metílicos
(δH 3,89, 3-OMe) com o carbono aromático C-3 (δC 148,8), justificando a proposta II. Dados
de RMN, disponíveis na literatura, reforçaram a estrutura proposta do ácido vanílico (lit.: 210
°C) (POUCHERT, 1993) (Tab. 23).
Tabela 23- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-4 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido vanílico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).
# C
Ác. vanílico δC (ppm) DMSO-d6
ACCE-4 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
1 121,7 123,2 2 112,6 114,0 7,55 (1H, m) 3 147,0 148,8 4 151,0 152,8 5 114,8 116,0 6,83 (1H, d, 8,7 Hz) 6 123,6 125,4 7,55 (1H, m) 7 167,5 170,2
3-OMe 55,6 56,5 3,89 (3H, s)
CO2H
OCH3
OH
123,2
114,0
148,8
152,8
116,0
125,4
170,2
56,5
CO2H
OCH3
OH
H
H
H1
23
4
56
7
7,55
6,83
7,55
3,89
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
215
Figura 122- Espectro de absorção na região do Infravermelho de ACCE-4 (pastilha de KBr)
Figura 123- Espectro de RMN 1H de ACCE-4 (CD3OD, 500 MHz)
CO2H
OCH3
OH
H
H
H1
23
4
56
7
7,55
6,83
7,55
3,89
CO2H
OCH3
OH
123,2
114,0
148,8
152,8
116,0
125,4
170,2
56,5
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
216
Figura 124- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 125- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACCE-4 (CD3OD, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
217
Figura 126- Espectro de massa de ACCE-4 (Impacto Eletrônico)
Figura 127- Espectro bidimensional de correlação heteronuclear (HMBC) de ACCE-4
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
218
5.19. Ácido p-hidroxi-benzóico (ACPa-5)
O extrato etanólico da parte aérea de espécimens jovens foi particionado com
H2O/AcOEt e cromatografado em Sephadex LH-20 e cartucho de SPE, produzindo um sólido
marrom ACPa-5 (p.f. 176,1-179,2 °C) (ítem 10.1.8.9, p. 295).
No espectro de RMN 1H de ACPa-5 (500 MHz, CD3OD, Fig. 128, p. 219), foram
observados apenas dois dupletos em δ 7,88 e 6,82 (2H, d, J = 9,6 Hz, H-2,6 e H-3,5),
característicos de um sistema aromático para-dissubstituído.
O espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-5 (125 MHz, CD3OD, Fig. 129, p. 219)
mostrou cinco linhas espectrais, das quais uma foi compatível com carbonila de ácido (δ
170,3, C-7) e as outras quatro foram associadas a carbonos aromáticos: δ 163,4 (C-4); 133,1
(C-2,6); 123,1 (C-1) e 116,2 (C-3,5). As absorções em δ 133,1 e 116,2. foram atribuídas a
carbonos hidrogenados, após análise do espectro de RMN 13C-DEPT135. Por subtração dos
espectros de RMN 13C (125 MHz, MeOD, Fig. 130, p. 220), os sinais em δ 163,4 (C-4) e
123,1 (C-1) foram reconhecidos como pertencentes a carbonos não-hidrogenados, sendo a
primeira absorção relacionada a carbono oxigenado.
ACPa-5 foi identificado como sendo o ácido p-hidroxi-benzóico, cujos dados de
RMN foram concordantes com os registrados na literatura (POUCHERT, 1993) (Tab. 24).
Tabela 24- Dados de RMN 1H e 13C de ACPa-5 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido p-hidroxi-benzóico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).
# C
Ac. p-hidroxi-benzóicoδC (ppm) DMSO-d6
ACPa-5 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
1 121,4 123,1 2,6 131,5 133,1 7,88 (1H, d, 9,6 Hz) 3,5 115,0 116,2 6,82 (1H, d, 9,6 Hz) 4 161,6 163,4 7 167,5 170,3
CO2H
OH
H
HH
H 1
2
3
4
56
7
6,82
7,88
CO2H
OH
123,1
133,1
116,2
163,4
170,3
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
219
Figura 128- Espectro de RMN 1H de ACPa-5 (CD3OD, 500 MHz)
Figura 129- Espectro de RMN 13C-CPD de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz)
CO2H
OH
123,1
133,1
116,2
163,4
170,3
CO2H
OH
H
HH
H 1
2
3
4
56
7
6,82
7,88
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
220
Figura 130- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACPa-5 (CD3OD, 125 MHz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
221
5.20. Ácido (E)-o-cumárico (ACS-6)
Originada do particionamento do extrato etanólico das sementes, a fração acetato de
etila ACSEA foi submetida a cromatografias convencionais (sílica e Sephadex LH-20) e
moderna (HPLC), levando à obtenção do sólido branco ACS-6 (p.f. 213,6-215,9 °C,
tR = 11,24 min) (ítem 10.1.7.6, p. 285).
Análise do espectro de RMN 13C-CPD de ACS-6 (125 MHz, CD3OD, Fig. 131, p.
223) revelou a existência de nove carbonos sp2, identificados a partir de seus deslocamentos
químicos (δ 171,6; 158,3; 142,4; 132,6; 130,1; 122,9; 120,9; 119,1 e 117,1). O sinal em δ
171,6 (C-9) foi atribuído à carbonila de ácido, enquanto que o sinal em δ 158,3 (C-2) foi
associado a carbono oxigenado. O espectro de RMN 13C-DEPT135 (125 MHz, CD3OD, Fig.
132, p. 223) mostrou seis linhas espectrais (142,4; 132,6; 130,1; 120,9; 119,1 e 117,1), sendo
todas pertencentes a carbonos monohidrogenados. Ausente no espectro DEPT135, o sinal em
δ 122,9 (C-1) foi relacionado a carbono não-hidrogenado.
Submetida a uma análise por espectrometria na região do infravermelho (Fig. 133,
p. 224), a amostra de ACS-6 apresentou uma banda larga em 3365 cm-1, referente à
deformação axial de O-H, bandas esqueletais em 1564 e 1459 cm-1 e absorções em 1399 e
1252 cm-1, relativas a deformações axiais C-O. Todavia, não foi verificada nenhuma banda
que pudesse ser associada à carbonila.
Através do espectro de RMN 1H de ACS-6 (500 MHz, CD3OD, Fig. 134, p. 224),
identificou-se a presença de um anel aromático orto-dissubstituído, caracterizado por dois
dupletos em δ 7,48 e 6,84 (1H, d, J = 8,0 Hz, H-6 e H-3) e dois tripletos em δ 7,20 e 6,84 (1H,
t, J = 8,4 Hz, H-4 e H-5), e uma olefina com configuração trans, devido à existência de dois
dupletos em δ 7,94 e 6,54 (1H, d, J = 16,0 Hz, H-7 e H-8), sugerindo uma estrutura de um
derivado cinâmico hidroxilado: ácido (E)-o-cumárico (lit. 210 °C- Catálogo Fluka, 2007).
A concordância entre os deslocamentos químicos de 13C apresentados por ACS-6 e
os descritos na literatura para o ácido o-cumárico reforçaram a proposta estrutural
(POUCHERT, 1993) (Tab. 25, p. 222).
CO2H
OH
H
H
H
H
H
H 7,20
6,84
1
23
4
5
6 7
89
6,54
7,947,48
6,84CO2H
OH
119,1
158,3117,1
132,6
120,9
130,1 142,4122,9
171,6
Tabela 25- Dados de RMN 1H e 13C de ACS-6 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de ácido (E)-o-cumárico, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).
# C
Ác. (E)-o-cumárico δC (ppm) CD3OD
ACS-6 δC (ppm) CD3OD
HSQC δH (ppm)(int., multip, JH,H)
1 120,8 122,9 2, 156,5 158,3 3 116,0 117,1 6,84 (1H, d, 8,0 Hz) 4 131,3 132,6 7,20 (1H, t, 8,4 Hz) 5 119,3 120,9 6,84 (1H, t, 8,4 Hz) 6 128,5 130,1 7,48 (1H, d, 8,0 Hz) 7 139,5 142,4 7,94 (1H, d, 16,0 Hz) 8 118,2 119,1 6,54 (1H, d, 16,0 Hz) 9 168,0 171,6
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
222
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
223
Figura 131- Espectro de RMN 13C-CPD de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz)
Figura 132- Espectro de RMN 13C-DEPT135 de ACS-6 (CD3OD, 125 MHz)
CO2H
OH
119,1
158,3117,1
132,6
120,9
130,1 142,4122,9
171,6
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
224
Figura 133- Espectro de absorção na região do IV de ACS-6 (pastilha de KBr)
Figura 134- Espectro de RMN 1H de ACS-6 (CD3OD, 500 MHz)
CO2H
OH
H
H
H
H
H
H 7,20
6,84
1
23
4
5
6 7
89
6,54
7,947,48
6,84
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
225
5.21. Quercetina (ACCE-1)
Cromatografias de adsorção (sílica) e exclusão (Sephadex LH-20) da fração
metanólica ACCEAM, produzida por particionamento do extrato etanólico das cascas do
caule, permitiram o isolamento de um sólido amarelo (p.f.> 300 °C), denominado ACCE-1
(ítem 10.1.6.5, p. 282), cujo espectro de RMN 1H (500 MHz, DMSO-d6, Fig. 135, p. 227)
mostrou um conjunto de sinais em δ 7,67 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5’); 7,53 (1H, dd, J = 8,5 e 2,1
Hz, H-6’) e 6,88 (1H, d, J = 2,1 Hz, H-2’), referentes a um sistema aromático de spin ABX e
dois dupletos em δ 6,41 e 6,18 (1H, d, J = 2,0 Hz, H-8 e H-6), compatíveis com hidrogênios
aromáticos meta-posicionados.
O espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6, Fig. 136, p. 227)
exibiu quinze linhas espectrais, sendo todas pertencentes a carbonos sp2 (δ 175,8; 163,9;
160,7; 156,2; 147,7; 146,8; 145,1; 135,7; 122,0; 120,0; 115,6; 115,1; 103,0; 98,2 e 93,4). A
absorção em δ 175,8 (C-4) foi associada à carbonila de cetona conjugada, enquanto os sinais
em δ 164,0 (C-7); 160,7 (C-5); 156,2 (C-9); 147,7 (C-2); 146,8 (C-4’); 145,1 (C-3’) foram
associados a carbonos oxigenados. Os carbonos hidrogenados foram identificados por RMN-
HSQC (Fig. 137, p. 228), através das seguintes correlações: os dupletos em δH 6,41 (C-8) e
6,18 (C-6) com os sinais de carbono em δC 93,4 (C-8) e 98,2 (C-6) e o sistema ABX [(δH 7,67
(H-5’); 7,53 (H-6’) e 6,88 (H-2’)] com os sinais de carbono em δC 115,6 (H-5’); 120,0 (H-6’)
e 115,1 (H-2’), respectivamente. Os dados espectroscópicos conduziram à dedução da
fórmula molecular C15H10O7, compatível com a estrutura de um flavonol pentahidroxilado, o
qual foi sugerido corresponder à quercetina (lit. 314 °C). Referências de dados de RMN 13C
deram suporte à proposição estrutural (AGRAWAL, 1989) (Tab. 26, p. 226).
A quercetina é o flavonol mais comumente encontrado em alimentos, sendo sua
ingestão diária estimada em até 38 mg, e a ela são atribuídas ações antioxidante,
anticarcinogênica, antiinflamatória e efeitos antiagregante e vasodilatador (ERLUND, 2004).
1'2
3
456
7
89
10
2'
3'
4'
5'6'
7,67
6,18
6,416,88
7,53
O
O
OH
OH
OH
OH
OHH
H
HH
H
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
147,7
135,7
175,8
160,7
98,2
164,0
93,4156,2
103,1
122,0115,1
145,1
146,8
115,6
120,0
Tabela 26- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-1 dispostos segundo as correlações obtidas através de espectros HSQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de quercetina, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).
# C
Quercetina δC (ppm) CD3OD
ACCE-1 δC (ppm) DMSO-d6
HSQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
2 147,5 146,8 3 136,5 135,7 4 176,5 175,8 5 161,0 160,7 6 99,5 98,2 6,18 (1H, d, 2,0 Hz) 7 166,0 164,0 8 94,5 93,4 6,41 (1H, d, 2,0 Hz) 9 156,7 156,2 10 104,0 103,1 1’ 123,0 122,0 2’ 116,0 115,1 6,88 (1H, d, 2,1 Hz) 3’ 145,7 145,1 4’ 148,1 147,7 5’ 116,5 115,6 7,67 (1H, d, 8,5 Hz) 6’ 121,0 120,0 7,53 (1H, dd, 8,5 Hz; 2,1 Hz)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
226
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
227
Figura 135- Espectro de RMN 1H de ACCE-1 (500 MHz, DMSO-d6)
Figura 136- Espectro de RMN 13C-CPD de ACCE-1 (125 MHz, DMSO-d6)
O
O
OH
OH
OH
OH
OH
147,7
135,7
175,8
160,7
98,2
164,0
93,4156,2
103,1
122,0115,1
145,1
146,8
115,6
120,0
1'2
3
456
7
89
10
2'
3'
4'
5'6'
7,67
6,18
6,416,88
7,53
O
O
OH
OH
OH
OH
OHH
H
HH
H
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
228
Figura 137- Espectro de RMN-HSQC (DMSO-d6, 125 x 500 MHz) de ACCE-1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
229
5.22. Isocampferídio (ACCE-7)
A partir do particionamento do extrato etanólico das cascas do caule, obteve-se uma
fração metanólica ACCEAM, que submetida a cromatografias em gel de sílica e Sephadex
LH-20, resultou na obtenção de um sólido amarelo chamado ACCE-7 (p.f. 290,7-292,1 °C)
(ítem 10.1.6.8, p. 278). Esta substância foi descoberta ser quimicamente semelhante ao sólido
amarelo ACPa-3 (5,0 mg), isolado do extrato etanólico das parte aérea de plantas jovens, após
análise por CCD.
Os espectros de RMN 1H (500 MHz, CD3OD, Fig. 138, p. 231) de ACCE-7 e
ACPa-3 mostraram dupletos em δ 7,93 e 6,89 (2H, d, J = 8,5 Hz, H-2’,6’) referentes a um
anel aromático para-dissubstituído, dois dupletos em δ 6,35 e 6,15 (1H, J = 2,0 Hz, H-8 e H-
6), atribuídos aos hidrogênios aromáticos meta-posicionados e um singleto em δ 3,77 (3H, s,
correspondente à metoxila. O espectro de RMN 13C-CPD (125 MHz, CD3OD, Fig. 139, p.
231) exibiu catorze linhas espectrais, das quais uma foi atribuída a carbonila flavonoídica (δ
180,0) e outras cinco foram associadas a carbonos sp2 oxigenados: δ 165,9 (C-7); 163,0 (C-5);
161,7 (C-4’); 158,4 (C-9); 158,0 (C-2) e 139,4 (C-3). No espectro de RMN 13C DEPT135
(125 MHz, CD3OD, Fig. 140, p. 232), foram verificadas absorções associadas a carbonos sp2
hidrogenados: δ 131,4 (C-2’,6’); 116,5 (C-3’,5’); 99,8 (C-6) e 94,8 (C-8). Da subtração dos
espectros de RMN 13C-CPD e DEPT135, resultaram apenas as absorções relativas aos
carbonos não-hidrogenados: δ 122,6 (C-1’); 105,9 (C-10).
A reunião dos dados espectroscópicos de ACCE-7 permitiu sugerir a fórmula
molecular C16H12O6, com índice de deficiência de hidrogênio igual a onze, correspondente a
um esqueleto flavônico tetrassubstituído, o qual foi identificado como sendo compatível à
estrutura do isocampferídio (lit.: p.f. 299-302 °C) (Djerassi et al, 1994). Dados de RMN 13C
da literatura corroboraram a proposta (AGRAWAL, 1989) (Tab. 27, p. 230).
O
O
OCH3
OH
OH
OH
158,0
139,4
180,0
163,0
99,8
165,9
94,8158,4
105,9
122,4
131,4
116,5
161,7
60,5
1'2
3
456
7
89
10
2'
3'
4'
5'6'
6,89
6,15
6,357,93
7,53
O
O
OCH3
OH
OH
OHH
H
H
H
3,77
Tabela 27- Dados de RMN 1H e 13C de ACCE-7 dispostos segundo as correlações obtidas através do espectro HMQC e comparação com deslocamentos químicos de 13C de isocampferídio, registrados na literatura (AGRAWAL, 1989).
# C
Isocampferidio δC (ppm) CD3OD
ACCE-7δC (ppm)CD3OD
HMQC δH (ppm)(int.,multip, JH,H)
2 157,3 158,0 3 139,4 139,4 4 179,6 180,0 5 163,1 163,0 6 100,7 99,8 6,15 (1H, d, 2,0 Hz) 7 167,1 165,9 8 95,7 94,8 6,35 (1H, d, 2,0 Hz) 9 158,3 158,4 10 105,7 105,9 1’ 122,4 122,6
2’,6’ 131,9 131,4 7,93 (2H, d, 8,5 Hz) 3’,5’ 117,5 116,5 6,89 (2H, d, 8,5 Hz)
4’ 162,1 161,7 3-OMe 61,9 60,5 3,77 (3H, s)
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
230
Figura 138- Espectro de RMN 1H (CD3OD, 500 MHz) de ACCE-7
Figura 139- Espectro de RMN 13C-CPD (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7 Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
231
Figura 140- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CD3OD, 125 MHz) de ACCE-7
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
232
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
233
5.23. Cumarina (ACS-1 e ACPa-2)
Cromatografia em gel de sílica da fração E7-ACPaAD(4-6) (380 mg) permitiu o
isolamento de 104 mg de cristais brancos sublimáveis (p.f. 67,8-68,7 °C), com odor forte e
peculiar de cumarina, denominados ACPa-2 e ACS-1 (ítem 10.1.7.1, p. 282).
O espectro de RMN 1H de ACPa-2 e ACS-1 (300 MHz, CDCl3, Fig. 141, p. 235)
exibiu dois multipletos em δ 7,51 e 7,29 (2H, m), relacionados aos hidrogênios aromáticos e
dois dupletos em δ 7,71 e 6,42 (1H, d, J = 9,5 Hz), associados aos hidrogênios cis-olefínicos.
O espectro de RMN 13C-CPD (75 MHz, CDCl3, Fig. 142, p. 235) apresentou nove
linhas espectrais, sendo uma delas em δ 160,9 (C-2) compatível com a carbonila lactônica
α,β-insaturada e as demais foram associadas aos carbonos sp2 (δ 154,3 -116,9). A
combinação dos espectros de RMN 13C-CPD e RMN 13C-DEPT135 (75 MHz, CDCl3, Fig.
143, p. 236). revelaram a existência de seis carbonos monohidrogenados [δ 141,6 (C-4);
132,0 (C-7); 128,1 (C-5); 124,6 (C-6); 117,1 (C-3) e 116,9 (C-8)] e três carbonos não
hidrogenados [δ 160,9 (C-2); 154,3 (C-10) e 119,0 (C-9)].
Dedução da fórmula molecular para ACS-1, C9H6O2, foi feita a partir dos seus dados
de RMN. Tendo o seu IDH = 7, foi proposta uma estrutura composta por um anel benzênico
mais um anel lactônico α, β-insaturado, sugerindo tratar-se da cumarina (lit.: p.f. 68-70 °C).
Os dados de RMN 13C descritos na literatura corroboraram a estrutura proposta para ACS-1 e
ACPa-2 (POUCHERT, 1993) (Tab. 28, p. 234).
6,42
7,71
23
45
67
8
4a
8a O O
H H
H
H
H
H
128,1
124,6
132,0
119,0
116,9154,3
117,1160,9
141,6
O O
Tabela 28- Dados de RMN 13C de ACS-1 e comparação com deslocamentos químicos de 13C de cumarina, registrados na literatura (POUCHERT, 1993).
# C
Cumarina δC (ppm) CDCl3
ACS-1 δC (ppm) CDCl3
2 160,6 160,9 3 116,4 117,1 4 143,3 141,6 5 127,7 128,1 6 124,3 124,6 7 131,6 132,0 8 116,6 116,9 9 118,6 119,0 10 153,8 154,3
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
234
Figura 141- Espectro de RMN 1H (CDCl3, 300 MHz) de ACS-1
Figura 142- Espectro de RMN 13C-CPD (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
235
Figura 143- Espectro de RMN 13C-DEPT135 (CDCl3, 75 MHz) de ACS-1
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
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6. BIOSSÍNTESE DE FORMAÇÃO DAS SUBSTÂNCIAS
ISOLADAS DE A. CEARENSIS
A via chiquimato é a principal rota metabólica de gênese de compostos aromáticos,
adotada por microorganismos e plantas. Os metabólitos desta rota não são biossintetizados
por animais, todavia podem ser adquiridos pela dieta. O intermediário central desta via é o
ácido chiquímico, substância isolada originalmente de plantas japonesas do gênero Illicium, o
qual dá origem a dois aminoácidos aromáticos: L-fenilalanina e L-tirosina. A partir destes
aminoácidos, são formados compostos com unidades C6C3 (fenilpropeno) como derivados
cinâmicos, cumarinas, lignanas e flavonóides, os quais são amplamente encontrados em
produtos naturais.
Principal precursor dos compostos fenólicos, O ácido chiquímico é gerado pelo
acoplamento do fosfoenolpiruvato com D-eritose-4-fosfato, resultando no ácido 7-fosfato-3-
desoxi-D-arabino-heptulosonico, o qual sofre eliminação de ácido fosfórico e reação aldólica
intramolecular para produzir o ácido 3-de-hidroquínico. Este intermediário é convertido em
ácido chiquímico após desidratação e redução com NADPH.
O ácido chiquímico pode seguir dois caminhos: dar origem a ácidos fenólicos
simples (ácido protocatecuico e ácido gálico) ou ser convertido em ácido chorísmico, um
intermediário-chave para a biossíntese de aminoácidos (Quadro 3, p. 240).
Os ácidos fenólicos obtidos pela via chiquimato se caracterizam pelo padrão de
hidroxilação preferencialmente para em relação ao grupo da cadeia lateral, na primeira
oxidação, e orto ao grupo hidroxi no caso de poli-hidroxilação. No entanto, através da via
acetato, outra via formadora de compostos fenólicos, o padrão de substituição é tipicamente
meta. Isto permite uma identificação segura da rota metabólica utilizada pela substância
fenólica, na maioria das vezes.
Os aminoácidos L-fenilalanina e L-tirosina, diferenciados apenas por uma hidroxila
da posição 4, são resultantes da descarboxilação sucedida de aromatização do ácido
chorísmico seguida por transaminação, promovida por transaminase dependente de piridoxal-
fosfato. Por sua vez, estes aminoácidos podem se transformar respectivamente em ácido
cinâmico e ácido p-cumárico, após eliminação de amônia da cadeia lateral. Todas as plantas
são capazes de desaminar a fenilalanina, entretanto a degradação da tirosina ocorre de forma
muito limitada em espécies gramíneas. Desta forma, o ácido p-cumárico é mais comumente
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
239produzido por hidroxilação do ácido cinâmico.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
240
Abaixo, seguem propostas biogenéticas para as substâncias isoladas de A. cearensis,
baseadas em evidências biossintéticas descritas da literatura, portanto tratando-se de esquemas
meramente especulativos.
Quadro 3- Rota biossintética de formação de ácidos fenólicos simples e aminoácidos aromáticos.
Através de uma série de reações de oxidação e metilação (promovida pela S-
adenosil-metiltransferase), o ácido p-cumárico pode ser transformado em ácido cafeico, ácido
ferúlico e sinápico. Estes derivados cinâmicos podem originar ácidos fenólicos simples,
utilizando um mecanismo de β-oxidação, semelhante à sofrida por ácidos graxos. Nesta
alternativa, um éster de coenzima A é incorporado aos ácidos cinâmicos e depois é eliminado
na forma de acetilCoA, através de reação de Claisen reversa, para gerar os derivados do ácido
CO2H
OH
OH
OH
CO2H
O
OH
OH
CO2H
OH
OH
OH
CO2H
OH
OH
Oxidação
Enolização
Desidratação
CO2H
OH
O CO2H
CH2
CO2H
OH
CO2H
O
CO2H
OH
CO2H
NH2PLP
OH
CO2H
NH2
CO2H
NH2
DescarboxilaçãoAromatização
Desidroxilação
L-Fenilalanina L-Tirosina
Ác. Protocatecuico
Ác. Gálico
Ác. Chiquímico
Ác. Chorísmico Ác. Prefênico Ác. L-Arogênico
CO2H
R
PAL
R= H- Ác. CinâmicoR= OH- Ác. p-Cumárico
PAL
1
2
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
241
benzóico: ácido p-hidroxi-benzóico, ácido protocatecuico e ácido vanílico (Quadro 4, p.
245).
Quadro 4- Biogênese de formação de amburosídios e derivados dos ácido benzóico e cinâmico.
O
O
OH
O OOH
OHOH
OH
RO
O
O
RO
OH
OH
UDPGlicose
CO2H CO2H
OH
CO2H
OH
OH
CO2H
OH
H3CO
CO2H
OH
H3CO OCH3
O2/NADPH O2/NADPH O2/NADPHSAMSAM
Ác. p-Cumárico Ác. Cafeico Ác. Ferúlico Ác. Sinápico
Ác. p-Hidroxi-benzóico Ác. Protocatecuico Ác. Vanílico
CO2H
OH
CO2H
OH
OH
CO2H
OH
H3CO
a. HSCoA/ATPb. H2Oc. NAD+
d. Beta-oxidação
+CH2OH
OH
NADPH
3 4
5
R=H- Amburosídio AR= CH3- Amburosídio B
O
O
OH
O OOH
OHOH
OR
OH
1, 2, 3, 4 ou 5+
1- R= Galoil- Amburosídio F2-R= Protocatecoil- Amburosídio D3-R= Feruloil- Amburosídio E4-R= Sinapoil- Amburosídio H5-R= Vaniloil- Amburosídio G
6.1. Amburosídios
Os amburosídios são glicosídios fenólicos encontrados, até o momento,
exclusivamente em A. cearensis. Sua biogênese deve-se iniciar provavelmente com a redução
do ácido p-hidroxi-benzóico a álcool p-hidroxi-benzílico, o qual pode ser esterificado por uma
molécula de ácido protocatecuico, através da hidroxila alcoólica (nucleófilo mais forte do que
a hidroxila fenólica), para render protocatecuato de p-hidroxi-benzila. A glicosilação do éster
com UDPglicose leva à síntese do amburosídio A. Caso a esterificação do álcool p-hidroxi-
benzílico seja feita com ácido vanílico, o heterosídio produzido será o amburosídio B. Os
demais amburosídio isolados são produzidos pela conjugação do amburosídio A com ácidos
fenólicos: ácido ferúlico (amburosídio E), ácido sinápico (amburosídio H), ácido
protocatecuico (amburosídio D), ácido vanílico (amburosídio G) e ácido gálico
(amburosídio F) (Quadro 4, p. 241).
6.2. Cumarinas
Reação de orto-hidroxilação do ácido (E)-cinâmico forma o ácido (E)-o-cumárico, o
qual pode se interconverter no seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico. A isomerização do
ácido o-cumárico favorece sua lactonização, a partir da qual é obtida a cumarina. Se em vez
de ácido cinâmico, o substrato for o ácido p-cumárico, o produto da lactonização é a
umbeliferona. Portanto, a oxidação do carbono 7 é a posição biogeneticamente preferida,
quando o anel benzênico da cumarina é monossubstituído. Entretanto, a proposta de
ocorrência de 6-hidroxi-cumarina pode ser justificada supostamente pela formação inicial de
aesculetina (6,7-dihidroxi-cumarina), seguida de desidroxilação seletiva da posição 7. A
biossíntese de protocatecuato de 6-cumarila seria facilmente explicada pela esterificação da
6-hidroxi-cumarina com ácido protocatecuico. A reação da aesculetina com formaldeído
geraria aiapina, após desidratação (Quadro 5, p. 241).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
242
CO2H CO2H
OH OHCO2H
O O
CO2H
OH
CO2H
OH OH OHCO2H
OHO OOH
O OOH
OH
O O
OH
UDPGlicose UDPGlicose
CO2H
OGlicose OGlicoseCO2H
+
CO2H
OH
OHO O
O
O
OH
OH
O O
O
O
Cumarina
Umbeliferona
Ác. (E)-o-Cumárico glicosilado Ác. (Z)-o-Cumárico glicosilado
Aesculetina
Ácido Protocatecuico
Aiapina
Protocatecuato de 6-cumarila 6-Hidroxi-cumarinaCH2O
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
243
Quadro 5- Rota biossintética de formação de ácidos cumáricos glicosilados e biogênese de cumarinas 6-monossubstituídas.
6.3. Flavonóides
A condensação de molécula de p-cumaroil-SCoa com mais três moléculas de
malonil-SCoA produz um alongamento da cadeia lateral, a qual se aromatiza após enolização
das carbonilas cetônicas. O produto gerado, a naringenina-chalcona, pode ser reduzida na
porção olefínica para fornecer floretina ou converter-se na forma isomérica de flavanona,
igualmente denominada naringenina. Sucessivas oxidações da naringenina com 2-oxo-
glutarato geram campferol e quercetina. O isocampferídio é obtido através da metilação do
campferol com S-adenosil metionina. O biflavonóide amburanina A é biossintetizado
através da condensação de unidades simples de flavonóides pré-formados: uma molécula de
floretina e outra de campferol (Quadro 6, p. 244). Mecanisticamente, é possível propor que a
formação desta substância seja desencadeada por uma adição de Michael da hidroxila do anel
B da floretina (C-4”) ao carbono olefínico β à carbonila do campferol (C-2). Nesta reação é
gerado um dienol susceptível a dois modos de tautomerização, por meio dos quais poderá ser
formada uma carbonila no C-3 (a) ou no C-4 (b). Em ambas as alternativas, ocorrerá uma
ciclização promovida pelo ataque nucleofílico do carbono aromático C-3”ao carbono C-3,
seguida por restauração da aromaticidade do anel B do fragmento da floretina. No entanto na
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
244
rota a, estas etapas são sucedidas por oxidação, dando origem à substância isolada
(amburanina A). Enquanto que na rota b, o ataque é sucedido por desidratação, resultando na
formação de um produto alternativo. O biflavonóde amburanina B é produzido pela
dimerização de duas moléculas de campferol, seguindo o mesmo modelo mecanístico da
amburanina A. (Quadro 7, p. 245).
Quadro 6- Biogênese de formação de flavonóis e biflavonóides.
O
CoAS
OH
OH
OO
O SCoA
O
OH
OOH
OH OH
OH
OOH
OH O
OH
OOH
OH O
OH
O2/ 2-oxo-glutarato
OH
OOH
OH O
OH
RO2/ 2-oxo-glutarato
OH
OOH
OH OH
NADPH
R=H- CampferolR= OH- Quercetina
Naringenina-Chalcona
Floretina
Aromadendrina
Naringenina
OH
OOH
OH O
OR1
R
R=H; R1=CH3- Isocampferídio
SAM
OH
OOH
OH OH
OH
OOH
OH O
OH
+O O
OOH
OH
OH
O
OH
OH
OH
OHAmburanina A
Floretina Campferol
OH
OOH
OH O
OH
OH
OOH
OH O
OH
+
O O
OOH
OH
OH
OO
OH
OH
OH
OH
H
Amburanina BCampferolCampferol
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
245
Quadro 7- Proposta mecanística de formação da amburanina A.
OH
OH
O
O
OH
OH
O
O
OH
OH
H
OH
O O
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O O
OH
OOH
OH
OH
OH
OH
OH
O
O O
OH
OOH
OH
OH
O+
OH
OH
OH
H
H
O O
OH
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
[O]
O O
OH
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
O O
OH
OO
OH
OH
O+
OH
OHH
H
O O
OH
OO
OH
OH
OH
OH
OH
OH
a
b
Amburanina A
Produto Alternativo
3"
2
34"
3"2
3
4"
B
CampferolFloretina
3"2
3
4"
3"
2
3
4"
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
246
6.4. Isoflavonóides
A biogênese da formononetina é iniciada com a migração do anel B do carbono C-2
para o C-3 da liquiritigenina (flavanona), através de um mecanismo de oxidação radicalar
promovido enzimaticamente por um átomo de ferro. Após desidratação, forma-se daidzeína, a
partir da qual se obtém a isoflavona desejada por metilação regiosseletiva da hidroxila do
carbono C-4’ (Quadro 8, p. 246).
Quadro 8- Rota biossintética de formação da isoflavona formononetina.
REFERÊNCIAS DEWICK, P.M. Medicinal Natural Products: a biosynthetic approach. 2nd ed. New York: John Wiley & Sons, 2002, 515 p.
OH
OO
O SCoA
ONADPH
OH
OOH
O SCoA
O
Claisen
O
OHOH
OH
O
OOH
OH
O2/NADPH
CH
O
OOH
OH
CH
O
OOH
OH
Enz-Fe=O
Enz-Fe-OH
O
OOH
OH
OH
O
OOH
OH
- H2O
SAM
O
OOH
OCH3Daidzeína Formononetina
LiquiritigeninaIsoliquiritigenina
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
247
7. VALIDAÇÃO DO MÉTODO CROMATOGRÁFICO
7.1. Validação
O processo de validação da metodologia de quantificação dos quatro principais
constituintes dos extratos de A. cearensis [(ácido protocatecuico (1), ácido vanílico (2),
cumarina (3) e amburosídio A (4)] consistiu na avaliação da maioria dos parâmetros de
desempenho analítico requeridos pelas duas mais importantes agências reguladoras nacionais
(ANVISA- Agência de Vigilância Sanitária e INMETRO- Instituto Nacional de Metrologia,
Normalização e Qualidade Industrial): seletividade, linearidade, precisão, exatidão e limites
de detecção e quantificação.
O método analítico aplicado para os diferentes extratos de A. cearensis foi
desenvolvido num HPLC/DAD (Waters 1525/2996), munido de uma coluna de fase reversa
(XTerra® 4,6 x 250 mm, 5 µm), utilizando-se um gradiente de eluição de 1mL/min de Et3N-
H3PO4 (pH= 3)/MeOH, variando de 20% para 50% de MeOH em 15 min de corrida. O
método cromatográfico empregado mostrou-se bastante seletivo para as substâncias de
interesse, propiciando uma boa separação entre seus respectivos picos, além de isentos de
interferentes, mesmo tratando-se de amostras quimicamente complexas.
As curvas de calibração analítica, construídas a partir de seis níveis de concentração
dos quatro padrões externos e devidamente ajustadas por regressão linear, apresentaram as
seguintes equações de regressão: y1= 58116x + 30531; y2= 61426x + 36265; y3= 24400x +
O
O
OH
OH
O OOH
OHOH
OH
O O
CO2H
OH
OH
CO2H
OCH3
OH1 2 3
4
58945 e y4= 27160x + 22275. Os coeficientes de correlação (r1 = 0,9945; r2 = 0,9944; r3 =
0,9943; r4 = 0,9933) (Tab. 29, p. 247), obtidos das curvas analíticas, revelaram relações de
proporcionalidade direta entre as concentrações das substâncias analisadas e as áreas dos
picos, detectados a 254 nm. As linearidades exibidas estão em consonância com os valores de
r recomendados pelo INMETRO (> 0,90) e pela ANVISA (> 0,99).
Tabela 29- Equações e coeficientes de correlação das retas dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ác. protocatecuico, ác. vanílico, cumarina e amburosídio A.
Padrão Equação da reta Coeficiente de correlação (r)
Ácido protocatecuico y1= 58116x + 30531 0,9945
Ácido vanílico y2= 61426x + 36265 0,9944
Cumarina y3= 24400x + 58945 0,9943
Amburosídio A y4= 27160x + 22275 0,9933
A precisão foi julgada pelo grau de repetitividade intradia e interdia dos ensaios, ou
seja, por análises repetidas ao longo de um dia e realizadas em três dias não-consecutivos,
respectivamente. Estatisticamente, este parâmetro foi determinado através dos coeficientes de
variação das áreas dos picos dos quatro padrões, contidos em soluções de controle de
qualidade em três níveis de concentração (baixa, alta e média). As determinações mais
precisas foram obtidas nas análises de ácido protocatecuico, intradia (> 2,6 %) e interdia (>
1,4 %). Ácido vanílico, cumarina e amburosídio A apresentaram graus de concordância
inferiores a 5,3; 5,6 e 3,6 %, em experimentos realizados no mesmo dia. Nesta mesma ordem,
a repetitividade interdia foi estimada em 2,7; 4,5 e 3,0 %. Como a ANVISA sugere valores
inferiores a 5 %, as medições do ácido vanílico e da cumarina, repetidas intra-corridas, foram
ligeiramente acima do limite proposto (Tab. 30, p. 249).
A exatidão foi aferida através da comparação entre as concentrações determinadas
experimentalmente e os valores de concentração tidos como verdadeiros (referência) dos
quatro padrões, em três níveis de concentração (baixa, alta e média). Dentre as substâncias de
interesse, os teores de amburosídio A foram os mais exatos, aproximadamente 99 %. Para os
demais, os graus de concordância entre os valores práticos e os de referência foram variáveis
com os níveis de concentração: ácido protocatecuico e ácido vanílico (95,3-102 %) e
cumarina (86,2-95,0 %), sendo que neste último a exatidão foi maior nas soluções mais
concentradas, diferentemente dos resultados observados para os ácidos fenólicos (Tab. 30, p.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
248249).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
249
Tendo em vista que as amostras eram extratos brutos, os quais requeriam um
tratamento prévio através de cartuchos de Extração de Fase Sólida (SPE), houve a
necessidade de se mensurar as possíveis perdas decorrentes desta operação. Os fatores de
recuperação dos quatro padrões foram determinados pela razão das respostas obtidas para
soluções tratadas em relação às soluções não-tratadas, em três níveis de concentração (baixa,
alta e média). Os melhores rendimentos de extração foram encontrados para a cumarina (95-
99 %), seguida do amburosídio A (90-97 %) e dos ácidos protocatecuico e vanílico (em torno
de 91 %). Uma vez que uma faixa de recuperação entre 80-120 % é plenamente aceitável para
procedimentos analíticos, foi possível constatar a eficiência do método de extração dos
analitos.
A partir dos parâmetros de desempenho analítico investigados, pôde-se verificar que
o método de validação desenvolvido possui seletividade, linearidade, precisão e exatidão
consideradas satisfatórias e que sua aplicação pode gerar resultados confiáveis, visto que
foram obtidos valores em conformidade com os rigorosos limites preconizados pela ANVISA
e pelo INMETRO (Tab. 30, p. 249). O método cromatográfico desenvolvido poderá ser
utilizado para determinação da autenticidade da matéria-prima, para quantificação dos
princípios ativos e avaliação da estabilidade do produto formulado a partir da planta A.
cearensis.
Tabela 30- Parâmetros de desempenho analítico dos quatro constituintes majoritários de A. cearensis: ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio A.
Precisão Exatidão Recuperação
Padrão CV (%)
1º.dia
CV (%)
2º.dia
CV (%)
3º.dia
CV (%)
média Cr/Ct (%) Ce/Ci (%)
Ác. protocatecuico
8 1,3 2,2 2,6 2,0 102,0 90,0
30 0,9 1,6 1,0 1,2 95,6 92,0
50 0,8 1,1 2,2 1,4 96,5 92,0
Ac. vanílico
8 0,7 3,7 2,6 2,3 102,0 92,0
30 1,3 3,9 3,0 2,7 95,3 91,0
50 0,5 0,4 5,3 2,1 95,9 91,0
Cumarina
8 3,4 5,6 4,6 4,5 86,2 95,0
30 1,5 5,2 4,3 3,5 91,0 96,0
50 1,3 1,8 5,1 2,7 95,0 99,0
Amburosídio A
8 2,7 3,6 2,7 3,0 98,7 90,0
30 1,4 1,0 3,0 1,8 98,7 96,0
50 0,6 1,1 1,9 1,2 99,0 97,0
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
250
7.2. Doseamento
O método validado foi adotado para quantificação dos quatro constituintes
majoritários, presentes em diferentes extratos etanólicos de A. cearensis.
O estudo químico da planta adulta foi realizado com as cascas do caule (extrato
etanólico) e com as sementes, devido ao emprego popular e comercial destas partes da planta.
Independente do método de extração adotado para a casca do caule, sohxlet ou maceração, a
ordem de concentração foi mantida: o amburosídio A foi o componente majoritário, seguido
por cumarina, ácido protocatecuico e ácido vanílico (Gráf. 1). A divergência residiu nos
maiores níveis de concentração encontrados para a extração feita em sohxlet. Como o
aumento de temperatura tende a favorecer a solubilização das substâncias, a extração num
aparelho sohxlet geralmente produz maiores rendimentos por processar-se a quente, em
detrimento da maceração que ocorre a frio. O extrato etanólico das sementes, gerado por
maceração, apresentou níveis detectáveis apenas de cumarina (23520 mg/100g ext. ou 1411
mg/100g planta), correspondendo ao maior teor achado entre todos os extratos analisados
(Tab. 31, p. 254).
900 720
2000
5280
320200
1340
2180
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Con
cent
raçã
o (m
g/10
0g E
xtra
to)
Soxhlet Maceração
Substâncias
Ác. protocatecuico
Ác. Vanílico
Cumarina
Amburosídio
Gráfico 1- Concentração dos quatro constituintes majoritários em extratos etanólicos das cascas do caule de A. cearensis, obtidos por maceração e soxhlet.
As análises quantitativas dos espécimens jovens de cumaru foram realizados com
extratos das plantas inteiras e extratos das partes aéreas e dos xilopódios (separadamente) de
2, 4, 7 e 9 meses de desenvolvimento.
Em extratos obtidos das plantas inteiras, foram possíveis apenas as determinações
dos teores de ácido vanílico e cumarina. Através do gráfico 2, observou-se um crescimento
linear nas concentrações de ácido vanílico e cumarina até o 7º mês, mês no qual ocorreu o Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
251
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
252
ápice da presença destas substâncias (3440 e 4060 mg/100g de extrato, respectivamente).
Todavia no último mês (9º), a concentração decaiu acintosamente, atingindo os níveis mais
baixos determinados (1520 e 660 mg/100g ext.), respectivamente. Por outro lado, numa
análise feita em relação à planta, notou-se que a produção de ácido vanílico foi sempre
declinante ao longo do tempo (de 217 para 17 mg/100g de planta) e a de cumarina foi
praticamente estável nos sete meses iniciais (em torno de 140 mg/100g de planta),
apresentando uma queda abrupta no nono mês (7 mg/100g). O ácido protocatecuico e o
amburosídio foram detectados, porém não se encontravam em níveis quantificáveis, salvo no
nono mês, no qual este último teve sua concentração estimada em 400 mg/100g ext.
Gráfico 2- Concentrações de ácido vanílico e cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis (valores expressos em relação à massa de extrato e à biomassa).
Nos extratos das partes aéreas, o constituinte majoritário foi o ácido vanílico cuja
maior concentração foi medida no 7º mês (8520 mg/100g ext ou 452 mg/100g planta),
enquanto que, no xilopódio, a cumarina foi o principal componente (4º mês: 3760 mg/100g
ext. ou 256 mg/100g planta), excetuando o último mês, no qual o amburosídio foi o mais
abundante (680 mg/100g ext. ou 5 mg/100g planta). Quanto ao ácido protocatecuico, sua
presença só foi mensurada no extrato da parte aérea de espécimens de 4 meses (360 mg/100g
ext. ou 20 mg/100g planta).
A concentração de ácido vanílico na parte aérea foi sempre superior à encontrada no
xilopódio. Nos extratos, os teores máximos e mínimos foram encontrados, respectivamente,
no 7º (p. aérea: 8520 mg/100g ext. e xilopódio: 1380 mg/100g ext.) e 9º mês (p. aérea: 3460 e
xilopódio: 540 mg/100g ext). Entretanto, os platôs de produção ocorreram em períodos
distintos: na parte aérea (7º mês- 452 mg/100g planta) e no xilopódio (2º mês- 146 mg/100g
planta).
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
0 2 4 6 8 10Idade (meses)
Con
cent
raçã
o (m
g/10
0g) Ác. vanílico
(ext.)
Ác. vanílico(planta)
Cumarina(ext.)
Cumarina(planta)
4780
780
6120
760
8520
1380
3460
540
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
9000C
once
ntra
ção
(mg/
100g
Ext
rato
)
2 4 7 9
Idade (meses)
Ácido Vanílico
P. aéreaXilopódio
354
146
337
52
452
2855
4
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
Con
cent
raçã
o (m
g/10
0g P
lant
a)
2 4 7 9
Idade (meses)P. aéreaXilopódio
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
253
Gráfico 3- Concentração de ácido vanílico em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.
A presença de cumarina foi registrada majoritariamente nos extratos da parte aérea,
em três dos quatro meses investigados, sendo o 7º mês o período de maiores rendimentos de
extração e produção (6060 mg/100g ext. ou 324 mg/100g planta). A exceção foi o 4º mês,
cujo extrato do xilopódio (3760 mg/100g ext. ou 256 mg/100g planta) apresentou um teor que
excedeu ao dobro da concentração aferida para a parte aérea (1660 mg/100g ext. ou 91
mg/100g planta). Curiosamente no primeiro mês analisado (2º), embora a proporção de
cumarina tenha sido maior no extrato da parte aérea (1540 mg/100g ext) do que no extrato
obtido do xilopódio (1320 mg/100g ext), este metabólito foi biossintetizado em maior escala
no xilopódio (247 mg/100g planta) do que na parte aérea (114 mg/100g planta).
Gráfico 4- Concentração de cumarina em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.
Nas amostras investigadas, a ocorrência de amburosídio A foi detectada
exclusivamente numa das partes da planta, a cada mês: xilopódio (2, 7 e 9 meses de idade) e
114
247
91
256
324
5024 3
0
50
100
150
200
250
300
350
Conc
entra
ção
(mg/
100g
Pla
nta)
2 4 7 9
Idade (meses)P. aéreaXilopódio
15401320
1660
3760
6060
2500
1500
420
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Con
cent
raçã
o (m
g/10
0g E
xtra
to)
2 4 7 9Idade (meses)
Cumarina
P. aéreaXilopódio
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
254
parte aérea (4 meses de idade), na qual foi verificada a sua menor concentração (260 mg/100g
ext.). No extrato de xilopódio de 9 meses de idade, foi medida a maior concentração de
amburosídio A (680 mg/100g ext.), entretanto o máximo de produção desta substância
ocorreu logo no 2º mês de cultivo (71 mg/100g planta).
Gráfico 5- Concentração de amburosídio A em extratos etanólicos de plantas jovens de A. cearensis, em diferentes estágios de desenvolvimento.
Numa análise comparativa entre os extratos de plantas jovens e adultas, pôde-se
observar que o extrato de xilopódio de 9 meses de idade (680 mg/100g de ext. ou 5 mg/100g
de planta) foi a única amostra, obtida de espécimens cultivados, a conter o amburosídio como
principal constituinte, tal qual foi encontrado no extrato da casca do caule da planta silvestre
(maceração: 2180 mg/100g de ext. ou 11 mg/100g de planta). Ainda assim, numa proporção
cerca de duas a três vezes menor.
O xarope apresentou teores de cumarina (298 mg/100g de planta) e amburosídio A
(33 mg/100g de planta) semelhantes aos estimados para o extrato da parte aérea de 7 meses de
idade (324 e 33 mg/100g de planta), embora isento de ácido vanílico, o mais importante
constituinte desta amostra (452 mg/100g de planta). O xilopódio de 2 meses também exibiu
composição química parecida com a do xarope: 247 e 71 mg/100g de planta de cumarina e
amburosídio A, além de 146 mg/100g de planta de ácido vanílico.
A avaliação química dos extratos de A. cearensis, obtidos da planta adulta e de
espécimens jovens, revelou que qualitativamente estes materiais foram muito parecidos, no
entanto, os constituintes analisados apresentaram níveis de concentração muito distintos, em
razão do método de extração, da idade e da parte da planta investigadas. Além disso, a forma
de expressão dos resultados (mg/100g de extrato ou planta), fortemente influenciável pelos
0
380
260
0 0
300
0
680
0
100
200
300
400
500
600
700
Con
cent
raçã
o (m
g/10
0g E
xtra
to)
2 4 7 9
Idade (meses)
Amburosídio
P. aérea
Xilopódio
0
71
14
0 06
0 5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Conc
entr
ação
(mg/
100g
Pla
nta)
2 4 7 9
Idade (meses)P. aéreaXilopódio
rendimentos de extração, demonstrou ser um parâmetro relevante na comparação entre as
concentrações estimadas.
Tabela 31- Concentração (mg/100g) dos quatro principais constituintes químicos detectados em diferentes extratos de A. cearensis, expressos em relação à massa de extrato e de material botânico.
Extrato Concentração (mg/100g)– CV (%) Ácido
protocatecuico Ácido
vanílico Cumarina Amburosídio Planta adulta
Silvestre Extrato Planta Extrato Planta Extrato Planta Extrato Planta
Casca do Caule
(Sohxlet)
900 (2,5)
54 720 (6,5)
43 2000 (1,5)
120 5280 (6,4)
317
Casca do Caule
(Maceração)
320 (6,3)
2 200 (5,6)
1 1340 (6,8)
7 2180 (5,5)
11
Xarope ND* ND - 298 (5,1)
- 33 (6,1)
Sementes ND ND 23520 (3,9)
1411 ND
Planta jovem Inteira
2 meses ND 1520 (1,3)
217 1020 (5,7)
146 ND
4 meses ND 2680 (13,4)
169 2000 (7,0)
126 ND
7 meses ND 3440 (4,3)
127 4060 (6,5)
150 ND
9 meses ND 1520 (6,1)
17 660 (1,8)
7 400 (5,7)
4
Parte aérea 2 meses ND 4780
(10,6) 354 1540
(3,0) 114 ND
4 meses 360 (3,3)
20 6120 (4,8)
337 1660 (2,0)
91 260 (8,7)
14
7 meses ND 8520 (1,0)
452 6060 (7,9)
324 ND
9 meses ND 3460 (6,3)
55 1500 (3,3)
24 ND
Xilopódio 2 meses ND 780
(5,3) 146 1320 (1,0) 247 380
(5,3) 71
4 meses ND 760 (7,5)
52 3760 (0,9) 256 ND
7 meses ND 1380 (2,9)
28 2500 (4,2) 50 300 (10,4)
6
9 meses ND 540 (9,8)
4 420 (10,8) 3 680 (9,4)
5
*ND- nível de concentração não-determinado.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
255
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,67
72,
933
3,68
04,
090
4,32
14,
705
5,04
1
040 7,48
7
10,7
29
14,0
3614
,669
191
15,6
5016
,726 17
,
5,63
26,
157
6,44
47,
9,04
810
,216
11,2
9911
,700
11,8
9212
,582
13,1
5613
,733
17,5
4317
,794
18,6
8919
,426
19,9
3820
,306
20,7
2821
,582
22,3
3222
,777
23,5
3424
,900
25,8
5326
,171
27,8
8628
,607
29,0
5229
,741
31,0
61 31,5
7032
,440
33,2
8034
,596
Figura 144- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da casca do caule (ACCE)- sohxlet
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,65
290
09
4,31
206
89 6 3
7,07
97,
586 10
,775
708
14,0
3614
,683
196
577
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
256
2,3,
173,
636
11,
5,5,
666,
176,
54 17,
17,
20,3
43
22,7
6223
,527
27,8
43
29,7
1731
,040
31,5
54
33,2
9634
,231
34,5
94
Figura 145- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (9 meses)
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,65
33,
194
3,66
84,
286
4,62
34,
962
5,58
36,
116
6,60
3 7,00
77,
455
7,84
88,
442
10,7
8011
,709
12,1
24 13,3
6214
,031
14,3
5514
,854
16,3
2516
,573
17,1
9417
,563
18,0
1918
,634
d
f
hg
i
j
18,9
7919
,800
19,8
9020
,272
22,7
9123
,367
23,5
2623
,907
24,5
6824
,881
25,8
7426
,203
26,7
23
29,0
7029
,731
31,5
80
33,3
6934
,047
34,6
07
Figura 146- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (9 meses)
f b
h
dj
ga
a
b
d
f g
h
j
AU
0,000
0,010
0,020
0,030
0,040
0,050
0,060
0,070
0,080
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
1,60
92,
663
2,88
83, 3,
185
644
4,30
04,
989
593
817,
022
7,46
9
10,6
89
14,0
2214
,672
14,8
28
435
187
17,5
6316
,17
,
5, 6,5 20,3
36
22,7
9123
,536
24,8
8325
,842
26,1
98
29,7
29
31,5
63
33,3
48
Figura 147- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (7 meses)
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,68
72,
928
3,16
23,
714
4,32
24,
675
4,98
95,
620
6,12
26,
481
6,67 7, 7,
7,89
48,
478,
829,
049,
7310
,2
11,
12,1
12,7 13
,9 040
488
8 9 3 5 3610
,813
723
32 1436
714
,062
393
,902
77 321
563
17,2
1358
203
101 006
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
257
14,
1415
,7 16,
16, 17,
18,
18,7
19,
19,9
0420
,282
20,9
1621
,801
22,8
0923
,280
23,5
5423
,952
24,7
0024
,917
25,8
9826
,217
26,7
41
29,1
0029
,776
31,6
1232
,056
33,4
0234
,054
34,5
78
Figura 148- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (7 meses)
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
1,08
31,
500
2,65
92,
875
3,56
94,
277
4,94
95,
594
6,7,
989
447
10,6
7722
866
573
326
714
14,8
7923
044
217
557
1
d
f
g
ij
11,
11,
12,
13,
,027
16,
16,
17,
17,
19,0
0619
,652
20,3
2721
,468
21,7
3322
,319
23,5
5524
,391
24,9
0025
,881
26,2
18
29,1
9029
,744
30,4
8631
,586
33,3
8234
,454
Figura 149- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (4 meses)
d a
b
f
g
h
ij
f
gh i
j
d
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
0,37
71,
185
2,66
82,
890
3,55
44,
322
5,09
05,
574
6,98
8 78,
427
9,02
09,
451,4
43
10,7
8069
210
2 3 13,3
37,0
3445 68
986
743
578
3 ,309
,549
17,1
84,5
5523
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
258
11,
12,
12,7
1 1414
,314
,14
,15
,15
, 16 16 1718
,018
,518
19,0
2719
,928
20,2
7620
,691
20,8
9621
,763
22,3
9922
,772
23,2
6323
,553
23,9
1424
,231
24,8
8025
,877
26,1
6926
,728
28,7
6729
,100
29,7
5930
,240
31,5
9632
,050
33,3
9734
,044
34,4
98
Figura 150- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (4 meses)
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,63
62,
882
3,20
13,
600
3,68
34,
382
4,96
55,
605
6,44
77,
010
7,44
5
10,6
78
14,0
1914
,674
14,8
2716
,229
16,9
0417
,220
17,5
8718
,013
20,3
7121
,435
21,7
3822
,326
23,5
1624
,871
25,8
5526
,185
29,2
4129
,720
31,5
61
33,3
56
Figura 151- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH do xilopódio da planta jovem (2 meses)
AU
-0,02
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Minutes0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00 35,00
2,61
63,
210
3,72
94,
302
4,96
65,
597
6, 6, 7,7,
8, 9,8226
966
000
4 453
431 6
10,7
5866
422
129
7 14,0
1314
,851
971
434
17,1
7753
938
d
f
gi
j
11,
12,
13,
15,
16, 17
,18
,6
20,3
4720
,887
21,4
1322
,335
22,7
7923
,488
24,8
6625
,843
26,1
8426
,704
28,6
6629
,696
30,5
2231
,537
33,2
8634
,566
Figura 152- Cromatograma de HPLC do ext. EtOH da parte aérea da planta jovem (2 meses)
d
f
gh
i
j
a bd
f
g hi j
Tabela 32- Relação das substâncias químicas identificadas, segundo seus tempos de retenção registrados em análises por HPLC, nos extratos de A. cearensis: planta adulta (casca do caule) e espécimens jovens (xilopódio e parte aérea).
Xilopódio (meses) Parte Aérea (meses) Substâncias
Identificadas
tR
(min.)
ACCE
2 4 7 9 2 4 7 9
a. Ác. (Z)-cumárico glicosilado
3,85 + + + +
b. Ác. 4-hidroxi-benzóico
4,99 + + + + +
c. Ác. (E)-cumárico glicosilado
6,02
d. Ác. protocatecuico 7,36 + + + + + + + +
e. Ác. o-cumárico 9,22
f. Ác. vanílico 10,87 + + + + + + + + +
g. Cumarina 13,98 + + + + + + + + +
h. Amburosídio A 14,65 + + + + + + +
i. Aiapina 14,85 + + + + + + +
j. Amburosídio B 17,17 + + + + + + + +
Análises comparativas dos cromatogramas de nove extratos de A. cearensis com
substâncias-padrão permitiram a identificação de onze constituintes químicos nestas amostras:
ácido 4-hidroxi-benzóico (Fig. 153, p. 259), ácido o-cumárico (Fig. 154, p. 259), ácido (Z)-
cumárico glicosilado (Fig. 155, p. 259), ácido (E)-cumárico glicosilado (Fig. 156, p. 260),
aiapina (Fig. 157, p. 260), cumarina (Fig. 158, p. 260), ácido vanílico (Fig. 159, p. 261), ,
amburosídio B (Fig. 160, p. 261), amburosídio A (Fig. 161, p. 261), ácido protocatecuico
(Fig. 162, p. 262) dispostos em ordem crescente de tempo de retenção (tR). O método de
identificação foi baseado no tempo de retenção e no espectro de ultravioleta extraído dos
picos.
Cumarina e ácido vanílico foram as únicas substâncias presentes em todos os extratos de
A. cearensis. O ácido protocatecuico foi encontrado em todos os extratos, exceto no extrato do
xilopódio de 4 meses de idade, enquanto que o amburosídio B só não foi detectado no
xilopódio de 4 meses. A aglicona e o glicosídio do ácido (E)-o-cumárico não foram
observados em nenhum dos extratos. Aiapina e os isômeros do ácido cumárico glicosilado
foram encontrados somente nas plantas jovens, além disso, o estereoisômero Z foi
identificado exclusivamente no xilopódio (Tab. 32).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
259
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
260
Figura 153- Cromatograma de HPLC do ácido p-hidroxi-benzóico
Figura 154- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-o-cumárico
Figura 155- Cromatograma de HPLC do ácido (Z)-o-cumárico glicosilado
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
3,85
AU
0,00
0,10
0,20
0,30
0,40
0,50
0,60
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
9,22
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
4,99
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
261
Figura 156- Cromatograma de HPLC do ácido (E)-o-cumárico glicosilado
Figura 157- Cromatograma de HPLC da aiapina
Figura 158- Cromatograma de HPLC da cumarina
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
13,98
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
14,85
AU
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
6,02
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
262
Figura 159- Cromatograma de HPLC do ácido vanílico
Figura 160- Cromatograma de HPLC do Amburosídio B
Figura 161- Cromatograma de HPLC do Amburosídio A
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
14,65
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
17,17
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
10,87
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
263
Figura 162- Cromatograma de HPLC do ácido protocatecuico
AU
0,00
1,00
2,00
3,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00 16,00 18,00 20,00
7,36
8. BREVE ABORDAGEM FARMACOLÓGICA DO ESTUDO
INTERDISCIPLINAR DE AMBURANA CEARENSIS
8.1. Avaliação da atividade farmacológica dos extratos etanólicos de espécimens jovens
Os extratos etanólicos da parte aérea (PA) e do xilopódio (X) de espécimens jovens
de A. cearensis, coletados aos 2, 4, 7 e 9 meses (m) de cultivo, foram avaliados em testes de
nocicepção (induzida por formalina) e edema de pata (induzida por carragenina), sendo seus
resultados comparados aos efeitos demonstrados pelo extrato etanólico da casca do caule da
planta silvestre adulta. Os extratos de xilopódio foram denominados EN-ACX e aqueles
provenientes da parte aérea foram designados EN-ACPa, onde N refere-se à idade da planta
(em meses de cultivo). A designação EN-ACPA+X corresponde ao extrato artificialmente
reconstituído. Esta pesquisa foi desenvolvida pela Profª Luzia Kalyne de Almeida Moreira
Leal (Departamento de Farmacologia e Fisiologia/UFC), como atividade do estudo integrado
para a validação química-farmacológica de A. cearensis.
Atividade antinociceptiva
Introduzido por Dubuisson e Dennis (DUBUISSON & DENNIS, 1977), o teste da
formalina permite a avaliação dos possíveis mecanismos modulatórios envolvidos numa dor
moderada e contínua, gerada pela lesão tecidual, sendo considerado como um dos modelos
mais válidos para dor clínica (TJOLSEN et al., 1992). A resposta nociceptiva para a formalina
ocorre de maneira bifásica: a 1ª fase (neurogênica) inicia-se imediatamente após a injeção de
formalina com duração de até 10 min., sendo causada predominantemente pela ativação de
nociceptores polinodais-C que liberam alguns neuropeptídios, incluindo glutamato e
substância P. Após um curto período de remissão, inicia-se a 2ª fase, que ocorre 15-30 min
após a injeção de formalina que persiste até 60 min. (TENG & ABBOTT, 1998), ocorrendo a
liberação de vários mediadores, como serotonina, histamina, bradicinina e prostaglandinas
(HUNSKAAR & HOLE, 1987); (TJOLSEN et al., 1992). Fármacos narcóticos que atuam a
nível central inibem as duas fases, mas fármacos que atuam perifericamente, como
antiinflamatórios não-esteroidais e dexametasona, inibem apenas a segunda fase da
nocicepção induzida pela formalina (SHIBATA et al., 1989).
Dentre os extratos etanólicos da parte aérea avaliados, apenas o obtido após 2 meses
de cultivo da planta, administrado por via oral (v.o.) na dose de 100mg/Kg, interferiu
significativamente na 1ª fase do teste, observado pela redução do tempo gasto pelo animal
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
264lambendo a pata (30,2 ± 5,2 seg.) em relação ao controle (49,4 ± 3,0 seg.), correspondendo a
uma inibição de 38,9%. Por outro lado, os extratos de xilopódio coletados aos 2, 4 e 9 m de
cultivo, nas doses de 100 e 200 mg/Kg (v.o.), causaram antinocicepção observada na 1ª fase
(2 m: 36, 6 ± 4,3 e 42,5 ± 3,5; 4 m: 21,9 ± 2,9 e 21,4 ± 2,8; 9 m: 21,4 ± 2,9 e 19,7 ± 2,9 seg.
respectivamente), correspondendo a uma inibição de 32 a 64%, comparado ao controle (54,2
± 3,1 seg.); enquanto que na 2ª fase resultados significativos foram observados apenas para o
E9-ACX na maior dose (16,5 ± 2,7 seg.), com uma inibição de 51,0% em relação ao controle
(33,7 ± 2,3 seg.)
Na avaliação dos extratos etanólicos produzidos a partir de toda a planta (PA+X) aos
4, 7 e 9 m de cultivo (200 mg/Kg, v.o.), observamos inibições significativas nas duas fases do
teste da formalina para os E7-ACPA+X (1ª fase: 20,8 ± 2,3; 2ª fase: 13,4 ± 1,93 seg.) e 9 m
(1ª fase:17,9 ± 1,3; 2ª fase: 10,8 ± 1,5 seg.) em relação ao controle (1ª fase: 40,2 ± 2,3; 2ª fase:
26,3 ± 3,1seg.). E4-ACPA+X inibiu significativamente apenas a 1ª fase do teste (21,5 ±
2,7seg.).
O extrato etanólico da casca do caule de A. cearensis (ACCE) silvestre, coletadas na
fase adulta da planta, nas doses de 100 e 200 mg/Kg, v.o., promoveu uma antinocicepção
observada pela redução do tempo gasto pelo animal lambendo a pata, tanto na 1ª fase (25,4 ±
3,9 e 22,8 ± 2,4 seg., respectivamente), correspondendo a uma inibição de 48 e 53%
respectivamente em relação ao controle (49,0 ± 3,0 seg.), quanto na 2ª fase (12,1 ± 21,8 e 6,5
± 1,1 seg., respectivamente), correspondendo a uma inibição dose-dependente de 47 e 71%
respectivamente em relação ao controle (22,8 ± 2,5 seg.).
Nos ensaios de avaliação da atividade antinociceptiva dos extratos de A. cearensis, o
EEtOH da casca do caule da planta adulta (200 mg/Kg, v.o.) na 1ª fase do teste da formalina
foi eqüipotente em relação extratos compostos (PA+X) de 4, 7 e 9m. Por outro lado, na 2ª fase
do teste a mesma mostrou-se mais potente que os referidos extratos.
Dos extratos etanólicos da planta cultivada avaliados, apenas os extratos E9-ACX e
os extratos compostos (PA+X) de 4, 7 e 9 m foram capazes de inibir, à semelhança da planta
adulta, as duas fases do teste da formalina. Os demais, na dose investigada, interferiram
apenas a 1ª fase do teste (E2-ACPA e E4-PA+X). Dessa forma, os resultados sugerem que o
efeito antinociceptivo observado parece estar relacionado à atividade antiinflamatória dos
extratos, além de uma possível ação central a ser confirmada com estudos posteriores.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
265
Atividade antiedematogênica
A resposta inflamatória aguda é caracterizada por um aumento na permeabilidade
vascular e infiltração celular levando à formação do edema, como resultado do
extravasamento de fluido, proteínas e acumulação de leucócitos no sítio inflamatório. O
modelo do edema de pata induzido por carragenina é largamente utilizado para determinar a
atividade antiinflamatória de novos fármacos e tem sido bem caracterizado, compreendendo
três fases distintas: a primeira fase envolve a liberação simultânea de histamina e serotonina,
nas concentrações em que cada amina exerce seu efeito máximo na permeabilidade vascular;
a segunda fase, por liberação de cininas como bradicinina, e a fase terminal por
prostaglandinas, presente no exsudato, 4h após a injeção de carragenina. Contudo a ação
desses mediadores parece ser dependente da presença do sistema complemento (DI ROSA et
al., 1971). Mais recentemente foi demonstrado que a ciclooxigenase-2 atinge sua expressão
máxima 1h após a injeção de carragenina. Outro mediador importante na inflamação aguda é
o óxido nítrico que em condições fisiopatológicas é produzido por três distintas isoformas de
óxido nítrico sintase (POSADAS et al., 2004).
Na avaliação da atividade antiedematogênica dos extratos ACPA investigados,
apenas o de 9 m (200 mg/Kg, v.o.) reduziu significativamente o edema de pata na 3ª h (79,8 ±
6,9 µL) e 4ª h (64,3 ± 8,4 µL) após a injeção de carragenina, correspondendo a uma inibição
de 37,4 e 41,3% respectivamente em relação ao controle (3ª h: 127,5 ± 5,3; 4ª h: 109,5 ±
4,5µL). Além disso, os grupos tratados com E-ACPA de 2 ou 7m, diferiram
significativamente em relação a E9-ACPA .
E2-ACX (200mg/Kg, v.o.) foi capaz de inibir o edema na 1ª h (48,0 ± 7,0µL) e 2ª h
(60,0 ± 7,9µL), apresentando uma inibição de 44,3 e 43,9% respectivamente em relação ao
controle (1ª h: 86,2 ± 12,7 e 2ª h: 107,0 ± 12,2µL). Enquanto, os demais extratos (4, 7 e 9 m)
na mesma dose não interferiram significativamente no edema, inclusive o tratamento com o
EEtOH de 2m diferiu significativamente em relação ao EEtOH 9 m.
Na dose de 200 mg/Kg, v.o., dentre os extratos compostos E-ACPA+X investigados
(4, 7 e 9 m e adulto), apenas o de 7 m foi capaz de inibir significativamente o edema na 3a h
após a injeção de carragenina, causando uma inibição de 34,3% em relação ao controle.
Porém, na dose de 400 mg/Kg, v.o., o extrato da planta adulta, silvestre, bem como
os obtidos pelo cultivo foram capazes de inibir significativamente o edema de carragenina em
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
266diferentes períodos de avaliação, com inibições de 25 a 64%. Os extratos E7-ACPA+X e E9-
ACPA+X foram eqüipotentes e apresentaram uma atividade antiedematogênica superior à da
planta adulta silvestre.
O estudo demonstrou o potencial antinociceptivo e antiedematogênico dos EEtOH
obtidos de A. cearensis cultivada, onde os extratos E7-ACPA+X e E9-ACPA+X
apresentaram-se pelo menos eqüipotentes em relação à planta adulta.
8.2. Avaliação da atividade farmacológica de substâncias isoladas de A. cearensis
Atividade Antiinflamatória
Em virtude do uso difundido de A. cearensis para o tratamento de doenças respiratórias
(gripe, resfriado, bronquite e asma) e as evidências farmacológicas de atividade
antiinflamatória mostradas pelo extrato hidroalcoólico de A. cearensis (LEAL et al., 2003), o
isocampferídio e o amburosídio A, isolados em nossos estudos, foram submetidos a diferentes
modelos de ensaios de inflamação, num estudo realizado pela Profa. Luzia Kalyne de
Almeida Moreira Leal.
As atividades antiedematogênicas do isocampferídio e do amburosídio A foram
observadas em modelos de edema de pata induzido por diversos agentes inflamatórios
(carragenina, dextrano, prostaglandina E2, histamina, serotonina), peritonite induzida por
carragenina e determinação das atividades das enzimas mieloperoxidase e elastase, incluindo
estudo histopatológico, avaliação morfométrica e avaliação da permeabilidade vascular de
ratos e camundongos. Os mecanismos de ação destas substâncias estão possivelmente
relacionados ao bloqueio da síntese, liberação e/ou ação de mediadores inflamatórios
(prostaglandina E2, histamina, e serotonina) e inibição parcial da degranulação de neutrófilos.
A ação antioxidante do amburosídio A foi evidenciada em modelos de hepatotoxicidade
induzida por CCl4, em fígado de ratos. A ação hepatoprotetora foi determinada através do
monitoramento das concentrações enzimáticas da catalase e enzimas transaminases, dos níveis
séricos de glutationa reduzida e substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico e análise
histológica do fígado, sugerindo que o amburosídio possui ação seqüestradora de radicais
livres e inibidora da peroxidação lipídica (LEAL et al., 2006a).
Atividade broncodilatadora
O isocampferídio apresentou efeito relaxante muscular em traquéias de cobaias, pré-
contraídas com carbacol ou KCl, independente da presença de epitélio. Por isso acredita-se
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
267
que este flavonóide seja capaz de mediar a ativação da via Óxido Nítrico Sintetase-Guanilato
Ciclase, promover a abertura de canais de K+ e interferir na liberação de neuropeptídios
(substância P e neurocinina A) (LEAL et al., 2006b).
As atividades antiinflamatória e broncodilatadora apresentadas pelo isocampferídio e
amburosídio A dão respaldo parcial ao uso tradicional da planta como alternativa terapêutica
para o tratamento de patologias respiratórias.
Atividade neuroprotetora
O amburosídio A teve sua ação neuroprotetora avaliada em modelos de neurotoxicidade
provocada pela neurotoxina 6-hidroxi-dopamina, em células mesencefálicas de ratos. Sua
ação neuroprotetora foi demonstrada por aferições dos níveis de óxido nítrico, nitrito e
substâncias reativas com ácido tiobarbitúrico, os quais revelaram uma suposta inativação do
fator nuclear–kappaB (NF-κB) e inibição da peroxidação lipídica como prováveis
mecanismos. A atividade antioxidante exibida neste tipo de ensaio farmacológico sugere um
potencial terapêutico do amburosídio A contra doenças neurodegenerativas como o Mal de
Parkinson (LEAL et al., 2005).
Atividade Citotóxica
Em pesquisa desenvolvida pela Profa. Letícia Veras Costa-Lotufo (Departamento de
Farmacologia e Fisiologia/UFC) em busca de novos agentes citotóxicos, foram testados
isocampferídio, campferol, ácido protocatecuico e amburosídio A.
Todavia apenas os flavonóides, isocampferídio e o campferol, exibiram significativos
efeitos antiproliferativos contra ovos de ouriço-do-mar e cinco linhagens de células tumorais
(dois tipos de células leucêmicas humanas, células cancerosas de mama, cólon e pele) em
ensaios in vitro, sinalizando um potencial antineoplásico para estes compostos (COSTA-
LOTTUFO et al., 2003).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
268
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
269
REFERÊNCIAS
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9. ATIVIDADE ALELOPÁTICA
9.1. Alelopatia
Alelopatia foi definida por Molish em 1937 como a circunstância em que
determinadas espécies de planta podem afetar o crescimento e o desenvolvimento de outras
por síntese e liberação de substâncias químicas específicas (aleloquímicos) no ambiente
(ABENAVOLI et al., 2003). A principal rota biogenética produtora de aleloquímicos é a via
chiquimato, sendo ácidos fenólicos e cumarinas os mais importantes (CHON et al., 2003).
A cumarina é conhecida por ser um forte inibidor da germinação de sementes e
crescimento de raízes. É uma substância modulada pela luz capaz de reduzir a taxa de
respiração e fotossíntese, em plantas intactas, por inibir o sistema de transporte de elétrons.
Apresenta um efeito ambíguo (indução e inibição) sobre o crescimento dependendo da
espécie e da concentração (ABENAVOLI et al., 2003).
9.2. Atividade alelopática do extrato aquoso das sementes de A. cearensis
A capacidade alelopática do extrato aquoso das sementes de Amburana cearensis
(ACEAq) foi testada na inibição da germinação de Lactuca sativa (alface), pelo Prof. Antonio
Marcos Esmeraldo Bezerra (Departamento de Fitotecnia-UFC). No bioensaio, as sementes de
L. sativa foram semeadas sobre discos de papel de filtro, previamente umedecidos com
solução de ACEAq, e dispostos sobre placas de Petri, as quais foram mantidas num
germinador (20 °C), com luz continua, por 15 dias. Os procedimentos de contagens foram
efetuados no 4º e 7º dia. No 11º dia, foi realizada a substituição dos discos de papel de filtro, o
umedecimento dos mesmos com água destilada e a repicagem das sementes. Decorridos
quatro dias, realizou-se a avaliação das sementes repicadas, classificando-as em plântulas
normais, plântulas anormais e sementes não germinadas.
ACEAq mostrou atividade em todas as concentrações testadas, que variaram de 0,54
a 34,50 mg/mL. A inibição da germinação foi revertida nos tratamentos a baixas
concentrações (0,54; 1,08; 2,16 e 4,32mg/mL) quando procedeu-se a troca dos discos de papel
de filtro e a posterior repicagem das sementes, mas não para as outras (Fig. 163, p. 270).
Partição liquído-liquido do ACEAq com clorofórmio, seguida da extração com acetato de
etila, forneceu uma fração aquosa (isenta de cumarina) exercendo ainda efeito inibitório. Este
resultado sugere que a cumarina não é a única responsável pela ação alelopática. Análise por
RMN revelou a presença de cumarina livre, na porção apolar, e glicosídeos de cumarina e
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
270ácido (Z)- o-cumárico, na fração polar (BEZERRA, 2001).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
271
Figura 163- Detalhe das plântulas normais (esquerda), anormais (centro) e sementes não germinadas (direita) observadas no bioensaio com extrato aquoso das sementes de cumaru.
A atividade alelopática demonstrada pelo extrato aquoso das sementes de A.
cearensis é uma prova científica do potencial bio-herbicida desta planta, a qual poderá ser
utilizada como uma arma química natural, de baixo custo e ecologicamente correta no
combate a ervas daninhas, possibilitando aumento na produtividade agrícola sem provocar
danos à saúde humana e ao meio-ambiente.
REFERÊNCIA
ABENAVOLI, M. R.; SORGONA, A.; SIDARI, M.; BADIANI, M.; FUGGI, A. Coumarin inhibits the growth of carrot (Daucus carota L. cv. Saint Valery) cells in suspension culture. J. Plant Physiol., v. 160, p. 227-237, 2003.
BEZERRA, A. M. E.; CANUTO, K. M.; SILVEIRA, E. R; FREITAS, J. B. S.; MEDEIROS-FILHO, S. Efeito do extrato aquoso das sementes de cumaru na germinação de alface. Hortic. Bras., v. 19, n. 2, p.243, 2001.
CHON, S-U; KIM, Y. M.; LEE, J. C. Herbicidal potential and quantification of causative allelochemicals from several Compositae weeds. Weed Res., v. 43, p. 444-450, 2003.
10. PARTE EXPERIMENTAL
10.1. ESTUDO QUÍMICO DOS CONSTITUINTES DE A. CEARENSIS
10.1.1. MATERIAL BOTÂNICO
As sementes de Amburana cearensis foram adquiridas no comércio de Fortaleza
pelo Prof. Antonio Marcos Esmeraldo Bezerra, pesquisador responsável pelo cultivo de
mudas desta espécie.
As cascas do caule de A. cearensis selecionadas para este estudo foram coletadas,
em setembro de 2002, na fazenda São Vicente, no município de Quixeramobim-Ce, pela
Profª. Luzia Kalyne Almeida M. Leal (Departamento de Farmácia-UFC), pesquisadora
responsável pelos ensaios farmacológicos de extratos e substâncias isoladas desta planta.
A identificação botânica foi fornecida pelo Prof. Afrânio Gomes Fernandes,
pertencente ao Departamento de Biologia da Universidade Federal do Ceará. As exsicatas
correspondentes à coleta encontram-se depositadas no Herbário Prisco Bezerra/UFC, com os
números de inscrição 837 e 847.
10.1.2. METODOLOGIA AGRONÔMICA
Cultivo de mudas de A. cearensis
Sementes foram semeadas, diretamente, em quatro canteiros de dimensões de 1,20 m
x 10,00 m cada, no Setor de Horticultura da UFC, os quais foram previamente adubados com
Bioadubo vitaemix® (2,8 kg m-2). Cada parcela compunha-se de seis fileiras regularmente
espaçadas de 20 cm, cuja densidade de semeadura foi de 50 sementes/fileira. Após o desbaste,
realizado 45 dias depois da semeadura, preservaram-se 20 plantas por parcela. Os tratamentos,
representados por oito épocas de colheita (60, 90, 120, 150, 180, 210, 240 e 270 dias após a
semeadura), foram distribuídos aleatoriamente segundo um delineamento de blocos ao acaso
com quatro repetições. Os tratos culturais dispensados foram duas capinas manuais (45 e 70
dias) e regas por microaspersão, exceto nos dias chuvosos. As partes aéreas foram
manualmente separadas dos respectivos xilopódios.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
272
10.1.3 Métodos cromatográficos
10.1.3.1. Cromatografia de adsorção
Nas cromatografias de adsorção foi empregada gel de sílica 60 da Merck ou da
Vetec (∅ µm 63-200). O comprimento e o diâmetro das colunas variaram de acordo com as
alíquotas das amostras e as quantidades de gel de sílica utilizadas. Para cromatografia de
camada delgada (CCD) utilizou-se cromatoplacas de gel de sílica 60 (∅ µm 2-25) sobre
poliéster T-6145 da Sigma Chemical CO (com indicador de fluorescência na faixa de 254
ηm). Os eluentes utilizados foram: hexano, clorofórmio, acetato de etila e metanol puros, ou
combinados em proporções crescentes de polaridade.
A revelação das substâncias nas cromatoplacas analíticas foi obtida por exposição à
luz ultravioleta em dois comprimentos de onda (254 e 366nm) realizada em aparelho
Spectroline modelo ENF-240 C/F e/ou por aspersão com solução de vanilina (C8H8O3) e
ácido perclórico (HClO4) em etanol (C2H6O), seguido de aquecimento em estufa a 100 0C por
aproximadamente 5 minutos, ou ainda por exposição a vapores de iodo.
10.1.3.2. Cromatografia de exclusão
Os fracionamentos por cromatografia de exclusão foram efetuados em gel de
dextrana Sephadex LH-20 da Pharmacia Fine Chemicals, utilizando-se metanol puro ou
combinado com água ou clorofórmio como fase móvel.
10.1.3.3 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE≈ HPLC)
As soluções de calibração, os extratos e frações de Amburana cearensis foram
analisados num aparelho de HPLC, constituído de uma bomba binária Waters-1525 e um
detector DAD Waters-2996 a 254nm. As separações foram efetuadas em colunas XTerra®
RP-18 (4,6 x 250 mm, 5 µm) e XTerra® RP-18 (10 x 250 mm, 10 µm), mantidas num forno
termostático a 35°C. As amostras foram eluídas com MeOH e solução aquosa de H3PO4, puro
ou tamponado com Et3N (pH=3,0), adotando-se fluxos de 1mL/min (coluna analítica) e 4,5
mL/min (coluna semi-preparativa).
Os solventes empregados apresentavam grau HPLC (MeOH-Tedia e H2O-Milli-Q) e
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
273
foram adequadamente filtrados através de membranas de nylon com poros de 0,45 µm
(Phenomenex) e desgaseificados por sonicação a vácuo durante 5 min. As amostras foram
dissolvidas nas fases móveis empregadas em cada análise e filtradas através de membranas de
teflon com poros de 0,45 µm (Waters).
10.1.3.4. Extração em Fase Sólida (EFS ≈ SPE)
As extrações em fase sólida de frações de A. cearensis, com fins de isolamento,
foram realizadas em cartuchos de fase reversa (C18) de 500 mg e 2g, fabricados pela Waters.
Na etapa de preparo das amostras injetadas no HPLC (clean-up), foram empregados cartuchos
de fase reversa de 100 mg, fabricados pela Varian. O uso dos cartuchos era precedido por
ativação do adsorvente com metanol, seguida de acondicionamento em água Mili-Q,
utilizando alíquotas equivalentes a três vezes o volume do cartucho.
10.1.4. Métodos espectroscópicos
10.1.4.1. Espectroscopia na região do infravermelho (IV)
Os espectros na região do infravermelho foram obtidos em Espectrômetro Perkin
Elmer, modelo FT-IR Spectrum 1000 da central analítica do Departamento de Química
Orgânica e Inorgânica da Universidade Federal do Ceará (DQOI/UFC), utilizando pastilhas
de KBr para análise das amostras.
10.1.4.2. Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e de
Carbono-13 (RMN 13C)
Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear de Prótio (RMN 1H) e Ressonância
Magnética Nuclear de Carbono-13 (RMN 13C), uni e bidimensionais, foram obtidos em
espectrômetros Bruker, modelo Avance DPX-300 e/ou modelo Avance DRX-500,
pertencentes ao Centro Nordestino de Aplicação e Uso da Ressonância Magnética Nuclear da
Universidade Federal do Ceará (CENAUREMN-UFC).
O espectrômetro Bruker Avance DRX-300, equipado com sonda de detecção inversa
de 5 mm e magneto de 7,046 T, foi operado nas freqüências de 300,13 e 75,47 MHz para
hidrogênio e carbono, respectivamente. Nos experimentos realizados no aparelho Bruker
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
274
Avance DRX-500, foram aplicadas freqüências de 500,13 MHz (1H) e 125,75 MHz (13C), sob
um campo magnético de 11,744 T. O tipo de sonda variou conforme o tipo de técnica: 1-
sonda dual de 5 mm com detecção direta (experimentos unidimensionais), 2- sonda
multinuclear de 5 mm com detecção inversa (experimentos bidimensionais).
As amostras foram dissolvidas em alíquotas de 0,6 mL de solvente deuterado:
clorofórmio (CDCl3), metanol (CD3OD), dimetilsulfóxido (DMSO-d6), água (D2O) ou
piridina (C5D5N), comercializados pelas companhias ACROS, Cambridge Isotope
Laboratories, Merck ou Aldrich.
Os deslocamentos químicos (δ) foram expressos em partes por milhão (ppm) e
referenciados, no caso dos espectros de prótio, pelos picos dos hidrogênios pertencentes às
moléculas residuais não-deuteradas dos solventes deuterados utilizados: clorofórmio (δ 7,27),
metanol (δ 3,31), DMSO (δ 2,50), piridina (δ 8,74; 7,58; 7,22), água (δ 4,80) e acetona
(δ.2,05) Nos espectros de carbono-13, os deslocamentos químicos foram referenciados pelos
picos centrais dos carbonos-13 dos solventes: clorofórmio (δ 77,23), metanol (δ 49,17),
DMSO (δ 39,51) piridina (δ 150,35; 135,91; 123,87) e acetona (δ 206,68 e 29,92).
As multiplicidades dos sinais de hidrogênio nos espectros de RMN 1H foram
indicadas segundo a convenção: s (singleto), d (dupleto), dd (duplo dupleto), t (tripleto), q
(quarteto), m (multipleto).
Nos experimentos unidimensionais de 1H e de 13C foram estabelecidos os seguintes
valores para os parâmetros de aquisição, respectivamente: larguras espectrais de 24 e 260
ppm, tempo de relaxação de 1 s e largura de pulso de 90o de 9,60 µs (0 dB) e 10,90 µs (-3 dB)
para 1H e 13C, respectivamente. Para todos os experimentos unidimensionais foram utilizados
65356 pontos para a aquisição e 32768 para o processamento, enquanto para os experimentos
bidimensionais foram utilizados 2048 x 256 pontos para a matriz de dados de aquisição e
2048 x 1024 pontos para o processamento. Predição linear para o processamento 2D,
utilizando 80 coeficientes, foi usada quando necessária. O número de transientes variou de 8,
para 1H, a 16384, para 13C, para os experimentos unidimensionais, e 2n (n ≥ 2) para
bidimensionais, dependendo do experimento e quantidade de amostra disponível.
Os microprogramas utilizados para a aquisição dos dados foram: 1H (zg), 13C-BB
(zgpg), 13C-DEPT135 (dept135), COSY (cosygp), NOESY (noesygpph), HSQC (hsqcgpph), 1H,13C-HMBC (hmbclpndqf).
A técnica DEPT (Distortionless Enhancement by Polarization Transfer), com
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
275ângulos de nutação de 135°, CH e CH3 com amplitudes em oposição aos CH2, e 90°, somente
CH, foi utilizada na determinação do padrão de hidrogenação dos carbonos em RMN 13C,
descrito segundo a convenção: C (carbono não-hidrogenado), CH (carbono metínico), CH2
(carbono metilênico ou metilidênico) e CH3 (carbono metílico). Os carbonos não-
hidrogenados foram caracterizados pela subtração do espectro DEPT 135 do espectro BB.
Os experimentos bidimensionais de correlação homonuclear (COSY e NOESY) e
heteronuclear (HMQC, HSQC e HMBC), realizados no aparelho Bruker Avance DRX-500,
foram efetuados em sonda multinuclear de 5 mm, com detecção inversa, empregando-se
gradiente de campo, posicionado no eixo z e magnitude de 10 A. Os valores de J utilizados
para os experimentos pertinentes foram 1JH,C = 145, nJH,C = 7, onde n ≥ 2.
10.1.4.3. Espectrometria de massa (EM)
Os espectros de massa de baixa resolução foram registrados num espectrômetro
Shimadzu, modelo QP 5000/DI-50, através de impacto eletrônico a 70 eV ((DQOI/UFC).
Os espectros de alta resolução dos amburosídios foram obtidos por ionização por
elétron-spray (EM-IES), enquanto que os espectros de biflavonóides foram produzidos por
impacto eletrônico (EM-IE). Os espectros por EM-IES foram registrados num espectrômetro
de quadrupolo com analisador de tempo-de-vôo (UltrOTOF-Q, Bruker Daltonics, Billerica,
USA), pertencente ao Laboratório de Espectrometria de Massas da USP-Ribeirão Preto, sendo
os scans aquiridos no modo positivo. Condições: voltagem capilar de 3400 V, temperatura e
fluxo do gás seco: 180 °C e 4 L/h. Nitrogênio foi utilizado como gás nebulizador e CF3CO2Na
foi empregado como padrão de calibração interna e externa. Os espectros de EM-IE foram
obtidos num aparelho VG Autospec Fisons Instruments (Micromass, Manchester),
pertencente à central analítica do Instituto de Química da UNICAMP.
10.1.5. Métodos físicos
10.1.5.1. Determinação do ponto de fusão (pf)
Os pontos de fusão, não corrigidos, foram determinados em equipamento da Mettler
Toledo, composto por uma placa aquecedora FP82HT e uma unidade de processamento FP90,
a uma taxa de aquecimento de 2 oC/min.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
276
10.1.5.2 Determinação da rotação óptica (α)
As rotações ópticas foram determinadas em polarímetro Perkin-Elmer, modelo 341,
sendo as medidas realizadas a 589 ηm (20 oC).
10.1.6. Estudo Fitoquímico da casca do caule de A. cearensis
10.1.6.1. Obtenção do extrato etanólico da casca do caule (ACCE1)
4,0 Kg de cascas do caule de planta adulta silvestre, trituradas mecanicamente,
foram divididas em alíquotas de, aproximadamente, 200 g e submetidas à extração com etanol
em aparelho Sohxlet, gerando 192,5 g (R= 4,8 %, p/p) de um sólido viscoso marrom, após
destilação do solvente sob pressão reduzida. O extrato etanólico obtido foi denominado
ACCE1.
10.1.6.2. Partição líquido-líquido do extrato etanólico ACCE1
O extrato etanólico ACCE1 (192,5 g) foi suspenso em 350 mL de água e
particionado com acetato de etila (3 x 150 mL), fornecendo 101,8 g de fração aquosa
(ACCE1A), após liofilização. A fração acetato de etila, previamente tratada com Na2SO4
anidro, foi destilada a vácuo, rendendo 82,6 g de um sólido marrom viscoso Depois de seca, a
fração acetato de etila (82,6 g) foi solubilizada com 200 mL de metanol e desengordurada
através de partição com hexano (3 x 100 mL). As fases hexânica e metanólica foram
rotaevaporadas e secas, gerando, respectivamente, 16,6 g de um sólido verde (ACCE1AH) e
64,5 g de um sólido escuro (ACCE1AM).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
277
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
278
Fluxograma 1- Partição líquido-líquido do extrato etanólico da casca do caule de A. cearensis.
Extrato etanólico ACCE (192,5 g)
Fração acetato de etila ACCEA (82,6 g)
Fração aquosa ACCEQ (101,8 g)
Fração metanólica ACCEAM (64,5 g)
Fração hexânica ACCEAH (16,6 g)
1. H2O 2. AcOEt
1. MeOH 2. Hexano
liofilização Na2SO4/Rotaevaporação
Rotaevaporação
10.1.6.3.Fracionamento de ACCEAM1
A fração ACCE1AM (64,5 g) foi adsorvida com 65,0 g de gel de sílica, pulverizada
em gral de porcelana e acondicionada sobre 48,7 g de gel de sílica numa coluna de vidro de
1000 mL. ACCE1AM foi fracionada por eluição com os seguintes solventes, obedecendo esta
ordem: CHCl3 (0,5 L), CHCl3/AcOEt (3,5 L), AcOEt (2,0 L) e MeOH (0,5 L). Após
evaporação dos solventes, foram obtidas as frações correspondentes a cada eluente, seguindo
a mesma seqüência: ACCE1AM/C (2,1 g), ACCE1AM/CA (22,7 g), ACCE1AM/A (25,3 g) e
ACCE1AM/M (12,3 g).
10.1.6.4.Cromatografia em sílica de ACCE1AM/CA
Numa coluna de 500 mL contendo 160,2 g de gel de sílica, acondicionou-se a fração
ACCE1AM/CA (22,7 g- sólido marrom), previamente adsorvida com 24,3 g de gel de sílica.
ACCE1AM/CA foi eluída com: CHCl3 (f1-6), CHCl3/AcOEt 10% (f7-18), CHCl3/AcOEt 20%
(f19-25), CHCl3/AcOEt 40% (f26-29), CHCl3/AcOEt 50% (f30-31), AcOEt (f32) e MeOH
(f33), coletando-se alíquotas de 75 mL. Através de análise por CCD, reuniram-se as frações
semelhantes: f3-7, f8-15, f16-19, f20-23, f24-31.
10.1.6.5. Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACCE1AM/CA(24-31)- Isolamento de
ACCE-1 (quercetina)
A fração ACCE1AM/CA(24-31) (4,0 g) foi dissolvida em 4 mL de MeOH e
cromatografada em 60,0 g de Sephadex LH-20 (∅int= 3,5 cm). Foram coletadas 34 frações de
10 mL, utilizando-se metanol como eluente. Monitoramento por cromatoplacas permitiu
reunir as frações idênticas: f2-8, f9-18 e f19-33. A cromatoplaca da fração 34 (40 mg) revelou
a presença de apenas uma mancha amarelada, sendo então submetida à análise
espectroscópica. Esta fração, um sólido amarelo, foi denominada ACCE-1 e identificada
como sendo o flavonol quercetina.
10.1.6.6. Isolamento de ACCE-2 ACCE- 3 e ACCE-4 (ácido protocatecuico, amburosídio
A e ácido vanílico)
Uma nova cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g; ∅int= 3,5 cm) foi realizada para
fração ACCE1AM/CA(24-31)(2-8) (2,4 g), empregando-se condições idênticas às adotadas no
procedimento anterior. As 20 frações obtidas foram submetidas à análise por CCD, resultando
em 4 grupos de frações: f4-6, f8-13 e f14-15 e f16-20. Após secagem à temperatura ambiente,
foi possível visualizar a presença de cristais aciculares amarelados na fração f4-6 (186 mg),
chamada ACCE-2, e um sólido rosado na fração f8 -13 (954 mg), intitulada ACCE-3. A
fração f14-15 (103 mg), sólido marrom escuro, foi recristalizada em CHCl3/AcOEt 50%,
obtendo-se 47 mg de cristais amarelados, designados ACCE-4. Todas as frações puras foram
quimicamente caracterizadas através de comparação dos seus dados espectrais com os já
descritos na literatura, revelando as seguintes substâncias químicas: ácido protocatecuico
(ACCE-2), amburosídio A (ACCE-3) e ácido vanílico (ACCE-4).
10.1.6.7. Isolamento de ACCE-5 (Amburanina A)
Após dissolução em 3 mL de MeOH, a fração ACCE1AM/CA(24-31)(9-18) (1,5 g)
foi submetida à cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), sendo eluída com
MeOH. 26 frações de 5 mL foram coletadas e reunidas, ao serem comparadas por CCD: f3-5,
f7-9 e f10-26.
A fração ACCE1AM/CA(24-31)(9-18)(10-26) (260 mg) foi cromatografada
novamente em Sephadex LH-20 (8 g- ∅int= 1,5 cm), obtendo-se 15 frações de 1mL. As
frações 6-12 apresentavam um sólido amarelo denominado ACCE-5 (61 mg) e identificado
como o biflavonóide amburanina A por técnicas espectroscópicas.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
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Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
280
10.1.6.8. Isolamento de ACCE-6 (Amburanina B)
Cromatografia em Sephadex LH-20 (8 g- ∅int= 3,5 cm) de ACCE1AM/CA(24-
31)(19-33) (254 mg) rendeu um sólido amarelo nas frações 5 a 12, sendo então reunidas
depois comparadas através de CCD. MeOH foi utilizado na solubilização da amostra (1,5 mL)
e na eluição de 15 frações (alíquotas de 3mL).
A fração f5-12 (162 mg) foi purificada por HPLC, utilizando-se uma coluna de fase
reversa e uma fase móvel composta por H2O-MeOH. O gradiente de eluição variou de 60%
para 75% de MeOH em 10 min, empregando-se um fluxo de 4,5 mL/min. O cromatograma
(Fig. 164) exibiu dois picos a 284 nm, sendo o pico 2 (53 mg; tR= = 8,82 min), denominado
ACCE-6, estruturalmente caracterizado através de técnicas espectroscópicas como
amburanina B.
Figura 164- Cromatograma de HPLC da fração ACCE1AM/CA(24-31)(19-33)(5-12)
AU
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00
8,82
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
281
Fluxograma 2- Metodologia de Isolamento de 6 substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis.
10.1.6.9. Obtenção e partição de ACCE2
Em virtude da necessidade de maiores quantidades de substâncias de interesse
farmacológico (amburosídio A e isocampferídio), repetiu-se a mesma metodologia de
extração do item 10.1.6.1.. Foram obtidos 228 g do extrato etanólico denominado ACCE2 a
partir de 4,2 Kg de casca do caule (R= 5,4 %, p/p), adquiridas nos mesmos local e período de
coleta. O extrato ACCE2 foi particionado com H2O (350 mL)/AcOEt (3 x 150 mL) e
posteriormente a fase acetato de etila foi seca e submetida à partição MeOH (180
mL)/Hexano (3 x 120 mL), resultando em 81,8 g e 14,4 g das frações metanólica
(ACCE2AM) e hexânica da fração (ACCE2AH), respectivamente.
ACCE1AM
ACCE1AM/C ACCE1AM/CA ACCE1AM/A ACCE1AM/M
Sílica
F24-31
Sephadex
F2-8 F9-18 F19-33 F34
Sílica
Sephadex Sephadex Sephadex
F4-6 F8-13 F14-18
ACCE-2 Ac. protocatecuico
ACCE-1 Quercetina
ACCE-3 Amburosídio A
ACCE-4 Ác. vanílico
F10-26
F6-12
Sephadex
ACCE-5 Amburanina A
F5-12
Pico 2
HPLC
ACCE-6 Amburanina B
10.1.6.10. Fracionamento de ACCE2AM
A fração ACCE2AM foi adsorvida com 80 g de gel de sílica, sendo posteriormente
acondicionada sobre 30 g de gel de sílica numa coluna de 1000 mL, e cromatografada com:
CHCl3 (1,7 L), CHCl3/AcOEt (2,1 L), AcOEt (2,6 L) e MeOH (0,8 L), fornecendo as frações
ACCE2AM/C (12,7 g), ACCE2AM/CA (15,7 g), ACCE2AM/A (38,6 g) e ACCE2AM /M
(10,2 g), respectivamente.
10.1.6.11. Cromatografia em sílica de ACCE2AM/CA
Adsorvida com 20,6 g de gel de sílica, a fração ACCE2AM/CA (15,4 g) foi
cromatografada numa coluna de 500 mL, contendo 102,1 g de gel de sílica. Para eluição,
foram aplicadas as seguintes misturas de solventes: CHCl3/AcOEt 10% (f1-3), CHCl3/AcOEt
20% (f4-5), CHCl3/AcOEt 50% (f6-19), além dos solventes puros AcOEt (f20-22) e MeOH
(f23), sendo as frações recolhidas em porções de 75 mL. As frações f1-5, f6-12, f13-19 e f20-
22 foram juntas depois de comparadas por CCD.
10.1.6.12. Isolamento de ACCE-7 e ACCE-8 (protocatecuato de 6-cumarila e
isocampferídio)
A fração ACCE2AM/CA (6-12) (4,1 g- sólido marrom) foi três vezes submetida à
cromatografia em 60 g de Sephadex LH-20 (∅int= 3,5 cm), adotando-se MeOH como eluente
nas duas primeiras colunas cromatográficas e CHCl3/MeOH 50%, na última. Foram coletadas
33 e 30 porções de 10 mL na primeira e segunda tentativas de isolamento, respectivamente,
enquanto que, na terceira, recolheram-se 25 alíquotas de 5 mL. Em todas as colunas, as
amostras foram aplicadas em volumes de 5 mL. Ao final desta série de separações, sempre
monitoradas por CCD, chegou-se ao isolamento de 171,4 mg de ACCE-7, sólido amarelo
obtido na fração f4-6, e 7 mg de ACCE-8, sólido vermelho encontrado na fração f13. Ambos
tiveram suas estruturas elucidadas por métodos espectroscópicos como sendo o flavonóide
isocampferídio e a cumarina protocatecuato de 6-cumarila, respectivamente.
10.1.6.13. Isolamento de ACCE-9 (formononetina)
A fração ACCE2AM/CA(13-19) (2,9 g-sólido marrom) foi dissolvida em 4,6 mL de
CHCl3/MeOH 50 % e adicionada a uma coluna de Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm),
utilizando a mesma mistura de solventes como fase móvel. Foram recolhidos volumes de 5
mL, totalizando 30 frações. A fração 29 (8 mg) apresentava um sólido amarelo, o qual foi
tratado com MeOH e filtrado, restando um sólido branco (3 mg) chamado de ACCE-9. A
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
282
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
283
determinação estrutural de ACCE-9 como sendo o isoflavonóide formononetina foi obtida
somente por RMN.
Fluxograma 3- Metodologia de Isolamento de 3 outras substâncias obtidas do extrato etanólico da casca do caule de A .cearensis.
10.1.7. Estudo Fitoquímico das Sementes de A. cearensis
10.1.7.1. Obtenção dos extrato etanólico das sementes (ACS)- Isolamento de ACS-1
(cumarina)
1,5 Kg de sementes moídas de A. cearensis foram maceradas em 1,8 L de CHCl3
durante 24h. Após secagem do solvente, obteve-se um óleo amarelo (312 g) contendo um
precipitado branco (53,5 g) o qual foi separado por remoção do líquido sobrenadante. Uma
alíquota de 1,0 g do sólido branco foi tratada com 50 mL de água fervente, resultando no
aparecimento de uma fase oleosa, removida por filtração simples. Depois de resfriada, a
solução aquosa foi filtrada, gerando-se 240,5 mg de cristais brancos (ACS-1), identificados
por RMN como cumarina. A torta, resíduo da extração, foi extraída com etanol em aparelho
Sohxlet, fornecendo 144,0 g (R= 9,6 %, pext./psemente) de um sólido marrom, nomeado ACSE
depois de evaporação do solvente a vácuo.
ACCE1AM
ACCE1AM/C ACCE1AM/CA ACCE1AM/A ACCE1AM/M
Sílica
Sephadex
F6-12
F29
Sílica
Sephadex
F4-6 F13
ACCE-7 Isocampferídio
ACCE-9 Formononetina
ACCE-8 Protocatecuato de 6-
cumarila
F13-19
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
284
Fluxograma 4- Obtenção dos extratos hexânico e etanólico das sementes de A. cearensis. Isolamento de ACS-1.
Sementes de A. cearensis
Recristalização
Hexano
Etanol
ACS-1
ACSE
ACSH Torta
Torta Cumarina
10.1.7.2. Partição do extrato etanólico ACSE
Em 300 mL de uma mistura H2O-MeOH (2:1), o extrato ACSE (144,0 g) foi
solubilizado e particionado com clorofórmio (3 x 100 mL), sendo imediatamente submetido à
partição com AcOEt (3 x 100 mL). A fase hidrometanólica foi rotaevaporada, para remoção
do metanol, e posteriormente liofilizada, rendendo 109,7 g de um sólido marrom (ACSEHm).
As fases orgânicas, previamente tratadas com Na2SO4 anidro, foram concentradas e secas,
resultando em 24,8 g de fração clorofórmica (ACSEC) e 5,3 g de fração acetato de etila
(ACSEA).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
285
Fluxograma 5- Partição do extrato etanólico das sementes de A. cearensis.
10.1.7.3.Cromatografia em Sephadex LH-20 de ACSEA
A fração ACSEA (5,3 g), sólido marrom dissolvido em 5 mL de MeOH, foi
cromatografada em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), gerando 30 frações de 10 mL, por
eluição com MeOH. Depois de análise por CCD, reuniram-se as frações: f2-11, f12-15, f16-
18, f19-25 e f20-28. Em virtude da baixa resolução alcançada na separação das frações
iniciais, decidiu-se recromatografar a fração f2-11 (2,6 g), adotando-se as mesmas condições.
Foram coletadas 20 frações de 10 mL, sendo reunidas as seguintes subfrações: f2-11(4-5), f2-
11(6-10) e f2-11(11-18).
10.1.7.4. Isolamento de ACS-2 (galato de amburosila)
A fração ACSEA(16-18) (61,8 mg) foi solubilizada em 1 mL de H2O/MeOH 50% e
aplicada em um cartucho de SPE (500 mg), previamente ativado e equilibrado com a fase
móvel. O cartucho foi eluído com 6 mL de H2O/MeOH 50% e posteriormente com 6 mL de
MeOH, sendo coletadas alíquotas de 1 mL. A fração 3 (9,3 mg), um sólido marrom viscoso,
foi designada ACS-2 e submetida à análise espectroscópica, pela qual teve sua estrutura
elucidada como galato de 6”-amburosila (amburosídio C).
Extrato etanólico ACSE (144,0 g)
Fração acetato de etila ACSEA (5,3 g)
Fração hidrometanólica ACSEHm
Fração hidrometanólica ACSEHm (109,7 g)
Fração clorofórmica ACSEC (24,8 g)
1. H2O/MeOH (2:1) 2. CHCl3
1. AcOEt
Rotaevaporação/Liofilização
Na2SO4/Rotaevaporação
Na2SO4/Rotaevaporação
10.1.7.5. Cromatografia em sílica de ACSEA(2-11)(11-18)-Isolamento de ACS-3 e ACS-4
Adsorvida com 2,0 g de gel de sílica, A fração ACSEA(2-11)(11-18) (1,6 g) foi
depositada sobre 25,0 g deste mesmo adsorvente, numa coluna de 125 mL. A eluição da
coluna foi efetuada inicialmente com Hexano/AcOEt 20% (f1-7), seguida de Hexano/AcOEt
25% (f8-16), Hexano/AcOEt 30% (f17-19), Hexano/AcOEt 40% (f20-22), Hexano/AcOEt
50% (f23-25), Hexano/AcOEt 75% (f26-27), AcOEt (f28), e finalmente MeOH (f29),
recolhendo-se alíquotas de 50 mL. Cromatoplacas expostas a vapores de iodo permitiram
selecionar e agrupar as frações idênticas: f1-5, f6-7, f8-11, f13-17, f18-20, f21-23, f25-29.
Análise por CCD revelou que as frações f21-23 (119 mg, ACS-3) e f12 (16 mg, ACS-4) eram
quimicamente equivalentes às frações ACCE-3 (amburosídio A) e ACCE-4 (ácido vanílico),
respectivamente, isoladas das cascas do caule.
10.1.7.6. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-5 e ACS-6 (6-hidroxi-cumarina e
ácido (E)-o-cumárico)
Alíquotas de 200 µL de solução aquosa de H3PO4/MeOH 20% da fração ACSEA(2-
11)(11-18)(13-17) (37 mg) foram injetadas num aparelho de HPLC, provido de coluna de fase
reversa. A fase móvel, composta por H3PO4 (pH= 3,0)/MeOH, variou de 20 a 60% de MeOH
em 20 min, adotando-se um fluxo de 4,7 mL/min. Selecionando-se a detecção de UV para 310
nm, obteve-se um cromatograma (Fig. 165, p. 286) exibindo 3 picos cujos tempos de retenção
foram de 7,56 min (pico 1); 10,30 min (pico 2) e 11,24 min (pico 3). O primeiro pico (14,3
mg) foi reconhecido como sendo quimicamente idêntico a ACS-4 (ácido vanílico), após
análise por RMN 1H. Os picos 2 e 3, ambos sólidos brancos, passaram a ser referidos como
ACS-5 (5,0 mg) e ACS-6 (9,7 mg), sendo estruturalmente caracterizados por RMN, IV e EM
como 6-hidroxi-cumarina e ácido cumárico, respectivamente.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
286
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
10,30
7,56
11,24
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
287
Figura 165- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(13-17)
10.1.7.7. Separação por HPLC- Isolamento de ACS-(7-12)
A fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20) (65,3 mg) foi analisada por HPLC numa
coluna de fase reversa, empregando-se uma mistura de composição variável de H3PO4 (pH=
3,0)/MeOH. A concentração de MeOH variou de 40 para 80% ao longo de 20 min de corrida,
mantendo-se um fluxo constante de 4,5 mL/min. As injeções foram realizadas através de
alíquotas de 200 µL de solução filtrada da amostra, dissolvida na fase móvel inicial. A 254
nm, foram detectados e coletados 5 picos (Fig. 166, p. 287): pico 1 (tR= 6,65 min, ACS-7),
pico 2 (tR= 9,36 min, ACS-8), pico 3 (tR= 11,06 min, ACS-9), pico 4 (tR= 12,50 min) e pico 5
(tR= 13,57 min, ACS-10). O pico 4 foi reinjetado e desdobrado em dois novos picos: pico 4.1.
(tR= 11,69 min, ACS-11) e pico 4.2 (tR= 13,54 min, ACS-12) (Fig. 167, p. 287). Este
conjunto de picos foi caracterizado como uma série de amburosídios denominados ACS- (7-
12) e identificados como sendo os amburosídios A, D-H.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
288
Figura 166- Cromatograma de HPLC da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)
Figura 167- Cromatograma de HPLC do pico 4 da fração ACSEA(2-11)(11-18)(18-20)
AU
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
13,54
11,69
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
6,65
11,06
12,50 13,57
9,36
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
289
Fluxograma 6- Metodologia de isolamento das 9 substâncias obtidas do extrato etanólico das sementes de A .cearensis.
ACSEA
F2-11
F11-18
Sephadex
F13-17 F21-23
F16-18
F12
Sílica
Sephadex Cartucho C18
Pico 1 Pico 2 Pico 3
ACS-2 AmburosídioC
ACS-3-AmburosídioA
F18-20
Pico-1
HPLC
F3
Pico 2
ACS-4 Ac. Vanilico ACS-5
6--Hidroxi-cumarina
ACS-6 Ác. Cumárico
Pico 3 Pico 5
HPLC
ACS-7 AmburosídioA
ACS-8 AmburosídioD
ACS-9 Amburosídio E
ACS-10 AmburosídioF
Pico 4
Pico-4.1 Pico-4.2
ACS-11 AmburosídioG
ACS-12 AmburosídioH
ACS-4 Ac. Vanilico
10.1.8.Obtenção dos extratos etanólicos dos xilopódios e das partes aéreas de plantas
cultivadas (ACX e ACPA)
As partes aéreas e os xilopódios moídos de espécimens jovens de A. cearensis (2-9
meses de desenvolvimento), cultivados por semeadura direta, foram extraídos por maceração
com etanol durante 24 h. Os extratos foram obtidos em quadruplicata para fins estatísticos,
perfazendo um total de 64, os quais foram assim denominados: EN-ACX, para aqueles
oriundos do xilopódio, e EN-ACPa, para aqueles provenientes da parte aérea, sendo N
referente à idade da planta (em meses de cultivo). Ao final, os extratos de mesma época foram
reunidos por serem quimicamente idênticos, conforme análise realizada por RMN, resultando
em 16 amostras (Tab. 33, p. 290).
Os extratos E2, E4, E7 e E9 do xilopódio e da parte aérea foram selecionados para
serem submetidos a testes farmacológicos devido às diferenças observadas em seus perfis
químicos, segundo análise espectroscópica por RMN (Ressonância Magnética Nuclear). A
partir deste ponto, os estudos foram direcionados pelos resultados dos ensaios farmacológicos
cujas respostas mais significativas foram observadas para o extrato E7 e E9.
10.1.8.1. Partição do extrato etanólico E7-ACX
Uma alíquota de 30,7 g de extrato E7-ACX (sólido escuro), correspondente à metade
da massa de extrato obtida, foi particionada com H2O (200 mL)/AcOEt (3 x 120 mL). A fase
aquosa foi liofilizada, gerando 9,2 g de um sólido marrom denominado E7-ACXQ. Tratada
previamente com Na2SO4 anidro, a fase acetato de etila foi filtrada e seca, obtendo-se E7-
ACXA (20,8 g), um sólido escuro. A fração E7-ACXA foi dissolvida em 200 mL de MeOH e
misturada com 120 mL de CH2Cl2, contudo a separação de fases só foi observada após a
adição de 50 mL de H2O. A partição foi concluída com mais duas extrações com 120 mL de
CH2Cl2, resultando em 11,7 g de fração hidrometanólica (E7-ACXAM) e 7,0 g da fração
diclorometano (E7-ACXAD), após devido tratamento.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
290
Tabela 33- Acompanhamento mensal das massas (g) e dos rendimentos (%) dos extratos etanólicos da parte aérea e do xilopódio de A. cearensis.
Extratos da parte aérea (canteiros) Mês
I (%) II (%) III (%) IV (%) Total
2 2,1 (7,0) 1,9 (8,0) 1,9 (7,1) 2,1 (7,6) 8,0
3 5,5 (8,0) 4,7 (8,5) 4,9 (8,8) 6,1 (12,9) 21,2
4 5,8 (4,5) 7,2 (7,0) 5,6 (4,4) 7,2 (6,0) 25,8
5 11,4 (3,4) 9,4 (3,6) 11,0 (3,8) 5,5 (1,6) 37,3
6 6,6 (2,8) 7,3 (2,9) 8,4 (2,9) 11,9 (5,6) 34,2
7 8,3 (4,0) 19,2 (5,8) 13,4 (4,0) 23,4 (7,4) 64,3
8 16,6 (5,6) 9,9 (2,90) 9,9 (6,7) 12,0 (3,7) 48,4
9 3,9 (0,8) 6,6 (1,6) 4,9 (1,1) 9,1 (2,8) 24,5
Extratos do xilopódio (canteiros) Mês
I (%) II (%) III (%) IV (%) Total
2 3,4 (16,0) 2,2 (21,4) 3,1 (19,6) 2,7 (17,9) 11,4 (19,4)
3 6,2 (7,3) 5,6 (10,2) 6,2 (9,7) 4,3 (11,8) 22,3 (43,5)
4 8,3 (4,5) 8,5 (8,4) 10,7 (6,6) 11,3 (7,6) 38,8 (64,6)
5 17,9 (10,0) 6,7 (2,4) 9,2 (3,9) 11,6 (6,2) 45,4 (82,7)
6 3,9 (0,7) 6,0 (1,0) 6,8 (1,1) 4,4 (0,8) 21,1 (55,3)
7 11,4 (1,8) 14,3 (1,6) 21,9 (1,9) 20,9 (2,5) 68,5 (132,8)
8 20,6 (1,9) 19,8 (1,7) 8,2 (1,3) 12,9 (1,1) 61,5 (109,9)
9 12,6 (1,2) 10,3 (0,6) 13,6 (0,7) 8,5 (0,6) 45,0 (69,5)
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291
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292
Fluxograma 7- Partição do extrato etanólico do xilopódio da planta jovem (7 meses) de A. cearensis.
Extrato etanólico E7-ACX (30,7 g)
Fração acetato de etila E7-ACXA (20,8 g)
Fração aquosa E7-ACXQ (9,2 g)
Fração hidrometanólica E7-ACXAM (11,7 g)
Fração diclorometano E7-ACXAD (7,0 g)
1. H2O (200 mL) 2. AcOEt (3 x 120 mL)
1. MeOH (200 mL) + H2O (50 mL) 2. CH2Cl2 (3 x 120 mL)
Liofilização/Rotaevaporação Na2SO4/Rotaevaporação
10.1.8.2. Fracionamento de ACXQ
A fração E7-ACXQ (9,2 g) foi dividida em duas porções eqüitativas e
cromatografada em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm) duas vezes, sob as mesmas
condições. A amostra foi dissolvida e eluída com H2O/MeOH 50%, obtendo-se 6 alíquotas de
30 mL em cada cromatografia. Em razão dos elevados teores de açúcares presentes nas
frações, as cromatografias foram monitoradas por RMN 1H. A fração f3 (3,9 g), resultante das
duas colunas, foi selecionada para novo fracionamento, em virtude da presença de sinais na
região de aromáticos no espectro de RMN 1H. Objetivando-se extrair os constituintes
heterosídicos, realizou-se uma partição H2O (25 mL)/n-butanol (3 x 15 mL) resultando numa
fração aquosa E7-ACXQ(3)Q (3,6 g) e outra butanólica E7-ACXQ(3)B (124 mg), sendo
ambas sólidos viscosos marrons.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
293
10.1.8.3. Separação por HPLC de ACXQ/B- Isolamento de ACX-1 (ác. cumarínico
glicosilado)
Através de um loop de 200 µL, a fração ACXQ(3)B (124 mg) foi injetada sucessivas
vezes num aparelho de HPLC, equipado com coluna de fase reversa. A amostra foi eluída
com H3PO4 (pH= 3,0)/MeOH, empregando-se o gradiente de 20 para 50% de MeOH em 10
min de corrida. O cromatograma (Fig. 168), visualizado a 254 nm, mostrou a separação de 3
picos cujos tempos de retenção foram de 4,73 min (pico 1), 5,56 min (pico 2) e 7,87 min (pico
3). O pico 3 rendeu 12 mg de um sólido viscoso amarelo, denominado ACX-1, e
quimicamente caracterizado como ácido cumarínico glicosilado.
Figura 168- Cromatograma de HPLC da fração ACXQ(3)B
10.1.8.4. Tratamento cromatográfico de E7-ACXAM- Isolamento de ACX-2
(amburanina B)
A fração E7-ACXAM (11,7 g) foi adsorvida com 15,0 g de gel de sílica e eluída a
vácuo com CH2Cl2 (150 mL), seguido de CH2Cl2/AcOEt (450 mL), AcOEt (800 mL) e
MeOH (450 mL). Após evaporação dos solventes, foram obtidas as frações correspondentes a
cada eluente, obedecendo a ordem de eluição: E7-ACXAM/D (1,0 g), E7-ACXAM/DA(1,7
g), E7-ACXAM/A (1,5 g) e E7-ACXAM/M (7,0 g).
A fração E7-ACXAM/DA(1,7 g) foi submetida à cromatografia em Sephadex LH-
20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), após dissolução em 5 mL de MeOH. Foram geradas 15 frações de 10
mL utilizando-se MeOH como fase móvel. Monitoramento por CCD permitiu a reunião das
frações semelhantes: f3-4, f5-7, f9-13. A fração f8 (120 mg) foi solubilizada em 1,0 mL de
H2O/MeOH 20% e purificada através de um cartucho de SPE (500 mg). Foram coletadas
AU
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00
4,737,87
5,56
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
294
frações de 3 mL, eluídas com H2O/MeOH 20% (f1-2), H2O/MeOH 50% (f3-4), MeOH (f5). A
subfração f8/5 (20,8 mg), sólido viscoso marrom denominado ACX-2, foi analisada por
técnicas espectrométricas, a partir das quais se chegou à estrutura da amburanina B.
Fluxograma 8- Metodologia de isolamento de duas substâncias isoladas do xilopódio das plantas jovens de A. cearensis (7 meses).
E7-ACX
E7-ACXQ
F3
Partição
E7-ACXA
Sephadex
Cartucho C18
Pico 3
ACX-2 Amburanina B
F8
ACX-1 Ác. cumarínico
glicosilado
HPLC
Partição
F-butanólica
Silica
E7-ACXAM
Partição
F5
E7-ACXAM/DA
Sephadex
10.1.8.5. Partição do extrato etanólico E7-ACPa
29,8 g do sólido verde-escuro E7-ACPa, aproximadamente metade da massa de
extrato obtida, foi submetida a sucessivas partições com H2O (200 mL)/AcOEt (3 x 120 mL),
e posteriormente com MeOH (200 mL) + H2O (50 mL)/ CH2Cl2 (3 x 120 mL), adotando-se
metodologia semelhante à aplicada para o extrato E7-ACX. As frações aquosa e acetato de
etila, oriundas da primeira partição, foram pesadas e denominadas E7-ACPaQ (10,5 g) e E7-
ACPaA (18,7 g), respectivamente. A segunda partição forneceu 5,2 g de fração metanólica
(E7-ACPaAM-sólido escuro) e 12,2 g de fração diclorometano (E7-ACPaAD-sólido verde).
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
295
Fluxograma 9- Partição do extrato etanólico da parte aérea da planta jovem (7 meses) de A. cearensis.
10.1.8.6. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD
A fração E7-ACPaAD (12,2 g) foi misturada com gel de sílica numa proporção 1:1 e
pulverizada em gral de porcelana, sendo acondicionada sobre 20 g de gel de sílica numa
coluna de 500 mL. Foram empregados os seguintes eluentes: hexano(f1- 100mL), hexano/
CH2Cl2 10% (f2- 300 mL), hexano/ CH2Cl2 25% (f3- 300 mL), hexano/ CH2Cl2 50% (f4- 700
mL), hexano/ CH2Cl2 75% (f5- 400 mL), CH2Cl2 (f6- 500 mL), CH2Cl2 /AcOEt 50% (f7- 500
mL), AcOEt (f8- 300 mL) e MeOH (f9- 200 mL). As frações f3 à f6 foram reunidas, após
comparação por CCD.
10.1.8.7. Cromatografia em Sephadex LH-20 de E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g)- Isolamento de
ACPa-1 (ácido vanílico)
A fração E7-ACPaAD(3-6) (1,8 g), sólido verde-claro, foi dissolvida em 10 mL de
MeOH e submetida à cromatografia em Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm), resultando em
15 frações de 30 mL. A coluna, eluída com MeOH, foi monitorada por cromatoplaca,
possibilitando a reunião das frações f2-3, f4-6, f9-13. A fração f2-3 foi tratada com CH2Cl2 e
filtrada, resultando no isolamento de um sólido branco denominado ACPa-1 (258,8 mg), cujo
rf em CCD foi idêntico ao de ACCE-4, embora que com aspecto físico distinto. No entanto, a
Extrato etanólico E7-ACPa (29,8 g)
Fração acetato de etila E7-ACPaA (18,7 g)
Fração aquosa E7-ACPaQ (10,5 g)
Fração hidrometanólica E7-ACPaAM (5,2 g)
Fração diclorometano E7-ACPaAD (12,2 g)
1. H2O (200 mL) 2. AcOEt (3 x 120 mL)
1. MeOH (200 mL) + H2O (50 mL) 2. CH2Cl2 (3 x 120 mL)
Liofilização/Rotaevaporação Na2SO4/Rotaevaporação
concordância dos sinais dos espectros de RMN 1H das frações ACPA-1 e ACCE-4 permitiu
identificá-las como sendo o ácido vanílico.
10.1.8.8. Cromatografia em sílica de E7-ACPaAD(4-6)-Isolamento de ACPA-2-4
(cumarina, e aiapina
Numa coluna de 125 mL contendo 40,0 g de gel de sílica, a fração E7-ACPaAD(4-6)
(380 mg) foi adsorvida com 1,5 g de gel de sílica e eluída com: hexano/ CH2Cl2 80% (f1),
CH2Cl2 (f2-4), CH2Cl2 /AcOEt 10% (f5-7), CH2Cl2 /AcOEt 25% (f8-10), CH2Cl2 /AcOEt
40% (f11-12), CH2Cl2 /AcOEt 50% (f13-14), AcOEt 10% (f15), MeOH (f16). As frações
foram coletadas em alíquotas de 100mL e reunidas após análise por CCD.
A fração f1 (104 mg), cristais brancos chamados ACPa-2, foi quimicamente
identificada após co-eluição com a fração ACS-1 (cumarina) em cromatoplaca, na qual suas
manchas apareceram superpostas.
Aplicando-se a mesma técnica para a fração f10 (5,4 mg), tendo ACCE-7
(isocampferídio) como padrão de referência, descobriu-se que as frações eram quimicamente
idênticas. A fração f10, sólido amarelo, passou a ser chamada ACPa-3.
A cromatoplaca da fração f3-4 (62,5 mg) apresentou somente uma mancha (azul-
fluorescente) ao ser visualizada sob UV, sendo intitulada ACPa-4 (cristais incolores).
Análises espectroscópicas revelaram a estrutura da cumarina aiapina.
10.1.8.9. Isolamento de ACPa- 5 e ACPa-6 (ácido p-hidroxi benzóico e amburosídio B)
Dissolvida em 0,5 mL de H2O, a fração E7-ACPaAD(3-6)(9-13) (52,2 mg) foi
adicionada a um cartucho de SPE (500 mg), já ativado e equilibrado com a fase móvel. O
cartucho foi eluído com H2O (f1-2), H2O/MeOH 30% (f3-4) e MeOH (f5), recolhendo-se
alíquotas de 2 mL. As frações f1 (5 mg) e f4 (23 mg), sólidos marrons viscosos, apresentaram
apenas uma mancha na cromatoplaca, revelada por exposição a vapores de iodo. Ambas as
frações, denominadas ACPa-5 (f1) e ACPa-6 (f4), foram identificadas por comparação dos
seus dados espectrais com os já disponíveis na literatura, levando às proposições das
estruturas referentes ao ácido p-hidroxi benzóico e ao amburosídio B, respectivamente.
10.1.8.10. Fracionamento de E7-ACPaQ
Uma alíquota de 5,0 g da fração E7-ACPaQ (10,5 g), solubilizada em 12 mL de
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
296H2O/MeOH 50%, foi aplicada numa coluna de Sephadex LH-20 (60 g- ∅int= 3,5 cm) e eluída
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
297
com H2O/MeOH 50%, resultando na obtenção de 10 frações de 20 mL. Foram reunidas as
frações 1 a 4, totalizando 3,5 g de um material marrom viscoso, cujo espectro de RMN 1H
permitiu caracterizá-lo como sendo uma mistura de açúcares.
A fração f7 (137 mg) foi dissolvida em 1 mL de H2O e cromatografada num
cartucho de SPE (500 mg), utilizando-se como fase móvel H2O (f7/1), seguida de H2O/MeOH
20% (f7/2-3), H2O/MeOH 30% (f7/4-5) e H2O/MeOH 50% (f7/6). Colhidas em alíquotas de 3
mL, as frações da coluna foram monitoradas por CCD, através da qual verificou-se que a
fração f7/4 (30 mg) era quimicamente equivalente à fração ACPa-6 (amburosídio B). As
subfrações eluídas com H2O/MeOH 20%, f7/2 e f7/3, foram reunidas e purificadas por HPLC,
como descrito abaixo.
10.1.8.11. Purificação por HPLC- Isolamento de E7-ACPa-7 (ácido cumárico
glicosilado)
A fração E7-ACPaQ(7)(2-3) (65 mg) foi purificada num aparelho de HPLC,
injetando-se alíquotas de 200 µL de solução aquosa de H3PO4/MeOH 20%. A separação,
realizada numa coluna de fase reversa, foi efetuada com um gradiente H3PO4/MeOH,
variando de 30 para 50% em 10 min. Foram obtidos 2 picos (Fig. 169), detectados a 254 nm e
registrados com tempos de retenção de 7,20 min (pico 1) e 9,07 min (pico 2). O pico 1
forneceu 24 mg de um sólido branco, denominado ACPa-7 e identificado por métodos
espectrométricos como o ácido cumárico glicosilado.
Figura 169- Cromatograma de HPLC da fração E7-ACPaQ(7)(2-3)
ACPAQ(7)(2-3)- ác. E cumárico glicos
AU
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
Minutes0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
9,07
7,20
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
298
Fluxograma 10- Metodologia de isolamento das 7 substâncias isoladas da parte aérea das plantas jovens de A. cearensis (7 meses).
E7-ACPa
E7-ACPaQ
F7
Partição
E7-ACPaA
Sephadex
Cartucho C18
Pico 1
F1
ACPa-6 Amburosídio B
HPLC
F2-3
E7-ACPaAD
Partição
F9-13 F2-3
Sephadex
F4
ACPa-7 Ác. Cumárico
glicosilado
Cartucho C18
F4-6
ACPa-1- Ác. Vanílico
F1 F4 F10F3-4
ACPa-2 Cumarina
ACPa-3 IsocampferídioACPa-4
Aiapina
ACPa-5 Ac. Hidroxi-
benzóico
ACPa-6 Amburosídio B
Sílica
10.2. Validação do método de quantificação de 4 substâncias presentes nos extratos de
Amburana cearensis
10.2.1. Preparo das Soluções
Preparação da solução-estoque
A solução-estoque foi preparada, em triplicata, pela dissolução de 5,0 mg de quatro
substâncias puras (ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e amburosídio), isoladas das
cascas do caule de A. cearensis, em 10,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH=
3)/MeOH 20%, resultando numa concentração de 500 µg/mL. A solução-estoque foi filtrada
através de membranas de teflon.
Preparação das soluções padrões e soluções de controle de qualidade
A partir de cada solução-estoque, foram obtidas seis soluções padrões (60, 40, 20,
10, 5 e 1 µg/mL) e três soluções de controle de qualidade (50, 30 e 8 µg/mL), através de
diluições com volumes apropriados, retirados apenas da primeira solução.
Alíquotas de 2,0 mL das soluções obtidas foram tratadas por cartuchos de SPE (100
mg) e eluídas com porções de 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH
80%, mantendo-se as concentrações iniciais.
Preparação das amostras
Foram preparadas três soluções de 500 µg/mL de cada um dos seguintes extratos
etanólicos de A. cearensis: cascas do caule (ACCE); sementes (ACS); xilopódios de
espécimens com 2 (E2-ACX), 4 (E4-ACX), 7 (E7-ACX) e 9 (E9-ACX) meses de idade,
partes aéreas de espécimens com 2 (E2-ACPa), 4 (E4-ACPa), 7 (E7-ACPa) e 9 (E9-ACPa)
meses de idade, e misturas artificialmente reconstituídas dos xilopódios com as partes aéreas
de mesmas idades (E2-ACX+PA, E4-ACX+PA, E7-ACX+PA, E9-ACX+PA). Cada amostra
foi produzida através da dissolução de 5,0 mg de extrato em 10,0 mL de solução aquosa de
Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH 20%, totalizando 14 amostras, as quais foram posteriormente
filtradas através de membranas de teflon.
Todas as amostras, em volumes de 2,0 mL, foram aplicadas em cartuchos de SPE e
eluídas com alíquotas 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH 80%. Exceto
o extrato ACS, cujo volume aplicado foi de 500 µL, implicando numa concentração final
correspondente a 1/4 da solução original.
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
299
Três amostras de xarope de cumaru, fitoterápico produzido com as cascas do caule
de A. cearensis, foram preparadas pela aplicação de alíquotas de 400 µL do xarope num
cartucho de SPE (100 mg). Eluições com 10 mL de H2O, a fim de se remover a sacarose,
foram sucedidas por adições de volumes de 2,0 mL de solução aquosa de Et3N-H3PO4 (pH=
3)/MeOH 80%, resultando em amostras diluídas a 1/5 da concentração inicial.
10.2.2. Condições analíticas
As soluções padrões e de controle de qualidade e as amostras (extratos e xarope)
foram analisadas por HPLC (loop=20 µL, Fig. 170, p. 300), em triplicata. As separações
foram realizadas através de uma coluna de fase reversa (4,6 x 250 mm, 5 µm), utilizando-se
um fluxo de 1mL/min de um gradiente composto por Et3N-H3PO4 (pH= 3)/MeOH, variando
de 20% para 50% de MeOH em 15 min de corrida.
Curva de calibração
A curva de calibração foi construída a partir das áreas dos picos obtidas pela injeção
de soluções de padrões externos (ácido protocatecuico, ácido vanílico, cumarina e
amburosídio), nas concentrações de 1, 5, 10, 20, 40 e 60 µg/mL.
Recuperação
A recuperação, na etapa de preparação das amostras, foi avaliada através da injeção
das soluções de controle de qualidade, nas concentrações de 8, 30 e 50 µg/mL, em
quintuplicata. Os fatores de recuperação de cada substância foram fornecidos pelas razões
entre as áreas dos picos obtidas pelas soluções tratadas por cartucho de SPE e as as áreas dos
picos registradas pelas soluções não-tratadas.
Precisão
A precisão do método foi examinada por comparação das concentrações obtidas para
soluções de controle de qualidade em níveis baixos (8 µg/mL), médios (30 µg/mL) e altos (50
µg/mL), sendo a repetitividade determinada ao longo de um dia e durante três dias não-
consecutivos.
Exatidão
A exatidão do método foi mensurada através da comparação das concentrações
fornecidas pela curva de calibração, para cada substância, em relação às concentrações, já
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
300
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
301
conhecidas, das soluções de controle de qualidade (valores de referência), em três níveis
distintos(baixos- 8 µg/mL, médios- 30 µg/mL e altos- 50 µg/mL).
AU
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Minutes1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 6,00 7,00 8,00 9,00 10,00 11,00 12,00 13,00 14,00 15,00
A B
CD
Figura 170- Cromatograma dos quatro padrões (conc.= 60 µg/mL) utilizados na validação de amostras de A. cearensis: A- ácido protocatecuico, B- ácido vanílico, C- cumarina e D- amburosídio A.
11. CONCLUSÃO
A pesquisa química de A. cearensis resultou no isolamento de:
1- Cumarina aiapina, dos ácidos fenólicos: ác. vanílico, ác. p-hidroxi-benzóico, ácido
(E)-o-cumárico glicosilado, seu estereoisômero ácido (Z)-o-cumárico glicosilado e sua
aglicona livre ácido (E)-o-cumárico.
2- Protocatecuato de 6-cumarila, substância inédita na literatura, e 6-hidroxi-cumarina
representam uma relevante descoberta devido à rara ocorrência deste tipo de composto na
natureza. Acredita-se que plantas, capazes de sintetizarem cumarinas oxigenadas apenas na
posição 6, apresentam um intrigante caminho biogenético, alternativo à rota metabólica
comumente encontrada nos organismos vivos.
3- Amburosídio A e B, já relatados anteriormente, e derivados do amburosído A,
inéditos na literatura: ferulato de 6”-amburosila, protocatecuato de 6”-amburosila, galato de
6”-amburosila, acetato de 6”-amburosila, sinapato de 6”-amburosila e vanilato de 6”-
amburosila.
4- Por último, a prospecção química revelou uma abundante presença de flavonóides,
substâncias que possuem comprovadas atividades farmacológicas: o flavonol quercetina, a
isoflavona formononetina, e os biflavonóides amburanina A e B, registrados pela primeira vez
na literatura.
A metodologia desenvolvida nas análises por HPLC, devidamente validada, poderá
ser adotada, no futuro, no controle de qualidade de produtos que utilizam A. cearensis em
suas formulações, podendo ser aplicado para verificar a autenticidade da matéria-prima,
estabilidade ou para quantificação dos princípios ativos. Este tipo de análise visa garantir a
eficácia e segurança do produto ao usuário, além de funcionar como certificado de qualidade
para a empresa fabricante.
A atividade alelopática demonstrada pelo extrato aquoso das sementes de A.
cearensis é uma prova científica do potencial bio-herbicida desta planta, a qual poderá ser
utilizada como uma arma química natural, de baixo custo e ecologicamente correta no
combate à ervas daninhas, possibilitando aumento na produtividade agrícola sem provocar
danos à saúde humana e ao meio-ambiente.
Os notáveis avanços no conhecimento químico e farmacológico de A. cearensis são
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
302
frutos de árduos esforços imprimidos por uma equipe multidisciplinar na pesquisa científica
Aspectos Químicos do Estudo Interdisciplinar (Química-Agronomia-Farmacologia) de Amburana cearensis A.C. Smith
303
desta espécie, ao longo de mais de uma década. Paulatinamente, estas descobertas estão
contribuindo para agregar mais segurança e garantir eficácia ao fitoterápico de A. cearensis,
cuja aceitação pela população se torna cada vez mais crescente.
No entanto, diante da ameaça de extinção de A. cearensis pelo extrativismo predatório,
torna-se imprescindível a adoção de um modelo de exploração auto-sustentável para a
espécie, tal como proposto em nossos estudos, no qual a planta adulta silvestre seja
substituída por plantas jovens cultivadas, já que em testes farmacológicos pré-clínicos,
extratos de plantas jovens com 7 e 9 meses de cultivo apresentaram tanto efeitos
antiedematogênicos (edema de pata induzido por carragenina) como antinociceptivos
(nocicepção induzida por formalina) equivalentes aos do extrato da planta adulta. Isto
significa que, a partir de 7 meses de cultivo, plantas jovens de A. cearensis já exibem
atividades antiinflamatória e analgésica similares às da planta adulta silvestre. As evidências
encontradas neste estudo garantem ser farmacologicamente viável a substituição da planta
adulta por espécimens jovens.
Desta forma, a produção industrial do fitoterápico de A. cearensis seria economicamente
viável, pois a indústria disporia de uma fonte de matéria-prima renovável e obtenível a curto
prazo, além de se assegurar a preservação da espécie. Os espécimens preservados poderiam
fornecer sementes para o cultivo de novas mudas, as quais poderiam ser aproveitadas na
Agricultura, na produção de um bio-herbicida eficiente e inofensivo à saúde humana e ao
meio-ambiente.
A diversidade de aplicações de A. cearensis atesta a importância medicinal e econômica
desta planta cujo aproveitamento racional poderá, no futuro, render vultosas divisas e
empregos para o Estado do Ceará, através de investimento tecnológico.