UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO
Verônica Leite de Holanda Gomes
ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO
METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL.
Rio de Janeiro 2016
Verônica Leite de Holanda Gomes
ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS
INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE JANEIRO, BRASIL.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos em Engenharia Química,
Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Orientadora: Karen Signori Pereira, D.Sc.
Rio de Janeiro, RJ
2016
Verônica Leite de Holanda Gomes
ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES EM NÉCTARES COMERCIAIS INDUSTRIALIZADOS DE LARANJA E UVA NA REGIÃO METROPOLITANA DO ESTADO DO RIO DE
JANEIRO, BRASIL.
Dissertação de Mestrado apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos em Engenharia Química,
Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em Engenharia Química.
Aprovada em 29 de setembro de 2016.
_____________________________________________ Karen Signori Pereira, D.Sc., UFRJ
_____________________________________________
Carla da Silva Carneiro, D.Sc., UFRJ
_____________________________________________
Maria Antonieta Peixoto Gimenes Couto, D.Sc., UFRJ
_____________________________________________ Maria Carmela Kasnowski Holanda Duarte, D.Sc., UFF
Dedico
A minha amada avó Linéa (in memoriam) que me criou e fez de mim quem sou hoje.
A minha mãe Nany Leite e ao meu irmão Caíque que são partes fundamentais da
minha vida. E a minhas tias Linelucia, Linelaura e Linelice, pelo amor e carinho
dedicados a mim.
Agradecimento
Agradeço a Deus por tudo o que Ele tem feito na minha vida, pela saúde, pela oportunidade de realizar uma pós-graduação, e pelas pessoas maravilhosas que colocou na
minha vida ao longo desta jornada. A minha família, principalmente minha mãe (Nany) e minhas tias (Luca, Lala e Lili) que
sempre me incentivaram e apoiaram a estudar e ser uma pessoa melhor a cada dia. A minha avó Linéa, que sei que onde quer que ela esteja estará sempre olhando por mim. Também aos
meus tios, minhas primas, meus primos, e meus sobrinhos e cunhado gringo, pelo apoio e carinho dedicados a mim nesta etapa. A minha prima-irmã Babi pela compreensão por todas
as vezes que não pude estar presente na vida dela e dos meus sobrinhos/afilhados, Beatriz e Jonh! Em especial ao meu irmão Caíque que aguentou todo o meu mal-humor e estresse,
demonstrando compreensão e carinho! A minha grande e melhor amiga Shirley Orozco, por estar comigo nos bons e maus
momentos desta etapa, sempre com uma palavra de ânimo e direção, me ajudando a manter o prumo e não perder o foco!
As minhas amigas Avassaladoras (Ana Célia, Bruna, Caroline, Daniele, Katiane, Michele e Rita) que sempre me incentivaram a continuar com meus estudos e crescer
profissionalmente, além da paciência em me ouvirem. A minha amiga Valéria Borges que também sempre me incentivou a continuar os estudos e me indicou o programa de pós-graduação ao qual estou. E a minha amiga Rachel
que sempre me cobrou ter uma titulação. Aos amigos Flávio, Gabi e Romulo, pelo apoio e companheirismo nos momentos finais
dessa jornada. As minhas amigas de turma Ariane, Camilla e Natalia, pelas boas risadas que demos ao
longo da realização das disciplinas e pelo conhecimento que construí ao lado de vocês. Em especial a minha amiga e meu anjinho Camilla, que conheci melhor ao longo do curso e que
sempre me ajudou como um anjo da guarda, se preocupando comigo, e acabou se tornando parte importante dessa minha realização, além de me apresentar a minha orientadora.
A minha orientadora Karen pelo apoio e compreensão total em todos os momentos , mesmo com todas as minhas dificuldades de tempo ela foi imprescindível na concretização
desse sonho. Agradeço também por ter aberto as portas do seu laboratório para mim, me deixando muito à vontade para trabalhar. Muito obrigada por tudo!!
À equipe do laboratório MicroAlim pela compreensão todas as vezes que eu precisava ocupar um equipamento por um mês, atrapalhando meio mundo. E ao João pelo suporte nos
experimentos e pelas conversas de fim de tarde.
A Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ) pela oportunidade de ingressar no programa de pós-graduação.
E a todos que contribuíram de determinada maneira para que eu conseguisse chegar onde cheguei, meus sinceros agradecimentos.
“Por vezes sentimos que aquilo que fazemos não
é senão uma gota de água no mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse uma gota”.
(Madre Teresa de Calcuta)
RESUMO
GOMES, Verônica Leite de Holanda. Isolamento de fungos termorresistentes em néctares comerciais industrializados de laranja e uva na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, Brasil. Rio de Janeiro, 2016. Dissertação (Mestrado em Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
Os néctares são bebidas à base de frutas, sendo susceptíveis ao processo de deterioração por micro-organismos, principalmente por aqueles que resistem ao processo
térmico de fabricação. Embora os fungos sejam sensíveis ao calor, algumas espécies podem produzir estruturas termorresistentes, como ascósporos, que podem sobreviver ao
tratamento térmico em produtos industrializados e se tornarem possíveis deteriorantes dos mesmos. O presente estudo teve como objetivo avaliar a presença de fungos
termorresistentes em néctares industrializados nos sabores laranja, uva e misto de uva e maçã, comercializados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro. Foram analisadas
três marcas de néctar de laranja, três de néctar de uva, e uma de néctar misto de uva e maçã destinada ao público infantil, identificadas como X, Y e Z, feitas em triplicata, totalizando 63
amostras. As análises das amostras foram realizadas por meio de medição do pH, choque térmico do néctar seguido de incubação direta em frascos de Erlenmeyer e plaqueamento com meio de cultura à base de batata (Ágar Batata Dextrose) na proporção de 1:1. Tanto a
incubação direta quanto o plaqueamento do néctar ocorreram num período de trinta dias em estufa com temperatura controlada à 30 °C, com verificação de possível crescimento a cada
sete dias. Os valores de pH encontrados nos néctares variaram de 2,42 a 3,57 (± 0,32). Após o período de incubação, não foi observado crescimento fúngico em nenhum dos frascos de
Erlenmeyer. No plaqueamento, houve crescimento em dez das 315 placas analisadas, sendo sete placas de néctar sabor laranja, das marcas X e Z, duas de sabor misto de uva e maçã, da
marca X, e uma de uva, da marca Z, totalizando quinze isolados fúngicos. Apenas a marca Y não teve crescimento em qualquer de suas amostras. Esses quinze isolados foram
identificados macro e microscopicamente em nível de gênero, sendo sete isolados (43,7%) pertencentes ao grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” e oito (53,3%) ao grupo “Penicillium
e gêneros relacionados”.
Palavras-chaves: Fungos termorresistentes, Néctar de Laranja, Néctar de Uva.
ABSTRACT
GOMES, Verônica Leite de Holanda. Isolation of heat-resistant fungi in orange and grape industrialized trading nectars in metropolitan region of Rio de Janeiro State, Brazil. Rio de Janeiro, 2016. Dissertation (Master's degree in Tecnologia de Processos Químicos e Bioquímicos) – Escola de Química, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2016.
Nectars are beverages from fruit, are susceptible to the process of deterioration by micro-organisms, especially by those who resist thermal manufacturing process. Although
fungi are sensitive to heat, some species can produce heat resistant structures , such as ascospores, which can survive the heat treatment in industrial products and become their
possible spoilage. This study aimed to evaluate the presence of heat-resistant fungi in industrialized nectars in orange, grape and mixed grape and apple flavors, marketed in the
metropolitan region of Rio de Janeiro State. Were analyzed three marks from orange nectar, three from grape nectar, and one from mixed nectar grape and apple aimed at children,
identified as X, Y and Z, made in triplicate, totalizing 63 samples. Analyzes of the samples were performed by measurement of pH, heat shock nectar followed by direct incubation in
Erlenmeyer flasks and plating with potato medium for culture (Potato Dextrose Agar) in a ratio of 1: 1. Direct incubation and plating the nectar occurred in thirty days in an incubator with temperature controlled at 30 °C, possible growth were checked every seven days. The pH
values founded in nectars ranged from 2.42 to 3.57 (± 0.32). After incubation, no fungal growth was observed in any of the Erlenmeyer flasks. In plating, there was growth in ten of
315 plaques analyzed, seven plates of orange-flavored nectar, brands X and Z, two mixed flavor of grape and apple, brand X, and one grape flavor, brand Z, totaling fifteen fungal
isolates. Only brand Y had no growth in any of its samples. These fifteen isolates were identified macroscopically and microscopically at the genus level, with seven isolates (43.7%)
belonging to the group "Aspergillus and their Teleomorphs" and eight (53.3%) to "Penicillium and related genres".
Keywords: Heat-resistant fungi, Orange Nectar, Grape Nectar.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1. Condições para identificação macro e microscópica.................................... 41 Quadro 2. Dados da literatura referente aos fungos termorressistentes isolados de
bebidas à base de frutas................................................................................................
54 Gráfico 1. Consumo de sucos e néctares por região, de 2011 a 2015............................ 17
Gráfico 2. Consumo de sucos e néctares no mercado brasileiro, de 2009 a 2012.......... 18 Figura 1. Esquema do ciclo de vida geral do fungo...................................................... 31
Figura 2. Levedura em brotamento. Micrografia de Saccharomyces cerevisae em diferentes fases do brotamento....................................................................................
32
Figura 3. Características da hifa fúngica. (a) Hifa septada, com septo. (b) Hifa cenocítica, sem septo. (c) Hifa crescendo a partir do esporo.........................................
32
Figura 4. Ilustração das estruturas do gênero Aspergillus............................................. 34 Figura 5. Ilustração das estruturas do gênero Penicillium............................................. 35
Figura 6. Diagrama da metodologia.............................................................................. 40 Figura 7. Técnica de microcultivo em lâmina e lamínula............................................... 41
Figura 8. Análise do crescimento fúngico em Erlenmeyer............................................. 45 Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA............ 46
Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”.........................................................................................................
48
Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e
gêneros relacionados”..................................................................................................
50
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Valores de pH das amostras de néctares, com média e desvio padrão para cada marca analisada....................................................................................................
43
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABIR Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e Bebidas Não Alcoólicas AIJN European Fruit Juice Association
ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária BDA Batata Dextrose Agar
BFP Boas Práticas de Fabricação CITRUS BR Associação Nacional de Exportadores de Sucos Cítricos
CYA Czapeck Yeast Agar G25N 25% Glycerol Nitrate Agar
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística MAPA Ministério de Agricultura, Pecuária e Abastecimento
MEA Malt Extratc Agar OIV Organização Internacional da Vinha e do Vinho
RDC Resolução da Diretoria Colegiada UFC Unidade Formadora de Colônia
UE União Europeia UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro
USDA United States Department of Agriculture
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO............................................................................................................ 13 2 OBJETIVOS................................................................................................................. 14
2.1 OBJETIVOS GERAIS.................................................................................................. 14 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.......................................................................................... 14
3 REVISÃO..................................................................................................................... 15 3.1 BEBIDAS À BASE DE FRUTAS.................................................................................... 15
3.2 MERCADOS MUNDIAL E NACIONAL DE BEBIDAS Á BASE DE FRUTAS....................... 17 3.2.1 Laranja................................................................................................................. 19
3.2.2 Uva....................................................................................................................... 20 3.3 MICROBIOLOGIA DE BEBIDAS Á BASE DE FRUTAS................................................... 22
3.3.1 Microbiologia de polpas de fruta......................................................................... 23 3.3.2 Microbiologia de néctares e sucos de fruta......................................................... 25
3.3.3 Principais fungos em frutas e bebidas à base de frutas....................................... 30 3.4 FUNGOS.................................................................................................................. 31
3.4.1 Características gerais........................................................................................... 31 3.4.2 Classificação taxonômica.................................................................................... 33
3.4.2.1 grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”............................................................ 33 3.4.2.2 grupo “Penicillium e gêneros relacionados”..................................................... 34 3.4.3 Fungos termorresistentes................................................................................... 35
3.4.4 Micotoxinas e Fungos Termorresistentes........................................................... 36 4 METODOLOGIA.......................................................................................................... 38
4.1 AMOSTRAS DE NÉCTARES....................................................................................... 38 4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES................................................... 38
4.3 MEDIÇÃO DO pH..................................................................................................... 40 4.4 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS TERMORRESISTENTES ISOLADOS........ 40
4.5 COMPARAÇÃO DOS FUNGOS ENCONTRADOS COM OS DESCRITOS NA LITERATURA..................................................................................................................
42
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................................... 43 5.1 ANÁLISE DO pH DOS NÉCTARES............................................................................... 43
5.2 CRESCIMENTO E ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES........................ 45 5.3 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS ISOLADOS DOS NÉCTARES................... 47
6 CONCLUSÕES............................................................................................................. 55 7 CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................................ 56
8 REFERÊNCIAS............................................................................................................. 57
APÊNDICE A – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR LARANJA..................................... 64 APÊNDICE B – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR UVA............................................. 65
APÊNDICE C – CÓDIGO PARA AS MARCAS DE SABOR MISTO DE UVA E MAÇÃ............... 66 APÊNDICE D – IDENTIFICAÇÃO E ORIGEM DOS ISOLADOS............................................. 67
ANEXO A – FÓRMULA DO MEIO DE CULTURA BATATA DEXTROSE ÁGAR (BDA)............ 68 ANEXO B – MEIOS DE CULTURA PARA IDENTIFICAÇÃO................................................. 69
ANEXO C – CORANTE PARA IDENTIFICAÇÃO.................................................................. 70 ANEXO D – FICHA DE IDENTIFICAÇÃO - CHAVE GERAL PARA FUNGOS EM ALIMENTOS. 71
13
1 INTRODUÇÃO
A alimentação adequada e balanceada é um dos aspectos fundamentais para se ter
qualidade de vida, além da prática de atividades físicas . E essa busca pela qualidade de vida
tem sido cada vez maior nos últimos tempos, levando ao consumo de produtos alimentícios
com apelo de saudabilidade, como, por exemplo, o consumo de néctares comerciais à base
de frutas em substituição aos refrigerantes.
Os alimentos derivados de frutas são bastante susceptíveis à deterioração por micro-
organismos, como os fungos, principalmente em frutas que crescem próximas ao solo, como
a uva. Com a maturação a fruta fica mais susceptível a entrada do fungo, pois a casca se torna
mais macia, o que facilita essa entrada.
Os fungos descritos como filamentosos apresentam pouca resistência ao calor, sendo
facilmente destruídos por meio de processos térmicos, que são comumente utilizados na
produção de vários alimentos, inclusive naqueles derivados de frutas. Porém algumas espécies
podem produzir estruturas termorresistentes na natureza, os esporos, que podem
permanecer em estado de latência nos alimentos, mesmo após processos térmicos. Além
disso, também podem ser ativados após exposição a altas temperaturas, podendo ocasionar
a deterioração do alimento durante o período de estocagem.
Com base na tendência nacional e mundial, o presente estudo propôs o isolamento e
a identificação em gênero de fungos termorresistentes em néctares comerciais
industrializados nos sabores laranja e uva, adquiridos na região metropolitana do Estado do
Rio de Janeiro.
14
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a ocorrência de fungos termorresistentes em amostras de néctares
industrializados nos sabores laranja, uva e misto de uva e maçã, comercializados na região
metropolitana do Estado do Rio de Janeiro.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- Isolar os fungos termorresistentes encontrados;
- Identificar em nível de gênero os fungos termorresistentes encontrados.
15
3 REVISÃO
3.1 BEBIDAS À BASE DE FRUTAS
O Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento (MAPA), por meio do Decreto
nº 6.871, de 4 de junho de 2009, regulamenta a Lei nº 8.918, de 14 de julho de 1994, sobre os
processos de padronização, classificação, registro, inspeção, produção, fiscalização e comércio
de bebidas. E essa lei define bebida como:
Art. 2º Para os fins deste Regulamento, considera -se: [...]
II bebida: o produto de origem vegetal industrializado, destinado à ingestão humana em estado líquido, sem finalidade medicamentosa ou terapêutica; III também bebida: a polpa de fruta, o xarope sem finalidade medicamentosa ou terapêutica, os preparados sólidos e l íquidos para bebida, a soda e os fermentados
alcoólicos de origem animal, os destilados alcoólicos de origem animal e as bebidas elaboradas com a mistura de substâncias de origem vegetal e animal; (BRASIL, 1994)
Ainda de acordo com a Lei nº 8.918/94, nos Incisos I e II do Art. 12º, a bebida pode ser
classificada como não-alcoólica, quando a graduação alcoólica não ultrapassa 0,5% em volume
de álcool etílico potável, a 20 °C, ou alcóolica, quando a graduação alcoólica estiver acima de
0,5% e até 54% em volume de álcool etílico potável, também a 20 °C.
As bebidas não-alcoólicas podem ser classificadas como suco ou sumo, polpa de fruta,
água de coco, néctar, refresco, refrigerante, soda, água tônica, xarope, preparado líquido,
preparado sólido, chá pronto para consumo, bebida composta de fruta, polpa de fruta ou
extrato vegetal, e extrato de guaraná, conforme a Lei nº 8.918/94 (grifo nosso):
Seção II Das Bebidas não-Alcoólicas Art. 18º - Suco ou sumo é a bebida não fermentada, não concentrada [...] e não diluída, destinada ao consumo, obtida da fruta madura e sã, ou parte do vegetal de
origem [...] Art. 19º - Polpa de fruta é o produto não fermentado, não concentrado, obtido de fruta polposa [...] Art. 20º - Água de coco é a bebida obtida da parte l íquida do fruto do coqueiro (Cocus
nucifera) não diluída e não fermentada, extraída e conservada [...] Art. 21º - Néctar é a bebida não fermentada, obtida da diluição em água potável da parte comestível do vegetal ou de seu extrato, adicionado de açúcares,
destinada ao consumo direto. § 1°
16
- Quando adicionado de dióxido de carbono, o néctar será denominado “néctar de
...”, acrescido do nome da fruta ou vegetal, gaseificado. § 2° - Néctar misto é a bebida obtida da diluição em água potável da mistura de partes
comestíveis de vegetais, de seus extratos ou combinação de ambos, e adicionado de açúcares, destinada ao consumo direto. Art. 22º - Refresco ou bebida de fruta ou de vegetal é a bebida não fermentada, obtida pela diluição, em água potável, do suco de fruta, polpa ou extrato vegetal de
sua origem, com ou sem adição de açúcares. [...] Art. 23º - Refrigerante é a bebida gaseificada, obtida pela dissolução, em água potável, de suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionada de açúcar. [...] Art. 24º - Soda é a água potável gaseificada com dióxido de carbono, com pressão
superior a duas atmosferas, a vinte graus Celsius, podendo ser adicionada de sais minerais. [...] Art. 25º - Água tônica de quinino é o refrigerante que contiver, obrigatoriamente, de
três a sete miligramas de quinino ou seus sais [...] por cem mili l itros de bebida. Art. 26º - Xarope é o produto não gaseificado, obtido pela dissolução, em água potável, de suco de fruta, polpa ou parte do vegetal e açúcar [...] Art. 27º - Preparado líquido ou concentrado líquido para refresco é o produto que
contiver suco, polpa ou extrato vegetal de sua origem, adicionado de água potável [...] com ou sem açúcares. [...] Art. 29º - Preparado líquido ou concentrado líquido para refrigerante é o produto que contiver suco ou extrato vegetal de sua origem, adicionado de água potável [...]
com ou sem açúcares. [...] Art. 31º - Preparado sólido para refresco é o produto à base de suco ou extrato vegetal de sua origem e açúcares [...]
Art. 32º - Chá pronto para consumo é a bebida obtida pela maceração, infusão ou percolação de folhas e brotos de várias espécies de chá do gênero Thea (Thea sinensis e outras), [...] podendo ser adicionado de outras substâncias de origem vegetal e de açúcares. [...]
Art. 34º - Bebida composta de fruta, de polpa ou de extrato vegetal é a bebida obtida pela mistura de sucos, polpas ou extratos vegetais [...] com produto de origem animal, tendo predominância em sua composição de produto de origem vegetal,
adicionada ou não de açúcares. [...] Art. 35º - Extrato de guaraná é o produto resultante da extração dos princípios ativos da semente de guaraná (gênero Paullinia), com ou sem casca, observados os l imites de sua concentração.
(BRASIL, 1994)
As indústrias de bebidas investiram na diversificação de sua linha de produção,
introduzindo produtos como o néctar de fruta, que ganhou espaço no mercado por apresentar
menor preço em relação aos sucos integrais pasteurizados ou reconstituídos (QUEIROZ;
MENEZES, 2005). Mamede et al. (2013) justificaram que a grande expansão da introdução de
sucos e néctares prontos para serem consumidos ocorreu devido a tendência mundial no que
diz respeito ao consumo de bebidas consideradas saudáveis, convenientes e saborosas.
17
3.2 MERCADOS MUNDIAL E NACIONAL DE BEBIDAS À BASE DE FRUTAS
De acordo com o Relatório de Mercado publicado pela Associação Europeia de Sucos
de Frutas (European Fruit Juice Association – AIJN), em 2012, independente da condição
financeira pela qual a União Europeia (UE) se encontrava, o consumo de sucos e néctares era
mantido por consumidores na região, pois essas bebidas são associadas a saúde e bem-estar.
Na busca por produtos de valor econômico mais acessível, “os néctares se beneficiaram em
alguns países pelo fato dos consumidores terem diminuído o consumo de sucos 100% para
economizar”, segundo o relatório de mercado AIJN (2012).
O consumo de suco de fruta e néctar, em âmbito mundial, foi em torno de 48.500
milhões de litros nos anos de 2011 a 2015, conforme os dados publicados no Relatório de
Mercado da AIJN (2012; 2013; 2014; 2015; 2016). Ainda de acordo com esses relatórios,
nesses cinco anos, a UE consumiu em média 10.150 milhões de litros em cada ano, seguida da
América do Norte, com consumo de 9.500 milhões de litros, Europa Ocidental com 9.200
milhões de litros, região Ásia-Pacífico com 7.750 milhões de litros, Leste Europeu com 5.000
milhões de litros, América Latina com 3.500 milhões de litros, e a região da África e do Oriente
Médio com 3.400 milhões de litros (Gráfico 1).
Gráfico 1. Consumo de sucos e néctares por região, de 2011 a 2015. Fonte: AIJN, 2012; 2013; 2014; 2015; 2016.
Esses dados mostram que os maiores consumidores de suco de fruta e néctar são a UE
seguida da América do Norte, porém o maior consumo per capita, nos últimos cinco anos, está
10.150
9.500
9.200
7.750
5.000
3.5003.400
Consumo de Sucos e Néctares por Região, de 2011 a 2015 (em milhões de litros)
U.E. América do Norte
Europa Ocidental Região Ásia-Pacífico
Leste Europeu América Latina
Região da África e do Oriente Médio
18
na América do Norte, com média de 27,2 litros por pessoa, enquanto que na UE, a média de
consumo é de 19,9 litros por pessoa (AIJN, 2012; 2013; 2014; 2015; 2016).
Com o objetivo de traçar um panorama no setor de bebidas no Brasil, Rosa, Cosenza e
Leão (2006) concluíram que, na época, o setor de bebidas como sucos ainda possuía grande
capacidade de expansão nos mercados interno e externo, sendo favorecido pelo
desenvolvimento de novos produtos, que levou a mudança de hábitos, em que antes o suco
seria um bem desnecessário, aumentando o consumo do produto no mercado nacional.
Segundo Associação Brasileira das Indústrias de Refrigerantes e de Bebidas Não
Alcoólicas (ABIR), nos anos entre 2002 e 2009 o consumo de sucos e néctares teve um
aumento de 14,5%, sendo consumidos mais de 463 milhões de litros em 2009 (ABIR, 2010).
Esses números aumentaram em 2010, que, ainda segundo a ABIR, alcançou 10,6% somente
naquele ano, com consumo de 513 milhões de litros (ABIR, 2011). E em 2012 o consumo
estimado foi cerca de 800 milhões de litros (4,5 litro/pessoa/ano) (MAMEDE et al., 2013)
(Gráfico 2).
Gráfico 2. Consumo de sucos e néctares no mercado brasileiro, de 2009 a 2012. Fonte: ABIR, 2010; 2011; MAMEDE et al., 2013.
A ABIR, em fevereiro de 2016, publicou uma notícia sobre a indústria de refrigerantes
no Brasil, que apresentou a menor produção no mês de janeiro desde 2012, com queda de
11,7% em referente ao mesmo mês de 2015. A justificativa para essa queda pode estar no
aumento do consumo de outras bebidas, como sucos e néctares, diz a ABIR (ABIR, 2016).
463513
800
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
2009 2010 2012
Ano
Consumo de Sucos e Néctares no Mercado Brasileiro (milhões de litros)
Consumo de Sucos eNéctares (milhões de litros)
19
No Brasil, o sabor laranja para bebidas como sucos e néctares sempre foi considerado
uma “preferência nacional” até final do século XX. Mas desde 2005 a preferência pelos
diferentes sabores tem sido alterada, e em 2010 a liderança dessa preferência foi pelo sabor
de uva (BRONZATO-JUNIOR, 2011).
Em 2014, Carmo, Dantas e Ribeiro (2014), realizaram uma pesquisa para caracterizar
o mercado consumidor de sucos prontos para o consumo, em Viçosa (MG), e concluíram que
esse mercado ainda apresentava grande potencial a ser explorado, já que a maioria dos
entrevistados costumavam consumir o produto de três a cinco vezes por semana. Sendo os
sabores de laranja e de uva os que apresentaram maior intenção de consumo dentre os
entrevistados.
3.2.1 Laranja
A laranja (Citrus sinensis) é considerada um alimento de alto valor nutricional por
possuir alto teor de carboidratos e de vitamina C (ácido ascórbico), que protege contra
oxidação no meio intracelular pelo alto poder redutor. Além disso, contém elementos e
nutrientes essenciais, como carotenoides, folato, potássio, assim como flavonoides,
hesperidina e narirutina com propriedades hipolipidêmicas, anti-inflamatórias e antioxidantes
(SOUZA, 2014).
Na década de 80, a laranja levou o Brasil ao posto de maior produtor da fruta, sendo a
maior parte de sua produção destinada às indústrias de sucos, destacando-se o suco
concentrado congelado (QUEIROZ; MENEZES, 2005).
Segundo dados do Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (IBGE, 2014) a
produção de laranja atingiu a faixa de mais de 16,4 milhões de toneladas em 2014, o que
equivale a 402,9 milhões de caixas, obtendo um aumento de 0,9% em relação à produção de
2013, tendo o Estado de São Paulo como o principal produtor, responsável por 72% dessa
produção. Sendo a produção nacional aproximada de 16,2 milhões de toneladas em 2015, e a
previsão de produzir em torno de 15,8 milhões de toneladas em 2016 (IBGE, 2016).
Um dos maiores produtores mundial de laranja, os Estados Unidos da América, de
acordo com o relatório do United States Department of Agriculture (USDA), no período 2014-
2015, produziu 6.378 milhões de toneladas de laranja, sendo que o Estado da Flórida produziu
68,3% do total do país (USDA, 2016). Esses dados refletem a redução na produção de laranja
20
pelo país desde a década de 80. E o consumo de suco de laranja na região também acompanha
essa retração, pois o mesmo teve redução nos últimos meses, segundo relatório da Nielsen,
agência que mede o consumo de suco de laranja pelos estadunidenses semanalmente, em
reportagem publicada em maio de 2016, no portal da Associação Nacional de Exportadores
de Sucos Cítricos (CITRUS BR, 2016).
Na determinação dos padrões físico-químicos na produção do néctar, o MAPA, com a
Instrução Normativa Nº42, de 11 de setembro de 2013, fixou uma quantidade mínima de 50%
(m/m) (cinquenta por cento massa massa) de suco de laranja no néctar de laranja, a partir de
31 de janeiro de 2016. Em complemento, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA),
com a Resolução da Diretoria Colegiada (RDC) Nº8, de 6 de março de 2013, que “dispõe sobre
a aprovação de uso de aditivos alimentares para produtos de frutas e de vegetais e geleia de
mocotó”, incluiu os néctares, e também determinou funções e limites máximos no uso desses
aditivos nos produtos alimentares.
Em outro estudo, Kim et al. (2013) avaliaram as características sensoriais de sucos de
laranja disponíveis comercialmente, para determinar o impacto de diferentes condições de
processo na preferência do suco de laranja, e identificar direcionadores de preferência nesses
sucos na Coréia. Os mesmos concluíram que existe muita semelhança entre o mercado
coreano e o global no segmento de sucos de laranja, e que a indústria destes deveria manter
elevado o sabor de laranja e doçura em seus sucos para atingir o mercado consumidor.
Considerando a necessidade de uma conformidade entre o produto e a legislação,
Ferrarezi (2008) avaliou a intenção de compra do consumidor e as características físico-
químicas de néctar e suco de laranja pronto para beber, concluindo que ocorreu falta de
homogeneidade entre os lotes e as marcas dos produtos, o que pode caracterizar certa falta
de compromisso dos produtores em atender aos limites exigidos pela legislação.
3.2.2 Uva
A uva (Vitis vinifera) é um produto rico em compostos fenólicos com ação antioxidante,
antiviral e anticarcinogênica comprovada por vários estudos (JAYAPRAKASHA; SINGH;
SAKARIAH, 2001; PONTES et al., 2010). Também possui quantidades expressivas de
resveratrol, substância com ação antioxidante, anti-inflamatória, antiviral, cardioprotetora,
quimiopreventiva de câncer, e retardo do envelhecimento (ACAUAN, 2007). Além disso, o
21
suco de uva também pode inibir a oxidação de lipoproteína de baixa densidade (LDL) (O’BRYNE
et al., 2002).
No Brasil, aproximadamente 90% da produção de uva e seus derivados está na região
do Rio Grande do Sul. De acordo com dados do IBGE, em 2012, a produção de uva no país
chegou a um pouco mais de 1,4 milhões de toneladas, sendo que 57% dessa produção foi
destinada a produção de vinhos, sucos e derivados, e o restante, 43% para consumo in natura
(MELLO, 2013). Nos anos seguintes, 2013 e 2014, a produção foi mantida em torno de 1,4
milhões de toneladas, com mais da metade da produção para consumo in natura e o restante
para processamento (PROTAS, 2015; MELLO, 2015). Em 2015, a produção foi de
aproximadamente 1,5 milhões de toneladas, e o destino dessa produção foi maior para o
processamento (52%) que para consumo in natura (48%) (MELLO, 2016).
Entre 2001 e 2003 a produção mundial de uva teve crescimento, mas entre 2004 e
2010 essa produção se manteve em torno de 67 milhões de toneladas (MELLO, 2012). Nos
anos de 2011 e 2012 a produção ficou em torno de 70 milhões de toneladas, atingindo a marca
de 77,6 milhões de toneladas em 2013, com uma queda sutil em 2014, em que a produção
mundial de uva ficou em torno de 73,7 milhões de toneladas, de acordo com o Relatório
Estatístico sobre Vitivinicultura da Organização Internacional da Vinha e do Vinho (OIV, 2015).
Ainda segundo este relatório, dentre os países com maior produção está a China, com cerca
de 15% da produção mundial, seguida por Estados Unidos da América, França, Itália e
Espanha.
O MAPA, por meio da Instrução Normativa Nº42, de 11 de setembro de 2013, também
fixou uma quantidade mínima de 50% (m/m) de suco de uva no néctar de uva, a partir de 31
de janeiro de 2016, assim como foi feito para o néctar de laranja.
Pontes et al. (2010) realizaram um trabalho para avaliar os atributos sensoriais e a
aceitação de sucos de uva comerciais no Brasil, incluindo o néctar de uva. Estes concluíram
que os néctares possuíam preço reduzido em relação ao suco de uva, bem como embalagens
mais práticas e estavam mais disponíveis no mercado, o que pôde influenciar o consumo do
mesmo, já que este teve aceitação equivalente à do suco de uva integral.
Com o intuito de contribuir para o controle de qualidade, a autenticidade e a tipicidade
de derivados de uva, como o néctar, produzidos no Brasil, Rizzon e Miele (2012)
desenvolveram um trabalho para determinar as diferenças físico-químicas dentre néctares e
bebidas de uva. Os autores concluíram que os sucos de uva integral e adoçado apresentaram
22
valores mais elevados de sólidos solúveis totais, ácidos tartárico e málico, compostos fenólicos
e minerais em relação ao néctar e à bebida de uva, que apresentaram valores mais elevados
da relação °Brix/acidez titulável.
Diante da importância comercial e da preferência do néctar de uva em relação aos
demais sabores, Mamede et al. (2013) realizaram um estudo para traçar o perfil sensorial de
diferentes marcas representativas de néctar de uva, assim como obter medidas de
parâmetros de cor por meio de colorímetro. Concluíram que a preferência do consumidor
estava em amostras que apresentaram alta intensidade de cor vinho e baixa intensidade de
cor marrom, sendo de menor aceitação amostras com aroma de cozido mais intenso. Logo,
esses atributos influenciam na preferência dos consumidores, e que a análise física da cor do
néctar de uva pode ser uma medida importante no padrão de qualidade.
3.3 MICROBIOLOGIA DE BEBIDAS À BASE DE FRUTAS
A bebida, por determinação da Lei 8.918/94, Seção I Art. 13º, “deve conter,
obrigatoriamente, a matéria prima vegetal, animal ou mineral, responsável por sua
característica sensorial, excetuando o xarope e o preparado sólido para refresco” (BRASIL,
1994). O néctar, por ser uma bebida à base de fruta, e com essa necessidade de se ter a fruta
na bebida, sugere uma busca por possíveis micro-organismos presentes nas mesmas, já que a
presença de micro-organismos no produto comercializado foi comprovada por diversos
autores em estudos anteriores.
A RDC nº12, de 2 de janeiro de 2001, da ANVISA, que aprova o Regulamento Técnico
sobre padrões microbiológicos para alimentos, determina apenas padrões para coliformes
termotolerantes que, no caso, devem ser ausentes em bebidas dos tipos refrescos, sucos e
néctares adicionados ou não de conservadores, congelados ou não; mas não faz qualquer
referência a padrões fúngicos.
Com o intuito de evitar perdas econômicas com uma possível contaminação do
alimento, torna-se necessária a implementação de práticas preventivas durante sua
fabricação. De acordo com a ANVISA, as Boas Práticas de Fabricação (BPF) podem ser descritas
como:
23
As Boas Práticas de Fabricação (BPF) abrangem um conjunto de medidas que devem
ser adotadas pelas indústrias de alimentos a fim de garantir a qualidade sanitária e a conformidade dos produtos alimentícios com os regulamentos técnicos. A legislação sanitária federal regulamenta essas medidas em caráter geral, aplicável a
todo o tipo de indústria de alimentos e específico, voltadas às indústrias que processam determinadas categorias de alimentos. (site: http://www.anvisa.gov.br/alimentos/bpf.htm)
Para que sejam garantidas as BPF é importante estabelecer os princípios do Sistema
de Análise de Perigos e Pontos Críticos, que permitem a identificação, a avaliação e o controle
dos perigos significativos para a segurança do alimento, desde a sua produção até seu
consumo (CODEX ALIMENTARIUS, 2006).
O tratamento térmico, que é regularmente utilizado na produção de muitos alimentos,
para alimentos ácidos, como frutas e derivados, tem sido tradicionalmente brando, pois
esporos de bactérias raramente são um problema nesses produtos, já que a pasteurização,
realizada com temperaturas em torno de 70 a 75 °C por 15 segundos, é suficiente para inativar
muitas enzimas, as leveduras e os conídios dos fungos. Porém, os ascósporos produzidos por
algumas espécies de fungos são capazes de sobreviver a esse processo de pasteurização
podendo causar deterioração do alimento (PITT; HOCKING, 2009).
3.3.1 Microbiologia de polpas de fruta
Segundo a Lei Nº 8.918/94, em seu Art. 19º, a polpa da fruta pode ser definida como
“produto não fermentado, não concentrado, obtido de fruta polposa, por processo
tecnológico adequado, atendido o teor mínimo de sólidos em suspensão” , que comumente é
utilizada como matéria-prima para a produção de néctares, sucos e outros derivados.
De acordo com a RDC nº12/01, da ANVISA, determina uma tolerância de 102 coliformes
a 45 °C/g e ausência de Salmonella sp/25g, para “polpa de frutas concentradas ou não, com
ou sem tratamento térmico, refrigeradas ou congeladas”.
Em 2004, na Colômbia, García et al. (2004) com o objetivo de avaliar a qualidade
microbiológica de polpa de mamão, relataram a presença de fungos como Aspergillus sp.,
Monilia sp., Cladosporium sp. e Penicillium sp., além da presença de aeróbios mesófilos e
coliformes termotolerantes.
Fazio (2006) em sua dissertação avalia a qualidade microbiológica de mais de sessenta
amostras de polpas congeladas de frutas comercializadas na região de São José do Rio Preto
24
(SP), isolando 136 leveduras de dezenove espécies diferentes, sendo as mais frequentes
Saccharomyces cerevisiae, Debaryomyces hansenii var. fabryi e Dekkera bruxellensis, e a
presença dos gêneros Cryptococcus sp. e Rhodotorula sp.
Também avaliando a qualidade microbiológica de polpas de frutas congeladas, Pereira
et al. (2006), em Minas Gerais, obtiveram contagens de fungos filamentosos que variaram de
< 10 a 2,6x104 UFC/g, o que representa um valor maior do que o permitido pela legislação
brasileira, porém não identificou os fungos isolados.
Em Boa Vista (RR), foi analisada a qualidade microbiológica de cem polpas de frutas
congeladas comercializadas na região. Sendo isolado um número significativo de fungos
filamentosos, leveduras e bactérias heterotróficas nas amostras analisadas, em que 78%
estavam em desacordo com os padrões para os mesmos de acordo com a legislação, com uma
média de 5,0x104 UFC/g para fungos filamentosos e leveduras. Os fungos isolados também
não foram identificados (SEBASTIANY; REGO; VITAL, 2009).
Ainda na avaliação da qualidade de polpas de frutas congeladas, Souza, Carneiro e
Gonsalves (2011), relataram que 50% das amostras analisadas pelo grupo apresentaram
valores acima do permitido pela legislação para a presença de fungos filamentosos e
leveduras, em polpas comercializadas no município de Russas (CE).
Com o objetivo de avaliar a qualidade microbiológica de polpas de açaí congeladas
comercializadas na cidade de Pouso Alegre (MG), foram analisadas 36 amostras por realização
de contagem de fungos filamentosos e leveduras, além de bactérias mesófilas, coliformes
totais e termotolerantes e pesquisa de E. coli. Dentre as amostras analisadas, 75%
apresentaram valores acima dos determinados pela legislação para contagem de coliformes
totais, 16,7% das amostras apresentaram coliformes termotolerantes acima do permitido e
13,8% confirmaram presença para E.coli. As contagens de fungos filamentosos e leveduras
também estavam acima dos valores estabelecidos em 8,3% das amostras. E na contagem de
bactérias mesófilas os valores variaram de 3x101 a 3,3x104 UFC/ml (FARIA; OLIVEIRA; COSTA,
2012).
Na cidade de Governador Valadares (MG), Ferreira-Marçal et al. (2014), com o objetivo
de analisar polpas de frutas congeladas comercializadas na cidade quanto aos parâmetros
físico-químicos, microbiológicos e microscópicos, avaliaram dez amostras de nove diferentes
sabores de polpas de frutas congeladas: acerola, cacau, caju, cupuaçu, goiaba, graviola,
mamão, manga e uva. E como resultado, não detectaram o crescimento de Salmonella nem
25
de coliformes totais nas amostras analisadas, mas nas contagens de fungos filamentosos e
leveduras foram observadas de 10 a 2,1x103 UFC/g, destacando a contagem da polpa de
graviola apresentou valor superior ao estabelecido pela legislação, mesmo que todas as outras
tenham se apresentado dentro do limite máximo.
Ainda em 2014, Donzeli et al (2014), publicaram um trabalho que avaliou parâmetros
físico-químicos e microbiológicos de polpas de frutas congeladas comercializadas na região do
Vale de São Francisco, nos municípios de Petrolina (PE) e Juazeiro (BA), sendo as polpas de
abacaxi, acerola, açaí, cacau, cajá, cupuaçu, graviola, goiaba, manga, maracujá, seriguela e
umbu. De acordo com os resultados obtido pelo grupo, não houve crescimento de coliformes
termotolerantes em nenhuma das amostras avaliadas, e, mesmo que os números de fungos
filamentosos e leveduras estivessem dentro do valor estabelecido pela legislação, estes
apareceram no valor de até 8,2x102 UFC/g.
Gonçalves (2014) avaliou a segurança microbiológica de polpa de cupuaçu processada
termicamente na região amazônica brasileira. Embora não tenha observado a presença de
coliformes ou Salmonella spp., e que os valores para fungos filamentosos e leveduras
estivessem dentro do permitido pela legislação, dois fungos termorresistente foram
identificados: Aspergillus niger e Aspergillus flavus, sendo que o último foi detectado com
potencial de produção de micotoxinas. O que reafirma a necessidade de fiscalização mais
rigorosa na produção de polpa de fruta.
3.3.2 Microbiologia de néctares e sucos de fruta
Os micro-organismos também podem ser encontrados em bebidas à base de frutas,
como em néctares e sucos, e o isolamento de fungos termorresistentes nesses tipos de
bebidas tem sido realizado por diversos autores.
King Jr, Michener e Ito (1969), realizam um trabalho de controle de Byssochlamys e
fungos termorresistentes em uvas e seus derivados, como suco de uva, nos Estados Unidos
(EUA). Os autores concluíram que os ascósporos de B. fulva (NRRL 3493) germinaram mais
prontamente quando tratados termicamente (4 min à 80 °C), em relação à germinação sem o
tratamento. E que esses ascósporos diferem dos esporos bacterianos por terem maior
resistência térmica em baixos valores de pH, como o obtido no suco de uva, no valor
aproximado de 3,8. Foram isoladas cepas de Byssochlamys nivea, Aspergillus sp., Penicillium
26
sp., Paecilomyces varioti e Thermoascus aurantiacum, entre outros fungos termorresistentes ,
em condições de tratamento térmico de 80°C por 30 minutos, sendo que os fungos B. nivea,
Penicillium sp. e T. aurantiacum cresceram também em condições de tratamento térmico de
88°C por 60 minutos.
Em 1998, Hoffmann et al., analisaram a qualidade microbiológica de amostras de
dezenove marcas diferentes de suco de laranja integral comercializadas em São José do Rio
Preto (SP), verificando que mais da metade das amostras não estavam de acordo com os níveis
estabelecidos pela legislação vigente. A contagem de fungos filamentosos e leveduras foi
entre 5,8x101 e 9,1x105 UFC/mL, também identificando a presença de coliformes totais e
termotolerantes.
Sousa et al. (2001) realizaram uma análise microbiológica em suco de laranja integral
e néctar de cupuaçu e de acerola, produzidos em certa indústria de Belém (PA) e
comercializados por ambulantes nesta cidade. A análise mostrou a presença de Salmonella sp.
em 4,2% das amostras, e a presença de coliformes termotolerantes em todas as amostras em
um nível acima do permitido pela legislação em vigor, bem como a presença de fungos
filamentosos e leveduras, chegando a 98% das amostras de sucos .
Cunha (2003) com o objetivo de avaliar o crescimento de fungos termorressistentes,
das espécies Byssochlamys fulva e Neosartorya fischeri, realizou experimentos com o método
de diluição e de plaqueamento, em sucos naturais de abacaxi e maracujá, em duas
temperaturas, 20 °C e 30 °C. Após a inoculação de suspensão de esporos observou-se o
crescimento de B. nivea no suco de abacaxi em três dias (a 20 °C), e em um dia e meio (30 °C).
Já o crescimento deste fungo no suco maracujá ocorreu em 4 dias (a 20 °C), e em um dia (a 30
°C). O estudo de N. fischeri não foi realizado por contaminação da suspensão de esporos.
Marcolino (2003) analisou amostras de bebida de uva pasteurizada e pronta para
beber, de uma indústria localizada no interior do Rio Grande do Sul, obtidas diretamente de
uma linha de processamento asséptico. E como resultado, a autora detectou a presença de
dois fungos termorresistentes identificado como Neosartorya fischeri.
Os gêneros de bactérias Bacillus e Alicylobacillus produzem endosporos que são
capazes de tolerar temperaturas extremas e permanecerem viáveis em sucos concentrados
congelados. Com o objetivo de detectar e quantificar micro-organismos que contaminam
normalmente sucos de laranja concentrados e congelados sem conservantes, Vaccari et al.
(2005) realizaram estudo com 36 amostras destes sucos. Como resultado foram encontrados
27
micro-organismo na maioria das amostras e identificados em cinco espécies do gênero
Bacillus, sendo o B. subtilis identificado em 74% das 80 cepas isoladas. Os resultados mostram
a sobrevivência elevada dos endosporos após a pasteurização ou a contaminação ambiental
pós-pasteurização.
Fernandes et al. (2006) analisaram quinze amostras de sucos tropicais nos sabores
acerola, goiaba e manga, coletadas em supermercados de Fortaleza (CE). Dentre as amostras
analisadas, todas estavam dentro dos padrões estabelecidos pela legislação quanto a
contagem de fungos filamentosos e leveduras e a presença de coliformes totais. Apenas uma
amostra do sabor goiaba apresentou contagem de fungos filamentosos e leveduras de
4,45x103 UFC/mL, além da contagem de micro-organismos aeróbios mesófilos de 6,6x103
UFC/mL. No mesmo ano, o grupo também analisou quinze amostras de sucos tropicais nos
sabores abacaxi, caju e maracujá, adquiridas no mercado local de Fortaleza (CE), em que
apenas uma amostra de maracujá apresentou contagem de leveduras de 2,3x102 UFC/mL e
outra do mesmo sabor apresentou contagem de micro-organismos mesófilos de 9,0x102
UFC/mL (PINHEIRO et al., 2006).
Avaliando a qualidade de sucos de fruta pasteurizados em supermercados de
Washington (DC), nos EUA, Tournas, Heeres e Burgess (2006) identificaram a presença de
fungos filamentosos (Fusarium spp., Geotrichum spp. e Penicillium spp.) em sucos de uva e
leveduras (Candida sake, C. lambrica e Kloeckera apis) em sucos de cenoura, laranja e uva.
Em 2007, Mattietto, Lopes e Menezes, publicaram um trabalho sobre a avaliação da
conservação das características de néctar misto de cajá, proveniente de Belém (PA), e umbu,
de Salvador (BA), adquiridos em feiras livres, durante o armazenamento em temperatura
ambiente. O tratamento térmico empregado foi eficiente por 60 dias de estocagem, pois, após
esse período, houve modificação nas propriedades sensoriais assim como o desenvolvimento
de fungos. De acordo com os autores, as características observadas ao microscópio eram
semelhantes ao de fungo do gênero Byssochlamys, em particular B. fulva, porém não foram
realizadas técnicas específicas de identificação.
Salomão, Massaguer e Aragão (2008) verificaram a ocorrência de fungos
termorresistentes em etapas do processo produtivo de néctar de maçã na região sul do Brasil,
sendo encontrados os fungos Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva e Eupenicillium sp.
Neste caso, os fungos das espécies Neosartorya fischeri e Byssochlamys fulva foram os mais
28
termorresistentes, pois sobreviveram ao choque térmico de 95°C por 20 minutos, tempo
muito superior ao aplicado a produtos de maçã.
Com o mesmo objetivo de verificar a ocorrência de fungos termorresistentes em sucos
de maçã concentrados, em uma indústria processadora de suco no Rio Grande do Sul (RS),
Welke et al. (2009) isolaram fungos do gênero Byssochlamys, identificando três cepas como
B. fulva e uma cepa como B. nivea, sendo esta produtora de patulina nas condições testadas.
De acordo com os autores, a presença destes fungos no suco durante seu armazenamento
pôde ser a causa de deterioração e possível produção da micotoxina.
Analisando fungos isolados de néctares de maracujá e abacaxi comerciais
pasteurizados, Ferreira et al. (2011) buscaram caracterizar a termorresistência desses fungos,
assim como verificar a produção de patulina pelos mesmo, quando inoculados nestes
néctares. Como resultado, isolaram os fungos termorresistentes Byssochlamys fulva em
néctar de maracujá e Byssochlamys nivea em néctar de abacaxi, sendo este último mais
termorresistente. E não foi observada a produção de patulina quando os fungos foram
inoculados diretamente nos néctares estudados.
Na análise micológica de quinze amostras de suco natural de laranja preparados e
comercializados em cinco pontos de venda, na cidade de Franca (SP), Soares et al. (2011)
isolaram e identificaram crescimento de leveduras em todas as amostras numa média de
7,25x103 ± 3,2 UFC/mL. Com 82% das leveduras sendo do gênero Candida (C. albicans, C.
guilliermondii, C. krusei, C. pelliculosa e C. tropicalis), 9% do gênero Rhodotorula (R. glutinis) e
9% do gênero Geotrichum (G. candidum). O grupo concluiu que boas práticas higiênico-
sanitárias devem ser implantadas, já que as espécies C. albicans e C. krusei, isoladas nos sucos
estudados, são importantes agentes de infecções, principalmente em indivíduos
imunodeficientes.
Com o objetivo de apresentar estudos sobre o desenvolvimento de fungos
termorresistentes em sucos de fruta concentrado, Nunes et al. (2012) fizeram uma revisão
incluindo métodos recomendados para enumerar esses fungos assim como a influência da
constituição do suco na sobrevivência dos ascósporos após o tratamento térmico. Por meio
do estudo foi possível concluir que as principais medidas de controle para evitar o
aparecimento de fungos termorresistentes e outros micro-organismos nos sucos
concentrados está no uso de matéria-prima de boa qualidade assim como a adoção de Boas
Práticas de Fabricação.
29
Em estudo realizado por Fukumoto (2012), que resultou em sua monografia, foram
avaliados néctares de uva industrializados comercializados na cidade do Rio de Janeiro na
busca por fungos termorresistentes. Como resultado, o autor detectou a presença de dois
fungos termorresistentes dentre as 68 amostras analisadas, sendo um identificado como
pertencente ao gênero Penicillium, e o outro sendo possivelmente do gênero Aspergillus,
tendo o último a termorresistência comprovada.
Silva (2013), em sua dissertação, avaliou a qualidade microbiológica de sucos de laranja
com baixo e médio teor de polpa, no Brasil, além de parâmetros físico-químicos. De acordo
com o autor, os tratamentos térmicos utilizados na análise foram suficientes para destruir
micro-organismos patogênicos nos sucos de laranja, sendo observada contagem de fungos
filamentosos e leveduras inferior a 10 UFC/mL, porém, o suco com médio teor de polpa
apresentou contagem de 10x101 UFC/mL.
Um estudo realizado nas cidades de Barra Mansa e Volta Redonda (RJ), por Brum et al.
(2014), avaliou a qualidade microbiológica de refrescos acondicionados em refresqueiras, nos
sabores caju e laranja. Dentre as sete amostras analisadas, duas estavam acima do padrão
estabelecido pela legislação brasileira quanto à presença de coliformes a 45°C ou
termotolerantes. O que evidencia que essas amostras estariam impróprias para o consumo.
Com o objetivo de identificar a presença de fungos, incluindo os termorressitentes, e
Alicyclobacillus spp. durante o processo de concentração de suco de maçã no Brasil, Salomão
et al. (2014) conseguiram isolar bactéria A. acidoterrestris e 19 fungos, identificando 12 desses
como pertencentes ao gênero Penicillium, em que metade pertencia a espécie Penicillium
expansum. Dentre os fungos termorresistentes isolados e identificados, obtiveram as espécies
Neosartorya fischeri, Byssochlamys fulva e também os gêneros Eupenicillium sp., Talaromyces
sp. e Eurotium sp. Concluindo que seus resultados refletem a necessidade de métodos para
eliminar ou prevenir a presença de micro-organismos no suco de maçã, bem como evitar a
produção de micotoxinas pelos fungos.
Mahgoub e El-Shourbagy (2015) analisaram a qualidade de diversos sucos de frutas
comercializados no Egito, utilizando parâmetros microbiológicos, físico-químicos e a
prevalência de esporos bacterianos. Na pesquisa foram isoladas, predominantemente,
espécies bacterianas como Alicyclobacillus acidoterrestris, Bacillus coagulans, B. licheniformis
e B. mycoides, e leveduras dos gêneros Candida spp. e Saccharomyces spp. Os autores
30
concluíram que existe a necessidade de padrões de higiene para a fabricação de sucos no país,
de acordo com os micro-organismos isolados e identificados.
Os estudos observados corroboram com a ideia de que a relação entre frutas, micro-
organismos e bebidas à base de frutas é muito estreita, considerando que os fungos
encontrados nas frutas, na sua maioria, são provenientes do solo e podem chegar à bebida
durante seu processamento. Esses estudos também mostram que a prevalência de fungos,
especialmente os termorresistente, são uns dos principais contaminantes de bebidas
processadas termicamente e comercializadas.
3.3.3 Principais fungos em frutas e bebidas à base de frutas
A deterioração microbiológica de frutas e seus derivados ocorre, na maioria das vezes,
por fungos, já que a fruta tende a ser ácida, com valores de pH entre 1,8 a 2,2 (como em
maracujá e limão) e 4,5 a 5,0 (como em tomates e figos), sendo mais resistente a invasão por
bactérias. E com o amadurecimento, as frutas se tornam ainda mais susceptíveis a invasão
pelo fungo, pois com o aumento de pH, a casca se torna levemente macia, enfraquecendo sua
defesa e permitindo a instalação do fungo (PITT; HOCKING, 2009).
Vários fungos podem causar deterioração em frutas, mas os gêneros comumente
relacionados a esse processo são pertencentes aos grupos “Aspergillus e seus teleomorfos”,
como o gênero Aspergillus, e “Penicillium e gêneros relacionados”, como o gênero Penicillium,
segundo Pitt & Hocking (2009), com destaque em uvas e frutas cítricas, como a laranja.
Nas bebidas à base de frutas, que são produtos submetidos a processos como
pasteurização e redução de pH, por exemplo, são considerados, como regra, estáveis
microbiologicamente. Porém, alguns fungos produzem esporos termorresistentes que
resistem ao processo de pasteurização e chegam ao produto final, como, por exemplo, fungos
dos gêneros Byssochlamys e Neosartorya (PITT; HOCKING, 2009).
31
3.4 FUNGOS
3.4.1 Características gerais
Os fungos são organismos constituídos de células eucarióticas com parede celular,
podem ser unicelulares, como as leveduras, ou multicelulares, como os fungos filamentosos e
os cogumelos, são quimio-heterótrofos e absorvem o alimento do ambiente, e podem se
reproduzir de forma sexuada, por meio de esporos, ou assexuada, por meio de conídios
(Figura 1). São amplamente distribuídos na natureza, podendo ser encontrados nos mais
diversos ambientes, como em geleiras ou nas raízes de plantas (TORTORA; FUNKE; CASE,
2010).
Figura 1. Esquema do ciclo de vida geral do fungo. Fonte: MORAES; PAES; HOLANDA, 2010, p. 402.
As leveduras são as formas não filamentosas e unicelulares dos fungos, são ovais ou
esféricas e maiores que as bactérias. Possui reprodução, normalmente por brotamento, em
que a célula forma uma protuberância na sua superfície que se alonga, a célula parental sofre
divisão nuclear e um núcleo migra para o broto. O material da parede celular fecha a
comunicação entre a célula parental e o broto, que se destaca dando origem a uma nova célula
(Figura 2) (TORTORA; FUNKE; CASE, 2010).
32
Figura 2. Levedura em brotamento. Micrografia de Saccharomyces cerevisae
em diferentes fases do brotamento. Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2010, p. 332.
Os fungos filamentosos têm seu crescimento a partir de esporos ou conídios com a
formação de finos filamentos, as hifas, resultando em uma massa filamentosa, denominada
micélio, que constitui a estrutura vegetativa, responsável pelo desenvolvimento do fungo e
pela absorção de nutrientes. As hifas vegetativas, por sua vez, se diferenciam para dar origem
a estruturas reprodutivas que formarão novos esporos ou conídios, garantindo a
disseminação e perpetuação do organismo. Essas hifas podem ser apocíticas ou septadas,
quando possui uma parede ou um septo dividindo a hifa em duas unidades de célula, ou
cenocíticas, sem septo (Figura 3) (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).
Figura 3. Características da hifa fúngica. (a) Hifa septada, com septo. (b) Hifa cenocítica, sem septo. (c) Hifa crescendo a partir do esporo.
Fonte: TORTORA; FUNKE; CASE, 2010, p. 331.
33
Conforme o tipo de reprodução que o fungo filamentoso realiza, este pode ser
classificado dentro de três grupos: 1. anamorfo, quando realiza apenas a reprodução
assexuada em seu ciclo de vida; 2. teleomorfo, quando realiza apenas a reprodução sexuada
em seu ciclo de vida; 3. holomorfo, quando realiza tanto a reprodução sexuada quanto a
assexuada em seu ciclo de vida (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).
3.4.2 Classificação taxonômica
O Reino Fungi, que pertence no Domínio Eukaria, é constituído pelos fungos, e está
dividido em sete filos Ascomycota, Basidiomycota, Blastocladiomycota, Chytridiomycota,
Glomeromycota, Microsporidia, e Neocallimastigomycota, e um grupo que reúne os fungos
anamórficos, porém este grupo não tem valor taxonômico, sendo seus representantes
relacionados aos filos Ascomycota ou Basidiomycota (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).
O grupo constituído pelos fungos anamórficos possuem, predominantemente, a
reprodução assexuada, com estrutura de propagação na forma de conídios, pois acredita-se
que a reprodução sexuada seja ausente, desconhecida ou essa capacidade tenha sido perdida.
A relação desse grupo com fungos pertencentes aos filos Ascomycota ou Basidiomycota está
na comparação de sequências gênicas (MORAES; PAES; HOLANDA, 2010).
Os fungos que possuem maior interesse em estudos de micro-organismos
deteriorantes de alimentos são aqueles pertencentes aos filos Ascomycota e Glomeromycota
(que inclui os representantes do antigo filo Zygomycota), e poucos do filo Basidiomycota (PITT;
HOCKING, 2009).
3.4.2.1 grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”
O grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”, segundo Pitt & Hocking (2009), é
caracterizado como, pelo menos, tolerantes a elevadas temperaturas, e espécies de
Aspergillus, e seu teleomorfo Eurotium, são os mais encontrados em deterioração de
alimentos por fungos. As três espécies teloeomorfas de Aspergillus mais significativas em
alimentos são: Eurotium, Neosartorya e Emericella.
Ainda segundo Pitt & Hocking (2009), Aspergillus é um gênero de Hyphomycetes
caracterizados, em termos gerais, pela formação de conidióforos com estipes largas e de
34
paredes grossas com uma vesícula, normalmente esférica, no ápice, por onde surgem fiálides,
ou métulas e fiálides, sendo a fiálide a célula conidiogênica. Além disso, o gênero Aspergillus
é caracterizado especificamente pela presença de célula podal com estipes, que,
normalmente, não são septadas (Figura 4).
Figura 4. Ilustração das estruturas do gênero Aspergillus. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modifica-ções.
3.4.2.2 grupo “Penicillium e gêneros relacionados”
De acordo com Pitt & Hocking (2009), o grupo “Penicillium e gêneros relacionados” são
gêneros que produzem conídios em uma estrutura chamada penicillus, que em Latim significa
pequena escova. O grupo consiste essencialmente de um grupo bem definido de fiálides ou
células similares, unicelulares, com conídios em cadeia. As fiálides podem estar tanto presas
diretamente a estipe quanto através de um ou mais estágios de ramificação (Figura 5). São
quatro os principais gêneros com essas características: Penicillium, Geosmithia, Paecilomyces
e Scopulariopsis.
35
Figura 5. Ilustração das estruturas do gênero
Penicillium. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modifica-ções.
Pitt & Hocking (2009) também relacionam os gêneros teleomorfos associados aos
gêneros anamórficos descritos. O gênero Byssoclamys é o teleomorfo de certas espécies de
Paecilomyces, enquanto que o gênero Eupenicillium está associado a espécies de Penicillium,
e o gênero Talaromyces está associado a espécies de Geosmithia, Paecilomyces e Penicillium,
mas de Paecilomyces não são encontrados em alimentos, assim como o teleomorfo do gênero
Scopulariopsis. Os autores enfatizam que a produção dos teleomorfos por quaisquer gêneros
anamórficos é mais exceção do que regra.
3.4.3 Fungos termorresistentes
A influência da temperatura tanto na preservação quanto na deterioração dos
alimentos está dividida entre as temperaturas durante o processo e aquelas durante a
estocagem. Os esporos de fungos termorresistentes podem persistir após o processo de
pasteurização aplicado aos alimentos ácidos. Os ascósporos de fungos filamentosos e de
leveduras, assim como células vegetativas, também são considerados es truturas
termorresistentes (PITT; HOCKING, 2009).
36
De acordo com Houbraken e Samson (2006) os fungos termorresistentes podem ser
definidos como aqueles capazes de sobreviver a temperatura igual ou superior a 75 °C por 30
minutos ou mais.
Em uma pesquisa realizada por Slongo e Aragão (2006), foram analisados fatores que
influenciam na ativação de ascósporos de Neosartoria fischeri em néctares aquecidos de
abacaxi e mamão, como meio de aquecimento, temperatura de produção e idade dos
ascósporos. A análise mostrou que a temperatura de produção é um fator que influencia na
ativação desses ascósporos, e consequentemente o desenvolvimento do fungo.
No ano seguinte, Slongo e Aragão (2007) publicaram um trabalho usando suco de
abacaxi para estudar a capacidade de resistência térmica de ascósporos de Byssochlamys
nivea e Neosartorya fischeri em três diferentes temperaturas (85, 90 e 92 °C). Seus resultados
mostraram que a resistência térmica de B. nivea em sucos de abacaxi é superior à de N.
fischeri, embora as duas espécies tenham se mostrado termorresistentes.
Outro estudo realizado para analisar a sobrevivência de ascósporos de Neosartorya
fischeri isolados de néctar de maçã, usando diferentes meios e diferentes temperaturas (80,
85 e 90 °C), mostrou que altas temperaturas são essenciais para eliminar os ascósporos de
sucos de fruta. Porém, essa prática pode causar alterações nas propriedades comerciais
desejadas para o produto (SALOMÃO; SLONGO; ARAGÃO, 2007).
Dentre os fungos pertencentes ao filo Ascomycota, o gênero Byssochlamys é notório
na deterioração de produtos derivados de frutas no tratamento com calor, destacando os
ascósporos das espécies B. fulva e B. nivea. Os ascósporos da espécie Neosartorya fischeri
possuem termorresistência semelhante aos da espécie B. fulva. Outras espécies de fungos
como Talaromyces e Eupenicillium também apresentam termorresistência e podem ser
isoladas de suco de frutas, polpas e concentrados (PITT; HOCKING, 2009).
O tratamento térmico ao qual os produtos derivados de frutas são submetidos pode
ativar as estruturas termorresistentes, desencadeando o desenvolvimento fúngico, e,
consequentemente, possíveis deterioração e produção de micotoxinas.
3.4.4 Micotoxinas e Fungos Termorresistentes
As micotoxinas podem ser definidas como produtos naturais de baixo peso molecular
produzidos como metabólitos secundários por fungos filamentosos. Esses metabólitos
37
constituem uma coleção química e toxigenicamente heterogênea que são agrupados somente
pelo fato de que seus membros são causadores de doenças e/ou morte em humanos e outros
vertebrados. Enquanto que todas as micotoxinas são de origem fúngicas, nem todos os
compostos tóxicos produzidos por fungos são chamados de micotoxinas (BENNETT; KLICH,
2003).
Espécies de fungos produtoras de micotoxinas são muito comuns e podem crescer em
uma ampla variedade de substratos e condições ambientais, e a micotoxina ocorre, com
determinada variação de severidade, em produtos agrícolas por todo o mundo. As
micotoxinas podem entrar no alimento quando o mesmo está no campo, ou durante a
estocagem, ou até ao longo de seu processamento (BENNETT; KLICH, 2003).
Várias pesquisas têm apontado para o fato de que a presença de fungos em bebidas à
base de frutas pode levar a ocorrência de micotoxinas nas mesmas , considerando que os
fungos, frequentemente encontrados, são potenciais produtores de determinadas
micotoxinas.
Segundo Tournas (1994), as espécies fúngicas mais comuns que levam a deterioração
de frutas e seus derivados são Byssochlamys fulva, Byssochlamys nivea, Neosartorya fischeri,
Talaromyces flavus, e Eupenicillium brefeldianum. Mas além da deterioração, esses fungos
termorresistentes são capazes de produzirem vários metabólitos secundário tóxicos.
Dentre as espécies do gênero Byssochlamys podem ser destacadas B. fulva e B. nivea
por serem citadas por vários autores como deteriorantes e produtoras de micotoxinas em
produtos pasteurizados, sendo as principais micotoxinas produzidas patulina, byssotoxina A e
ácido bissoclâmico (HOUBRAKEN; SAMSON, 2006; NUNES et al., 2012).
A espécie de Neosartorya fischeri, que tem como anamorfo Aspergillus fischerianus,
possui algumas cepas capazes de produzir fumitremorginas A e C e verruculogena (NIELSEN;
BEUCHAT; FRISVAD, 1988). As espécies Talaromyces flavus e Eupenicillium brefeldianum não
têm sido relatadas como produtoras de micotoxinas.
38
4 METODOLOGIA
4.1 AMOSTRAS DE NÉCTARES
As amostras de néctares de laranja e uva analisadas foram adquiridas em diferentes
supermercados localizados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro, no período
de janeiro de 2014 a abril de 2014, estando todas com seus envases em bom estado e dentro
do prazo de validade.
Foram analisadas três marcas diferentes de néctar de laranja, três de néctar de uva, e
uma de néctar misto de uva e maçã destinada ao público infantil. Essas análises foram feitas
de três lotes em triplicata, totalizando 63 unidades amostrais, que foram armazenadas em
temperatura ambiente, como nos supermercados, no Laboratório de Microbiologia de
Alimentos (MircAlim) da Escola de Química/UFRJ, até que fossem realizados os experimentos.
Para preservar a identidade das marcas dos néctares analisados, cada marca diferente
de néctar foi identificada por uma letra, sendo o sabor identificado com sua letra inicial, e os
lotes e a replicata identificados por algarismos arábicos (Apêndices A, B e C).
Todas as demais etapas dos processos experimentais foram realizadas no Laboratório
de Microbiologia de Alimentos (MircAlim) da Escola de Química/UFRJ, utilizando os aparelhos
do próprio laboratório.
4.2 ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES
O isolamento de fungos termorresistentes a partir de néctares de laranja, uva e misto
de uva e maçã foi feito seguindo a metodologia de Houbraken e Samson (2006), com algumas
modificações.
O método proposto por Houbraken e Samson (2006), sugere banho-maria em
temperatura de 75 °C e uso de meio de cultura a base de extrato de malte com adição de
antibiótico (cloranfenicol). No trabalho realizado, essas condições foram modifi cadas,
utilizando temperatura de 80 °C para o banho-maria, como proposto por Pitt e Hocking (2009),
e meio de cultura a base de batata, por ser um meio de cultura mais rico em nutrientes quando
comparado ao meio a base de extrato de malte, oferecendo condições melhores para o
39
possível crescimento fúngico, e sem a adição de qualquer antibiótico, o que poderia permitir
o crescimento de outros micro-organismos.
As amostras dos néctares se encontravam em embalagens do tipo cartonada, com
volume total de 200 mL. Em uma capela de fluxo laminar (VECO®, BIO SEG 09), 150 mL do
néctar foram vertidos em frascos do tipo Erlenmeyer com tampa de rosca de 500 mL
esterilizados para realizar o tratamento térmico, no qual esses frascos foram colocados em
banho-maria (QUIMIS®) à 80 °C por 30 min, depois deste tempo, foram colocados em banho
frio (0 °C), para um rápido resfriamento das amostras. Os outros 50 mL de néctar não tratado
termicamente foram utilizados para a medição do pH, e depois descartados adequadamente.
Após o tratamento térmico, foram retirados 50 mL da amostra de néctar e misturados
em outro frasco de Erlenmeyer de 250 mL contendo 50 mL de meio de cultura à base de batata
(Batata Dextrose Agar – BDA) em dupla concentração (Anexo A), também esterilizados,
totalizando 100 mL no volume final, que foram vertidos em cinco placas de Petri esterilizadas.
Tanto as placas de Petri, com a solução de meio de cultura e néctar, quanto os outros 100 mL
de néctar tratado termicamente foram incubados em estufa (QUIMIS®) à 30 °C por 30 dias,
com observações semanais para verificação de possível crescimento.
Dessa forma, as amostras foram analisadas por dois métodos, segundo Houbraken e
Samson (2006): método da placa de Petri ou plaqueamento, e método de incubação direta
(Figura 6).
40
Figura 6. Diagrama da metodologia.
Fonte: HOUBRAKEN; SAMSON, 2006, com modificações.
Os fungos isolados dos néctares foram repicados para tubos de ensaio com meio de
cultura BDA (Anexo A) e, após crescimento em estufa à 25 °C por sete dias, os mesmos foram
armazenados em geladeira (CONSUL®, BIPLEX, CRD36), à 5°C, para posterior identificação.
4.3 MEDIÇÃO DO pH
A medição do pH das amostras foi obtida por meio de um medidor de pH (TECNOPON®,
PA210), realizada de acordo com as etapas da Figura 6, sem a submissão do néctar ao choque
térmico.
4.4 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS TERMORRESISTENTES ISOLADOS
Os fungos termorressitentes encontrados foram isolados por meio da técnica de
repique para um tubo de ensaio, e identificados através da observação e descrição de suas
características macro e microscópicas, segundo a técnica de Pitt e Hocking (2009).
41
Após o isolamento das culturas, estas foram analisadas macroscopicamente por meio
da técnica de ponto de inóculo, em que o isolado foi inoculado no centro das placas de Petri
com meios de cultura específicos para identificação. Foram feitas cinco placas de cada isolado,
em câmara de fluxo laminar, em três temperaturas diferentes, mas todas com o mesmo tempo
de incubação, e com placa invertida (Quadro 1). Os meios de cultura utilizados foram: Czapeck
Yeast Extract Agar (CYA), 25% Glycerol Nitrate Agar (G25N), e Malt Extract Agar (MEA) (Anexo
B).
Meio de Cultura Temperatura de Incubação Tempo de Incubação
CYA
5°C 7 dias
25°C 7 dias
37°C 7 dias
G25N 25°C 7 dias
MEA 25°C 7 dias
Quadro 1. Condições para identificação macro e microscópica.
Fonte: PITT; HOCKING, 2009.
Para a incubação em temperaturas diferentes foram utilizadas estufas climatizadas
para as temperaturas de 25°C e 30°C, e geladeira para a temperatura de 5°C.
A análise microscópica foi feita por meio da técnica de microcultivo em lâmina e
lamínula (Figura 7), em câmara de fluxo laminar, com as mesmas condições de meios de
cultura, temperaturas e tempo de incubação utilizadas para as características macroscópicas
(PITT; HOCKING, 2009).
Figura 7. Técnica de microcultivo em lâmina e lamínula. Fonte: PITT; HOCKING, 2009 – com modificações.
42
Após o tempo de incubação de sete dias nas temperaturas determinadas , as placas
foram então separadas para observação das características macroscópicas e microscópicas.
As características macroscópicas foram feitas com auxílio de uma lupa (PHOENIX
LUFERCO®, CP608). O tamanho da colônia foi medido através do diâmetro da colônia com
régua. As cores do anverso e do reverso da colônia também foram observadas, bem como
suas texturas, sendo a textura do anverso das colônias classificada como aveludada,
algodonosa ou flocosa, e a do reverso, em lisa ou sulcada. Também foi verificada a presença
ou a ausência de exsudatos.
As características microscópicas foram feitas com auxílio de um microscópio óptico
comum (NIKON, ECLIPSE, E200). Foram observadas características como septação da hifa;
tamanho, forma e cor dos esporos maduros; e presença ou ausência de fiálides, métulas e
vesículas. Para a observação das lâminas ao microscópio as mesmas foram coradas com
corante lactofucsina (Anexo C), segundo metodologia de Pitt e Hocking (2009).
As características observadas foram anotadas em uma ficha de identif icação
organizada de acordo com a chave geral para identificação de fungos (Anexo D). A partir da
reunião de todas essas características, estas foram comparadas em uma chave dicotômica
para a identificação do gênero (PITT & HOCKING, 2009, p.55).
4.5 COMPARAÇÃO DOS FUNGOS ENCONTRADOS COM OS DESCRITOS NA LITERATURA
Após a identificação dos fungos termorressistentes isolados das amostras de néctares
de laranja, uva e misto de uva e maçã, estes foram comparados com dados obtidos através da
pesquisa em literatura específica.
43
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 MEDIÇÃO DO pH DOS NÉCTARES
Na medição do pH dos néctares foram observados valores de pH que variaram entre
2,9 e 3,57 no sabor laranja, entre 2,42 e 2,89 para o sabor uva, e entre 2,64 e 2,8 para o misto
de uva e maçã, considerando as três marcas analisadas (Tabela 1).
Tabela 1. Valores de pH das amostras de néctares, com média e desvio padrão para cada marca analisada.
SABOR LARANJA
MARCA CÓDIGO pH MARCA CÓDIGO pH MARCA CÓDIGO pH
X
XL 11 3,10
Y
YL 11 3,12
Z
ZL 11 3,56
XL 12 3,12 YL 12 3,12 ZL 12 3,57
XL 13 3,11 YL 13 3,12 ZL 13 3,56
XL 21 3,00 YL 21 2,9 ZL 21 3,5
XL 22 3,00 YL 22 2,9 ZL 22 3,5
XL 23 3,00 YL 23 2,9 ZL 23 3,5
XL 31 3,05 YL 31 2,98 ZL 31 3,37
XL 32 3,06 YL 32 2,98 ZL 32 3,37
XL 33 3,05 YL 33 2,98 ZL 33 3,37
Média pH ± Desvio padrão
3,05 ± 0,05
Média pH ± Desvio padrão
3,00 ± 0,09
Média pH ± Desvio padrão
3,48 ± 0,08
SABOR UVA
X
XU 11 2,54
Y
YU 11 2,57
Z
ZU 11 2,7 XU 12 2,55 YU 12 2,56 ZU 12 2,7
XU 13 2,55 YU 13 2,55 ZU 13 2,7
XU 21 2,73 YU 21 2,43 ZU 21 2,7 XU 22 2,73 YU 22 2,44 ZU 22 2,7
XU 23 2,72 YU 23 2,44 ZU 23 2,7
XU 31 2,72 YU 31 2,42 ZU 31 2,89 XU 32 2,72 YU 32 2,42 ZU 32 2,88
XU 33 2,72 YU 33 2,43 ZU 33 2,88
Média pH ± Desvio padrão
2,66 ± 0,08
Média pH ± Desvio padrão
2,47 ± 0,06
Média pH ± Desvio padrão
2,76 ± 0,09
SABOR MISTO DE UVA E MAÇÃ
X
XUm 11 2,8 X
XUm 21 2,69 X
XUm 31 2,65 XUm 12 2,8 XUm 22 2,64 XUm 32 2,66
XUm 13 2,8 XUm 23 2,66 XUm 33 2,65
Média pH ± Desvio padrão 2,71 ± 0,07
Os valores observados no presente estudo para o pH dos néctares sabor laranja estão
abaixo dos descritos na literatura, que relatam valores de pH 3,46 (SILVA et al., 2012) e até pH
44
4,5 (RAMIREZ; SILUPU; CRUZ, 2010) para os néctares desse sabor. O mesmo aconteceu com
os néctares de sabor uva, que também apresentaram valores abaixo dos descritos na
literatura, como pH 2,92 (RIZZON; MIELE, 2012) e pH 2,9 (SILVA et al., 2012), e ainda mais
distantes do valor obtido por Santana et al. (2012), que relatam valores de pH 3,28, porém
ficando próximo dos resultados mostrados por Gurak et al. (2008), que obtiveram valores de
pH que variaram de 2,6 a 3,49.
Na análise para o sabor misto de uva e maçã, os valores obtidos estão abaixo do que
se tem descrito na literatura, como mostrado no trabalho de Silva et al. (2012), em que foram
analisadas amostras de néctares também destinadas ao público infantil, que obtiveram um
valor de pH 3,59 para o sabor uva, e ainda destacam que duas marcas de néctar de uva
apresentaram acidez mais elevada que os demais sabores analisados, fato esse demonstrado
tanto pelo baixo pH quanto pela elevada capacidade tampão intrínseca. Para esses autores,
as bebidas caracterizadas como ácidas são potenciais causadoras da erosão dental pela
dissolução do esmalte.
De acordo com os valores de pH encontrados nos néctares, que variaram de 2,42 a
3,57, poderia haver crescimento fúngico em qualquer uma das amostras analisadas,
considerando que os fungos podem crescer em meios com pH que varia de 2 a 11 (TOURNAS,
1994). Já que os micro-organismos deteriorantes em sucos de frutas conseguem se reproduzir
mesmo em pH considerado baixo, igual ou inferior a 3, como os encontrados nestes sucos
(MARCOLINO, 2003).
Mesmo assim, não houve crescimento de fungos nas marcas analisadas, possivelmente
por não apresentarem formas fúngicas termorresistentes, como ascósporos, em seus
néctares, correspondendo a boa prática de fabricação do produto, como ocorrido com a
marca Y, que apresentou os menores valores de pH dentre as marcas analisadas.
Uma análise da medição do pH do néctar tratado termicamente e adicionado ao meio
de cultura em dupla concentração, na proporção de 1:1, feita com fita medidora de pH,
mostrou valores de pH acima daqueles obtidos do néctar sem o tratamento térmico e sem a
adição do meio de cultura, sendo os valores de pH 3 para o sabor uva e pH 4 para o sabor
misto de uva e maçã. Não houve análise para o sabor laranja. Mostrando que a diluição do
néctar em meio de cultura pode elevar o valor do pH, fato que favoreceria o crescimento de
fungos filamentosos.
45
5.2 CRESCIMENTO E ISOLAMENTO DE FUNGOS TERMORRESISTENTES
A técnica utilizada para o isolamento dos fungos termorresistentes nos néctares
envolveu dois processos de incubação após o choque térmico: néctar direto em Erlenmeyer e
plaqueamento do néctar diluído em meio de cultura de dupla concentração na proporção de
1:1.
Após o período de 30 dias não foi observado crescimento fúngico, ou de qualquer
outro micro-organismo, em nenhuma das marcas nem dos sabores dos néctares que foram
incubados nos frascos de Erlenmeyer (Figura 8).
Figura 8. Análise do crescimento fúngico em Erlenmeyer.
O possível não crescimento de fungos termorresistentes nos Erlenmeyers pode ser
devido ao baixo pH das amostras, ou estresse celular, ou injúria causados pela exposição a
alta temperatura, pois, dentre os fungos considerados deterioradores, sendo os mais
frequentes Neosartoria fischeri e Byssochlamys spp., crescem melhor em pH superiores a 3,0
(SOUZA; PEÑA; FIOROTTI, 2011; NUNES et al., 2012).
Porém foi observado crescimento fúngico em 10 placas, nas quais o néctar foi incubado
diluído em meio de cultura de dupla concentração, sendo sete placas de néctar sabor laranja,
de duas marcas X e Z, duas de sabor misto de uva e maçã, da marca X, e uma de uva, da marca
Z, com um total de 15 isolados fúngicos (Figura 9). Dentre as três marcas analisadas, nenhum
fungo cresceu na marca Y.
46
Sabor Laranja
Marca X XL 31 Placa I
XL 33 Placa I
XL 33 Placa II
XL 33 Placa III
XL 33 Placa IV
Marca Z
ZL 31 Placa I
ZL 32 Placa I
Sabor Uva – Marca Z ZU 13 Placa I
Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA.
47
Sabor Misto de Uva e Maçã – Marca X XUm 11 Placa I
XUm 11 Placa II
Figura 9. Crescimento fúngico do néctar plaqueado com meio de cultura BDA (continuação).
O crescimento fúngico em algumas placas pode ser devido ao aumento do valor do pH,
pois o mesmo se torna levemente elevado com a adição do meio de cultura. Esse crescimento
foi lento, em relação ao tempo médio de crescimento em condições normais para fungos
filamentosos, em torno de sete dias em temperatura ambiente, e se deu próximo às bordas
das placas, sugerindo certa demanda de oxigênio para que esses fungos pudessem crescer
naquele ambiente.
Os resultados obtidos corroboram com a ideia de que os baixos valores de pH não
caracterizaram um fator limitante para o crescimento fúngico, desde que se tivesse a presença
de formas de resistência, como esporos ou ascosporos, do mesmo nos néctares analisados,
como ocorreu nas marcas X e Z.
Os fungos que cresceram nas placas foram isolados em tubos de ensaio com meio de
cultura BDA, e após setes dias foram armazenados em geladeira a temperatura de 5 °C para
posteriormente serem identificados.
5.3 IDENTIFICAÇÃO EM GÊNERO DOS FUNGOS ISOLADOS DOS NÉCTARES
Dentre os fungos isolados, foram identificados sete pertencentes ao grupo dos
“Aspergillus e seus teleomorfos”, e oito ao grupo dos “Penicillium e gêneros relacionados”, de
acordo com a chave geral para fungos deteriorantes proposta por Pitt e Hocking (2009)
(Apêndice D).
Todos os sete fungos do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” foram isolados de
néctar sabor laranja, tanto da marca X quanto da marca Z. As características macroscopia e a
48
microscopia dos isolados foram observadas e analisadas de acordo com as descrições de Pitt
e Hocking (2009) (Figura 10).
XL 31 IA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 31 IB MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 31 IC MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”.
49
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 31 ID MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 33 IIA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
ZL 32 IA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” (continuação).
50
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
ZL 32 IC MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
Figura 10. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Aspergillus e seus teleomorfos” (continuação).
Os fungos do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”, foram isolados dos três
sabores, sendo cinco do sabor laranja (marcas X e Z), um de uva (marca Z) e dois do misto de
uva e maçã (marca X). E suas características macroscopia e a microscopia também foram
observadas e analisadas de acordo com as descrições de Pitt e Hocking (2009) (Figura 11).
XL 33 IA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”.
51
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 33 IIIA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XL 33 IV MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XUm 11 A MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados”
(continuação).
52
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
XUm 11 B MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
ZL 31 IA MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados” (continuação).
53
ZL 32 IE MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
ZU 13 I MACROSCOPIA
CYA 5°C
CYA 25°C
CYA 37°C
G25N 25°C
MEA 25°C
MICROSCOPIA
CYA 25°C
CYA 37°C
MEA 25°C
Figura 11. Macroscopia e microscopia (400x) dos isolados do grupo “Penicillium e gêneros relacionados” (continuação).
Para Pitt e Hocking (2009), espécies de Aspergillus competem com espécies de
Penicillium e Fusarium pela dominância no mundo da flora fúngicas. Aspergilli normalmente
crescem mais rápido que Penicillia, embora eles levem mais tempo para esporular, e
geralmente produzem esporos que são mais resistentes a luz e substâncias químicas. Dessa
forma pode-se dizer que espécies de Aspergillus dominam a deterioração nos trópicos
enquanto que as espécies de Penicillium dominam nas regiões temperadas.
Os estudos realizados por King, Michener e Ito (1969), Hoffmann et al. (1998), Sousa
et al. (2001), Marcolino (2003), Tournas, Heeres e Burgess (2006), Fukumoto (2012), e Silva
54
(2013), relatam a presença de fungos em bebidas à base de frutas, como laranja e uva, como
pode ser observado no Quadro 2.
Fungo Isolado Produto Referência
Aspergillus sp.
Penicillium sp.
Uva e suco de uva King, Michener e Ito (1969).
Fungos filamentosos
(sem identificação)
Suco de laranja integral Hoffmann et al. (1998);
Sousa et al. (2001).
Neosartorya fischeri Bebida de uva pasteurizada Marcolino (2003).
Penicillium spp. Suco de uva Tournas, Heeres e Burgess (2006).
Aspergillus sp.
Penicillium sp.
Néctar de uva Fukumoto (2012).
Fungos filamentosos
(sem identificação)
Suco de laranja Silva (2013).
Quadro 2. Dados da literatura referente aos fungos termorressistentes isolados de bebidas à base de frutas .
Os resultados relativos à identificação dos fungos isolados corroboram os resultados
descritos na literatura, pois os fungos isolados e identificados como pertencentes aos grupos
“Aspergillus e seus teleomorfos” e “Penicillium e gêneros relacionados”, no presente trabalho,
são os mesmos grupos já descritos na literatura específica.
55
6 CONCLUSÕES
A avaliação para a presença de fungos termorresistentes em néctares industrializados
nos sabores laranja e uva comercializados na região metropolitana do Estado do Rio de Janeiro
identificou fungos pertencentes aos grupos “Aspergillus e seus teleomorfos” e “Penicillium e
gêneros relacionados” em seis amostras das 63 analisadas, equivalendo a 9,5% do total de
amostras do estudo.
Dentre os quinze fungos termorresistentes isolados, 46,7% (sete isolados) pertencem
ao grupo “Aspergillus e seus teleomorfos”, e 53,3% (oito isolados) pertencem ao grupo
“Penicillium e gêneros relacionados”.
56
7 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Os baixos valores de pH nas amostras, não seriam um fator limitante, pois fungos
deteriorantes em bebidas conseguem se reproduzir nessas condições . Porém, não houve
crescimento em todas as marcas analisadas, possivelmente por não apresentarem formas
termorresistente, como esporos e ascosporos, indicando boa prática de fabricação do produto
e boa manipulação na análise. Sendo a marca Y, a única que não teve crescimento em
qualquer de suas amostras, mas também foi a que apresentou os menores valos de pH.
Uma análise da medição do pH do néctar tratado termicamente e adicionado do meio
de cultura, feita com fita de pH, mostrou valores de pH acima daqueles obtidos do néctar sem
tratamento térmico e sem adição do meio de cultura, no sabor misto de uva e maçã.
Isso poderia justificar o crescimento fúngico em placas com o néctar diluído em meio
de cultura, que poderia ser devido ao pH ter sido levemente elevado, sendo esse crescimento
lento e próximo às bordas da placa. Já o não crescimento fúngico em frascos de Erlenmeyers,
poderia ser atribuído ao baixo pH, ou estresse celular, ou injúria causados pela exposição a
alta temperatura, desfavorecendo o desenvolvimento do fungo.
57
8. REFERÊNCIAS
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64
APÊNDICE A
Códigos para as marcas de sabor laranja.
MARCA SABOR LOTE REPLICATA CÓDIGO
X
Laranja (L)
1
1 XL 11
2 XL 12 3 XL 13
2
1 XL 21 2 XL 22
3 XL 23
3
1 XL 31 2 XL 32
3 XL 33
Y
Laranja (L)
1
1 YL 11
2 YL 12 3 YL 13
2
1 YL 21
2 YL 22 3 YL 23
3
1 YL 31 2 YL 32
3 YL 33
Z
Laranja (L)
1
1 ZL 11
2 ZL 12
3 ZL 13
2
1 ZL 21
2 ZL 22
3 ZL 23
3
1 ZL 31
2 ZL 32
3 ZL 33
65
APÊNDICE B
Códigos para as marcas de sabor uva.
MARCA SABOR LOTE REPLICATA CÓDIGO
X
Uva (U)
1
1 XU 11
2 XU 12 3 XU 13
2
1 XU 21 2 XU 22
3 XU 23
3
1 XU 31 2 XU 32
3 XU 33
Y
Uva (U)
1
1 YU 11
2 YU 12 3 YU 13
2
1 YU 21
2 YU 22 3 YU 23
3
1 YU 31 2 YU 32
3 YU 33
Z
Uva (U)
1
1 ZU 11
2 ZU 12
3 ZU 13
2
1 ZU 21
2 ZU 22
3 ZU 23
3
1 ZU 31
2 ZU 32
3 ZU 33
66
APÊNDICE C
Códigos para as marcas de sabor misto de uva e maçã.
MARCA SABOR LOTE REPLICATA CÓDIGO
X
Uva + Maçã (Um)
1
1 XUm 11
2 XUm 12
3 XUm 13
2
1 XUm 21
2 XUm 22
3 XUm 23
3
1 XUm 31
2 XUm 32
3 XUm 33
67
APÊNDICE D
Identificação e origem dos isolados.
Grupo de Identificação Isolados Origem
“Aspergillus e seus teleomorfos”
XL 31 IA XL 31 IB
XL 31 IC XL 31 ID
Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 1
XL 33 IIA Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 3
ZL 32 IA ZL 32 IC
Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 2
“Penicillium e gêneros relacionados”
XL 33 IA
XL 33 IIIA XL 33 IV
Marca X; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 3
XUm 11 I XUm 11 II
Marca X; Sabor Misto Uva e Maçã; Lote 1; Replicata 1
ZL 31 IA Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 1
ZL 32 IE Marca Z; Sabor Laranja; Lote 3; Replicata 2
ZU 13 I Marca Z; Sabor Uva; Lote 1; Replicata 3
68
ANEXO A
Fórmula do meio de cultura Batata Dextrose Ágar (BDA):
Batata Dextrose Ágar (BDA): Meio BDA em pó (Merck) 39g Água destilada 1000mL
Batata Dextrose Ágar (BDA) em dupla concentração:
Meio BDA em pó (Merck) 78g Água destilada 1000mL
69
ANEXO B
Meios de cultura para identificação (PITT & HOCKING, 2009):
Czapek Yeast Extrac Agar (CYA) K2HPO4 1g Concentrado Czapek*1 10mL Solução de metal traço*2 1mL
Extrato de levedura 5g Sacarose 30g
Ágar 15g Água destilada 1000mL
Ágar Glicerol Nitrato 25% (G25N):
K2HPO4 0,75g Concentrado Czapek*1 7,5mL
Extrato de levedura 3,7g Glicerol, grau analítico 250mL
Ágar 12g Água destilada 750mL
Ágar Extrato de Malte (MEA): Extrato de Malte 20g Peptona 1g Glicose 20g Ágar 20g Água destilada 1000mL
*1 Concentrado Czapek:
NaNO3 30g KCl 5g MgSO4 . 7H2O 5g FeSO4 . 7H2O 0,1g Água destilada 100mL
*2 Solução de metal traço:
CuSO4 . 5H2O 0,5g ZnSO4 . 7H2O 1g Água destilada 100mL
70
ANEXO C
Corante para identificação (PITT & HOCKING, 2009):
Lactofucsina: Fucsina ácida (1%) 0,1g
Ácido lático 85% 100mL
71
ANEXO D
Ficha de Identificação – Chave Geral para Fungos em Alimentos
(Pitt & Hocking, 2009 – p.55)
Nome da Cepa: ___________________________________
Origem: ________________________________________________________________________________ _ __ _
Data de Isolamento: __________________ Data de Identificação: ___________________
Característica CYA 5°C CYA 25°C CYA 37°C G25N 25°C MEA 25°C
Tamanho da
colônia (7 dias)
Cor da colônia
Hifa sepatada
ou asseptada
Esporos madu-
ros (7 dias)
Cor dos
esporos
Tamanho e for-
ma do esporo
(conídio)
Presença de
fiálides
Presença de
métulas
Presença de
vesícula
Observações:
___________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________
___________________________________________________________________________________________