UNIVERSITE PARIS 12 – VAL DE MARNE
THESE
présentée pour obtenir le grade de
DOCTEUR de l’Université Paris 12 – Val de Marne
Spécialité : Sciences de l’Univers et de l’Environnement
par
Catherine GOUNOU
MOBILITE DES ELEMENTS TRACES METALLIQUES DANS LES SEDIMENTS : COUPLAGE ET COMPARAISON DES APPROCHES
CHIMIQUE ET MICROBIOLOGIQUE Soutenue le 09 juillet 2008 devant le jury : M. Daniel THEVENOT Président du jury M. Jacques BERTHELIN Rapporteur M. Philippe CAMBIER Rapporteur M. Philippe BATAILLARD Examinateur Mme Tatiana VALLAEYS Examinatrice M. Jean-Marie MOUCHEL Directeur de thèse M. Noureddine BOUSSERRHINE Directeur de thèse
Remerciements
2
Remerciements
Au terme de cette thèse, effectuée conjointement au CEREVE et à l’UMR 137 IRD-BIOSOL
(équipe Biologie des Sols et des Eaux) de l’Université Paris12-Val de Marne, je souhaite
remercier un grand nombre de personnes qui, de près ou de loin, ont contribué à son
aboutissement.
En premier lieu, mes remerciements s’adressent aux personnes qui ont accepté de juger ces
recherches : Daniel Thévenot, Professeur Emérite du CEREVE qui m’a fait l’honneur de
présider le jury ; Philippe Cambier et Jacques Berthelin, directeurs de recherche,
respectivement à l’INRA de Versailles et au LIMOS-CNRS de Nancy qui se sont intéressés à
ce travail en tant que rapporteurs ainsi que Philippe Bataillard, chargé de recherche au BRGM
d’Orléans et Madame Tatiana Vallaeys, chargée de recherche à l’INRA de Jouy pour avoir
accepté d’endosser le rôle d’examinateur.
J’exprime ensuite toute ma reconnaissance à Jean-Marie Mouchel, Professeur au laboratoire
Sysiphe, de l’Université Pierre et Marie Curie, qui a pris le temps de diriger ce travail. Je lui
sais gré de ses conseils précieux, notamment pour l’interprétation des résultats et la rédaction
de ce mémoire.
J‘adresse également ma gratitude à Noureddine Bousserrhine, maître de conférences à l’UMR
BIOSOL (équipe Biologie des Sols et des Eaux), qui a co-encadré ma thèse durant ces 4
années. Grâce à lui, la découverte du monde mystérieux de la microbiologie et de la biologie
moléculaire fut passionnante. En outre, j’ai pris conscience de l’interaction entre la géochimie
et la microbiologie. Je le remercie également pour avoir pris le temps de me conseiller dans la
mise en œuvre des expériences, l’interprétation et la rédaction des résultats microbiologiques.
Un grand merci à Gilles Varrault, maître de conférences au CEREVE, qui m’a également
aidée pour l’interprétation des résultats des analyses de métaux et la relecture de mon
mémoire. Je lui suis reconnaissante d’avoir mis à ma disposition l’ICP-AES et d’avoir investi
dans un pH-stat pour mener à bien mes expérimentations.
Certains résultats n’auraient pu être obtenus sans la collaboration de Sophie Ayrault du
Laboratoire des Sciences du Climat et de l’Environnement pour l’analyse des métaux par ICP-
MS ni celle de Marie-Claude Millot et Mohamed Guerrouache de l’équipe des Systèmes
Remerciements
3
Polymères Complexes pour leur aide scientifique et technique dans la séparation des acides
organiques par HPLC. Qu’ils trouvent ici mes très grands remerciements.
Merci à Catherine Lorgeoux et Mohamed Saad, ingénieurs au CEREVE pour leur aide
respective dans l’analyse par chromatographie ionique et du carbone organique dissous.
Cette thèse n’aurait pu avoir lieu sans l’obtention des matières premières : les sédiments ! Je
remercie donc le Service Navigable de la Seine pour nous avoir autorisés à effectuer les
prélèvements dans la Seine et la Marne et avoir mis à notre disposition son personnel très
sympathique et ses remarquables embarcations…dont une a malencontreusement coulé lors
de l’une de nos campagnes de prélèvements, conséquence d’un feu de moteur ! Les
prélèvements sont parfois source de prise de risques !
Je remercie tout le personnel des laboratoires du CEREVE et du LBSE, en particulier :
- Evelyne Garnier-Zarli, Professeur et Directrice du LBSE pour m’avoir accueillie au sein de
son laboratoire,
- Maman Catherine Martin, secrétaire très dévouée du LBSE pour m’avoir soutenue durant
toute ma thèse et en particulier lors de la rédaction et …
- mes «compagnonnes» de route, Jennifer Harris et Marieke Demoucron, doctorantes, avec
qui j’ai partagé ces 4 années de thèse au quotidien, pour leur bonne humeur et leur soutien
moral.
Enfin, je remercie mes parents qui m’ont toujours encouragée, tout particulièrement dans les
moments difficiles.
Résumé
4
Résumé Les activités anthropiques entraînent une contamination des sédiments de rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). Si la majorité des ETM se retrouvent piégés dans les sédiments, ceux-ci peuvent être remobilisés et passer en solution dans certaines conditions physico-chimiques et sous l’action des microorganismes autochtones. Les métaux relargués peuvent alors constituer un danger potentiel pour les organismes vivants dans les sédiments et dans la colonne d'eau. Dans le cas des sols, l’impact de l’activité microbienne autochtone sur la mobilité des ETM a souvent été rapporté. Cependant une telle activité de solubilisation n’a été que rarement étudiée dans le cas des sédiments. Une telle connaissance est pourtant importante pour la prédiction du comportement des métaux contenus dans les sédiments et la gestion de ces derniers, notamment lors de leur stockage suite aux opérations de dragage. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans les sédiments en conditions anaérobies. La première phase de notre étude qui a consisté à incuber des sédiments de Seine et de Marne en milieu anaérobie dopé en glucose avait pour objectif d’étudier la corrélation entre le métabolisme microbien et le comportement des métaux en solution et dans les sédiments. Dans ces conditions opératoires, une forte solubilisation du fer et du manganèse (sous forme réduite) associée à une solubilisation de métaux traces (Co, Cu, Ni) a été mise en évidence, ce qui a laissé supposer l’intervention de bactéries ferri-réductrices dans les phénomènes observés. Une activité fermentaire importante a été observée et caractérisée par la production d’acides organiques majoritaires tels que les acides acétique et butyrique. Un tel résultat souligne l’importance des bactéries fermentatrices dans les phénomènes de dissolution observés. La deuxième étape de ce travail a consisté à confirmer l’importance de l’activité ferri-réductrice et à en identifier les acteurs principaux. Les analyses moléculaires menées ont montré que les bactéries ferri-réductrices majoritairement identifiées, appartiennent aux espèces Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa. L’utilisation d’un modèle géochimique nous a permis de montrer que les voies métaboliques supportant la réduction du fer et la mobilité des métaux étaient les fermentations butyrique et acétique. La troisième étape a consisté à comparer les impacts directs (réduction enzymatique) et indirects (propriétés des acides organiques produits) de Paenibacillus polymyxa et Clostridium butyricum sur la mobilité du fer, du manganèse et des autres métaux. Une telle étude a montré que les acides organiques produits (acétique, lactique, succinique, propionique et butyrique) ont un très faible impact sur la solubilisation aux pH rencontrés dans les sédiments et que la réduction enzymatique microbienne est le principal mécanisme de dissolution des éléments métalliques en milieu anaérobie.
Mots-clés : éléments traces métalliques, sédiments, bactéries ferri-réductrices, fermentation
Abstract
5
Abstract Antropic activities lead to the metallic contamination of river sediments. Most of trace metals are sorbed on sediments but a part of them can be released into aquatic environment when environmental conditions are modified. This is often due by the autochthonous microbial activity. Microbial activites and their consequences on the mobility of metals have been widely studied in soils. Metals are released through direct or indirect microbial mechanisms. Such studies in the case of sediments are very seldom. However, it can be usefull to understand the microbial mechanisms of metal release in sediments, and particularly for a good management of dredged sediments. In this environmental framework, the aim of this research work was to understand and to evaluate the role of the microbial and chemical mechanisms in the release of metals from river sediments in anaerobic conditions. Firstly, sediments from the Marne and Seine rivers were incubated in anaerobic conditions. A high solubilisation of iron and manganese occurred associated to the solubilisation of trace metals (Co, Cu, Ni, Pb). Meanwhile, organic acids were produced and the medium was acidified. Thus fermentation was supposed to be the main process of microbial metabolism. Furthermore these observations led us to suppose the presence of iron-reducing bacteria.
In a second step, the extent of the iron-reducing activity was studied. The main iron-reducing bacteria identified in the Marne sediments belonged to the species Clostridium butyricum and Paenibacillus polymyxa. The use of a geochemical model revealed that fermentation and reduction of iron(III) were the main metabolic pathways. Finally direct (enzymatic reduction) and indirect (complexation with organic acids, acidification) impacts of iron-reducing bacteria on the release of metals were compared. Acidification and organic acids had a weak impact on metal solubility in the range of studied pH (between 6,5 and 5). Enzymatic reduction is the main mechanisms of metal release in anaerobic conditions. Indeed the metallic concentrations can be 40 times higher in the presence of iron-reducing bacteria. Key-words: trace metals, sediments, iron-reducing bacteria, fermentation
Table des matières
6
Table des matières
Remerciements..................................................................................................... 2
Résumé ................................................................................................................. 4
Abstract ................................................................................................................ 5
Table des matières ............................................................................................... 6
Liste des figures ................................................................................................. 13
Liste des tableaux .............................................................................................. 16
Introduction générale........................................................................................ 20
Partie 1 : Synthèse bibliographique................................................................. 23
I. Les éléments traces métalliques dans l’environnement.......................... 24
I.1. Définition des éléments traces métalliques........................................................... 24
I.1.1. Classification et propriétés physico-chimiques des ETM ................................ 24
I.1.2. Toxicité............................................................................................................. 27
I.2. Origine des éléments traces métalliques dans l’environnement aquatique ...... 29
I.2.1. Origine naturelle............................................................................................... 29
I.2.2. Origine anthropique.......................................................................................... 31
I.3. Cycle des éléments traces métalliques dans l’environnement aquatique.......... 34
I.4. Cas du bassin versant de la Seine ......................................................................... 37
I.4.1. Présentation du bassin versant de la Seine ....................................................... 37
I.4.2. Contribution des différents compartiments à la pollution métallique du bassin
versant .......................................................................................................................... 38
I.4.3. Zones contaminées en ETM dans le bassin versant de la Seine....................... 41
II. Les éléments traces métalliques dans les sédiments................................ 42
II.1. Formation des sédiments ....................................................................................... 42
II.1.1. Origine des particules sédimentaires................................................................ 42
II.1.2. Sédimentation, diagénèse des sédiments et rôle dans la mobilité des ETM et
éléments majeurs .............................................................................................................. 43
II.2. Propriétés physico-chimiques des sédiments ....................................................... 48
II.2.1. Granulométrie des sédiments ........................................................................... 48
II.2.2. Composition minéralogique des sédiments...................................................... 48
Table des matières
7
II.3. Interaction entre éléments traces métalliques et composants des sédiments : cas
des oxydes de fer................................................................................................................. 51
II.3.1. Mécanismes d’immobilisation des ETM sur les oxydes de fer........................ 51
II.3.2. Mobilité des ETM associés aux oxydes de fer ................................................. 54
II.3.3. Importance de l’étude des oxydes de fer et des ETM associés d’un point de vue
environnemental ............................................................................................................... 57
III. Rôle des microorganismes dans la mobilité des ETM ............................ 57
III.1. Oxydation des sulfures métalliques .................................................................. 59
III.1.1. Microorganismes impliqués ............................................................................. 59
III.1.2. Mécanismes de lixiviation................................................................................ 59
III.1.3. Importance du contact bactérie-minéral dans le phénomène de biolixiviation 61
III.1.4. Paramètres influençant la lixiviation des sulfures de métaux .......................... 62
III.1.5. Conséquences de l’oxydation des sulfures sur l’environnement ..................... 63
III.2. Réduction des oxydes de Fe (III)....................................................................... 64
III.2.1. Réduction du fer et fermentation...................................................................... 65
III.2.2. Réduction couplée à l’oxydation des acides organiques et composés organiques
aromatiques ...................................................................................................................... 66
III.2.3. Réduction du fer et oxydation du soufre .......................................................... 67
III.2.4. Réduction du fer et oxydation de l’hydrogène ................................................. 68
III.2.5. Importance du contact entre bactéries et oxydes de fer lors de la réduction.... 68
III.2.6. Facteurs influençant la réduction des oxydes de Fe(III) .................................. 70
III.2.7. Conséquences de la réduction des oxydes de Fe sur la mobilité des ETM dans
les sols .......................................................................................................................... 73
III.3. Immobilisation des éléments traces métalliques par les microorganismes... 73
III.3.1. La biosorption .................................................................................................. 73
III.3.2. Précipitation par réduction du soufre et des composés soufrés oxydés ........... 75
IV. Méthodes d’évaluation de la biodisponibilité, mobilité, et spéciation des
ETM dans les sédiments ................................................................................... 76
IV.1. Les extractions simples ...................................................................................... 77
IV.2. Les extractions séquentielles ............................................................................. 78
Partie 2 : Mobilité des éléments traces métalliques et activité microbienne
autochtone : importance des bactéries ferri-réductrices............................... 83
Table des matières
8
Chapitre 1 : Interactions éléments traces métalliques et activité
microbienne autochtone.................................................................................... 84
I. Introduction ................................................................................................ 85
II. Matériel et méthodes .................................................................................. 86
II.1. Sites d’étude et description des lieux de prélèvement......................................... 86
II.2. Matériel utilisé et stockage des échantillons ........................................................ 89
II.2.1. Dispositif expérimental .................................................................................... 89
II.2.2. Caractérisation physico-chimique des sédiments............................................. 91
II.2.3. Suivi du métabolisme microbien...................................................................... 92
II.3. Mobilité des éléments traces métalliques ............................................................. 95
II.3.1. Principe des techniques de spectroscopie utilisées .......................................... 96
II.3.2. Analyse des éléments métalliques totaux......................................................... 96
II.3.3. Analyse des ETM dissous ................................................................................ 97
II.3.4. Répartition des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment
.......................................................................................................................... 98
III. Résultats et discussion.............................................................................. 100
IV. Conclusions et perspectives ..................................................................... 127
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes :
importance des bactéries ferri-réductrices ................................................... 129
I. Introduction .............................................................................................. 130
II. Matériel et méthodes ................................................................................ 131
II.1. Incubation des sédiments et suivi du métabolisme microbien ......................... 131
II.1.1. Incubation des sédiments ............................................................................... 131
II.1.2. Suivi du métabolisme microbien.................................................................... 131
II.2. Caractérisation génétique des communautés microbienne .............................. 133
II.2.1. Principe........................................................................................................... 133
II.2.2. Méthode.......................................................................................................... 133
II.3. Isolement et identification des bactéries ferri-réductrices ............................... 135
II.3.1. Milieu de culture ............................................................................................ 135
II.3.2. Ensemencement et incubation des bactéries .................................................. 136
II.3.3. Vérification de l’activité réductrice de fer des colonies................................. 136
Table des matières
9
II.3.4. Identification des bactéries ferri-réductrices .................................................. 136
II.3.5. Purification de l’ADN .................................................................................... 137
II.3.6. Séquençage de l’ADN et identification des bactéries .................................... 137
III. Résultats et discussion.............................................................................. 140
III.1. Evolution de la densité microbienne au cours de l’incubation..................... 140
III.2. Evolution de la capacité métabolique ............................................................. 141
III.3. Evolution de la diversité microbienne ............................................................ 145
III.4. Importance du fer dans la décomposition de la matière organique dans les
sédiments ........................................................................................................................... 148
III.4.1. Sulfato-réduction............................................................................................ 148
III.4.2. Réduction du fer ............................................................................................. 149
III.5. Estimation des populations microbiennes majoritaires................................ 150
III.6. Identification des bactéries ferri-réductrices................................................. 154
IV. Conclusions et perspectives ..................................................................... 156
Partie 2 : Comparaison des mécanismes microbiologiques et chimiques
dans la mobilité des éléments traces métalliques ......................................... 158
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des éléments
traces métalliques ............................................................................................ 159
I. Introduction .............................................................................................. 160
II. Matériel et méthodes ................................................................................ 161
II.1. Caractéristiques des sédiments étudiés .............................................................. 161
II.2. Incubation des sédiments..................................................................................... 161
II.2.1. Stérilisation des sédiments ............................................................................. 161
II.2.2. Préparation de l’inoculum et ensemencement de Paenibacillus polymyxa.... 162
II.2.3. Incubation....................................................................................................... 162
II.3. Suivi de la croissance microbienne ..................................................................... 162
II.4. Suivi de la mobilité des éléments métalliques .................................................... 163
III. Résultats et discussion.............................................................................. 165
III.1. Métabolisme de Paenibacillus polymyxa......................................................... 165
III.2. Mobilité des éléments métalliques au cours de l’incubation ........................ 168
III.2.1. Eléments métalliques dissous......................................................................... 168
Table des matières
10
III.2.2. Attaque des différentes fractions du sédiment ............................................... 172
III.2.3. Provenance des éléments métalliques solubilisés .......................................... 174
IV. Conclusions et perspectives ..................................................................... 194
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la
mobilité des éléments traces métalliques....................................................... 196
I. Introduction .............................................................................................. 197
II. Matériel et méthodes ................................................................................ 198
II.1. Choix des acides organiques................................................................................ 198
II.2. Dispositif expérimental ........................................................................................ 199
II.3. Modélisation.......................................................................................................... 200
III. Résultats et discussion.............................................................................. 201
III.1. Rôle du pH dans la dissolution des ETM ....................................................... 201
III.2. Rôle des acides organiques dans la dissolution des éléments métalliques... 202
III.2.1. Approche globale ........................................................................................... 202
III.2.2. Etude quantitative........................................................................................... 206
III.3. Bilan : Comparaison de l’effet du pH, des acides organiques et de l’activité
réductrice de Paenibacillus polymyxa. ............................................................................ 217
III.3.1. Eléments du groupe 1 (Fe, Mn, Sr) ................................................................ 218
III.3.2. Eléments du groupe 2 (Co, Ni, Pb) ................................................................ 218
III.3.3. Eléments du groupe 3 (Cd, Ag)...................................................................... 219
IV. Conclusions et perspectives ..................................................................... 220
Conclusions générales et perspectives ........................................................... 221
Bibliographie.................................................................................................... 226
Annexes............................................................................................................. 254
Annexe 1 : Caractéristiques analytiques de la mesure du CO2 .................. 255
Annexe 2 : Caractéristiques analytiques du dosage du glucose par
spectrophotométrie UV (avec le kit D-Glucose, Roche) .............................. 258
Annexe 3 : Caractéristiques analytiques de la séparation et de la
quantification des acides organiques par HPLC.......................................... 259
Table des matières
11
Annexe 4 : Exemples de gammes d’étalonnage du carbone organique
dissous 264
Annexe 5 : Caractéristiques analytiques des mesures de métaux en ICP-
AES et ICP-MS................................................................................................ 266
Annexe 6 : Exemple de gamme d’étalonnage du Fe(II)............................... 267
Annexe 7 : Spéciation des métaux dans les sédiments ................................. 268
Mise en place et vérification du protocole..................................................... 268
I. Introduction .............................................................................................. 269
II. Matériels et méthodes............................................................................... 270
II.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique .......................................... 270
II.1.1. Dopage des acides humiques.......................................................................... 270
II.1.2. Dissolution des acides humiques par l’hydroxyde de sodium ....................... 271
II.1.3. Dissolution des acides humiques par le pyrophosphate de sodium ............... 271
II.2. Dissolution des métaux liés aux sulfures ............................................................ 272
II.2.1. Hydroxyde de sodium puis acide nitrique...................................................... 272
II.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique ............................................... 272
III. Résultats et discussion.............................................................................. 273
III.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique (acides humiques dopés) ..
............................................................................................................................ 273
III.1.1. Par l’hydroxyde de sodium ............................................................................ 273
III.1.2. Par le pyrophosphate de sodium..................................................................... 273
III.2. Dissolution des sulfures de métaux ................................................................. 274
III.2.1. Par l’hydroxyde de sodium puis par l’acide nitrique ..................................... 274
III.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique ................................................ 275
IV. L’acétate d’ammonium, solubilisant d’une partie des métaux liés aux
acides humiques ?............................................................................................ 277
IV.1. Matériel et méthodes........................................................................................ 278
IV.1.1. Dopage des acides humiques.......................................................................... 278
IV.1.2. Dissolution par l’acétate d’ammonium .......................................................... 278
IV.2. Résultats ............................................................................................................ 278
IV.2.1. Cadmium ........................................................................................................ 278
Table des matières
12
IV.2.2. Fer................................................................................................................... 278
IV.2.3. Plomb ............................................................................................................. 278
IV.2.4. Zinc................................................................................................................. 279
IV.2.5. Conclusions .................................................................................................... 279
V. Conclusion ................................................................................................. 279
Bibliographie.................................................................................................... 280
Annexe 8 : Description des plaques biolog (familles et composés) ............. 282
Annexe 9 : Validation de l’analyse des sulfates ............................................ 284
Annexe 10 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le calcul des
indices de saturation des minéraux métallo-carbonatés.............................. 286
Annexe 11 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le calcul des
indices de saturation des sulfures métalliques.............................................. 287
Annexe 12 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées pour la
modélisation de la spéciation des métaux en fonction du pH et des acides
organiques ........................................................................................................ 288
Annexe 13 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées pour la
modélisation de la spéciation des métaux à pH 6 avec mélange des acides
organiques ........................................................................................................ 292
Liste des figures
13
Liste des figures
Figure 1 : Classification périodique des éléments.................................................................... 26
Figure 2 : Schématisation du cycle hydrologique des métaux traces en milieu aqueux (d’après
Salomons et Förstner, 1984)..................................................................................................... 35
Figure 3 : Carte du bassin versant de la Seine (Piren-Seine) ................................................... 37
Figure 4: Profils de As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb, Zn, Mn, Fe, SO42-, ΣH2S et pH dans l’eau
interstitielle dans les sédiments du Lac Chevreuil (Huerta-Diaz et al., 1998) (○), (∆) et (□)
représentent 3 profils différents. La flèche indique les limites de détections analytiques. ...... 46
Figure 5 : Schématisation de la complexation externe et interne à la sphère d’hydratation
(Sposito, 1989) ......................................................................................................................... 53
Figure 6 : Interactions microorganismes-métaux (d’après Ledin, 2000) ................................. 58
Figure 7 : Mécanismes de solubilisation des sulfures de métaux acido-solubles par attaque
chimique et microbiologique (Schippers et Sand, 1999) ......................................................... 60
Figure 8 : Mécanisme de dissolution des sulfures de métaux acido-insolubles par attaque
chimique et microbiologique (Schippers et Sand, 1999) ......................................................... 61
Figure 9 : Réduction dissimilatrice des oxydes de fer et fermentation (Lovley, 1991) ........... 65
Figure 10 : Réduction du Fe(III) via les acides humiques ....................................................... 69
Figure 11 : Mécanisme de réduction des oxydes de Fe(III) via les sidérophores .................... 70
Figure 12 : Concentration de Fe réduit par Vibrio en fonction de la température (d’après Jones
et al, 1984)................................................................................................................................ 71
Figure 13 : Populations bactériennes impliquées dans la réduction du soufre et ses formes
oxydées (d’après Boust et al, 1999) ......................................................................................... 75
Figure 14 : Carte du bassin versant de la Seine en amont et en aval de l’agglomération
parisienne ................................................................................................................................. 86
Figure 15 : Carte du site de Méry-sur-Marne (a) et détails du lieu de prélèvement (b)........... 87
Figure 16 : Carte du site d’Andrésy (a) et détails du lieu de prélèvement (b) ......................... 88
Figure 17 : Incubation en batch des sédiments ........................................................................ 90
Figure 18 : Evolution de la densité microbienne au cours des incubations des sédiments de
Marne et de Seine avec 0,5 % de glucose .............................................................................. 140
Figure 19 : Evolution de la dégradation des sources de carbones dans les sédiments de la
Marne (a) et de la Seine (b) .................................................................................................... 142
Figure 20 : Evolution de la concentration en glucose et acides organiques dans les incubations
des sédiments de la Marne et de la Seine (0,5 % de glucose) ................................................ 143
Liste des figures
14
Figure 21 : Evolution des profils DGGE au cours de l’incubation (en semaine) des sédiments
de Marne (a) et de Seine (b) ................................................................................................... 147
Figure 22 : Evolution des sulfates dans les incubations de la Marne (a) et de la Seine (b) ... 149
Figure 23 : Evolution des teneurs en Fe désorbé (µg.g-1 sédiments secs) dans les sédiments de
la Seine et de la Marne ........................................................................................................... 150
Figure 24 : Consommation de glucose et production d’acides organiques au cours de
l’incubation de P.polymyxa (barres d’erreur = écart-types des 3 réplicats) ........................... 165
Figure 25 : Evolution du pH au cours de l’incubation en présence de P. polymyxa (barres
d’erreur = écart-types des 3 réplicats) .................................................................................... 167
Figure 26 : Dissolution du Fe, Mn et Sr au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres
d’erreur = écart-types des 3 réplicats) .................................................................................... 168
Figure 27 : Dissolution du Co, Cr, Ni et Pb au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres
d’erreur = écart-types des 3 réplicats) .................................................................................... 169
Figure 28 : Dissolution de l’Ag, Cd et Cu au cours de l’incubation avec P. polyxmyxa (barres
d’erreur = écart-types des 3 réplicats) .................................................................................... 170
Figure 29 : Teneurs en Mn en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes
phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................................... 176
Figure 30 : Teneurs en Sr en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes
phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................................... 177
Figure 31 : Teneurs en Co en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les
différentes phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................. 178
Figure 32 : Teneurs en Ni en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les
différentes phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................. 179
Figure 33 : Teneurs en Pb en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les
différentes phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................. 180
Figure 34 : Teneurs en Cr en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les
différentes phases du sédiment (dans les 3 réplicats)............................................................. 181
Figure 35 : Evolution du taux de dissolution des fractions du sédiment au cours de
l’incubation............................................................................................................................. 186
Figure 36 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates+oxydes
de Mn, oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de
l’incubation............................................................................................................................. 187
Liste des figures
15
Figure 37 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates, oxydes de
Mn + oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de
l’incubation............................................................................................................................. 188
Figure 38 : Dispositif expérimental du pH-stat (vue d’ensemble) ......................................... 200
Figure 39 : Evolution de la concentration en métaux dissous en fonction du pH en absence de
P. polymyxa ............................................................................................................................ 201
Figure 40 : Concentrations en métaux dissous en présence des acides lactique, acétique,
succinique et de la bactérie P.polymyxa en fonction du pH................................................... 205
Figure 41 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’acétate (400 mg.l-1)en
fonction du pH........................................................................................................................ 207
Figure 42 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au lactate (700 mg.l-1) en
fonction du pH........................................................................................................................ 208
Figure 43 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au succinate (480 mg.l-1)
en fonction du pH................................................................................................................... 209
Figure 44 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au propionate (100 mg.l-
1) en fonction du pH ............................................................................................................... 211
Figure 45 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liée au butyrate (1 g.l-1) en
fonction du pH........................................................................................................................ 212
Figure 46 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’oxalate (1 g.l-1) en
fonction du pH........................................................................................................................ 213
Figure 47 : Concentration maximale de CO2 (vpm) mesurée dans le flux d’azote en fonction
de la masse de CO2 injectée (mg)........................................................................................... 257
Figure 48 : Gammes étalons de chaque acide organique étudié ............................................ 262
Liste des tableaux
16
Liste des tableaux
Tableau 1 : Teneurs du fonds géochimique des éléments majeurs et des éléments traces dans
la croûte terrestre (Baize, 1997) ............................................................................................... 30
Tableau 2 : Emissions totales moyennes des ETM (tonnes.an-1) dans l’atmosphère en France
métropolitaine en 1990 et 2006 ainsi qu’en Europe (2005) (CITEPA, 2007; Mathias, 2007) 31
Tableau 3 : Quantités de minerais de métaux extraits en 1998 au Canada (kt), (Statistiques
Canada, 1998)........................................................................................................................... 33
Tableau 4 : Emission atmosphérique dans le bassin versant de la Seine jusqu’à l’entrée de
l’estuaire, Poses (64700 km²) par catégorie de source (an 2000) ; 1. Emission atmosphérique
annuelle (t.an-1) (CITEPA, 2007) 2. Importance relative des sources majeures d’émission : ‘-
‘<1% ; 1%≤*<10% ; 10%≤**<20% ; ***≥20%...................................................................... 38
Tableau 5 : Teneurs de fond moyennes en ETM dans les sédiments du bassin de la Seine
(µg.g-1) (Meybeck et al, 1998) ................................................................................................. 39
Tableau 6 : Apports de métaux dans les zones cultivées du bassin de la Seine (t.an-1)
(Thevenot et al, 2007) .............................................................................................................. 40
Tableau 7 : Stocks d’ETM dans le bassin urbain de Paris et sa banlieue (t.an-1) (Thévenot et
al, 2007) ................................................................................................................................... 40
Tableau 8 : Rétention des ETM (t.an-1) dans le système aquatique par le stockage des
particules dans le bassin versant de la Seine (Thévenot et al, 2007) ....................................... 41
Tableau 9 : Ordre d’apparition des réactions de réduction couplées à l’oxydation de la matière
organique (Reeburgh, 1983)..................................................................................................... 43
Tableau 10 : Exemples de microorganismes fermenteurs et réduisant le fer(III) en présence de
différentes sources de carbone donneuses d’électrons (Bousserrhine, 1995) .......................... 66
Tableau 11 : Pourcentage de fer réduit par les bactéries ferri-réductrices en fonction de la
surface de goethite (d’après Roden et Zachara (1996)) ........................................................... 71
Tableau 12 : Pourcentage de réduction du Fe(III) en fonction du pourcentage de substitution
de l’Al sur une goethite par Clostridium butyricum (Dominik et al, 2002)............................. 72
Tableau 13 : Pourcentage de fer et d’ETM solubilisé par Clostridium butyricum en fonction
de l’ETM de substitution sur une goethite (Bousserrhine et al, 1999a)................................... 72
Tableau 14 : Facteurs à l’origine de la mobilité des métaux traces dans les différents minéraux
du sédiment (d’après Pickering, 1986)..................................................................................... 78
Tableau 15 : Procédures d’extraction séquentielle généralement employées dans la littérature
.................................................................................................................................................. 80
Liste des tableaux
17
Tableau 16 : Exemple de répartition des ETM et éléments majeurs dans différents de
sédiments (%) par la méthode d’extraction séquentielle de Tessier ....................................... 81
Tableau 17 : Paramètres physico-chimiques analysés pour la caractérisation des sédiments . 91
Tableau 18 : Conditions de minéralisation des sédiments ....................................................... 97
Tableau 19 : Caractéristiques des amorces utilisées au cours de la caractérisation génétique de
la communauté microbienne totale et de l’identification des bactéries ferri-réductrices....... 135
Tableau 20 : Capacité des microorganismes des sédiments de la Marne et de la Seine à
dégrader le glucose et les acides organiques au cours du temps............................................ 143
Tableau 21 : Concentrations en glucose, sulfates, fer dissous, acide butyrique et acétique (en
mg.l-1) utilisées pour modéliser l’importance des communautés microbiennes .................... 151
Tableau 22 : Estimation de la biomasse des différentes communautés microbiennes
fonctionnelles dans les sédiments de la Marne et de la Seine................................................ 152
Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments de Marne (mai 2006)........ 161
Tableau 24 : Teneurs en métaux totaux (µg.g-1 de sédiments secs) dans les sédiments de la
Marne ..................................................................................................................................... 161
Tableau 25 : Résumé des différentes étapes de l’extraction séquentielle (oxydes de Fe
amorphes/cristallins) .............................................................................................................. 164
Tableau 26 : Masse de C produite (mg) ou disparue pendant l’incubation de P. polymyxa .. 166
Tableau 27 : Comparaison des bilans en carbone obtenus après consommation du glucose par
P. polymyxa ............................................................................................................................ 166
Tableau 28 : Calcul des indice de saturation des minéraux métallo-carbonatés à pH 6 par
Visual Minteq......................................................................................................................... 171
Tableau 29 : Teneurs des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment
avant incubation (µg.g-1 de sédiments secs)........................................................................... 173
Tableau 30 : Phases majoritaires et pourcentage de phase attaquée des différents éléments
métalliques au cours de l’incubation (estimation qualitative)................................................ 182
Tableau 31 : Poids attribué à chaque élément métallique dans le calcul des pourcentages de
chaque fraction attaquée......................................................................................................... 183
Tableau 32 : Poids attribué à chacune des mesures observées au cours de l’incubation ....... 184
Tableau 33 : Taux de dissolution (valeurs minimales et maximales) des différentes phases au
4ème jour et en fin d’incubation obtenus pour les différents modèles..................................... 189
Tableau 34 : Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées par les différents modèles et
observées ................................................................................................................................ 190
Liste des tableaux
18
Tableau 35 : Indices de saturation des sulfures métalliques à pH 6 calculé par Visual Minteq
................................................................................................................................................ 192
Tableau 36 : Acides organiques étudiés et produits au cours des essais à partir de 5 g.l-1 de
glucose.................................................................................................................................... 198
Tableau 37 : Pourcentage des formes complexées aux acides entre pH 5 et 6,5 ................... 214
Tableau 38 : Comparaison des teneurs totales théoriques et expérimentales extraites en
métaux à pH 6 en présence d’acides organiques (µg.l-1)........................................................ 215
Tableau 39 : Estimation par Visual Minteq de la distribution (%) des espèces métalliques à pH
6 dans les incubations réalisées avec P.polymyxa.................................................................. 217
Tableau 40 : Part (%) de l’activité réductrice de P.polymyxa, du pH 6 et des acides
organiques dans la solubilisation des éléments métalliques................................................... 217
Tableau 41 : Masse de CO2 injecté (mg) en tenant compte de la diminution de pression en
CO2 dans le flacon due aux prélèvements successifs pour l’injection ................................... 256
Tableau 42 : Concentration maximale de CO2 (vpm) dans le flux d’azote determinée par le
spectrophotomètre Béryl 100 Cosma ..................................................................................... 256
Tableau 43 : Pression partielle de CO2 (Pa) dans le flacon au cours des prélèvements
successifs ................................................................................................................................ 256
Tableau 44 : Facteurs de dilution obtenus en calculant le rapport concentration de CO2 lue sur
le spectrophotomètre (Béryl Cosma 100) sur la concentration de CO2 dans le flacon (vpm) 257
Tableau 45 : Répétabilité de la mesure de l’acide lactique (20 mg.l-1) .................................. 259
Tableau 46 : Domaine de linéarité (mg.l-1) des acides organiques étudiés ............................ 263
Tableau 47 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-AES...................................... 266
Tableau 48 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-MS........................................ 266
Tableau 49 : Protocole d’extraction séquentielle permettant de distinguer les métaux liés à la
matière organique de ceux liés aux sulfures (Campanella et al, 1995).................................. 269
Tableau 50 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par l’hydroxyde
de sodium ............................................................................................................................... 273
Tableau 51 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par le
pyrophosphate de sodium....................................................................................................... 273
Tableau 52 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et
HNO3 (50ml) .......................................................................................................................... 274
Tableau 53 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et
HNO3 (200ml) ........................................................................................................................ 275
Liste des tableaux
19
Tableau 54 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au
pyrophosphate de sodium et HNO3 (50 ml) ........................................................................... 276
Tableau 55 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au
pyrophosphate de sodium et au HNO3 (200 ml) .................................................................... 276
Introduction générale
20
Introduction générale
L’accroissement des activités anthropiques a entraîné une contamination des sédiments de
rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). A la
suite de leurs émissions, la majorité des ETM se trouve sous forme particulaire. Ces particules
sont transportées par ruissellement et se retrouvent en milieu fluvial où elles sédimentent. Si
la plupart des ETM se retrouve piégée dans les sédiments, une partie est susceptible d’être
solubilisée vers la colonne d’eau suite aux modifications des conditions physico-chimiques du
milieu. Par exemple lors des opérations de dragage, une importante solubilisation des ETM
peut survenir suite à l’aération des sédiments. Les ETM ainsi solubilisés peuvent interagir
avec la chaîne alimentaire et présenter un danger potentiel de toxicité pour les organismes
vivants et pour l’Homme.
Plusieurs auteurs ont souligné le lien étroit entre les modifications physico-chimiques du
milieu et l’activité microbienne autochtone. Dans le cas des sols, la mobilité des ETM a
souvent été associée à l’activité des microorganismes aérobies ou anaérobies. Ainsi, en milieu
aérobie, certaines bactéries autotrophes oxydent les sulfures de fer entraînant la production
d’acide sulfurique (Sand et al., 1992; Dopson et Lindström, 1999; Fowler et al., 1999;
Rohwerder et al., 2003). Cette baisse du pH provoque la dissolution d’autres sulfures
métalliques libérant ainsi les ETM en solution. Certains métabolites microbiens, tels que les
acides oxalique ou citrique produits par des microorganismes hétérotrophes ont également
étaient décrits comme étant cause de mobilité, via des phénomènes de complexation, de
certains ETM liés à des minéraux, autres que les oxydes de fer, et réactifs à des modifications
de pH telles que les fractions échangeables ou carbonates (Burckhard et al., 1995; Jones, 1998;
Wasay, 1998; Glover et al., 2002; Araujo do Nascimento, 2006).
En condition anaérobie, la dissolution des oxydes de fer par réduction bactérienne est un
mécanisme très connu et est très largement décrit (Munch et Ottow, 1980; Lovley, 1991;
Bousserrhine, 1995; Roden, 2006). Cette réduction entraîne non seulement la solubilisation du
fer mais celle des ETM qui y sont souvent associés (adsorbés ou en substitution) (Francis et
Dodge, 1988, 1990; Berthelin et al., 1995; Bousserrhine et al., 1999b). Les rares études
portant sur les facteurs limitant cette réduction ont montré la nécessité d’un contact direct
entre les oxydes de fer et les microorganismes (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992;
Bousserrhine, 1995). De ce fait, la dissolution des ETM adsorbés sur les oxydes de fer ne
Introduction générale
21
paraît pas directement liée à des facteurs physico-chimiques du milieu tels que l’acidification
ni à la complexation des ETM par les métabolites microbiens libérés dans le milieu.
Si la solubilisation des ETM dans les sols par l’activité des microorganismes a été largement
étudiée, rares sont les travaux qui se sont intéressés en détail à ces phénomènes dans les
sédiments. La majeure partie des études portant sur les sédiments s’attache uniquement à
quantifier les teneurs métalliques totales ou les teneurs contenues dans certaines fractions
(Biksham et al., 1991; Hirner, 1992; BradleyMoran et Woods, 1997; Tack et Verloo, 1999;
Yu et al., 2001; El Bilali et al., 2002; Akcay et al., 2003; Gismera et al., 2004; Hlavay et al.,
2004). Or, cette approche quantitative ne met pas l’accent sur le rôle des microorganismes
dans les phénomènes de solubilisation et par conséquent ne reflète pas réellement le rôle des
microorganismes dans les distributions observées. La compréhension de ces phénomènes de
solubilisation est pourtant nécessaire pour la gestion environnementale des sédiments dragués
et leur stockage en particulier. De plus, il n’est pas certain que les rares modèles diagénétiques,
qui ont cherché à introduire les ETM, mais dont le moteur est une activité hétérotrophe non
spécifique, permettent d’atteindre suffisamment de détails.
Dans ce contexte, les objectifs de ce travail ont donc été
- d’évaluer l’effet des microorganismes autochtones sur la mobilité des ETM dans deux
sédiments différents par leur nature et leur composition chimique (Marne et Seine),
- de caractériser les microorganismes impliqués dans la dissolution des ETM et le type de
métabolisme mis en œuvre et
- d’évaluer la part de la dissolution métallique liée à un contact direct entre sédiments et
microorganismes, de celle due à l’acidification du milieu et à la complexation par les
métabolites produits par les microorganismes.
Ce mémoire débute par une revue bibliographique visant à décrire les interactions entre
métaux et microorganismes. On y trouvera un volet consacré à l’origine des ETM dans les
sédiments ainsi qu’une description des différentes fractions du sédiment porteuses de ces
ETM, leur mode de fixation et les conditions physico-chimiques entraînant leur mobilité.
Cette synthèse bibliographique présente également les différents modes de solubilisation et
d’immobilisation des ETM par les microorganismes. Une attention toute particulière a été
portée sur les interactions oxydes de fer – bactéries ferri-réductrices. En effet, ce genre
d’interactions occupe probablement une place centrale dans des environnements anaérobies
Introduction générale
22
similaires à ceux de nos sédiments. L’objectif sous-jacent de cette synthèse bibliographique
est également de montrer que les tests de lixiviation et autres extractions séquentielles,
permettant respectivement d’accéder à la fraction disponible et aux fractions contenues dans
les divers compartiments des sédiments, ne reflètent pas la réalité des échanges qui peuvent
s’effectuer au sein d’un sédiment puisqu’elles ne tiennent pas véritablement compte de
l’activité des microorganismes.
La 1ere partie est consacrée à une description des phénomènes de solubilisation des ETM
observés lors de l’incubation des sédiments de Marne et de Seine en lien avec le métabolisme
des microorganismes autochtones. Ce chapitre est divisé en deux chapitres, le 1er, sous forme
d’article, présente le devenir des ETM au cours d’une incubation en émettant des hypothèses
quant au métabolisme mis en place par les bactéries et son lien avec la mobilité des ETM. Le
2ème chapitre a pour objectif de confirmer les hypothèses émises quant au métabolisme
microbien et à mettre en évidence l’importance des bactéries ferri-réductrices dans nos
sédiments. L’identification des espèces bactériennes majoritaires responsables des
phénomènes observés y est également abordée en utilisant des techniques de biologie
moléculaire.
La 2ème partie est consacrée à l’étude de l’effet d’une culture pure de Paenibacillus polymyxa,
bactérie ferri-réductrice isolée de nos sédiments, sur la mobilité des ETM et l’importance du
contact bactéries-sédiments dans cette solubilisation. Le 1er chapitre est consacré à l’effet de
cette bactérie sur la mobilité des ETM sur un sédiment stérile. La dissolution des ETM, les
acides organiques produits et l’acidification du milieu ont été suivis au cours de l’incubation.
Le 2ème chapitre estime les parts d’ ETM dissous via les mécanismes de complexation et
d’acidification comparées à celle de la réduction enzymatique par P.polymyxa.
Enfin, ce mémoire se termine par une conclusion générale reprenant les principaux résultats
obtenus au cours de ce travail ainsi qu’une partie perspectives quant à ses applications
scientifiques et techniques.
Partie 1: Synthèse bibliographique
23
Partie 1 : Synthèse bibliographique
Partie 1: Synthèse bibliographique
24
I. Les éléments traces métalliques dans l’environnement
I.1. Définition des éléments traces métalliques
Le terme de métaux lourds est souvent employé pour désigner les métaux et métalloïdes
associés à une contamination et un potentiel toxique et écotoxique. Cependant, ce terme est
utilisé sans fondement scientifique ni juridique. Il n’a jamais été défini par un organisme tel
que l’IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry) (Duffus, 2001). En
général, sont appelés métaux lourds les éléments ayant une densité supérieure à 5 g.cm-3 et
précipitant avec les sulfures. Or, certains métaux toxiques ne sont pas particulièrement lourds
(ex : le zinc) alors que certains éléments toxiques ne sont pas tous des métaux (ex : l’arsenic).
Ainsi, pour toutes ces raisons, il est préférable d’utiliser le terme d’éléments traces
métalliques (ETM) plutôt que métaux lourds.
Conventionnellement, en sciences du sol, les éléments traces métalliques sont les 68 éléments
minéraux constituants de la croûte terrestre, dont le pourcentage massique est inférieur à
0,1% (Baize, 1997).
I.1.1. Classification et propriétés physico-chimiques des ETM
Dans la classification des éléments dite de Mendeleïev (figure 1), tous les éléments des blocs
s (sauf l’hydrogène et l’hélium), d et f sont des métaux ainsi que sept des éléments du bloc p.
De nombreux métaux possèdent deux propriétés chimiques caractéristiques (Shriver et Atkins,
2001) :
- la formation d’oxydes et d’hydroxydes basiques lorsque le métal est au degré
d’oxydation I et II et
- la formation de cations simples (hydratés) en solution aqueuse acide.
Ces deux propriétés sont donc importantes pour connaître les formes sous lesquelles les ETM
seront présents dans les sédiments et dans les sols (ex : formation d’oxydes, de sulfures
métalliques…).
Les métaux du bloc s regroupent les métaux alcalins et les alcalino-terreux. On les rencontre
particulièrement dans les minéraux et les eaux naturelles, notamment le Ca, Na et Mg (Shriver
et Atkins, 2001).
A l’état naturel, les éléments à gauche du groupe 6 se trouvent principalement sous forme
d’oxydes métalliques ou de cations métalliques associés à des oxyanions (exemples : chromite
FeCr2O4, hématite Fe2O3 et pyrulosite MnO2). A la droite du fer, le cobalt, cuivre et nickel se
Partie 1: Synthèse bibliographique
25
trouvent à l’état naturel essentiellement sous forme de sulfures et d’arséniures. Le zinc est
l’élément le plus abondant du groupe 12 ; Cd et Hg sont beaucoup moins abondants. Les
sulfures sont les principaux minerais du groupe, le zinc et le cadmium y sont souvent associés
(Shriver et Atkins, 2001).
Les éléments métalliques du bloc p (métaux pauvres et métalloïdes) ont une abondance très
variable dans la croûte terrestre. Ainsi l’aluminium est l’élément le plus abondant. On le
retrouve principalement dans les argiles et les aluminosilicates. Le thorium et le bismuth sont
les moins abondants (Shriver et Atkins, 2001).
Partie 1: Synthèse bibliographique
26
Bloc s Bloc d Bloc f Bloc pBloc s Bloc d Bloc f Bloc p
Figure 1 : Classification périodique des éléments
Partie 1: Synthèse bibliographique
27
Les hommes ont largement utilisé les éléments traces métalliques pour développer leur
industrie. Or, les ETM présents dans l’environnement sont potentiellement biodisponibles
pour les êtres vivants. Si certains ETM sont essentiels pour leur développement, d’autres
présentent une certaine toxicité, notamment en fonction de leur forme chimique et ceci à partir
d’une certaine dose. C’est pourquoi il est nécessaire de s’intéresser au devenir des éléments
métalliques dans l’environnement.
I.1.2. Toxicité
Suivant leur nécessité pour les organismes vivants, les ETM peuvent être classés en deux
groupes : les éléments essentiels ou oligo-éléments et les éléments non nécessaires (Bliefert et
Perraud, 2001). De plus, un élément peut être essentiel pour un type d’organisme et non
nécessaire pour un autre.
Les organismes vivants présentent des besoins en éléments essentiels en concentrations bien
définies. Une carence peut entraîner l’inhibition d’une fonction de l’organisme alors qu’un
excès est à l’origine d’une toxicité.
La majeure partie des études portant sur la toxicité des ETM dans les sédiments, les rivières et
les sols concerne leurs effets sur les micro-organismes et/ou l’adaptation de ces derniers à leur
présence (Hassen et al., 1998; Bruins et al., 2000; Konstantinidis et al., 2003). Dans les sols,
l’effet toxique des ETM est principalement étudié sur les nématodes. Des concentrations
importantes en Cr et Se (> 90 mg.kg-1 de sol) entraînent une baisse significative de la diversité
de la communauté (Nagy et al., 2004). De même, le Co, Ni et Zn présentent des effets sur la
communauté à partir d’une teneur de 1600 mg.kg-1 de sol. Les nématodes semblent être
cependant plus sensibles au Cd puisqu’une diminution de la diversité est observée à partir de
160 mg.kg-1 de sol (Korthals et al., 1996). Dans les rivières, la toxicité des ETM a été
largement étudiée sur la moule Dreissena polymorpha, particulièrement sensible aux
contaminations métalliques (Naimo, 1995; Gundacker, 1999; Camusso et al., 2001). En effet,
celle-ci en filtrant l’eau pour se nourrir des microorganismes ingère également des ETM
dissous et associés aux matières en suspension. Les moules d’eau douce peuvent donc
accumuler de fortes teneurs en ETM qui engendreront des problèmes au niveau de leur
croissance, de l’efficacité de filtration, de l’activité enzymatique et du comportement (Naimo,
1995). Les conséquences métaboliques, notamment sur leur capacité de filtration apparaissent
à des concentrations de l’ordre de 10 ng.l-1 de Hg, 15 ng.l-1 de Cu, 100 ng.l-1 de Cd, 200 ng.l-1
de Zn et 400 ng.l-1 de Pb (Mouabad et Pihan, 1993). Chez l’Homme, l’accumulation d’ETM
dans l’organisme peut conduire à des dysfonctionnements du système rénal (Pb, Cd, Cr),
Partie 1: Synthèse bibliographique
28
neurologique (Pb, As, Cd, Mn) ou hépatique (Cd) et provoquer des cancers (Goyer et
Clarkson, 2001).
L’accumulation des ETM dans les tissus vivants provient de leur forte capacité à former les
liaisons avec les ligands cellulaires (Bliefert et Perraud, 2001). De la nature et de la force de
ces liaisons découlent le degré de toxicité. Ainsi, plus ces liaisons sont ioniques, plus le métal
sera électronégatif, plus la liaison sera forte et donc la toxicité importante. Les cations
métalliques peuvent aussi former des liaisons de coordination c’est-à-dire de complexation
avec différents ligands cellulaires contenant des groupes –OH, -NH2, -SH et les peptides. Plus
le complexe cation métallique-ligand cellulaire sera stable et plus la toxicité sera importante
(Bliefert et Perraud, 2001) . Certains cations métalliques, tels que Hg2+, Cd2+ ou Pb2+ peuvent
induire une toxicité dans les cellules animales en perturbant l’action d’enzymes protectrices
impliquées dans l’élimination des radicaux libres. Or ces derniers sont particulièrement
toxiques car ils entraînent l’oxydation des lipides membranaires donc une destruction
membranaire.
La toxicité aiguë d’un ETM pour un organisme dépend de plusieurs facteurs (Bliefert et
Perraud, 2001):
- sa forme (spéciation),
- la façon dont il est absorbé (ingestion, inhalation…),
- le type d’organisme dans lequel il se trouve (plantes, animaux…),
- l’âge de l’organisme et son état de développement,
- son accumulation à certains endroits de l’organisme.
La toxicité des ETM dépend de plusieurs paramètres environnementaux modifiant leur
spéciation en solution. Parmi ces paramètres, on peut citer notamment le pH dont une
augmentation entraîne la précipitation des cations métalliques sous forme d’hydroxydes ou
d’oxydes de métaux insolubles. Il en résulte une diminution de la toxicité car les précipités
formés sont généralement moins disponibles et moins toxiques que les cations métalliques
libres.
La valeur du potentiel d’oxydo-réduction peut également affecter la toxicité des ETM en
favorisant la prédominance de leurs formes oxydées ou réduites. Il en est ainsi du chrome et
de sa forme Cr(VI) dont la toxicité est beaucoup plus importante que la forme réduite Cr(III).
Partie 1: Synthèse bibliographique
29
I.2. Origine des éléments traces métalliques dans
l’environnement aquatique
Dans l’environnement aquatique, les ETM sont d’origine naturelle et anthropique. A partir de
leurs points d’émission, les ETM vont emprunter différentes voies de dispersion pour se
retrouver dans le milieu aquatique. Les cheminements pris par les ETM dépendent de leur
mode d’introduction (rejets directs dans les rivières, dans l’atmosphère ou sur le sol) ainsi que
de leur forme physique (solide, liquide ou gazeuse) (Foster et Charlesworth, 1996).
L’atmosphère constitue un milieu clé pour le transfert des polluants métalliques vers le milieu
aquatique. Ainsi, à l’échelle globale de la Terre, cette voie fournit plus de 70% du plomb et du
vanadium total, environ 30 % de mercure total et 20% de cadmium total au milieu aquatique.
Dans les régions rurales et reculées, l’atmosphère fournit la majeure partie des stocks d’ETM
dans le milieu aquatique.
I.2.1. Origine naturelle
I.2.1.1. Sols
Les ETM sont présents de façon naturelle dans les sols et constituent ainsi le fonds
géochimique. Les teneurs en ETM du fonds géochimique dépendent à la fois des teneurs
présentes dans les roches mères et des processus intervenus lors de la formation du sol et qui
ont pu lessiver ou concentrer les éléments (Robert, 1996). Les éléments traces ne représentent
que 0,6% des éléments totaux alors que les 12 éléments majeurs interviennent pour 99,4%
(tableau 1, (Baize, 1997)). Les métaux les plus abondants dans la croûte terrestre sont
l’aluminium et le fer. Ce dernier, en particulier, intervient dans de nombreux processus
biologiques notamment dans les processus énergétiques microbiens et ceci dans les
environnements aérobies et anaérobies (Lovley, 1991).
Partie 1: Synthèse bibliographique
30
Tableau 1 : Teneurs du fonds géochimique des éléments majeurs et des éléments traces dans la croûte
terrestre (Baize, 1997)
Eléments majeurs (%) Oxygène 46,6 Potassium 2,50 Silicium 27,7 Magnésium 2,00 Aluminium 8,1 Titane 0,44 Fer 5,0 Hydrogène 0,14 Calcium 3,63 Phosphore 0,11 Sodium 2,80 Manganèse 0,10
Eléments traces (mg.kg-1) Fluor 700 Cobalt 23 Chlore 200 Plomb 15 Chrome 200 Bore 3 Vanadium 110 Molybdène 1 Nickel 80 Iode 0,3 Zinc 65 Cadmium 0,2 Azote 46 Sélénium 0,09 Cuivre 45
Les processus d’érosion des sols contribuent à la dispersion des ETM et éléments majeurs
dans le système aquatique (Martin et Meybeck, 1979). Ainsi, l’érosion chimique des sols
participe à l’enrichissement en Al, Fe et Ti des matières en suspension dans les rivières car
d’autres éléments sont plus facilement dissous. A l’inverse, les matières en suspension sont
faiblement enrichies en Na, Ca, Mg et Sr car ces éléments se trouvent principalement sous
forme dissoute. Aucun enrichissement par rapport à l’Al n’a été observé dans les matières en
suspension pour les terres rares, Co, Cr, Cs, Fe, Mn, Rb, Si, Th, Ti, U et V. A l’inverse, des
apports en Br, Sb, Pb, Cu, Mo et Zn, ainsi qu’en Ni et P ont été observés dans les matières en
suspension. L’érosion des sols peut donc contribuer à un enrichissement en ETM et éléments
majeurs dans le milieu aquatique sous forme dissoute ou particulaire.
I.2.1.2. Sources naturelles contribuant à l’émission d’ETM dans
l’atmosphère
Ainsi que nous l’avons vu, l’atmosphère est un élément clé dans la dispersion des ETM par
leurs retombées sur les continents et leurs entrées dans les systèmes fluviaux. Les principales
sources naturelles d’ETM dans l’atmosphère sont les poussières terrigènes, les volcans, les
aérosols marins et les feux de forêts (Nriagu, 1989). Les éruptions volcaniques libèrent, en
moyenne par an et dans le monde, entre 18800 et 27000 T de Cu, entre 3200 et 4200 T de Pb
et 1000 T de Hg dans l’atmosphère (Bliefert et Perraud, 2001). En 1989, les sources
naturelles ne représentaient qu’entre 30 et 50 % des émissions globales d’ETM
atmosphériques (Nriagu, 1989). En effet, les principales sources d’ETM dans l’atmosphère
Partie 1: Synthèse bibliographique
31
sont d’origine anthropique et sont émises par les pays développés et en voie
d’industrialisation comme nous allons le voir dans le paragraphe suivant.
I.2.2. Origine anthropique
I.2.2.1. L’atmosphère : vecteur des sources anthropiques d’ETM
Des études portant sur la contamination des ETM dans les milieux polaires ont montré que
ceux-ci étaient principalement émis par les pays industrialisés. Ainsi la pollution métallique
dans l’Arctique est issue des émissions anthropiques de l’Eurasie en hiver et de l’Europe en
été. A l’échelle du globe, l’origine des ETM est donc fluctuante en fonction des saisons
(Pacyna, 1995). Dans l’Antarctique, l’analyse de la glace a montré que les teneurs en V, Cr,
Mn, Cu, Zn, Co, Ag, Cd, Ba, Pb, Bi et U étaient inférieures à 3.10-15 g.g-1 entre 1834 et 1990
(Planchon et al., 2002). Si des éléments comme le Mn, Co, Ba, V et Cd présentent peu de
fluctuations temporelles, une augmentation des teneurs en Cr, Cu, Zn, Ag, Pb, Bi et U est
apparue au cours du temps et particulièrement dans les dernières années. L’origine de cette
augmentation est liée au développement des activités anthropiques en Amérique du Sud,
Afrique du Sud et en Australie (extraction des mines et fonderies au Chili, Pérou, Zaïre et
Zambie).
Les émissions atmosphériques totales des ETM en France métropolitaine entre 1990 et 2006
et en Europe sont présentées dans le tableau 2.
Tableau 2 : Emissions totales moyennes des ETM (tonnes.an-1) dans l’atmosphère en France
métropolitaine en 1990 et 2006 ainsi qu’en Europe (2005) (CITEPA, 2007; Mathias, 2007)
Emissions totales moyenne en France (tonnes.an-1)
Emissions moyennes en Europe (tonnes.an-1) (d’après l’EMEP)
Année 1990 2006 2005 As 16,4 10,5 7,6 Cd 18,8 4,6 7,6 Cr 391 40 16 Hg 27 7,9 3,4 Ni 316 162 62 Pb 4283 128 90 Zn 1895 261 274
Si, dans la plupart des cas, les rejets d’ETM en France sont supérieurs à la moyenne
européenne, on constate une diminution très importante depuis 1990. Si les industries
manufacturières restent les principales émettrices d’ETM en particulier pour l’As, le Cd, le
Cr, le Hg, le Pb et le Zn, la diminution observée est essentiellement due aux progrès des
Partie 1: Synthèse bibliographique
32
techniques de transformation des métaux ainsi qu’à la mise en place de dépoussiéreurs plus
efficaces (CITEPA, 2007). Les émissions de Hg dues à l’incinération des ordures
ménagères ont également diminué grâce à l’amélioration du traitement des fumées. Le plomb
était émis à 97 % par le trafic routier dans les années 1990 et a progressivement diminué pour
devenir quasiment nul après l’interdiction de distribution des essences plombées en 2000.
Actuellement, les émissions de Pb proviennent à 62 % de l’industrie manufacturière (CITEPA,
2007). Le Ni est principalement émis lors de la production d’énergie, en particulier lors des
opérations de raffinage du pétrole et de production d’électricité (CITEPA, 2007).
L’émission de Cu n’a pratiquement pas varié depuis 1990 avec environ 170 T rejetées par an.
Le Cu provient majoritairement du transport routier (54 % en 2005) et dans une moindre
mesure du transport ferroviaire (34 % en 2005) et est émis lors de l’usure des plaquettes de
frein et des caténaires (CITEPA, 2007).
La majorité des ETM parvient dans l’atmosphère sous forme particulaire ou aérosols dont la
taille est comprise entre 0.05 et 100µm de diamètre (Spokes et Jickells, 2006). Les plus fines
particules s’agglomèrent en particules plus grosses sous l’agitation atmosphérique puis
sédimentent (Spokes et Jickells, 2006). Ces aérosols représentent une source importante
d’ETM pour les milieux dans lesquels ils se déposent. Cependant une partie des éléments
métalliques atmosphériques est solubilisée dans l’eau de pluie. Cette solubilisation est
généralement supérieure à 80% pour le Na, Cl, K, Ca, Se et Br, entre 50 et 80 % pour le Mg,
V, Cr, Mn, As, Co, Ni, Cu, Cd, Sb et Pb et moins de 25 % pour l’Al, Sc et Fe (Cawse, 1980).
Cette relative solubilité des ETM dans l’atmosphère dépend de leur spéciation. Une étude
réalisée sur les particules fines atmosphériques (<100µm) (Fernandez Espinosa et al., 2002)
a montré que près de 40 % du Ni, 35 % du Co, 32 % du Mn et 50 % du V étaient adsorbés sur
la fraction soluble et échangeable et donc facilement solubilisés dans l’eau de pluie. A
l’inverse, 54 % du fer se trouvait dans la fraction résiduelle. Par conséquent, la spéciation des
éléments métalliques atmosphériques présente des implications significatives pour leur
transfert et leur devenir dans les différents compartiments de l’environnement.
I.2.2.2. Les rejets urbains
Une part importante des ETM d’origine anthropique provient des systèmes hydrologiques
urbains. Les eaux pluviales ruissellent sur les chaussées et les toitures et contribuent
également à la pollution due aux réseaux d’assainissement unitaires. De ces trois sources
urbaines, les ruissellements de chaussées sont généralement les plus contaminés en ETM
Partie 1: Synthèse bibliographique
33
(Förster, 1993). Certaines parties des véhicules (freins, pneus) sont constituées de Cu, Pb, Zn,
Cr, Ni ou Cd et l’usure de ces pièces entraîne la libération de ces éléments sur la chaussée
(Legret et Pagotto, 1999 ; Sorme et Lagerkvist, 2002). A Paris, dans le bassin versant du
Marais, les ruissellements de toitures représentent 63 % du volume total d’eau qui ruisselle
dans ce bassin versant, générant plus de 85 % de Cd, Pb, Zn et 66 % du Cu trouvés dans le
réseau d’assainissement par temps de pluie (Garnaud, 1999). Le lessivage des structures en
béton est à l’origine des ETM suivants, en concentrations détectables dans les ruissellements :
As, Be, Cd, Cr, Hg, Ni, Pb, Sb, Se et Th (Hillier et al., 1999).
Dans de nombreux environnements urbains, des quantités significatives d’ETM sont associées
aux effluents domestiques et industriels et boues de stations d’épuration (STEP). Une
étude réalisée par Imhoff et al. (1981) a montré que les stations d’épuration le long de la Ruhr
recevaient 31 % de métaux issus des effluents domestiques et 69 % issus des effluents
industriels. Cependant, la charge relative émise dépendait de l’ETM avec 90% de Cr, 65% de
Ni et 50 % de Cu émis par l’industrie. En France, la part de métaux contenue dans les rejets
de STEP urbaines et industrielles est constituée à 79 % de Zn, 14 % de Cu, 2 % de Ni, Pb et 1
% de Cr (Barré et al., 2008).
I.2.2.3. Les activités minières
La pollution en ETM due aux activités minières remonte à 7000 avant JC, date des premières
exploitations humaines de métaux avec la fusion du cuivre (Renfrew et Bahn, 1991). Le
développement de la métallurgie a ensuite conduit à une augmentation de l’impact
environnemental de l’extraction des métaux. Avec la révolution industrielle, en particulier
depuis le début du 20ème siècle, l’exploitation des mines métallifères a augmenté d’une façon
considérable en vue de leur transformation en produits manufacturés (Nriagu, 1990). Le
tableau 3 donne un exemple de quantités de minerais extraits de mines métalliques au Canada
en 1998 (Statistiques Canada 1998) : Tableau 3 : Quantités de minerais de métaux extraits en 1998 au Canada (kt), (Statistiques Canada, 1998)
Minerais kilotonnes extraits Fer 96743 Or / argent 36454 Plomb / zinc 8484 Nickel/cuivre 15041 Cuivre/Zinc 87654 Autres minerais 15518
Partie 1: Synthèse bibliographique
34
Les activités minières entraînent des conséquences majeures pour l’environnement (Ceto et
Mahmud, 2000) comme :
- une acidification des eaux de ruissellement due aux sulfures métalliques via la
production d’acide sulfurique en présence d’oxygène,
- une pollution métallique des eaux de surface et souterraines ainsi que des sédiments,
- l’émission des métaux sous forme particulaire dans l’atmosphère et
- une pollution au cyanure, utilisé notamment pour améliorer l’extraction de l’or une.
Qu’ils soient d’origine naturelle ou anthropique, les ETM empruntent donc différentes voies
dont la principale est la voie atmosphérique pour se retrouver dans le milieu aquatique, dans
lequel ils vont effectuer un cycle.
I.3. Cycle des éléments traces métalliques dans l’environnement
aquatique
Dans l’environnement aquatique, il existe quatre réservoirs d’ETM qui interagissent (figure
2) : les matières en suspension (MES), la colonne d’eau elle-même, les sédiments et les eaux
interstitielles (Salomons et Förstner, 1984). De très nombreux mécanismes
(adsorption/désorption, (co)-précipitation/dissolution…) interviennent entre les MES et les
ETM dissous en solution (1). Les échanges entre MES et sédiments interviennent lors des
processus de sédimentation et érosion/resuspension (2). Puis des échanges de métaux se
produisent entre les différentes fractions du sédiment et les eaux interstitielles (3) qui se
retrouveront à nouveau dans les eaux de surface (4) à travers des mécanismes de diffusion par
exemple.
Partie 1: Synthèse bibliographique
35
Matières en suspension
Eaux de surface
Eaux interstitielles
Eaux souterraines
Sols
VégétationHomme
Sédiments
Biota
Milieu aqueux Milieu terrestre
1
2
3
4
Figure 2 : Schématisation du cycle hydrologique des métaux traces en milieu aqueux (d’après Salomons et
Förstner, 1984)
Les échanges entre sédiment et eau sont particulièrement importants. Concrètement, les ETM
des sédiments et des eaux interstitielles peuvent se retrouver en solution sous forme
particulaire ou dissoute lors des opérations de dragage qui entraînent un brassage des
sédiments et modifient les paramètres physico-chimiques du milieu dont les conditions
d’oxydo-réduction et le pH (Eggleton et Thomas, 2004). Lors des crues, les sédiments sont
remis en suspension, ce qui entraîne une mobilité des ETM qui se retrouvent soit sous forme
particulaire (2) soit sous forme dissoute dans les eaux de surface car provenant des eaux
interstitielles (4). A l’inverse, lors des périodes d’étiage, les particules en suspension
sédimentent et les ETM se retrouvent piégés dans les sédiments (2) (Meybeck et al., 1999;
Sherrell et Ross, 1999; Birch et al., 2001). Cependant, la régulation des ETM dissous par le
régime hydrique est plus complexe car des phénomènes d’oxydo-réduction s’ajoutent aux
phénomènes purement physiques. Dans la Seine et la Marne, il a été montré que les
concentrations en Li, B, Rb, Sr et Ba étaient corrélées au régime hydrique et qu’elles étaient
plus fortes en période de crue (Elbaz-Poulichet et al., 2006). Cependant, les concentrations en
Mn, Cu, Mo, Cd et Pb n’étaient pas corrélées au type de régime hydrique. Ainsi les
concentrations en Mn, Cu et Cd dissous augmentaient rapidement en été alors que la
concentration en Mo diminuait. Ces variations ont été attribuées aux processus d’oxydo-
Partie 1: Synthèse bibliographique
36
réduction. La concentration en oxygène dissous diminuant en été, le milieu devient alors plus
réducteur ce qui entraîne un relargage du Mn, Cu, Cd et Pb alors que le Mo est immobilisé.
Les ETM présents dans ces quatre compartiments sont constamment en interaction avec le
biota présent dans le milieu aquatique. En extrayant de l’eau et des sédiments des nutriments
indispensables à leur croissance, les organismes vivants ingèrent les ETM potentiellement
toxiques qui y sont associés. Afin de contrer cette toxicité, ces organismes mettent en place un
mécanisme de détoxification différent selon que les cellules adoptent une stratégie de
régulation ou d’accumulation (Phillips et Rainbow, 1989). La régulation intracellulaire totale
du métal empêche son entrée dans la cellule ou en accélère sa sortie et l’ETM sera donc rejeté
dans le milieu aquatique. Au contraire, l’accumulation se traduit par une séquestration du
métal dans le milieu intracellulaire et est rendu non disponible par la synthèse de ligands et
donc par la formation de complexes « métal-ligand ». Ces organismes accumulateurs
contribuent donc à une diminution des ETM dissous.
Les surfaces biologiques sont les substrats les plus importants pour le piégeage des métaux
dans certains milieux aquatiques, tels que les lacs, et les concentrations en ETM dissous
peuvent parfois être contrôlées par l’adsorption à la surface cellulaire (Adriano (2001) selon
Newman et McKintosch (1991)). Lorsque ces organismes périssent, leur décomposition
pourra de nouveau rendre les ETM biodisponibles ou bien ceux-ci seront piégés dans les
sédiments ou adsorbés sur les matières en suspension.
De même que les remises en suspension et le piégeage des ETM dans les sédiments peuvent
être contrôlés par le régime hydrique et donc par les variations saisonnières, ces dernières
contrôlent également la rétention ou le relargage des ETM par l’activité biologique. En été,
l’activité biologique étant plus importante, la rétention des ETM sera plus importante qu’en
hiver lors de la décomposition de la matière organique qui pourra entraîner une solubilisation
des ETM. Par exemple, il a été montré que la répartition du Mn, Cu, Zn, Cd et Pb dans le
Rhin était corrélée à l’activité du phytoplancton (Admiraal et al., 1995). Le Mn apparaît sous
forme particulaire lors du bloom algal alors que le manganèse dissous est plus important en
période de faible activité du phytoplancton.
Ainsi, la régulation des ETM dans le milieu aquatique est très complexe et dépend à la fois de
paramètres chimiques, physiques et biologiques, le tout fluctuant en fonction des saisons.
Partie 1: Synthèse bibliographique
37
C’est pourquoi il est intéressant d’étudier les paramètres chimiques et biologiques régissant
les ETM afin d’en comprendre le devenir, en particulier au niveau des sédiments, et sous
l’activité des microorganismes.
I.4. Cas du bassin versant de la Seine
Notre thématique de recherche s’intéressant aux sédiments du bassin versant de la Seine, il
nous est apparu indispensable d’une part de présenter ce bassin versant et d’autre part de
distinguer les différentes sources d’émission d’ETM afin de situer et justifier le choix des
sites de prélèvement par rapport à leur niveau de contamination.
I.4.1. Présentation du bassin versant de la Seine
Le bassin versant de la Seine, d’une superficie de 75 000 km², est caractérisé par une forte
densité de population (environ 215 habitants au km²). La plus forte concentration de
population se situe au niveau de Paris et sa banlieue (2740 km² pour 9,47 millions d’habitants)
dans une zone allant de la Seine et Marne à la confluence de la Seine et de l’Oise (figure 3)
SeineOise
MarneSeine
Oise
Marne
Figure 3 : Carte du bassin versant de la Seine (Piren-Seine)
Partie 1: Synthèse bibliographique
38
Le bassin de la Seine regroupe 25% de la production agricole française, 25-30% de la
production industrielle française, 23% de la population française mais transporte moins de
10% de l’eau et des sédiments (Thevenot et al., 2007). 98% des eaux usées produites dans
Paris et sa banlieue sont collectées et traitées par quatre stations d’épuration : Seine-Amont,
Seine-Aval, Seine-Centre et Marne-Aval (SIAAP, 2007)
Par conséquent, de par sa densité de population et de ses nombreuses activités agricoles et
industrielles, le bassin versant de la Seine présente des stocks de métaux importants dans
divers compartiments, tels que les sols, les structures urbaines et industrielles, les sols
industriels pollués, les décharges et les sédiments.
I.4.2. Contribution des différents compartiments à la pollution
métallique du bassin versant
I.4.2.1. Rejets atmosphériques
Les ETM atmosphériques sont émis par des industries, des transformations énergétiques
(usines d’incinération d’ordures ménagères, combustion du charbon…) ainsi que par les
transports. Ces émissions représentent entre 6 et 16% des émissions totales en France. Dans le
bassin de la Seine, le Cr, Cu, Ni, Pb et Zn sont les ETM les plus fortement émis (tableau 4,
d’après Thévenot et al., 2007). Les activités industrielles de transformation énergétique et
manufacturières sont les principales émettrices d’ETM dans l’atmosphère du bassin. Tableau 4 : Emission atmosphérique dans le bassin versant de la Seine jusqu’à l’entrée de l’estuaire, Poses
(64700 km²) par catégorie de source (an 2000) ; 1. Emission atmosphérique annuelle (t.an-1) (CITEPA,
2007) 2. Importance relative des sources majeures d’émission : ‘-‘<1% ; 1%≤*<10% ; 10%≤**<20% ;
***≥20%
As Cd Cr Cu Hg Ni Pb Zn 1. Emission à l’intérieur du bassin 2,4 1,5 16 29 1,6 34 35 140
2. Importance relative des émissions
Transformation énergétique *** *** * * *** *** *** ***
Industries de manufacture *** *** *** * ** ** *** ***
Résidentiel tertiaire * * * * * ** * * Agriculture - - - - - - - - Transport routier - - - *** - - * - Autre transport - - - ** - - ** -
Partie 1: Synthèse bibliographique
39
I.4.2.2. Erosion naturelle des sols
Les fonds géochimiques des sédiments de la Seine ainsi que dans l’ensemble du bassin
versant ont été déterminés sur la base d’échantillons historiques (à Paris Bercy et à l’estuaire)
et de petits bassins forestiers vierges de toute activité anthropique (Meybeck et al., 1998;
Thévenot et al., 2002). Les résultats moyens obtenus sont présentés dans le tableau 5.
L’aluminium et le fer sont les éléments ayant les plus fortes teneurs. Ceci concorde avec le
fait que ce sont les éléments majeurs dans la croûte terrestre (tableau 1). Le strontium est
également un élément présent en forte teneur. Les teneurs en Co, Ni, Pb et Zn se situent dans
la moyenne des teneurs habituellement mesurées dans les roches sédimentaires (Baize, 1997). Tableau 5 : Teneurs de fond moyennes en ETM dans les sédiments du bassin de la Seine (µg.g-1) (Meybeck
et al, 1998)
Al Ag As Ba Be Cd Co Cr Cu
33 000 2,7 6,5 ± 0,8
210 ± 50
1,3 ± 0,2
0,25 ± 0,05
7 ± 1
40 ± 5
15 ± 5
Fe Hg La Li Na Ni P Pb Sb
15 000 0,03 ± 0,0015
20 ± 2
38 ± 4
17000 ± 300
16 ± 2
750 ± 100
23 ± 3
0,5 ± 0,1
Sr V Zn 220 ± 30
40 ± 5
60 ± 10
I.4.2.3. Activités agricoles
L’agriculture impacte à plus ou moins long terme sur la pollution métallique. Cet impact est
dû :
- aux ETM présents dans les compléments alimentaires, dans les engrais (sources de Cd,
par exemple) et dans les produits phytosanitaires,
- aux retombées atmosphériques,
- à l’utilisation des boues de station d’épuration comme engrais.
Les apports en ETM par les zones agricoles dans le bassin de la Seine liés à la fertilisation
sont beaucoup plus faibles que les dépôts atmosphériques pour le Cu, Ni, Pb et Zn (Thevenot
et al., 2007). A l’inverse, les apports de Cd et Cr, liés à la fertilisation, sont plus importants
que les retombées atmosphériques (tableau 6). De même, les apports en Cd, Cr et Ni sont plus
importants avec la fertilisation qu’avec la réutilisation des boues de station d’épuration, à
l’échelle du bassin.
Partie 1: Synthèse bibliographique
40
Tableau 6 : Apports de métaux dans les zones cultivées du bassin de la Seine (t.an-1) (Thevenot et al, 2007)
Cd Cr Cu Ni Pb Zn Engrais contenant du P 5,76 28,8 7,2 7,2 1,44 28,8 Epandage des boues de station d’épuration 0,35 5,1 31 2 15 83
Dépôts atmosphériques 1,66 5,22 166 23,9 108 583
I.4.2.4. Activités de Paris et son agglomération
Les rejets métalliques issus des activités de Paris et son agglomération et contribuant à la
pollution du bassin versant ont été étudiés dans le cadre du programme OPUR (Gromaire-
Mertz, 1998; Garnaud, 1999; Chebbo et al., 2001; Gromaire et al., 2001; Gromaire et al.,
2002; Rocher, 2003). De nombreuses sources ont été identifiées telles que les émissions
atmosphériques, le trafic routier, les retombées atmosphériques, le ruissellement des toitures
et des rues, les eaux usées domestiques, les eaux usées industrielles rejetées directement dans
le milieu naturel ou connectées au réseau d’assainissement ainsi que les ETM provenant du
dessablement du réseau d’assainissement. Les stocks métalliques issus de ces différentes
sources ont été estimés et sont présentés dans le tableau 7. Le zinc est l’élément le plus
fortement émis. On remarque également que le cuivre est le plus fortement émis par le trop
plein du réseau d’assainissement. La collecte des effluents est effectuée par la station
d’épuration d’Achères qui reçoit chaque jour 27,5 m3.s-1 d’effluents (SIAAP, 2007).
L’efficacité d’abattement de la pollution métallique en sortie de STEP est de 76% pour le Cu,
70% pour le Zn et 49 % pour le Cu (Thévenot et al, 2007). L’efficacité d’abattement du Cd
est difficile à estimer en raison des faibles concentrations et des limites de détection des
appareils de mesure. Les éléments métalliques émis par les activités urbaines et non abattus
par les STEP vont contribuer à l’augmentation des teneurs en ETM dans le milieu fluvial que
ce soit sous forme dissoute ou particulaire.
Tableau 7 : Stocks d’ETM dans le bassin urbain de Paris et sa banlieue (t.an-1) (Thévenot et al, 2007)
Cd Cu Pb Zn Eaux usées domestiques 0,42 111 17 229 Ruissellement urbain 0,19 26 84 470 Eaux industrielles connectées au réseau d’assainissement 0,005 1,2 0,3 10 Eaux industrielles rejetées directement en rivière 0,011 3 0,8 23 Trop plein du réseau d’assainissement 0,051 606 6,6 52 Sédiments du réseau d’assainissement 0,13 18 42 110 Boues de station d’épuration 0,76 68 32,4 180 Eaux traitées en station d’épuration 2,07 26 25,5 90
Partie 1: Synthèse bibliographique
41
I.4.2.5. Rétention des ETM particulaires dans le système
aquatique
Arrivés dans les rivières, les ETM associés aux particules en suspension peuvent se déposer
dans le lit de la rivière, dans les sites naturels en cas d’inondation (laisses de crues) ou bien
dans des ouvrages de stockage. Les particules sédimentées sont aussi draguées puis stockées
ou épandues sur des zones spécifiques.
La qualité des sédiments est contrôlée tous les 3 ans avant dragage par le Service de la
Navigation de la Seine. Entre 60 000 et 180 000 tonnes de sédiments ont été draguées par an
sur les 15 dernières années. 70% des sédiments dragués sont ensuite stockés sous une couche
d’eau, selon les pratiques actuelles (Carpentier et al., 2002a, 2002b). Ce stockage de
sédiments constitue donc une réserve potentielle d’ETM susceptibles d’être relargués dans le
milieu environnant en fonction des conditions physico-chimiques de stockage et de l’activité
biologique.
Le tableau 8 synthétise la rétention des ETM associés aux particules dans le système
aquatique (Thévenot et al., 2007). Les laisses de crue et les sédiments dragués constituent les
réservoirs les plus importants d’ETM.
Tableau 8 : Rétention des ETM (t.an-1) dans le système aquatique par le stockage des particules dans le
bassin versant de la Seine (Thévenot et al, 2007)
Cd Cr Cu Hg Pb Zn Rétention dans les réservoirs 0,012 2,34 1,17 0,005 0,63 0,68 Laisses de crues 0,026 3,18 1,70 0,013 1,25 2,5 Dragage 0,170 4,7 3,05 0,040 4,30 14
La rétention totale des sédiments dans le bassin de la Seine est estimée à 200 000 tonnes par
an, ce qui correspond en moyenne au quart de la quantité de sédiments exportée vers
l’estuaire (700 000 t.an-1).
I.4.3. Zones contaminées en ETM dans le bassin versant de la Seine
Les sources de pollutions métalliques dans le bassin de la Seine sont multiples et contribuent à
un stockage d’ETM dans divers compartiments, notamment les sédiments. Une distribution
géographique de la pollution métallique a été établie sur la base d’un indicateur de pollution
métallique conçu par Meybeck et al. (2004). Cet indicateur est basé sur les teneurs en Cd, Cu,
Hg, Pb et Zn dans les échantillons particulaires et normalisé par rapport aux teneurs de fonds
géochimiques.
Partie 1: Synthèse bibliographique
42
L’indice varie de 1 (bruit de fond géochimique) à 40 (contamination forte) à travers
l’ensemble du bassin mais des valeurs supérieures à 100 (contamination extrême) ont été
observées dans des affluents de l’Eure. Des corrélations entre les indices de contamination et
les ETM ont montré que les activités anthropiques avaient un fort impact sur les
concentrations en Ag, Sb et P, un impact marginal sur les concentrations en Ba, Ni et Cr et un
très faible impact sur les concentrations en Li, Be, V, Co ainsi qu’en éléments majeurs.
Dans le bassin supérieur de la Seine, on observe une évolution marquée de l’impact
anthropique de l’amont vers l’aval. En aval de la confluence de la Marne et de la Seine, juste
avant l’entrée dans Paris, la contamination diminue suite à un effet de dilution spatiale. En
entrant dans le grand Paris, la contamination métallique augmente suite aux rejets urbains de
temps de pluie dans la Seine et aux affluents contaminés péri-urbains. En traversant Paris,
l’indice augmente en raison des rejets du réseau unitaire. En aval de Paris, les indices de
contamination sont plus complexes à expliquer, particulièrement dans et autour de la zone de
confluence avec l’Oise. Ceci est dû non seulement à l’arrivée de l’Oise mais également aux
rejets de la station d’épuration de Seine-Aval (Achères) dont les masses d’eau se mélangent
plus ou moins rapidement avec la Seine. Plus en aval, les masses d’eau de la Seine, de l’Oise
et des rejets de la station d’épuration Seine-Aval sont progressivement mélangées, ce qui se
traduit par une diminution de la contamination métallique.
Comme nous l’avons vu précédemment, le comportement des ETM et éléments majeurs dans
le milieu aquatique fluctue au cours du temps. Il en est donc de même dans le bassin versant
de la Seine, selon les périodes d’étiage ou de crues, par exemple ainsi qu’en fonction de
l’activité du phytoplancton. Les concentrations et teneurs en ETM et éléments majeurs dans le
bassin versant de la Seine sont donc en perpétuel changement, c’est pourquoi il est intéressant
d’étudier leur devenir.
II. Les éléments traces métalliques dans les sédiments
II.1. Formation des sédiments
II.1.1. Origine des particules sédimentaires
Les particules solides constituant les sédiments ont trois origines (Chamley, 2000) :
- terrigène lorsque les particules proviennent de l’érosion des continents,
- allochimique lorsque les particules proviennent du bassin sédimentaire lui-même ou
Partie 1: Synthèse bibliographique
43
- orthochimique qui correspond aux précipités chimiques dans le bassin sédimentaire ou
à l’intérieur du sédiment durant la diagénèse.
Les particules d’origine terrigène sont issues de l’altération superficielle des roches selon des
mécanismes physique (érosion éolienne et variations de température), chimique (hydrolyse,
acidification et salinité) et biologique (activité des microorganismes).
II.1.2. Sédimentation, diagénèse des sédiments et rôle dans la mobilité
des ETM et éléments majeurs
Les sédiments de rivière résultent d’une accumulation de particules en suspension au fond des
cours d’eau, appelée sédimentation. La sédimentation dépend de trois grands types de
paramètres intimement liés : les paramètres hydrodynamiques (débit de la rivière, direction du
courant, forme et profondeur des cours d’eau), physiques (taille des particules) et chimiques
(conditions de pH et d’oxydo-réduction) (Cojan et Renard, 1997).
La diagénèse, qui regroupe l’ensemble des réactions chimiques qui se déroulent dans les
sédiments après le dépôt des matières en suspension mais aussi pendant leur sédimentation,
joue un rôle important sur le comportement des ETM et éléments majeurs (Salomons et
Förstner, 1984). La variation des concentrations de nombreuses substances dans l’eau
interstitielle avec la profondeur reflète ces réactions diagénétiques. Ces réactions sont
d’origines abiotique et biologique. La plupart des réactions biologiques est due à une
décomposition de la matière organique par les microorganismes. Pour oxyder la matière
organique, les bactéries utilisent les accepteurs d’électrons présents, en suivant une hiérarchie
qui dépend de l’apport énergétique fournit par la réduction de chaque oxydant (tableau 9).
Dans les sédiments de la Seine, à l’aval d’Achères, la méthanisation est un processus majeur
lors de la dégradation de la matière organique en période d’étiage. Le CH4 est supérieur à 80
% des gaz totaux émis à l’interface eau-sédiment (Garban et al., 1995).
Tableau 9 : Ordre d’apparition des réactions de réduction couplées à l’oxydation de la matière organique
(Reeburgh, 1983)
Réaction de réduction Eh (mV) Energie fournie (kJ.mol-1 de CH2O dégradé)
Réduction de O2 O2 → H2O 720-740 -475 Dénitrification NO3
- → N2 710 -448 Réduction du Mn Mn(IV) → Mn(II) 460 -349 Réduction du Fe Fe(III) → Fe(II) 60 -114 Réduction des sulfates SO4
2- → HS- -200 -77 Méthanogénèse CH2O → CO2, CH4 -250 -58
Partie 1: Synthèse bibliographique
44
La réduction des oxydes de manganèse et de fer après disparition de l’oxygène et
dénitrification peut entraîner la dissolution des ETM adsorbés sur ces oxydes (Salomons et
Förstner, 1984). Le sulfure d’hydrogène résultant de la réduction des sulfates peut réagir avec
les minéraux contenant du fer pour former des sulfures de fer. Le fer libéré peut ensuite réagir
avec les sulfures pour former des sulfures de fer.
Les sédiments sont donc un compartiment très réactif du milieu aquatique. Cette forte
réactivité tient d'une part au fait qu'ils contiennent toute une plage de compartiments de
conditions d’oxydo-réduction différentes, et que de la matière particulaire et dissoute peut être
transportée dans ces différents compartiments.
On représente souvent les profils de teneurs dans les sédiments selon une échelle où le zéro
est placé au niveau de l'interface avec l'eau surnageante (exemple de profils figure 4). Par
rapport à l'interface, chaque couche de sédiment paraît s'enfoncer progressivement vers le bas.
En réalité, c'est l'interface qui progresse vers le haut et les couches peuvent être en réalité
immobiles. Selon cette vision, les couches de sédiment ne passeraient pas d'un milieu
d’oxydo-réduction à un autre mais évolueraient isolément vers des conditions d’oxydo-
réduction de plus en plus réductrices en fonction de l'activité biologique, hétérotrophe
essentiellement, à l’œuvre au sein de la couche.
En réalité, même dans un milieu très calme, il existe des processus de transfert de particules
ou d'espèces dissoutes entre les couches. La diffusion moléculaire est effective pour les
composés dissous dès lors que les taux de sédimentation sont suffisamment faibles. Rares sont
les milieux où la vitesse de sédimentation est supérieure à 1 cm par an, et l'application des
coefficients de diffusion moléculaires, même quelque peu corrigés pour tenir compte de la
tortuosité (Boudreau, 1996), montre que la diffusion moléculaire est capable de faire migrer
significativement les composés dissous à ces échelles d'espace et de temps (avec un
coefficient de diffusion de 10-10 m2.s-1, le temps caractéristique pour la diffusion sur 1 cm est
de t=L2/D=0.01*0.01/10-10 = 106 secondes = 100 jours). La compaction progressive du
sédiment provoque aussi une remontée de l'eau interstitielle vers l'interface avec l'eau
surnageante. Mais c'est sans doute la bioturbation, qui, dans de très nombreux milieux calmes,
est le facteur principal du mélange entre les couches successives de sédiments. Les modèles
biogéochimiques qui simulent la distribution et les flux d'éléments au sein des sédiments
prennent en compte effectivement ces phénomènes de diffusions (Soetaert et al., 1996; Wang
et Van Cappellen, 1996; Hunter et al., 1998; Boudreau, 1999; Millward et Liu, 2003;
Partie 1: Synthèse bibliographique
45
Meysman et al., 2005). De fait, si l’on admet, comme c'est généralement le cas, que le milieu
est de plus en plus réducteur avec la profondeur dans le sédiment, des espèces dissoutes
générées dans les compartiments les plus réduits du sédiment peuvent effectivement remonter
vers des secteurs moins réduits, et les composés voire les particules subissent des cycles
d’oxydo-réduction et non pas seulement des successions d’oxydo-réduction.
L'observation des profils de concentrations dans l'eau interstitielle doit nous éclairer sur ces
migrations. Des techniques développées récemment, technique de diffusion sur gel (DGT) ou
technique d'équilibre de diffusion (DET) permettent d'accéder, au prix d'un temps de contact
plus long, à des profils plus précis et sans doute plus fiables que les méthodes d'extraction
(délicates) d'eau interstitielle sous atmosphère inerte après tranchage des sédiments (Gao et al.,
2006). Ces techniques permettent des mettre en évidence des gradients de concentration des
éléments actifs sensibles aux variations d’oxydo-réduction (Fe, Mn, S) et des gradients de
métaux traces. On observe très souvent un pic de concentration qui engendre naturellement
des phénomènes de diffusion à la fois vers le haut et vers le bas. Le pic est généré par la
libération de métaux initialement liés aux particules (liées à des oxydes ayant été réduits,
voire de la matière organique) (Zhang et al., 1995; Huerta-Diaz et al., 1998). La diffusion
vers le bas est liée à la formation de sulfures qui fixent le fer et les métaux traces sous forme
particulaire, et induisent donc un déficit de concentration. Le déficit de concentration vers le
haut est soit simplement lié à des concentrations moindres de métaux dissous dans l'eau
surnageante soit à une réoxydation dans le sédiment des métaux (Fe) réduits. La re-
précipitation peut avoir lieu dans les couches d’eau profondes des lacs par exemple et non pas
dans le sédiment.
La figure 4 donne un exemple de profils d’ETM dans les eaux interstitielles de sédiments
d’eau douce d’un lac acide. On note une forte augmentation de fer dissous sous l’interface
eau-sédiment dans le lac Chevreuil. Elle témoigne de la dissolution des oxydes de fer et de la
diffusion des ions Fe(II) libérés vers la surface. Les sulfates sont fortement réduits, selon une
dynamique opposée à celle des ions Fe(II). Des sulfures apparaissent à la même profondeur
mais le pic présente une molarité très inférieure aux teneurs en sulfates. Puis les sulfures
dissous disparaissent de nouveau en profondeur, ce qui témoigne de la formation de sulfures
insolubles et implique la disparition d’une partie des ions Fe(II) avec la profondeur. Le
manganèse ne présente pas le même type de profil, ce qui suggère de très faibles interactions
avec les sulfures.
Partie 1: Synthèse bibliographique
46
Figure 4: Profils de As, Cd, Co, Cu, Ni, Pb, Zn, Mn, Fe, SO42-, ΣH2S et pH dans l’eau interstitielle dans les
sédiments du Lac Chevreuil (Huerta-Diaz et al., 1998) (○), (∆) et (□) représentent 3 profils différents. La
flèche indique les limites de détections analytiques.
Partie 1: Synthèse bibliographique
47
Dans un milieu beaucoup plus énergétique, tel qu'une rivière, de nombreux processus
mécaniques sont susceptibles d'accélérer les cycles d’oxydo-réduction successifs auxquels
sont soumis les particules et les éléments qu'elles contiennent. Les cycles
déposition/resuspension ou exondations multiples peuvent être générés à des échelles de
temps très variables par les successions de crues et d'étiages, qui provoquent à la fois des
variations de niveau d'eau et de vitesse de l'eau, le passage des bateaux, très influents en
étiage dans la partie naviguée de la Seine (Martin, 2001) voire encore les dragages. Pour
autant qu'ils ne soient pas trop rapides pour que des conditions successives réduites et
oxydantes puissent s'établir, ces mécanismes forcent des séquences d’oxydo-réduction au
cours desquelles les ETM pourraient osciller entre des fractions sulfures ou oxydes (Fe et Mn)
(Mucci et al., 2003 ; Van Cappellen et Wang, 1996). En particulier, dans les estuaires et plus
encore dans les marais salins, la salinité joue un rôle très important dans la diagénèse précoce
des sédiments. Ainsi, ce type de sédiments contient plus de phases de fer réactif que les
sédiments marins (Kostka et Luther, 1995). Le cycle rédox du fer est très rapide et complet :
la forme oxydée est très rapidement transformée en forme réduite sous forme de pyrite due à
la présence de sulfates en fortes concentrations. Le cycle rédox est contrôlé à la fois par la
réduction des sulfates et l’oxydation du sédiment qui dépendent à la fois du cycle annuel
(luminosité, température) mais aussi d’effets épisodiques tels que les marées (Kostka et
Luther, 1995). Une étude comparative entre la composition de sédiments fluviaux et marins
en estuaire (estuaire de la Scheldt, sud-ouest des Pays-Bas) réalisée sur la fraction vaseuse
(<63 µm) a montré une variation de la teneur en As, Cd, Cr, Cu, Hg, Ni, Pb et Zn (Verlaan,
2000). Les variations constatées s’expliquent par :
- l’apport de particules fluviales dans la zone de mélange,
- la précipitation chimique du Ni sur les oxydes de manganèse insolubles dans la zone
de transition entre la zone supérieure de l’estuaire anoxique et la zone inférieure
oxique et
- la formation de sulfures de Cd, Cu, Hg et Zn insolubles dans la zone supérieure
anoxique de l’estuaire et une mobilisation du Cd, Cu, Hg et Zn dans la zone oxique
inférieure de l’estuaire.
Ainsi les sédiments contribuent à une régulation des ETM et éléments majeurs selon des
processus complexes faisant intervenir activité chimique, physique et biologique et ceci en
lien étroit avec les propriétés physico-chimique des sédiments.
Partie 1: Synthèse bibliographique
48
II.2. Propriétés physico-chimiques des sédiments
II.2.1. Granulométrie des sédiments
Les sédiments sont habituellement décomposés en deux principales fractions, la fraction
grossière et la fraction fine.
La fraction grossière présente une granulométrie supérieure à 50 µm et est divisée en sous-
fractions (Norme Afnor, NF X 31-107) :
- > 2 mm : débris végétaux ou agrégats
- entre 2 mm et 200 µm : sables grossiers
- entre 200 et 50 µm : sables fins et limons
La fraction fine présente une granulométrie inférieure à 50 µm se divise également en sous-
fractions suivantes :
- entre 50 et 20 µm : limons grossiers
- entre 20 et 2 µm : limons fins
- < 2 µm : colloïdes ou argiles
La connaissance de la granulométrie est particulièrement importante car les fractions fines et
en particulier les argiles assurent la cohésion des sédiments en raison de leurs propriétés
électriques et leur structure en feuillets. Les ETM se trouvent préférentiellement adsorbés sur
les fractions fines, car celles-ci présentent de très grandes surfaces spécifiques comportant de
nombreux sites d’adsorption. Les fractions fines peuvent être constituées de composés actifs
pour les ETM tels que les hydroxydes ou les matières organiques. Ainsi, dans les sédiments
de la Seine, Carpentier et al. (2002b) ont montré que le Cr, le Fe, l’Al, le Mn et le Ni étaient
majoritairement présents sur les fractions fines.
II.2.2. Composition minéralogique des sédiments
Les minéraux, de par leurs propriétés physico-chimiques, sont capables de réagir avec les
ETM présents dans le milieu environnant. En fonction de la répartition des ETM au sein d’un
sédiment, ils seront faiblement ou fortement adsorbés donc plus ou moins mobilisables en
fonction des conditions chimiques du milieu.
II.2.2.1. Les minéraux primaires et secondaires
- Les silicates primaires
Les silicates primaires proviennent de la destruction physique de la roche mère. On les trouve
principalement dans le sable et les limons fins ainsi que dans les argiles.
Partie 1: Synthèse bibliographique
49
La structure des silicates primaires est basée sur des tétraèdres de silice SiO44- qui peuvent se
trouver soit sous forme d’unité isolée soit liés entre eux par leurs sommets de façon à former
des chaînes simples ou doubles, des couches ou des réseaux tridimensionnels (Sposito, 1989).
Des substitutions isomorphiques de Si par Al, Al par Fe(III) et Mg par Fe ou Al se produisent
simultanément aux substitutions de nombreux éléments traces.
L’attaque chimique des silicates primaires contribue à la libération d’espèces majeures telles
que le Na+, Mg2+, K+, Ca2+, Mn2+ et Fe2+. Les cations métalliques Co2+, Cu2+et Zn2+ se
trouvant dans les silicates primaires à l’état de traces sont libérés par érosion (Sposito, 1989).
- Les argiles
Les argiles sont des silicates d’alumine de formule générale (n SiO2Al2O3, mH2O). La
structure cristalline des argiles est disposée en feuillets constitués d’un empilement de
couches tétraédriques de SiO2 et de couches octaédriques de Al2O3.
La substitution des ions Si4+ par les ions Al3+ au sein des feuillets est une propriété
fondamentale des argiles permettant d’expliquer leur affinité pour les éléments traces
métalliques. Par cette substitution, les argiles sont chargées négativement. Cependant, il existe
aussi d’autres charges négatives à la surface des feuillets dues par exemple à des fonctions
hydroxyles. Ces charges sont capables de former des liaisons avec les éléments métalliques
cationiques.
- Les oxydes et hydroxydes
De part leur grande abondance dans la lithosphère et leur faible solubilité aux pH des sols,
l’aluminium, le fer et le manganèse constituent la plupart des oxydes, oxyhydroxydes et
hydroxydes (Sposito, 1989).
Les oxydes de fer se présentent sous forme d’oxydes, d’hydroxydes et d’oxy-hydroxydes et
leur structure est composée de Fe, O et/ou OH. Les hydroxydes de fer possèdent des
groupements hydroxyles –OH sur leur surface, ce qui leur confère des propriétés acido-
basiques. Ils seront donc très fortement impliqués dans les mécanismes d’adsorption des
cations métalliques en solution. Le fer peut se trouver sous forme divalente (ex : FeO,
Fe(OH)2) mais également être sous forme trivalente (Fe2O3) (Cornell et Schwertmann, 2003).
Les composés ferriques les plus communément rencontrés dans les systèmes
environnementaux sont (Cornell et Schwertmann, 2003) :
Partie 1: Synthèse bibliographique
50
- la goethite (α-FeOOH), qui est la forme hydroxyde la plus stable
thermodynamiquement à température ambiante,
- la ferrhydrite (5Fe2O3, 9H2O) qui est un oxyde de fer amorphe très répandu dans les
environnements de surface et
- l’hématite (α-Fe2O3) qui est une forme cristalline très répandue dans les sols et les
roches et est extrêmement stable d’un point de vue thermodynamique.
De par leurs propriétés, les oxydes de fer présentent de nombreuses interactions avec les ETM
qui seront détaillées dans le paragraphe II.3 de ce chapitre.
- Les carbonates
Enfin les sédiments sont composés de carbonates qui interagissent avec les ETM et
contribuent à leur solubilité en cas de modification des conditions physico-chimiques. Par
exemple, une acidification du milieu entraînera la dissolution des carbonates mobilisant en
solution les ETM y étant coprécipités comme le Mn, Fe, Co ou Cd (Sposito, 1989).
II.2.2.2. La matière organique
La matière organique est constituée de biomolécules telles que les acides organiques, les
amines ou les polysaccharides produits par les microorganismes ainsi que les substances
humiques. Toutes ces molécules présentent certaines caractéristiques qui seront déterminantes
pour leur interaction avec les ETM (Sposito, 1989) telles que l’existence d’une grande variété
de groupements fonctionnels réactifs (carboxyliques, carbonyles, amines, phénoliques,
alcooliques…) et un caractère anionique sur le réseau macromoléculaire ayant des effets sur la
réactivité des groupes fonctionnels.
L’adsorption des cations à la surface des minéraux et matières organiques est contrôlée par les
charges de surface qui dépendent du pH (Park, 1965). Le point de charge nulle permet de
caractériser la capacité d’adsorption des ETM sur la surface en fonction du pH. Il s’agit de la
valeur de pH pour laquelle le nombre de charges protoniques de surface positives et négatives
se compense. Les ions s’adsorbant sur une charge opposée à la leur, l’adsorption ne devient
significative qu’à un pH voisin ou supérieur au pH de point de charge nulle. Cependant, les
interactions entre ETM et groupes minéralogiques sont beaucoup plus complexes et ne se
limitent pas à des phénomènes d’adsorption. En effet, les ETM peuvent également être co-
Partie 1: Synthèse bibliographique
51
précipités à la surface des minéraux ou bien des substitutions de cations dans les réseaux
cristallins peuvent se produire, comme nous allons le voir dans le cas des oxydes de fer.
II.3. Interaction entre éléments traces métalliques et composants
des sédiments : cas des oxydes de fer
Nous avons choisi de traiter les interactions entre ETM et sédiments en nous intéressant plus
particulièrement aux oxydes de fer. Comme nous l’avons vu précédemment, les réactions
biotiques et abiotiques contribuant à la diagénèse précoce des sédiments sont très importantes
dans la régulation des métaux traces. En particulier des concentrations importantes d’ETM
s’accumulent à l’interface d’oxydo-réduction lors de la formation diagénétique des
oxyhydroxydes de Fe et Mn (Douglas et Adeney, 2000). Il est probable que ceux-ci se
forment par nucléation et via l’activité microbienne. La géochimie des ETM sur les oxydes de
fer dépend des apports en ETM en provenance des sédiments et/ou de la colonne d’eau et des
modifications physico-chimiques du fond et des eaux interstitielles. Les oxydes de fer peuvent
donc constituer un puits pour les ETM mais peuvent aussi être solubilisés par différents
mécanismes physico-chimiques et microbiologiques, notamment en milieu anaérobie, où les
conditions sont réductrices (cas des sédiments).
II.3.1. Mécanismes d’immobilisation des ETM sur les oxydes de fer
Les oxydes de fer servent de réservoirs aux ETM. Le phénomène chimique principal mis en
jeu est la co-précipitation qui est la précipitation simultanée d’un élément chimique avec
d’autres éléments (Sposito, 1989). Les trois types de co-précipitation sont l’inclusion ou
substitution isomorphique, l’adsorption spécifique et la formation de solution solide. Dans
notre étude, nous ne nous intéresserons qu’aux deux premiers mécanismes. Ainsi, le réseau
cristallin des oxydes de fer se compose majoritairement d’atomes d’oxygène et de fer.
Cependant, les atomes de fer peuvent se substituer avec d’autres cations métalliques présents
dans le milieu environnant.
II.3.1.1. Substitution cationique
La probabilité de substitution cationique du fer dépend du rayon du cation métallique et de sa
valence (Cornell et Schwertmann, 2003). Un cation de valence +III est l’espèce la plus
probable pour se substituer au Fe(III). Le cas de substitution des oxydes de fer amorphes est le
plus fréquemment rencontré dans le milieu naturel. Par conséquent, les oxydes de fer agissent
comme des pièges pour les métaux de valence +III et plus rarement +II et +IV.
Partie 1: Synthèse bibliographique
52
La goethite alumineuse est le meilleur exemple de substitution isomorphe par l’aluminium. En
effet, l’Al(III) peut remplacer jusqu’à 1/3 du Fe(III) total présent dans la goethite (Cornell et
Schwertmann, 2003). Le pH et la température jouent un rôle important dans cette substitution.
Le pH modifie la spéciation de l’Al en solution. A pH acide, la forme Al3+ est majoritaire ce
qui facilite la substitution. Une augmentation de température entraîne une diminution de
l’incorporation de l’Al, probablement suite à une augmentation de la vitesse de croissance du
cristal. La substitution présente des conséquences sur la solubilisation de la goethite. En
fonction du métal incorporé, la dissolution de la goethite substituée diminue dans l’ordre
suivant :
Mn-goethite > goethite pure > V-goethite > Al-goethite > Cr-goethite
La substitution de la goethite par l’aluminium est fréquemment rencontrée dans les sols
tropicaux (Cornell et Schwertmann, 2003). A l’inverse, bien que les rayons ioniques du Fe(III)
et du Mn(III) soient proches, la substitution par le Mn(III) est très limitée car celui-ci présente
une sphère de coordination tétragonale distordue sur un site octaédrique (effet Jahn-Teller).
Bien que les métaux puissent être incorporés dans le réseau cristallin des oxydes de fer, les
cations métalliques peuvent également être piégés sur les oxydes de fer par adsorption.
II.3.1.2. Adsorption spécifique des cations métalliques
L’adsorption spécifique joue un rôle particulièrement important dans le processus
d’interaction entre les ETM et les sédiments. Il s’agit d’une accumulation nette de matière
(ETM) à l’interface d’une phase solide (sédiment) et d’une solution aqueuse (colonne d’eau).
Elle diffère de la précipitation par le fait qu’elle n’aboutit pas au développement d’une
structure moléculaire tridimensionnelle. L’adsorption spécifique d’ETM sur les sédiments fait
intervenir deux processus (figure 5) :
La complexation externe à la sphère d’hydratation : elle correspond à une adsorption physique
mettant en jeu une déformation des orbitales électroniques du ligand et du métal de part et
d’autre de la sphère d’hydratation, de type dipôle-dipôle. Ce mécanisme est instantané et
réversible. Les cations adsorbés sont facilement échangeables (Sposito, 1989).
La complexation interne à la sphère d’hydratation : elle correspond à une adsorption mettant
en jeu des liaisons covalentes donc de plus forte énergie. Aucune molécule d’eau n’est
interposée entre le cation métallique et les groupes fonctionnels de l’adsorbant. Le complexe
Partie 1: Synthèse bibliographique
53
formé est assez stable et les cations fortement liés à l’adsorbant. La désorption est par
conséquent moins facile car elle requiert une plus grande énergie pour rompre les liaisons
(Sposito, 1989).
Figure 5 : Schématisation de la complexation externe et interne à la sphère d’hydratation (Sposito, 1989)
Dans le cas des oxydes de fer, il s’agit d’un phénomène d’interaction des espèces adsorbées
avec les groupes hydroxyles présents à la surface des hydroxydes de fer –OH. L’oxygène peut
interagir avec les protons des acides alors que les cations métalliques agissent comme des
acides de Lewis et échangent l’hydrogène du groupement –OH avec d’autres ligands pour
former des complexes de surface (Cornell et Schwertmann, 2003) :
≡FeOH + Mz+ FeOM(z-1)+ + H+
et ≡Fe(OH)2 + Mz+ (FeO)2M(z-2)+ + 2H+
L’adsorption cationique entraîne une libération de protons et donc une acidification du milieu.
Certains paramètres tels que la force ionique de la solution et la température ont une influence
sur la capacité d’adsorption des oxydes de fer. Selon l’électrolyte, l’adsorption sera renforcée
ou supprimée. Par exemple, Crisenti et Sverjensky (1999) ont observé une augmentation de
l’adsorption des cations avec une solution de NaClO4 alors qu’une concentration forte en
NaCl entraîne une diminution de l’adsorption. Une température élevée augmente l’adsorption
des cations sur les oxydes de fer (Cornell et Schwertmann, 2003 d’après Machesky, 1985).
Suivant le type d’oxyde, la force d’adsorption des ETM est différente. Ainsi sur la goethite, le
cuivre est le métal le plus fortement adsorbé suivi par le Pb, Zn, Cd, Co, Ni et Mn alors que
Partie 1: Synthèse bibliographique
54
sur l’hématite, les forces d’adsorption du Cu et du Pb sont inversées (McKenzie, 1980; Gerth
et Brümmer, 1983). Quant à la ferrihydrite, la force d’adsorption des ETM sur la ferrihydrite
suit l’ordre suivant : Pb>Cu>Cd>Zn>Ni>Ca (Dzombak et Morel, 1990).
En cas de faibles concentrations en cations et d’un nombre limité de sites disponibles sur les
oxydes, une compétition entre cations se produit (Benjamin et Leckie, 1981). Ainsi, le Zn
supprime toute adsorption du Cu sur la ferrihydrite.
L’adsorption spécifique des cations sur les oxydes de fer est un phénomène. La durée
d’adsorption du Ni, Zn et Cd varie de 2 h à 42 jours (Brümmer et al., 1988). En effet, il existe
des processus rapides et d’autres plus lents, relevant plus de la diffusion, de la réorganisation
des atomes en surface et dans le réseau du solide.
La réversibilité de l’adsorption spécifique dépend du type de complexe de surface formé ainsi
que de l’ETM adsorbé. S’il s’agit d’un complexe de surface interne, la désorption sera
beaucoup plus difficile (Quirk et Posner, 1975). Dans ce cas, les ETM se sont rapidement
adsorbés en surface puis par un mécanisme de diffusion lente se sont adsorbés sur les sites
internes.
Malgré une force d’adsorption plus élevée que pour les autres ETM, le plomb peut être
complètement désorbé de la goethite (Padmanabham, 1983) alors que la désorption du Cu, Zn,
Cd, Ni et Co suit une courbe d’hystérésis (Padmanabham, 1983; Brümmer et al., 1988;
Barrow et al., 1993).
II.3.2. Mobilité des ETM associés aux oxydes de fer
La dissolution des oxydes de fer dépend de différents paramètres tels que la température du
système, les propriétés acido-basiques et d’oxydo-réduction du milieu ainsi que des propriétés
intrinsèques aux oxydes (Cornell et Schwertmann, 2003).
La dissolution des oxydes de fer se produit selon différents mécanismes que sont la
protonation, la complexation et la réduction.
II.3.2.1. Protonation
Le mécanisme détaillé de la dissolution des oxydes de fer par protonation a été proposé par
Stumm et Furrer (1987). Il s’agit d’une adsorption de protons sur les groupements hydroxyles
Partie 1: Synthèse bibliographique
55
à la surface des oxydes. L’adsorption du proton affaiblit la liaison Fe-O conduisant à la
libération du fer en solution. L’équation de dissolution par protonation est la suivante :
FeOOH + nH+ → [Fe(OH)(3-n)]aqn+ + (n-1) H2O
II.3.2.2. Complexation
Lors de la dissolution des oxydes par complexation, les ligands organiques s’adsorbent à la
surface de l’oxyde, ce qui affaiblit la liaison Fe-O et provoque la libération du complexe
ligand-Fe(III) en solution (Stumm et Furrer, 1987) :
≡Fe(III)-OH + L- + H+ → ≡Fe(III)-L + H2O → Fe(III)-Laq + H2O
Ainsi, l’oxalate permet de dissoudre la goethite, l’hématite et la ferrihydrite dans une gamme
de pH comprise entre 3 et 5 alors qu’en l’absence du ligand, la dissolution se produit à pH nul
(Stumm et al., 1985)
Les protons facilitent la dissolution des groupements OH par protonation, affaiblissant ainsi la
liaison Fe-O et dans une moindre mesure augmentent la charge négative à la surface de
l’oxyde facilitant l’adsorption du ligand. Si le pH diminue, la protonation des ligands en
solution augmente, ce qui diminue l’adsorption du ligand et donc la formation du complexe
Fe(III)-Laq. Ainsi, le taux de dissolution des oxydes de fer par complexation diminue. Par
conséquent, la désorption par complexation en présence de ligands organiques est maximale à
un pH donné. Par exemple, la dissolution de l’hématite par l’acide citrique est maximale entre
pH 4 et 5 alors que la dissolution de la goethite par l’acide oxalique est maximale à pH 2,6
(Cornell et Schindler, 1987).
II.3.2.3. Réduction
La dissolution des oxydes de fer par réduction est le mécanisme le plus important dans le
milieu naturel. La réduction du Fe(III) en Fe(II) déstabilise la sphère de coordination du fer
par perte de charge et parce que la taille du Fe(II) est plus grande que celle du Fe(III) (0,078
vs 0,064 nm) (Cornell et Schwertmann, 2003). Le Fe(II) est donc libéré en solution.
La dissolution des oxydes de fer par réduction augmente lorsque l’activité des électrons
augmente c’est-à-dire lorsque le potentiel d’oxydo-réduction du milieu diminue. La réduction
peut se faire par des réactifs chimiques réducteurs synthétiques ou naturels tels que le
dithionite ou l’hydroquinone (voir Cornell et Schwertmann (2003) pour une revue complète
Partie 1: Synthèse bibliographique
56
des différents réducteurs chimiques utilisés) mais également par photochimie et surtout par
voie bactérienne.
La réduction par photochimie est initiée lors de l’apport d’énergie par transfert de charge dans
les groupes Fe(III)-OH de surface. Des ligands, tels que l’oxalate ou le citrate, impliqués dans
la dissolution par complexation peuvent, après avoir été activés photochimiquement, réduire
les oxydes de fer dissous. Un exemple de réduction par photochimie est la formation d’ions
Fe2+ dans les eaux de surface comme étant le résultat d’alternance jour-nuit avec une
augmentation diurne de la concentration en Fe2+ (McKnight et al., 1988).
La réduction biologique des oxydes de fer fait intervenir des microorganismes ferri-réducteurs
vivant en milieu anaérobie (Lovley, 1991). Les oxydes de fer servent d’accepteurs terminaux
dans leur chaîne respiratoire. Tous ces mécanismes ainsi que les principaux microorganismes
impliqués seront détaillés dans le paragraphe III.
II.3.2.4. Comparaison de l’efficacité des mécanismes de
dissolution
Banwart et al. (1989) ont montré qu’à pH 3, le taux de dissolution de l’hématite était plus
important par réduction que par complexation et enfin par protonation (un facteur de 350
entre la réduction et la protonation). De même, le taux de dissolution de la goethite par
réduction microbienne était 400 fois plus important que par protonation.
A pH neutre, la dissolution par protonation était extrêmement lente alors que la réduction en
particulier en présence de ligands complexants était beaucoup plus efficace.
La réduction est donc le mécanisme majeur de dissolution des oxydes de fer et du transport du
fer dans les écosystèmes.
Cependant, la substitution métallique peut avoir une influence sur les mécanismes de
solubilité des oxydes de fer. Ainsi, les effets de substitution sur la dissolution de la goethite
sont plus importants pour des températures comprises entre 20 et 50°C. L’aluminium n’a pas
de conséquence sur la dissolution photochimique de la goethite dans l’oxalate à pH 2,6
(Cornell et Schindler, 1987) alors que l’on observe une diminution de la dissolution de la
goethite et de l’hématite de synthèse substituées en Al dans un mélange réducteur composé de
dithionite/citrate/bicarbonate (Torrent et al., 1987). Le Cr(III) stabilise la goethite et la
préserve d’une dissolution par protonation alors que celle-ci est favorisée lors d’une
substitution par le Mn, Al, Ni et Co (Lim-Nunez et Gilkes, 1987; Schwertmann, 1991)
Partie 1: Synthèse bibliographique
57
II.3.3. Importance de l’étude des oxydes de fer et des ETM associés
d’un point de vue environnemental
Comme nous venons de le voir, de nombreux ETM sont associés aux oxydes de fer et cela
peut avoir des conséquences sur leur mobilité. La coprécipitation ou l’adsorption des ETM
participent à la dépollution des ETM dans l’environnement. Ainsi un cas de dépollution
naturelle en As par les oxydes de fer a été rencontré dans un récif corallien de
Papouasie Nouvelle-Guinée. En atteignant les eaux de surface aérobies, les fluides
hydrothermaux riches en As et Fe dissous se déchargent de leurs teneurs en As car celui-ci est
quasiment complètement adsorbé et/ou coprécipité sur la ferrihydrite. Le piégeage de
l’arsenic permet donc de préserver le biotope d’une contamination en arsenic (Pichler et
Veizer, 1999). De plus, les oxydes de fer contribuent par des réactions d’oxydo-réduction à la
détoxification des ETM. C’est le cas de la réduction du Cr(VI) en Cr(III), qui a lieu dans les
sols et les sédiments en condition anoxique (Wehrli et al., 1989). Dans ce processus, le Fe(II)
agit comme un donneur d’électrons et entraîne la formation d’un oxyde de fer selon la
réaction :
2 CrO42- + 6 Fe2+ + 4 H2O → 2Cr3+ + 6 FeOOH + 2 H+
Cependant, les oxydes de fer peuvent être à l’origine de pollution métallique en particulier
sous l’action des microorganismes. Ainsi dans les sols ferralitiques de Nouvelle-Calédonie, la
réduction bactérienne du fer entraîne la mobilité du Co et du Ni coprécipités sur les oxydes de
fer et manganèse (Quantin et al., 2001).
L’action des microorganismes va donc avoir un impact très important sur la solubilisation des
métaux ainsi que leur piégeage.
III. Rôle des microorganismes dans la mobilité des ETM
Depuis que la vie est apparue sur Terre, il y a environ 3,5 milliards d’années, les bactéries et
les champignons ont progressivement conquis les enveloppes superficielles (eaux, sédiments,
sols...) et interviennent dans les processus d’altération. Ces micro-organismes obtiennent
l’énergie nécessaire à leur croissance et à leur multiplication dans des réactions
d’oxydoréduction impliquant des substances soit organiques (on parle alors de bactéries et de
champignons chimio-organotrophes), soit minérales (il s’agit alors de bactéries chimio-
lithotrophes). Simultanément, ces micro-organismes produisent et excrètent des métabolites
qui peuvent avoir des propriétés oxydantes, réductrices, alcalines, acides ou complexantes,
tant vis-à-vis des minéraux solides que des éléments libérés en solution. Enfin, que ceci soit
Partie 1: Synthèse bibliographique
58
ou non justifié par leurs besoins nutritionnels, ils peuvent absorber dans leurs cellules ou fixer
sur leurs constituants cellulaires (par exemple leurs parois) des éléments métalliques et agir
alors comme de véritables pièges à éléments minéraux (Berthelin, 1988; Berthelin et al.,
1995).
L’ensemble de ces phénomènes est résumé dans la figure 6 (d’après Ledin, 2000). Les micro-
organismes liés au soufre et au fer jouent un rôle particulièrement important sur le devenir des
ETM.
Figure 6 : Interactions microorganismes-métaux (d’après Ledin, 2000)
Une mobilisation des ETM par les microorganismes peut être due à une oxydation du soufre
conduisant à une acidification du milieu et donc à une dissolution des ETM par baisse du pH.
La réduction des oxydes de fer entraîne la dissolution des ETM y étant adsorbés.
A l’inverse, l’immobilisation des ETM peut être due à une réduction des sulfates en sulfures
qui se complexent avec les cations métalliques pour précipiter sous forme de sulfures
métalliques. D’autres bactéries, en oxydant le Fe(II) en Fe(III) vont conduire à la formation
d’oxydes de fer sur lesquels les ETM peuvent s’adsorber. Nous détaillerons certains de ces
mécanismes dans la suite de ce chapitre.
Partie 1: Synthèse bibliographique
59
III.1. Oxydation des sulfures métalliques
L’oxydation biologique des sulfures métalliques est un phénomène largement rapporté dans la
littérature. Elle est rencontrée dans les mines et les sédiments en conditions aérobies et est
réalisée par des microorganismes autotrophes afin d’obtenir l’énergie nécessaire à leur
croissance.
III.1.1. Microorganismes impliqués
Les micro-organismes oxydant les sulfures de métaux les plus fréquemment étudiés (Suzuki,
2001; Baker et Banfield, 2003) sont les suivants :
-Thiobacillus ferrooxidans qui oxyde les composés soufrés réduits en sulfates et les ions Fe(II)
en Fe(III),
- Thiobacillus thiooxidans qui oxyde uniquement les composés soufrés réduits et
- Leptospirilum ferroxidans qui oxyde uniquement les ions Fe(II).
Il s’agit de bactéries de type Gram négatif. Le pH optimal de croissance de ces bactéries et en
particulier de Thiobacillus ferrooxidans est de 2 mais elles sont capables de pousser dans une
gamme de pH plus large et comprise entre 1.5 et 6 (Leduc et Ferroni, 1994).
III.1.2. Mécanismes de lixiviation
Suivant le type de sulfures métalliques, les mécanismes de lixiviation diffèrent. En raison de
la nature de la liaison entre le S et l’atome métallique, les sulfures de métaux seront attaqués
par oxydation ou par protonation (Crundwell, 1988). Les bandes de valence du FeS2, MoS2 et
WS2 étant uniquement issues des liaisons chimiques entre les atomes métalliques, celles-ci ne
contribuent pas à la liaison chimique entre le métal et le soufre dans le cristal. La liaison M-S
est uniquement ionique (Welz et Rosenburg, 1987). Par conséquent, ces sulfures sont
uniquement altérables par oxydation, par exemple par les ions Fe3+. A l’inverse, les sulfures
métalliques, tels que ZnS, PbS, MnS2 ou CuFeS2, ont des bandes de valence auxquelles les
orbitales des métaux et du soufre contribuent. Par conséquent, ces sulfures métalliques sont
acido-solubles (Crundwell, 1988; Schippers et Sand, 1999).
III.1.2.1. Lixiviation des sulfures de métaux acido-solubles
La lixiviation des sulfures de métaux est un processus chimique dans lequel les ions ferriques
et les protons interviennent. Le rôle des micro-organismes est de produire les composés
chimiques et de créer les espaces dans lesquels les réactions de lixiviation peuvent se produire
(Rawlings, 2005).
Partie 1: Synthèse bibliographique
60
La lixiviation des sulfures de métaux acido-solubles, encore appelée mécanisme polysulfure,
est réalisée par l’intermédiaire de l’attaque combinée des ions ferriques et des protons avec le
soufre élémentaire comme principal composé intermédiaire (figure 7).
MS
M2+ + Sn2-
S8
SO42-
H+
Attaque par acidification
Fe2+
Fe3+
Attaque par oxydation
2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2OTf, Lf MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+
0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+
0,125S8 + 1,5O2 + H2O SO42- + 2H+
MS
M2+ + Sn2-
S8
SO42-
H+
Attaque par acidification
Fe2+
Fe3+
Attaque par oxydation
Fe2+
Fe3+
Fe2+
Fe3+
Attaque par oxydation
2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2OTf, Lf MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+MS + Fe3+ + 2H+ M2+ + H2S.+ + Fe2+
0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+0,5H2S + Fe3+ 0,125S8 + Fe2+ + H+
0,125S8 + 1,5O2 + H2O SO42- + 2H+
Figure 7 : Mécanismes de solubilisation des sulfures de métaux acido-solubles par attaque chimique et
microbiologique (Schippers et Sand, 1999)
En milieu acide et oxygéné, Acidithiobacillus ferrooxidans et Leptospirilum ferrooxidans
oxydent le Fe(II) en Fe(III) (Schippers et Sand, 1999) selon la réaction suivante :
2 Fe2+ + 2H+ + ½ O2 → 2Fe3+ + H2O
Le Fe(III) produit attaque le sulfure de métal selon la réaction suivante :
MS + Fe3+ + 2H+ → M2+ + H2S.+ + Fe2+
puis par une suite de réactions conduire à la formation de soufre élémentaire (figure 7). Le
soufre élémentaire est relativement stable mais peut être oxydé en sulfate par des bactéries
sulfato-oxydantes telles que Acidithiobacillus thiooxidans ou Acidithiobacillus caldus selon la
réaction :
0,125 S8 + 1,5 O2 + H2O → SO42- + 2H+
L’acide sulfurique produit entraîne alors la solubilisation directe des sulfures de métaux.
Le rôle des micro-organismes dans la solubilisation des sulfures métalliques est donc de
produire de l’acide sulfurique pour une attaque par protonation et de conserver le fer à l’état
ferrique pour une attaque oxydante du minéral.
Partie 1: Synthèse bibliographique
61
III.1.2.2. Sulfures de métaux acido-insolubles
Les sulfures de métaux acido-insolubles sont attaqués uniquement par voie biologique
(Schippers et Sand, 1999) selon un mécanisme communément appelé mécanisme thiosulfate
(figure 8). Dans ce mécanisme, la solubilisation est réalisée par oxydation des sulfures de
métaux par le fer ferrique produit comme précédemment par les micro-organismes. L’attaque
conduit à la formation de thiosulfate comme produit intermédiaire principal et à la formation
d’acide sulfurique comme produit final. Cependant, contrairement au mécanisme précédent, la
production de H+, ne participe pas à l’attaque chimique des sulfures de métaux pour les
raisons évoquées précédemment.
Fe2+
Fe3+
Tf, Lf
MS
M2+ + S2O32-
SO42- + H+
FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+
S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4
2- + 8Fe2+ + 10H+
2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O
Tf : Thiobacillus ferroxidans
Lf : Leptospirillum ferroxidans
Fe2+
Fe3+
Tf, LfFe2+
Fe3+
Tf, Lf
MS
M2+ + S2O32-
SO42- + H+
FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+
S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4
2- + 8Fe2+ + 10H+
2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O
Tf : Thiobacillus ferroxidans
Lf : Leptospirillum ferroxidans
MS
M2+ + S2O32-
SO42- + H+
FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+FeS2 + 6Fe3+ + 3H20 S2O32- + 7Fe2+ + 6H+
S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4
2- + 8Fe2+ + 10H+S2O32- + 8Fe3+ + 5H20 2SO4
2- + 8Fe2+ + 10H+
2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O2Fe2+ + 2H+ + 1/2O2 2Fe3+ + H2O
Tf : Thiobacillus ferroxidans
Lf : Leptospirillum ferroxidans
Figure 8 : Mécanisme de dissolution des sulfures de métaux acido-insolubles par attaque chimique et
microbiologique (Schippers et Sand, 1999)
III.1.3. Importance du contact bactérie-minéral dans le phénomène de
biolixiviation
Les bactéries sulfo- et ferro-oxydantes sont présentes en suspension et à la surface des
sulfures. Bien que le contact minéral-bactérie ne soit pas nécessaire à l’oxydation des sulfures
et en particulier de la pyrite, celui-ci accélère de façon très significative le processus
d’oxydation (Dziurla, 1995). Le type de contact entre les bactéries sulfo-oxydantes et les
sulfures de métaux est un contact indirect, les bactéries étant liées aux sulfures de métaux par
des substances polymériques extracellulaires (Dziurla, 1995).
Ohmura et al (1993) ont montré que lors de l’oxydation de la pyrite par A. ferrooxidans, la
bactérie était distribuée en monocouche à la surface du minéral. Une meilleure adhérence du
Partie 1: Synthèse bibliographique
62
complexe bactérie-substances polymériques extracellulaires est rapportée lorsque la densité
cellulaire est faible. Par ailleurs, d’autres résultats suggèrent que l’interaction entre A.
ferrooxidans et la pyrite serait contrôlée par l’affinité des cellules pour le Fe3+ ou le Fe2+
présents sur la surface du minéral (Dziurla, 1995). Cette affinité pourrait être due à une ou
plusieurs protéines membranaires intervenant dans le mécanisme d’adhésion.
III.1.4. Paramètres influençant la lixiviation des sulfures de métaux
III.1.4.1. Type de micro-organismes
Le type de micro-organismes et leurs relations déterminent le rendement de dissolution des
sulfures de métaux. Ainsi, en ce qui concerne la dissolution de la pyrite, il a été observé que
le consortium Leptospirillum sp, Acidithiobacillus caldus et Ferroplasma sp entraînait une
plus grande dissolution de la pyrite que lorsque Leptospirillum sp était seule ou en présence
de A. caldus (Okibe et Johnson, 2004).
De même, la présence simultanée d’ A. caldus et Sulfobacillus thermosulfidooxidans dissout
99,9 % du Fe de l’arsenopyrite, alors que seulement 36% du Fe est dissous en présence de S.
thermosulfidooxidans (Dopson et Lindström, 1999). Cependant, en présence d’A. caldus, la
quantité de S0 n’augmente pas de façon significative. Selon ces derniers auteurs, l’addition de
A. caldus modifie l’efficacité de lixiviation de l’arsenopyrite selon trois mécanismes :
1) l’oxydation du soufre augmente le taux de lixiviation de l’arsenopyrite en éliminant la
couche de soufre à la surface du minéral, rendant accessible le Fe à l’attaque biologique,
nécessitant un contact entre minéral et bactéries,
2) production de métabolites organiques tels que des cétoacides qui stimulent la croissance
microbienne autotrophe et mixotrophe,
3) production d’agents de surface actifs dans la solubilisation du S0. En effet, il a été
également observé qu’ A. caldus produisait de tels agents de surface favorisant la dissolution
du S0 (Dopson et Lindström, 1999).
III.1.4.2. Paramètres physico-chimiques
En milieu naturel, les variations saisonnières et en particulier la température influencent
significativement la composition de la communauté bactérienne. Ainsi, l’étude des
communautés microbiennes dans des eaux de drainage extrêmement acides d’une mine par
Edwards et al. (1999) a montré qu’au mois de janvier 95 % des bactéries n’étaient pas des
archéobactéries alors qu’en juillet-août 50 % de la population microbienne était composé
d’archéobactéries. Par ailleurs, A. ferrooxidans est la plus abondante lorsque le pH est de 2,5
Partie 1: Synthèse bibliographique
63
et la température de 20°C alors que l’inverse est observé à pH 0,5. L. ferrooxidans est la plus
abondante lorsque le pH est compris entre 0 et 3 et la température entre 20 et 50°C.
III.1.5. Conséquences de l’oxydation des sulfures sur l’environnement
L’oxydation des sulfures peut avoir un impact négatif pour l’environnement. En effet, les
activités minières intensives représentent un danger potentiel pour le milieu naturel. Comme
nous venons de le décrire, l’activité de ces bactéries entraîne une acidification du milieu. En
fonction de la composition des minerais et en particulier des ETM qui les composent, ceux-ci
vont se retrouver en fortes concentrations dans les eaux de surface et souterraines.
Cependant cette capacité de lixiviation peut être utilisée à des fins de dépollution. En effet,
cette capacité a été appliquée dans le domaine environnemental et en particulier dans la
remédiation des sites miniers, le traitement des déchets industriels, la dépollution des boues de
station d’épuration et pour la bioremédiation des sols et sédiments contaminés en ETM
(Bosecker, 2001).
Dans ces configurations, les conditions de lixiviation (croissance des microorganismes
notamment) sont optimisées de manière à prévenir tout risque de contamination du milieu
environnant. Récupération des métaux dissous par lixiviation et remédiation des sites pollués
sont alors réalisées simultanément (Bosecker, 1997).
Dans le cas des résidus minéraux industriels (cendres d’incinération, cendres volantes…), la
plupart des méthodes conventionnelles de bioremédiation peuvent échouer car les ETM sont
généralement présents sous forme d’oxydes plutôt que de sulfures. Or, ces oxydes de métaux
peuvent être détruits par l’acide sulfurique produit par T. thiooxidans. Si, dans la plupart des
cas, un traitement chimique par attaque acide s’avère beaucoup plus facile, l’utilisation de
telles bactéries présente l’avantage d’un coût économique moindre et d’une source continuelle
d’acide sulfurique. Par ailleurs, durant la production d’acide par T. thiooxidans, le pH diminue
graduellement. Ainsi, les métaux passent en solution à différentes vitesses en fonction de leur
solubilité, ce qui permet de les séparer (Brombacher et al., 1998).
Les boues de station d’épuration ont longtemps été épandues sur les terres cultivées comme
engrais. Or ces boues contiennent de fortes teneurs en métaux. L’utilisation de bactéries sulfo-
oxydantes du genre Thiobacillus entraîne l’acidification des boues à pH 2. Cette diminution
de pH a permis de solubiliser les métaux et de rendre leurs teneurs compatibles avec les
normes recommandées appliquées en agriculture (Blais et al., 1992).
De la même manière, les sédiments de dragage des cours d’eau qui peuvent être épandus
contiennent des quantités non négligeables de métaux. Or l’aération de ces sédiments entraîne
Partie 1: Synthèse bibliographique
64
leur acidification et donc la mobilité des métaux. Des techniques de remédiation consistent à
accélérer la lixiviation naturelle en activant les Thiobacillus naturellement présents dans les
sédiments. Ainsi il a été possible de solubiliser en deux jours, en réacteurs, entre 47 et 80 %
de Cu, 81-89 % de Mn et 42-60% de Ni (Couillard et Chartier, 1991).
Concernant la remédiation des sols pollués, des souches de T. ferrooxidans ont permis
d’extraire en totalité le Cd, Co, Cu et Ni et en présence de T.thiooxidans plus de 80% de Cd,
Co, Cu et Zn ont été extraits (Gomez et Bosecker, 1999).
Ainsi la lixiviation des ETM par les microorganismes autotrophes peut être utilisée dans un
but environnemental et participer à la dépollution des matrices solides contaminées en ETM.
III.2. Réduction des oxydes de Fe (III)
Le fer joue un rôle vital chez tous les organismes vivants et en particulier au niveau de leur
métabolisme cellulaire. En effet, le fer intervient dans le transport, le stockage et l’activation
de l’oxygène moléculaire, la réduction des ribonucléotides et le diazote, l’activation et la
décomposition des péroxydes et le transport d’électrons via une grande variété de
transporteurs d’électrons (Pierre et al., 2002).
En milieu aérobie, ainsi que nous l’avons décrit précédemment, certaines bactéries sont
capables d’oxyder le fer(II) pour tirer leur énergie. En milieu anaérobie, le fer est un élément
important dans la respiration des microorganismes qui l’utilisent comme accepteur terminal
d’électrons dans leur chaîne respiratoire à la place de l’oxygène (Luu et Ramsay, 2003).
Cette propriété du fer à être utilisé soit comme accepteur soit comme source d’électrons
provient de la valeur du potentiel d’oxydo-réduction du couple Fe2+/Fe3+ (+700mV).
Cependant, le fer est un élément dont la solubilité est très faible et par conséquent peu
disponible. C’est pourquoi, les mécanismes de mobilisation du fer par les microorganismes
ont été particulièrement étudiés tant d’un point de vue métabolique qu’au niveau des
conséquences biogéochimiques et en particulier de la genèse des sols (Cornell et
Schwertmann, 2003).
La réduction bactérienne des oxydes de fer est un mécanisme fréquemment rencontré dans les
sols et sédiments en conditions anaérobies.
Dans la majorité des cas, il s’agit d’une réduction enzymatique dissimilatrice du Fe(III). Les
bactéries ferri-réductrices utilisent le Fe(III) comme accepteur terminal d’électron dans leur
Partie 1: Synthèse bibliographique
65
chaîne respiratoire en milieu anaérobie à la place de l’oxygène (Lovley, 1991). Le Fe(III) est
donc réduit en Fe(II). La réduction dissimilatrice, où de grandes quantités de Fe(II)
s’accumulent à l’extérieur des bactéries, se différencie de la réduction assimilatrice au cours
de laquelle de faibles quantités de Fe(II) sont produites et assimilées par les bactéries.
III.2.1. Réduction du fer et fermentation
Les premiers microorganismes ayant été décrits pour leur capacité à réduire le Fe(III)
possédaient un métabolisme de type fermentaire (figure 9). Il s’agissait de souches de
Clostridium sporogenes et de Paenibacillus polymyxa cultivées sur un milieu contenant du
glucose comme source de carbone (Starkey et Halvorson, 1927; Roberts, 1947).
Cependant, lors de ce processus, le fer n’est pas un accepteur majoritaire d’électrons. En effet,
moins de 5% d’équivalents réducteurs sont transférés vers le fer (Lovley, 1991 ; Bousserrhine
et al., 1999a). Le fer apparaît donc être un puits minoritaire d’électrons pour le métabolisme
fermentaire. Chez Paenibacillus polymyxa, la plupart des équivalents d’électrons, initialement
présents dans le glucose, se retrouve dans l’éthanol, le 2,3-butylène glycol, les acides lactique
et formique (Roberts, 1947).
Les calculs thermodynamiques montrent que la stratégie métabolique d’utiliser le Fe(III),
même en étant un puits mineur d’électrons, peut fournir aux bactéries fermentatrices une
énergie plus importante que la fermentation seule (Lovley, 1991).
Figure 9 : Réduction dissimilatrice des oxydes de fer et fermentation (Lovley, 1991)
Partie 1: Synthèse bibliographique
66
Par ailleurs, la réduction des oxydes de Fe(III) peut s’avérer plus efficace en présence d’un
consortium de micro-organismes. Ainsi, la réduction d’oxyde de Fe(III) faiblement cristallisé
et en présence de glucose, nécessite la présence simultanée d’Escherichia coli et de
Geobacter metallireducens (GS-15). En effet, la présence d’E. coli seule, entraîne la
fermentation du glucose mais ne réduit pas le Fe(III) car E. coli ne possède pas les enzymes
spécifiques. Si G. metallireducens est seulement présente, celle-ci ne pourra pas métaboliser
le glucose. Aussi, est-il nécessaire qu’E.coli métabolise le glucose en éthanol pour que celui-
ci soit utilisé par G. metallireducens pour réduire le Fe(III). Cette réduction du Fe(III) en Fe(II)
est réalisée par contact direct entre G. metallireducens et l’oxyde de Fe(III) car l’enzyme
responsable de la réduction est située sur la membrane de la bactérie (Lovley, 1991)
D’autres bactéries comme Clostridium butyricum utilisent aussi le mécanisme de fermentation
pour réduire les oxydes de Fe(III) en Fe(II) (tableau 10). Les produits majoritaires de
fermentation obtenus sont alors de l’acétate, le butyrate, le dioxyde de carbone et de
l’hydrogène. Ces bactéries du genre Clostridium ont été décrites dans des sols hydromorphes
en milieu anaérobie (Munch et Ottow, 1983; Bousserrhine, 1995; Bousserrhine et al., 1999a,
1999b; Dominik et al., 2002).
Tableau 10 : Exemples de microorganismes fermenteurs et réduisant le fer(III) en présence de différentes
sources de carbone donneuses d’électrons (Bousserrhine, 1995)
Microorganismes Donneurs d’électrons Formes de fer Aerobacter sp glucose Oxyhydroxyde de fer ferrique
amorphe (OHFA) Bacillus cereus Glucose-asparatine Hématite Bacillus circulans Sucrose
Glucose-asparatine OHFA hématite
Bacillus polymyxa Glucose Glucose Sucrose
OHFA Hématite OHFA
Bacillus subtilis glucose Hématite Bacteroides hypermegas Glucose-tryptone Chlorure ferrique Clostridium butyricum glucose Hématite Clostridium sporogenes Glucose, peptone OHFA Echerichia coli Glucose, peptone,
Glucose-asparagine OHFA hématite
Pseudomonas aeruginosa Glucose-asparagine hématite Vibrio sp Glucose Chlorure ferrique
III.2.2. Réduction couplée à l’oxydation des acides organiques et
composés organiques aromatiques
Partie 1: Synthèse bibliographique
67
Bien que peu de microorganismes capables de tirer leur énergie de produits de fermentation
avec réduction du Fe(III) aient été isolés, ceux-ci sont probablement largement répandus dans
l’environnement (Lovley, 1991). Les bactéries oxydant l’acide acétique et réduisant le fer ont
été identifiées dans de nombreux types de sédiments (Lovley et Phillips, 1986). Ainsi, la
bactérie GS-15 a été décrite comme étant capable d’oxyder totalement l’acide acétique en
dioxyde de carbone en réduisant simultanément le Fe(III) en Fe(II) selon l’équation (Lovley et
Phillips, 1988) :
Acetate- + 8Fe(III) + 4H2O→ 2HCO3- + 8Fe(II) + 9H+
D’autres bactéries, telle que Shewanella putrefaciens sont également capables d’oxyder
l’acide formique en dioxyde de carbone avec réduction du fer(III) (Lovley et Phillips, 1989) :
Formate- + 2Fe(III) + H2O → HCO3- + 2Fe(II) + 2H+
Cependant cette bactérie oxyde de façon incomplète le lactate et le pyruvate tout en réduisant
le Fe(III) :
Lactate- + 4Fe(III) + 2H2O → acetate- + HCO3- + 4Fe(II) + 5H+
Pyruvate- + 2Fe(III) + 2H2O → acetate- + HCO3- + 2Fe(II) + 3H+
Outre les acides organiques, les composés aromatiques sont également oxydés par les
bactéries (Lovley, 1991). Ceci d’autant plus que ces molécules composent majoritairement la
matière organique naturelle, notamment dans les sédiments et contribuent à la pollution
anthropique (cas du toluène et du phénol).
Certaines bactéries sont donc capables d’oxyder ces composés aromatiques en réduisant le
Fe(III). Ainsi la bactérie GS-15 peut complètement oxyder le benzoate, le toluène, le phénol
et le p-crésol en dioxyde de carbone en réduisant simultanément le Fe(III) (Lovley et
Lonergan, 1990). Ce type de bactéries pourrait donc être utilisé pour la dépollution de
composés organiques en milieu anaérobie, par exemple.
III.2.3. Réduction du fer et oxydation du soufre
La réduction du fer par les bactéries utilisant le soufre élémentaire comme donneur d’électron
a été décrite par Brock et Gustafson (1976) chez les bactéries Thiobacillus thiooxidans,
Thiobacillus ferrooxidans et Sulfolobus acidocaldarius selon la réaction :
Partie 1: Synthèse bibliographique
68
S° + 6Fe(III) + 4H2O → HSO4- + 6Fe(II) + 7H+
Seule T. ferrooxidans peut tirer son énergie de cette oxydation du sulfure avec réduction du
Fe(III). Ces bactéries sont rencontrées en milieu aérobie mais ne nécessitent pas la présence
de matières organiques puisque ce sont des bactéries chimiolithotrophes.
III.2.4. Réduction du fer et oxydation de l’hydrogène
Les microorganismes vivant dans les sédiments peuvent coupler l’oxydation de l’hydrogène à
la réduction du fer. Par exemple, des souches du genre Pseudomonas (Balashova et Zavarzin,
1980) et de l’espèce Shewanella putrefaciens (Lovley et Phillips, 1989) sont capables
d’oxyder l’hydrogène avec le fer(III) comme unique accepteur d’électrons selon la réaction :
H2 + 2Fe(III) → 2H+ + 2Fe(II)
En milieu acide, Acidophilum cryptum utilise l’hydrogène pour réduire les oxydes de Fe(III)
amorphes contenus dans les sédiments lacustres (pH 3,2).
III.2.5. Importance du contact entre bactéries et oxydes de fer lors de la
réduction
Les oxydes de fer étant pratiquement insolubles dans l’eau à pH neutre, un contact direct entre
bactéries et oxydes de fer est nécessaire. Des études ont montré que la réduction des oxydes
de fer par les produits du métabolisme des bactéries ferri-réductrices était quasiment nulle.
Les produits exocellulaires ne contribuent donc pas à la réduction des oxydes de fer de façon
significative (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992).
Cependant dans certaines conditions, notamment lorsque les oxydes de fer sont peu
accessibles et en milieu aérobie, la réduction du Fe(III) peut s’effectuer après complexation
avec les acides humiques et les sidérophores (Lovley et al., 1998, Hersman et al, 1995).
Les acides humiques jouent le rôle d’intermédiaires lors des transferts d’électrons entre les
mécanismes réducteurs de Fe(III) et les oxydes de Fe(III) insolubles (Lovley et al., 1998). Le
relargage du Fe(III) par les acides humiques est un mécanisme abiotique (figure 10).
Partie 1: Synthèse bibliographique
69
e -
Fe(III)
Acétate
CO2
Fe2+
Acides humiquesoxydés
Acides humiquesréduits
Bactérie
e -
Fe(III)
Acétate
CO2
Fe2+
Acides humiquesoxydés
Acides humiquesréduits
Bactérie
Figure 10 : Réduction du Fe(III) via les acides humiques
Les sidérophores ont un rôle différent. Produits en condition nutritionnelle déficitaire en fer,
ce sont des molécules de faibles poids moléculaires utilisées comme chélatants du Fe et
sécrétées par les bactéries et les champignons lorsque la cinétique de dissolution du fer est
lente, notamment en milieu neutre ou basique et aérobie. Environ 500 sidérophores sont
connus. Les ligands sont hexadentates mais aussi tridentates. La stabilité du complexe Fe-
sidérophore est exceptionnelle avec une constante de stabilité supérieure à 1030 (Hersman et
al., 1995; Neilands, 1995; Kalinowski et al., 2000; Boukhalfa et Crumbliss, 2002; Kraemer,
2004)
Après production et relargage du sidérophore par les bactéries, celui-ci se lie à l’oxyde de
Fe(III) pour former un complexe sidérophore-Fe(III) qui diffuse ensuite à travers la
membrane bactérienne (figure 11).
Partie 1: Synthèse bibliographique
70
OO
OO
OOORelargage du
sidérophore
BactérieEx : Pseudomonas
Oxyde de Fe(III)
Reconnaissance du Fe(III)
par le sidérophore
Fe
O
OO
O
OO
Formation du complexesidérophore-Fe
Diffusion du complexeà travers la membrane cellulaire
En milieu aérobie
OO
OO
OOORelargage du
sidérophore
OO
OO
OOO
OO
OO
OOORelargage du
sidérophore
BactérieEx : Pseudomonas
Oxyde de Fe(III)
Reconnaissance du Fe(III)
par le sidérophore
Fe
O
OO
O
OO
Formation du complexesidérophore-FeFe
O
OO
O
OOFe
O
OO
O
OO
Formation du complexesidérophore-Fe
Diffusion du complexeà travers la membrane cellulaire
Diffusion du complexeà travers la membrane cellulaire
En milieu aérobie
Figure 11 : Mécanisme de réduction des oxydes de Fe(III) via les sidérophores
Lorsque le complexe Fe(III)-sidérophore se trouve à l’intérieur de la bactérie, le fer est réduit
en Fe(II)-sidérophore puis il y a séparation du Fe2+ et du sidérophore. Ce dernier est soit
détruit soit recyclé et est expulsé hors de la cellule.
III.2.6. Facteurs influençant la réduction des oxydes de Fe(III)
L’importance de la réduction enzymatique des oxydes de fer (III) dépend de nombreux
paramètres intrinsèques aux oxydes de fer.
III.2.6.1. Le type et la surface des oxydes de Fe(III)
Les oxydes amorphes ou faiblement cristallisés sont plus facilement réductibles (Hansel et al.,
2004). Ainsi le rendement de réduction du Fe(III) par Shewanella putrefaciens est de 25%
pour la ferrihydrite, 4,6% pour la goethite et 1,4 % pour l’hématite. Ceci tient au fait que les
formes amorphes sont thermodynamiquement moins stables que les formes cristallisées.
Par ailleurs, plus la surface de l’oxyde est importante et plus la réduction du Fe(III) le sera
également (Bousserrhine, 1995; Roden et Zachara, 1996; Dominik et al., 2002). Les
pourcentages de réduction du Fe(III) par Shewanella alga en fonction de la surface de la
goethite sont présentés dans le tableau 11.
Partie 1: Synthèse bibliographique
71
Tableau 11 : Pourcentage de fer réduit par les bactéries ferri-réductrices en fonction de la surface de
goethite (d’après Roden et Zachara (1996))
Surface (m2.g-1) Pourcentage de Fe(III) réduit 153,3 12,6±0,3 55,2 2,7±0,1 31 1,5±0,2
III.2.6.2. Les paramètres physico-chimiques
La présence d’oxygène est un facteur inhibiteur de la réduction de la goethite ainsi que l’a
montré (Bousserrhine, 1995) lors de ses études portant sur les paramètres influençant la
réduction des oxydes de fer par Clostridium butyricum.
La température est également un facteur important car la réduction des oxydes de Fe(III) ne
sera optimale que dans une gamme de température donnée (Jones et al., 1984). Ceci est dû au
fait que la température accélère le métabolisme carboné et donc la vitesse de production des
électrons utilisés pour la réduction. Par exemple, l’oxydation du malate avec réduction du
Fe(III) (1 mmol.l-1) par Vibrio ne sera optimale qu’entre 10-15 °C et 35 °C (figure 12).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
10 15 20 25 30 35 40
Température (°C)
Fe2+
(µm
ol.L
-1)
Figure 12 : Concentration de Fe réduit par Vibrio en fonction de la température (d’après Jones et al, 1984)
La nature du substrat carboné joue un rôle non négligeable sur le rendement de la réduction
des oxydes de Fe(III). Vibrio est capable de réduire le Fe(III) en utilisant du malate et du
glucose mais n’utilisera pas le lactate (Jones et al., 1984). De même, le rendement de
réduction des oxydes de Fe(III) par A. cryptum sera de 93 % avec de l’hydrogène comme
donneur d’électrons et seulement de 21 % avec de la cellobiose (Bousserrhine, 1995). Par
ailleurs, A. cryptum n’oxydera pas le lactate, le formate, le pyruvate, l’acétate ou le benzoate
pour réduire le Fe(III).
Partie 1: Synthèse bibliographique
72
Enfin, selon la composition du milieu de culture, la réduction dissimilatrice sera différente. La
réduction de la goethite par C. butyricum sera deux fois plus faible dans un milieu riche en
nutriments que dans un milieu eau distillée + glucose à cause de la présence du carbonate de
calcium qui tamponne le milieu (Bousserrhine, 1995). Cette modification du pH modifie le
métabolisme carboné et par conséquent, la production d’électrons produits.
III.2.6.3. La présence de métaux substitués
Dans le milieu naturel, les oxydes de Fe sont associés à d’autres éléments traces métalliques.
Ces ETM exercent une influence sur le rendement de réduction des oxydes de Fe(III)
adsorbés ou en substitution.
Ainsi, plus une goethite sera substituée en aluminium et plus le rendement de réduction sera
faible (Dominik et al., 2002). En effet, l’aluminium bloque l’accès aux sites, en précipitant à
la surface des oxydes de fer. Or, ces sites sont nécessaires à Clostridium butyricum pour
réduire le Fe(III) en Fe (II) (tableau 12). Tableau 12 : Pourcentage de réduction du Fe(III) en fonction du pourcentage de substitution de l’Al sur
une goethite par Clostridium butyricum (Dominik et al, 2002)
Pourcentage de substitution Pourcentage de réduction du Fe(III) 0 >90 5 45 33 15
D’autres auteurs ont montré qu’un hydroxyde de Fe présentant des substitutions en Ni
conduira à une inhibition de la réduction du Fe(III) par Shewanella putrefaciens par un
mécanisme chimique non défini (Fredrickson et al., 2001; Zachara et al., 2001).
Dans le même cadre, des études menées par Bousserrhine et al ont montré que la nature de
l’élément en substitution influençait le rendement de la réductibilité bactérienne des oxydes
de fer (Bousserrhine, 1995; Bousserrhine et al., 1999a, 1999b) (tableau 13).
Tableau 13 : Pourcentage de fer et d’ETM solubilisé par Clostridium butyricum en fonction de l’ETM de
substitution sur une goethite (Bousserrhine et al, 1999a)
ETM substitué (5%) Pourcentage de fer solubilisé Pourcentage d’ETM solubilisé Co > 90 Mn > 90 Cr 60 8 Al 36 18
Partie 1: Synthèse bibliographique
73
III.2.7. Conséquences de la réduction des oxydes de Fe sur la mobilité
des ETM dans les sols
Dans la nature, de nombreux ETM sont adsorbés ou substitués dans les oxydes de fer. La
réduction des oxydes de fer par les microorganismes peut donc conduire à un relargage des
ETM adsorbés dans l’eau interstitielle des sédiments et des sols en milieu anaérobie (Lovley
et Coates, 1997; Ponthieu et al., 2006). Cette désorption entraîne donc un risque potentiel
pour l’écosystème aquatique. Ainsi que nous venons de le voir précédemment, des ETM
coprécipités sur une goethite artificielle ont été désorbés lors de la réduction du Fe(III) par
Clostridium sp. (Francis et Dodge, 1990; Bousserrhine et al., 1999a, 1999b). Dans des sols en
milieu anaérobie, la réduction de goethite riche en Ni en Co par Shewanella putrefaciens
provoque la dissolution de ces ETM (Zachara et al., 2001). Dans des sols ferralitiques
hydromorphes, l’activité des bactéries ferri-réductrices autochtones a entraîné la mobilité du
cobalt et du cuivre (Quantin et al., 2001).
Bien que les microorganismes soient à l’origine de la mobilisation des ETM dans les sols,
d’autres microorganismes pourront entraîner leur immobilisation dans certaines conditions
physico-chimiques. C’est pourquoi il est nécessaire de s’intéresser à ces phénomènes dans
cette revue bibliographique car de telles conditions physico-chimiques peuvent se manifester
dans les sédiments et permettre de comprendre la mobilité et la redistribution des ETM. Par
ailleurs, l’immobilisation des ETM par les microorganismes peut constituer un bon outil de
dépollution des eaux de surface et souterraine.
III.3. Immobilisation des éléments traces métalliques par les
microorganismes
Les microorganismes peuvent être à l’origine d’une immobilisation des ETM par des
mécanismes de biosorption et par la réduction des sulfures.
III.3.1. La biosorption
La biosorption est la rétention des éléments métalliques organiques et inorganiques solubles
ou insolubles à la surface des cellules bactériennes par des mécanismes physico-chimiques
tels que l’adsorption (Gadd, 2001). La biosorption peut conduire à la formation de minéraux
stables par nucléation ou à une accumulation à l’intérieur des microorganismes par divers
systèmes de transports internes (assimilation active).
Partie 1: Synthèse bibliographique
74
III.3.1.1. Adsorption à la surface des cellules microbiennes
L’accumulation passive ou adsorption des métaux traces à la surface des cellules bactériennes
dépend des propriétés de surface des cellules telles que les charges électriques et l’orientation
des groupes fonctionnels liant le métal ainsi que de la spéciation du métal en phase aqueuse
(Ledin, 2000). Les groupes fonctionnels ayant le plus de pouvoir ligand sont les groupes
carboxyliques, aminés et phosphorylés. L’accumulation dépend également de l’âge des
cellules et si celles-ci sont vivantes ou mortes. Ainsi, des cellules d’un jour de Thiotrix
accumulent beaucoup moins de Ni ou Zn que les mêmes cellules âgées de 2-5 jours
(Shuttleworth et Unz, 1993). La capacité de biosorption des cellules mortes peut être
supérieure, égale ou inférieure à celle de cellules vivantes (Ledin, 2000).
Par ailleurs, les paramètres physico-chimiques environnementaux ont une influence sur la
rétention des métaux traces par les cellules bactériennes. Ainsi, lorsque le pH du milieu
augmente, les sites fonctionnels à la surface des cellules se déprotonent ce qui rend possible
leur liaison avec les cations métalliques. A des pH plus élevés, les métaux ont tendance à se
désorber car les microorganismes produisent des métabolites solubles qui pourront se lier aux
métaux et ainsi entrer en concurrence avec les sites fonctionnels de surface cellulaire. De plus,
à pH élevé, des complexes métalliques anioniques ou neutres se forment et par conséquent ont
moins d’affinité pour les sites de surface que les cations libres (Ledin, 2000). L’influence des
conditions d’oxydo-réduction sur la rétention des métaux traces à la surface des bactéries a été
très peu étudiée. Cependant, il a été montré que l’état d’oxydation du Fe influence de façon
significative sa tendance à se lier aux polymères bactériens anioniques tels que les capsules
(McLean et al., 1992).
III.3.1.2. Formation de minéraux
Les sites d’adsorption des métaux traces à la surface de la paroi cellulaire bactérienne peuvent
servir de site de nucléation pour la formation de minéraux. Ainsi, chez Bacillus subtilis, le
développement de phases minérales silicates a été observé à la surface de la bactérie et a servi
d’interface pour la sorption des métaux (Beveridge et Murray, 1980). Des minéraux de fer
peuvent également être formés par les microorganismes (Konhauser et al., 1993). Les liaisons
Fe-bactéries servent en effet de sites de nucléation pour la formation et la croissance de
phases minérales présentant un large spectre de morphologie allant de structures amorphes
telles que des gels aux structures cristallisées en fonction du degré d’hydratation. Les métaux
liés aux oxyhydroxydes et silicates formés sur les parois bactériennes sont très difficiles à
Partie 1: Synthèse bibliographique
75
désorber et résistent aux attaques à l’EDTA et autres ligands organiques (Urrutia et Beveridge,
1993, 1995)
III.3.2. Précipitation par réduction du soufre et des composés soufrés
oxydés
Nous avons vu précédemment qu’en milieu anaérobie, les bactéries ferri-réductrices étaient à
l’origine de la réduction des oxydes de fer. Le fer(II) solubilisé peut repréciter en raison de
l’activité des bactéries sulfato-réductrices présentes dans le milieu.
III.3.2.1. Bactéries sulfato-réductrices
La réduction du soufre et des composés soufrés oxydés fait intervenir des bactéries anaérobies
sulfato-réductrices (figure 13).
La réduction des sulfates et autres formes oxydées du soufre peut s’effectuer de deux
manières :
- la réduction assimilatrice qui produit des ions sulfures, nécessaires aux synthèses
cellulaires et
- la réduction dissimilatrice dans laquelle le composé soufré oxydé sert uniquement
d’accepteur terminal d’électron dans la production d’ATP en anaérobiose. Le sulfure
d’hydrogène dégagé correspond au produit terminal de la respiration des sulfates.
Bactéries réductrices du
soufre :
DesulforomonasDesulfovibrioPyrodictiumArchaebacteria…
SO42- SO3
2-
SO2, HSO3-
S° S2O32-
HS-, S2-
Bactéries sulfato-réductrices
DesulfovibrioDesulfobulbusDesulfobacterDesulfococcusDesulfosarcinaDesulfonema
DesulfoarculusDesulfotomaculumArchaebacteria…
Enzyme : sulfite réductase
dissimilatrice
Bactéries réductrices du
soufre :
DesulforomonasDesulfovibrioPyrodictiumArchaebacteria…
SO42- SO3
2-
SO2, HSO3-
S° S2O32-
HS-, S2-
Bactéries sulfato-réductrices
DesulfovibrioDesulfobulbusDesulfobacterDesulfococcusDesulfosarcinaDesulfonema
DesulfoarculusDesulfotomaculumArchaebacteria…
Enzyme : sulfite réductase
dissimilatrice
Figure 13 : Populations bactériennes impliquées dans la réduction du soufre et ses formes oxydées
(d’après Boust et al, 1999)
Partie 1: Synthèse bibliographique
76
III.3.2.2. Conséquence sur l’immobilisation des ETM
Les sulfures produits sont connus pour être des phases d’adsorption pour les ETM (Boust et
al., 1999). Les sulfures de fer apparaissent lorsque leur produit de solubilité est atteint c’est-à-
dire lorsque les concentrations en sulfures dissous (HS-) issus de l’activité des bactéries
sulfato-réductrices et celles en fer dissous ne sont plus compatibles avec le maintien de ces
espèces à l’état dissous. Le fer réduit en solution provient de la réduction des oxydes de fer
par les bactéries ferri-réductrices.
Le monosulfure de fer (FeS ou greigite) précipite sous forme d’enduits mal cristallisés et très
dispersés qui peuvent ensuite évolués vers des formes plus résistantes et mieux cristallisées de
type pyrite (FeS2). Les sulfures ainsi formés peuvent conduire à l’apparition de sulfures
polymétalliques par substitution des sulfures de métaux moins solubles que le sulfure hôte. Le
cadmium peut ainsi s’échanger avec le fer déjà précipité sous forme de sulfures :
FeS(s) → Fe2+ + S2-
Cd2+ + FeS(s) → Cd2+ + Fe2+ + S2-
Cd2+ + FeS(s) → CdS(s) + Fe2+
De la même façon, le cuivre dont le sulfure est plus insoluble que celui du cadmium peut par
substitution conduire à l’apparition de sulfure de cuivre :
Cu2+ + CdS(s) → CuS(s) + Cd2+
Il a été montré en laboratoire (Boust et al., 1999) qu’après trois jours d’incubation de
sédiments en milieu anoxique, de fortes proportions de cobalt, zinc, cadmium, manganèse et
antimoine étaient associés aux sulfures.
IV. Méthodes d’évaluation de la biodisponibilité, mobilité, et
spéciation des ETM dans les sédiments
Afin d’évaluer le devenir des ETM dans les sols et sédiments, diverses méthodes d’extraction
chimique ont été mises en place. L’extraction chimique est la mise en solution aqueuse d’une
fraction d’un ou de plusieurs éléments présents dans la phase solide du sol. Deux types de
méthodes sont utilisés : l’extraction simple et l’extraction séquentielle (Lebourg et al., 1996).
Les méthodes d’extraction permettent de déterminer l’extractibilité, la biodisponibilité, la
mobilité et la spéciation des ETM. L’extractibilité est la capacité des ETM à passer en
Partie 1: Synthèse bibliographique
77
solution et dépend de la solution extractante (nature et concentration), des conditions
opératoires (rapport sol/solution, durée et mode d’agitation,…) mais aussi de la matrice
étudiée et de l’état de l’élément dans le sol (Lebourg et al., 1996). Dans le cas des sols, la
biodisponibilité est la potentialité d’un ETM à être absorbé par une plante. La mobilité est
définie par la capacité d’un élément à migrer d’un point à un autre, à passer d’une forme
chimique à une autre ou à changer de phase (passage de la phase solide à la phase liquide)
(Juste, 1988). Ainsi, on distingue une fraction dite mobile (à court terme) et une seconde
fraction dite mobilisable (à long terme). La spéciation est la caractérisation de la répartition
d’un élément dans les différents compartiments du sol ou de l’état chimique dans lequel il se
trouve dans ces différents compartiments (ionique, complexé…).
IV.1. Les extractions simples
Quatre types de solution d’extraction sont utilisés pour les extractions simples : les acides
dilués, les complexants organiques, les solutions salines et l’eau déionisée (Beckett, 1989).
Les quantités totales d’ETM sont estimées en utilisant des acides forts concentrés.
L’évaluation de la fraction disponible peut être réalisée à l’aide d’acides dilués comme l’acide
acétique (0,1 mol.l-1), chlorhydrique (0,1 mol.l-1) ou un mélange d’acides. Cependant,
l’utilisation des acides dilués est trop agressive et peu discriminante vis-à-vis des différentes
formes sous lesquelles se trouvent les ETM. Les complexants organiques sont utilisés pour
quantifier les ETM échangeables, ceux complexés par la matière organique ainsi que ceux
fixés sur les hydroxydes du sol (hydroxydes de Fe, de Mn et d’Al). L’EDTA (Acide éthylène
diaminotétraacétique) et le DTPA (acide diéthylène triaminepentaacétique) sont les réactifs
les plus utilisés pour évaluer la biodisponibilité du Cd, Zn, Ni, Cu et Pb (Shuman, 1988). Le
DTPA possède un pouvoir d’extraction plus faible que celui de l’EDTA mais plus fort que
celui des solutions salines.
L’eau déionisée a été utilisée pour simuler la mobilité des ETM dans les conditions naturelles
par l’eau du sol. L’extraction du Cd, Cu, Zn, Pb et Ni par l’eau déionisée est sensée donner
une bonne évaluation des risques de transfert de ces ETM dans les sols pollués (Lebourg et al.,
1996). Cependant cette technique présente de nombreux problèmes analytiques tels que de
faibles concentrations dissoutes, ce qui nécessite le recours à des appareils de mesures ayant
de très faibles limites de détection. De plus, l’extraction à l’eau ne permet pas une bonne
floculation de la suspension, ce qui perturbe le dosage. L’extraction à l’eau est donc plus
adaptée dans le cas de matrices fortement polluées. Les extractions par des solutions salines
Partie 1: Synthèse bibliographique
78
regroupent les solutions de sels divers : CaCl2, NaNO3, NH4NO3, etc. La concentration de ces
sels varie généralement de 0,01 à 1 mol.l-1. La solubilisation se fait essentiellement par
échange cationique. Cependant, les effets d’une contamination en Pb, Cr et Ni sont rarement
évalués avec les solutions salines. La variabilité des conditions expérimentales ne permet pas
de définir clairement les domaines d’application des trois réactifs les plus couramment utilisés
et cités précédemment.
De plus, tous ces tests sont réalisés sur des durées très courtes avec une très petite quantité
d’échantillons. Il est donc difficile d’extrapoler les résultats sur des durées très longues.
IV.2. Les extractions séquentielles
Les méthodes d’extraction séquentielle ont été développées afin de déterminer la répartition
géochimique des ETM dans les sols et les sédiments en fonction des propriétés oxydantes,
réductrices, acido-solubles et échangeables des différentes phases. Les différentes fractions
sur lesquelles se trouvent les ETM, leurs mécanismes d’immobilisation dans les différents
minéraux du sédiment ainsi que les facteurs entraînant leur relargage sont résumés dans le
tableau 14 (d’après Pickering, 1986). Tableau 14 : Facteurs à l’origine de la mobilité des métaux traces dans les différents minéraux du
sédiment (d’après Pickering, 1986)
Phase des sédiments fixant les ETM
Mécanismes d’immobilisation Facteurs de relargage
Minéraux primaires Réseau cristallin - Métaux liés en position inerte
Destruction complète du réseau
Carbonates Physiquement sorbés Coprécipitation
Diminution du pH Modification de la pression de CO2
Matières organiques (substances humiques, résidus organiques)
Physiquement sorbés, complexes métalliques, chimiquement sorbés (échanges de H+ dans les groupements –COOH, -OH)
Dépend du pH Destruction du groupe organique
Hydroxydes et oxydes de Fe et Mn
Hydroxydes de métaux co-précipités Sorption physique Sorption chimique (échange d’H+)
Dissolution partielle dans l’acide ; Réduction du fer et du manganèse Photochimie
Sulfures Co-précipitation Oxydation du soufre Acides fulviques et organiques Sels métalliques solubles Variation de pH
Destruction de la matière organique
C’est pourquoi ces méthodes sont basées sur l’utilisation successive de réactifs ayant des
propriétés chimiques différentes afin de dissoudre successivement les diverses phases
minérales et organiques du sédiment et de libérer les ETM associés. Différentes fractions ont
ainsi été définies en fonction de leurs propriétés physico-chimiques : échangeable, acido-
soluble, réductible, oxydable et résiduelle.
Partie 1: Synthèse bibliographique
79
La fraction échangeable représente l’ensemble des ETM facilement désorbés par un sel neutre
entraînant une modification de la composition du milieu. Les sels fréquemment employés sont
l’acétate d’ammonium, de sodium et le chlorure de magnésium. En général, la fraction
échangeable est faible dans les sols et les sédiments. La fraction acido-soluble correspond aux
ETM liés aux carbonates et est donc sensible aux variations de pH. L’accès aux ETM liés à
cette fraction est réalisé en utilisant un tampon acétate d’ammonium/acide acétique à pH 5.
La fraction réductible correspond aux ETM liés aux oxydes de fer et de manganèse,
thermodynamiquement instables en conditions réductrices. Ces oxydes peuvent être détruits
en partie en modifiant les conditions de pH et de potentiel d’oxydo-réduction du milieu. Ainsi
le réactif le plus couramment employé est le chlorhydrate d’hydroxylamine en milieu acide
(NH2OH, HCl). La fraction oxydable représente les ETM liés aux matières organiques
(micro-organismes vivants, matières organiques dégradées…) et sulfures. Le peroxyde
d’hydrogène (H2O2), oxydant très fort, est généralement utilisé pour quantifier les ETM liés à
cette fraction. Enfin la fraction résiduelle inclut tous les ETM ayant résisté aux étapes
d’extraction précédente. Elle est constituée des ETM piégés dans la matrice cristalline
argileuse et dans les minéraux à réseau cristallin stable. Par conséquent, les ETM se trouvant
dans cette fraction ont une faible réactivité et sont difficilement relargués dans les conditions
rencontrées dans le milieu naturel. En général, les ETM de la fraction résiduelle sont
quantifiés par fusion alcaline ou à l’aide d’un mélange d’acides forts, tels que l’acide
fluorhydrique, nitrique et chlorhydrique.
Les différents schémas d’extraction séquentielle généralement utilisés dans la littérature sont
présentés dans le tableau 15.
Partie 1: Synthèse bibliographique
80
Tableau 15 : Procédures d’extraction séquentielle généralement employées dans la littérature
(Tessier et al., 1979) (Kersten et Förstner, 1986) (Hirner et al., 1990) B K O Q XY
Echangeable Carbonates Oxydes de Fe/Mn Organique Résiduelle
D K M V Q Z
Echangeable Carbonates Oxydes de Mn Oxydes de Fe amorphes Sulfures + organiques Résiduelle
A D G H L X LYZ
Solubles à l’eau Echangeables Organique (échangeable avec solvants) Organique (acides humiques et fulviques) Minérale facilement soluble Minérale difficilement soluble Organique insoluble
(Sposito et al., 1982) (Shuman et Hargrove, 1985) (Zeien et Brümmer, 1989) E I R Z
Echangeable Composés sorbés Organique Carbonates et sulfures
F J N T U LXZ
Echangeable Organique Oxydes de Mn Oxydes de Fe amorphes Oxydes de Fe cristallisés Résiduelle
C D N S T U XYZ
Echangeable et facilement soluble Carbonates Oxydes de Mn Organique Oxydes de Fe amorphes Oxydes de Fe cristallisés Résiduelle
(Ure et al, 1993) – Méthode BCR P M Q (sans HNO3)
Echangeable/Carbonates Oxyhydroxydes de Fe/Mn Sulfures+organiques
A : eau, B : MgCl2, C : NH4NO3, D : NH4OAc, E : KNO3, F: Mg(NO3)2, G : benzène/méthanol, H: benzène/méthanol/KOH, I : NaOH, J : NaOCl, K : NaOAc/HOAc, L : HCl, M : NH2OH. HCl/ HNO3, N: NH2OH.HCl+NH4OAc, O : NH2OH.HCl/HOAc, Q : H2O2/HNO3/NH4OAc R : EDTA, S : NH4-EDTA, T: (NH4)2C2O4, U: acide ascorbique/tampon oxalate, V: tampon oxalate, X : HF, Y : HClO4, Z : HNO3, P : CH3COOH
La diversité des méthodes d’extraction séquentielle tant au niveau de la définition des
différentes fractions que de la nature des réactifs employés reflète la complexité de la
répartition des ETM dans les sols et sédiments et montre également que ces différentes
méthodes ont toujours été source de controverses. En effet, de nombreux reproches ont été
faits à l’encontre de ces méthodes notamment au niveau de leur sélectivité et des phénomènes
de réadsorption des ions métalliques sur le sédiment au fur et à mesure des étapes d’extraction
(Pickering, 1986; Hirner, 1992; Xiao-Quan et Bin, 1993; Bermond, 2001; Billon et al., 2001;
Li et al., 2001). De plus, les résultats obtenus entre les différentes méthodes utilisées sont
difficilement comparables. C’est pourquoi une méthode d’harmonisation au niveau européen
(méthode BCR) a été proposée pour permettre de réaliser des comparaisons dans la
distribution des ETM entre les sédiments et sols étudiés (Ure et al., 1993). Cette méthode
d’extraction ne comporte que 3 étapes caractérisant les ETM liés aux fractions
échangeable/acido-soluble, réductible et oxydable. Cependant cette méthode d’extraction a
également été améliorée et modifiée à de nombreuses reprises car elle présente également des
problèmes de reproductibilité et de réadsorption (Quevauviller et al., 1993; Mossop et
Davidson, 2003; Fernández et al., 2004; Bacon et al., 2005; Ciceri et al., 2008).
Partie 1: Synthèse bibliographique
81
Quelques exemples de résultats obtenus par extraction séquentielle réalisée avec la méthode
classique de Tessier (1979) sont présentés dans le tableau 16. Les sédiments étudiés
proviennent de rivières du Canada, de Turquie, d’Inde et de Lettonie. Tableau 16 : Exemple de répartition des ETM et éléments majeurs dans différents de sédiments (%) par
la méthode d’extraction séquentielle de Tessier
Echangeable Carbonatée Réductible Oxydable Résiduelle Cu 1-5 11-21 6-40 10-31 25-44 Cd 5-40 18-30 5-22 3-28 20-27 Pb 1-40 5-15 10-30 2-23 42-43 Zn 0-5 10-13 25-30 4-20 45-57 Co 1-7 2-12 13-42 21-29 21-45 Cr 1 1 53 18 25 Fe <1 0.05-2 12-23 2-20 56-83 Mn 0.5-13 12-13 14-52 1-5 28-57 Ni 1-4 4-12 11-30 5-30 41-64
D’après Tessier et al., 1979; Klavins et al., 2000; Akcay et al., 2003; Jain, 2004
De plus, l’échantillonnage, le stockage et la préparation des sédiments avant l’extraction
séquentielle requièrent de nombreuses précautions. En effet, le broyage et le séchage peuvent
modifier la répartition des ETM sur les différentes phases porteuses, en particulier pour les
échantillons en anaérobie (Herr et Gray, 1997; Stephens et al., 2001). Par exemple, le passage
en milieu aérobie lors du prélèvement peut entraîner une oxydation des sulfures en sulfates,
sous-estimant la fraction oxydable.
Une étude a comparé différentes méthodes de stockage de sols couramment utilisées :
humidification, séchage puis ré-humidification, conservation au frais (4°C pendant 15 jours)
et congélation (-20°C pendant 15 jours) (Perez et al., 2004). Les résultats ont montré une
modification importante de la répartition des ETM, en particulier lorsque les échantillons de
sol sont séchés puis réhumidifiés. Seuls les échantillons gardés au frais à 4°C pendant 15 jours
ont donné des résultats similaires à ceux obtenus immédiatement après prélèvement.
Une des méthodes employées lorsque des études de spéciation sont réalisées sur des carottes
de sédiment est la congélation. Or, l’analyse des ETM par extraction séquentielle de carottes
de sédiments congelées a montré que ce type de stockage ne préservait pas la répartition des
métaux dans les différentes phases du sédiment (Hjorth, 2004). Les zones anaérobies sont les
plus sensibles à la congélation, en particulier les métaux liés aux sulfures. De plus, le fer
associé aux carbonates montre une certaine tendance à s’oxyder durant le processus de
congélation. Afin de contrer l’effet de l’oxygène sur la modification de la répartition des ETM
dans les sédiments anoxiques lors de leurs prélèvements, une méthode de prélèvement inerte a
été proposée (Einax et Nischwitz, 2001). Elle consiste à transférer immédiatement les
Partie 1: Synthèse bibliographique
82
sédiments dans un récipient contenant de l’argon. Cette méthode semble efficace et montre
que les conditions anoxiques doivent être préservées pour éviter de modifier la répartition du
Cd, Zn, Pb, Mn et Fe mais qu’elle ne semble pas utile pour le Co, Ni, Cu et Cr car ces
éléments sont généralement situés sur des phases non sensibles à l’oxygène.
Après avoir rappelé l’origine des ETM dans les hydrosystèmes et en particulier dans le bassin
de la Seine, nous avons focalisé notre analyse sur les interactions liquide/solide qui contrôlent,
pour une large part, à la fois le transit des ETM dans l’hydrosystème et la biodisponibilité des
contaminants.
Au sein des sédiments, différentes fractions sont potentiellement actives, car susceptibles de
transformations majeures au cours des processus diagénétiques. Il s’agit des oxydes de fer et
de manganèse, des sulfures et de la matière organique. Les oxydes de fer et de manganèse
sont solubilisés en conditions réductrices et formés en conditions oxydantes, alors que les
sulfures sont solubilisés en conditions oxydantes et formés en conditions réductrices. La
matière organique est la source d’énergie pour la réduction dans les processus diagénétiques.
De nombreux auteurs se sont ainsi intéressés à la mise au point de méthodes d’extractions
chimiques destinées à évaluer les quantités d’ETM associées à ces différentes fractions.
Cependant, aucune méthode n’est spécifique d’une fraction. Les différentes combinaisons
d’extractants mettent en œuvre des mécanismes de solubilisation (échange d’ions,
acidification, réduction, oxydation,…) plus ou moins intenses. De plus, il est aussi difficile,
par exemple, de distinguer matières organiques et sulfures car ces deux fractions sont
solubilisées par voie oxydative alors que leurs devenirs sont complètement différents dans
l’environnement. Une des principales questions reste donc la représentativité
environnementale de ces méthodes. En effet, comme nous l’avons largement discuté dans
cette analyse bibliographique, les mécanismes de la mobilisation ou fixation des ETM sur
différentes fractions sont essentiellement d’origine microbiologique. Aussi la question
suivante demeure-elle relativement irrésolue : l’action des populations de microorganismes
réputées solubiliser telle ou telle fraction solubilise-t-elle effectivement d’une part, la fraction
telle que les méthodes d’extraction séquentielle l’identifie et d’autre part, solubilise-t-elle les
ETM associés ? Sur la base de cette question générale, nous nous intéresserons dans la suite à
la solubilisation des oxydes ferriques dans des sédiments du bassin de la Seine.
Partie 2 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
83
Partie 2 : Mobilité des éléments traces métalliques et activité
microbienne autochtone : importance des bactéries ferri-
réductrices
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
84
Chapitre 1 : Interactions éléments traces métalliques et activité
microbienne autochtone
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Introduction
85
I. Introduction
Les éléments traces métalliques sont répartis dans les sols et sédiments au sein des différentes
fractions minérales et organiques. Cette répartition dépend des conditions physico-chimiques
du milieu telles que les conditions d’oxydo-réduction et de pH. En fonction de ces conditions
environnementales, les ETM sont soit libérés soit immobilisés. Par exemple, une acidification
du milieu entraîne la dissolution des carbonates conduisant à une mobilité des ETM y étant
fixés. Dans des conditions réductrices, les sulfates transformés en sulfures s’associent aux
ETM pour former des sulfures métalliques qui précipitent.
Or, ces modifications des conditions d’oxydo-réduction et de pH sont principalement liées à
l’activité microbienne autochtone. Dans les sols, de nombreuses études ont montré qu’en
milieu anaérobie, les bactéries ferri-réductrices étaient à l’origine de la mobilisation des ETM
lors de la réduction dissimilatrice des oxydes de fer (phase porteuse d’ETM), qu’elles utilisent
comme accepteur terminal d’électrons dans leur métabolisme énergétique. En milieu aérobie,
des bactéries oxydant les sulfures sont à l’origine d’une très forte acidification du milieu
entraînant une mobilité importante des ETM.
Si la mobilité des ETM due à l’activité microbienne autochtone a été largement étudiée dans
les sols, peu d’études se sont intéressées aux interactions ETM-activité microbienne
autochtone dans les sédiments. Il est cependant essentiel de comprendre ces phénomènes de
relargage des ETM dans les sédiments qui peuvent avoir un impact environnemental
important notamment en termes de contamination métallique des nappes phréatiques et des
milieux aquatiques de surface. Cette connaissance est également indispensable pour la gestion
des sédiments. Dans le cas particulier de la gestion des sédiments de dragage, il est important
de connaître les conditions dans lesquelles les ETM seront susceptibles d’être relargués de
façon à stocker ces sédiments de manière raisonnée.
L’objectif de ce 1er chapitre est donc d’étudier par une approche générale la mobilité des ETM
dans des sédiments de Marne et de Seine et de mettre en relation cette mobilité avec l’activité
des microorganismes autochtones.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
86
II. Matériel et méthodes
II.1. Sites d’étude et description des lieux de prélèvement
Les sédiments étudiés sont issus de la Marne et de la Seine et plus précisément de Méry-sur-
Marne et d’Andrésy (figure 14). Les études de pollution en ETM dans le bassin versant
supérieur de la Seine ont montré une évolution marquée de l’impact anthropique de l’amont
vers l’aval (Meybeck et al., 2004). En amont de Paris, la pollution métallique est beaucoup
plus faible qu’en aval. L’augmentation en concentrations métalliques au fur et à mesure que la
Seine traverse Paris est due aux rejets urbains de temps de pluie dans la Seine et aux affluents
contaminés péri-urbains, aux rejets du réseau unitaire et industriels. En aval de Paris, les
indices de contamination sont beaucoup plus complexes, notamment autour de la confluence
avec l’Oise. Cette complexité provient d’un mélange de masses d’eau à la confluence mais
également des rejets de la station d’épuration de Seine-Aval (Achères). Par conséquent, on
peut s’attendre à avoir des teneurs en ETM plus fortes à Andrésy qu’à Méry-sur-Marne. Nous
avons donc choisi deux sédiments contaminés différemment en ETM de façon à vérifier si les
mécanismes de mobilité de métaux et les activités microbiennes étaient similaires ou non
selon le type de sédiments (très anthropisés à Andrésy et beaucoup moins à Méry).
Andrésy
Méry-sur-Marne
Andrésy
Méry-sur-Marne
Figure 14 : Carte du bassin versant de la Seine en amont et en aval de l’agglomération parisienne
Sur les deux sites, les prélèvements ont été effectués à l’amont du barrage-écluse comme
indiqué sur les figures 15 et 16.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
87
Site de prélèvementSite de prélèvement
(a)
Ecluse et barrage
Point de prélèvement
Ecluse et barrageEcluse et barrage
Point de prélèvementPoint de prélèvement
(b) Figure 15 : Carte du site de Méry-sur-Marne (a) et détails du lieu de prélèvement (b)
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
88
Stationd’épuration
Seine-Aval(Achères)
Site de prélèvement
Confluence de la Seineet de l’Oise
Stationd’épuration
Seine-Aval(Achères)
Site de prélèvement
Confluence de la Seineet de l’Oise
(a)
Point de prélèvement
Barrage
Ecluse
Point de prélèvement
Barrage
Ecluse
(b)
Figure 16 : Carte du site d’Andrésy (a) et détails du lieu de prélèvement (b)
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
89
II.2. Matériel utilisé et stockage des échantillons
Au cours des campagnes d’échantillonnage, réalisées en novembre 2005 et mai 2006, les
sédiments ont été prélevés à l’aide d’une benne Eckman. L’utilisation de ce type de benne
permet d’échantillonner presque tous les types de sédiments et de récolter les sédiments
jusqu’à 30 cm de profondeur. Par ailleurs, il assure une bonne protection contre le risque de
lessivage s’il n’est pas remonté trop rapidement. Cependant, ce type de benne peut perturber
l’intégrité du sédiment lors du prélèvement et une contamination possible en éléments
métalliques en fonction du matériau de la benne. C’est pourquoi nous avons choisi une benne
en acier inoxydable, minimisant les risques de corrosion.
Les sédiments collectés ont été conservés sous une couche d’eau du site dans des flacons en
plastique (préalablement rincés à l’acide nitrique ultrapur dilué (65%, Normapur)), afin de
préserver les conditions anaérobies, caractéristiques du sédiment.
Pour toutes les expériences d’incubation menées, les sédiments n’ont été ni séchés ni broyés.
En effet, le séchage et le broyage peuvent d’une part influer sur la population microbienne
autochtone et d’autre part modifier l’état d’oxydation et la spéciation des métaux présents ou
de leurs phases porteuses (Herr et Gray, 1997; Stephens et al., 2001). Cependant, comme nous
le verrons par la suite, ce choix technique a généré des problèmes d’hétérogénéité des sous-
échantillons.
II.2.1. Dispositif expérimental
Les incubations de sédiments ont été conduites en batch (figure 17). Il s’agit d’un système en
milieu clos dans lequel l’incubation débute avec une quantité connue de substrat que les
microorganismes vont utiliser en continu pour leur croissance. Des flacons sérum de 250 ml
contenant 150 ml de milieu de culture ont été stérilisés par autoclave. Les incubations
commencent lors de l’introduction de 20 g de sédiments humides. Les poids secs des
sédiments de Marne et de Seine ont été déterminés par ailleurs. Les sédiments de la Marne et
de la Seine contiennent respectivement en moyenne 50 % et 30 % d’humidité. Tous les
résultats analytiques ont été ramenés en masse sèche pour les calculs.
Le rapport masse de sédiments/volume de solution = 10 environ a été choisi car il s’agit du
rapport qui est utilisé dans les tests de lixiviation (Paschke et al., 1999; Cappuyns et al., 2004;
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
90
Cappuyns et Swennen, 2005) destinés à estimer la quantité de métaux biodisponibles dans les
sols et sédiments. Toutes les manipulations ont été réalisées sous hotte à flux laminaire afin de
ne pas contaminer en microorganismes les sédiments et les flacons.
Figure 17 : Incubation en batch des sédiments
Les conditions anaérobies ont été créées dans les cultures par un dégazage sous flux d’azote.
Les flacons ont ensuite été placés à l’obscurité dans une étuve à 28 ± 2°C pendant 10 jours au
minimum et 1 mois au maximum et sans agitation. Nous avons choisi de ne pas agiter les
flacons afin de récréer les conditions naturelles de l’interface eau-sédiment en milieu calme et
donc caractéristiques d’un milieu anaérobie. En effet, l’agitation en milieu naturel conduit à
une réoxygénation de l’interface eau-sédiment et par conséquent au passage d’un milieu
anaérobie à un milieu aérobie. Ceci entraîne donc des modifications très importantes aux
niveaux chimique et biologique comme la réoxydation des sulfures et donc une acidification
du milieu avec la formation d’acide sulfurique et le développement de bactéries aérobie
strictes (s et al., 1998; Brune et al., 2000; Caille et al., 2003; Eggleton et Thomas, 2004;
Shipley et al., 2004; Cappuyns et Swennen, 2005).
Afin, d’une part, de stimuler la croissance bactérienne pour accélérer les processus microbiens
et d’autre part, d’apprécier l’impact de l’intensité de l’activité microbienne sur les vitesses de
réaction de solubilisation des métaux, trois milieux de culture contenant des concentrations
croissantes en glucose ont été testés :
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
91
- milieu 1 : eau distillée + 0,15 g.l-1 de levure + 0,05 % de glucose
- milieu 2 : eau distillée + 0,15 g.l-1 de levure + 0,1 % de glucose
- milieu 3 : eau distillée + 0,15 g.l-1 de levure + 0,5 % de glucose
L’extrait de levure (Difco Laboratories) est utilisé comme source d’azote alors que le glucose
est une source de carbone.
Par ailleurs, les sédiments de la Marne et de la Seine ont été incubés et étudiés en triplicat
pour chaque milieu de culture. Chaque semaine, des triplicats de flacons ont été sacrifiés afin
de réaliser les analyses chimiques et biologiques sur les sédiments.
Afin de contrôler toute éventuelle contamination en ETM des microcosmes, des blancs ont été
réalisés dans les mêmes conditions mais sans ajout de sédiments.
II.2.2. Caractérisation physico-chimique des sédiments
Les sédiments ont été caractérisés avant incubation à l’INRA d’Arras (tableau 17) :
Tableau 17 : Paramètres physico-chimiques analysés pour la caractérisation des sédiments
Paramètres Méthode Physique Granulométrie NF X 31-107 Argile (< 2 µm) Limons fins (2/20 µm) Limons grossiers (20/50 µm) Sable fin (50/200 µm) Sable grossier (200/2000 µm) Chimique pH de l’eau NF ISO 10390 Carbone organique (g.kg-1) C/N Matière organique (g.kg-1)
NF ISO 10694 NF ISO 13878
Capacité d’échange cationique (cmol+.kg-1)
NF X 31-130
Pour l’analyse granulométrique, la détermination des fractions les plus fines (< 50 µm)
s'effectue au moyen de 3 prélèvements successifs (à la pipette dite de Robinson) dans une
suspension de sol en cours de sédimentation. La fraction des sables fins est séparée par
passage sur tamis de 50 µm et sous courant d'eau de la suspension après prélèvements des
fractions fines. Prélèvements et tamisage sont réalisés après destruction de la matière
organique par l'eau oxygénée (H2O2) sur une prise d'essai d'environ 10 g. La dispersion finale
est réalisée par un court passage aux ultrasons après addition de dispersant [(NaPO3)6 +
Na2CO3] et après avoir au préalable séparé les sables grossiers (> 0,200 mm) par tamisage.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
92
L’analyse du pH est réalisée après mise en suspension de l'échantillon du sédiment séché à
l'air dans l'eau dans un rapport 1/5 (v/v).
La méthode de l’analyse du carbone organique repose sur la transformation en dioxyde de
carbone de la totalité du carbone présent dans l'échantillon. La réaction s'effectue en portant
ce dernier à environ 1000°C en présence d'oxygène. Après séparation chromatographique, la
quantité de gaz carbonique formée est quantifiée au moyen d'un catharomètre (conductibilité
thermique). La teneur en azote (organique et minéral) de l'échantillon est déterminée en le
chauffant à environ 1000°C en présence d'oxygène. Les produits de combustion ou
décomposition sont réduits à l'état d'azote moléculaire (N2). Les quantités de N2 formées sont
quantifiées, après séparation chromatographique, au moyen d'un catharomètre.
Enfin, la CEC a été déterminée selon la méthode de Metson qui comprend trois étapes.
L'échantillon est d'abord saturé en ions ammonium (NH4+ ) par percolations successives d'une
solution d'acétate d'ammonium (CH3CO2NH4) à 1 mol.l-1. Le pouvoir tampon de cette
dernière permet de ramener le pH du milieu aux environs de 7, ce qui constitue une des
caractéristiques essentielles de la méthode. Après avoir éliminé l'excès d'ions ammonium par
percolations d'alcool éthylique, on procède ensuite à leur échange par une solution de chlorure
de sodium à 1 mol.l-1. Les ions ammonium déplacés sont dosés par spectrocolorimétrie sur la
solution précédente, une fois filtrée.
II.2.3. Suivi du métabolisme microbien
L’activité des microorganismes a été suivie pendant toute la durée des incubations.
Tout d’abord, la croissance bactérienne a été étudiée en dosant le CO2 produit et en
dénombrant les bactéries anaérobies au cours de l’incubation.
Parallèlement la consommation du glucose et la production d’acides organiques ont été
suivies afin de caractériser les processus fermentaires des microorganismes autochtones. Le
carbone organique dissous ainsi que la variation du pH ont également été analysés.
II.2.3.1. Activité globale et minéralisation du carbone
Le CO2 produit par les microorganismes anaérobies a été suivi régulièrement au cours de
l’incubation par prélèvement d’1 ml de l’atmosphère des microcosmes à l’aide de seringues
stériles (TERUMO) équipées d’aiguilles stériles à travers les septums hermétiques des flacons
sérum, préalablement nettoyés à l’éthanol pour éviter toute contamination. Les flacons n’ont
donc pas été ouverts. La teneur en CO2 a été déterminée par spectrométrie infra-rouge
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
93
(BERYL 100 COSMA). Les caractéristiques analytiques de l’appareil et des mesures ainsi
que la procédure d’étalonnage sont regroupées en annexe 1.
II.2.3.2. Evolution de la densité des microorganismes anaérobies
dans les microcosmes au cours de l’’incubation
Chaque semaine, des suspensions-mères de sédiments ont été préparées à partir de chaque
microcosme sacrifié (2g de sédiment humide dans un 10 ml d’eau physiologique (NaCl,
10 g.l-1) puis une série de dilution a été réalisée à partir de ces suspensions-mères. L’eau
physiologique est utilisée afin de ne pas créer un déséquilibre osmotique entre la
concentration en minéraux dans les cellules microbiennes et la solution de culture. Le
déséquilibre pourrait, en effet, créer une augmentation de la pression osmotique des cellules
microbiennes et les faire éclater. 1 ml de chaque dilution est ensemencé en profondeur dans
un milieu de culture coulé en boîte de Pétri. Le milieu de culture est un milieu PCA (Plate
Count Agar) contenant les composants suivants : hydrolysat pancréatique de caséine 5 g.l-1,
extrait de levure 2,5 g.l-1, glucose 1 g.l-1, agar 15 g.l-1. L’incubation des boîtes de Pétri est
réalisée à 30°C, en condition anaérobie. Pour réaliser l’anaérobiose, les boîtes de Pétri sont
placées dans une jarre avec un sachet GENbox anaer permettant d’obtenir une concentration
en O2 < 0,1% après 2,5 h et une concentration en CO2 > 16% après 24 h. Les colonies sont
dénombrées après 48 h puis 72 h puis le nombre de colonies est rapporté en unité CFU par
gramme de sédiments secs. Il est à noter que seul 1 % de la totalité des bactéries présentes
dans le milieu est cultivable.
II.2.3.3. Dosage du glucose
Le glucose a été dosé par réaction enzymatique (Kit D-Glucose, Roche) dont le principe est le
suivant :
En présence de l’enzyme hexokinase et d’ATP, le D-glucose est phosphorylé en D-glucose-6-
phosphate (G-6-P) avec formation simultanée d’ADP. En présence de l’enzyme glucose-6-
phosphate déshydrogénase (G-P-DH), le G-6-P est oxydé par le NADP en D-gluconate-6-
phosphate avec formation de NADPH.
La quantité de NADPH formée dans la réaction est proportionnelle à la quantité de D-glucose
présente dans l’échantillon. L’absorbance est mesurée en spectrophotométrie UV à une
longueur d’onde de 340 nm. Les caractéristiques analytiques de la mesure sont données en
annexe 2.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
94
II.2.3.4. Dosage des acides organiques
La recherche d’acides organiques produits par les microorganismes a été réalisée par
chromatographie liquide haute performance (HPLC) sur 1 ml de milieu de culture (les
échantillons sont conservés par congélation avant analyse). Ce dosage a pour objectif la mise
en évidence d’un métabolisme fermentaire souvent mis en place par les microorganismes en
conditions anaérobies.
Les acides formique, pyruvique, lactique, acétique, succinique, propionique et butyrique ont
été analysés. Après optimisation de la méthode de séparation en se basant sur la méthode
employée par Tormo et Izco (2004). Les acides ont été séparés sur une colonne en phase
inverse (Atlantis T3 5 µm, 4,6*250 mm) selon les conditions suivantes données en annexe 3.
II.2.3.5. Dosage du carbone organique dissous
Le carbone organique dissous a été dosé suivant le protocole du laboratoire du CEREVE.
Tout le matériel utilisé est préalablement grillé à 500°C afin d’éliminer toute trace de carbone
organique. A 38 ml d’échantillon filtré sous vide, 2 ml d’acide orthophosphorique concentré
(85 % Normapur, analytical reagent) sont ajoutés afin de stopper toute activité biologique.
L’échantillon est ensuite conservé en chambre froide à 4 °C jusqu’à analyse.
L’analyse du COD se fait de façon indirecte, par mesure du CO2 libéré après une oxydation
chimique du carbone organique présent dans l’échantillon par ajout de persulfate de sodium à
chaud (90°C). Le CO2 produit est ensuite analysé par spectrométrie infra-rouge (1010 OI-
ANALYTICAL). La masse de CO2 résultante est proportionnelle à la masse de COD dans
l’échantillon. Un exemple de gamme est donné en annexe 4.
II.2.3.6. Suivi du pH
Afin de suivre l’évolution de l’acidité du milieu, le pH a été mesuré régulièrement à l’aide
d’une électrode combinée (Metrohm) au cours de l’incubation dans 20 ml de solution prélevée
à l’aide d’aiguilles et de seringues stériles et après filtration de la solution à travers un filtre en
acétate de cellulose (0,45 µm de diamètre de pore). L’électrode est calibrée avant chaque
analyse à l’aide de solutions tampons à pH 7 et 4 (pH cal, Schott Geräte)
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
95
II.2.3.7. Détermination du carbone minéralisé
Le carbone inorganique produit au cours de l’incubation a été déterminé à partir de la
concentration en CO2 mesurée dans l’atmosphère du flacon et du pH mesuré en solution à
partir de la théorie thermodynamique. Les réactions, qui se produisent, lorsque le dioxyde de
carbone est dissous dans l’eau, peuvent être représentées par les équilibres suivants :
CO2(g) ⇔ CO2(aq) (1)
CO2(aq) + H2O ⇔ H2CO3 (2)
H2CO3 ⇔ H+ + HCO3- (3)
HCO3- ⇔ H+ + CO3
2- (4)
Cependant, il est difficile de distinguer par des moyens analytiques CO2(aq) et H2CO3. C’est
pourquoi l’on préfère confondre les deux espèces et exprimer leurs concentrations comme la
concentration probable de l’espèce CO2* (Lewis et Randall, 1961).
Les réactions 1, 2 et 3 sont donc redéfinies en espèces probables selon les équations-bilans
suivantes :
CO2(g) ⇔ CO2*
(aq) (5)
CO2*
(aq) ⇔ H+ + HCO3- (6)
Les relations d’équilibre entre les concentrations des différentes espèces peuvent alors s’écrire
comme suit :
K0 = [CO2*] / PCO2 (7)
K1 = ([H+].[HCO3-]) / [CO2
*] (8)
K2 = ([H+].[ CO32-]) / [HCO3
-] (9)
avec K0 = 2.99.106 Pa.mol-1.l pour le CO2 à 25°C, K1 = 10-6.3 et K2 = 10-10.3 à 25°C. Etant
données les valeurs de pH mesurées au cours de l’incubation, nous ne tiendrons compte que
des équations 7 et 8 pour calculer le CO2 dissous total.
II.3. Mobilité des éléments traces métalliques
Les éléments métalliques totaux, dissous ainsi que dans les différentes fractions du sédiment
ont été suivis au cours de l’incubation.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
96
L’analyse des éléments métalliques a été réalisée par spectroscopie d’émission atomique et de
masse couplée à un plasma à couplage inductif (ICP-AES et ICP-MS).Des précisions sur les
performances des deux méthodes sont données en annexe 5.
II.3.1. Principe des techniques de spectroscopie utilisées
II.3.1.1. ICP-AES
L’ICP-AES est une méthode d’analyse spectroscopique basée sur l’utilisation d’un plasma
d’argon. Il s’agit d’un mélange gazeux conducteur contenant des concentrations relativement
élevées d’ions argon et d’électrons qui constituent les espèces conductrices. Le plasma
d’argon atteint des températures comprises entre 6000 et 8000 K. A ces températures, les
éléments sont excités. Cet état excité n’étant pas stable, les éléments se désexcitent en
émettant des photons dont la longueur d’onde est caractéristique de chacun des éléments
analysés.
Les avantages de l’ICP-AES sont que les limites de détection sont très faibles, de l’ordre du
µg.l-1, et que tous les éléments sont mesurés simultanément. De plus, la torche à plasma étant
axiale dans l’appareil utilisé, elle permet d’effectuer les mesures sur toute la longueur de la
flamme, conduisant ainsi à une sensibilité maximale.
II.3.1.2. ICP-MS
La spectrométrie de masse couplée à un plasma inductif est une technique reposant sur la
séparation, l’identification et la quantification des éléments contenus dans un échantillon en
fonction de leur masse. Elle est basée sur une torche à plasma générant des ions, comme en
ICP-AES. A la différence de cette dernière technique, les ions sont séparés par spectromètre
de masse quadripolaire en fonction de leur masse et de leur charge. L’ICP-MS présente une
excellente sensibilité permettant de détecter des éléments présents au niveau du ppt et de
nombreux éléments en trace au niveau du ppb.
II.3.2. Analyse des éléments métalliques totaux
L’analyse des métaux traces et majeurs totaux a été réalisée suivant le protocole de
minéralisation de Bettinelli et al. (2000).
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
97
250 mg d’échantillon humide sont pesés précisément dans les bombes de minéralisation et 2
ml d’HF (40 %, Normatom), 2 ml d’HNO3 (65 %, Normatom) et 6 ml d’HCl (30 %,
Normatom) sont ajoutés. Le mélange est laissé au repos toute la nuit.
Puis la minéralisation par micro-ondes (MLS 1200, Milestone) a lieu selon les conditions
suivantes (tableau 18) :
Tableau 18 : Conditions de minéralisation des sédiments
Etape 1 2 3 4 5 Puissance (W) 250 400 600 0 300 Durée (min) 8 4 6 2 3
Après refroidissement, 2 ml d’acide borique saturé sont ajoutés pour précipiter les ions
fluorures. Les bombes sont ensuite fermées puis placées dans le four micro-ondes et chauffées
à nouveau pendant 3 min à 300 W.
Les liqueurs obtenues sont transvasées dans des fioles de 50 ml et complétées à 50 ml avec de
l’eau MilliQ avant d’être analysées.
II.3.3. Analyse des ETM dissous
Des aliquotes de milieu de culture (20 ml) sont prélevés régulièrement au cours de
l’incubation. Après filtration immédiate sur filtre en acétate de cellulose (0.45 µm de diamètre
de pores), préalablement rincés à l’acide nitrique (2% Normapur) puis à l’eau ultrapure
(MilliQ, Millipore) et acidification, les échantillons sont analysés.
Les éléments traces dont les concentrations étaient fréquemment inférieures à la limite de
détection de l’ICP-AES, le Cd, Co, Cr, Cu, Ni, Pb et Zn ont donc été analysés en ICP-MS
équipé d’une cellule à collision pour réduire les interférences isobariques (Xseries CCT,
Thermo Electron). Les courbes de calibration ont été obtenues en analysant les solutions (2, 5,
10, 20 µg.l-1) préparées à partir de la solution multi-élémentaire PlasmaCal 4 (100 mg.l-1, SCP
Science). Rh, In et Re ont été utilisés comme standards internes aux concentrations
respectives de 10, 1 et 1 µg.l-1 à partir d’une solution mono-élémentaire (1000 mg.l-1, SCP
Science).
De plus, le fer(II) a été analysé par colorimétrie immédiatement après échantillonnage. 1 mL
d’échantillon est addition à 1 mL de phénantroline (0,5 %). Après agitation, le mélange doit
reposer pendant 30 min à température ambiante avant lecture au spectrophotomètre à 490 nm.
La coloration rouge développée est très stable. La concentration en Fe(II) est obtenue à partir
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
98
d’une gamme étalon réalisée dans les mêmes conditions avec une solution de chlorure de fer
(annexe 6).
II.3.4. Répartition des éléments métalliques dans les différentes
fractions du sédiment
Les éléments métalliques sont répartis sur les différents minéraux constituant les sédiments
tels que les carbonates, les oxydes de fer et manganèse, les silicates ainsi que sur les matières
organiques. Les conditions physico-chimiques du milieu et en particulier le pH et les
conditions redox sont à l’origine de cette répartition. Des modifications de ces conditions,
notamment sous l’influence des microorganismes en milieu anaérobie peuvent entraîner une
dissolution des carbonates par acidification, une réduction des oxydes de fer et manganèse et
la précipitation des métaux sous forme de sulfures insolubles en conditions fortement
réductrices. C’est pourquoi, nous nous sommes intéressés à la répartition des éléments
métalliques au sein du sédiment avant et après incubation.
De nombreux protocoles d’extractions séquentielles ont été proposés, la plupart basée sur
celui de Tessier (1979). Bien que ces extractions soient toujours soumises à de nombreuses
controverses (notamment à cause des phénomènes de réadsorption, par exemple), nous avons
néanmoins décidé d’employer un protocole d’extraction. De plus, la plupart des protocoles ne
permettent pas de distinguer les métaux liés aux sulfures de ceux liés à la matière organique.
Or, sulfures et MO font partie des "phases" actives, c'est à dire très évolutives dans les
processus biogéochimiques et diagénétiques. Le problème est moins critique pour les oxydes
de Fe et/ou Mn car leur devenir biogéochimique est assez proche, même si le Mn est plus
réactif que le Fe, ce qui n'est pas du tout le cas des matières organiques ou des sulfures.
Le protocole adopté pour cette spéciation est celui préconisé par Campanella et al. (1995) qui
permet de distinguer les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures et que
nous avons vérifié et légèrement modifié (annexe 7). En particulier, nous avons éliminé
l’attaque qui consistait à séparer les métaux liés aux humines des acides humiques. En effet, le
but de notre extraction séquentielle est de distinguer les métaux liés aux matières organiques
de ceux liés aux sulfures. Il ne nous est donc pas nécessaire de distinguer les différents types
de matières organiques. Afin de préserver les conditions anaérobies et donc éviter tout risque
d’oxydation des sulfures, les spéciations ont été réalisées sous flux d’azote dans une boîte à
gants et tous les réactifs utilisés ont été dégazés. La spéciation a été réalisée sur les sédiments
avant, après 1 semaine et 4 semaines d’incubation.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Matériel et méthodes
99
Les différentes étapes de ce protocole sont les suivantes :
Etape 1 : Métaux échangeables et liés aux carbonates. 90 ml d’acétate d’ammonium (1M)
ajusté à pH 5 avec de l’acide acétique pur sont ajoutés à 9 g de sédiment humide. Après 24 h
d’agitation à 130 tr.min-1, le mélange est centrifugé à 4200 tr.min-1 pendant 15 min (Jouan,
GR412). Le surnageant est récupéré et acidifié à pH 1 avec de l’acide nitrique ultrapur avant
dosage des métaux par ICP-AES. Le pH a été vérifié au bout de 24 h et est resté stable.
Etape 2 : Métaux liés aux oxydes de Fe et de Mn. 90 ml de 1:1 (v:v) chlorure
d’hydroxylammonium (1 M) : acide acétique (25 %) sont ajoutés au culot de l’étape
précédente. La suite du protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.
Etape 3 : Métaux liés aux matières organiques. 50 ml de NaOH (0,5 M) sont ajoutés au culot.
La suite du protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.
Etape 4 : Métaux liés aux sulfures. 50 ml de HNO3 (8 M) sont ajoutés au culot. Le mélange
est chauffé à 85 °C pendant 3 h avec agitation manuelle de temps en temps. Puis la suite du
protocole concernant le surnageant est la même que précédemment.
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Résultats et discussion
100
III. Résultats et discussion
Les résultats et discussion de ce 1er chapitre sont présentés sous la forme d’un article soumis à
la revue « Water, Air and Soil Pollution ».
101
Title : Influence of microbial activity on the release of heavy metals in anaerobic river
sediments
C. Gounou*1,2, N. Bousserrhine2, G. Varrault1, J.-M. Mouchel3
1*Université Paris-Est, Cereve, UMR-MA102 - AgroParisTech, 61 Avenue du Général de
Gaulle, 94010 Créteil Cedex, France, tel : 33 145 176 563, fax : 33 145 171 999,
[email protected], [email protected]
²LBSE, Université Paris 12-Val de Marne, 61 avenue du Général de Gaulle, 94010 Créteil
Cedex, France, [email protected] 3 UMR 7619 Sisyphe, Université Pierre et Marie Curie, 75252 Paris Cedex 05, France :
102
Abstract
The impact of the autochthonous microbial activity on the release of metals in river sediments
has been studied. Sediments were incubated in anaerobic conditions and enriched in glucose
to stimulate microbial metabolism. Glucose was fermented and organic acids were produced.
If no obvious correlation between the acidification of the medium and the release of metals
was observed, a more significant correlation was observed between microbial activity and the
release of metals (r²=0.9). In particular, a strong activity of the iron-reducing bacteria took
place leading to the solubilisation of co-precipitated metals on iron-oxides. The presence of
the iron-reducing bacterium Clostridium butyricum, known for its iron-reducing activity was
supposed since a high concentration of butyrate was produced and it was probably implied in
the dissolution of metals.
Key-words : trace metals, microorganisms, river sediments, fermentation, iron-reducing
bacteria
1.Introduction
Anthropic activities lead to the metallic pollution of environment and particulary of river
sediments. Metals carried on suspended matter can settle and remain trapped in sediments,
which have been considered as potential chemical time bombs (Cappuyns 2006).
Indeed particle bound metals can be mobilized by changing physico-chemical conditions such
as the acidification of the medium or a change in the redox conditions (Calamano 1993; Chen
2001 ; Chuan 1996; Sims 1978). If physico-chemical parameters can roughly explain the
overall solubilization patterns of trace metals and their repartition in the different fractions of
sediments, the autochthonous microbial activities play a major role on the fate of metals in
aquatic systems in soils and sediments (Berthelin 1995 ; Kurek 2002 ; Bosecker 1997 ; Ledin
2000; Huang 2005; Gadd 2004). They can provoke a severe acidification of the medium
during sulphide oxidation (Gomez 1999; Lombardi 2001; Ryu 2003) or reduce iron and
manganese oxides (Lovley 1991). Conversely, other organisms can also promote the
oxidation of Fe and Mn oxides. If such phenomena have been described in soils, studies in
sediments are very seldom and particularly in strictly anaerobic conditions (Regnell and
Tunlid 1891; Charlatchka and Cambier 2000). However it is necessary to understand the
microbial activity in anoxic sediments since the potential release of metals, in particularly in
freshwater, may contaminate the neighbouring groudwater masses, for example in the case of
storage of dredged sediments in wet ponds (Carpentier et al 2002a 2002b).
103
The aim of this work was to study the fate of particle bound metals in sediments in response
to an increase of the heterotrophic microbial activity. Fluvial sediments were sampled and
incubated in anaerobic conditions. The release of metals and its distibution patterns in the
sediments as well as microbial metabolism were monitored during the incubation period.
2 Materials and Methods
2.1 Sampling
The first twenty centimetres of sediments were collected in the Marne River (Méry-sur-Marne)
and in the Seine River (Andrésy) in November 2005 with an Eckman grab. These sites were
chosen because of their position regarding the Paris conurbation which is considered as a
major source of contamination, Méry is located upstream of Paris while Andrésy is
downstream and deeply affected by the city. Once collected, sediment samples were
transferred into a 10 L plastic bottle previously washed with nitric acid (5 %, Normatom) to
avoid any metallic contamination. Sediments were kept moist under a Marne or Seine water
layer and were not crushed nor dried to preserve anaerobic conditions and thus preserve their
main characteristics. Given the mass of the sediment block, it is expected that sampling did
not significantly modified the bulk particulate speciation of metals, while the dissolved
speciation in interstitial water was certainly modified.
2.2 Experimental Design
Sediment incubations were carried out in anaerobic conditions in autoclaved serum flasks
(250 ml) sealed with a Teflon faced silicone septum and caped with aluminium seals. The
incubation started when 20 g (wet weight) were added to the 150 ml sterilized culture medium
containing 0.5 % of glucose (C source) and 0.15 g.l-1 of yeast extract (N source). This culture
medium was used to stimulate bacterial growth, accelerate potential the evolution of
sediments and study the impact of the microbial activity on the release of metals. The
anaerobic conditions were created by degassing the system with nitrogen. Incubations were
conducted in the dark at 28 ± 2 °C for 4 weeks without shaking to avoid resuspension of
sediments and consequently to only consider diffusion of metals during the incubation and
simulate diffusion of metals in calm and anaerobic areas. Blanks incubations were realised in
the same experimental conditions without any sediment addition.
Incubations of sediments and blanks were realised in triplicate and all manipulations were
done under a sterilised hood to avoid any microbial contamination. The dry weight of
sediments was determined: the moisture content in sediment samples was 50 % for the Marne
104
and 30 % for the Seine samples. All results are given against dry weight. All microbial and
chemical parameters were sampled and measured under inert atmosphere
2.3 Microbial metabolism
CO2 production was quantified with an infrared spectrophotometer (Beryl 100 Cosma). pH
was measured in the culture medium sampled with a sterile syringe through the septum to
keep anaerobic conditions and filtered through a 0.45 µm (pore diameter) cellulose acetate
filter (Sartorius). The total inorganic C was computed from the gaseous CO2 measurements,
and H2CO3 and HCO3- concentrations determined from the Henry’s law (KH = 2.99*106
Pa.L.mol-1) and the CO32-/HCO3
-/H2CO3 equilibrium (K1=10-6.3, K2=10-10..3). All constants are
given for 28 °C. Glucose was measured enzymatically in 1 ml of the culture medium using a
commercial kit (Kit D-Glucose, Roche). Pyruvate, formate, acetate, lactate, priopionate and
butyrate, which are the main organic acids produced during the glucose fermentation (Lovley
1988) were analysed in 1 ml of medium solution by HPLC according to Tormo and Izco
(2004). Briefly, the separation of organic acids was realised by HPLC with a reversed phase
column (Atlantis T3 5 µm, 4,6*250 mm) and a gradient of KH2PO4 (20 mM) and acetonitrile.
Organic acids were detected on-line by a UV spectrophotometer at 210 nm (UVD340S,
Gynkotek).
2.4 Metals in solution and in sediments.
Total metals in sediments were quantified before incubation by microwave mineralization
according to the method of Bettinelli et al (2000). Briefly it consisted in a mineralization with
a mix of 6 ml of HCl (30 %, Normatom), 3 ml of HNO3 (65 %, Normatom) and 2 ml HF (40
%, Normatom) for 250 mg of dry sediments. Furthermore the total contents of Fe and Al in
sediments before incubation were quantified according to the method NF EN ISO 11885
(INRA, Arras, France), which is based on a total extraction with fluorhydric acid only on 250
mg of sediment sample sieved to 250 µm.
Dissolved metals were analysed in 20 ml of the growing medium after filtration (0.45 µm
acid-washed membrane filter). Sequential extraction of metals was realised according to the
method of Campanella et al (1995) that we slightly modified to separate organic matter bound
metals and sulphide-bound metals. The step allowing to separate organic matter, exchanging
for acid-base effect, to humic compounds was removed since we are only interested in the
metals linked to the totality of organic matter. In order to keep anaerobic conditions and avoid
105
sulphide oxidation, the whole sequential extraction was realised under N2 atmosphere in a
glove box and reagents were degassed with nitrogen. The different steps of the sequential
extraction were the following:
Exchangeable and carbonate fraction: 90 ml of ammonium acetate (1 M) adjusted to pH 5
with acetic acid were added to 9 g of moist sediments. After shaking at 130 rpm for 24 h, the
mixture was centrifuged at 2400 g for 15 min. The pH value was checked at the end of the
extraction step and the supernatant was recovered.
Fe and Mn oxides fraction: 90 ml of hydroxylammonium chloride (1M, Normapur)/ acetic
acid (25 %, Normapur) 1:1 (v:v) were added to the sediment residue. The pH was 3.2. Then
the treatment was the same as the previous step.
Organic matter fraction: 50 ml of NaOH (0.5 M) were added to the sediment residue and the
treatment was the same as the previous step.
Sulphide fraction: 50 ml of HNO3 (8 M, Normatom) were added to the sediment residue and
the treatment was the same as the previous stage. Nevertheless, concerning this step, results
obtained must be interpreted very carefully because the residual fraction starts to be attacked.
All recovered supernatants were acidified at pH 1 with nitric acid (65 %, Normatom) and kept
at 4 °C before analysis. Analyses of metals were performed by using ICP-OES (Vista MPX,
Varian). 11 elements were analysed: Ag, Al, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Pb, Mn, Ni, and Zn.
Standards were prepared from an ICM 240 (Promochem) solution. The analytical quality was
controlled against reference solutions SPS-WW1 and SPS-SW1 (table 1). Although we are
well aware that sequential extractions are not perfectly specific of the fractions of particles
they are intended to destroy, we shall use the name of the fractions to refer to the extraction
steps, as a commonly done practice (Tessier et al. 1979; Quevauviller et al. 1993; Rauret 1998;
Dold 2003).
3 Results and Discussion
3.1. Characterisation of sediments
Physical and chemical characteristics of the sediments are given in the table 2 (Inra, Arras,
France). Both sediments are very different in their composition, the Seine sediment was much
coarser than the Marne sediments.
3.1.1. Total metal contents
106
The total metal contents in Marne and Seine sediments were analysed before incubation (table
3) according to the Bettinelli et al. (2002) method. Some differences between both sediments
in their metallic contents are noticed. The Marne sediments contained higher loads of Al, Fe
and Mn than the coarser Seine sediments. As far as trace metals are concerned, the Marne
sediments have higher contents of Cr, Ni and Zn than the Seine sediments. However higher
contents of Pb were found in the Seine sediments than in the Marne sediments. The higher Al
content in the Marne sediments could be explained by a higher clay fraction (440 g.kg-1) than
the Seine sediments (28 g.kg-1). However this result must be taken cautiously since the total
metals were analysed on the whole sediment whereas granulometry was analysed on particles
lower than 250 µm. Previous studies (Carpentier et al. 2002b) realised on dredged sediments
of the Seine showed good correlations between the percentage of fine particules and Cr, Fe,
Al, Mn and Ni. As a consequence, the higher loads of Al, Fe, Mn, Cr and Ni found in the
Marne sediments can be explained by the higher fractions of clays in these sediments.
Conversely, the concentrations in Ag, Cd, Cu, Pb and Zn measured in the coarser Seine
sediment, although similar to the concentrations obtained in the Marne sediment indicate a
much higher contamination status downstream of Paris, as expected (Thévenot, 2007).
3.1.2. Sequential extraction
It was performed on both sediments before incubation. Since no specific attack of the residual
fraction was attempted, metal contents in this fraction were estimated by difference. A
pseudo-residual fraction was calculated as the difference between total content
(HCl+HNO3+HF and microwave extraction) and the sum of the contents of the other fractions.
For the Marne sediments, results show that Co belonged mainly to the
exchangeable/carbonates fraction and Fe and Mn oxides fraction, Cu to the organic matter and
sulphide fractions (table 4a). Iron was mainly contained in the Fe/Mn oxides and sulphides.
Ni was mainly bound to the sulphide fractions and Mn mainly belonged to the exchangeable
and carbonates fraction. As the pH of the sediment was 8.1 and the redox potential was about
-0.2V, the Eh-pH stability diagram of Mn confirms that Mn was mainly under carbonate form.
In the much coarser Seine sediments, the distribution of metals showed some noticeable
differences (table 4b). A significant difference regards to the percentage of Fe in the
exchangeable+carbonate fraction which was much higher in Seine sediments (up to 28 %).
The percentage of Co and Ni in the organic fraction was 4 times higher the in Seine sediments,
107
up to about 20 %, while the same percentage decreased by more than a factor 2 for Cu, down
to 20 % also. The fractionation of Mn was about the same in both samples.
3.2. Microbial metabolism
3.2.1 Fermentation process
Rates of carbon mineralization were high during the first four days for both sediment samples
before a plateau occurred (Fig. 1). No latency period was observed at the beginning of the
experiment meaning a good physiological state of microorganisms and a good adaptation to
the experimental conditions. Quantities of inorganic carbon produced were quite similar for
both sediments and reach a maximum of 137 mg for the Marne and 175 mg for the Seine
sediment samples. Glucose was totally degraded after 4 days of incubation in both sediment
samples and several organic acids were detected: acetate, lactate, propionate and butyrate. In
the Marne sediments, butyrate and acetate were the major organic acids produced after 4 days
of incubation up to 23 and 130 mg-C at the end of the incubation, while the initially produced
lactate disappeared after 4 days. In the Seine sediments, the organic acid production pattern
was different. No lactate was detected. Only a small amount of propionate was produced (0.2
mg-C). The maximum of acetate was observed during the first stage of the incubation (13 mg-
C) followed by a plateau at about 3.5 mg-C after 3 days. Butyrate increased during the first
four days to attain a maximum value of 90 mg-C. The production of such organic acids
indicates that fermentation metabolism occurred (Charlatchka and Cambier 2000).
Furthermore Dassonville et al (2004) also demonstrated that in soils enriched with glucose in
anaerobic conditions, the microbial metabolism of glucose led to the initial formation of CO2
and acetate, while smaller quantities of lactate and propionate were accumulated.
The decrease of acetate in the experiments with Seine sediments could be due to a
consumption of acetate by autochthonous microorganisms (Lovley and Philipps 1988). In the
Marne and Seine sediment samples, after 10 days of incubation, about 75 % of the organic
carbon introduced as glucose was transformed into organic acids and mineralized carbon. The
organic carbon not determined can be due to the production of other metabolites such as
alcohols, amino-acids and other polysaccharides not analysed and to the increase of the
biomass. Indeed microorganisms increased from about 7.2x105 to 3.5x108 CFU.g-1 of dry
sediments in the Marne flasks and from 106 to 1.1x108 CFU.g-1 of dry sediments in the Seine
flasks after 1 day of incubation and which was the maximum. If it is assumed that the average
dry weight per bacterium is 2.7 x 10-13 g (Reynolds and Pepper 2000), the estimated biomass
108
in the Marne sediments is 0.9 mg and 0.42 mg in the Seine sediments after 1 day of
incubation.
To conclude, the organic acid production patterns in our incubations indicated that
microorganisms had a fermentative metabolism rather than an anaerobic respiration since
glucose was mainly transformed into carbon dioxide, organic acids and probably alcohols.
3.2.2 Acidification of the medium
For the Marne sediments, a strong acidification of the aqueous medium was observed during
the first four days of incubation from 8.2 to 5.8 (Fig. 2). Then after the day #7, the pH slightly
decreased until 5.5 and stabilized until the end of the incubation. For the Seine flasks, a
stronger acidification was noticed during the first two days from 7.7 to 5.1. Then pH
increased until the day #4 and remained constant at 5.4 until the end of the experiment.
This decrease can be attributed to the secretion of protons, amino-acids or organic acids.
Indeed the most thermodynamically favoured fermentation glucose reactions are the
following (Lovley and Philipps 1988) :
C6H12O6 + H2O → CH3COO- + CH3CH2COO- + HCO3- + H2 + 3H+ (1)
C6H12O6 + 2.6H2O → 0.6CH3COO- + 0.7CH3CH2CH2COO- + 2HCO3- + 2.6H2 + 3.3H+ (2)
Assuming that reactions 1 and 2 mainly occurred in our sediments and using the maximum
quantities of propionate and butyrate produced, it can be estimated that 13 mmol H+ in 150 ml
of solution was produced. This was calculated by considering the maximal quantity (mmole)
of each organic acid produced in 150 ml of solution: 2 mmol of butyrate, 1 mmol of acetate
and 0.2 mmol of propionate. Acetate was not considered in the equilibrium 2 to calculate the
total of the protons produced. As 4 mmol of glucose were introduced in 150 ml of solution at
the beginning of the incubation, 12 mmol of H+ were expected to be produced theoretically
and 13 mmol were really produced. As a consequence a part of the acidification of the
medium is due to the production of organic acids. A similar acidification from 7.5 to 5.5 was
found in anaerobic sediments incubated with 20 g.l-1 of glucose (Dassonville et al. 2004).
3.3 Metals in solution and sediments and their relationship with the microbial metabolism
3.3.1 Dissolved Fe and Mn
For the Marne sediments, high dissolution of Fe and Mn during the first five days of
incubation occurred followed by a plateau (Fig. 3). Maximum contents were 1600 and 110
µg.g-1 respectively. Same trends were observed for the dissolution of Fe and Mn in the Seine
109
sediments but dissolved amounts were lower than for the Marne sediments with about 600
and 20 µg.g-1 for Fe and Mn, respectively (Fig. 3). The dissolution of Fe and Mn was
maximum during the first days of the experiments and synchronous with the higher decrease
of pH. Several processes may be involved in the general positive relationship between
lowering of pH and metal release, which has been widely demonstrated for various substrates
(Sims and Patrick 1978; Calamano et al. 1993; Chuan et al. 1996; Stumm and Morgan 1996;
Chen and Lin 2001; Gundersen and Steinnes 2003; Qureshi et al. 2003; Yang et al. 2006).
However, no strict correlation between pH and Fe and Mn release was observed in our
sediments since after the strong pH decrease during the first day, pH started in slowly increase
while metals were still released in the supernatant. It is likely that slow kinetics at interfaces
slowly buffer the strong pH decrease due to -dissolved- glucose degradation, while additional
slow kinetics also at interface induce a slow release of metals. Accordingly, a reverse
relationship (dissolved metals increase with an increasing pH) was found for the final part of
the experiment. Same trends as our results are observed in a previous study, in which an
increase of the leached metals were observed in soils with a decrease of the pH but both
parameters were not obviously correlated (Linde et al. 2007). In their study, the only
relationship with R2 values above 0.2 was found for Cu and Cr concentration versus pH.
Much better correlations were obtained between C mineralization and the release of Fe and
Mn (R²>0.80) for both sediments. In particular, it can be noticed that dissolved iron attained a
plateau when glucose was completely consumed (Figs 1 and 3). Other experiments realised
with only 0.1 % of glucose instead of 0.5 % in the same incubation conditions (not presented
here) revealed a relationship between the percentage of glucose and the concentration of iron
dissolved. With 0.5 % of glucose, about 5 % and 10 % of the total iron was leached in the
Marne and Seine sediments, respectively while only about four times less of the total iron was
leached with 0.1 % of glucose in both sediments. The same plateau of iron concentration was
observed after the consumption of all glucose.
As better correlations were found between the Fe and Mn release with C mineralization, the
presence of iron and manganese reducing bacteria was supposed. Indeed some fermentative
bacteria are known to oxidise organic matter by reducing iron and manganese oxides at the
same time to use them as final electron acceptor (Lovley, 1991). The production of butyric
acid is characteristic of the microorganism Clostridium butyricum, known for its iron-
reducing activity (Lovley, 1991). Furthermore thermodynamic calculations suggest that the
metabolic strategy of using Fe(III) as a minor electron sink provide a slightly greater energy
110
yield than fermentation alone (Lovley, 1991). The percentage of the electrons produced by
fermentation and used for the iron reduction was calculated (table 5) at the end of the
incubation by assuming that all the dissolved iron was iron (II) and following the fermentation
equilibriums (Jones and Wood 1986) from the concentration of organic acids at the end of the
incubation:
Glucose → 2 propionate + 4e- (3)
Glucose → 2 lactate + 4e- (4)
Glucose → 1 butyrate + 4e- (5)
Glucose → 2 acetate + 8e- (6)
Fe3+ + e-→ Fe2+ (7)
The total amount of electrons produced (mmoles) was compared to the total amount of
electrons used to reduce iron (III) into iron (II). 2.39 and 5.42 % of electrons were used to
reduce iron-oxides, in the Marne and Seine, respectively. Identically low percentages are used
for the reduction of iron oxides such as goethite, usually lower than 6 % (Lovley 1991).
Under the assumption that all the dissolved iron was produced by the reductive dissimilatory
activity of iron-reducing bacteria on the Fe oxides measured by the sequential extraction
procedure, bacteria would have been able to reduce 60 % and 46 % of iron-oxides in Marne
and Seine sediments.
3.3.2. Other dissolved metals
As far as other metals are concerned (Co, Cu and Ni), their dissolution profiles were similar to
the Fe and Mn dissolution profiles for both sediments (Fig. 4). A high rate of dissolution was
observed for all metals during the first five days followed by a plateau. Maximum dissolution
contents were 1 and 0.7 µg.g-1 for Co/Ni and Cu respectively for the Marne sediments and 0.4;
0.2 and 0.1 µg.g-1 for Cu, Ni and Co, respectively, in the Seine sediments. The dissolved
contents of the other metals were very low and did not increase during the incubation (such
for Cd, Cr and Pb). As for Fe and Mn, no correlation was found between their release and the
decrease of pH whereas good correlations were found between the contents of dissolved
metals and carbon mineralization (R² between 0.62 and 0.93). Furthermore, the similarity of
dissolution profiles between Fe and Co, Cu, Mn and Ni, in the Seine and Marne sediments
suggests that these metals have been released from the iron oxides. The ratios of dissolved
metal/dissolved iron during the incubation were compared to the ratios of metal/iron in the
111
different fractions of the sediments measured by sequential extraction before the incubation
(Fig. 5). These ratios must also be compared to the exchangeable/carbonate fraction because
the acidification due to fermentation may also have released a fraction of the trace metals that
have been released by this extraction step. In the Marne sediments (Fig. 5a), it appeared that
the dissolution of Cu was close to the dissolution of Cu coming from the Fe/Mn oxide fraction.
The same behaviour was observed for Co and Ni. For Mn, it was close to the dissolution of
Mn coming from exchangeable/carbonate and Mn/Fe oxides fractions. The same results were
obtained for the Seine sediments (Fig. 5b). Such correlations have been observed in pore-
water sediments: dissolved Ni and Cu increased in the zone of Fe and Mn reduction
(Leermarkers et al. 2005).
As a consequence, metals adsorbed or co-precipitated on iron-oxides were released during
their reduction as it has been observed in previous studies (Francis and Dodge 1990;
Bousserrhine et al. 1999a,b; Quantin et al. 2001). In further studies, it will be interesting to
characterize the iron-reducing bacteria in our sediments and their relative contribution to the
dissolution of metals.
The aim of this paper was to study the activity of heterotrophic bacteria on the release of
metals in anaerobic sediments. Despite some different physico-chemical properties between
sediments, similar trends were observed. The organic matter was fermented and CO2 and
organic acids were produced. Meanwhile, the release of Co, Cu, Fe, Mn and Ni occurred. A
strong correlation was noticed between the dissolution of Fe and the other metals. This fact let
to think that Co, Cu, Mn and Ni were leached from iron-oxides by iron-reducing bacteria.
This was emphasized by the results of sequential extraction that showed a correlation between
dissolved metals and metals dissolved coming from the iron oxides. Furthermore the presence
of iron-reducing bacteria was highlighted by the analysis of organic acids and particularly a
high concentration of butyrate (1 g.l-1), which is usually produced by the iron-reducing
bacterium, Clostridium butyricum. In further studies, it would be interesting to analyse more
precisely the evolution of the microorganisms during the incubation and identify the
microorganisms and particularly, the iron-reducing bacteria.
In a more general view, this study shows that autochthonous microorganisms can also be used
as a biological method to estimate metals linked to the different fractions of sediments and
particularly to the iron-oxides thanks to the use of iron-reducing bacteria. This method can be
used alternatively to the usual chemical extraction scheme, which’s cons are well known, such
as readsorption on other mineral fractions of soils and sediments.
112
Acknowledgements
The authors are grateful to Research Ministry and the University Paris Est for their financial
and technical support and also to the Service of the Navigation of Seine for their authorization
and technical support for the sediment sampling.
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117
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12
Time (days)
C (m
g)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Cglu
cose
(mg)
LactateAcetatePropionateButyrateMineralized CCorg acid + C mineralizedGlucose
a) Marne
0
50
100
150
200
250
300
0 2 4 6 8 10 12
Time (days)
C (m
g)
0
50
100
150
200
250
300
350
400C
gluc
ose
(mg)
AcetatePropionateButyrateMineralized CCorg acid + C mineralizedGlucose
b) Seine
Fig. 1. : Evolution of organic and inorganic carbon during the incubation (error bars : standard
deviation between triplicates)
118
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Time (days)
pH
Marne Seine
Fig. 2. : Evolution of pH in the growing medium during the incubation
119
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (days)
Diss
olve
d M
n (µ
g.g
-1 o
f dry
sed
imen
ts)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
Diss
olve
d Fe
(µg.
g-1
of d
ry s
edim
ents
)
Mn-Marne Mn-Seine Fe-Marne Fe-Seine
Fig. 3 : Evolution of the content of dissolved Fe and Mn during the incubation
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
Time (days)
Diss
olve
d m
etal
s (µ
g.g
-1 o
f dry
sed
imen
ts)
Co-Marne Cu-Marne Ni-Marne Co-Seine Cu-Seine Ni-Seine
Fig. 4 : Evolution of the content of dissolved Co, Cu and Ni during the incubation
120
y = 0.0004x - 0.0344R2 = 0.9244
0
1
2
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed C
o (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
a) Co
y = 0.0005x - 0.0646R2 = 0.9079
0
5
10
15
20
25
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed C
u (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
b) Cu
121
y = 0.0681x + 1.5881R2 = 0.9171
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed M
n (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
c) Mn
y = 0.0006x + 0.0112R2 = 0.8926
0
2
4
6
8
10
12
0 500 1000 1500 2000 2500 3000
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed N
i (µg
.g-1
)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
d) Ni
A- Marne
122
y = 0.0001x + 0.008R2 = 0.975
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed C
o (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
a) Co
y = 0.0005x + 0.0736R2 = 0.8702
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Dissolved Fe (µg.g-1)
Diss
olve
d C
u (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
b) Cu
123
y = 0.0313x - 0.2676R2 = 0.9734
0
20
40
60
80
100
120
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed M
n (µ
g.g
-1)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
c) Mn
y = 0.0002x + 0.0321R2 = 0.9037
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
2
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Dissolved Fe (µg.g-1)
Dis
solv
ed N
i (µg
.g-1
)
dissolvedExch/CarbFe/Mn oxidesOrganic matterSulphides
d) Ni
B-Seine
Fig. 5 : Correlation between dissolved metals and dissolved Fe for the dissolved metals
during incubation and in the different fractions of the sediment
124
TABLE 1 : Mean values (µg.l-1) of control solutions analysed by ICP-AES (experimental and
theorical values)
Parameters Marne Seine Method Physical Size fractions (g.kg-1) NF X 31-107 Clay (<2 µm) 440 28 Fine silt (2/20 µm) 346 4 Coarse silt (20/50 µm) 153 2 Fine sand (50/200 µm) 32 9 Coarse sand (200/2000 µm) 29 957 Chemical pH water 8.1 7.8 NF ISO 10390 Organic carbon (g.kg-1) 23 26.9 C/N 9.6 47.6 Organic matter (g.kg-1) 39.7 51.2
NF ISO 10694 NF ISO 13878
CEC (cmol+.kg-1) 15.8 1.42 NF X 31-130 TABLE 2 : Physical and chemical characteristics of sediments (fractions < 250 mm)
SW1 Mean Theorical values WW1 Mean Theorical values Al 50±3 50± 1 Co 59.7±3.5 60.0± 0.3 Cu 21±1 20± 1 Cu 416±6 400± 2 Cr 2.36±0.07 2.00± 0.02 Cr 210±3 200± 1 Cd 0.58±0.13 0.50± 0.01 Cd 21.0±1.4 20.0± 0.1 Co 2.00±0.00 2.00± 0.02 Fe 1000±6 1000± 5 Fe 21±2 20± 1 Mn 419±9 400± 2 Mn 10.2±0.5 10.0± 0.1 Pb 103.5±4.9 100.0± 0.5 Ni 9.0±0.0 10.0± 0.1 Zn 608.5±12.0 600± 6 Pb 6.7±0.3 5.0± 0.1 Zn 23±4 20± 1
125
1
Samples Ag Al Cd Co Cr Cu Fe Mn Ni Pb Zn Mean content 0.35 6370 0.38 6 24 22 11800 203 12 16 65 Marne sediments Standard deviation 0.04 1500 0.03 1 2 1 900 5 1 1 3 Mean content 0.31 11600 0.5 2 9.4 21 3900 114 4 41 46 Seine sediments Standard deviation 0.02 2616 0.1 1 1.8 7 454 24 1 19 5
Background of the Seine watershed (Thévenot et al. 2007)
Mean content 2.7 33000 0.25 7 40 15 15000 16 23 60
TABLE 3 : Total content of metals (µg.g-1 of dry sediments) before incubation. Standard deviation represents deviation between triplicates. 2
3
4
5
126
Content (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 1.5 2.4 57 312 2.9 Fe/Mn oxides 1.5 2.9 2837 128 3.0 Organic matter 0.17 19 33 0.35 0.74 Sulphides 0 14 1427 63 9.8 Sum of the fractions 3.17 38.3 4354 503.35 16.44 Pseudo-residual 2.83 - 7446 - - Standard deviation (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.1 0.2 9 9 0.1 Fe/Mn oxides 0.1 0.1 70 13 0.2 Organic matter 0.03 1 2 0.05 0.06 Sulphides 0 0 143 5 0.6
a) Marne
Content (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.19 2.4 584 101 0.74 Fe/Mn oxides 0.25 2.9 1298 59 0.60 Organic matter 0.11 3.3 9.5 0.06 0.17 Sulphides - 9.3 203 17 1.7 Sum of the fractions 0.55 17.9 2094.5 177.06 3.21 Pseudo-residual 1.45 3.1 1806 - 0.79 Standard deviation (µg.g-1) Co Cu Fe Mn Ni Exchangeable/carbonate 0.03 0.2 98 6 0.06 Fe/Mn oxides 0.02 0.02 93 6 0.01 Organic matter 0.06 1.3 3.6 0.01 0.08 Sulphides - 1.9 5 1 0.07
b) Seine
TABLE 4 : Content of metals in the different fractions of the sediment before incubation (%
recovered represents the ratio of the sum of each fractions out of the total metals)
Marne Seine Fe2+ (mmol) 0.29 1.72 Acetate (mmol) 0.95 0.15 Byturate (mmol) 2.02 1.66 Propionate (mmol) 0.22 0.005 Electron production (meq e-) 12 7 Percentage of electrons implicated in the Fe(III) reduction 2.39 5.42
TABLE 5 : Metabolism of microorganisms and its implication in the reduction of iron oxides
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Conclusions et perspectives
127
IV. Conclusions et perspectives
L’objectif de ce premier chapitre était d’étudier la mobilité des éléments traces métalliques et
éléments majeurs dans les sédiments de la Seine et de la Marne sous l’activité des
microorganismes autochtones en milieu anaérobie. Bien que les sédiments étudiés aient des
propriétés physico-chimiques différentes, les résultats obtenus sont similaires tant du point de
vue microbiologique que de la mobilité métallique.
La croissance microbienne se manifeste par une consommation rapide du glucose, durant les 4
premiers jours d’incubation, accompagnée d’un dégagement de dioxyde de carbone et d’une
production d’acides organiques. Aussi, les bactéries semblent-elles mettre en place un
processus de fermentation. Nous avons pu observer une acidification du milieu de culture
passant d’un pH 7,5 à un pH 5.
Parallèlement à l’activité microbienne, nous avons observé une forte dissolution des ETM et
éléments majeurs, en particulier du Co, Cu, Fe, Mn et Ni. Il semble que cette dissolution ne
soit pas corrélée à l’acidification du milieu mais plutôt liée à l’activité microbienne. En effet,
nous avons constaté une corrélation entre la cinétique de solubilisation des ETM et éléments
majeurs et la croissance microbienne, en particulier la production de CO2 et la consommation
du glucose.
Par ailleurs, une forte corrélation entre la dissolution du fer d’une part, et celle du Co, Cu, Mn
et Ni d’autre part, est à souligner.
La présence de bactéries fermentaires avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer est donc
fortement suspectée. En effet, celles-ci, en réduisant les oxydes de fer pourraient être à
l’origine de la désorption des ETM y étant adsorbés. Ceci est d’ailleurs renforcé par les
analyses d’extractions séquentielles qui révèlent que les ETM dissous proviennent de la
fraction réductible c’est-à-dire des oxydes de manganèse et des oxydes de fer. De plus, la
forte production d’acide butyrique au cours de l’incubation nous laisse penser qu’une des
bactéries ferri-réductrices présentes dans le milieu pourrait être Clostridium butyricum. En
effet, cette bactérie est connue pour son activité fermentaire et sa capacité à réduire les oxydes
de fer (Bousserrhine, 1995, 1999a, 1999b).
Chapitre 1 : Interaction ETM-activité microbienne autochtone
Conclusions et perspectives
128
Il s’agit donc maintenant d’approfondir le métabolisme mis en place par les microorganismes,
de savoir si les communautés microbiennes sont modifiées au cours de l’incubation et de
mettre en évidence et d’identifier les bactéries ferri-réductrices présentent dans les sédiments.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
129
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des
microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Introduction
130
I. Introduction
Dans le premier chapitre dédié à l’étude de la mobilité des éléments traces métalliques et
éléments majeurs dans les sédiments de la Marne et de la Seine en relation avec l’activité de
microorganismes autochtones, les résultats ont montré que, malgré des propriétés physico-
chimiques différentes des sédiments étudiés, les mêmes tendances ont été observés concernant
le métabolisme microbien et le devenir des éléments métalliques.
La matière organique ajoutée (glucose) a été dégradée très rapidement par un processus
fermentaire conduisant à la production d’acides organiques et de dioxyde de carbone.
Simultanément, une acidification du milieu s’est produite. Parallèlement à ce métabolisme
microbien, nous avons observé une dissolution du Fe, Mn, Co, Cu, et Ni. Par ailleurs, il a été
constaté que la dissolution réductrice du fer était corrélée à celle de certains ETM. Nous
avons donc supposé que ces ETM étaient associés aux oxydes de fer, cette hypothèse étant
renforcée par les résultats obtenus lors de l’extraction séquentielle. Nous en avons donc déduit
que, dans les conditions opératoires, les bactéries mettaient en place un métabolisme de type
fermentaire avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer. La présence d’acide butyrique
dans les incubations nous a laissé supposer que des bactéries de l’espèce Clostridium
butyricum, bactérie anaérobie tellurique connue pour son métabolisme fermentaire et sa
capacité à réduire les oxydes de fer (Bousserrhine, 1995, 1999a,b), étaient présentes et
jouaient un rôle prépondérant dans les sédiments étudiés.
Aussi, nous sommes-nous attachés, dans ce volet, à étudier le métabolisme mis en place
parallèlement à la réduction bactérienne du fer et à en identifier les acteurs ainsi qu’à en
suivre leur dynamique. L’importance d’autres activités microbiennes susceptibles de nous
renseigner davantage sur le devenir des éléments métalliques a également été abordée. Il
s’agira essentiellement des activités concernant les sulfates.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
131
II. Matériel et méthodes
II.1. Incubation des sédiments et suivi du métabolisme microbien
II.1.1. Incubation des sédiments
Les sédiments de la Marne et de la Seine, issus de la campagne de prélèvement de novembre
2005, ont été mis à incuber en batch pendant un mois dans les mêmes conditions que celles
mises en place dans les expérimentations du chapitre 1.
Nous avons choisi de travailler avec 0,5 % de glucose dans ce volet puisque c’est à cette
concentration que les résultats les plus représentatifs et significatifs ont été observés. En fait,
les résultats présentés dans cette partie ont été obtenus lors des incubations effectuées
précédemment (cf. chapitre1).
II.1.2. Suivi du métabolisme microbien
L’activité des microorganismes a été suivie pendant toute la durée des incubations.
La densité microbienne anaérobie a été étudiée pendant la durée de l’incubation selon le
protocole décrit dans le chapitre 1.
II.1.2.1. Suivi de la diversité fonctionnelle ou capacité
métabolique des microorganismes
Le suivi de la diversité fonctionnelle permet de constater d’éventuelles modifications dans la
structure de la communauté microbienne au cours de l’incubation. Celle-ci a été suivie chaque
semaine en utilisant la technique Biolog mise au point par Garland et Mills (Garland et Mills,
1991) (Microplaques AN, Biolog, AES laboratories). Il s’agit d’une plaque de 96 puits
contenant chacun une source de carbone différente et un réactif, le tétrazolium. Les sources de
carbone sont regroupées par famille : amines, polysaccharides, hydrates de carbone, acides
organiques, acides aminés et divers (annexe 8). L’oxydation des sources de carbone par les
microorganismes entraîne la réduction du tétrazolium qui prend alors une coloration violette
et dont l’intensité est mesurée au spectrophotomètre (Opsys MR, Dynex Technologies) à une
longueur d’onde de 590 nm. 100 µl de suspension du sédiment à analyser a été inoculé dans
chacun des puits puis la plaque a été mise à incuber dans un bocal « Le Parfait » fermé
hermétiquement et contenant un sachet GENbox anaer (Biomérieux) permettant de réaliser
l’anaérobiose. Après 48 h puis 72 h d’incubation à 30 °C, la plaque est analysée au lecteur de
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
132
plaques. Entre les deux mesures, un sachet GENbox anaer est replacé dans le bocal afin de
recréer les conditions anaérobies pour la suite de l’expérimentation. L’effet de l’oxygénation
pendant la lecture de la plaque est considéré comme négligeable. Chaque puit fournit donc
une réponse oui/non selon que le composé qu’il contient est significativement dégradé ou non
dans les conditions d’incubation choisies. Les résultats seront interprétés en les examinant par
famille et en comptant le pourcentage de composés (ou puits) donnant une réponse positive
pour chaque famille.
II.1.2.2. Mesure du potentiel d’oxydo-réduction
Le potentiel d’oxydo-réduction a été mesuré, au cours de l’incubation, à l’aide d’une électrode
de platine (Metrohm) immédiatement après prélèvement de l’échantillon et filtration à 0,45
µm.
II.1.2.3. Dosage des sulfates
Afin de mettre en évidence d’éventuelles réactions de sulfato-réduction, souvent rapportées au
cours de transformation microbienne en conditions anaérobies, les ions sulfates ont été dosés
par chromatographie ionique (C1 Metrosep Anion Dual 1 + précolonne, Metrohm).
Le principe de la chromatographie ionique repose sur l’interaction électrostatique entre la
résine de la colonne et les ions à séparer. La résine est chargée soit positivement pour séparer
les anions soit négativement pour séparer les cations. En fonction de la force de l’interaction
électrostatique entre la résine et les ions, la séparation se fera plus ou moins facilement.
Dans notre cas, l’éluant est un mélange de carbonate de sodium (2,5 mM, Normapur,
Analytical Grade) et d’hydrogénocarbonate de sodium (2,4 mM, Merck). Le débit est de 0,5
ml.min-1 et le volume d’échantillon injecté est 20 µL. La gamme étalon est préparée à partir
d’une solution standard multiéléments (Fluka multielement IC standard solution II). 10 ml de
milieu de culture ont été prélevés à différents temps et filtrés à 0,47 mm avant analyse.
Les caractéristiques analytiques sont indiquées en annexe 9.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
133
II.2. Caractérisation génétique des communautés microbienne
II.2.1. Principe
Depuis Torsvik (1980) qui a extrait directement les acides nucléiques à partir d’échantillons
de sol, de nombreuses méthodes ont été développées pour analyser la diversité génétique du
monde microbien en tenant compte de la fraction non cultivable représentant 90 % du
peuplement microbien d’un sol. Parmi ces méthodes, la DGGE (Electrophorèse en Gradient
de Gel Dénaturant) permet d’obtenir une image instantanée de cette diversité (Muyzer et al.,
1993). Cette technique consiste à séparer des fragments d’ADN dont la taille est identique
mais dont la séquence est différente selon le principe suivant :
1) On amplifie, sur un échantillon d'ADN extrait du milieu naturel, le gène rrn ou codant
pour l’ARN ribosomal 16S. Celui-ci est présent chez les bactéries et les archéobactéries. Il se
compose de régions variables, caractéristiques de chaque espèce, encadrées de régions
conservées utilisées en tant qu’amorces (Lane et al, 1974, Woese, 1970).
2) Le mélange des produits de la réaction de PCR est mis à migrer sur un gel présentant un
gradient vertical de produits dénaturants constitués d’acrylamide et d’urée (Muyser et al,
1993).
3) En fonction de leurs séquences et en particulier du pourcentage de bases GC, les
fragments amplifiés vont migrer plus ou moins loin sur le gel et on obtiendra in fine une
image de la « diversité » de la communauté microbienne.
II.2.2. Méthode
II.2.2.1. Extraction de l’ADN.
L’ADN a tout d’abord été extrait sur 0.25 g de sédiments (masse sèche) à l’aide d’un kit
d’extraction (PowersoilTM, MO BIO Laboratories, Ozyme, France). Il s’agit dans un premier
temps de lyser les cellules microbiennes. Le tube initial dans lequel est introduit le sédiment
contient un tampon permettant la dispersion des particules de sédiments tout en protégeant les
acides nucléiques de toute dégradation. L’ajout d’un réactif, dont le but est de lyser
complètement les cellules, permet de casser les acides gras et les lipides associés à la
membrane de nombreux organismes. Les cellules sont lysées par combinaison d’agents
chimiques et par agitation mécanique. Les étapes suivantes consistent à éliminer, par
précipitation à froid (4°C) et centrifugation, les matières organiques et inorganiques afin
d’augmenter la pureté de l’ADN. L’étape suivante consiste à purifier l’ADN. Pour ce faire,
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
134
l’ADN est fixé sur une micro-colonne de silice (du kit PowersoilTM, MO BIO Laboratories,
Ozyme, France) à l’aide d’une forte concentration de solution saline. Les impuretés restantes
sont donc éliminées par filtration à travers le gel de la colonne filtrante mais fixatrice d’ADN.
L’ADN fixé est purifié à l’aide de la solution d’éthanol (70 %) qui permet d’éliminer à l’aide
d’une étape de filtration-centrifugation, tous les résidus de sels, acides humiques et autres
contaminants tout en maintenant l’ADN fixé sur la colonne. Une seconde étape de filtration-
centrifugation permet d’éliminer l’éthanol résiduel. La dernière étape consiste à récupérer
l’ADN en le désorbant de la colonne de silice à l’aide d’une solution tampon d’élution
(Tampon Tris 10 mM, pH 8).
II.2.2.2. Amplification PCR (Polymerase Chain Reaction)
Afin d’amplifier une séquence partielle de l’ARNr 16S, les amorces 518r et 338f ont été
utilisées (tableau 19). Une PCR a été réalisée sur 2 µL d’ADN dans 23 µL de mélange
contenant les amorces 518r (0,4 pmol.µl-1) et 338f (0,4 pmol.µl-1), la Taq Polymerase (Master
Mix, 1 pmol.µl-1) et de l’eau stérile. La PCR a été effectuée selon les conditions suivantes
(PTC-200 Peltier Thermal Cycler (Biorad)) : dénaturation à 94 °C pendant 5 min
(dénaturation initiale); 31 fois le cycle suivant : 94 °C pendant 30 s (dénaturation), 60 °C
pendant 1 min (hybridation), 72 °C pendant 3 min (élongation) et enfin 72 °C pendant 15 min.
La quantité d’ADN amplifié a été estimée par migration électrophorèse sur gel d’agarose (1 %)
dans un bain de solution tampon TAE (dilué 50 fois et composée de 40 mM de Tris, 20 mM
d’acide acétique, 1 mM d’EDTA, pH 8,3, Biorad) (200 V) en utilisant un marqueur de taille
moléculaire (multiple de 200 paires de bases (pb) de 200 à 10000 pb) (SmartLadder,
Eurogentec). La migration de l’ADN est visualisée en ajoutant 3 µL de bleu de bromothymol
dans chaque échantillon d’ADN.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
135
Tableau 19 : Caractéristiques des amorces utilisées au cours de la caractérisation génétique de la
communauté microbienne totale et de l’identification des bactéries ferri-réductrices
Amorces Séquences 5’→ 3’ Position Région de l’ARNr 16S
Référence
338f (F)+
518r (R)
ACTCCTACGGAGGCAGCAG ATTACCGCGGCTGCTG
338-355
518-534
V3
Muyser et al , 1993
27f AGAGTTTGATGATGGCTCAG 27- Lane, 1991 1100r GGGTTGCGCTCGTTG 1110 Lane, 1991 705r CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTC 705 + : GC clamp (CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCG) attaché
en 5’ de l’amorce
II.2.2.3. Analyse DGGE
Les brins d’ADN amplifié par PCR ont été séparés par électrophorèse (150 V pendant 10 min
puis 20 V pendant 6 h) sur un gel d’acrylamide avec un gradient linéaire de dénaturation de
40 à 60 % en utilisant le Bio-Rad D-CodeTM System chauffé à 60 °C. Après migration, le gel
est plongé dans un bain de bromure d’éthidium pendant 15 min puis rincé à l’eau pendant 10
min. Les bandes d’ADN sont ensuite visualisées sous ultraviolet avec le lecteur de gel Geldoc
2000 (Bio-Rad, Marnes la Coquette, France) puis analysées avec le logiciel Quantity One
(Bio-Rad, Marnes la Coquette, France).
II.3. Isolement et identification des bactéries ferri-réductrices
II.3.1. Milieu de culture
L’isolement des bactéries ferri-réductrices a été réalisé sur un milieu gélifié de Bromfield
modifié (Bousserrhine, 1995) dont la composition est la suivante (pour 1 litre) :
- KH2PO4 : 0,5 g
- MgSO4, 7H2O : 0,5 g
- (NH4)2SO4 : 1 g
- Extrait de levure : 0,15 g
- Fe2O3H2O : 0,5 g
- Glucose : 10 g
- CaCO3 : 3 g
- Agar : 15 g
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
136
Ce milieu permet de cultiver les bactéries anaérobies et de mettre en évidence celles qui sont
ferri-réductrices. Le milieu est ensuite réparti dans des flacons puis autoclavé à 120 °C
pendant 20 min. Après refroidissement à 45 °C, le milieu est coulé en boîtes de Pétri.
II.3.2. Ensemencement et incubation des bactéries
Chaque semaine, 2 g de sédiments humides sont dilués dans 10 ml d’eau physiologique
(10 g.l-1 NaCl) et une série de dilution adéquate est réalisée. 100 µl de chaque dilution est
étalée sur des boîtes de Pétri de milieu Bromfield solide. Les boîtes sont ensuite mises à
incuber à 28 °C dans des bocaux «Le Parfait » fermées hermétiquement où l’anaérobiose a
été réalisée.
Les colonies ayant poussé sont dans un premier temps repiquées et purifiées une à une sur du
milieu Bromfield solide. Dans un second temps, elles sont ensemencées dans du milieu
Bromfield liquide afin de vérifier leur activité ferri-réductrice.
II.3.3. Vérification de l’activité réductrice de fer des colonies
Les colonies sont repiquées individuellement dans des tubes stériles contenant du milieu
Bromfield liquide, dont la composition est identique à celle du milieu solide en absence
d’agar et de carbonate de calcium. Les tubes sont dégazés sous azote et mis à incuber à 28 °C
pendant 48 h.
L’apparition de fer II, dosé par spectrophotométrie, permet de prouver qu’une colonie est
effectivement issue d’une bactérie ferri-réductrice.
II.3.4. Identification des bactéries ferri-réductrices
II.3.4.1. Extraction d’ADN
Les souches purifiées issues des boîtes de Pétri sont remises en culture dans un milieu nutritif
LB (10 g.l-1 de tryptone, 5 g.l-1 d’extrait de levure, 5 g.l-1 de NaCl, pH 7) afin d’obtenir un
culot bactérien suffisant pour l’extraction d’ADN.
Après centrifugation pour récupérer le culot bactérien, l’ADN est extrait à l’aide du kit
DNeasy® Tissue Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France). Après extraction, l’ADN est quantifié
par spectrophotométrie UV à 260 nm (ND-1000 spectrophotometer, Nanodrop,
ThermoScientific) afin de vérifier que la quantité d’ADN est suffisante pour les étapes
suivantes.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
137
II.3.4.2. Amplification de l’ADN
L’ADN extrait est ensuite amplifié en utilisant les amorces 27f et 1100r (tableau 19) de
façon à obtenir environ 1000 paires de bases sur l’ARNr 16S. La PCR est réalisée sur un
volume final de 40 µl contenant 20 µl de Taq Polymérase (Master Mix, 1 pmol.µl-1), 1,6 µl
d’amorce 27f (10 pmol.µl-1) et 1,6 µl d’amorce 1100r (10 pmol.µl-1). La quantité de volume
d’ADN est ajoutée de telle façon à obtenir une concentration finale en ADN de 10 ng.µl-1. De
l’eau stérile purifiée est également ajoutée pour compléter le volume à 40 µl.
Les étapes d’amplification sont les suivantes : dénaturation initiale à 96 °C pendant 5 min et
44 fois le cycle suivant : 96 °C pendant 30 s (dénaturation), 56 °C pendant 30 s (hybridation),
72 °C pendant 1 min 30 s (élongation) puis après le dernier cycle, 72 °C pendant 5 min.
II.3.5. Purification de l’ADN
Après amplification, les brins d’ADN migrent sur un gel d’agarose (1 %) de la façon suivante :
3 µl de bleu de bromothymol (servant à visualiser à la migration de l’ADN) est ajouté à 40 µl
d’ADN amplifié. La migration est réalisée dans du TAE (dilué 50 fois et composée de 40 mM
de Tris, 20 mM d’acide acétique, 1 mM d’EDTA, pH 8,3, Biorad) pendant 40 min à 120V.
Le gel est ensuite plongé dans un bain de bromure d’éthidium pendant 15 min puis rincé à
l’eau ultrapure pendant 10 min avant d’être visualisé sous UV.
Les bandes d’ADN sont alors découpées et purifiées à l’aide du kit de purification DNA and
Gel Band purification kit (GE Healthcare). Ce kit permet d’éliminer, en suivant les
instructions du fournisseur, l’agarose et autres impuretés provenant de la migration par
électrophorèse.
II.3.6. Séquençage de l’ADN et identification des bactéries
II.3.6.1. Principe du séquençage d’ADN
Le séquençage d’ADN consiste à déterminer l’ordre des nucléotides d’un fragment d’ADN
donné. Il est réalisé par la méthode dérivée de celle de Sanger et al (1977) qui est une
méthode par synthèse enzymatique sélective (Brevet ABI). Le principe consiste à initier la
polymérisation de l’ADN à l’aide d’une amorce complémentaire à une partie du fragment.
L’élongation de l’amorce est réalisée par la polymérase Taq. Les quatre
désoxyribonucléotides (dATP, dCTP, dGTP et dTTP), marqués par des composés fluorescant
à des longueurs d’onde différentes, sont ajoutés, ainsi qu’en faible concentration, l’un des
quatre didésoxynucléotides (ddATP, ddCTP, ddGTP ou ddTTP). Ces didésoxynucléotides
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
138
jouent le rôle de terminateurs d’élongation : une fois incorporés dans le nouveau brin
synthétisé, ils empêchent la poursuite de l’élongation. On obtient donc des chaînes de
longueurs différentes. La détection des fragments se fait en utilisant un traceur fluorescent
attaché soit à l’oligonucléotide, soit au didésoxyribonucléotide. Une fois la réaction de
séquence terminée, les fragments de différentes tailles sont séparés par électrophorèse
capillaire puis le séquenceur détecte la fluorescence aux différentes longueurs d’ondes
d’émission repérant ainsi les fragments d'ADN et leur taille précise. Le séquenceur permet de
lire les quatre nucléotides en même temps.
II.3.6.2. Méthode de séquençage
- Réactions de séquences
Les réactions de séquence sont réalisées sur les fragments d’ADN purifiés et quantifiés au
nanodrop. La concentration en ADN doit être suffisante pour obtenir une concentration finale
de 5 ng.µl-1 après ajout des réactifs permettant de réaliser les réactions de séquence. Les
réactions de séquence sont effectuées avec le kit BigDye Terminator v1.1. Cycle sequencing
kit (AppliedBiosystems) dans un volume final contenant 4 µL de SRR (réactif contenant
l’enzyme, les dNTP et les ddNTP), 2 µL de TP5x (tampon) et 0,32 µL d’amorce 27f, 1100r
ou 705r (tableau 19) à 10 pmol.l-1. Le volume d’ADN est ajouté de telle façon à avoir une
concentration de 5 ng.µl-1. De l’eau purifiée stérile est ajoutée éventuellement pour compléter
le volume final à 20 µl.
Les étapes des réactions de séquence sont les suivantes : dénaturation initiale à 96 °C pendant
1 min puis 24 fois le cycle suivant : 96 °C pendant 10 s (dénaturation), 50 °C pendant 5 s
(hybridation) et 60 °C pendant 4 min (élongation).
- Purification
Les fragments d’ADN sont ensuite purifiés de la façon suivante afin d’éliminer les
didésoxynucléotides marqués non incorporés :
L’ADN est précipité dans un mélange contenant 50 µl d’éthanol absolu et 2 µl d’acétate de
sodium (3 M) pendant 45 min puis centrifugé pendant 20 min à la vitesse maximale afin
d’obtenir un culot d’ADN. Le surnageant est soigneusement pipeté puis 150 µl d’éthanol
(70 %) est ajouté pour purifier l’ADN. Après centrifugation à vitesse maximale pendant 5 min,
le surnageant est éliminé et les tubes mis à sécher à l’obscurité pour éviter toute dégradation
de l’ADN par les UV.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Matériel et méthodes
139
- Dénaturation
20 µl de formamide est ensuite ajouté à l’ADN afin d’être dénaturé à 96 °C pendant 2 min et
avant passage au séquenceur.
- Séquençage et identification des bactéries
Le séquençage est réalisé sur un séquenceur capillaire (310 Genetic Analyser, Applied
Biosystems) dont le principe est le suivant : les brins d’ADN sont séparés dans le capillaire
contenant un électrolyte. La migration des fragments d’ADN se met en place grâce à
l’application d’un champ électrique et les fragments sont séparés en fonction de leur charge
ionique. Les fragments séparés sont ensuite détectés par spectrométrie UV. Les résultats sont
obtenus grâce au logiciel DNA Sequencing Analysis Software, version 3.7. Les séquences
obtenues pour chaque amorce sont alors assemblées afin d’obtenir la séquence complète grâce
aux logiciels Chromas et Seaview. La séquence complète est alignée avec les bases de
séquences RDP (Ribosomal Database Project, www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) afin de
rechercher le microorganisme présentant la séquence la plus proche et donc l’identité la plus
probable de l’espèce en présence.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
140
III. Résultats et discussion
III.1. Evolution de la densité microbienne au cours de l’incubation
Dans les sédiments de la Marne, le pic de densité microbienne a été atteint après 24 h
d’incubation avec 3,5.108 CFU.g-1 de sédiments secs puis la densité a diminué pour se
stabiliser autour 106 CFU.g-1 de sédiments secs après 3 semaines d’incubation (figure 18a).
Dans les sédiments de la Seine, la densité microbienne a atteint également un pic après 24 h
d’incubation à 108 CFU.g-1 de sédiments secs. Contrairement à l’évolution de densité dans les
sédiments de la Marne, la densité microbienne a diminué le 3ème jour mais a ré-augmenté
après le 5ème jour pour atteindre de nouveau la valeur maximale (figure 18b).
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
1,E+09
0 1 3 5 7 14 21 28
Temps (jours)
CFU
.g-1
séd
imen
ts s
ecs
a) Marne
1,E+00
1,E+01
1,E+02
1,E+03
1,E+04
1,E+05
1,E+06
1,E+07
1,E+08
1,E+09
0 1 3 5 7 14 21 28
Temps (jours)
CFU
.g-1
séd
imen
ts s
ecs
b) Seine
Figure 18 : Evolution de la densité microbienne au cours des incubations des sédiments de Marne et de
Seine avec 0,5 % de glucose
La densité s’est ensuite stabilisée la 1ère et 2ème semaine pour finalement décroître à 8.105
CFU.g-1 de sédiments secs en fin d’incubation. Bien que les sédiments étudiés aient une
structure et des propriétés physico-chimiques différentes, l’évolution de la densité
microbienne suit globalement le même profil dans les deux incubations. Le pic observé après
24 h d’incubation montre que les communautés microbiennes se sont rapidement adaptées aux
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
141
conditions de culture et leur croissance a été dopée par la présence de glucose qui est une
source de carbone facilement accessible et dégradable.
III.2. Evolution de la capacité métabolique
L’utilisation des plaques Biolog permet d’étudier la capacité métabolique des bactéries c’est-
à-dire leur aptitude à dégrader diverses sources de carbone. Une éventuelle modification de
cette capacité métabolique pourrait indiquer une modification de l’équipement enzymatique
au niveau d’une même communauté ou une modification dans la communauté elle-même. Les
sources de carbone de la plaque Biolog sont classées par famille (AES, Biolog). Pour notre
étude, nous ne nous intéresserons qu’ à l’évolution de la capacité de dégration des hydrates de
carbone et en particulier du glucose ainsi qu’à celle des acides organiques.
Dans les sédiments de la Marne, la capacité à dégrader les hydrates de carbone diminue après
une semaine d’incubation pour augmenter ensuite (figure 19a). Il en est de même pour les
acides organiques puisqu’après 1 semaine d’incubation, les microorganismes ne sont plus
capables de dégrader qu’environ 4 % des acides organiques présents. Cependant, cette
capacité augmente de nouveau en fin d’incubation. S’il l’on s’intéresse plus particulièrement
à la dégradation du glucose et des acides organiques produits par fermentation dans les
incubations (acétique, lactique, butyrique et propionique), on observe une corrélation entre la
capacité de dégradation de ces substrats (résultats des Biolog) et leur évolution au cours de
l’incubation (figure 20a, tableau 20). Ainsi, avant incubation, les puits correspondants à ces
substrats sont positifs donc dégradés. Après une semaine d’incubation, les bactéries ne sont
plus capables de dégrader le glucose mais cette aptitude apparaît de nouveau après 2 semaines
d’incubation. Il en est de même pour l’acide lactique. Puisque les bactéries ont dégradé le
glucose en 4 jours d’incubation, on peut supposer qu’elles sont aussi capables de dégrader
l’acide lactique pendant ces 4 jours et qu’elles perdent leur capacité à dégrader le glucose et
l’acide lactique entre le 4ème et le 7ème jour. Les communautés microbiennes sont donc
capables de dégrader l’acide lactique ce qui explique la disparition observée après 4 jours
d’incubation. A l’inverse, les bactéries ne peuvent pas dégrader les acides acétique, butyrique
et propionique pendant toute la durée de l’incubation. Une augmentation de la concentration
en solution de ces acides a effectivement été observée.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices
Résultats et discussion
142
Pourcentage de familles de C dégradées en fonction du temps d'incubation (en semaine) - Marne
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Polysaccharides Amines Hydrates decarbone
Acidesorganiques
Acides aminés Autres
Sources de carbone
Pour
cent
age t0
t1t2t3t4
a) Marne
Pourcentage de familles de C dégradées en fonction du temps d'incubation (en semaine) - Seine
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Polysaccharides Amines Hydrates decarbone
Acidesorganiques
Acides aminés Autres
Sources de carbone
Pour
cent
age t0
t1t2t3t4
b) Seine
Figure 19 : Evolution de la dégradation des sources de carbones dans les sédiments de la Marne (a) et de la Seine (b)
au cours de l’incubation (glucose 0,5 %)
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices
Résultats et discussion
143
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Temps (jours)
Con
cent
ratio
n (m
g.L
-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Conc
entr
atio
n de
glu
cose
et d
'aci
de
buty
rique
(mg.
L-1
)
Acide acétique Acide propioniqueAcide lactique Acide butyriqueGlucose
a)Marne
0
50
100
150
200
250
300
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Temps (jours)
Con
cent
ratio
n (m
g.L
-1)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Con
cent
ratio
n de
glu
cose
et d
'aci
de
buty
rique
(mg.
L-1
)
Acide acétique Acide propioniqueAcide butyrique Glucose
b) Seine Figure 20 : Evolution de la concentration en glucose et acides organiques dans les incubations des sédiments de la Marne et de la Seine (0,5 % de glucose)
Tableau 20 : Capacité des microorganismes des sédiments de la Marne et de la Seine à dégrader le glucose et les acides organiques au cours du temps
Marne Seine Sources de carbone ( N° de puits de la plaque Biolog)
Temps (semaine) Temps (semaine) 0 1 2 3 4 0 1 2 3 4 Glucose (B10) + - + + + + + + + + Acide acétique (E2) + - - - - + - - - - Acide butyrique (E6) + - - - - - - - - - Acide lactique (E11) + - + + + + + + + - Acide propionique (F4) + - - - + + - - - -
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
144
De même que pour la Marne, nous avons étudié la capacité des bactéries de la Seine à
dégrader le glucose et les acides organiques produits par fermentation (figure 20b, tableau 20).
D’une manière générale, la communauté microbienne des sédiments de la Seine dégrade
beaucoup moins de sources de carbone que celle des sédiments de la Marne et ceci quel que
soit le type de substrat carboné (figure 19b), alors que les quantités de bactéries anaérobies
cultivables sont du même ordre.
Les bactéries peuvent dégrader le glucose pendant toute la durée de l’incubation. Les acides
butyrique et propionique sont dégradés avant incubation mais ne le sont plus pendant
l’incubation. Ceci explique donc que leurs concentrations aient augmenté. L’acide acétique
n’est dégradé qu’avant incubation. Cependant, au cours de l’incubation, nous observons une
diminution de la concentration en acide acétique entre le 1er et le 3ème jour d’incubation puis à
nouveau une augmentation. On peut donc supposer que des bactéries ont été capables de
dégrader l’acide acétique en début d’incubation puis ont disparu ou ont adopté une autre voie
métabolique après 1 semaine d’incubation. Enfin, les bactéries sont capables de dégrader
l’acide lactique tout au long de l’incubation. C’est pourquoi il n’a pas été détecté en solution
lors des incubations alors qu’il s’agit d’un produit de fermentation très commun.
Pour les deux types de sédiments, les capacités métaboliques des communautés microbiennes
sont différentes avant l’incubation. En effet, la plupart des sources de carbone sont dégradées
alors qu’elles ne le sont plus après une semaine d’incubation. Une modification de la capacité
métabolique dans les deux sédiments s’est donc produite au cours de la 1ère semaine. L’ajout
de glucose a pu favoriser le développement de bactéries de type fermentaire inhibant les
bactéries dont le métabolisme était de type respiration anaérobie, c’est-à-dire oxydant les
acides organiques, par exemple. L’augmentation du pourcentage d’acides organiques
dégradés en fin d’incubation montre qu’après 4 semaines, les microorganismes utilisent à
nouveau la voie de la respiration anaérobie alors que la voie de la fermentation était
privilégiée en début d’incubation.
Par ailleurs, si l’on étudie les pourcentages de sources de carbones oxydées, on observe des
différences entre les deux sédiments, ce qui laisse penser que les communautés microbiennes
sont différentes.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
145
La modification de la capacité métabolique au cours de l’incubation peut être due soit à une
modification de la population microbienne soit à une modification des voies métaboliques de
ces mêmes communautés. Afin de connaître lequel de ces processus s’est produit dans les
incubations, nous avons étudié l’évolution de la diversité microbienne.
III.3. Evolution de la diversité microbienne
Nous avons comparé les empreintes des bandes d’ADN observées en DGGE en fonction du
temps d’incubation. Chaque bande d’ADN a été numérotée (figure 21). Pour les deux
sédiments, on observe une très grande variation avant et après une semaine d’incubation, ce
qui confirme le fait que la modification de la capacité métabolique est très probablement due à
un changement de communautés. En particulier, de nombreuses bandes d’ADN apparaissent
ou s’intensifient. Ces bandes peuvent donc correspondre à l’apparition de microorganismes de
types bactéries fermentatrices qu’il n’y avait pas ou peu avant l’incubation et qui se sont
développés suite à l’ajout de glucose. Après une semaine d’incubation, on remarque, pour les
deux sédiments, que les empreintes d’ADN ne varient plus ce qui laissent supposer que la
diversité génétique des communautés microbiennes n’a pas varié. Aussi, les changements de
capacité métabolique observés en fin d’incubation et en absence de glucose seraient-ils
probablement dus à une modification des voies métaboliques plutôt qu’à des modifications de
communautés.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
146
1
2
3
456
7
8
10 111213
15
16
17
1 1 11
22
33
3 44
44
5 5
55
66 6
7778
88
9 910
1010
10
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1212 1313
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14 1414
16
1717 17
1
2
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t0 t1 t2 t3 t4
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1212 1313
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t0 t1 t2 t3 t4
a) Marne
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
147
t1 t2 t3 t4
11
2 2 22
3 3 33
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5 5 5 5
66 6 6
7
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12 12 1213 13 13
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11
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66 6 6
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t1 t2 t3 t4
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11
12 12 1213 13 13
14 14 141516 16
b)Seine (remarque : le profil a t0 n’a pas été représenté car inexploitable) Figure 21 : Evolution des profils DGGE au cours de l’incubation (en semaine) des sédiments de Marne (a)
et de Seine (b)
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
148
Afin de déterminer la contribution des différentes voies anaérobies dans la dégradation de la
matière organique, nous avons étudié l’importance des accepteurs d’électrons présents. En
effet, pour oxyder la matière organique en conditions anaérobies, les bactéries utilisent les
accepteurs d’électrons présents dans un ordre bien établi qui dépend de l’apport énergétique
fournit par la réduction de chaque oxydant. Les processus suivant peuvent ainsi se succéder :
dénitrification, réduction du Fe, réduction des sulfates puis méthanogénèse (Reeburgh, 1983).
Jones (1985) estime que la décomposition de la matière organique en système aquatique
résulte de la respiration aérobie (45 %), la méthanogénèse (25 %), la dénitrification (20 %),
des processus de fermentation (7 %), de la réduction des sulfates (2 %) et enfin de la
réduction du fer (1 %).
Nous nous sommes donc intéressés à l’évolution des sulfates et du fer au cours des
incubations, ceci afin de souligner l’importance des bactéries ferri-réductrices dans les
sédiments.
III.4. Importance du fer dans la décomposition de la matière
organique dans les sédiments
III.4.1. Sulfato-réduction
La vitesse de diminution des sulfates est très lente au cours de l’incubation des deux
sédiments (figure 22). De plus, la concentration initiale en sulfates était faible dès le début de
l’incubation dans les deux sédiments (5 mg.l-1). Par conséquent, l’utilisation des sulfates
comme accepteur terminal d’électrons est une voie très minoritaire dans les sédiments. Ceci
d’autant plus que l’utilisation des sulfates intervient après celle des nitrates, du manganèse et
du fer (Reeburgh, 1983). Cependant, bien que la réduction des sulfates soit faible, les sulfures
produits pourraient néanmoins réagir avec les métaux dissous pour former des sulfures
métalliques.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
149
0
1
2
3
4
5
6
7
0 5 10 15 20 25Temps (jours)
Con
cent
ratio
n (m
g.l-1
)
Sulfate-MarneSulfates-Seine
Figure 22 : Evolution des sulfates dans les incubations de la Marne (a) et de la Seine (b)
III.4.2. Réduction du fer
On constate une dissolution croissante du fer dans les sédiments de la Marne au cours de
l’incubation jusqu’à 1600 µg.g-1 de sédiments secs (figure 23). Dans les sédiments de la Seine,
le fer est rapidement dissout durant les 4 premiers jours d’incubation puis se stabilise à partir
du 5ème jour et jusqu’à la fin de l’incubation avec environ 600 µg.g-1 de sédiments secs de fer
désorbé. Le potentiel d’oxydo-réduction étant d’environ -300 mV, une simulation sur Visual
Minteq nous indique qu’environ 99 % du fer est sous forme de Fe(II) donc quasiment réduit
en totalité.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
150
0
200
400
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0 2 4 6 8 10 12
Temps (jours)
Tene
urs
déso
rbée
s (µ
g.g
-1 s
édim
ents
sec
s)
Fe-MarneFe-Seine
Figure 23 : Evolution des teneurs en Fe désorbé (µg.g-1 sédiments secs) dans les sédiments de la Seine et de
la Marne
Dans nos sédiments, le fer est donc l’accepteur d’électrons majoritaire lors de la dégradation
de la matière organique.
III.5. Estimation des populations microbiennes majoritaires
Dans ce volet, nous avons donc tenté d’estimer par le calcul, la biomasse formée et impliquée
dans les principales réactions cataboliques identifiées, de façon à mettre en évidence
l’importance de certaines voies métaboliques et qui pourraient jouer dans la mobilité des
métaux. Un intérêt particulier a été donné à la réduction du fer.
Pour ce faire, nous nous sommes basés sur le modèle proposé par (Dassonville et al., 2004a;
Dassonville et al., 2004b). Ce modèle prend en compte six communautés microbiennes
fonctionnelles classées en fonction de leur activité catabolique : les bactéries dénitrifiantes, les
ferri-réductrices, deux communautés fermentatrices produisant soit de l’acétate et de l’éthanol
ou du butyrate, les bactéries acétogènes et les sulfato-réductrices. Ce modèle permet
d’estimer la biomasse microbienne en fonction de l’énergie produite (ATP) par mole de
substrat consommé et de la biomasse produite par mole d’ATP produite selon l’équation :
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
151
Bm = ([S].Vw.YATP.Ybm/ms) . eN
avec
Bm = biomasse estimée (g.kg-1 de sol ou sédiment)
[S] = quantité de substrat consommé par m3 de solution,
Vw = volume de la solution (m3),
YATP = ATP par mole de substrat consommé (mole ATP.mol-1 de substrat)
Ybm = biomasse produite par mole d’ATP produite (g de biomasse.mol-1 d’ATP)
ms = masse de sol ou sédiments (kg)
eN = 50 ou 100 % si l’on considère la dépense en énergie pour la fixation de l’azote par les
microorganismes.
Pour utiliser ce modèle, les données obtenues après 2 jours d’incubation ont été utilisées car
nous avions toutes les données disponibles en glucose, acide acétique, butyrique, sulfate et fer
(tableau 21). Par ailleurs, après deux jours d’incubation, la dégradation du glucose atteint une
vitesse maximale, ce qui nous permet de mieux évaluer les voies fermentaires ainsi que les
principaux accepteurs d’électrons.
Tableau 21 : Concentrations en glucose, sulfates, fer dissous, acide butyrique et acétique (en mg.l-1)
utilisées pour modéliser l’importance des communautés microbiennes
Temps (jours)
Glucose Sulfates Fe Acide butyrique Acide acétique
0 5533 5,7 0 0 0 Marne 2 2210 3,4 59 130 222 0 5777 3,5 0 0 0 Seine 2 1515 2,4 29 864 120
Etant donnée l’évolution faible des nitrates au cours du temps dans les sédiments de la Marne,
nous avons choisi de ne pas les inclure dans le modèle.
Ce modèle nous a permis d’estimer la biomasse maximale de chacune des six communautés
microbiennes au cours de l’incubation. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau 22.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-réductrices
Résultats et discussion
152
Tableau 22 : Estimation de la biomasse des différentes communautés microbiennes fonctionnelles dans les sédiments de la Marne et de la Seine
Voie métabolique ATP par mole de substrat consommé Biomasse par mole d'ATP produite Ybm (g biomasse par mole d'ATP consommée)
Substrat consommé S (mol.m-3)
Biomasse estimée (50% d'efficacité) g.kg-1 de sédiment
Biomasse estimée (100% d'efficacité) g.kg-1 de sédiment
Réduction du Fe(III) 4 (Lovley, 1995) 6,5 1,06 0,10 0,21 Fermentation acétique 3 (Pelmont, 1993) 12 3,70 0,50 1,00 Fermentation butyrique 3 (Pelmont, 1993) 12 1,48 0,20 0,40
Marne
Réduction des sulfates 0,5 (Widdel, 1988) 6,5 0,02 2,92E-04 5,84E-04
Réduction du Fe(III) 4 (Lovley, 1995) 6,5 0,52 5,07E-02 1,01E-01 Fermentation acétique 3 (Pelmont, 1993) 12 2,00 0,27 0,54 Fermentation butyrique 3 (Pelmont, 1993) 12 9,77 1,32 2,64
Seine
Réduction des sulfates 0,5 (Widdel, 1988) 6,5 0,01 1,40E-04 2,79E-04
(Widdel, 1988; Pelmont, 1993; Lovley, 1995)
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
153
Dans les sédiments de la Marne, après deux jours d’incubation et au cours de la fermentation
du glucose, les bactéries fermentant le glucose en acide acétique et butyrique sont majoritaires.
La fermentation acétique prédomine sur la fermentation butyrique si l’on considère la quantité
de biomasse formée. Les bactéries ferri-réductrices sont prépondérantes devant les bactéries
sulfato-réductrices. L’accepteur d’électrons au cours de la fermentation du glucose est donc
majoritairement le fer devant les sulfates.
Dans les sédiments de la Seine, les résultats sont similaires. Les bactéries fermentatrices de
glucose prédominent, ce qui confirme les suppositions que nous avions émises dans le sous-
chapitre précédent. Cependant, contrairement aux sédiments de la Marne, les bactéries
fermentant le glucose en acide butyrique sont majoritaires. La biomasse réduisant le fer est
plus faible dans les sédiments de la Seine que de la Marne après 2 jours d’incubation, ce qui
résulte des concentrations en fer dissous plus faibles dans les essais avec les sédiments de la
Seine (figure 23) ; les communautés ferri-réductrices semblent donc moins nombreuses dans
les sédiments de la Marne. Une autre explication serait également que les teneurs en fer et la
nature des oxydes de fer sont différentes dans les deux sédiments, les oxydes de fer amorphes
étant plus facilement réduits par les bactéries ferri-réductrices que les oxydes de fer
cristallisés. La biomasse réduisant les sulfates est très faible (1,4.10-4 g.kg-1 de sédiment) : les
sulfates jouent donc un rôle très faible comme accepteurs d’électrons lors de l’oxydation de la
matière organique.
Contrairement à ce qui est rapporté dans la littérature (Jones, 1985), l’oxydation du glucose
résulte très peu de la dénitrification et de la réduction des sulfates dans les sédiments. Au
contraire, il semble que dans notre cas, la fermentation du glucose avec réduction du fer
prédomine. La fermentation du glucose serait donc couplée à la réduction dissimilatrice des
oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrice selon le modèle (Lovley, 1991):
Substrat fermentable (glucose) → ne- + nH+ + produits de fermentation (acide butyrique,
acétique…)
e- + Fe(OH)3 + 3H+ → Fe2+ + 3 H2O
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
154
Dans les sédiments, la fermentation du glucose entraîne la formation des acides acétique et
butyrique que les bactéries présentes sont peu capables de dégrader, d’après les résultats
obtenus lors de l’analyse de la capacité métabolique.
Tous ces résultats semblent souligner l’importance et la prédominance des bactéries ferri-
réductrices dans les incubations. C’est pourquoi, nous avons tenté de les isoler et de les
identifier.
III.6. Identification des bactéries ferri-réductrices
Sur l’ensemble des bactéries ayant poussé et s’étant avérées comme ferri-réductrices, 48
bactéries ont été isolées et identifiées. 72 % de ces 48 bactéries ferri-réductrices appartiennent
à l’espèce Clostridium butyricum (97-99 % de probabilité), 16 % à l’espèce Paenibacillus
polymyxa (96-98 % de probabilité), 4 % à l’espèce Bacillus thurigiensis, cereus ou anthracis
(97-99 % de probabilité) et 2 % à l’espèce Bacillus subtilis (94 % de probabilité).
Dans les sédiments de la Seine, peu de bactéries ferri-réductrices ont poussé contrairement
aux sédiments de la Marne. Néanmoins, les expérimentations entreprises ont montré que les
quelques colonies ayant pu être identifiées appartenaient toutes à l’espèce Clostridium
butyricum.
Les performances ferri-réductrices de Clostridium butyricum ont été décrites dans la
littérature (Lovley, 1991 ; Bousserrhine, 1995). Il s’agit d’une bactérie hétérotrophe dont le
métabolisme est de type fermentaire avec réduction dissimilatrice du fer (Bousserrhine, 1995 ;
Munch et Ottow, 1983). On la rencontre dans la plupart des milieux environnementaux tels
que les sédiments de rivières (Lovley et Phillips, 1986) ou les sols ferralitiques (Bousserrhine,
1995). Cette espèce présente la propriété de réduire plus facilement les oxydes de fer
amorphes que cristallins (Munch et Ottow, 1980).
Les propriétés ferri-réductrices de Paenibacillus polymyxa ont été décrites pour la première
fois par Roberts (1947). Il s’agit d’une bactérie présente dans les sols et sédiments. En
présence de fer, P. polymyxa oxyde plus de glucose qu’en son absence (Roberts, 1947). De
même que pour C. butyricum, P. polymyxa réduit préférentiellement les oxydes de fer
amorphes (Ehrlich, 1990) lorsque le glucose joue le rôle de donneur d’électrons.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Résultats et discussion
155
Bacillus cereus et Bacillus subtilis ont été décrites comme ferri-réductrices et isolées dans des
sols glaiseux (Ottow et Glathe, 1971). Cependant ces bactéries sont plus connues pour leur
réduction des nitrates que du fer (Ottow et Glathe, 1971; Nakano et Zuber, 1998). Aussi, leur
activité ferri-réductrice dans les sédiments est-elle sans doute limitée par rapport aux activités
ferri-réductrices de C. butyricum et P. polymyxa.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Conclusions et perspectives
156
IV. Conclusions et perspectives
Le premier chapitre de cette étude a montré une solubilisation des éléments métalliques au
cours de l’incubation des sédiments de la Marne et de la Seine en présence de glucose. En
particulier, la dissolution du fer semble être corrélée à celle d’autres éléments traces
métalliques. Parallèlement, les microorganismes fermentent le glucose avec la production
d’acides organiques. Nous avons alors supposé que la dissolution des ETM était
probablement liée à la présence de bactéries ferri-réductrices qui, lors de la fermentation du
glucose, réduisaient les oxydes de fer, ceux-ci jouant le rôle d’accepteur terminal d’électrons.
La réduction de ces oxydes entraînait donc la dissolution des ETM y étant adsorbés.
L’objectif de ce deuxième chapitre était donc d’étudier plus précisément les communautés
microbiennes présentes dans les sédiments au cours de l’incubation, de façon à montrer que
les bactéries réalisant la fermentation avec réduction dissimilatrice du fer étaient majoritaires
ainsi que de les identifier. Nous avons donc étudié très précisément leur métabolisme et les
avons caractérisés d’un point de vue génétique.
L’étude métabolique et génétique a révélé une modification de population lors de la première
semaine d’incubation, très probablement liée à l’ajout de glucose. La diversité génétique des
communautés microbiennes semble ensuite n’avoir pas varié durant les 4 semaines
d’incubation. Au cours de la première semaine d’incubation, les microorganismes ont oxydé
le glucose par voie fermentaire mais ont été incapables d’oxyder les acides organiques
produits par fermentation, en particulier les acides acétique et butyrique. Après 4 semaines,
d’incubation, les microorganismes ont été à nouveau capables d’oxyder ces acides organiques
en mettant en place la respiration anaérobie.
L’analyse des sulfates au cours de l’incubation a montré que la sulfato-réduction était un
processus minoritaire dans les sédiments. Par conséquent, les sulfates ne sont pas utilisés
comme accepteurs terminaux d’électrons.
Inversement, les teneurs désorbées en fer sont très importantes et le fer est pratiquement sous
forme réduite. Le fer est donc bien utilisé comme accepteur terminal d’électrons lors de la
fermentation du glucose. Ces résultats ont également la présence de bactéries ferri-réductrices.
Chapitre 2 : Métabolisme et diversité génétique des microorganismes : importance des bactéries ferri-
réductrices
Conclusions et perspectives
157
Les bactéries ferri-réductrices identifiées dans les sédiments de la Marne sont majoritairement
Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa, bactéries connues pour fermenter la
matière organique, et en particulier le glucose, avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer,
en particulier les oxydes de fer amorphes.
Il est intéressant de noter que malgré le fait que les sédiments soient complètement différents
d’un point de vue physico-chimique, les phénomènes observés aux niveaux cataboliques et
génétiques sont similaires.
Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa sont les principales bactéries impliquées
dans la fermentation du glucose et la réduction des oxydes. Lors des incubations, nous avons
observé une diminution du pH et la production d’acides organiques. Il nous faut à présent
savoir si la mobilité des ETM est liée à un contact direct entre bactéries et oxydes de fer ou si
l’acidification du milieu et la présence des oxydes organiques suffisent à entraîner une
dissolution des ETM.
Partie 2 : Comparaison des mécanismes chimiques et microbiologiques dans la mobilité des ETM
158
Partie 2 : Comparaison des mécanismes microbiologiques et
chimiques dans la mobilité des éléments traces métalliques
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
159
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des
éléments traces métalliques
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Introduction
160
I. Introduction
Les travaux réalisés dans le chapitre précédent ont mis en évidence une mobilité des éléments
traces métalliques et du fer dans les sédiments de Seine et de Marne, liée à la présence de
bactéries fermentatrices réduisant les oxydes de fer. En particulier, nous avons mis en
évidence la présence de deux bactéries ferri-réductrices majoritaires, Clostridium butyricum et
Paenibacillus polymyxa. Ce processus de réduction bactérienne a déjà été décrit dans la
littérature comme étant un mécanisme microbiologique clé dans les sols en conditions
anaérobie (Lovley, 1987; Lovley et Phillips, 1988; Coates et al., 1998; Chen et al., 2003).
L’objectif de ce chapitre est d’étudier précisément l’impact de l’une de ces bactéries ferri-
réductrices, Paenibacillus polymyxa, sur la mobilité des éléments métalliques. Nous nous
sommes intéressés à son métabolisme ainsi qu’aux différentes fractions du sédiment porteuses
d’éléments métalliques concernées par son action solubilisatrice. En particulier, nous avons
cherché à savoir si l’attaque des différentes phases porteuses de métaux se faisait
simultanément ou bien par étape. En effet, la plupart des études portant sur l’impact des
bactéries sur la mobilité des métaux dans les sédiments s’intéresse uniquement à la répartition
des éléments métalliques avant et après incubation (Chartier et al., 2001) mais ne se focalise
pas sur l’aspect cinétique. Or, il se peut que les oxydes de fer soient réduits après la
dissolution de la fraction échangeable ou carbonatée, par exemple.
De plus, la littérature rapporte que les bactéries ferri-réductrices réduisent plus facilement les
oxydes de fer amorphes que cristallisés (Munch et Ottow, 1980 ; Rajot, 1992 ; Bousserrhine,
1995). Nous avons également donc cherché à mettre en évidence l’impact de P. polymyxa sur
les différents types d’oxydes de fer.
Afin d’atteindre nos objectifs, des sédiments stériles ont été incubés dans un milieu de culture
et ensemencés avec P. polymyxa.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
161
II. Matériel et méthodes
II.1. Caractéristiques des sédiments étudiés
Les sédiments étudiés sont ceux de la Marne, prélevés en mai 2006 au même endroit qu’en
novembre 2005, à Méry-sur-Marne. Les caractéristiques physico-chimiques et les teneurs
totales en métaux sont assez proches de celles des sédiments prélevés en novembre 2005
(tableaux 23 et 24). Les sédiments de la Seine n’ont pas été étudiés car les échantillons
prélevés en mai 2006 à Andrésy présentaient des caractéristiques complètement différentes de
celles prélevées en novembre 2005. En particulier, si les sédiments présentaient une texture de
sable grossier en novembre 2005, les sédiments de mai 2006 étaient majoritairement
constitués de feuilles et autres matières organiques grossières. Aussi, pour des raisons de
comparaison avec les expériences effectuées précédemment, nous sommes-nous attachés à ne
travailler que sur les sédiments de la Marne. Tableau 23 : Caractéristiques physico-chimiques des sédiments de Marne (mai 2006)
Paramètres Marne (mai 2006) Méthode Physiques Granulométrie (g.kg-1) NF X 31-107 Argile (<2 µm) 203 Limons fins (2/20 µm) 194 Limons grossiers (20/50 µm) 206 Sable fin (50/200 µm) 310 Sable grossier (200/2000 µm) 60 Chimiques pH 8.1 NF ISO 10390 Carbone organique (g.kg-1) 24 C/N 11.2 Matière organique (g.kg-1) 41.5
NF ISO 10694 NF ISO 13878
CEC (cmol+.kg-1) 9.91 NF X 31-130
Tableau 24 : Teneurs en métaux totaux (µg.g-1 de sédiments secs) dans les sédiments de la Marne
(mai 2006)
Ag Al Cd Co Cr Cu Fe Mn Ni Pb Sr Zn Moyenne 0.54 5272 0.68 5.1 32 26 11700 325 15 15 100 68 Ecart-type 0.20 3252 0.41 0.6 2 3 950 43 1 1 88 10
II.2. Incubation des sédiments
II.2.1. Stérilisation des sédiments
Avant d’être incubés avec P. polymyxa les sédiments ont été stérilisés par autoclavage selon la
méthode suivante :
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
162
- 40 g de sédiments humides sont autoclavés à 120 °C pendant 20 min dans un flacon
sérum de 500 ml,
- après refroidissement, le flacon est dégazé à l’azote,
- le flacon est mis à incuber à 28 °C pendant 24 h afin de faire pousser les germes qui
auraient résisté à l’autoclave,
- après 24 h, le CO2 est à nouveau mesuré. Si la concentration en CO2 n’est pas nulle,
les sédiments sont autoclavés à nouveau et les étapes 2 à 4 sont ré-effectuées.
Afin de stériliser totalement les sédiments, trois cycles d’autoclavage ont été nécessaires.
II.2.2. Préparation de l’inoculum et ensemencement de Paenibacillus
polymyxa
L’ensemencement de P.polymyxa est réalisé avec une suspension bactérienne de 107
cellules.ml-1 de milieu de culture, concentration habituellement utilisée pour permettre une
bonne adaptation et donc une bonne croissance dans le milieu. La suspension bactérienne a
été préparée dans de l’eau physiologique et calibrée après dénombrement microscopique sur
cellule de Malassez.
II.2.3. Incubation
L’incubation de 40 g de sédiments stériles avec 300 ml de milieu de culture (0,5 % de glucose
+ 0,15 g.l-1 de levure) est réalisée dans des flacons sérums. L’expérimentation démarre avec
l’ajout des bactéries ferri-réductrices. Après dégazage à l’azote, les flacons sont incubés à 28
°C pendant 10 jours. Les incubations sont réalisées en triplicat.
Des blancs en triplicat contenant le sédiment mais sans ajout de bactéries ont été incubés dans
les mêmes conditions que les sédiments ensemencés.
II.3. Suivi de la croissance microbienne
La croissance microbienne a été suivie en analysant le CO2 ainsi que le métabolisme carboné
(glucose, acides organiques, pH). Les méthodes d’analyse des paramètres suivis ont été
décrites précédemment (chapitre 1, matériels et méthodes). Par ailleurs, après incubation,
nous avons vérifié que les souches de bactéries étaient restées pures en les isolant, en les
purifiant puis en les identifiant par des techniques moléculaires, selon les méthodes de culture
et de séquençage des bactéries ferri-réductrices décrites précédemment (chapitre 2, matériels
et méthodes).
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
163
II.4. Suivi de la mobilité des éléments métalliques
Au cours de l’incubation, les métaux dissous ont été analysés suivant le protocole décrit dans
le chapitre 1, matériels et méthodes.
Nous avons également réalisé une extraction séquentielle afin de savoir quel type d’oxydes de
fer (amorphe ou cristallin) ont été attaqués, en mettant en oeuvre trois méthodes d’extraction
séquentielle (Kostka et Luther III, 1994; Arunachalam et al., 1996; Krasnodebska-Ostrega et
al., 2001). L’objectif de cette extraction est de savoir si P. polymyxa s’attaque
préférentiellement à un type d’oxyde de fer. Différents auteurs ont en effet rapporté des
attaques différentielles des oxydes amorphes ou cristallisés par les bactéries ferri-réductrices
(Munch et Ottow, 1980 ; Rajot, 1992 ; Bousserrhine, 1995).
- Discussion du choix du protocole d’extraction :
Les protocoles d’extractions séquentielles ont toujours fait l’objet de nombreuses polémiques
quant à leur spécifité d’attaque et les réadsorptions possibles de métaux (Xiao-Quan et Bin,
1993; Li et al., 2001; Baeyens et al., 2003). En particulier, les réactifs utilisés ne s’attaquent
pas vraiment à une fraction minéralogique spécifique (ex : oxyde de manganèse ou oxydes de
fer) mais à l’ensemble des fractions minéralogiques réagissant à des conditions physico-
chimiques (ex : baisse du pH ou conditions oxydantes ou réductrices). C’est pourquoi, dans de
nombreux protocoles, sont indiquées phase échangeable, acido-soluble, réductible, oxydable
et résiduelle. Etant donné notre objectif, nous avons choisi d’employer un protocole utilisant
des réactifs permettant de distinguer les fractions minéralogiques correspondant aux phases
réductibles, c’est-à-dire les oxydes de manganèse, les oxydes de fer amorphes et cristallisés.
Dans leur protocole permettant de distinguer oxydes de fer amorphes et réductibles, Kostka et
Luther III (1994) ont montré que l’utilisation du dithionite attaquait entièrement les oxydes de
Fe (III) cristallisés et que l’ascorbate s’attaquait uniquement aux oxydes de fer amorphes alors
que les autres réactifs couramment utilisés tels que l’oxalate détruisait les deux types
d’oxydes. Par ailleurs, Krasnodebska-Ostrega et al (2001) ont montré que l’augmentation de
la concentration en hydroxylamine acidifiée n’avait pas d’influence sur le taux d’oxydes de
manganèse dissous. Cependant, une augmentation de la durée de contact pouvait commencer
à dissoudre les oxydes de fer. Les conditions optimales pour dissoudre les oxydes de
manganèse étaient donc d’utiliser de l’hydroxylamine (0,05 M) acidifiée avec de l’acide
nitrique à pH 2 et en contact avec le sédiment pendant 30 min, ce qui permettait de solubiliser
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
164
entre 70 et 80 % des oxydes de Mn. Dans le protocole d’Arunchalam et al (1996), l’acétate
d’ammonium est dilué 100 fois par rapport aux protocoles habituellement utilisés (Kersten et
Förstner, 1987; Chester et al., 1988). Arunchalam et al (1996) ont constaté que de diluer 100
fois l’acétate d’ammonium entraînait une diminution de 2 à 16 fois, les concentrations en
métaux échangeables. Nous avons donc conservé la concentration habituellement utilisée qui
est de 1 mol.l-1.
Dans notre étude, l’extraction séquentielle a été réalisée sur 400 mg de sédiments humides
avec un volume de réactif de 20 ml pour chaque étape. Toutes les étapes ont été réalisées sous
flux d’azote dans une boîte à gants afin de préserver les conditions anaérobies et éviter toute
réoxydation. De plus, tous les réactifs ont été préalablement dégazés à l’azote. A la fin de
chaque étape, les tubes de réaction ont été centrifugés à 20000 tours par min pendant 10 min,
puis le surnageant a été récupéré, filtré à 0,45 µm et acidifié avant analyse par ICP-AES et
ICP-MS.
Le protocole de chaque phase analysée est résumé dans le tableau 25.
Tableau 25 : Résumé des différentes étapes de l’extraction séquentielle (oxydes de Fe amorphes/cristallins)
Phase Réactif Protocole
Echangeable Acétate d’ammonium (1 M), pH 7 Agitation à 200 tr.min-1 sur table d’agitation pendant 1 h
« Carbonatée » ou phase acido-soluble
Acide acétique (0,1 M), pH 3,5 Idem
« Oxydes de manganèse » ou phase réductible 1
Chlorure d’hydroxylamine (0,05 M), pH 2
Idem pendant 30 min
« Oxydes de fer amorphe » (selon méthode de Ferdelman) ou phase réductible 2
10 g de citrate de sodium, 10 g de bicarbonate de sodium dans 200 ml d’eau ultrapure. Après dégazage, ajout de 4 g d’acide ascorbique
Agitation à 125 tr.min-1 pendant 24 h
« Oxydes de fer cristallin » ou phase réductible 3
0,5 g de dithionite de sodium Chauffage à 60 °C pendant 4 h avec agitation à 125 tr.min-1
« Matières organiques/sulfures » ou phase organique
1) 6 ml de H2O2 (30 %) + 20 ml de HNO3 (65 %). 2) Après refroidissement, 10 ml d’acétate d’ammonium (1 M), pH 7
1) Chauffage à 90 °C pendant 1h30 avec agitation de temps en temps puis refroidissement à température ambiante 2) idem 1)
« Résiduelle » (terme opérationnel puisqu’il reste encore quelques particules de sédiments après traitement)
1) 6 ml d’HNO3(65 %) 2) idem 1) 3) après refroidissement, ajout de 6 ml d’eau ultrapure
1) chauffage à 90 °C pendant 1h30 2) idem 1)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
165
III. Résultats et discussion
III.1. Métabolisme de Paenibacillus polymyxa
Les résultats obtenus montrent que le glucose introduit à 5 g.l-1 est totalement consommé par
Paenibacillus polymyxa en 6 jours (figure 24). Cette consommation s’accompagne de la
production d’acides lactique, acétique et succinique. Les variations des concentrations des
acides lactique et succinique sont similaires avec une très forte augmentation durant les 2
premiers jours, atteignant un maximum de 43 et 32 mgC, respectivement. Puis entre le 3ème et
le 6ème jour d’incubation, les quantités d’acides présents diminuent fortement pour se
stabiliser à partir du 6ème jour à 10 et 8 mgC, respectivement. L’acide acétique est produit en
moindre quantité par rapport aux acides précédents avec une quantité maximale de C de 11mg
qui est atteinte après 4 jours d’incubation. Une stabilisation est ensuite observée. On remarque
que la quantité totale de carbone inorganique (CO2 + H2CO3 + HCO3-) produit est très forte et
augmente régulièrement au cours de l’incubation pour se stabiliser vers la fin à 365 mg. Dans
les blancs, nous n’avons observé qu’une très faible augmentation du dioxyde de carbone (0,35
µgC) et aucune production d’acides organiques.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps (jours)
m C
(mg)
0
100
200
300
400
500
600
m C
gluc
ose
(mg)
Cinorg acide lactique Acide acétique Acide succinique Glucose
Figure 24 : Consommation de glucose et production d’acides organiques au cours de l’incubation de
P.polymyxa (barres d’erreur = écart-types des 3 réplicats)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
166
Le bilan de carbone au cours de l’incubation est résumé dans le tableau 26. Tableau 26 : Masse de C produite (mg) ou disparue pendant l’incubation de P. polymyxa
Temps (jours)
Cinorg glucose lactique acétique succinique Total (Cinorg + Cacides)
0 0 510 0 0 0 0 1 34 333 24,32 3,04 3,49 64 2 65 171 43,19 6,89 31,98 146 3 252 103 36,67 8,32 27,96 324 4 341 8 27,25 10,89 17,70 395 6 360 3 13,45 10 8,29 391 8 360 0 10,89 8,92 8,14 388
Le glucose est transformé majoritairement en métabolites organiques comme les acides
lactique, acétique et succinique mais des alcools sont aussi très probablement formés, ainsi
qu’une augmentation de la masse microbienne. En effet, en mettant en culture des souches de
P. polymyxa dans un milieu contenant du glucose, Marwoto et al. (2004) ont montré une
transformation du glucose en (R,R)-2,3-butanediol, d’éthanol, d’acétate, d’acétoine, de lactate,
formate, succinate, CO2 et de masse microbienne (tableau 27). Les acides obtenus dans notre
incubation correspondent donc bien à ceux normalement produits par cette bactérie. De plus,
la faible quantité d’acide acétique produite est également retrouvée dans leur étude puisque
après ajout de 36 g.l-1 de glucose, 1,8 g.l-1 d’acide lactique et 2,36 g.l-1 d’acide succinique ont
été produits contre 0,12 g.l-1 d’acide acétique. Dans les incubations, après ajout de 5 g.l-1 de
glucose, P. polymyxa a produit environ 0,45 g.l-1 d’acide lactique, 0,300 g.l-1 d’acide
succinique et 0,140 g.l-1 d’acide acétique.
Tableau 27 : Comparaison des bilans en carbone obtenus après consommation du glucose par P. polymyxa
Concentration (g.l-1) (Marwoto et al, 2004)
Notre étude (g.l-1)
Glucose introduit 36 5 Glucose consommé 32,4 5 (R-R)-2,3-butanediol 9,09 Ethanol 5,70 Acide acétique 0,12 0,14 Acétoïne 3 Acide lactique 1,80 0,45 Acide formique 2,25 Acide succinique 2,36 0,30 H2 0,15 CO2 8,39 1,25 Biomasse formée 1,8
Parallèlement, une acidification du milieu se produit durant les trois premiers jours, le pH
passant de 8,1 à 6,0 en 3 jours puis le pH remonte pour se stabiliser à 6,3 à partir du 6ème jour
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
167
(figure 25). Dans les blancs, le pH est resté relativement stable avec une valeur de 7,5 en fin
d’incubation.
5
5,5
6
6,5
7
7,5
8
8,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Temps (jours)
pH
Figure 25 : Evolution du pH au cours de l’incubation en présence de P. polymyxa (barres d’erreur = écart-
types des 3 réplicats)
La chute de pH observée dans les incubations est due à la fermentation du glucose et
notamment à la production des acides organiques. En effet, dans une autre étude, des cultures
de P. polymyxa en milieu Bromfield liquide enrichi en glucose et sans carbonate de calcium
ont conduit à une chute du pH dans le milieu de 7 à 4,5 (Lefebvre-Drouet et Rousseau, 1995).
Dans les incubations, une partie de la quantité de protons produite est neutralisée par la
capacité tampon du sédiment ce qui permet au pH de remonter et de se maintenir à une valeur
stable en fin d’incubation.
Les caractéristiques physico-chimiques des blancs n’ayant pas varié pendant l’incubation,
nous déduisons que les résultats obtenus sont uniquement dus à l’activité de P. polymyxa. La
vérification de la pureté des souches après incubation, par culture et par voie moléculaire, a
confirmé qu’il s’agissait bien de souches de P. polymyxa.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
168
III.2. Mobilité des éléments métalliques au cours de l’incubation
III.2.1. Eléments métalliques dissous
Les éléments métalliques dissous peuvent être classés en trois groupes. Le 1er groupe
comprend les éléments dont les teneurs extraites en solution sont les plus importantes, c’est-à-
dire le fer, le manganèse et le strontium et que nous appellerons Eléments Métalliques
Majeurs (EMM) (figure 26). Le 2ème groupe rassemble les ETM dont les teneurs extraites en
solution sont plus faibles et qui augmentent au cours de l’incubation, soit le cobalt, le chrome,
le nickel et le plomb (figure 27). Enfin, le 3ème groupe comprend les ETM dont les teneurs
extraites évoluent faiblement ou peu (figure 28).
En présence de P. polymyxa, les quantités de fer et de manganèse extraites sont importantes
durant les 4 premiers jours et atteignent environ 400 µg.g-1 de sédiments secs et 60 µg.g-1 de
sédiments secs, respectivement (figure 26) On remarque néanmoins une légère baisse du Fe et
Mn en solution en fin d’incubation, qui pourrait être due à une précipitation, notamment sous
forme de sulfures (Fakih, 2004). La vitesse de solubilisation du strontium est plus faible mais
les teneurs extraites se stabilisent également au bout du 4ème jour d’incubation. Les teneurs
extraites dans les blancs en Fe, Mn et Sr sont très faibles comparées à celles extraites dans les
incubations avec respectivement 1,97 ± 0,41, 2,32 ± 0,64 et 1,59 ± 0,24 µg.g-1 de sédiments
secs après 8 jours d’incubation.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0 2 4 6 8 10
Temps (jours)
Tene
urs
extr
aite
s (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts
secs
)
0
100
200
300
400
500
600
Tene
urs
extra
ites
en F
e (µ
g.g-
1 de
sé
dim
ents
sec
s)
MnSrFe
Figure 26 : Dissolution du Fe, Mn et Sr au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres d’erreur =
écart-types des 3 réplicats)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
169
Le nickel et le cobalt sont les deux éléments du second groupe dont les vitesses de
solubilisation sont les plus importantes (figure 27). Les teneurs extraites en cobalt se
stabilisent après 4 jours d’incubation à 0,35 µg.g-1 de sédiments secs pour légèrement
diminuer en fin d’incubation ; le nickel se stabilise après 6 jours à 0,37 µg.g-1 de sédiments
secs. Les teneurs extraites en Cr et Pb sont beaucoup plus faibles avec un maximum de 0,05
µg.g-1 de sédiments secs atteint après 4 jours d’incubation pour ces deux éléments. On
remarque une remontée significative du chrome à 0,9 µg.g-1 de sédiments secs en fin
d’incubation dans les trois réplicats. Les teneurs extraites dans les blancs après 8 jours
d’incubation pour le Co, Cr, Ni et Pb sont respectivement de 0,025 ± 0,002 ; 0,064 ± 0,001 ;
0,20 ± 0,01 et 0,019 ± 0,003 µg.g-1 de sédiments secs. On remarque que les teneurs en Cr
extraites sont proches de celles obtenues lors de l’extraction avec P. polymyxa.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
0,45
0 2 4 6 8 10
Temps (jours)
Tene
urs
extra
ites
(µg.
g-1
de s
édim
ents
sec
s)
CoCrNiPb
Figure 27 : Dissolution du Co, Cr, Ni et Pb au cours de l’incubation avec P. polymyxa (barres d’erreur =
écart-types des 3 réplicats)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
170
Les teneurs extraites en Ag et Cu diminuent au cours de l’incubation et celles du Cd restent
stables. Cependant, les écarts-types étant importants, il est difficile d’interpréter les variations
de teneurs extraites de ces ETM au cours de l’incubation. De plus, les teneurs extraites dans
les blancs en Ag, Cd et Cu après 8 jours d’incubation sont respectivement de 0,001 ± 0,001 ;
(3,12 ± 0,56).10-4 et 0,15 ± 0,03 µg.g-1 de sédiments secs. Ces teneurs sont proches de celles
obtenues au cours de l’incubation avec P. polyxmya et nous pouvons supposer que celle-ci
n’aura qu’une très faible influence sur la dissolution de ces ETM.
0
0,0005
0,001
0,0015
0,002
0,0025
0,003
0 2 4 6 8 10
Temps (jours)
Tene
urs
extra
ites
(µg.
g-1
de s
édim
ents
se
cs)
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Tene
urs
extr
aite
s en
Cu
(µg.
g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
AgCdCu
Figure 28 : Dissolution de l’Ag, Cd et Cu au cours de l’incubation avec P. polyxmyxa (barres d’erreur =
écart-types des 3 réplicats)
Nous pouvons constater une diminution de certains métaux dissous en fin d’incubation
notamment pour le Fe, le Mn et le Co. Or, nous avons pu observer une très forte production
de carbone inorganique et notamment de CO2 dissous. Aussi, les métaux ont-ils pu précipiter
sous forme de carbonates. Nous avons donc réalisé un calcul des indices de saturation (log
(produit des activités ioniques / Ks)) des minéraux métallo-carbonatés sur Visual Minteq à
partir des concentrations de métaux dissous et de carbonates à pH 6 (annexe 10).
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
171
Tableau 28 : Calcul des indice de saturation des minéraux métallo-carbonatés à pH 6 par Visual Minteq
Minéral Index de saturation (log)
Ag2CO3 -14 Aragonite (CaCO3) -1 Artinite (Mg2CO3(OH)2) - 3H2O -11 Azurite (Cu(OH)2, 2CuCO3) -7 CaCO3,H2O -2 Calcite (CaCO3) -1 Cerrusite (PbCO3) -2 CoCO3 -1 CuCO3 -2 Dolomite (disordered) (CaMg(CO3)2) -3 Dolomite (ordered) (CaMg(CO3)2) -2 Huntite CaMg3(CO3)4 -9 Hydrocerusite Pb3(CO3)2(OH) -8 Hydromagnesite Mg5(CO3)4(OH)2·4(H2O)
-23
Hydrozincite Zn5(CO3)2(OH)6 -15 Magnesite (MgCO3) -2 Malachite Cu2(CO3)(OH)2 -4 MgCO3, 5H2O -5 MnCO3 (am) 0 Natron Na2CO3·10H2O -11 Nesquehonite Mg(HCO3)(OH)·2(H2O) -5 NiCO3 -1 Pb10(OH)6O(CO3)6 -70 Pb2OCO3 -11 Pb3O2CO3 -20 Rhodochrosite (MnCO3) 0.4 Siderite (FeCO3) 0.9 Smithsonite (ZnCO3) -1 Strontianite (SrCO3) -2 Thermonatrite Na2CO3.H2O -13 Vaterite (CaCO3) -1 ZnCO3 -1 ZnCO3,H2O -2
Cette simulation montre une précipitation possible du Mn et du Fe sous forme carbonates
(tableau 28), ce qui peut expliquer la diminution des concentrations de ces métaux en fin
d’incubation.
Par ailleurs, nos résultats montrent que les profils d’extraction du fer sont similaires à ceux
des autres éléments métalliques étudiés (hormis les ETM du 3ème groupe). Quel que soit
l’élément considéré, les vitesses d’extraction sont maximales durant les 4 premiers jours
d’incubation correspondant à la phase de croissance exponentielle de P. polymyxa. Les profils
de solubilisation des EMM et ETM sont liés au profil de consommation du glucose, c’est-à-
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
172
dire que lorsque le glucose est totalement consommé, l’extraction des éléments métalliques
atteint un palier maximal quand la consommation du glucose est maximale (figure 24).
P.polymyxa est une bactérie connue pour son activité fermentaire avec réduction
dissimilatrice du fer (Robert, 1947). En réduisant les oxydes de fer, celle-ci peut donc
contribuer à la solubilisation des ETM y étant adsorbés.
Nous avons donc tenté d’estimer la part des éléments métalliques dissous provenant des
oxydes de fer, en essayant de savoir si P. polymyxa réduisait préférentiellement les oxydes de
fer amorphes et/ou cristallisés.
III.2.2. Attaque des différentes fractions du sédiment
Le tableau 29 regroupe les teneurs en éléments métalliques dans les différentes fractions du
sédiment avant incubation. Les extractions séquentielles ont été réalisées sur trois échantillons
de sédiment.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
173
Tableau 29 : Teneurs des éléments métalliques dans les différentes fractions du sédiment avant incubation (µg.g-1 de sédiments secs)
(3 réplicats ont été extraits séparément)
Phases Réplicats Fe Mn Sr Co Ni Cr Pb 1 0,14 4,9 1,9 0,05 0,09 0,0004 0,11 2 0,12 7,8 2,0 0,09 0,07 0,00 0,13
Echangeable
3 0,17 8,5 2,3 0,07 0,13 0,00 0,16 1 128 65 90 0,36 0,19 0,10 0,21 2 144 99 83 0,54 0,27 0,04 0,14
Acido-soluble (Carbonates)
3 241 93 84 0,55 0,42 0,47 0,13 1 93 14 18 0,11 0,02 0,05 0,02 2 61 25 31 0,07 0,02 0,05 0,01
Réductible 1 (oxydes de manganèse) 3 102 23 28 0,09 0,02 0,05 0,01
1 377 8,7 11 0,25 0,02 1,26 0,62 2 892 18 13 0,60 0,02 1,71 0,92
Réductible 2 (oxydes de fer amorphes) 3 930 16 14 0,49 0,02 1,56 0,82
1 3001 18 3,0 0,99 0,02 3,36 2,55 2 6854 71 58 1,01 2,65 6,86 0,11
Réductible 3 (oxydes de fer cristallisés) 3 17367 40 18 1,40 2,00 5,26 3,98
1 22 3,33 6,0 0,20 0,76 2,97 2,05 2 17 2,20 10 0,04 0,17 4,56 0,03
Oxydable (Matière organique/ Sulfures)
3 28 4,47 1,9 0,36 1,35 1,38 1,59
1 855 2,47 0,72 0,26 0,79 1,93 2,19 2 2645 15 3,5 1,3 3,63 4,85 10,5
« Résiduelle »
3 2045 5,03 1,1 0,54 1,44 3,07 4,01
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
174
Le fer est principalement présent dans les fractions réductibles 2 et 3 qui correspondent
majoritairement aux oxydes de fer amorphes et cristallisés ainsi que sur la fraction résiduelle.
Le manganèse se trouve sous forme la forme acido-soluble et en particulier sous forme de
carbonates, ce qui concorde avec les formes décrites dans la littérature (Stumm et Morgan,
1996). On le retrouve également dans les phases réductibles (oxydes de manganèse et de fer).
On remarque que le strontium est présent sur les mêmes phases que le manganèse et dans des
teneurs similaires à celles du manganèse.
Certains ETM, tels que le Ni, Cr et Pb, présentent de très faibles teneurs dans les phases
échangeable, carbonates et réductible 1 et des teneurs un peu plus fortes dans les phases
réductibles 2 et 3, correspondant majoritairement aux oxydes de Fe amorphes et cristallisés.
On remarque que les triplicats ne sont pas toujours répétables. Le fer est l’élément qui
présente la plus forte variation entre les triplicats : les teneurs dans la phase réductible,
correspondant majoritairement aux oxydes de fer amorphes, varient de 377 à 930 µg.g-1 de
sédiments secs, celles correspondant majoritairement aux oxydes de fer cristallisés de 3000 à
17367 µg.g-1 de sédiments secs et dans la fraction résiduelle de 855 à 2645 µg.g-1 de
sédiments secs. Pour les autres éléments métalliques, la variation entre réplicats est
importante sur la phase oxydable (matière organique/sulfures) et la phase résiduelle. Cette
variation peut s’expliquer par le fait que les sédiments n’ont été ni séchés ni broyés ni
homogénéisés avant incubation afin de préserver les conditions anaérobies et de ne pas
modifier la répartition des éléments métalliques dans les fractions du sédiment. Cette méthode
présente l’inconvénient de ne pas avoir un sédiment homogène. Par conséquent, certaines
zones du sédiment seront plus ou moins riches en éléments métalliques.
III.2.3. Provenance des éléments métalliques solubilisés
III.2.3.1. Approche qualitative
Afin d’estimer de quelle phase provenaient les éléments métalliques solubilisés, nous avons
utilisé le fer comme élément de référence et avons procédé de la façon suivante. Pour chaque
élément métallique étudié, nous avons tracé les teneurs extraites en solution du métal en
fonction des teneurs extraites en solution en Fe au cours de l’incubation, ceci afin de vérifier
que la dissolution du métal était bien corrélée à celle du fer.
Puis, nous avons placé sur le même graphique, les teneurs du métal en fonction de celles du
fer dans chacune des phases du sédiment avant incubation. Les phases étudiées (échangeable,
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
175
carbonates, phases réductibles 1, 2 et 3 (oxydes de Mn et oxydes de Fe amorphes et
cristallisés) sont celles susceptibles d’être attaquées lors de la croissance de P. polymyxa. Ceci
nous permet donc de tirer des conclusions quant à la provenance de l’élément métallique en
solution : en effet, si les points d’une phase du sédiment sont proches de la droite de
régression des ETM dissous et si la quantité extraite est inférieure à celle déterminée dans
cette phase avant incubation (tableau 29), l’élément métallique dissous provient alors
probablement de cette phase.
Les teneurs en Mn dissous sont très fortement corrélées à celles du Fe (R²>0,96) et ceci dans
les 3 réplicats (figure 29). On remarque que ces rapports sont proches de ceux observés dans
les carbonates et les oxydes de Mn. En tenant compte des teneurs extraites maximales en Mn
et des teneurs sur les carbonates, entre 60 et 70 % du Mn pourrait provenir des « carbonates »,
en fin d’incubation. Les rapports dans les phases réductibles (oxydes de fer amorphes et
cristallisés) sont très éloignés de ceux des teneurs solubilisées, ce qui signifie que la part de
Mn provenant des « oxydes de fer » est faible.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
176
y1 = 0,19x + 7,96R2 = 0,96
y2 = 0,13x + 6,44R2 = 0,99
y3 = 0,12x + 6,36R2 = 0,98
0,0000
10,0000
20,0000
30,0000
40,0000
50,0000
60,0000
70,0000
80,0000
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en M
n (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
20,0000
40,0000
60,0000
80,0000
100,0000
120,0000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en M
n (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 29 : Teneurs en Mn en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes phases du
sédiment (dans les 3 réplicats)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
177
Les teneurs en Sr dissous sont fortement corrélées (r² = 0,92 et r² = 0,98 pour deux réplicats) à
celles du Fe dissous (figure 30). Bien que le Sr soit majoritairement fixé sur les « carbonates »,
le Sr en solution semble provenir en majorité des « oxydes de manganèse » (50 % de cette
phase) et de la phase réductible « oxydes de fer amorphes » (90 % de cette phase). En effet,
les fractions « carbonates » et « oxydes de Mn » portent des quantités de Sr importantes et
pourraient donc être la source des quantités mobilisées lors des expériences. Cependant, étant
données les quantités de Fe mobilisées simultanément, il est probable que les fractions
« oxydes de fer amorphes » jouent un rôle important comme source de Sr mobilisable.
y3 = 0,03x + 1,63R2 = 0,98
y2 = 0,03x + 1,86R2 = 0,98
y1 = 0,04x + 2,57R2 = 0,92
0,0000
10,0000
20,0000
30,0000
40,0000
50,0000
60,0000
70,0000
80,0000
90,0000
100,0000
0 500 1000 1500
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en S
r (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1 echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 1)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
10,0000
20,0000
30,0000
40,0000
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60,0000
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90,0000
100,0000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en S
r (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 30 : Teneurs en Sr en fonction des teneurs en Fe en solution et dans les différentes phases du
sédiment (dans les 3 réplicats)
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
178
Les teneurs en Co dissous sont fortement corrélées (r² = 0,97 et r² = 0,98 pour deux réplicats)
à celles du Fe extrait (figure 31). Le Co en solution semble provenir des phases réductibles
« oxydes de manganèse » et « oxydes de Fe amorphes ». Il est probable que la désorption du
Co provient d’abord d’une attaque des carbonates (50 %) due à l’acidification du milieu puis
d’une attaque des oxydes de Fe amorphes par réduction bactérienne des oxydes de fer (60 %).
y3 = 0,0007x + 0,0181R2 = 0,989
y2 = 0,0008x + 0,0282R2 = 0,9762
y1 = 0,0011x + 0,0298R2 = 0,936
0,0000
0,1000
0,2000
0,3000
0,4000
0,5000
0,6000
0,7000
0,8000
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en C
o (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 1)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
0,2000
0,4000
0,6000
0,8000
1,0000
1,2000
1,4000
1,6000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en C
o (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 31 : Teneurs en Co en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases
du sédiment (dans les 3 réplicats)
Les teneurs en Ni extrait sont fortement corrélées (r² = 0,64 et r²>0,83 pour deux réplicats) à
celles du Fe extrait (figure 32). Le nickel en solution semble provenir majoritairement des
« carbonates », ce qui concorde avec les teneurs déterminées lors des extractions séquentielles
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
179
où le nickel est majoritairement fixé sur la fraction « carbonatée ». Cependant, une partie non
négligeable semble aussi provenir des oxydes de fer cristallisé.
y2 = 0,0005x + 0,094R2 = 0,64
y3 = 0,0005x + 0,113R2 = 0,83
y1 = 0,0009x + 0,103R2 = 0,89
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0,3000
0,3500
0,4000
0,4500
0,5000
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en N
i (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1 Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)Linéaire (extrait - 1)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
2,5000
3,0000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en N
i (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés avant 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 32 : Teneurs en Ni en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases
du sédiment (dans les 3 réplicats)
Les teneurs en Pb extrait sont également très fortement corrélées aux teneurs en Fe extrait
(figure 33), en particulier pour 2 réplicats (r²>0,92). De plus, ces deux éléments semblent
provenir de la phase réductible « oxydes de Mn ». Or, si l’on se réfère au tableau 29, on
constate qu’il n’y a quasiment pas de plomb dans cette phase (0,01 – 0,02 µg.g-1 de sédiments
secs). Le plomb est en effet majoritairement fixé sur les phases réductibles « oxydes de fer
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
180
amorphes » et « oxydes de fer cristallisés ». Puisque le fer est également fixé majoritairement
sur ces phases réductibles, il est donc probable qu’une partie du plomb extrait provienne de
ces phases.
y1 = 0,0002x + 0,0167R2 = 0,923
y2 = 6E-05x + 0,0157R2 = 0,9699
y3 = 8E-05x + 0,0175R2 = 0,7939
0,0000
0,0500
0,1000
0,1500
0,2000
0,2500
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 500
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en P
b (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1 echangeable 2echangeable 3 carbonates 1 carbonates 2carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
0,5000
1,0000
1,5000
2,0000
2,5000
3,0000
3,5000
4,0000
4,5000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en P
b (µ
g.g-
1 de
séd
imen
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3 carbonates carbonates 2 carbonates 3 Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2 Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 33 : Teneurs en Pb en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases
du sédiment (dans les 3 réplicats)
Les teneurs en Cr extrait en solution ne sont pas corrélées à celles du Fe extrait en solution en
début d’incubation (figure 34). Néanmoins, après 2 jours d’incubation, une corrélation entre
ces deux éléments apparaît. Le Cr dissous semble provenir en majorité de la phase acido-
soluble « carbonates » et de la phase réductible « oxydes de Mn ». Or, le chrome est
majoritairement présent dans les phases réductibles « oxydes de fer amorphes et cristallisés ».
Une partie non négligeable en solution provient donc de ces phases.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
181
y1 = 0,0002x - 0,004R2 = 0,83
y2 = 0,0002x - 0,005R2 = 0,86
y3 = 0,0001x - 0,006R2 = 0,79
-0,0200
0,0000
0,0200
0,0400
0,0600
0,0800
0,1000
0 100 200 300 400 500 600
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en C
r (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2echangeable 3carbonates 1carbonates 2carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3 Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3Linéaire (extrait - 1)Linéaire (extrait - 2)Linéaire (extrait - 3)
Zoom du graphique ci-dessous
0,0000
1,0000
2,0000
3,0000
4,0000
5,0000
6,0000
7,0000
8,0000
0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000 18000 20000
Teneurs en Fe (µg.g-1 de sédiments secs)
Tene
urs
en C
r (µg
.g-1
de
sédi
men
ts s
ecs)
extrait - 1extrait - 2extrait - 3echangeable 1echangeable 2 echangeable 3carbonates 1carbonates 2 carbonates 3Oxydes de Mn 1Oxydes de Mn 2Oxydes de Mn 3Oxydes de Fe amorphes 1Oxydes de Fe amorphes 2Oxydes de Fe amorphes 3Oxydes de Fe cristallisés 1 Oxydes de Fe cristallisés 2 Oxydes de Fe cristallisés 3
Figure 34 : Teneurs en Cr en fonction des teneurs en Fe en solution (extrait) et dans les différentes phases
du sédiment (dans les 3 réplicats)
En conclusion de cette première approche, nous observons que la dissolution du Cr, Cu, Ni,
Mn et Sr est fortement corrélée à celle du fer, comme nous le supposions.
L’étude qualitative, en fonction des phases attaquées, montre que les rapports métal/Fe
extraits en solution sont proches de ceux de la phase acido-soluble « carbonates » et de la
phase réductible « oxydes de Mn ». Or, la phase réductible « oxydes de Mn » n’est pas
forcément celle sur laquelle sont fixés les métaux en majorité (tableau 30). De plus, nous
avons vu que le Cr et le Pb pouvaient difficilement provenir de la phase acido-soluble
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
182
« carbonate » et de la phase réductible « oxydes de manganèse » puisque les teneurs dans ces
phases sont très faibles. En effet, ces ETM sont majoritairement situés sur les phases
réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer cristallisés ». Cette approche
qualitative présente donc des limites.
Tableau 30 : Phases majoritaires et pourcentage de phase attaquée des différents éléments métalliques au
cours de l’incubation (estimation qualitative)
Métal Phases attaquées Pourcentage de phase attaquée Mn Carbonates 60-70 % Sr Oxydes de Mn
Phase réductible « oxydes de fer amorphe » 50 % 90 %
Co Carbonates Phase réductible « oxydes de fer amorphe »
50 % 60 %
Ni Carbonates 90 % Pb Phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et
« oxydes de fer cristallisés » ?
Cr Phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer cristallisés »
?
Nous avons alors quantifié la part de chacune des phases impliquée dans les teneurs en
éléments métalliques dissous pour chaque point cinétique de l’incubation. Le but recherché
est d’estimer plus précisément dans quelle proportion les fractions sont solubilisées et si elles
sont attaquées successivement ou non au cours de l’incubation.
III.2.3.2. Approche quantitative
Les pourcentages de chaque fraction participant aux teneurs dissoutes en éléments métalliques
pour chaque point cinétique de l’incubation ont été calculés à partir de l’équation suivante :
Mi = jj *ϕ∑j
im
avec φj = fraction de la phase j solubilisée et mij = teneurs en éléments métalliques dans cette
phase (µg.g-1 de sédiments secs).
Sous une autre forme, cela revient à résoudre l’équation suivante d’inconnue vecteur B, dans
laquelle A est la matrice des compositions de chaque fraction (en µg.g-1 de sédiments secs) et
C la quantité d’ETM libérée (en µg.g-1 de sédiments secs) pour un instant donné de
l’incubation.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
183
X =
La résolution de l’équation a été réalisée par optimisation à l’aide d’une fonction quadratique
des inconnues φj dont la formule est la suivante :
)( métal poids*nobservatio poids*²∑ ⎟⎟⎠
⎞⎜⎜⎝
⎛⎟⎠⎞
⎜⎝⎛ −
nobservationobservatioestimationMinimum
sous contrainte 0< φj <1, le logiciel R permettant de résoudre facilement ce problème de
minimisation sous contrainte.
Le poids des observations correspond à la pertinence de la teneur en métal dissoute obtenue
lors des incubations au cours du temps. La valeur du poids est comprise entre 0 et 1. Celle-ci a
été attribuée en fonction des écarts entre les triplicats (répétabilité des triplicats) et par rapport
à l’évolution au cours du temps. Si l’écart d’une mesure par rapport aux deux autres réplicats
est faible (écart-type relatif < 10 %) et si la teneur augmente par rapport aux points cinétiques
précédents, la mesure est jugée valable donc son poids est de 1. Si l’écart-type relatif est
compris entre 50 et 60 %, un poids de 0,5 est donné. Ceci permet de corriger les erreurs dues
au fait que les échantillons sont parfois assez hétérogènes entre eux. Le poids de chaque métal
a ensuite été attribué par rapport à ses teneurs solubilisées et par rapport à l’évolution au cours
du temps. Si le métal est très fortement solubilisé et augmente au cours du temps, son poids
est de 1. Si le métal est très faiblement solubilisé et/ou sa teneur alterne entre augmentation et
diminution dans le temps, son poids est de 0.
Les poids attribués à chaque métal sont regroupés dans le tableau 31 : Tableau 31 : Poids attribué à chaque élément métallique dans le calcul des pourcentages de chaque
fraction attaquée
Pb Cu Cr Ni Co Cd Sr Mn Fe Poids 0 0 0 1 1 0 1 1 1
BVecteur 838281
...
...030201
5%.........1%
ttt
ttt
PhasePhase
−−−
−−−
CVecteur ...83
8281
.......
0302
...01...
ttt
ttt
FeCuPb
−−−
−−−
MatriceA...5
432
...1...
PhasePhasePhasePhasePhase
FeCuPb
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
184
Les poids attribués à chaque mesure observée sont regroupés dans le tableau 32. Seuls sont
indiqués les poids des mesures observées pour les métaux auxquels ont été attribués un poids
de 1. Tableau 32 : Poids attribué à chacune des mesures observées au cours de l’incubation
Ni Co Sr Mn Fe 1-t0 1 1 1 1 1 2-t0 1 1 1 1 1 3-t0 1 1 1 1 1 1-t1 1 1 1 1 0,5 2-t1 1 1 1 1 1 3-t1 1 1 1 1 1 1-t1' 0,2 1 1 1 0,5 2-t1' 0,5 1 1 1 1 3-t1' 0,5 1 1 1 1 1-t2 1 1 1 1 0,5 2-t2 1 1 1 1 1 3-t2 1 1 1 1 1 1-t3 1 1 1 1 0,5 2-t3 1 1 1 1 1 3-t3 1 1 1 1 1 1-t4 1 1 1 1 0,5 2-t4 0,5 1 1 1 1 3-t4 1 1 1 1 1 1-t6 1 1 1 1 0,5 2-t6 1 1 1 1 1 3-t6 1 1 1 1 1 1-t8 1 1 1 1 0,5 2-t8 1 1 1 1 1 3-t8 1 1 1 1 1 4-t0 1 1 1 1 1 5-t0 1 1 1 1 1 6-t0 1 1 1 1 0,5 4-t8 1 1 1 1 1 5-t8 1 1 1 1 1 6-t8 1 1 1 1 0,5
Après résolution de l’équation, nous obtenons une matrice nous indiquant la fraction de
chaque phase solubilisée ainsi que la teneur dissoute de chaque EMM et ETM recalculée pour
chaque point cinétique d’incubation et pour chaque réplicat.
La phase 1 correspond à la fraction échangeable, la phase 2 à la fraction acido-soluble
« carbonatée », la phase 3 aux « oxydes de manganèse », la phase 4 aux « oxydes de fer
amorphes » et la phase 5 aux « oxydes de fer cristallisés ».
Pour bien identifier le rôle des incertitudes sur la matrice A, nous avons réalisé les tests avec
chacun des réplicats des extractions séquentielles effectuées avant incubation.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
185
Les résultats obtenus pour chaque triplicat sont pratiquement semblables ce qui montre que
malgré les écarts de teneurs de métaux entre les triplicats d’extraction séquentielle, des
conclusions peuvent néanmoins être tirées. Nous ne présenterons ici que les résultats liés au
1er réplicat d’extraction séquentielle ; pour les deux autres réplicats, le même type de
raisonnement et de conclusions peuvent être tenus.
Nous avons testé 3 modèles différents en regroupant ou non les différentes phases. En effet,
nous avons constaté des rapports semblables Sr/Mn dans les phases 2 et 3, ce qui semble
étonnant. Nous avons donc décidé de regrouper ces deux phases dans l’un des modèles. Ainsi,
le 1er modèle simule la dissolution des éléments métalliques pour chacune des 5 phases
séparées, dans le 2ème modèle, les phases 2 et 3 ont été regroupées et dans le 3ème modèle, les
phases 3 et 4 ont été regroupées.
Les résultats du modèle 1 sont les suivants :
La figure 35 nous montre que très rapidement, la fraction échangeable (phase 1) est dissoute
en solution et ceci pour les 3 réplicats de flacons incubés avec P. polymyxa. Les ETM dissous
en solution proviennent donc majoritairement de la fraction échangeable au tout début de
l’incubation. A partir du 2ème jour, on observe une augmentation de la dissolution des
« oxydes de fer amorphes » (fraction 4) et ceci jusqu’au 4ème jour puis une diminution. On
peut donc supposer que les « oxydes de fer amorphes » commencent à être réduits et donc à
participer à l’augmentation des teneurs en métaux dissous après 2 jours d’incubation, ce qui
correspond à l’activité maximale de P. polymyxa. En effet, celle-ci est en pleine croissance à
cette période de l’incubation, au regard de la cinétique de consommation de glucose (figure
24). On remarque une diminution du taux de dissolution des oxydes de fer amorphes en fin
d’incubation et ceci pour les 3 flacons d’incubation. Par ailleurs, nous avons remarqué une
légère diminution des teneurs en Fe, Mn et Co. On peut supposer qu’une précipitation de ces
éléments métalliques se produit et notamment une réadsorption voire une substitution par le
Co et le Mn sur les oxydes de fer amorphes. Or, Bousserrhine (1995) a montré que la
substitution de goethite en Mn et Co ralentissait la réduction de ces oxydes par les bactéries
ferri-réductrices. Ceci pourrait donc expliquer le fait qu’en fin d’incubation les « oxydes de
fer amorphes » soient moins attaqués.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
186
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Temps (jours)
Taux
de
diss
olut
ion
phase1phase2phase3phase4phase5
Figure 35 : Evolution du taux de dissolution des fractions du sédiment au cours de l’incubation
On constate une faible dissolution de la phase acido-soluble « carbonates » (phase 2) alors
que le pH de la solution diminue jusqu’à 6 et que les résultats de l’analyse qualitative
montraient une dissolution importante des carbonates, notamment pour le Mn, Sr, Co et Ni.
Or, dans les extractions séquentielles, l’attaque des « carbonates » est réalisée à pH 3,5.
L’acidification du milieu n’est sans doute pas assez forte pour entraîner une dissolution
complète des carbonates. Par ailleurs, nous observons que les « oxydes de Mn » ne sont
pratiquement pas solubilisés. Or, l’analyse qualitative a montré que le Sr semblait provenir à
50 % des « oxydes de Mn ». Il est donc fortement probable que lors de l’attaque séquentielle,
l’acide acétique à pH 3,5 utilisé pour dissoudre les « carbonates » dissout aussi une partie des
oxydes de Mn. Cette hypothèse est fortement probable car il a été montré qu’un pH 5 était
suffisant pour libérer la majeure partie des métaux adsorbés sur les « oxydes de manganèse »
(Baeyens, 2003). On observe également une faible dissolution des « oxydes de fer
cristallisés ». Il est donc possible que P. polymyxa réduise plus facilement les « oxydes de fer
amorphes » que « cristallisés » comme la plupart des bactéries ferri-réductrices.
Nous avons donc réalisé le même test en additionnant les teneurs des phases 2 + 3 (carbonates
et oxydes de Mn) (modèle 2). Nous avons donc supposé que l’acide acétique à pH 3,5 avait
attaqué aussi les oxydes de Mn (figure 36).
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
187
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Temps (jours)
Taux
de
diss
olut
ion
phase1phase2.3phase4phase5
Figure 36 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates+oxydes de Mn, oxydes
de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de l’incubation
Les résultats obtenus lors de cette simulation des phases dissoutes sont proches de ceux
obtenus lorsque les phases acido-soluble « carbonates » et réductible « oxydes de Mn »
étaient séparées. On constate toujours la dissolution complète de la fraction échangeable après
deux jours d’incubation. De même la dissolution des « oxydes de fer amorphes » augmente
jusqu’au 4ème jour pour diminuer en fin d’incubation. Les « oxydes de fer cristallisés » sont
toujours moins dissous que les « oxydes de fer amorphes ». Nos hypothèses émises
précédemment concernant l’explication du comportement des « oxydes de fer » restent donc
valables. Les taux de dissolution des phases acido-soluble « carbonates » + phase réductible
« oxydes de fer amorphes » sont proches de ceux observés lorsque la phase « carbonates »
était dissociée de celle des « oxydes de manganèse ». On peut donc supposer que la phase des
« oxydes de manganèse » a bien été attaquée par l’acide acétique lors de l’extraction
séquentielle.
Nous avons néanmoins testé l’évolution du taux de dissolution des fractions si l’on supposait
que dans l’extraction séquentielle, l’hydroxylamine acidifiée à pH 2 n’attaquait pas les oxydes
de fer amorphes. Nous avons donc regroupé les phases 3 et 4 (« oxydes de Mn » et « oxydes
de Fe amorphes ») pour la simulation (modèle 3) Les résultats obtenus sont présentés figure
37.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
188
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Temps (jours)
Taux
de
diss
olut
ion
phase1phase2phase3.4phase5
Figure 37 : Evolution du taux de dissolution des fractions (échangeable, carbonates, oxydes de Mn +
oxydes de fer amorphes et oxydes de fer cristallisés) du sédiment au cours de l’incubation
Dans ce cas, on observe une dissolution beaucoup plus faible de la phase réductible « oxydes
de fer amorphes » voire une dissolution nulle dans certains cas. Ce résultat n’est donc pas
acceptable quant à nos hypothèses émises sur la réduction des oxydes de fer par P. polymyxa.
Il est donc hautement probable que les oxydes de Mn aient été en grande partie attaqués par
l’acide acétique à pH 3,5 lors de l’attaque de la fraction « carbonatée ».
L’ensemble des résultats obtenus pour les 3 modèles est regroupé dans les tableaux 33 et 34.
Le tableau 33 présente les taux de dissolution des différentes phases au 4ème jour, c’est-à-dire
au moment où l’activité microbienne est maximale et au 8ème jour soit en fin d’incubation. Les
résultats obtenus après le 4ème jour sont difficiles à interpréter, des phénomènes de
reprécipitations, ayant probablement eu lieu. C’est pourquoi nos conclusions ne s’attacheront
qu’à tenter d’interpréter les phénomènes de solubilisation des différentes phases lorsque
l’activité microbienne est à son maximum.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
189
Tableau 33 : Taux de dissolution (valeurs minimales et maximales) des différentes phases au 4ème jour et
en fin d’incubation obtenus pour les différents modèles
Taux de dissolution Modèle 1 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2 0-0,14 0,08-0,14 Phase 3 0-0,3 0 Phase 4 0,2-0,85 0,13-0,56 Phase 5 0,01-0,14 0,02-0,14 Modèle 2 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2+3 0,04-0,12 0,06-0,11 Phase 4 0,24-0,91 0,13-0,57 Phase 5 0,006-0,13 0,01-0,13 Modèle 3 4ème jour 8ème jour Phase 1 1 1 Phase 2 0-0,17 0,05-0,15 Phase 3+4 0-0,52 0-0,29 Phase 5 0,04-0,16 0,05-0,15
Le tableau 34 présente les teneurs extraites dissoutes calculées par modèle ainsi que les
teneurs extraites dosées expérimentalement.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
190
Tableau 34 : Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées par les différents modèles et observées
Quantités d’éléments métalliques désorbés calculées (µg.g-1 de sédiments secs) Quantités d’éléments métalliques désorbés observées (µg.g-1 de sédiments secs)
Modèle 1 Modèle 2 Modèle 3 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour 4ème jour 8ème jour Fe 440 ± 107 408 ± 105 439 ± 107 407 ± 106 448 ± 106 416 ± 105 400 ± 102 371 ± 100 Mn 18 ± 1 16 ± 1 17± 1 16 ± 1 19 ± 1 17 ± 1 61 ± 3 56 ± 3 Sr 18 ± 1 16 ± 1 18 ± 1 16 ± 1 18 ± 1 15± 1 15 ± 1 13 ± 1 Ni 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,03 0,12 ± 0,01 0,12 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,11 ± 0,01 0,25 ± 0,09 0,37 ± 0,02 Co 0,30 ± 0,03 0,26 ± 0,02 0,30 ± 0,03 0,26 ± 0,02 0,28 ± 0,03 0,24 ± 0,02 0,35 ± 0,03 0,30 ± 0,02 Cr 0,98 ± 0,24 0,75 ± 0,09 1,01 ± 0,27 0,75 ± 0,10 0,73 ± 0,20 0,56 ± 0,03 0,05 ± 0,01 0,08 ± 0,01 Pb 0,66 ± 0,08 0,57 ± 0,04 0,66 ± 0,10 0,56 ± 0,04 0,56 ± 0,08 0,50 ± 0,06 0,051 ± 0,008 0,047 ± 0,014 Cu 0,35 ± 0,17 0,39 ± 0,15 0,34 ± 0,17 0,38 ± 0,15 0,43 ± 0,16 0,45 ± 0,15 0,11 ± 0,03 0,12 ± 0,11 Cd 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,010 ± 0,001 0,013 ± 0,001 0,012 ± 0,001 (3,86 ± 0,55).10-4 (3,76 ± 0,32).10-4
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
191
Le modèle retenu est donc celui pour lequel les phases acido-soluble et réductible 1
(carbonates et oxydes de Mn) ont été regroupées soit le modèle 2 car il reflète mieux les
processus chimiques et microbiologiques qui pourraient intervenir au cours de l’incubation,
notamment l’attaque de la phase acido-soluble « carbonates » et de la phase réductible
« oxydes de fer amorphes ». Si l’on compare les teneurs extraites recalculées par le modèle 2
par rapport à celles observées expérimentalement, on observe que ce modèle fonctionne
parfaitement avec le Fe et le Sr mais sous-estime les teneurs extraites en Mn (tableau 34).
Cela semble normal puisque nous avons constaté que les teneurs en Mn et Sr étaient
similaires sur chacune des phases étudiées (figure 27) bien que de sérieux doutes puissent être
émis quant à la sélectivité des réactifs utilisés. Le modèle surestime les teneurs extraites en Cr,
Pb, Cu et Cd par rapport à celles réellement analysées au cours de l’incubation. Il se pourrait
que cette surestimation soit due au fait que l’optimisation ne prend pas en compte des re-
précipitations sous forme de sulfures. Nous avons donc réalisé une simulation de la
distribution des sulfures métalliques à pH 6 à partir des concentrations totales dissoutes en
éléments métalliques analysées et des concentrations en sulfures, ainsi qu’en rentrant les
concentrations en acides organiques présents. Les sulfures n’ayant pas été analysés, nous
avons estimé leurs concentrations par rapport aux concentrations en sulfates mesurées dans le
chapitre 2. Nous avons fait l’approximation que les sulfates disparus étaient tous transformés
en sulfures (HS-), potentiellement libres et pouvant conduire à de nouvelles précipitations. Les
indices de saturation des sulfures de métaux calculés par Visual Minteq (log ((produit des
activités ioniques)/ Ks)) sont présentés dans le tableau 35 et ont été calculés en entrant les
concentrations en métaux et éléments majeurs indiquées en annexe 11.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
192
Tableau 35 : Indices de saturation des sulfures métalliques à pH 6 calculé par Visual Minteq
Minéraux Indice de saturation (log)
Acanthite (Ag2S) 2 CaS -14 Chalcopyrite (CuFeS2) 23 CoS (alpha) 0,7 CoS (beta) 5 Covellite CuS 14 FeS -0,5 Galena PbS 4 Greenockite CdS 1 Mackinawite (Fe,Ni)1 + xS (où x = 0 to 0,11) 0,06 MgS -21 MnS (vert) -4 MnS (rose) -7 NiS (alpha) -1 NiS (beta) 4 NiS (gamma) 6 Spharelite (ZnS) 4 SrS -19 Wurtzite (ZnS) 2
Nous observons que l’Ag, le Cd et le Pb peuvent précipiter sous forme de sulfures puisque
leurs indices de saturation sont positifs, en particulier sous forme de Ag2S, CdS et PbS. Il en
est de même pour le cuivre dont la modélisation indique une sursaturation en covellite (CuS)
ainsi qu’en CuFeS2 avec un indice de saturation très élevé (23,9). Par ailleurs, on observe
également une précipitation de sulfure de nickel.
Les variations de teneurs extraites observées au cours de l’incubation pour les éléments du
groupe 3 (Ag, Cd et Cu) sont donc vraisemblablement dues à des phénomènes de relargage et
reprécipitation sous forme de sulfures.
Par ailleurs, on observe des variations entre réplicats du pourcentage de phase « oxydes de fer
amorphes » attaquée alors que ces variations sont moins marquées voire inexistantes pour les
autres phases. Or, les extractions séquentielles ont montré une forte variabilité du fer et des
autres métaux dans les différentes phases et en particulier dans les « oxydes de fer amorphes »
(tableau 29). On peut donc supposer que les cinétiques de dissolution des oxydes de fer
amorphes sont différentes à cause de cette inhomogénéité. En effet, des études ont montré que
l’attaque des oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrices est différente selon la pureté des
oxydes de fer. Par exemple, le taux de goethite attaqué par Clostridium butyricum est différent
selon que la goethite est pure ou substituée ou non en métaux (Bousserrhine, 1995). Plus de
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
193
90 % du fer est relargué de la goethite pure après 150 h de contact. Ce taux de dissolution
descend à 40 et 15 % si la goethite est substituée avec 5 et 35 % d’aluminium. De plus, les
substitutions des oxydes de fer par les métaux conduisent à une efficacité plus ou moins
grande de la réduction des oxydes de fer par les bactéries ferri-réductrices. Ainsi, des
substitutions de la goethite par le Mn et le Co ralentissent la dissolution du fer. De même, si
une goethite est substituée en Cr, les pourcentages finaux de dissolution du fer ne dépassent
par 60 %. Dans un sol latéritique du Burundi contenant 70 % de goethite (substituée à 20 %
en Al), 10 % d’hématite (substituée à 7 % en Al) et 20 % de kaolinite, les 3 oxydes de fer
étant substitués en Cr (2 %) et présentant des phases polymétalliques Fe-Cr-Cu et Mn-Cr-Fe,
les résultats ont montré une faible solubilisation des métaux (Bousserrhine, 1995). Le taux de
réduction de la goethite n’atteint pas 17 %.
Puisque les oxydes de fer présentent des teneurs en métaux inhomogènes entre réplicats,
certaines parties des oxydes de fer seront plus ou moins rapidement réduites par les
microorganismes, suivant que les oxydes sont peu ou fortement substitués en métaux. Cette
hypothèse de substitution pourrait donc expliquer les variations de pourcentage d’attaque de
cette phase entre réplicats. Cette inhomogénéité dans la dissolution des oxydes de fer
amorphes pourrait également montrer qu’il s’agit de la phase préférentiellement attaquée par
P. polymyxa dans les incubations.
L’implication des différentes fractions dans la solubilisation des éléments métalliques se fait
donc par dissolution des phases par étape. En début d’incubation, les éléments métalliques
dissous proviennent de la fraction échangeable puis après 2 jours d’incubation, les éléments
métalliques dissous sont issus des oxydes de fer amorphes, preuve de l’activité importante de
P. polymyxa dans la réduction des oxydes de fer jusqu’au 4ème jour d’incubation, puisque
jusqu’à 95 % des oxydes de fer amorphes peut être solubilisé. Cette phase correspond à sa
période de pleine croissance puisqu’après 4 jours tout le glucose a été consommé. Malgré les
résultats de l’étude qualitative, il semble que les carbonates soient peu impliqués dans la
solubilisation des éléments métalliques, ce qui signifie que l’acidification du milieu participe
moins à la dissolution des éléments métalliques que la réduction des oxydes de fer. De même,
P. polymyxa s’attaque beaucoup moins aux oxydes de fer cristallisés qu’aux oxydes de fer
amorphes.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Conclusions et perspectives
194
IV. Conclusions et perspectives
L’objectif de ce chapitre était d’étudier le métabolisme d’une des bactéries majoritaires
isolées, Paenibacillus polymyxa, et ses conséquences sur la mobilité des éléments traces
métalliques dans les sédiments.
Le métabolisme mis en place par P. polymyxa est un mécanisme de type fermentaire avec
production d’acides acétique, lactique et succinique accompagné d’une production de dioxyde
de carbone. Le glucose ajouté est consommé très rapidement, comme nous l’avions déjà
constaté dans les incubations en présence du consortium bactérien total. Nous avons
également constaté une diminution du pH jusqu’à 6. L’acidification est donc moins marquée
que dans les incubations précédentes où le pH descendait jusqu’à 5.
Parallèlement à ce métabolisme, nous avons observé une dissolution du Fe, Mn, Co, Cr, Ni,
Pb et Sr. La dissolution du Fe est corrélée à celle des autres éléments métalliques. Par
conséquent, cette dissolution est bien liée à la réduction des oxydes de fer par P. polymyxa.
Les résultats obtenus lors de l’extraction séquentielle et la modélisation effectuée, nous
montrent que la dissolution des différentes phases du sédiment participe à l’augmentation des
teneurs en éléments métalliques dissous de façon différente au cours de l’incubation. En début
d’incubation, les éléments métalliques dissous proviennent de la fraction échangeable puis on
constate une augmentation des métaux provenant des oxydes de fer amorphes. Cette
dissolution des oxydes de fer amorphes atteint son paroxysme au bout du 4ème jour, moment
où l’activité de P.polymyxa atteint son maximum. A partir du 4ème jour, le glucose a été
entièrement consommé et l’on observe une diminution de la participation des oxydes de fer
amorphes aux teneurs dissoutes en métaux. Ceci est donc lié au fait que P. polymyxa ne réduit
plus autant les oxydes de fer étant donné qu’il n’y a plus de source de carbone facilement
dégradable, c’est-à-dire de glucose. Cette diminution de la réduction peut également être due
à une substitution de certains éléments métalliques (Co, Cr et Mn) dans les oxydes de fer,
inhibant alors l’activité réductrice des bactéries (Bousserrhine, 1995).
On constate également que P. polymyxa réduit beaucoup plus les oxydes de fer amorphes que
cristallisés puisque ces derniers ne participent quasiment pas à la mobilisation d’éléments
métalliques.
Chapitre 3 : Rôle de Paenibacillus polymyxa dans la mobilité des ETM
Conclusions et perspectives
195
Enfin, la modélisation montre que les carbonates ne sont que faiblement dissous au cours de
l’incubation (<10 %). Ceci laisserait donc supposer que l’acidification du milieu n’est pas
suffisante pour entraîner une mobilité des éléments métalliques et que cette dernière est
principalement due à l’activité réductrice de P. polymyxa et des bactéries ferri-réductrices en
général.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
196
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens
dans la mobilité des éléments traces métalliques
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Introduction
197
I. Introduction
La fermentation de la matière organique entraîne la production de métabolites tels que des
acides organiques et une diminution du pH du milieu (Ehrlich et al., 1981; Lovley et Phillips,
1986; Lovley, 1987). L’acidification du milieu et la production d’acides organiques ont,
effectivement, été observées dans les incubations que ce soit en présence de la communauté
microbienne ou en présence de Paenibacillus polymyxa seule.
Lors de l’incubation avec P. polymyxa, nous avons observé que la majeure partie du fer et des
éléments métalliques dissous en solution provenait de la fraction échangeable et de la
réduction des oxydes de fer amorphes. Des études réalisées à l’aide de membranes à dialyse,
séparant les oxydes de fer des bactéries, ont montré que très peu de fer était solubilisé,
soulignant le faible impact des métabolites microbiens sur la réduction et la solubilisation des
oxydes (Munch et Ottow, 1983; Rajot, 1992). La réduction des oxydes de fer nécessite donc
un contact direct entre bactéries et oxydes de fer.
Cependant, il a été en effet montré que l’acidification du milieu entraînait la désorption des
ETM liés aux carbonates dans les sols et sédiments (Chen et Lin, 2001; Shanableh et Omar,
2003; Qureshi et al., 2004). Dans la rhizosphère, en milieu aérobie, des études ont rapporté
que des acides organiques tels que l’acide oxalique, malique et citrique provoquaient la
dissolution des éléments métalliques par complexation (Gyliene et Salkauskas, 1998; Jones,
1998; Glover et al., 2002).
Les objectifs de ce chapitre sont donc :
- d’étudier le rôle du pH et des acides organiques produits par les bactéries ferri-
réductrices dans la désorption du fer et des éléments métalliques, respectivement par
acidification et par complexation,
- de comparer acidification et complexation à la réduction microbienne enzymatique
dans la mobilité du fer et des éléments métalliques.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
198
II. Matériel et méthodes
L’objectif de cette étude est de comparer la part du fer et des ETM dissous liée à l’activité
réductrice de P.polymyxa à celle liée à la dissolution des éléments métalliques par
complexation avec les acides organiques et par acidification du milieu.
Le principe des expérimentations est donc de mettre en contact les sédiments avec une
solution d’acide organique à différentes valeurs de pH. La capacité tampon du sédiment étant
particulièrement importante, il nous a fallu maintenir le pH à la valeur souhaitée, à l’aide d’un
pH-stat.
La partie ci-dessous décrit donc le choix et la préparation des acides organiques ainsi que le
dispositif expérimental et le pH-stat en particulier.
II.1. Choix des acides organiques
Les acides organiques étudiés ont été choisis en fonction de ceux identifiés et quantifiés dans
les incubations comprenant le consortium bactérien total et dans celles réalisées avec
Paenbacillus polymyxa. Les acides ont été préparés dans les concentrations maximales
obtenues lors des incubations, à partir de solutions commerciales de pureté supérieure à 98 %
(Sigma-Aldrich).
L’ensemble des acides organiques étudiés et leurs concentrations sont regroupés dans le
tableau 36. La deuxième colonne indique quelles bactéries produisent l’acide considéré. Par
exemple, l’acide acétique a été détecté dans les incubations avec P. polymyxa mais également
dans les incubations où l’ensemble des bactéries autochtones (consortium) était présent. Tableau 36 : Acides organiques étudiés et produits au cours des essais à partir de 5 g.l-1 de glucose
Acides organiques produits Bactéries Acide acétique (400 mg.l-1) Consortium/Paenibacillus polymyxa Acide lactique (700 mg.l-1) Consortium/Paenibacillus polymyxa Acide succinique (480 mg.l-1) Paenibacillus polymyxa Acide propionique (100 mg.l-1) Consortium Acide butyrique (1000 mg.l-1) Consortium
Afin de comparer l’effet complexant des acides organiques entre eux, une solution d’acide
oxalique (1 g.l-1) a également été préparée. En effet, l’oxalate est un excellent ligand des
cations métalliques qui tendent à former de nombreux précipités insolubles. Les constantes de
complexation de l’acide oxalique avec les métaux sont en effet très élevées (Martell et Smith,
1989). Il s’agit habituellement de ligands bidentates formant des cycles à 5 membres de type
MO2C2.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
199
Après préparation à la concentration souhaitée, les acides organiques ont été ramenés à pH 7
avec une solution de NaOH (2 M) afin d’être proche du pH des sédiments et donc ne pas
entraîner une solubilisation de la fraction échangeable et carbonatée, sensible aux variations
de pH.
II.2. Dispositif expérimental
Pour chacun des acides organiques, le dispositif expérimental est le suivant : 40 g de
sédiments humides (soit 20 g de sédiments secs) de Marne (issus de la campagne de
prélèvement de mai 2006) autoclavés – afin d’être dans les mêmes conditions que dans les
incubations menées avec P. polymyxa – ont été mis en contact avec 300 ml d’acide organique.
La solution d’acide organique – sédiment est successivement ramenée aux pH suivants : 6,5 ;
6 ; 5,5 et 5. Ces pH correspondent approximativement à ceux observés au cours des
incubations de sédiments enrichis en glucose. La baisse du pH est réalisée à l’aide de micro-
ajouts d’acide nitrique Normatom à 1,5.10-2 M. à l’aide du pH-stat (785 DMP Titrino,
Metrohm) piloté à l’aide du logiciel Tiamo 1.2 (Metrohm) (figure 38). Dès que le pH a été
atteint, celui-ci est maintenu constant pendant 24 h à l’aide de micro-ajouts d’acide nitrique
pour contrer l’effet tampon du sédiment.
La solution a été dégazée continuellement sous flux d’azote afin de ne pas être en conditions
oxydantes et le bullage d'azote a permis une agitation suffisante de la solution pour
l’homogénéiser sans remettre les sédiments en suspension. En effet, si l’on veut comparer les
phénomènes liés à la mobilité des métaux, il est important de respecter au maximum les
conditions dans lesquelles ont été réalisées les expériences. En particulier, les sédiments n’ont
jamais été agités durant les incubations. C’est pourquoi, il était important de ne pas les
remettre en suspension lors des expériences avec le pH-stat.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Matériel et méthodes
200
Figure 38 : Dispositif expérimental du pH-stat (vue d’ensemble)
Après 24 h, 20 ml de solution a été prélevé, filtré et acidifié avant analyse des métaux par
ICP-AES et ICP-MS.
II.3. Modélisation
Afin d’étudier la spéciation des métaux dissous et la capacité de complexation des acides
organiques sur les métaux, une modélisation des espèces en solution a été réalisée aux
différents pH et avec les différents acides en utilisant le logiciel Visual Minteq
(www.lwr.kth.se/English/OurSoftware/vminteq/), qui est une version dérivée de MINTEQA2
ver 4.0, crée par l’US EPA en 1999 et dont les bases de données, notamment les constantes de
complexations entre métaux et acides organiques proviennent de NIST (National Institute of
Standards and Technology).
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
201
III. Résultats et discussion
III.1. Rôle du pH dans la dissolution des ETM
Les sédiments ont été mis en contact avec de l’eau MilliQ puis le pH a été abaissé
progressivement à l’aide du pH stat aux pH 6.5, 6, 5.5 et 5. On constate que le pH présente un
faible impact sur la mobilité des métaux (figure 39). Les concentrations solubilisées sont très
faibles comparées à celles obtenues lors des incubations avec P. polymyxa. Par exemple, le
fer n’atteint ici qu’une concentration de 30 µg.l-1 au maximum à pH 6 alors que la
concentration dissoute était de 50 000 µg.l-1 dans l’incubation avec P. polymyxa.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
4,50 5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Conc
entra
tion
(µg.
L-1
)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Conc
entra
tion
en F
e, M
n et
Sr (
µg.L
-1)
CoCrCuNiPbFeMn Sr
Figure 39 : Evolution de la concentration en métaux dissous en fonction du pH en absence de P. polymyxa
Le pH a donc un faible impact sur la mobilité des éléments métalliques. Ceci est confirmé par
le fait que les carbonates, normalement attaqués en milieu acide, ne sont que très peu dissous
(<10 %) et participent donc peu à la quantité d’éléments métalliques dissous ainsi que nous
l’avons constaté lors de la modélisation réalisée à partir des extractions séquentielles et des
teneurs désorbées dans l’incubation avec P. polymyxa.
Nous avons donc tenté de savoir quelle était la part d’éléments métalliques dissous par
complexation avec les acides organiques produits par P. polymyxa mais aussi produits lorsque
l’ensemble de la communauté microbienne était présent dans les sédiments.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
202
III.2. Rôle des acides organiques dans la dissolution des éléments
métalliques
La dissolution des éléments métalliques est différente suivant l’acide organique considéré. La
figure 40 représente la dissolution des métaux par les acides organiques aux différentes
valeurs de pH étudiées ainsi que les concentrations dissoutes obtenues lors de l’incubation
avec P. polymyxa.
III.2.1. Approche globale
On remarque que les acides organiques ont un faible impact dans la dissolution des métaux
comparée à la concentration en métaux dissous lors de la présence de P. polymyxa (figure 40).
En particulier, les acides succinique, lactique et acétique dissolvent 10 fois moins de fer qu’en
présence de P. polymyxa. L’acide succinique est l’acide produit par cette bactérie qui désorbe
le plus de manganèse comparé aux concentrations dissoutes lors de l’addition d’acides
lactique et acétique, ce dernier ayant la plus faible influence sur la dissolution du manganèse.
Néanmoins, même si l’acide succinique semble jouer un rôle dans la dissolution du
manganèse, les concentrations dissoutes sont 10 fois plus faibles qu’en présence de la bactérie.
L’acide succinique et l’acide lactique dissolvent le strontium dans les mêmes concentrations,
l’acide acétique entraînant la plus faible dissolution. On remarque que plus le pH diminue et
plus la concentration en strontium augmente, ce qui signifie que cet élément est sensible à
l’acidification du milieu. Cependant aux valeurs de pH considérées dans l’incubation avec P.
polymyxa, on constate que celle-ci dissout environ 6 fois plus de Sr qu’en présence d’acides
organiques.
Le cobalt est peu solubilisé en présence d’acides organiques. L’acide succinique est à
nouveau l’acide qui entraîne la plus forte solubilisation et la concentration en solution
augmente lorsque le pH diminue. Cependant, P. polymyxa dissout 20 fois plus de Co que les
acides organiques qu’elle produit.
Les mêmes conclusions peuvent être tirées avec le Ni et le Pb.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
203
0
100
200
300
400
500
600
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Fe d
isso
us p
ar a
cide
s (µ
g/L)
0
10000
20000
30000
40000
50000
60000
Fe d
isso
us p
ar P
.pol
ymyx
a (µ
g/L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
a) Fe
0
100
200
300
400
500
600
700
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Mn
diss
ous
par
acid
es (µ
g/L)
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
Mn
diss
ous
par
P.p
olym
yxa
(µg/
L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
b) Mn
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
204
0
50
100
150
200
250
300
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Sr d
isso
us p
ar a
cide
s (µ
g/L)
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Sr d
isso
us p
ar P
.pol
ymyx
a (µ
g/L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
c) Sr
0,00
0,20
0,40
0,60
0,80
1,00
1,20
1,40
1,60
1,80
2,00
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Co d
isso
us p
ar a
cide
s (µ
g/L)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Co d
isso
us p
ar P
.pol
ymyx
a (µ
g/L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
d) Co
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
205
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Ni d
isso
us p
ar a
cide
s (µ
g/L)
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Ni d
isso
us p
ar P
.pol
ymyx
a (µ
g/L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
e) Ni
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
5,00 5,50 6,00 6,50 7,00
pH
Pb d
isso
us p
ar a
cide
s (µ
g/L)
0,00
1,00
2,00
3,00
4,00
5,00
6,00
Pb d
isso
us p
ar P
.pol
ymyx
a (µ
g/L)
lactique (700mg/L) Acétique (400mg/L)Succinique (480mg/L) Paenibacillus polymyxa
f) Pb
Figure 40 : Concentrations en métaux dissous en présence des acides lactique, acétique, succinique et de la bactérie P.polymyxa en fonction du pH
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
206
III.2.2. Etude quantitative
Afin d’étudier plus précisément la dissolution des métaux par complexation avec les acides
organiques produits par P. polymyxa, d’une part et par l’ensemble de la communauté
microbienne, d’autre part, nous avons modélisé la spéciation des espèces métalliques
dissoutes en fonction du pH, à l’aide de Visual Minteq.
Pour chaque acide organique étudié, nous avons utilisé les concentrations en éléments
métalliques et éléments majeurs (Ca, Mg, Na, K) mesurées en ICP-AES et ICP-MS lors des
expériences réalisées à l’aide du pH-stat à pH 6,5 ainsi que les concentrations en sulfates
mesurées lors des incubations en présence de la communauté microbienne totale (chapitre 2)
(annexe 12). De plus pour le fer, des calculs réalisés à partir de la constante de solubilité du
fer III ont montré que la majorité du fer était sous forme réduite. Ceci est confirmé par la
valeur du potentiel d’oxydo-réduction que nous avons estimé à partir de l’étude de Miao et al.
(2006). En passant d’un milieu oxydant à un milieu réducteur, ces auteurs ont montré une très
forte dissolution du fer et du manganèse, éléments les plus sensibles aux conditions d’oxydo-
réduction comme ce que l’on a pu observer pour des Eh compris entre -200 et -150 mV.
Les concentrations en fer utilisées pour les simulations sont donc celles du fer ferreux. Nous
avons alors simulé une titration de pH 6,5 à pH 1 afin d’estimer la concentration des
différentes espèces métalliques et donc le pouvoir complexant des acides organiques sur une
large gamme de pH. Cette gamme permet de déterminer la zone de pH dans laquelle les
acides ont le pouvoir complexant maximal et ainsi proposer des réactifs chimiques permettant
de mieux appréhender les phénomènes de solubilisation en milieu naturel par rapport à ceux
traditionnellement utilisés (acide oxalique, EDTA…).
Pour chacun des acides, nous n’avons représenté que les espèces métalliques dont les
distributions étaient supérieures à 1 %. De plus, nous avons représenté l’évolution des
distributions par groupes d’éléments métalliques précédemment définis :
- groupe 1 : Fe, Mn et Sr qui sont les éléments majoritairement dissous lors de
l’incubation avec P. polymyxa,
- groupe 2 : Co, Ni et Pb
- groupe 3 : Cd et Cu.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
207
III.2.2.1. Acide acétique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Fe+2Fe-Acetate+Mn+2Mn-Acetate+Sr+2Sr-Acetate+
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pHPo
urce
ntag
e
Co+2Co-Acetate+Ni+2Ni-Acetate+Pb+2Pb-Acetate+Pb-(Acetate)2 (aq)
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Cd+2Cd-Acetate+Cu+2Cu-Acetate+Cu-(Acetate)2 (aq)
c) groupe 3
Figure 41 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’acétate (400 mg.l-1)en fonction du
pH
Les résultats montrent que l’acide acétique est un faible complexant pour les espèces majeures
c’est-à-dire le fer, le manganèse et le strontium (groupe 1) (figure 41). En effet, quel que soit
le pH étudié plus de 90 % de ces espèces se trouvent sous forme libre. Pour les ETM du
groupe 2, seul le plomb est lié à l’acétate à près de 60 % si l’on considère les deux formes
complexées et ceci entre pH 6,5 et 5, soit la gamme de pH dans laquelle se déroulent les
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
208
incubations. Entre 20 et 30 % du Cd et entre 30 et 40 % du Cu sont liés à l’acétate entre pH
6,5 et 5.
III.2.2.2. Acide lactique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Fe+2Mn+2Mn-Lactate+Sr+2Sr-Lactate+
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Co+2Co-(Lactate)2 (aq)Co-Lactate+Ni+2Ni-(Lactate)2 (aq)Ni-Lactate+Pb+2Pb-(Lactate)2 (aq)Pb-Lactate+
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Cd+2Cd-(Lactate)2 (aq)Cd-Lactate+Cu+2Cu-(Lactate)2 (aq)Cu-Lactate+
c) groupe 3
Figure 42 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au lactate (700 mg.l-1) en fonction du
pH
Les éléments métalliques du groupe 1 sont très peu complexés au lactate (figure 42). Le
manganèse est l’élément le plus complexé au lactate : légèrement supérieur à 10 % entre pH
6,5 et 5. Les éléments du groupe 2 sont nettement plus complexés au lactate. Le plomb est lié
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
209
au lactate à plus de 70 %, le nickel à environ 45 % et le cobalt à environ 30 %. Pour les
éléments du groupe 3, le Cu est complexé à plus de 85 % au lactate et le cadmium à
seulement 20 % entre pH 6,5 et 5.
III.2.2.3. Acide succinique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pou
rcen
tage
Fe+2Mn+2Mn-Succinate (aq)MnH-Succinate+Sr+2SrH-Succinate+Sr-Succinate (aq)
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pou
rcen
tage
Co+2CoH-Succinate+Co-Succinate (aq)Ni+2NiH-Succinate+Ni-Succinate (aq)Pb+2PbH-(Succinate)2-PbH-Succinate+Pb-(Succinate)2-2Pb-Succinate (aq)
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pou
rcen
tage
Cd+2CdH-Succinate+Cd-Succinate (aq)Cu+2CuH-Succinate+Cu-Succinate (aq)
c) groupe 3
Figure 43 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au succinate (480 mg.l-1) en fonction
du pH
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
210
L’acide succinique se complexe plus fortement les éléments du groupe 1 que les deux acides
précédents (figure 43), hormis le fer qui se trouve à presque 100 % sous forme libre. Si le
succinate est lié au manganèse à un peu plus de 20 % à pH 6,5, ce pourcentage diminue
rapidement pour n’atteindre que 8 % à pH 5. Le strontium suit la même tendance que le
manganèse. Au cours des incubations menées avec P.polymyxa, nous observions des
tendances similaires de dissolution du Sr et du Mn, qui étaient principalement liés à la phase
acido-soluble. On peut donc supposer qu’une partie de la dissolution de ces deux éléments est
liée à la complexation par l’acide succinique produit par cette bactérie. Dans le groupe 2, le
plomb est l’élément majoritairement complexé par le succinate, entre 80 et 90 % de Pb-
succinate entre pH 5 et 6,5. Ces pourcentages diminuent ensuite rapidement lorsque le pH est
inférieur à 5. La complexation du Co et du Ni par le succinate suivent les mêmes tendances,
passant de 30 à 10 % d’espèces complexées entre pH 6,5 et 5. Enfin pour le groupe 3, le Cu
est complexé au succinate entre 50 et 75 % et le Cd entre 15 et 35 % entre pH 5 et 6,5.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
211
III.2.2.4. Acide propionique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age Fe+2
Mn+2Sr+2Sr-Propionate+
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Co+2Co-Propionate+Ni+2Ni-Propionate+Pb+2Pb-Propionate+Pb-(Propionate)2 (aq)
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age Cd+2
Cd-Propionate+Cu+2Cu-Propionate+
c) groupe 3
Figure 44 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées au propionate (100 mg.l-1) en fonction
du pH
L’acide propionique se complexe très faiblement aux éléments métalliques quel que soit le
groupe d’éléments considérés (figure 44). En effet, le fer, le manganèse et le strontium sont
quasiment uniquement sous forme libre. Dans le groupe 2, le plomb est l’élément le plus
fortement complexé à l’acide propionique, entre 20 et 30 %, entre pH 5 et 6,5. Enfin, dans le
groupe 3, le cuivre est complexé entre entre 10 et 12 % et le cadmium à environ 3 entre pH 5
et 6,5.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
212
III.2.2.5. Acide butyrique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age Fe+2
Mn+2Sr+2Sr-Butyrate+
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pHPo
urce
ntag
e
Co+2Co-Butyrate+Ni+2Ni-Butyrate+Pb+2Pb-Butyrate+
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Cd+2Cu+2Cu-Butyrate+
c) groupe 3
Figure 45 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liée au butyrate (1 g.l-1) en fonction du pH
De même que l’acide propionique, l’acide butyrique complexe très peu les éléments
métalliques, quel que soit le groupe étudié. Le nickel et le cuivre sont les deux éléments les
plus fortement complexés au propionate, entre 40 et 45 % entre pH 5 et 6,5.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
213
III.2.2.6. Acide oxalique
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Fe+2Fe-(Oxalate)2-2Fe-Oxalate (aq)Mn+2Mn-(Oxalate)2-2Mn-Oxalate (aq)Sr+2Sr-Oxalate (aq)
a) groupe1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pHPo
urce
ntag
e
Co+2CoH-Oxalate+Co-(Oxalate)2-2Co-OxalateNi+2Ni-(Oxalate)2-2Ni-Oxalate (aq)Pb+2PbH-Oxalate+Pb-(Oxalate)2-2
b) groupe 2
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6 7
pH
Pour
cent
age
Cd+2Cd-(Oxalate)2-2Cd-Oxalate (aq)Cu+2Cu-(Oxalate)2-2Cu-Oxalate (aq)
c) groupe 3
Figure 46 : Evolution de la distribution des espèces métalliques liées à l’oxalate (1 g.l-1) en fonction du pH
L’acide oxalique complexe très fortement les ETM en solution, à plus de 95 % si l’on
additionne les espèces complexées (figure 46) entre pH 5 et 6,5. Le Sr est le seul élément qui
se complexe le moins à l’acide oxalique, entre 46 et 48 % entre pH 5 et 6,5.
En conclusion, on observe que les acides organiques produits par les microorganismes ont des
propriétés complexantes en solution différentes vis-à-vis des éléments métalliques (tableau
37).
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
214
Tableau 37 : Pourcentage des formes complexées aux acides entre pH 5 et 6,5
Acide acétique (400 mg.l-1)
Acide lactique (700 mg.l-1)
Acide succinique (480 mg.l-1)
Acide propionique (100 mg.l-1)
Acide butyrique (1000 mg.l-1)
Acide oxalique (référence) (1000 mg.l-1)
Fe <10 % - - - - 97-98% Mn <10 % ≈ 10 % 8-20 % - - 96 % Sr <10 % 5 % 8-20 % - 5 % 46-48 % Co <10 % 30 % 10-30 % - 5 % ≈ 100 % Ni <10 % 45 % 10-30 % - 5 % ≈ 100 %
Pb 60 % > 70 % 80-90 % 20-30 % 38-45 % ≈ 100 % Cd 20-30 % 20 % 15-35 % <5 % - 95 % Cu 30-40 % 85 % 50-75 % 10-12 % 40-45 % ≈ 100 %
Ainsi, l’acide propionique est l’acide le moins complexant, suivi de l’acide butyrique. A
l’inverse, l’acide succinique est l’acide dont la forme complexée aux métaux est la plus
importante. Si l’on analyse le pourcentage de forme complexée par éléments métalliques, on
remarque que quel que soit l’acide, le fer est majoritairement sous forme libre, sauf pour
l’acétate. Le plomb et le cuivre sont les éléments dont les pourcentages de formes complexées
sont les plus importants. Par ailleurs, les acides organiques produits ont un faible pouvoir
complexant si l’on compare les pourcentages d’espèces complexées pour chaque acide par
rapport à ceux obtenus avec l’acide oxalique.
Cependant, dans la discussion ci-dessus, nous n’avons pas pris en compte l’effet du pH. Il
nous faut donc distinguer l’effet du pH de celui du pouvoir complexant des acides organiques.
Nous nous sommes donc placés à pH 6. Ce pH est la valeur minimale obtenue lors de
l’incubation avec P.polymyxa. Ceci permettra donc de comparer ensuite directement, l’effet
du pH, des acides organiques et de la capacité réductrice de P.polymyxa dans la solubilisation
des éléments métalliques.
Afin de distinguer l’effet du pH de l’effet de complexation, nous avons calculé une valeur
théorique totale de métaux dissous (tableau 38) à partir des concentrations dissoutes dans le
blanc (effet pH) et du pourcentage complexés aux acides déterminés lors de la modélisation
selon la formule : Mtot = Mblanc + M-acide avec
Mtot = concentration totale dissoute du métal (µg.l-1),
Mblanc = concentration dissoute du métal dans le blanc (µg.l-1) (effet pH)
M-acide = concentration dissoute du métal complexé à l’acide organique (µg.l-1) (effet
complexant de l’acide organique)
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
215
Tableau 38 : Comparaison des teneurs totales théoriques et expérimentales extraites en métaux à pH 6 en
présence d’acides organiques (µg.l-1)
Groupe 1 Fe Mn Sr Total théo Total exp Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 30 14 400 157 166 123 butyrate 27 16 360 266 163 155 Lactate 27 56 410 230 164 208 Propionate 27 22 360 271 158 154 Succinate 27 83 449 447 183 201 Oxalate 1319 49 10635 56 301 20 Blanc expérimental (effet pH)
27 360 158
Groupe 2 Co Ni Pb Total théo Total exp Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 0,64 0,35 1,12 0,61 0,05 0,12 butyrate 0,59 0,58 1,04 0,7 0,03 0,11 Lactate 0,83 0,29 1,91 0,61 0,08 0,24 Propionate 0,58 0,71 1,02 0,93 0,02 0,15 Succinate 0,79 0,68 1,40 0,82 0,23 0,2 Oxalate 305 0,38 8357 0,89 13 0,19 Blanc expérimental (effet pH)
0,58 1 0,02
Groupe 3 Cd Cu Total théo Total exp Total théo Total exp Acetate 0,03 0,01 0,91 0,76 butyrate 0,02 0,02 1,00 1,2 Lactate 0,03 0,01 4,21 1,91 Propionate 0,02 0,03 0,61 1,45 Succinate 0,03 0,01 2,13 3,92 Oxalate 0,46 0,01 178 1,45 Blanc expérimental (effet pH)
0,02 0,53
Si l’on compare les valeurs expérimentales de concentrations métalliques dissoutes par les
acides organiques par rapport aux concentrations obtenues dans le blanc à pH 6, on constate,
d’une manière générale, que les acides organiques ont une très faible influence sur la
dissolution des éléments métalliques. Ceci confirme les résultats obtenus par Münch (1983),
Rajot (1992) et Bousserrhine (1995) qui observaient une très faible dissolution des éléments
métalliques par les produits de fermentation des bactéries ferri-réductrices.
De plus, on observe des différences entre les concentrations théoriques totales et celles
trouvées expérimentalement quel que soit l’élément métallique considéré. En particulier, des
différences très importantes sont observées entre les concentrations dissoutes expérimentales
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
216
et celles théoriquement attendues pour l’acide oxalique alors que celui-ci est un très fort
complexant métallique et devrait donc fortement dissoudre les métaux. On pourrait donc
supposer que les acides organiques jouent un rôle très faible dans la dissolution des éléments
métalliques et que la dissolution des métaux observés est due principalement à un effet
cinétique. En effet, les tests ont été effectués sur 24 h. Si l’on avait laissé les sédiments plus
longtemps en contact avec les acides organiques aux pH étudiés, les concentrations dissoutes
par complexation auraient certainement été plus importantes.
On pourrait donc à partir de la concentration dissoute en 24 h estimer la concentration
dissoute en n jours et arriver ainsi à une concentration maximale désorbée et ainsi à un
pourcentage maximal de désorption métallique non lié à l’activité réductrice de P. polymyxa
mais due à la complexation par les acides organiques à un pH donné.
III.2.2.7. Mélange d’acides en présence de Paenibacillus
polymyxa
Lors de l’incubation avec Paenibacillus polymyxa, l’acide acétique, lactique et succinique
sont produits simultanément. Nous avons donc simulé la distribution des espèces métalliques
en solution en présence de ces trois acides. Cette distribution a été simulée à pH 6 avec les
concentrations métalliques déterminées expérimentalement et en tenant compte également des
sulfures présents dans le milieu (tableau 39 et annexe 13). Les éléments métalliques du
groupe 1 sont majoritairement sous forme libre, entre 76 et 91 %. L’acétate est ensuite l’acide
organique auquel le Fe, Mn et Sr sont le plus lié alors que les simulations réalisées avec les
acides seuls montraient que le succinate était l’acide succinique le plus complexant.
Pour le groupe 2, le Co et le Ni sont majoritairement sous forme libre avec 75 et 72 % de Co2+
et Ni2+. Le Pb2+ ne représente que 17 % des espèces de Pb en solution. Cela confirme les
résultats obtenus lors des modélisations réalisées avec les acides organiques seuls dans
lesquelles nous avons pu observer que le Pb était l’un des éléments qui se complexait le plus
aux acides organiques. Le cobalt se complexe à l’acétate, au lactate et succinate dans les
mêmes proportions alors que le nickel se complexe davantage au lactate. Le plomb est
majoritairement complexé au succinate (42 %) et à l’actétate (25 %).
Enfin, pour le groupe 3, le cadmium est majoritairement sous forme libre (65 %) puis
complexé à l’acétate. Le cuivre est majoritairement lié au lactate (26 %), ce qui concorde avec
les simulations réalisées avec les acides seuls où le cuivre était complexé à 85 % au lactate.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
217
Tableau 39 : Estimation par Visual Minteq de la distribution (%) des espèces métalliques à pH 6 dans les
incubations réalisées avec P.polymyxa
M libre M-acetate M-lactate M-succinate Fe 76 7 - - Mn 79 8 3 4 Sr 91 5 1 3 Co 74 7 8 6 Ni 64 7 12 5
Pb - - - - Cd 65 21 4 7 Cu 26 17 39 17
III.3. Bilan : Comparaison de l’effet du pH, des acides organiques
et de l’activité réductrice de Paenibacillus polymyxa.
Afin de comparer l’effet du pH, des acides organiques et de l’activité réductrice de
Paenibacillus polymyxa, nous avons calculé le pourcentage de chacun de ces facteurs à partir
de la concentration totale dissoute obtenue lors de l’incubation avec P. polymyxa et qui, par
conséquent, tenait compte de tous ces paramètres. Les calculs ont été effectués à pH 6.
Les concentrations dissoutes dues à l’activité réductrice de P. polymyxa ont été calculées, par
différence, en retranchant aux concentrations totales, les concentrations dissoutes par l’effet
pH et celles dissoutes par le pouvoir complexant des acides lactique, acétique et succinique
(tableau 40). Tableau 40 : Part (%) de l’activité réductrice de P.polymyxa, du pH 6 et des acides organiques dans la
solubilisation des éléments métalliques
Activité réductrice
Effet pH Complexation par les acides organiques
Total Paenibacillus polymyxa
HNO3 Acide lactique
Acide acétique
Acide succinique
Cd (µg.l-1) 0,02 ? 0,02 0,03 0,03 0,03 Co (µg.l-1) 35 32,16 0,58 0,83 0,64 0,79 Pourcentage 100 91,88 1,65 2,37 1,82 2,25 Cu (µg.l-1) 8 3,6 0,53 0,76 1,2 1,91 Pourcentage 100 45 6,62 9,5 15 23,87 Fe (µg.l-1) 48500 48302 28 56 31 83 Pourcentage 100 99,59 0,05 0,11 0,06 0,17 Mn (µg.l-1) 6300 4681 360 410 400 449 Pourcentage 100 74 5,71 6,51 6,35 7,12 Ni (µg.l-1) 39 33 1 1,91 1,12 1,4 Pourcentage 100 86 2,56 4,89 2,87 3,59 Pb (µg.l-1) 5 4 0,02 0,24 0,12 0,2 Pourcentage 100 88 0,4 4,8 2,4 4 Sr (µg.l-1) 1500 768 157 208 166 201 Pourcentage 100 51 10,47 13,87 11,01 13,4
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
218
III.3.1. Eléments du groupe 1 (Fe, Mn, Sr)
Le fer solubilisé provient à plus de 99 % de l’activité réductrice de P.polymyxa. Le pH et les
acides organiques ont donc un très faible pouvoir de dissolution du fer en milieu réducteur. Le
manganèse dissous provient à 74 % de l’activité réductrice de P.polymyxa. Les effets du pH et
des acides organiques sont sensiblement équivalents et participent entre 5 et 7 % à la
dissolution du Mn. Bien que la courbe de dissolution du Sr soit similaire à celle du Fe, les
résultats montrent que finalement l’activité réductrice microbienne ne compte que pour 51 %
de la dissolution totale de cet élément. Environ 13 % du Sr est dissous par complexation avec
les acides acétique et succinique et 11 % par l’acide acétique. L’effet du pH compte pour 10
%. L’effet de l’acidité et de la complexation par les acides organiques est compatible avec le
fait que le Sr était principalement lié aux carbonates, phase sensible aux variations de pH. De
même, le Mn semblait également principalement lié aux carbonates. On aurait donc pu
s’attendre aussi à un effet plus important du pH et des acides organiques dans la dissolution
du Mn. Cependant, les bactéries ferri-réductrices peuvent aussi réduire le manganèse des
oxydes de manganèse avant les oxydes de fer (Lovley, 1991), ce qui s’est vraisemblablement
produit dans les incubations.
III.3.2. Eléments du groupe 2 (Co, Ni, Pb)
L’activité réductrice de P. polymyxa contribue à près de 92 % du Co mis en solution. Puisque
le fer dissous provient à plus de 99 % de l’activité ferri-réductrice et que les courbes de
dissolution du Fe et du Co ont le même profil et que le Co est en majorité fixé sur la phase
réductible des oxydes de fer, on en déduit que le Co est issu de cette phase et est donc dissous
lors de la réduction microbienne des oxydes de fer. Les mêmes conclusions peuvent être tirées
pour la dissolution du Ni, qui provient à 86 % de l’activité réductrice de P. polymyxa.
Cependant, le Ni est principalement fixé sur la phase réductible «oxydes de fer cristallisés ».
On peut donc penser que P. polymyxa réduit aussi une partie de cette phase. Les résultats
trouvés pour le Co et le Ni en relation avec l’activité des bactéries ferri-réductrices a déjà été
observée dans des sols ferralitiques hydromorphes (Quantin et al, 2001).
Le Pb provient à 88 % de l’activité ferri-réductrice de P. Polymyxa. Le pH a un très faible
impact sur la mobilité du Pb. L’acide acétique et succinique contribuent, respectivement, à 5
et 4 % de la dissolution du Pb en solution. La dissolution du Pb est donc liée à la réduction
des oxydes de fer et ceci d’autant plus que la courbe de dissolution du Pb était similaire à
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Résultats et discussion
219
celle du Fe et que le Pb se trouve majoritairement dans les phases réductibles « oxydes de Fe
amorphes » et « oxydes de Fe cristallisés ».
III.3.3. Eléments du groupe 3 (Cd, Ag)
Il est particulièrement difficile d’estimer l’origine de la dissolution du Cd et de l’Ag car ces
éléments sont en très faibles concentrations dans les incubations. L’activité ferri-réductrice ne
semble pas à l’origine de leur dissolution. Il se pourrait que ces éléments se trouvent sur la
phase échangeable ou extractible à l’eau ou dans la fraction résiduelle. Comme ces éléments
étaient présents en faibles teneurs dans les sédiments, respectivement 0 ,35 et 0,38 µg.g-1, il a
été particulièrement difficile de les doser en solution et lors des extractions séquentielles.
C’est pourquoi il serait hasardeux de tenter d’émettre des hypothèses quant à l’origine exacte
de leur solubilisation.
Chapitre 4 : Rôle de l’acidification et des métabolites microbiens dans la mobilité des ETM
Conclusions et perspectives
220
IV. Conclusions et perspectives
L’objectif de ce chapitre était de comparer la part de l’acidification et de la complexation par
les acides organiques dans la dissolution des éléments métalliques par rapport à la réduction
enzymatique effectuée par les bactéries ferri-réductrices et en particulier par Paenibacillus
polymyxa.
Il en résulte que l’activité réductrice contribue à plus de 99 % à la dissolution du fer, 92 % du
cobalt, 88 % du Pb, 86 % du Ni et 74 % du Mn. Ceci montre donc que la majorité des métaux
dissous provient des phases réductibles « oxydes de fer amorphes » et « oxydes de fer
cristallisés ». Le pH et les acides organiques ont un faible rôle dans la dissolution des métaux,
hormis pour le Sr pour lequel 10 % proviennent du pH et 37 % des acides organiques.
Les acides organiques les « plus » impliqués dans la dissolution des ETM sont les acides
acétique et succinique.
Ces résultats confirment ceux observés par Münch (1983), Rajot (1992) et Bousserrhine
(1995) qui avaient montré que la dissolution des ETM co-précipités sur les oxydes de fer
nécessitait un contact direct entre la bactérie et les oxydes de fer. Néanmoins, notre étude a
permis de quantifier plus précisément la contribution de chacun des paramètres à la
dissolution des éléments métalliques.
Conclusions générales et perspectives
221
Conclusions générales et perspectives
Conclusions générales et perspectives
222
La mobilité des éléments traces métalliques dans les sols et sédiments dépend des conditions
environnementales. En particulier, le pH du milieu et le potentiel d’oxydo-réduction sont des
paramètres majeurs modifiant la distribution des ETM dans les phases minérales et
organiques constituant les sols et sédiments (Sposito, 1989; Stumm et Morgan, 1996).
Cependant, ces paramètres environnementaux sont, dans la majorité des cas, modifiés par
l’activité des microorganismes autochtones. Ainsi, ces derniers peuvent être à l’origine d’une
solubilisation des ETM par des mécanismes directs ou indirects, tels que l’oxydation, la
réduction, la protonation et la complexation (Gadd, 2000; Ledin, 2000; Gadd, 2004). Si la
plupart de ces phénomènes sont bien décrits dans les sols, rares sont les études qui s’y sont
intéressé dans les sédiments. La connaissance de ces mécanismes est cependant primordiale
pour comprendre la mobilité des ETM dans les sédiments, d’une part et des sédiments vers les
nappes phréatiques et eaux superficielles, d’autre part. Une telle connaissance est également
importante pour la gestion des sédiments, notamment lors de leur stockage suite aux
opérations de dragage, où des conditions aérobie et anaérobie peuvent se succéder.
Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de
certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans des sédiments de
compositions chimiques et minéralogiques différentes (Marne et Seine) en condition
anaérobie.
Les incubations des différents sédiments effectuées en microcosmes et en milieu anaérobie,
montrent qu’en présence d’une source de carbone facilement dégradable, telle que le glucose,
les communautés microbiennes autochtones mettent en place un métabolisme fermentaire.
Les acides organiques, tels que l’acide acétique, lactique, butyrique et propionique ainsi que
du dioxyde de carbone sont les principaux produits observés. De plus, le milieu de culture
s’acidifie. Parallèlement, à cette fermentation, une dissolution de certains éléments
métalliques se produit. Le fer est l’élément le plus solubilisé et se trouve sous forme réduite.
Sa solubilisation est fortement corrélée à celle du manganèse, cobalt, cuivre et nickel. On peut
donc supposer que ces métaux sont associés aux oxydes de fer, ce qui est confirmé par les
extractions séquentielles. Un tel résultat a souvent été rapporté dans les sols (Lovley, 1991,
Bousserrhine, 1995, Quantin et al., 2001) et indique la présence de bactéries ferri-réductrices
qui couplent fermentation du glucose à la réduction des oxydes de fer, entraînant ainsi la
dissolution des ETM associés. Dans notre étude, les oxydes de fer servent de puits mineurs
d’électrons puisque le pourcentage des équivalents d’électrons produits et utilisés pour la
Conclusions générales et perspectives
223
réduction n’excède pas 6 %, quel que soit le sédiment considéré. Ces résultats sont en accord
avec ceux rapportés par Lovley (1991).
Les analyses minérales de la solution montrent que parallèlement au processus de réduction
du fer, des phénomènes de sulfato-réduction se produisent. Ce dernier phénomène pourrait
être à l’origine de la formation de sulfures de fer. L’ampleur de ces processus reste cependant
minoritaire comparativement à la réduction microbienne des oxydes de fer.
L’utilisation d’outils moléculaires nous a permis d’identifier les bactéries ferri-réductrices
majoritaires dans l’un des deux sédiments étudiés (la Marne) : Clostridium butyricum et
Paenibacillus polymyxa. Ces bactéries ont déjà été rapportées pour leur capacité à fermenter
la matière organique, en particulier le glucose, avec réduction dissimilatrice des oxydes de fer,
en particulier les oxydes de fer amorphes. Il est intéressant de noter que, malgré le fait que les
sédiments soient complètement différents d’un point de vue minéralogique, les communautés
microbiennes (analyse par DGGE) et les processus métaboliques (étude du métabolisme,
Biolog…) mis en place semblent similaires.
Une acidification du milieu et une apparition d’acides organiques se sont produit dans les
incubations. Nous avons alors souhaité évaluer la contribution de la baisse du pH et de la
complexation par les acides organiques (solubilisation indirecte) des métaux par rapport à
celle liée à la réduction bactérienne des oxydes de fer (solubilisation directe).
Pour ce faire, nous avons étudié :
- la capacité solubilisatrice de l’une des deux bactéries ferri-réductrices majoritaires
identifiées, Paenibacillus polymyxa, en la mettant en contact avec un sédiment de Marne
préalablement stérilisé,
- les propriétés complexantes des acides organiques avec les éléments métalliques en les
mettant en contact avec ces mêmes sédiments et
- l’effet de l’acidification en réalisant la même expérimentation avec de l’eau ultrapure dans
les mêmes conditions de pH que précédemment.
Comparativement à ce qui a été rapporté par d’autres auteurs (Bousserrhine, 1995 ; Rajot,
1992 ; Munch et Ottow, 1983), les résultats obtenus montrent, de façon plus fine, que
l’acidification du milieu impacte très peu sur la solubilité des éléments métalliques. De même,
Conclusions générales et perspectives
224
la complexation par les acides organiques entraîne une dissolution des métaux très faible : les
concentrations en ETM dissous sont 10 à 40 fois plus faibles que celles observées lors de
l’incubation avec P.polymyxa. La réduction enzymatique directe du fer semble donc être le
processus majeur (>75 %) dans les phénomènes de solubilisation des éléments métalliques en
milieu anaérobie, notamment pour le fer, le manganèse, le cobalt, le nickel et le plomb. Les
acides organiques et le pH des incubations contribuent surtout à la dissolution du Sr, la
réduction enzymatique ne comptant que pour 51 %. De plus, les extractions séquentielles
montrent que P. polymyxa réduit principalement les oxydes de fer amorphes comme cela est
le cas pour de nombreuses bactéries ferri-réductrices (Lovley, 1991).
Au terme de ce travail de recherche, et bien que nous ayons mis en évidence l’importance des
bactéries ferri-réductrices dans la mobilité des métaux dans les sédiments en milieu anaérobie,
certaines questions demeurent posées.
Si l’ajout de glucose avait pour objectifs de stimuler la croissance et l’activité microbienne,
cette source a probablement favorisé certaines souches bactériennes, notamment celles qui
fermentent. On peut donc se poser la question de savoir si l’utilisation d’autres sources de
carbone, telles que des matières organiques naturelles, conduirait aux mêmes observations ou
favoriserait d’autres groupements fonctionnels. L’utilisation de l’acétate pourrait constituer
une piste intéressante de ce point de vue car cette source de carbone est plus souvent
rencontrée dans le milieu naturel que le glucose. Il constitue également un substrat de choix
pour certains microorganismes hétérotrophes anaérobies.
L’étude menée a souligné l’effet mineur de paramètres comme le pH et la complexation par
les produits métaboliques dans les phénomènes de dissolution des éléments métalliques
observés. Il reste cependant à évaluer l’effet de ces mêmes paramètres dans des conditions
d’oxydo-réduction similaires à celles rencontrées dans les sédiments. En particulier, il serait
intéressant de simuler des remises en suspension de sédiments en passant d’un milieu
anaérobie à un milieu aérobie et d’étudier la mobilité des métaux ainsi que les modifications
des communautés microbiennes et d’établir un lien entre ces deux phénomènes.
Les résultats obtenus ouvrent une voie vers la mise en place de nouvelles méthodes
d’extraction séquentielle impliquant des microorganismes. En effet, les reproches faits aux
méthodes chimiques classiques résident dans le fait que les réactifs utilisés manquent de
Conclusions générales et perspectives
225
sélectivité et sont loin de prendre en compte l’activité microbienne autochtone et ses
conséquences sur le relargage des ETM. Ces conséquences, ainsi que nous venons de le voir,
peuvent être très importantes. Une nouvelle façon de réaliser des extractions séquentielles
pour estimer la part des ETM liée aux différentes fractions du sédiment serait donc d’avoir
recours à certaines « bactéries phase spécifique » : les bactéries ferri-réductrices non
fermentatrices semblent être des candidates idéales pour estimer la part des ETM liée aux
oxydes de fer amorphes La mise en œuvre de tels procédés implique cependant l’utilisation de
milieux de culture simples et la maîtrise des métabolismes microbiens. De plus, ainsi que l’a
montré la modélisation de la cinétique d’extraction séquentielle, l’activité de P.polymyxa
conduit également à une dissolution des métaux échangeables et de ceux liés aux carbonates
et oxydes de Mn. Aussi, pourrait-on envisager de combiner les extractions séquentielles
chimiques et microbiennes afin d’affiner la quantification des teneurs en métaux sur les
différentes phases des sols et sédiments.
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Annexes
254
Annexes
Annexes
255
Annexe 1 : Caractéristiques analytiques de la mesure du CO2
Les mesures de CO2 ont été réalisées à l’aide d’un spectromètre infra-rouge (Beryl 100
Cosma). Un flux d’azote traverse le détecteur infrarouge. Le gaz contenu dans la seringue de
prélèvement est injecté dans le flux d’azote et la concentration par pic de CO2 est rapportée
lors de la traversée du détecteur.
La précision et la justesse de la mesure de CO2 a été déterminée en injectant 10 fois un certain
volume de CO2 pur contenu dans un flacon sérum de 250 ml (330 mL en réalité) et prélevé à
l’aide d’une aiguille et d’une seringue dans les mêmes conditions que les prélèvements
effectués au cours de l’incubation.
Les résultats obtenus sont regroupés dans les Tableau 41, 42, 43 et 44 et figure 47.
Les masses de CO2 injectées ont été calculées en tenant compte de la diminution de la
pression partielle de CO2 dans le flacon due aux prélèvements successifs (tableaux 41 et 43).
Puis nous avons représenté les concentrations maximales lues sur le spectrophotomètre en
fonction de la quantité de CO2 injectée (tableau 42 et figure 47). Le gaz porteur diluant le gaz
injecté, nous avons calculé ce facteur de dilution en effectuant le rapport de concentration de
CO2 lu sur la concentration de CO2 dans le flacon (tableau 44). On remarque que le gaz
injecté est moins dilué par le gaz vecteur (N2) lorsqu’un volume plus important est injecté.
Aussi, avons-nous corrigé toutes nos valeurs mesurées en tenant compte du facteur 130 ± 4
obtenu lors de l’injection d’1 ml de CO2, quantité d’air injectée lors des incubations. Par
ailleurs, il est à noter que cette procédure d’étalonnage pourrait intégrer un éventuel dés-
étalonnage de la pente de réponse de l’appareil.
Annexes
256
Tableau 41 : Masse de CO2 injecté (mg) en tenant compte de la diminution de pression en CO2 dans le
flacon due aux prélèvements successifs pour l’injection
Volume de CO2 injecté (µL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
0,178 0,354 0,528 0,698 0,861 1,018 1,166 1,305 1,433 1,549 0,178 0,354 0,527 0,697 0,860 1,016 1,164 1,302 1,429 1,545 0,177 0,354 0,527 0,696 0,859 1,014 1,162 1,299 1,425 1,540 0,177 0,353 0,527 0,695 0,858 1,013 1,159 1,296 1,421 1,535 0,177 0,353 0,526 0,694 0,856 1,011 1,157 1,292 1,417 1,531 0,177 0,353 0,526 0,693 0,855 1,009 1,154 1,289 1,414 1,526 0,177 0,353 0,525 0,693 0,854 1,007 1,152 1,286 1,410 1,521 0,177 0,353 0,525 0,692 0,852 1,005 1,149 1,283 1,406 1,517 0,177 0,352 0,524 0,691 0,851 1,003 1,147 1,280 1,402 1,512 0,177 0,352 0,524 0,690 0,850 1,002 1,144 1,277 1,398 1,508
Tableau 42 : Concentration maximale de CO2 (vpm) dans le flux d’azote determinée par le
spectrophotomètre Béryl 100 Cosma
Volume de CO2 injecté (µL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
995 2424 3096 3724 4692 5285 5642 5930 6541 6977 923 2520 3192 3750 4613 5041 5564 6105 6401 6628 920 2355 3035 3741 4561 5451 5320 6113 6113 6576 898 2451 3131 3733 4622 5337 5538 5948 6358 6453 968 2520 3070 3924 4483 5267 5581 5939 6270 6279 1047 2451 3140 3994 4439 5320 5669 6017 6323 6558 872 2529 3000 3994 4552 5363 5686 5887 6366 6480 1099 2407 3113 3837 4422 5058 5625 5843 6497 6698 1056 2267 3209 3820 4578 5058 5407 6087 6349 6837 918 2372 3183 3872 4648 4884 5555 5887 6497 6645
Tableau 43 : Pression partielle de CO2 (Pa) dans le flacon au cours des prélèvements successifs
Volume de CO2 injecté (µL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
100000 99697 99095 98198 97014 95554 93831 91859 89656 87241 99970 99637 99005 98079 96867 95380 93632 91637 89412 86977 99939 99577 98915 97960 96720 95207 93433 91414 89168 86713 99909 99516 98825 97841 96574 95034 93235 91193 88925 86450 99879 99456 98735 97722 96427 94861 93037 90972 88682 86188 99849 99396 98645 97604 96281 94688 92840 90751 88441 85927 99818 99335 98556 97486 96135 94516 92643 90531 88199 85667 99788 99275 98466 97367 95990 94344 92446 90312 87959 85407 99758 99215 98376 97249 95844 94173 92250 90093 87719 85148 99728 99155 98287 97132 95699 94002 92055 89874 87480 84890
Annexes
257
Tableau 44 : Facteurs de dilution obtenus en calculant le rapport concentration de CO2 lue sur le
spectrophotomètre (Béryl Cosma 100) sur la concentration de CO2 dans le flacon (vpm)
Volume de CO2 injecté (µL)
100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000
1005 411 320 264 207 181 166 155 137 125 1083 395 310 262 210 189 168 150 140 131 1086 423 326 262 212 175 176 150 146 132 1112 406 316 262 209 178 168 153 140 134 1032 395 322 249 215 180 167 153 141 137 954 406 314 244 217 178 164 151 140 131 1145 393 329 244 211 176 163 154 139 132 908 412 316 254 217 187 164 155 135 128 945 438 307 255 209 186 171 148 138 125 1086 418 309 251 206 192 166 153 135 128
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
0,000 0,500 1,000 1,500 2,000
Quantité de CO2 injectée (mg)
Sig
nal (
vale
ur p
ic) d
e l'a
naly
seur
(vpm
)
Figure 47 : Concentration maximale de CO2 (vpm) mesurée dans le flux d’azote en fonction de la masse de
CO2 injectée (mg)
Annexes
258
Annexe 2 : Caractéristiques analytiques du dosage du glucose par
spectrophotométrie UV (avec le kit D-Glucose, Roche)
D’après la notice du kit, la limite de détection du glucose est 0.2 mg.l-1 d’échantillon pour un
volume maximum de 2 ml d’échantillon. Le domaine de linéarité s’étend sur une gamme de 1
µg à 100 µg de glucose/prise d’essai soit de 0.4 mg pour un volume d’échantillon de 2 ml à 1
g pour un volume d’échantillon de 100 µl.
Concernant la précision de la mesure, entre deux analyses, une différence de 0.005 à 0.01
unité d’absorbance peut être constatée, ce qui correspond à 4-8 mg.l-1 de glucose pour un
échantillon de 100 µl.
Les moyennes des concentrations en glucose analysées avant incubation sont de 5.15 ± 0.53
g.l-1. Nous pouvons donc considérer que les valeurs obtenues sont acceptables.
Annexes
259
Annexe 3 : Caractéristiques analytiques de la séparation et de la
quantification des acides organiques par HPLC
La méthode de séparation des acides organiques a été mise au point à l’aide de solutions
commerciales d’acides organiques (Fluka). La phase mobile est constituée d’un mélange de
KH2PO4 (20mM) ajusté à pH 2,2 avec de l’acide phosphorique (solution A) et d’acétonitrile
(solution B). Un gradient a été réalisé au cours de l’élution avec une pompe Spectra series
P200 selon les conditions suivantes :
1) 0-7 min : 100% de A
2) 7-12 min : 93% de A et 7% de B en gradient linéaire
3) 12-19 min : 93% de A et 7% de B (isocratique)
4) après 19 min, retour aux conditions initiales.
Ces conditions, associées à ce type de colonne, permettent de séparer les acides formique et
pyruvique en début d’analyse puis le gradient permet d’accélérer la sortie des autres acides.
En effet les acides formique et pyruvique sont très difficiles à séparer à cause de leur structure
et de leur polarité très proches.
La vitesse d’élution est de 1 ml.min-1 et le volume injecté est de 100 µl (Shimadzu)
Les composés ont ensuite été détectés en UV à une longueur d’onde de 210 nm (spectromètre
UVD340S, Gynkotek), qui correspond à l’absorbance maximale de tous les acides étudiés.
L’acquisition des chromatogrammes et leur traitement ont été effectués à l’aide du logiciel
Chroméléon.
Les acides ont tout d’abord été injectés un par un afin de déterminer le temps de rétention puis
la répétabilité de la mesure (exemple pour l’acide lactique tableau 45) Tableau 45 : Répétabilité de la mesure de l’acide lactique (20 mg.l-1)
Temps de rétention (min)
Aire du pic (mUA.min)
Hauteur du pic (mUA)
6,3 8,83 55 6,31 8,9 56 6,31 9,11 57 6,28 9,06 58 6,27 9,17 58 6,25 9,15 58 6,24 9,07 58 6,23 9,23 59 6,18 9,08 58 6,19 9,1 58
Annexes
260
Une gamme étalon (0-1 g.l-1), contenant un mélange d’acides, a ensuite été injectée afin de
déterminer le domaine de linéarité de chaque acide (figure 48 et tableau 46)
pyruvique (0-1 mg.l-1)
y = 1,54x + 0,03R2 = 0,9955
0
0,5
1
1,5
2
0 0,5 1 1,5
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
pyruvique (1-5 mg.l-1)
y = 1,6857x - 0,0989R2 = 0,9994
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
pyruvique (5-50 mg.l-1)
y = 1,7777x - 0,6352R2 = 0,9998
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
lactique (20-100 mg.l-1)
y = 0,0759x + 8,0422R2 = 0,9799
0
5
10
15
20
0 50 100 150
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
lactique (100-500 mg.l-1)
y = 0,0858x + 7,9225R2 = 0,9991
0
10
20
30
40
50
60
0 200 400 600
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
Annexes
261
acétique (0-10 mg.l-1)
y = 0,096x - 0,0033R2 = 0,9999
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
0 5 10 15
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
acétique (10-50 mg.l-1)
y = 0,0966x - 0,0079R2 = 1
-1
0
1
2
3
4
5
6
0 20 40 60
Concentration (mg.l-1)
Hau
teur
du
pic
(mU
A)
acétique (50-200 mg.l-1)y = 0,0974x - 0,056
R2 = 0,9999
-5
0
5
10
15
20
25
0 100 200 300
Concentration (mg.l-1)
Hau
teur
du
pic
(mU
A)
acétique (200-1000 mg.l-1)
y = 0,095x + 0,5593R2 = 0,9996
0
20
40
60
80
100
120
0 500 1000 1500
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
succinique (0-10 mg.l-1)y = 0,073x - 0,0017
R2 = 0,9999
00,10,20,30,40,50,60,70,8
0 5 10 15
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
succinique (10-50 mg.l-1)y = 0,0736x + 0,0021
R2 = 1
00,5
11,5
22,5
33,5
4
0 20 40 60
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
succinique (50-200 mg.l-1)
y = 0,0726x + 0,006R2 = 1
02468
10121416
0 100 200 300
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur
du p
ic (m
UA)
succinique (200-1000 mg.l-1)
y = 0,0727x - 0,0996R2 = 0,9999
01020304050607080
0 500 1000 1500
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur
du p
ic (m
UA)
Annexes
262
propionique (0-10 mg.l-1)
y = 0,061x - 0,0083R2 = 0,9978
00,10,20,30,40,50,60,7
0 5 10 15
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
propionique (10-50 mg.l-1)
y = 0,0593x + 0,0068R2 = 1
00,5
11,5
22,5
33,5
0 20 40 60
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
propionique (50-200 mg.l-1)
y = 0,0585x - 0,002R2 = 0,9999
02468
101214
0 100 200 300
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
propionique (200-1000 mg.l-1)
y = 0,0505x + 1,291R2 = 0,9951
0
10
20
30
40
50
60
0 500 1000 1500
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
butyrique (0-10 mg.l-1)
y = 0,021x + 0,0017R2 = 0,9992
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0 5 10 15
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
butyrique (10-50 mg.l-1)
y = 0,0246x - 0,0304R2 = 0,9964
00,20,40,60,8
11,21,4
0 20 40 60
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
butyrique (50-200 mg.l-1)
y = 0,0219x + 0,068R2 = 0,9989
0
1
2
3
4
5
0 100 200 300
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
butyrique (200-1000 mg.l-1)
y = 0,0201x + 0,4167R2 = 0,9949
0
5
10
15
20
25
0 500 1000 1500
Concentration (mg.l-1)
Haut
eur d
u pi
c (m
UA)
Figure 48 : Gammes étalons de chaque acide organique étudié
Annexes
263
Tableau 46 : Domaine de linéarité (mg.l-1) des acides organiques étudiés
Acide Domaine de linéarité (mg.l-1)
Pyruvique 0-50
Lactique 20-500
Acétique 0-1000
Succinique 0-1000
Propionique 0-1000
Butyrique 0-1000
Annexes
264
Annexe 4 : Exemples de gammes d’étalonnage du carbone
organique dissous
a) Gamme faible 29/08/2006 par: C. GOUNOU29/08/2006
381 137518
Gamme d'étalonnage
Position Conc. (mgC/L) Aire (cts) Aire corrigée
(cts)
Erreur sur concentration
(mgC/L)3 0 457 320 0,22484 0,5 3210 3073 0,22295 1 5053 4916 0,22186 2 9092 8955 0,21957 5 21956 21819 0,21488 8 34722 34585 0,21409 11 47657 47520 0,2172
10 15 65541 65404 0,228011 20 89905 89768 0,2528
Rmq : lorsqu'une des valeurs est aberrante ne pas remplir la colonne des concentrations et inscrire "a"
dans la colonne des aires.
Aire du blanc eau (counts) :Delta (counts) :
Gamme préparée le:passée le:
Aire du réactif (counts) :
y = 0,0002268x - 0,0187478R2 = 0,9992909
0
5
10
15
20
25
0 20000 40000 60000 80000 100000Aire corrigée (cts)
Con
cent
ratio
n (µ
gC)
gammed'étalonnage
Linéaire (gammed'étalonnage)
Annexes
265
b) Gamme forte
28/08/2006 par: C. GOUNOU28/08/2006
235 11246
Gamme d'étalonnage
Position Conc. (mgC/L) Aire (cts) Aire corrigée
(cts)
Erreur sur concentration
(mgC/L)3 0 265 254 0,99104 2,5 2700 2689 0,98505 5 5162 5151 0,97946 10 9987 9976 0,96967 20 20141 20130 0,95418 40 40046 40035 0,94579 60 59574 59563 0,9658
10 80 81082 81071 1,018311 100 103569 103558 1,1025
N° ANA002 Version 00
Delta (counts) :
Gamme préparée le:passée le:
Aire du réactif (counts) :
Rmq : lorsqu'une des valeurs est aberrante ne pas remplir la colonne des concentrations et inscrire "a"
dans la colonne des aires.
Aire du blanc eau (counts) :
FEUILLE DE CALCUL COD ETALONNAGE
y = 0,0009774x + 0,2604755R2 = 0,9994853
0
20
40
60
80
100
120
0 20000 40000 60000 80000 100000 120000Aire corrigée (cts)
Con
cent
ratio
n (µ
gC)
gammed'étalonnage
Linéaire (gammed'étalonnage)
Annexes
266
Annexe 5 : Caractéristiques analytiques des mesures de métaux en
ICP-AES et ICP-MS Les limites de détection (µg.l-1) des métaux mesurés en ICP-AES et en ICP-MS sont données
dans les tableaux 47 et 48 : Tableau 47 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-AES
Métal Ag Al B Ba Be Ca Cd Co Cr Cu Fe K Li 1,8 1,6 0,8 0,2 0,05 0,1 0,15 0,6 0,4 0,5 0,3 20 0,1 Métal Mg Mn Mo Na Ni P Pb Sb Si Sn Sr V Zn 0,02 0,05 1 0,5 0,8 3 2 0,8 3 2,5 0,05 0,5 0,2
Tableau 48 : Limites de détection (µg.l-1) des métaux en ICP-MS
Elément Concentration (µg.l-1) 64 Zn 0,03 66 Zn 0,34 63 Cu 0,02 65 Cu 0,04 60 Ni 0,5 61 Ni 0,55 59 Co 0,01 52 Cr 0,01 53 Cr 0,02 107 Ag 0,01 109 Ag 0 111 Cd 0,01 114 Cd 0,01 207 Pb 0,01 209 Pb 0
Pour les analyses en ICP-AES, les courbes d’étalonnages effectuées pour 4 gammes ont
montré que les mesures étaient parfaitement linéaires (r²>0,9999) sur 0-5, 5-20, 20-50, 50-200,
200-1000 µg.l-1. Il en est de même en ICP-MS sur la gamme 0-20 µg. .l-1.
Annexes
267
Annexe 6 : Exemple de gamme d’étalonnage du Fe(II)
y = 0,3027xR2 = 1
0
0,5
1
1,5
2
2,5
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentration (Fe (II) (mg.l-1)
Abso
rban
ce (U
A)
ALinéaire (A)
Annexes
268
Annexe 7 : Spéciation des métaux dans les sédiments
Mise en place et vérification du protocole
Annexes
269
I. Introduction
La plupart des méthodes de spéciation des métaux contenus dans les sédiments s’intéressent
aux métaux associés à la fraction échangeable, liés aux carbonates, aux oxydes de fer et de
manganèse, à la matière organique et à la fraction résiduelle (Tessier et al., 1979;
Quevauviller et al., 1993; Xiao-Quan et al., 1993; Quevauviller et al., 1997; Rauret, 1998;
Tokalioglu et al., 2000; Yu et al., 2001; Baeyens et al., 2003).
Cependant très peu de méthodes de spéciation permettent de différencier les métaux liés à la
matière organique de ceux liés aux sulfures car les métaux associés à ces deux phases sont
solubilisés en une seule étape oxydative. Or, dans le cadre de l’étude du devenir des métaux
présents dans les sédiments sous l’action des microorganismes, il est primordial de pouvoir
déterminer les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures. En effet, ces deux
compartiments ont des devenirs tout à fait différents au sein des processus de diagénèse, et ils
sont tous deux porteurs de quantités éventuellement importantes de métaux traces. Il a été
constaté qu’au cours du temps et sous l’action des bactéries sulfato-réductrices, les métaux
précipitaient sous forme de sulfures (Boust et al, 1999). De même, il a été constaté que
parallèlement à la dégradation de la matière organique par les microorganismes, les métaux se
retrouvaient en solution (Boust et al, 1999). Aussi, est-il important, de pouvoir quantifier à la
fois les métaux liés à la matière organique de ceux liés aux sulfures. Campanella et al. (1995)
propose un protocole permettant de séparer ces deux fractions en utilisant l’hydroxyde de
sodium pour obtenir les métaux liés aux matières organiques (acides fulviques et humiques) et
l’acide nitrique pour obtenir ceux liés aux sulfures (Tableau 49).
Tableau 49 : Protocole d’extraction séquentielle permettant de distinguer les métaux liés à la matière
organique de ceux liés aux sulfures (Campanella et al, 1995)
Réactifs Phases
NH4OAc(1 M), pH 5 Acido-soluble
NH2OH, HCl (1 M) + AcOH (25 %) Réductibles
HCl (0,1 M) Matières organiques
NaOH (0,5 M) Acides humiques
HNO3 (8 M), 85°C Sulfures
Annexes
270
D’autres auteurs (Hall et al., 1996; Hall et al., 1997; Tonelli et al., 1997) proposent d’extraire
les métaux liés à la matière organique en utilisant du pyrophosphate de sodium à la place de
l’hydroxyde de sodium.
En se basant sur le protocole de spéciation de Campanella et al. (1995), les objectifs de ce
travail étaient de
- comparer l’efficacité de l’hydroxyde de sodium par rapport au pyrophosphate de
sodium pour solubiliser les métaux liés à la matière organique,
- vérifier que l’utilisation de l’hydroxyde de sodium n’entraînait pas la formation
d’hydroxyde de métaux lors de la dissolution des métaux liés la matière organique,
- vérifier que l’hydroxyde de sodium et le pyrophosphate de sodium ne mobilisaient pas
également les métaux liés aux sulfures,
- évaluer l’efficacité de dissolution métaux liés aux sulfures en utilisant l’acide nitrique
- appliquer la méthode de spéciation retenue sur des sédiments certifiés et dopés en
acides humiques dopés en métaux et en sulfures de métaux.
II. Matériels et méthodes
II.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique
Les matières organiques peuvent être dispersées par différents réactifs. Nous avons testé le
NaOH et le pyrophosphate de sodium qui ont été utilisés par Campenalla et al. (1995) et Hall
et al. (1996), respectivement. Des acides humiques commerciaux ont été dopés en métaux.
Une fois dopés, les métaux ont été dissous en utilisant d’une part l’hydroxyde de sodium et
d’autre part le pyrophosphate de sodium. Toutes les manipulations ont été réalisées en
triplicat.
II.1.1. Dopage des acides humiques
Après purification des acides humiques commerciaux (Fluka) selon le protocole de Varrault
(2001), les acides humiques ont été dopés selon la méthode suivante (Gossart, 2001) :
Annexes
271
- 100 mg d’acides humiques sont mélangés avec 50 ml de solution métallique dans des
flacons plastiques, bouchés et placés sous atmosphère inerte (N2) et sous agitation
mécanique pendant 24h,
- le mélange est ensuite centrifugé pendant 40 min à 4200 trs.min-1,
- le surnageant est récupéré et analysé par ICP-AES pour calculer le rendement
d’adsorption et connaître ainsi les teneurs en métaux dans les acides humiques.
La solution métallique contient les éléments suivants : Cd, Cu, Pb et Zn à 2,5 mg.l-1
(provenant d’une solution-mère mono-métallique (Normadose) de cadmium, cuivre, plomb et
zinc à 1 g.l-1 dans HCl 2M ). Cette concentration a été choisie, après plusieurs essais, d’une
part pour avoir le meilleur rendement d’adsorption possible et d’autre part pour se rapprocher
des teneurs réelles en métaux dans la phase organique contenus dans les sédiments d’après la
littérature (Campanella et al, 1995).
II.1.2. Dissolution des acides humiques par l’hydroxyde de sodium
La dissolution des acides humiques dopés par l’hydroxyde de sodium est réalisée selon le
protocole de Campanella et al (1995) :
- 50 ml de NaOH (0,5M) est ajouté aux acides humiques dopés
- agitation mécanique pendant 24h
- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1, récupération et filtration du surnageant
sur filtres hydrophiles en PolyTétraFluoroEthylène (0,45 µm) (Millipore).
Le filtrat est récupéré et analysé en ICP-AES.
II.1.3. Dissolution des acides humiques par le pyrophosphate de sodium
La dissolution des acides humiques dopés par le pyrophosphate de sodium est réalisée selon le
protocole modifié de Hall et al (1996) :
- 50 mL de pyrophosphate de sodium (0,1 M) est ajouté aux acides humiques dopés
- agitation mécanique pendant 1h,
- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1, récupération et filtration du surnageant sur
filtres hydrophiles en Polyfluorure de Vinylidène PVDF (0,45 µm) (Millipore).
Le filtrat est récupéré et analysé en ICP-AES.
Annexes
272
Remarque : deux types de filtres ont été testés car il fallait que ceux-ci résistent à des pH
élevés (de l’ordre de 13). Il en résulte que ce sont les filtres hydrophiles en PVDF qui sont les
mieux adaptés.
II.2. Dissolution des métaux liés aux sulfures
Les sulfures de métaux suivants ont été choisis : sulfure de cadmium, de fer, de plomb et de
zinc (poudre, pureté > 99 %, Sigma-Aldrich). Afin de ne pas oxyder les sulfures en sulfate,
toutes les manipulations ont été effectuées sous azote dans une boîte à gants. 0,1g de sulfure
de chaque métal a été pesé et les sulfures ont été mélangés dans un même flacon en plastique.
Tous les réactifs utilisés pour la dissolution des métaux ont été préalablement désoxygénés en
faisant circuler un flux d’azote.
II.2.1. Hydroxyde de sodium puis acide nitrique
Afin de vérifier que le traitement par l’hydroxyde de sodium ne solubilisait pas les métaux
liés aux sulfures, les deux dernières étapes du protocole proposé par Campanella et al (1995)
ont été appliquées sur les sulfures de métaux. Tout d’abord, les sulfures de métaux ont été
traités à l’hydroxyde de sodium comme précédemment (cf II.1.2).
Le culot obtenu est ensuite traité de la façon suivante :
- 50 ml de HNO3 (8 M) sont ajoutés
- le mélange est chauffé à 85 °C au bain marie pendant 3 h avec agitation
- centrifugation pendant 20 min à 4200 trs.min-1
- récupération du surnageant et analyse des métaux à l’ICP-AES
II.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique
De la même façon, afin de vérifier que le pyrophosphate de sodium ne solubilisait pas les
métaux liés aux sulfures, le protocole décrit au paragraphe II.1.3. a été appliqué aux sulfures
puis le culot obtenu a été traité à l’acide nitrique comme décrit au paragraphe II.2.1.
Annexes
273
III. Résultats et discussion
III.1. Dissolution des métaux liés à la matière organique (acides humiques
dopés)
III.1.1. Par l’hydroxyde de sodium
Les teneurs en Cd, Pb et Zn dans les acides humiques sont respectivement et en moyenne
pour les trois réplicats effectués de 900 ppm, 700 ppm et 900 ppm.
Les rendements de dissolution obtenus après traitement au NaOH (0,5 M) sont les suivants
(Tableau 50) :
Tableau 50 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par l’hydroxyde de sodium
Cd Pb Zn
Moyenne (%) 66.6 79.6 82.3
Ecart-type (%) 2.3 1.1 12.8
Il en résulte que le Cd est l’élément qui est le moins bien solubilisé.
III.1.2. Par le pyrophosphate de sodium
Les teneurs en Cd, Pb et Zn dans les acides humiques sont respectivement et en moyenne
pour les triplicats effectués de 600 ppm, 675 ppm et 560 ppm.
Après traitement par le pyrophosphate de sodium (0,1 M) des acides humiques dopés, les
rendements de dissolution sont les suivants (Tableau 51):
Tableau 51 : Pourcentage de dissolution des métaux liés aux acides humiques par le pyrophosphate de
sodium
Cd Pb Zn
Moyenne (%) 80.5 79.0 78.0
Ecart-type (%) 0.7 2.8 15.5
Annexes
274
On constate que le pourcentage de dissolution du Cd est plus important avec le pyrophosphate
de sodium qu’avec l’hydroxyde de sodium.
Compte-tenus des résultats obtenus dans cette première partie, il semble a priori que le
pyrophosphate permettrait de solubiliser plus de cadmium que le NaOH (les autres éléments
étant solubilisés avec le même ordre de grandeur), ce qui nous ferait opter pour l’utilisation du
pyrophosphate de sodium.
Le choix du réactif va donc se faire en fonction de son comportement vis-à-vis des sulfures de
métaux.
III.2. Dissolution des sulfures de métaux
III.2.1. Par l’hydroxyde de sodium puis par l’acide nitrique
Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn dans les sulfures sont respectivement et en moyenne pour les
triplicats effectués de 820 mg.g-1, 745 mg.g-1, 1180 mg.g-1 et 1030 mg.g-1. Après avoir été
traités à l’hydroxyde de sodium, les sulfures de métaux sont solubilisés à l’acide nitrique. Les
résultats sont les suivants (Tableau 52) :
Tableau 52 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et HNO3
(50ml)
Cd Fe Pb Zn
Moyenne 0.00 1.33 1.44 0.54 % de dissolution par NaOHEcart-type 0.00 0.33 0.95 0.46
Moyenne 0.4 62.27 1.59 133.27 % de dissolution par HNO3
(50 ml) Ecart-type 0.28 4.14 0.99 20.19
L’utilisation d’hydroxyde de sodium solubilise de façon très peu significative les sulfures de
métaux au bout de 24h. Concernant le traitement à l’acide nitrique, on remarque que le
cadmium et le plomb sont très peu solubilisés contrairement au fer et au zinc. On peut
supposer que le rapport masse de sulfure/volume d’acide était trop important compte-tenues
des teneurs en métaux dans les sulfures. Aussi, a-t-il été décidé de diminuer ce rapport en
augmentant le volume d’acide nitrique utilisé.
Annexes
275
Dans une deuxième expérience, nous avons ajouté 200 ml d’acide nitrique (8M) au lieu de 50
ml comme préconisé par Campanella et al (1995). Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont
respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de 805, 700, 915 et 820 mg.g-1. Les
résultats obtenus ont été les suivants (Tableau 53) :
Tableau 53 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au NaOH et HNO3
(200ml)
Cd Fe Pb Zn
Moyenne 0.00 0.01 0.78 0.29 % de dissolution par NaOH Ecart-type 0.01 0.00 1.24 0.25
Moyenne 86.74 94.53 85.37 74.67 % de dissolution par HNO3
(200 ml) Ecart-type 0.72 22.37 2.33 12.73
Les rendements de dissolution des sulfures de métaux par le NaOH sont du même ordre de
grandeur que ceux trouvés précédemment, ce qui confirme le fait que ce réactif solubilise très
peu les métaux adsorbés sur les sulfures. De plus, le fait d’augmenter le volume d’acide
nitrique permet de solubiliser plus de 85 % du cadmium et du plomb. La dissolution du Fe est
également plus importante.
Le même type d’expérience a été réalisé en utilisant le pyrophosphate de sodium à la place de
l’hydroxyde de sodium.
III.2.2. Pyrophosphate de sodium puis acide nitrique
Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de
930, 760, 1485 et 780 mg.g-1.
Les rendements de dissolution après traitement au pyrophosphate de sodium puis à l’acide
nitrique ont été les suivants (Tableau 54) :
Annexes
276
Tableau 54 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au pyrophosphate de
sodium et HNO3 (50 ml)
Cd Fe Pb Zn
Moyenne 0.18 0.22 6.29 0.19 % de dissolution par le
pyrophosphate de sodium Ecart-type 0.07 0.03 0.95 0.06
Moyenne 1.05 72.52 3.23 85.47 % de dissolution par HNO3
(50 ml) Ecart-type 0.30 9.43 1.43 29.08
On remarque les pourcentages de dissolution des sulfures de métaux par le pyrophosphate de
sodium sont du même ordre de grandeur que ceux obtenus par l’hydroxyde de sodium.
Néanmoins, une petite différence est constatée concernant le sulfure de plomb, celui-ci étant
légèrement plus solubilisé par le pyrophosphate de sodium (6 % au lieu d’1% environ pour le
traitement par NaOH). Concernant la dissolution par l’acide nitrique, on remarque que les
sulfures de cadmium et de plomb sont très peu solubilisés comme ceci a été constaté
précédemment.
Aussi, avons-nous décidé de diminuer le ratio masse de sulfures / volume d’acide nitrique en
utilisant 200 ml d’acide nitrique au lieu de 50 ml. Les teneurs en Cd, Fe, Pb et Zn sont
respectivement et en moyenne sur les trois réplicats de 890, 665, 955 et 840 mg.g-1.
Les résultats obtenus sont les suivants (Tableau 55) :
Tableau 55 : Pourcentage de dissolution des sulfures de métaux après traitement au pyrophosphate de
sodium et au HNO3 (200 ml)
Cd Fe Pb Zn
Moyenne 0.17 0.14 5.96 0.20 % de dissolution par le
pyrophosphate de sodium Ecart-type 0.01 0.02 0.97 0.01
Moyenne 98.4
7
47.83 91.1
3
87.07 % de dissolution par HNO3
(200 ml) Ecart-type 5.41 3.72 1.83 7.43
De même que précédemment, on constate une dissolution un peu plus importante pour le
sulfure de plomb que pour les autres sulfures de métaux par le pyrophosphate de sodium et
ceci avec le même ordre de grandeur (environ 6 %), ce que l’on ne remarque pas dans le cas
du NaOH. Par ailleurs, les rendements de dissolution des sulfures de métaux après diminution
Annexes
277
du rapport masse de sulfures / volume d’acide nitrique sont nettement supérieurs à ceux
obtenus en utilisant 50 ml d’acide (hormis pour le fer).
En comparant l’effet du pyrophosphate de sodium et du NaOH sur la dissolution des sulfures
de métaux, on constate que le pyrophosphate solubilise plus de plomb que le NaOH ; les
autres sulfures n’étant pratiquement pas solubilisés. 6 % de dissolution est assez élevé
compte-tenu du faible écart-type. Par ailleurs, ce protocole sera avant tout utilisé pour
déterminer la part des métaux liés aux sulfures sous l’action des microorganismes. Nous
avons donc choisi d’utiliser le NaOH pour solubiliser les métaux liés à la matière organique
afin de préserver au maximum la composition des sulfures de métaux.
Concernant le volume d’acide nitrique à utiliser, il est clair que nous allons opter pour 200
mL afin d’être sûrs de solubiliser complètement les métaux (sachant qu’en réalité, les teneurs
en sulfures de métaux seront sûrement beaucoup plus faibles que celles utilisées dans cette
étude).
Ce protocole a ensuite été testé sur des sédiments certifiés (LGC 6139, River Clay sediments)
dopés en sulfures de métaux et acides humiques dopés en métaux et sur ces mêmes sédiments
mais non dopés. Les résultats ont montré que les réactifs utilisés dans les étapes précédant
l’extraction des métaux liés aux sulfures n’attaquaient pas les sulfures métalliques. De plus,
nous avons constaté une bonne extraction des métaux liés aux sulfures.
IV. L’acétate d’ammonium, solubilisant d’une partie des métaux liés aux
acides humiques ?
Cependant, il est apparu que le réactif permettant de solubiliser les métaux liés à la fraction
échangeable et carbonatée, à savoir l’acétate d’ammonium, semblait également solubiliser les
métaux liés aux acides humiques, en particulier pour le cadmium, le plomb et le zinc. Des
tests ont donc été menés pour vérifier si l’acétate d’ammonium solubilisait aussi les métaux
liés aux acides humiques.
Annexes
278
IV.1. Matériel et méthodes
IV.1.1. Dopage des acides humiques
0,1g d’acides humiques Fluka purifié ont été mis en contact avec 50 ml de solution métallique
contenant 2.5 mg.l-1 de cadmium, fer, plomb et zinc pendant 24 h sous agitation et sous
atmosphère inerte. Puis le surnageant a été récupéré après centrifugation et analysé pour
déterminer la teneur en métaux sur les acides humiques.
IV.1.2. Dissolution par l’acétate d’ammonium
Après séchage, les acides humiques ont été mis en contact avec 90 mL d’acétate d’ammonium
(1M) (ajusté à pH 5 avec de l’acide acétique) pendant 24h sous agitation à 130 tours par
minute. Puis après centrifugation, le surnageant a été récupéré et analysé par ICP-AES.
IV.2. Résultats
IV.2.1. Cadmium
Le pourcentage de dissolution du cadmium est assez aléatoire variant de 22 à 67 %. Il est
donc tout à fait probable que dans le cas des sédiments dopés une partie du cadmium fixé sur
les acides humiques aient été solubilisés par l’acétate d’ammonium.
IV.2.2. Fer
Concernant le fer, le pourcentage de dissolution est répétable atteignant en moyenne 46 %.
Cependant très peu de fer avait été retrouvé dans la partie liée aux carbonates et facilement
échangeable.
IV.2.3. Plomb
Environ 20 % du plomb fixé sur les acides humiques est solubilisé par l’acétate d’ammonium,
ce qui prouve qu’une partie trouvée du plomb trouvée dans la partie échangeable et liée aux
carbonates provenait bien des acides humiques.
Annexes
279
IV.2.4. Zinc
Le pourcentage de zinc solubilisé des acides humiques est relativement variable (entre 15 et
54 %). On observe un comportement similaire à celui obtenu lors de la dissolution du
cadmium. Aussi n’est-il pas surprenant d’obtenir une quantité importante de zinc dans la
partie échangeable et liée aux carbonates car celle provient certainement des acides humiques
dopés.
IV.2.5. Conclusions
Les résultats obtenus concernant la dissolution des métaux liés aux acides humiques par
l’acétate d’ammonium sont très élevés. Il existe donc un risque potentiel de dissolution des
métaux liés aux acides humiques, le pourcentage de dissolution pouvant aller jusqu’à 68 %
pour le cadmium ! Ces résultats seraient sûrement à reconfirmer en effectuant le test sur plus
de 3 échantillons pour obtenir une plus grande représentativité.
V. Conclusion
Les objectifs de cette étude étaient de choisir les réactifs permettant de solubiliser les métaux
liés à la matière organique d’une part et aux sulfures d’autre part. Il apparaît que pour la
dissolution de la matière organique, l’hydroxyde de sodium est le meilleur réactif devant le
pyrophosphate de sodium car ce dernier attaque légèrement le sulfure de plomb ce qui n’est
pas le cas du NaOH. De plus, l’utilisation du NaOH n’entraîne pas la formation d’hydroxyde
de métaux, à condition qu’il soit laissé en contact avec les acides humiques uniquement
pendant 24 h, des hydroxydes de métaux, se formant au bout de 48 h.
Les résultats obtenus montrent que la partie des métaux liés aux sulfures est effectivement
bien solubilisée. Par contre, on ne peut rien dire concernant la dissolution des métaux liés aux
acides humiques puisqu’une partie des métaux liés aux acides humiques tels que le cadmium,
le fer, le plomb et le zinc semble être solubilisés par l’acétate d’ammonium et se retrouver
dans la fraction des métaux échangeables et liés aux carbonates.
Il convient donc de refaire des tests avec des sédiments dopés en acides humiques dopés en
métaux et appliquer le protocole de spéciation pour vérifier que l’acétate d’ammonium
solubilise aussi une partie des métaux liés aux acides humiques.
Annexes
280
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Annexes
282
Annexe 8 : Description des plaques biolog (familles et composés)
Annexes
283
A2-E1 : hydrates de carbones, sucres, alcools et acides
E2-F12 : Acides organiques
G1-H6 : Acides aminés, peptides et dérivés
H7-H12 : Nucléotides et nucléosides
Annexes
284
Annexe 9 : Validation de l’analyse des sulfates
Concentration Aire (counts) SCE (i) Droite: y = b1u + b0 Pente:b1Origine à
l'ordonnée : b0
0 0,0001 1,7948E-05 Coefficients de la droite 11,7827512 1,54175860 0,0002 Ecart-type sur les coefficients 0,13440974 0,48636550 0,0003 Limite inf. à 99% 11,41829 0,222950 0,0005 Limite sup. à 99% 12,14721 2,860570 0,005
0,5 8,29 2,07120,5 6,36 Unité: mg/L0,5 70,5 7,60,5 7,5 Ecart-type des résidus 2,05978
1 13,83 2,23372 Limte de détection 0,31 12,11 Limite de quantification 0,51 13,941 131 13,5
1,5 20,63 33,0674 Source des variations Somme Degré de Variance F Valeur critique1,5 18,75 des carrés liberté estimée à 1%1,5 18,34 Régression 32604 1 32604 7,777E+03 7,51,5 25,48 Erreur de modèle 27 6 5 1,08E+00 3,431,5 19,75 Erreur expérimentale 134,1626179 32 4
2 25,13 16,92092 Totale 32765,33739 392 28,922 23,282 26,052 25,2
4 49,41 27,72468 CONCLUSIONS4 52,824 46,79 Limite de détection 0,3 mg/L4 46,94 Limite de quantification 0,5 mg/L4 46,85 63,12 26,37268 Linéarité modèle de régression linéaire acceptable5 63,1 domaine d'étalonnage validé5 57,475 59,05 REMARQUE:5 62,1
7,5 89,9 25,7727,5 92,157,5 85,27,5 88,97,5 89,9
CARACTERISATION DE METHODEANALYSE sulfates
Gamme faible
TEST DE LINEARITE
Représentation graphique
y = 0,084452x - 0,116981R2 = 0,995079
02468
10
0 50 100
Annexes
285
Concentration Aire (counts) SCE (i) Droite: y = b1u + b0 Pente:b1Origine à
l'ordonnée : b0
0 0,0001 1,7948E-05 Coefficients de la droite 12,9547021 -7,44378790 0,0002 Ecart-type sur les coefficients 0,21622801 4,39576830 0,0003 Limite inf. à 99% 12,36839 -19,363210 0,0005 Limite sup. à 99% 13,54102 4,475630 0,0055 54,47 47,868925 55,28 Unité: mg/L5 57,355 63,125 59,2 Ecart-type des résidus 17,25913
7,5 87,09 33,04948 Limte de détection 0,47,5 88,9 Limite de quantification 2,87,5 85,27,5 92,157,5 91,2510 115,93 68,6361772 Source des variations Somme Degré de Variance F Valeur critique10 123,8 des carrés liberté estimée à 1%10 115,489 Régression 1069224 1 1069224 4,015E+03 7,510 124,149 Erreur de modèle 2798 6 466 1,75E+00 3,4310 120,3 Erreur expérimentale 8521,439914 32 26615 172,68 411,184891 Totale 1080543,747 3915 197,2315 182,8915 191,40115 195,325
20 265,18 904,280307 CONCLUSIONS20 245,0920 230,212 Limite de détection 0,4 mg/L20 259,66 Limite de quantification 2,8 mg/L20 235,6830 372,365 5222,51015 Linéarité modèle de régression linéaire acceptable30 302,716 domaine d'étalonnage validé30 376,76630 397,099 REMARQUE:30 375,96340 502 1833,9099740 550,9840 506,37540 541,8340 525,745
CARACTERISATION DE METHODEANALYSE sulfates
Gamme forte
TEST DE LINEARITE
Représentation graphique
y = 0,076383x + 0,735537R2 = 0,989524
01020304050
0 200 400 600
Annexes
286
Annexe 10 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le
calcul des indices de saturation des minéraux métallo-carbonatés
Annexes
287
Annexe 11 : Concentrations des espèces (µg.l-1) utilisées pour le
calcul des indices de saturation des sulfures métalliques
Annexes
288
Annexe 12 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées
pour la modélisation de la spéciation des métaux en fonction du
pH et des acides organiques
a) Acide acétique
b) Acide lactique
Annexes
289
c) Acide succinique
Annexes
290
d) Acide propionique
e) Acide butyrique
Annexes
291
f) Acide oxalique
Annexes
292
Annexe 13 : Concentrations (µg.l-1) des espèces chimiques utilisées
pour la modélisation de la spéciation des métaux à pH 6 avec
mélange des acides organiques
Résumé Les activités anthropiques entraînent une contamination des sédiments de rivière en de nombreux polluants et en particulier en éléments traces métalliques (ETM). Si la majorité des ETM se retrouvent piégés dans les sédiments, ceux-ci peuvent être remobilisés et passer en solution dans certaines conditions physico-chimiques et sous l’action des microorganismes autochtones. Les métaux relargués peuvent alors constituer un danger potentiel pour les organismes vivants dans les sédiments et dans la colonne d'eau. Dans le cas des sols, l’impact de l’activité microbienne autochtone sur la mobilité des ETM a souvent été rapporté. Cependant une telle activité de solubilisation n’a été que rarement étudiée dans le cas des sédiments. Une telle connaissance est pourtant importante pour la prédiction du comportement des métaux contenus dans les sédiments et la gestion de ces derniers, notamment lors de leur stockage suite aux opérations de dragage. Dans ce contexte, l’objectif de cette thèse a été de comprendre et d’évaluer l’importance de certains des processus microbiens et chimiques de mobilité des ETM dans les sédiments en conditions anaérobies. La première phase de notre étude qui a consisté à incuber des sédiments de Seine et de Marne en milieu anaérobie dopé en glucose avait pour objectif d’étudier la corrélation entre le métabolisme microbien et le comportement des métaux en solution et dans les sédiments. Dans ces conditions opératoires, une forte solubilisation du fer et du manganèse (sous forme réduite) associée à une solubilisation de métaux traces (Co, Cu, Ni) a été mise en évidence, ce qui a laissé supposer l’intervention de bactéries ferri-réductrices dans les phénomènes observés. Une activité fermentaire importante a été observée et caractérisée par la production d’acides organiques majoritaires tels que les acides acétique et butyrique. Un tel résultat souligne l’importance des bactéries fermentatrices dans les phénomènes de dissolution observés. La deuxième étape de ce travail a consisté à confirmer l’importance de l’activité ferri-réductrice et à en identifier les acteurs principaux. Les analyses moléculaires menées ont montré que les bactéries ferri-réductrices majoritairement identifiées, appartiennent aux espèces Clostridium butyricum et Paenibacillus polymyxa. L’utilisation d’un modèle géochimique nous a permis de montrer que les voies métaboliques supportant la réduction du fer et la mobilité des métaux étaient les fermentations butyrique et acétique. La troisième étape a consisté à comparer les impacts directs (réduction enzymatique) et indirects (propriétés des acides organiques produits) de Paenibacillus polymyxa et Clostridium butyricum sur la mobilité du fer, du manganèse et des autres métaux. Une telle étude a montré que les acides organiques produits (acétique, lactique, succinique, propionique et butyrique) ont un très faible impact sur la solubilisation aux pH rencontrés dans les sédiments et que la réduction enzymatique microbienne est le principal mécanisme de dissolution des éléments métalliques en milieu anaérobie.
Mots-clés : éléments traces métalliques, sédiments, bactéries ferri-réductrices, fermentation