Untersuchungen zur Biokompatibilität und Biofunktionalität von Implantatmaterialien am
Beispiel von Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen
Dissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Naturwissenschaften
der Fakultät für Biologie der Ruhr-Universität Bochum
angefertigt in der Chirurgische Forschung der
Chirurgischen Klinik und Poliklinik der Berufsgenossenschaftlichen Kliniken
Bergmannsheil Universitätsklinik Bochum
vorgelegt von Denise Bogdanski
aus
Gelsenkirchen
Bochum 2005
Tag der mündlichen Prüfung: 22.12.05 1. Gutachter Prof. Dr. M. Köller
2. Gutachter Prof. Dr. K. P. Hoffmann
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1 EINLEITUNG .............................................................................................. 1
1.1 Implantat-Biomaterialien....................................................................... 1 1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen ..................................................................3 1.1.2 Polymere .....................................................................................................3 1.1.3 Keramiken ...................................................................................................3
1.2 Biokompatibilität ................................................................................... 4 1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993 ..........6
1.3 Biofunktionalität .................................................................................... 8
1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen ........................................... 9 1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial................11 1.4.2 NiTi-Biokompatibilität.................................................................................12 1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi .........................................................................13
1.5 Nickel Toxizität .................................................................................... 15 1.5.1 Nickel-Allergie ...........................................................................................15
1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung.. 16 1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung.................17
1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen ........................................... 19 1.7.1 Leukozyten ................................................................................................19 1.7.2 Osteoblasten .............................................................................................20 1.7.3 Cytokine ....................................................................................................21 1.7.4 Adhäsionsmoleküle ...................................................................................22 1.7.5 Chemotaxis ...............................................................................................24 1.7.6 Apoptose ...................................................................................................25
1.8 Fragestellung....................................................................................... 25
2 MATERIAL UND METHODEN ................................................................. 27
2.1 Materialien............................................................................................ 27 2.1.1 Reagenzien/Puffer.....................................................................................27 2.1.2 Verbrauchsmaterial ...................................................................................28 2.1.3 Cytokine (Standards).................................................................................29 2.1.4 Antikörper ..................................................................................................29 2.1.5 Assays.......................................................................................................29 2.1.6 Zelllinien ....................................................................................................30 2.1.7 Metalle.......................................................................................................30 2.1.8 Software ....................................................................................................30 2.1.9 Geräte .......................................................................................................31
I
Inhaltsverzeichnis
2.2 Gradientenwerkstoff............................................................................ 32
2.3 Metallprobekörper ............................................................................... 34
2.4 Calciumphosphat-Beschichtung........................................................ 34
2.5 Zellkultur .............................................................................................. 35 2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten........................35 2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen ........................................................35 2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen............................................................36
2.6 Isolierung humaner Leukozyten ........................................................ 36
2.7 Isolierung humaner Thrombozyten.................................................... 38
2.8 Zelladhärenz-Analysen ....................................................................... 38 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern ...............................38 2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-beschichteten
und unbeschichteten Probekörpern...........................................................38 2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbe-
schichteten Metallprobekörpern ................................................................39 2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propi-
diumjodid ...................................................................................................39
2.9 Mikroskopie ......................................................................................... 40 2.9.1 Durchlichtmikroskopie ...............................................................................40 2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie............................................................................41 2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie....................................................................41
2.10 Quantitative Bildanalytik..................................................................... 42
2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung............... 42
2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren... 43
2.13 Cytotoxizitäts-Analyse ........................................................................ 44
2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten........................ 45
2.15 Durchflußcytometrie ........................................................................... 46
2.16 Funktionsassays ................................................................................. 48 2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................48 2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine.......................................................50 2.16.3 Chemotaxis-Bioassay................................................................................52 2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................53 2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)..............................................................54
II
Inhaltsverzeichnis
2.17 Analyse der Nickelfreisetzung ........................................................... 55
2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung................................................. 55
2.19 Statistik ................................................................................................ 56
3 ERGEBNISSE .......................................................................................... 57
3.1 Gradientenwerkstoff............................................................................ 57
3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik .......................................................................................... 59
3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colori-metrisches Verfahren.......................................................................... 63
3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung der LDH-Aktivität ................................................................................................ 64
3.5 Apoptose.............................................................................................. 65
3.6 Zelladhäsion ........................................................................................ 71 3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschich-
teten Probekörpern....................................................................................71 3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf beschichteten und unbeschichteten
Probekörpern.............................................................................................73 3.6.3 Adhärenz von Lymphozyten/Monozyten auf beschichteten und unbe-
schichteten Probekörpern..........................................................................75 3.6.4 Adhärenz von Thrombozyten auf beschichteten und unbeschichteten
Probekörpern.............................................................................................76
3.7 Funktionsassays ................................................................................. 77 3.7.1 Expression von Adhäsionsmolekülen........................................................77 3.7.2 Chemotaxis-Bioassay................................................................................80
3.8 Analyse der Cytokinfreisetzung......................................................... 82 3.8.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array ......................................................82 3.8.2 Cytokinquantifizierung von Leukozyten durch ELISA................................83
3.9 Analyse der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern .................... 85
3.10 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid .............. 87
3.11 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid nach Zellstimulation ..................................................................................... 88
4 DISKUSSION............................................................................................ 91
III
Inhaltsverzeichnis
4.1 Bewertung der Biokompatibilität ....................................................... 91
4.2 Gradientenwerkstoffe zur ersten schnellen Analyse der Biokom-patibilität............................................................................................... 92
4.3 Zelladhäsion als ein Parameter der Biokompatibilität ..................... 94
4.4 Zellproliferation als Kriterium für Biokompatibilität......................... 96
4.5 Die Bedeutung einer Cytokinfreisetzung für die Beurteilung von Biokompatibilität ................................................................................. 99
4.6 Der Einsatz konditionierter Medien zur Beurteilung der Biokom-patibilität ............................................................................................ 101
4.6.1 Die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen durch kondi-tionierte Medien.......................................................................................103
4.6.2 Konditionierte Medien und Apoptose.......................................................104
4.7 Nickel-Freisetzung aus NiTi.............................................................. 105
4.8 Nickelallergie ..................................................................................... 110
5 ZUSAMMENFASSUNG.......................................................................... 112
6. SUMMARY ............................................................................................. 115
7 LITERATURVERZEICHNIS.................................................................... 118
ERKLÄRUNG ................................................................................................ 128
CURRICULUM VITAE ................................................................................... 129
EIGENE PUBLIKATIONEN ........................................................................... 130
DANKSAGUNG............................................................................................. 131
IV
Verwendete Abkürzungen
Verwendete Abkürzungen
AM Acetoxymethylester
BSA Bovines Serumalbumin
BMP bone morphogenetic protein
CaP Calciumphosphat
CD cluster of differentiation
CGF colonic growth factor
Co-Cr Kobalt-Chrom
CSF colony stimulating factor
ConA Concanavalin A
DMSO Dimethyl-Sulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen
ECACC Europäische Sammlung von Zellkulturen
ECL enhanced chemiluminescence
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EDX Energie-dispersive Röntgenspektroskopie
ELISA enzyme linked immunosorbent assay
FACS fluorescence activated cell sorter
FCS fötales Kälberserum
FSC forward scatter
FGF fibroblast growth factor
FGL Formgedächtnislegierung
FITC Fluoreszeinisothiozyanat
GM-CSF granulocyte colony stimulating factor
HAP Hydroxylapatit
HRP horse radish peroxidase
ICAM intercellular adhesion molecule
IFN Interferon
IL Interleukin
KM konditionierte Medien
LDH Lactat-Dehydrogenase
LECAM L-Selektin, CD62L
V
Verwendete Abkürzungen
LPS Lipopolysaccharid
MG-63 Osteosarkoma-Zellen
MTT Methyltetrazolium
MCP Makrophagen Chemoattraktorprotein
MFI mittlere Fluoreszenz-Intensitäten
NiTi Nickel –Titan
Ni Nickel
mRNA messenger-Ribonukleinsäure
PE Phycoerythrin
PerCP Peridin Chlorophyll
PBMC periphere mononukleäre Zellen
PBS Phosphate Buffered Saline
PMN polymorphkernige neutrophile Granulozyten
PMT Photomultiplier
ppm parts per million
Ras Rat sarkoma (Protein der kleinen G-Protein-Gruppe)
REM Rasterelektronenmikroskopie
SAOS-2 Osteosarkoma-Zellen
SCS supersaturated calcium phosphate solution
SFB Sonderforschungsbereich
SSC sideward scatter
STAT signal transducers and activators of transcription
Tab. Tabelle
TdT terminale Desoxyadenylattransferase
Ti Titan
Ti6Al4V Titan-Aluminium-Vanadium-Legierung
TGF transforming growth factor
TMB Tetramethylbenzidin
TNF Tumornekrosefaktor
TUNEL terminale desoxyribosyl-transferase mediated dUTP nick
end labeling
TSST-1 toxic shock syndrome toxin-1
XRD Röntgenpulverdiffraktometrie
VI
Einleitung
1 Einleitung
Künstliche Implantate sind heute unersetzliche medizinische Gewebs-
substitute. Sie ermöglichen es dem Patienten, nach Unfall, Krankheit oder de-
generativer, schmerzhafter Funktionseinschränkung wieder eine höhere Le-
bensqualität zu erreichen. So unterstützen Implantate z.B. geschädigte Hartge-
webe (Knochen) oder Weichteilgewebe (z.B. Gefäße) und übernehmen
bestimmte Funktionen.
Die zunehmende Anzahl unterschiedlicher Implantatmaterialien in der moder-
nen Medizin bei stetigen Neuentwicklungen von innovativen Biomaterialien (z.B.
poröse Metalle, poröse Calciumphosphat- oder Carbonat-Verbindungen, nano-
strukturierte Oberflächen) erfordert eine schnelle und auch präoperative Ana-
lyse hinsichtlich der Biokompatibilität und gegebenenfalls des individuellen Al-
lergisierungspotentials.
1.1 Implantat-Biomaterialien
Das National Institute of Health definierte den Begriff „Biomaterial“ als:
„Jede von einem Arzneimittel zu unterscheidende Substanz oder Kombination von Substanzen natürlichen oder synthe-tischen Ursprungs, die für unlimitierte Zeit als Ganzes oder als Teil des menschlichen Körpers verwendet werden kann, um ein Gewebe, ein Organ oder eine Funktion des menschlichen Körpers zu behandeln, zu vermehren oder zu ersetzen“ (1987).
Biomaterialien sind damit Werkstoffe, die im direkten Kontakt mit dem Organis-
mus stehen. Sie dürfen keine unerwünschte Wirkung auf den Organismus aus-
üben, sie sollen vom Körper mindestens toleriert bzw. im günstigsten Fall wie
körpereigenes Material akzeptiert werden.
An Biomaterialien werden unterschiedliche Ansprüche gestellt. Zum einen wird
eine hohe mechanische Belastbarkeit, Verschleißarmut und Langlebigkeit wie
z.B. bei Hüft- oder Gelenkprothesen gefordert. Zum anderen sind im Bereich
der Knochenrekonstruktion resorbierbare Implantate wünschenswert. Einerseits
werden also inerte, passive Implantatmaterialien benötigt, andererseits aber
1
Einleitung
auch aktivierende Werkstoffe, die mit dem Organismus in Wechselwirkung tre-
ten und aktiv die körpereigene Regeneration induzieren und fördern. Die Vor-
aussetzung ist jedoch die Charakterisierung und das Verständnis der Zusam-
menhänge der Wechselwirkungen zwischen dem Biomaterial und dem Orga-
nismus bzw. Gewebe.
Bezüglich der biologischen Verträglichkeit können Biomaterialien folgenderma-
ßen eingeteilt werden:
Einteilung Definition
Biotolerante Materialien werden vom umliegenden Gewebe als fremd er-
kannt, mit einer Bindegewebsschicht umschlossen
aber nicht abgestoßen.
Bioinerte Materialien gehen beim Kontakt mit dem umliegenden Gewebe
keine chemischen Bindungen ein.
Bioaktive Materialien sind zu chemischen und biologischen Wechselwir-
kungen mit dem Gewebe wie z.B. Knochen
befähigt.
Ein weiterer wichtiger Faktor bei der Beurteilung von Implantat-Biomaterialien
stellt die Verweildauer des Implantats im Organismus dar. Ultrakurzzeitimplan-
tate sind Implantate, die nur kurz mit dem Körper in Kontakt kommen, z.B. chir-
urgische Instrumente bei einer Operation. Unter Kurzzeitimplantate versteht
man Implantate, die nach einer vorhersehbaren Zeit wieder aus dem Körper
entfernt werden wie z.B. Osteosyntheseplatten, die zur Behandlung von Kno-
chenfrakturen eingesetzt werden. Dauer- oder Permanentimplantate sollten
derart konzipiert werden, dass sie für die Restlebensdauer des Patienten im
Körper verbleiben können.
Je nach Anforderung kommt heute eine sehr große Zahl verschiedenster Mate-
rialien zum klinischen Einsatz. Dabei können drei Hauptklassen an Materialien
unterschieden werden: Metalle bzw. Metall-Legierungen, Polymere (synthetisch
und natürlich), Keramiken und Verbundwerkstoffe dieser Materialien.
2
Einleitung
1.1.1 Metalle und Metall-Legierungen
Metalle sind die am meisten verwendeten Werkstoffe in der Medizin und
finden hauptsächlich zwei Anwendungsgebiete. Zum einen werden sie bei Pro-
thesen wie Knie-, Hüft- oder Schulterprothesen eingesetzt. Zum anderen kom-
men sie als Hilfsmittel zur Fixierung von Strukturen als Schrauben, Osteo-
syntheseplatten, Drähte, Marknägel und Stents zum Einsatz. Die drei häu-
figsten verwendeten Implantatmetalle sind: rostfreier Stahl, Kobalt-Chrom-Le-
gierungen und Titan bzw. Titanlegierungen. Die mechanischen Eigenschaften
wie Stabilität, Elastizität und eine gute Verformbarkeit (Duktilität) machen Me-
talle zu besonders geeigneten Implantatmaterialien. Nachteilig ist allerdings die
mögliche Entstehung von Korrosion und damit die mögliche Sensibilisierung
gegen freiwerdende Metallionen wie z.B. Nickel- oder Kobaltionen.
1.1.2 Polymere
Polymere sind langkettige Moleküle, die aus vielen gleichen oder ähnlichen
Einheiten (Monomeren) bestehen. Der Vorteil von Polymeren ist durch eine ge-
zielte Synthese, Modifizierung oder Mischung maßgeschneiderte Eigenschaften
für das jeweilige Einsatzgebiet zu schaffen. Allerdings reichen die mecha-
nischen Eigenschaften nicht an die von Metallen heran. Polymere werden z.B.
als Knochenzement, Implantate (Kunststoffauskleidung der künstlichen Gelenk-
pfanne) oder Zahnfüllmaterial eingesetzt. Als natürliches Polymer wird vor allem
Kollagen vom Typ I in Medizinprodukten eingesetzt. Als Quellen dienen vorwie-
gend Rinderhaut oder -sehnen.
1.1.3 Keramiken
Die Keramiken werden im Wesentlichen in zwei Gruppen unterteilt: die
Hartkeramiken (z.B. Gelenkköpfe und –pfannen), bei denen die guten mecha-
nischen Eigenschaften im Vordergrund stehen und die meist auf Calciumphos-
phatbasis bestehenden biodegradierbaren Keramiken (z.B. Implantatbeschich-
tungen). Diese Keramiken werden vor allem in der Unfallchirurgie und Orthopä-
die eingesetzt, hier steht eine gute Interaktion mit dem umgebenden Gewebe
3
Einleitung
im Vordergrund. Im Vergleich zu Metallen und Polymeren zeigen Keramiken
eine hohe Sprödigkeit und eine daraus resultierende aufwändige Verarbeitung.
Der Vorteil allerdings liegt bei der ungewöhnlich hohen Härte dieses Materials.
Abb. 1. Implantat-Biomaterialien. A) System aus einem Polymer zur Stabilisierung von Kno-
chenfragmenten im Gesichtsbereich (verändert nach Wintermantel et al. 1999), B) Keramikhüft-
köpfe (Isp GmbH), C) Hüftpfanne (ESKA GmbH) und D) kombiniertes-Implantat (Hüften-
doprothese, Ceraver)
1.2 Biokompatibilität
Biomaterialien für Medizinprodukte mit Anwendungen im menschlichen
Körper erfordern eine vollständige Integration in den Organismus und eine opti-
mierte Interaktion mit dem entsprechenden Gewebe am Anwendungsort. Ob ein
Werkstoff eine ausreichende Biokompatibilität besitzt, hängt unter anderem von
dem vorgesehenen Einsatzort und der Einsatzdauer ab. Materialien, die in Kon-
takt mit Blutbestandteilen und Gefäßen kommen, müssen eine hohe Hämo-
kompatibilität aufweisen. Werden sie im Kontakt mit Weich- oder Hartgewebe
4
Einleitung
eingesetzt, ist eine entsprechende Gewebeverträglichkeit erforderlich. Beson-
dere Anforderungen müssen an Biomaterialien gestellt werden, die in Biohy-
bridsystemen eingesetzt werden, wo sie in Kontakt mit sowohl Blut bzw.
Plasma als auch Gewebezellen kommen. Die Biokompatibilität eines Materials
sollte nicht gleichgesetzt werden mit der “biologischen Verträglichkeit”, deren
einziges Merkmal der toxische bzw. schädigende Effekt auf biologische Sys-
teme ist. Eine Analyse auf mögliche Cytotoxizität sollte daher bei allen Materi-
alien als eine Basisuntersuchung voran gehen, um die Grundtauglichkeit als
Biomaterial festzustellen. Gegenwärtige Implantatentwicklungen machen jedoch
weiterführende Analysen notwendig. Die Biokompatibilität wurde von Williams
(2003) in Abhängigkeit von der Implantatanwendung hier speziell für Langzeit-
implantate wie folgt neu definiert:
Die Biokompatibilität eines Medizinproduktes für die Langzeit-anwendung bezieht sich auf die Fähigkeit des Produktes die vorgesehene Funktion mit dem erwünschten Grad der Integra-tion in den Organismus auszuführen, ohne in diesem jegliche unerwünschten lokalen oder systemischen Effekte auszulö-sen.
In dieser Definition werden die aktiven Wechselwirkungen zwischen Biomaterial
und Organismus betont und dass ein bestimmtes Material für bestimmte An-
wendungen geeignet ist, für andere Anwendungen hingegen nicht.
Nach dem heutigen Stand der Biomaterialforschung existiert kein universeller,
standardisierbarer Test zur Objektivierung der Biokompatibilität. Die typische
Situation nach Implantation von Biomaterialien ist eine inflammatorische Reak-
tion (Fremdkörperreaktion), wobei Ausprägung und Dauer individuell starke Un-
terschiede aufweisen. Bisherige Methoden zur Analyse der Biokompatibilität be-
ruhen oft auf Cytotoxizitäts- bzw. Proliferationsanalysen bestimmter Testzell-
linien (z.B. Mausfibroblasten oder Osteoblastenzelllinien) in Anlehnung an die
DIN EN ISO 10993 (Biologische Beurteilung von Medizinprodukten, 2003). Der-
artige Zelllinien und Analysen reichen jedoch als Testsysteme nicht immer aus,
um Informationen über die Biokompatibilität in einer differenzierteren Zell- und
Gewebeumgebung ermitteln zu können. Daher ist es sinnvoll, neben den Cyto-
5
Einleitung
toxizitäts- bzw. Proliferationsanalysen auch funktionelle Analysen mit Hilfe im-
munologischer Methoden zur Testung der Biofunktionalität heranzuziehen. Mit
den Möglichkeiten der modernen zellbiologischen und immunologischen Ana-
lytik können neue Biomaterialen vor dem tierexperimentellen Einsatz bzw. vor
der klinischen Erprobung genauer charakterisiert werden, und eine patienten-
spezifische in vitro Diagnostik könnte ggf. das mögliche Risikopotential z.B. hin-
sichtlich allergischer Reaktionen vermindern.
1.2.1 Biologische Beurteilung von Medizinprodukten: DIN EN ISO 10993
Eine fachgerechte biologische Beurteilung ist Voraussetzung dafür, dass
Medizinprodukte sicher und ohne unerwünschte Nebenwirkungen eingesetzt
werden können. Die DIN EN ISO 10993 (harmonisierte, europäische Norm
2003) gibt den Rahmen vor, innerhalb dessen eine biologische Beurteilung ge-
plant werden soll, um die Anzahl und Belastung von Versuchstieren zu minimie-
ren. Sie beschreibt die allgemeinen Grundsätze, die für die biologische Beur-
teilung von Medizinprodukten gelten. Sie enthält eine Einteilung von Medizin-
produkten nach Kontaktdauer (Tab. 1) und Applikationsort (Tab. 2), sowie eine
Auswahl geeigneter Prüfverfahren.
Tab. 1. Einteilung von Medizinprodukten nach der Kontaktdauer (Quelle: DIN EN ISO 10993).
Kontaktdauer Beschreibung
Kurzzeitig Medizinprodukte, deren einmalige oder mehrfache Anwendung oder
Kontaktdauer wahrscheinlich bis zu 24 Stunden dauert
Längerer Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder Langzeitanwendung
oder Kontaktdauer wahrscheinlich mehr als 24 Stunden, aber nicht län-
ger als 30 Tage dauert
Dauernd Medizinprodukte, deren einmalige, mehrfache oder Langzeitanwendung
oder Kontaktdauer mehr als 30 Tage dauert
6
Einleitung
Tab. 2. Einteilung von Medizinprodukten nach der Art des Körperkontaktes (DIN EN ISO
10993).
Körperkontakt Körperoberfläche/ Applikationsort
Beschreibung
Gewebe, Knochen
Medizinprodukte, die hpts. mit Knochen in
Kontakt kommen, z.B. Knochenzemente,
orthopädische Nägel
Medizinprodukte, die hpts. mit Gewebe und
Gewebeflüssigkeiten in Kontakt kommen,
z.B. Sehnenersatz
Implantierbare Me-dizinprodukte
Blut Medizinprodukte, die hpts. mit Blut in Kon-
takt kommen, z.B. Herzklappen
Die in dieser Arbeit verwendeten Probekörper werden demnach als implan-
tierbare Medizinprodukte mit den Applikationsorten Gewebe und Knochen ein-
geteilt. Die Kontaktdauer wird als Dauerkontakt d.h. eine einmalige, mehrfache
oder Langzeitanwendung oder Kontaktdauer mit mehr als 30 Tagen eingestuft.
In den Tab. 3 und 4 sind die jeweiligen Prüfverfahren dargestellt, die für diese
Implantate vorgeschlagen werden.
Tab. 3. Prüfungen für dauerimplantierbare Medizinprodukte zur grundlegenden Beurteilung, die
in Erwägung gezogen werden müssen (DIN EN ISO 10993).
Einteilung Biologischer Effekt
Körper-kontakt
Kontaktdauer A-kurzzeitig
(≤ 24 h) B-länger (> 24 h
bis 30 Tage) C-dauernd (> 30
Tage)
Cyt
otox
izitä
t
Sen
sibi
lisie
rung
Irrita
tion
oder
intra
kuta
ne
Rea
ktiv
ität
Syst
emis
che
Toxi
zitä
t (a
kute
)
Sub
chro
nisc
he T
oxiz
ität
(Sub
akut
e)
Gen
toxi
zitä
t
Impl
anta
tion
Häm
okom
patib
ilitä
t
A X X X B X X X X X X X Gewebe/
Knochen C X X X X X X X A X X X X X X X B X X X X X X X X Blut
C X X X X X X X X
7
Einleitung
Tab. 4. Prüfungen für dauerimplantierbare Medizinprodukte zur zusätzlichen Beurteilung, die in
Erwägung gezogen werden müssen (DIN EN ISO 10993).
Einteilung Biologischer Effekt
Körper-kontakt
Kontaktdauer A-kurzzeitig
(≤ 24 h) B-länger (> 24 h
bis 30 Tage) C-dauernd (> 30
Tage)
Chronische Toxizität
Kanzero-genität
Reproduktions- und Entwicklungs-
toxizität
Biode- gradation
A B Gewebe/
Knochen C X X A B Blut
C X X
Allerdings wird aufgrund der Vielfalt von Medizinprodukten darauf hingewiesen,
das nicht mit jedem Medizinprodukt alle in der jeweiligen Kategorie aufgeführten
Prüfungen durchzuführen sind (DIN EN ISO 10993-1). Für eine biologische Be-
urteilung werden folgende Prüfverfahren empfohlen: Cytotoxizität, Sensibili-
sierung, Gentoxizität, Implantation und für eine zusätzliche Beurteilung chro-
nische Toxizität und Kanzerogenität. Für jedes Prüfverfahren werden Anlei-
tungen zu den entsprechenden Prüfmethoden und z.B. Kontrollmaterialien ge-
geben.
1.3 Biofunktionalität
Die Biofunktionalisierung steht bei der Entwicklung von Biomaterialien
derzeit im Vordergrund, d.h. das Material soll z.B. durch besondere Oberflächen
(definierte Rauhigkeiten) oder durch Beschichtungen aktiv sein Umfeld beein-
flussen z.B. zu einem verbesserten Einwachsverhalten führen. Beispielsweise
lässt sich reines Titan sehr gut ohne adverse Reaktionen in den Körper, speziell
in den Knochen, einbringen, jedoch entsteht keine mechanische Anbindung an
den Knochen. Um eine mechanische Verankerung zu erreichen wird die Titan-
8
Einleitung
oberfläche funktionalisiert, indem sie aufgeraut wird. Durch die Beschichtung
von Metallimplantaten z.B. mit Calciumphosphaten oder osteogenen Wachs-
tumsfaktoren (z.B. Bone Morphogenic Proteins, BMPs) wird eine Funktionalisie-
rung erreicht, die zu einer besseren Integration in das umgebende Gewebe
führt.
1.4 Nickel-Titan Formgedächtnislegierungen
Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen (NiTi-FGL) gehören zu einer
Familie von intermetallischen Materialien die auch „shape memory alloys“ ge-
nannt werden. Sie enthalten annähernd eine gleiche Menge aus Nickel (50 at%)
und Titan. Für den klinischen Einsatz sind sie besonders interessant, da sie für
ein Metall ungewöhnliche mechanische Eigenschaften aufweisen, dass sind
zwei Formgedächtniseffekte: der so genannte Einwegeffekt und die Pseu-
doelastizität. Der Einwegeffekt beruht auf dem „thermischen Erinnerungsver-
mögen“ des NiTi, nach einer Verformung des Ausgangszustandes behält das
NiTi seinen verformten Zustand solange bei, bis es erhitzt wird und dann wieder
in seine Ausgangsform zurückkehrt (Abb. 2 und 3).
Abb. 2. Büroklammer aus NiTi-FGL. A) Büroklammer im Ausgangszustand, B) mechanisch
verformte Büroklammer, C-E) verformte Büroklammer wird in ca. 90°C heißes Wasser getaucht
und kehrt wieder in den Ausgangszustand F) zurück.
9
Einleitung
Verformung
Entlastung
Pseudoelastizität (konstante Temperatur)
Verformung
Erwärmen
Einwegeffekt
Austenit
Austenit
Martensit
Martensit
Abb. 3. Schematische Darstellung der martensitischen Umwandlung bei den Formgedächtnis-
effekten (Pseudoelastizität und Einwegeffekt). Verändert nach Memory Metalle GmbH.
Die Pseudoelastizität beruht auf dem „mechanischen Erinnerungsvermögen“,
dabei kehrt das NiTi auch nach starker Verformung durch eine äußere Belas-
tung, bei Entlastung wieder in seine Ausgangsform zurück (Lipscomb et al.
1996, Yahia et al. 2000) (Abb. 2 und 3). Im Gegensatz zu nicht pseudoelas-
tischen Metallen findet hier keine elastische Dehnung aufgrund des Ausein-
anderrückens von Atomen statt. So wird eine Elastizität konventioneller Metalle
um das 20-fache übertroffen. Bei beiden Formgedächtniseffekten ist die physi-
kalische Ursache, die so genannte martensitische Umwandlung (Abb. 3). NiTi
kann in zwei verschiedenen temperaturabhängigen Kristallstrukturen (Phasen),
„Martensit“ (Tieftemperaturphase) und „Austenit“ (Hochtemperaturphase) exis-
tieren. Beim Einwegeffekt wandelt sich die Tieftemperaturphase durch Erwär-
mung in die Hochtemperaturphase um, da die thermodynamische Stabilität von
der Temperatur abhängig ist, d.h. bei tiefen Temperaturen ist der Martensit sta-
10
Einleitung
biler und bei hohen der Austenit. Bei der Pseudoelastizität entsteht bei einer
konstanten Temperatur durch Belastung aus dem Austenit der Martensit, da die
thermodynamische Stabilität der Phasen auch durch die mechanische Belas-
tung bestimmt wird. In einem bestimmten Temperaturbereich begünstigt also
eine mechanische Belastung den Martensit gegenüber dem Austenit, der wie-
derum ohne Belastung in diesem Temperaturbereich stabiler wäre. Die marten-
sitische Umwandlung kann als Scherprozess dargestellt werden, bei dem sich
alle Atome gleichzeitig von einer Ausgangsposition z.B. im Hochtemperaturbe-
reich in eine Endposition im Tieftemperaturbereich verschieben, ohne dabei
Nachbaratome zu ändern. Die Transitionstemperatur (Temperatur des Phasen-
überganges) und die mechanischen Eigenschaften sind abhängig von der Ni-
ckel-Titan-Zusammensetzung, den metallurgischen Behandlungen und können
so je nach Anwendung variiert werden.
1.4.1 Nickel-Titan-Formgedächtnislegierungen als Implantatmaterial
Die Anwendungsgebiete der NiTi-Materialien im medizinischen Bereich
haben sich seit den frühen 1970-er Jahren ständig vergrößert. In Deutschland
werden sie klinisch als intravaskuläre Stents, als orthodontische Drähte, als
Klammern in der Fußchirurgie und als sogenannte Mikro-Coils zum Verschluss
von Aneurysmen im Gehirn (Nattrass et al. 1998, Schneevoigt et al. 1999,
Ryhänen 1999) eingesetzt. Im Vergleich zu den chirurgischen Edelstählen wird
allerdings der hohe Nickelanteil des Materials problematisch gesehen, da ad-
verse Gewebereaktionen sowie Sensibilisierungen befürchtet werden. Der Ein-
satz von NiTi-FGL in der Medizin wird deswegen in Deutschland kontrovers dis-
kutiert (Bogdanski et al. 2002, Menne 1994, Riepe et al. 2002).
Gerade aufgrund der ausgezeichneten mechanischen Eigenschaften sollen
NiTi-FGL weitere Anwendungen im klinischen Bereich finden, z.B. als poröse
Biomaterialien. Poröse Metalle haben im Vergleich zu kompakten Metallen die
Vorteile, dass sie leichter sind und ein besseres Einwachsverhalten des umge-
benden Gewebes zeigen. Zusätzlicher Vorteil von pörosen NiTi-FGL ist die gute
Implantat-Knochen-Verbindung, sie führt zu geringerem Knochenabrieb als es
von anderen Materialien bekannt ist. Derzeit befindet sich u.a. ein neues Im-
plantat in klinischer Erprobung, bei der ein porös strukturiertes Metallimplantat
11
Einleitung
(Nitinol, Actipore®, Biorthex Inc.) mit interkonnektierendem Porensystem als
Platzhalter in das ausgeräumte Bandscheibensegment platziert wird. Eine
Weiterführung dieser Entwicklung könnte die Nutzung von porösem NiTi als
Träger von bioaktiven Substanzen oder Stammzellen sein.
1.4.2 NiTi-Biokompatibilität
Beim Vergleich der Biokompatibilitäts-Analysen von NiTi-FGL werden
widersprüchliche Resultate in der Literatur beschrieben. Wataha et al. (1997)
konnten zeigen, dass NiTi eine gesteigerte Sekretion von IL-1β bei Monozyten
und die entsprechende IL-1β-Konzentration bei Endothelzellen eine Induktion
der Expression von ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1) verursachte.
Das NiTi besitzt demnach ein Risiko zur Förderung einer inflammatorischen
Reaktion des Organismus. Shabalovskaya (2002) zeigte, dass NiTi keinen Ein-
fluss auf die Proliferation von humanen Lymphozyten hat. Auch Rocher et al.
(2004) stellten für NiTi eine mit Titan vergleichbare gute Cytokompatibilität von
humanen Zelllinien fest. NiTi-Stents mit unterschiedlicher Oberflächenbehand-
lung zeigten eine gute Zellproliferation von humanen Fibroblasten und in vivo
ein gutes Einwachsverhalten im Kaninchenmuskel (Trepanier et al. 1998). Im
Gegensatz dazu konnten Plant et al. (2005) bei humanen Endothelzellen aus
Nabelschnurvenen (HUVEC) eine Zunahme des oxidativen Stresses und einen
Verlust von VE-Cadherin und F-actin nach NiTi-Oberflächenbehandlung (Oxi-
dation durch Hitzebehandlung bei 300°C und 400°C) feststellen. PBMC
(peripheral blood mononuclear cells) treten vermehrt im Implantatlager im Fall
einer Immunreaktion oder einer Typ IV Allergie auf. Ryhänen et al. (1998)
konnten keinen Unterschied in der PBMC-Zellzahl zwischen den unterschied-
lichen Materialien (rostfreier Stahl, Titan-Aluminium-Vanadium-Legierung) mes-
sen. Im Cytotoxizitätstest (MTT, Methyltetrazolium) und Cytokompatibili-
tätstestungen konnten keine Biokompatibilitätsveränderungen von NiTi im Ver-
gleich zu reinem Titan oder 316L Edelstahl festgestellt werden (Armitage et al.
2003). Im Vergleich zu Kontrollansätzen ohne Testmaterial zeigte NiTi in der
Kokultur mit humanen Osteoblasten und Fibroblasten eine gleich hohe Prolife-
rationsrate, d.h. NiTi wird in vitro von Osteoblasten und Fibroblasten gut toleriert
(Ryhänen et al. 2000). In Anlehnung an die DIN EN ISO 10993 konnten eben-
12
Einleitung
falls keine cytotoxische, allergische oder gentoxische Aktivität von NiTi be-
obachtet werden (Wever et al. 1997), so dass auf eine gute Kurzzeit-Biokompa-
tibilität geschlossen wurde. Sowohl die Überstände als auch die Korrosionspro-
dukte von NiTi-Stent-Drähten nach Anlegen eines Potentials von +1 Volt
(6 Stunden, 37°C) zeigten einen potentiell toxischen Effekt auf glatte Gefäß-
muskelzellen, speziell wenn die Nickelkonzentration 9 µg/ml überstieg (Shih et
al. 2000).
1.4.3 Nickelfreisetzung aus NiTi
Durch Korrosion im Organismus können Metallionen aus Implantaten
herausgelöst werden. Die Korrosionsresistenz eines Implantatmetalls ist cha-
rakterisiert durch die Bildung von Oxidschichten an der Oberfläche. Die Ober-
fläche von NiTi besteht zumeist aus einer Titandioxidschicht und nur im ge-
ringen Umfang aus Nickeloxiden (Shabalovskaya et al. 1996). Die Freisetzung
von Nickel aus NiTi ist proportional zur Nickelkonzentration an der Oberfläche,
die Nickelkonzentration wiederum ist stark abhängig von der Oberflächenbe-
handlung (z.B. Polieren, Ätzen) (Shabalovskaya 2002). Deshalb existieren in
der Literatur sehr unterschiedliche Angaben zur Nickelfreisetzung aus NiTi, je-
der Autor verwendet unterschiedliche Probengrößen und -geometrien und
Oberflächenbehandlungen. In der Tab. 5 sind die wichtigsten Referenzen zur
Nickelfreisetzung dargestellt. Im Vergleich zu rostfreiem Stahl und Co-Cr-Legie-
rungen findet bei NiTi innerhalb der ersten Tage nach Eintauchen in eine Lö-
sung eine erhöhte Nickel-Freisetzung statt (6-11ng/L). Nach einigen Tagen
stimmt sie mit der Nickel-Freisetzung von rostfreiem Stahl und Co-Cr-Legie-
rungen überein und sinkt dann bis unter die Nachweisgrenze ab
(Shabalovskaya 2002). Ryhänen et al. (1997) analysierten die Nickelfreisetzung
von NiTi im Zellkulturmedium aus der Kokultur von NiTi mit humanen Osteo-
blasten und Fibroblasten. Sie stellten eine anfänglichen Nickelfreisetzung von
125-87 µg/L fest, im Gegensatz dazu konnte bei Edelstahl eine Nickelfreiset-
zung von 7 µg/L gemessen werden. Die Nickelfreisetzung von NiTi verminderte
sich allerdings nach zwei Tagen auf 23-5 µg/L (Edelstahl 11-1 µg/L). Weitere
Untersuchungen zur Nickelfreisetzung im künstlichen Speichel mit elektrother-
mischer Atomabsorptionsspektrometrie zeigten, dass aus NiTi-Drähten sig-
13
Einleitung
nifikant mehr Nickel freigesetzt wird, als aus rostfreiem Stahl (Jia et al. 1999).
Wever et al. (1998) konnte stellten fest, dass eine Immersion von NiTi in
künstlicher Körperflüssigkeit (Hank´Solution) eine Reduzierung der Nickel-
Freisetzung von anfänglich 14.5 x 10 -7 µg/cm2 x s nach 10 Tagen unter die
Nachweisgrenze verursachte. NiTi setzte nach 3 Tagen in Kokultur mit
Epithelzellen 0,081 ± 0,006 mg/L und nach 6 Tagen 0,176 ± 0,008 mg/L
Nickelionen frei. Im Vergleich dazu setzt reines Nickel nach 3 Tagen Kokultur
mit Epithelzellen 6,500 ± 0,037 mg/L und nach 6 Tagen 11,364 ± 0,034 mg/L
Nickelionen frei (Rocher et al. 2004). Durch das Anlegen eines Potentials von
+1 Volt an NiTi-Drähten wird nach 6 Stunden bei 37°C mehr Nickel freigesetzt
(208 ± 12 mg/L) als bei einfacher Immersion für 24 Stunden bei 37 °C (0,95 ±
0,23 mg/L) (Shih et al. 2000). Die Nickelfreisetzung von orthodontischen
Drähten in künstlichem Speichel wird im Vergleich zu unbelasteten Proben (1,4
- 1,6 µg/L) während einer mechanischer Belastung (1mm/min, 24 Stunden,
38°C ± 0,2 °C) erhöht (2,3 µg/L) (Jia et al. 1999).
Tab. 5. Wichtigsten Referenzen zur Nickelfreisetzung aus NiTi.
Material Nickelfreisetzung Referenz
Plättchen mit 12 and 15 mm Durchmesser und 1,2 mm Höhe
81 ± 6 µg/L nach 3 Tagen, 176 ± 8 µg/L
nach 6 Tagen
Rocher et al. 2004
Plättchen (1cm2), unterschiedliche Oberflächen-Behandlungen
6-11 µg/L (je nach Oberflächen Behandlung)
Shabalovskaya 2002
Plättchen 6 x 7 mm 125 –87 µg/L initial, nach 2 Tagen 23-5 µg/L
Ryhänen et al. 1997
orthodontische–Drähte (80 mm), mit einer Oberfläche von
17,5 mm2
1,4 µg/L nach 24 h Jia et al. 1999
zyklierte orthodontische–Drähte (80 mm), mit einer Oberfläche von
17,5 mm2
2,3 µg/L 24 h zykliert
(1mm/min, 38°C) Jia et al. 1999
Drähte
Immersion ohne angelegtes Potential (24 h 37°C): 0,95 ±
0,23 mg/L Korrosives Medium (1,0 V
Potential, 6h 37 °C): 208 ± 12 mg/L
Shih et al. 2000
14
Einleitung
1.5 Nickel Toxizität
Die Nickelaufnahme über die Nahrung liegt bei ca. 0,15 mg Nickel/Tag
und im Trinkwasser befinden sich zwischen 0,001 und 0,01 mg Nickel/L. Die
Toxizität eines Metalls innerhalb des Körpers ist von der Konzentration der frei-
gesetzten Metallionen und der Toxizität dieser Ionen abhängig. Nickel gehört zu
den essentiellen Spurenelementen. Ein Nickelmangel verursacht z.B. eine ver-
minderte Aktivität verschiedener Enzyme und Muskeldegeneration. Auf der an-
deren Seite können hohe Nickelkonzentrationen gesundheitsschädliche Effekte,
allergische Reaktionen oder sogar Karzinome verursachen. Nickel und seine
anorganischen Verbindungen gelten eher als mindergiftig, allerdings sind die
organischen Nickelverbindungen z.T. hochgiftig. Ni2+ gelangt über das Mg2+
Transportsystem über die Zellmembran in das Zellinnere.
1.5.1 Nickel-Allergie
Nickel ist der Hauptverursacher der sogenannten allergischen Kontakt-
dermatitis. Manche Schätzungen gehen davon aus, dass ein Fünftel aller Men-
schen überempfindlich auf Nickel reagieren. In den meisten Fällen werden
diese allergischen Reaktionen durch nickelhaltigen Schmuck, z. B. Ohrstecker
oder Piercing, Clips, Ringe oder Halsketten ausgelöst. Schon geringste Nickel-
freisetzungen können bei sensibilisierten Menschen eine Nickelallergie auslö-
sen. Die Kontaktdermatitis ist eine zellvermittelte Reaktion vom Spättyp (Typ-
IV-Reaktion nach Coombs und Gell) (Tab. 6), die eine spezifische Sensibilisie-
rung auf einen Stoff (Kontaktallergen) voraussetzt. Nickel als niedermolekulare
Substanz gehört zu den Kontaktallergenen (Haptene), die erst nach Bindung an
Proteine zu vollständigen Allergenen (Hapten-carrier-Komplex) werden. Das
Allergen wird von antigenpräsentierenden Zellen aufgenommen, wodurch diese
aktiviert werden. Die aktivierten antigenpräsentierenden Zellen wandern zu den
lokalen Lymphknoten und präsentieren das Antigen zirkulierenden T-Lympho-
zyten. Unter dem Einfluss weiterer kostimulatorischer Signale wandeln sich
T-Zellen in reife Effektor- oder Memoryzellen um. Diese Zellen verlassen den
Lymphknoten und breiten sich im Körper aus. Nach abgeschlossener Sensibili-
sierungsphase führt ein wiederholter Kontakt des Allergens mit den antigen-
15
Einleitung
sensibilisierten T-Zellen zu einer Freisetzung verschiedener Cytokine und Me-
diatoren (IL-1β , IL-1α, IL-6, IL-7, TNF-α, GM-CSF). Sie führen zur Aktivierung
von Makrophagen und mononukleären Zellen, sowie deren Wanderung an den
Ort der Antigenbelastung. Dies führt zu inflammatorischen Prozessen im Kör-
pergewebe oder in den Organen. Insbesondere die Schleimhäute von Augen,
Darm, Nase und Bronchien und die Haut neigen zu heftigen Reaktionen. Die
Symptome treten aber nicht sofort, sondern erst 12 bis 72 Stunden nach dem
Allergenkontakt auf, deswegen wird dieser Allergietyp auch Spättyp genannt.
Tab 6. Einteilung der Allergietypen nach Coombs und Gell (Janeway 2002).
Pathogenese
Dauer bis zum
Auftreten der Sym-
ptome
Krankheitsbilder (Beispiele) Antikörper Allergene
Typ I
die allergische
Sofortreaktion
IgE-Bildung und IgE-vermittelte Mediatorfrei- setzung (u.a.
Histamin)
< 30 Minuten
Heuschnupfen, Binde-
hautentzündung, Nesselsucht (Urtikaria),
Gastroenteritis, allergisches
Asthma, Anaphylaxie
(Schock)
IgE-vermittelt
z.B. Pollen, Milben,
Tierhaare, Schimmelpilze, Nahrungsmittel, Insektengifte, Arzneimittel
Typ II zellzerstörende (cytotoxische)
Antikörper in Minuten
z.B. Transfusions-
und Transplantations-
reaktionen, Autoim-
munreaktionen
Cytotoxische Antikörper
der Klassen IgG, IgM
-
Typ III Zirkulierende Immunkomplexe 3-8 Stunden
Exogen Allergische
Alveolitis, z.B. Farmerlunge,
Vogelhalterlunge
hauptsächlich durch IgG vermittelt
z.B. Schimmelpilze, Bakterien (ther-
mophile Aktinomyzeten)
Typ IV die
verzögerte Reaktion
durch sensibili-sierte Lympho-
zyten
24-48 Stunden
z.B. Kontaktekzem, Arzneimittel-Exanthem
keine (zellvermittelt)
Kontaktallergene (z.B. Nickel)
1.6 Optimierung der Biokompatibilität von NiTi durch Beschichtung
Um mögliche Nickel-Freisetzungen von NiTi zu verhindern und das An-
wachs- und Einwachsverhalten zu verbessern, kommen Beschichtungen in Be-
tracht. Als Beschichtungen können biologisch aktive Peptide und Bindungs-
16
Einleitung
proteine bzw. Einzelsequenzen, Keramiken und Polymerfilme verwendet wer-
den. Entsprechend ihrer Anwendung z.B. als Knochenimplantat, können so
Materialien wie NiTi mit bioaktiven Substanzen beschichtet werden.
In den letzten zwanzig Jahren kam es zu einem gesteigerten Interesse an
Hydroxylapatiten (HAP, Ca10(PO4)6(OH)2) und verwandte Calciumphosphate
(CaP) in den Bereichen Biomaterialien und Biomineralisation. Das Interesse in
der Verwendung von HAP als Biomaterial hat mehrere Gründe: Einerseits weist
es eine hohe chemische Ähnlichkeit zu Apatit auf, ein natürliches Mineral, wel-
ches ein Hauptbestandteil der anorganischen Komponenten in Knochen und
Zähnen ist. Der Hauptbestandteil ist Karbonatapatit, ein Hydroxylapatit mit ei-
nem Karbongehalt von 4% bis 6%. Andererseits findet ein Prozess nach der
Implantation von HAP statt, den man als „spontaneous interfacial osteointegra-
tion“ bezeichnet, d.h. es entsteht eine knöcherne Verbindung zwischen Im-
plantat und Wirtsknochen.
Die Beschichtung von Metallimplantaten mit Calciumphosphat verbessert den
Kontakt von Knochen zum Implantat und führt zu einer stabilen Verbindung
(Willmann 1999, Dorozhkin et al. 2002). So lösen die beschichteten Implantate
keine adversen Antworten des Körpers aus, und die Calciumphosphate verbes-
sern stattdessen die Biokompatibilität und die Langzeit-Beständigkeit des Im-
plantates. Das Plasmaspray-Verfahren ist die Standardmethode für das be-
schichten von Metallimplantaten mit Calciumphosphat. Calciumphosphat-Pulver
wird durch Gasdruck versprüht und anschließend bis zur Schmelze erhitzt.
Beim Auftreffen auf die zu beschichtende Oberfläche kühlt das Calciumphos-
phat wieder ab und erstarrt zu einer einheitlichen Schicht. Zum Einsatz kommen
Plasmaspray-beschichtete Implantate in der Medizin als zementfreie Hüft-
schäfte und -pfannen sowie bei Zahnimplantaten.
1.6.1 Calciumphosphat-Schicht aus wässriger übersättigter Lösung
Die in dieser Arbeit verwendete Calciumphosphatschicht (Choi et al.
2003) ist im Gegensatz zum Plasmaspray-Verfahren eine Beschichtung aus
einer wässrigen übersättigten Calciumphosphatlösung (supersaturated calcium
phosphate solution, SCS), die bei Raumtemperatur stattfindet. Die Beschich-
tung des NiTi wurde unter Leitung von Herrn Prof. Epple am Institut für anorga-
17
Einleitung
nische Chemie der Universität Duisburg-Essen durchgeführt. Die Calciumphos-
phatschicht soll neben den bereits erwähnten Vorteilen als Nickelbarriere und
biomimetisches Implantat-Interface dienen und somit das An- und Einwachs-
verhalten von Knochenimplantaten aus NiTi verbessern, d.h. die Biokompatibili-
tät und Biofunktionalität der NiTi-Formgedächtnislegierung erhöhen. Im Ver-
gleich zum Plasmaspray-Verfahren ist durch die Beschichtung aus wässriger
Lösung ggf. sogar eine Integration von bioaktiven Substanzen wie Wachs-
tumsfaktoren und Antibiotika sowie eine Beschichtung innerer Oberflächen (z.B.
poröse Materialien) möglich (Choi et al. 2003).
Die Beschichtung von NiTi mit Calciumphosphat erfordert eine Vorbehandlung
des Metalls. Zunächst werden die Metallplättchen mit einem organischen Lö-
sungsmittel (z.B. Ethanol) gereinigt und anschließend wird die NiTi-Oberfläche
mit Wasserstoffperoxid und Kaliumhydroxid angeätzt. Nach dem Ätzvorgang
erfolgt die Kristallisation durch Immersion in übersättigter wässriger Calcium-
phosphatlösung. Nach einer Immersion von 24h entsteht eine ca. 10 µm dicke
Schicht. Die Beschichtung der Probekörper mit Calciumphosphat zeigt eine
Morphologie mit typischen plättchenförmigen Kristallen (Abb. 4 A).
Abb. 4. Calciumphosphatschicht aus wässriger Lösung. A) einfache Immersion, B) doppelte
Immersion C) Ansicht von oben.
Bei der Calciumphosphatschicht handelt es sich um eine Mischphase aus Octa-
calciumphosphat und Hydroxylapatit (Choi et al. 2003). Durch eine zweite Im-
mersion wird eine verbesserte Stabilität der Beschichtung durch Quervernet-
zung erreicht (Abb. 4 B). Durch die Beschichtung aus wässriger übersättigter
18
Einleitung
Lösung ist eine NiTi-Oberfläche entstanden, mit einer ähnlichen Zusammenset-
zung wie die mineralische Phase von Knochen, die sich für den Einsatz im
Knochenimplantat-Bereich eignen könnte.
1.7 Vergleichende Zell-Reaktions-Analysen
Wie bereits im Abs. 1.2.1. beschrieben verlangt die Norm DIN EN ISO
10993 definierte Analyseverfahren (Tab. 3 und 4) zur biologischen Bewertung
von Medizinprodukten. Diese Verfahren reichen jedoch für eine intensivere Be-
urteilung der Biofunktionalität und Biokompatibilität eines Implantatmaterials
nicht immer aus. Es bieten sich deshalb weiterführende Untersuchungen an wie
die biologische Analysemethode der Werkstoffe in Blut- und Zellkulturen. Aus
diesem Grund kamen in dieser Arbeit humane Leukozyten und Osteoblasten
zum Einsatz. Sie sollten zeigen, wie der Organismus auf unterschiedliche Mate-
rialien und Oberflächen reagiert. Diese Analysen orientierten sich an der kli-
nischen Relevanz, d.h. sie bezogen sich auf ein konkretes Implantat oder den
Einsatzort eines solchen. Der Knochenaufbau differiert stark im Vergleich zu
Muskeln oder etwa intravasalen Gewebe, so dass die entsprechenden Implan-
tate individuell für ihren Einsatzort und ihre Funktion im Körper gestaltet und
analysiert werden müssen.
1.7.1 Leukozyten
Die ersten Zellen, die i. a. mit einem Implantat in Kontakt treten, sind
Leukozyten (Eriksson et al. 2001). Dementsprechend liegt der experimentelle
Ansatz dieser Dissertation bei der Analyse der Interaktion von Leukozyten mit
dem Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Implantatmate-
rial.
Hauptaufgabe der Leukozyten ist die Abwehr von Krankheitserregern, um den
Körper vor Infektionen zu schützen. Sie spielen eine wesentliche Rolle bei Ent-
zündungen, bakteriellen und parasitären Infektionen sowie bei allergischen Re-
aktionen und Autoimmunerkrankungen. Die Leukozyten setzen sich aus ver-
schiedenen Subpopulationen zusammen: im wesentlichen Granulozyten, Lym-
phozyten und Monozyten.
19
Einleitung
Die neutrophilen Granulozyten sind mit 50 bis 80 Prozent die zahlenmäßig
stärkste Gruppe der Leukozyten. Sie sind die wichtigsten Funktionsträger im
unspezifischen Abwehrsystem des Blutes. Neutrophile Granulozyten bleiben
durchschnittlich nur sechs bis acht Stunden im Blutkreislauf. Beim Beginn von
Infektionen nehmen die neutrophilen Granulozyten im Blut besonders rasch zu,
um Bakterien und Gewebetrümmer zu phagozytieren.
Der Anteil der Lymphozyten beträgt zwischen 25 und 40 Prozent der Gesamt-
leukozyten beim gesunden Menschen. Davon befinden sich beim Erwachsenen
jedoch nur vier Prozent im Blutkreislauf. Rund 95 Prozent der im Knochenmark
und in den lymphatischen Organen (Thymus, Milz, Mandeln, den Peyerschen
Plaques und Lymphknoten) gebildeten Lymphozyten sind auch dort gespei-
chert. Bei Bedarf können sie in die Blutbahn abgegeben werden.
Mit 8 bis 12 Prozent sind die Monozyten die zahlenmäßig kleinste Gruppe der
Leukozyten. Unter diesen stellen sie jedoch mit einem Durchmesser von 12-20
µm die größten Zellen dar. Außerdem sind sie unter den Leukozyten am besten
in der Lage, Bakterien und Gewebetrümmer durch Phagozytose unschädlich zu
machen. Monozyten bleiben zwei bis drei Tage im peripheren Blut. Gemeinsam
mit den basophilen Granulozyten vermitteln und fördern sie allergische Reakti-
onen. Eine Erhöhung der Monozytenzahl findet sich regelmäßig auf dem Höhe-
punkt einer Infektion, der "monozytären Abwehrphase".
1.7.2 Osteoblasten
Die Analyse der Interaktion eines Implantatmaterials für den Einsatz im
bzw. am Knochen mit Osteoblasten ist eine Voraussetzung, da sie als Indika-
torzellen für das Knochenwachstum dienen.
Im Knochengewebe findet man drei Zellpopulationen Osteoblasten, Osteozyten
und Osteoklasten. Sie unterscheiden sich hinsichtlich ihrer Morphologie und
Funktion, im Falle der Osteoklasten auch bezüglich der Herkunft. Die Osteo-
klasten dienen der Knochenresorption, sie sind mobile Zellen und stammen von
hämatopoetischen Stammzellen des Knochenmarks ab.
Die Osteoblasten sind als knochenbildende Zellen mesenchymalen Ursprungs.
Sie produzieren die aus Osteoid und Kollagenfasern (Typ I) bestehende Inter-
zellularsubstanz des Knochengewebes und veranlassen deren Mineralisation.
20
Einleitung
Bei fortschreitender Knochenbildung sind die Osteoblasten von mineralisierter
Matrix umgeben und werden dann Osteozyten genannt.
1.7.3 Cytokine
An der Regulation der interzellulären Kommunikation sowohl der Osteo-
blasten als auch der Leukozyten sind Wachstumsfaktoren und Cytokine im ho-
hen Maße beteiligt. Bei der Zellaktivierung kommt es zur Veränderung des
Cytokin-Expressionsmusters und der Konzentrationen, so dass Cytokine als ge-
eignete Parameter der Zellaktivierung dienen.
Cytokine sind hormonähnliche regulatorische Mediatoren. Sie wirken auf unter-
schiedliche Zelltypen und werden von vielen verschiedenen Zellen gebildet. In
der Regel werden sie nach Stimulierung produziert und sind in sehr geringen
Konzentrationen (pg bis ng) aktiv. Es handelt sich in der Regel um einfache
Polypeptide (5-100 kDa). Cytokine sind an der Regulierung der Ontogenese,
der Gewebereparatur, der Immunabwehr, der Entzündung, der Kontraktilität in
Herz und Gefäßen, der Aufrechterhaltung der Körperprozesse und der Apo-
ptose beteiligt. Die Funktion der Cytokine schließt zahlreiche Effekte auf die
Zellen des Immunsystems und die Regulierung entzündlicher Prozesse ein.
Mittlerweile sind eine große Zahl verschiedener Cytokine identifiziert worden.
Es gibt derzeit verschiedene Ansätze zur Klassifizierung der Cytokine. Teils
werden Cytokine nach ihrer Funktion, ihrer Struktur oder nach den Cytokinre-
zeptoren eingeteilt. Aus der Beschreibung der Funktion ergibt sich die her-
kömmliche Einteilung nach Interferonen (IFN), Interleukinen (IL-1 bis IL-23),
Tumornekrosefaktoren (TNF), Kolonie-stimulierende Faktoren (CSF), Wachs-
tumsfaktoren (z.B. FGF), transformierende Wachstumsfaktoren (TGF), Chemo-
kinen (z.B. MCP-1) und Virokinen (z.B. CGF). Allerdings zeigte sich, dass die
meisten Cytokine neben ihrer Haupteigenschaft auch weitere Funktionen ha-
ben.
Cytokine binden an hochaffine Rezeptoren und wirken in der Regel lokal. Sie
können auf die produzierende Zelle oder Zellen des gleichen Typs in autokriner
Weise wirken. Teils können sie auch auf andere Zelltypen in parakriner Weise
wirken. Beeinflussen sie Zellen in unmittelbarer Nähe, d.h. ist ein Zellkontakt
vorhanden, handelt es sich um einen juxtakrinen Effekt. Werden Cytokine mit
21
Einleitung
dem Blut oder Gewebeflüssigkeiten transportiert, können sie auch auf weiter
entfernt liegende Zellen in endokriner Weise wirken.
Die Cytokinfunktionen werden durch die Interaktion mit den entsprechenden
hochaffinen Rezeptoren, den darauf folgenden Signaltransduktionswegen und
der anschließenden Genaktivierung bestimmt. Ein Drittel der bekannten Cyto-
kine z.B. IL-6 vermitteln ihre Wirkung über intrazelluläre Janus-Kinasen (Jak)
und/oder sogenannte STAT-(signal transducers and activators of transcription)
Faktoren. Weitere Cytokin-Rezeptor-Signaltransduktionswege können über G-
Proteine (z.B. Ras) und NF-кB zur biologischen Funktion führen.
Grundlegende Interaktionsmöglichkeiten von Cytokinen sind z.B. der synergis-
tische Effekt, bei dem in Gegenwart von mehreren Cytokinen eine stärkere Re-
aktion erreicht wird, als wenn nur eines der Cytokine vorhanden wäre. Beim
antagonistischen Wirkprinzip können bestimmte Cytokine die Produktion
anderer Cytokine oder Proteine blockieren. Weitere Interaktionsmöglichkeiten
sind: Stimulierung der Rezeptorexpression, Kompetition am Rezeptor, Bindung
an lösliche Rezeptoren, Herabregulation der Rezeptorexpression, redundante
Funktionen und pleiotrope Wirkung.
Der Knochenstoffwechsel unterliegt dem modulierenden Einfluss diverser, sys-
temisch wie lokal wirksamer Cytokine. Die Differenzierung und Proliferation von
Osteoblasten wird durch TGF-β stimuliert, zudem hemmt es auch die Wirkung
von Cytokinen wie IL-1, IL-6 und TNF-α. Die Knochenresorption wird von den
Cytokine wie IL-1, IL-6 sowie TNF-α beeinflusst. Diese Faktoren, meist von
Monozyten oder Granulozyten gebildet, aktivieren über verschiedene Me-
chanismen die Osteoklasten.
1.7.4 Adhäsionsmoleküle
Die adhäsiven Interaktionen von Zellen sind essentiell für die Prolifera-
tion, Differenzierung und viele andere Funktion der Zellen. Auch bei der zel-
lulären Kommunikation, wie sie bei zahlreichen physiologischen Prozessen
stattfindet, spielt die Zelladhäsion eine wesentliche Rolle. In physiologischen
Situationen wird unter Zelladhäsion der spezifische, Rezeptor-vermittelte Kon-
takt zwischen Zellen oder zwischen Zellen und der sie umgebenden extrazel-
lulären Matrix verstanden. Diese Interaktionen besitzen einerseits eine mecha-
22
Einleitung
nische Funktion, die für die Elastizität und Zugfestigkeit, also für Gewebeinte-
grität und die Zellwanderung von Bedeutung sind. Zum anderen wirken die Ad-
häsionsrezeptoren auch als Signaltransmitter. Durch Adhäsion werden intra-
zelluläre Prozesse induziert, die zur Umstrukturierung des Cytoskeletts und zur
Induktion von Signalkaskaden führen können. Diese intrazellulären Vorgänge
können ihrerseits Affinität, Expressionsmuster und Spezifität des Rezeptors
beeinflussen.
Bei den Adhäsionsmolekülen handelt es sich um eine heterogene Gruppe von
Molekülen, die auf den Oberflächen der Zellen exprimiert werden. Dabei sind
einige der Adhäsionsmoleküle permanent vorhanden, bei anderen hingegen ist
die vorherige Aktivierung der Zelle durch entsprechende Mediatoren notwendig.
Bei den Adhäsionsmolekülen handelt es sich um transmembranäre Glykopro-
teine, die sich Aufgrund struktureller Ähnlichkeiten in vier Großfamilien einteilen
lassen: die Cadherine, die Selektine, die Integrine und die Familie der Im-
munglobulin-Superfamilie.
Mitglieder der Cadherinfamilie sind Adhäsionsmoleküle, die in spezialisierten
Membranbereichen, wie der Zonula adherens und den Desmosomen von Epi-
thelzellen, lokalisiert sind. Die Familie der Selektine, bestehend aus den drei
Mitgliedern der L-(Leukozyten), P-(Plättchen) und E-(Endothel)–Selektine, wer-
den auf Endothelzellen und verschiedenen Blutzellen exprimiert. Während ent-
zündlicher Prozesse initiieren Selektine die Interaktion von Leukozyten mit En-
dothelzellen, das "Rollen", dem das Auswandern der Zellen aus dem Blut ins
Gewebe folgt. Die Zelladhäsionsmoleküle der Immunglobulinfamilie besitzen
eine oder mehrere Immunglobulin-Domänen. Die vierte Familie der Adhäsions-
moleküle stellen die Integrine dar, welche auf praktisch allen Zellen exprimiert
und bereits früh während der Embryonalentwicklung benötigt werden. Sie sind
beteiligt an Zellwachstum, Differenzierung, Immunantworten, Wundheilung aber
auch an pathologischen Prozessen wie der Tumorentstehung. Integrine binden
andere membranständige Adhäsionsrezeptoren auf benachbarten Zellen. Die
Funktion der Adhäsionsmoleküle zu definieren und in einzelne Klassen einzu-
teilen hat sich als sehr schwierig herausgestellt. Bei jeder Wechselwirkung zwi-
schen Endothel und zirkulierenden Leukozyten sind mehrere verschiedene
Paare Adhäsionsmoleküle beteiligt. Es ist also nicht möglich, einem Adhäsi-
onsmolekül eine bestimmte Zellbewegung zuzuordnen. Interzelluläre Adhäsi-
23
Einleitung
onsmoleküle (ICAM) gehören zur Immunglobulin-Superfamilie. Sie spielen eine
wichtige Rolle bei immunologischen Vorgängen wie z.B. der Adhäsion von Leu-
kozyten an ein aktiviertes Endothel während der Chemotaxis. Eine Vielzahl von
vaskulären Zelladhäsionsmolekülen auf den Leukozyten sowie auf den Endo-
thelzellen vermittelt und kontrolliert die Adhäsion der Blutzellen an die Gefäß-
wand. Dadurch findet eine Steuerung der Leukozytenmigration in Entzün-
dungsherde statt. Dieser Prozess läuft in einer Kaskade von hintereinander ge-
schalteten molekularen Interaktionen ab. Zunächst vermitteln die Selektine, das
"Andocken" und "Rollen" der Leukozyten auf der Endotheloberfläche. Dies führt
zur Verlangsamung der Leukozyten und ermöglicht den Kontakt mit Signalstof-
fen auf der Endotheloberfläche, wie z. B. den Chemokinen. Diese stimulieren
die Aktivierung von Integrinen auf der Leukozytenoberfläche, die dann die effi-
ziente Bindung dieser Zellen an die Endotheloberfläche vermitteln. Als Ligan-
den der Integrine fungieren Mitglieder der Immunglobulin-Superfamilie. Die nun
stabil adhärierenden Leukozyten können sich gezielt fortbewegen und schließ-
lich aktiv durch die Endothelzellschicht hindurchwandern. Die Änderung der
Expression von Adhäsionsmolekülen wie z.B. das LECAM-1 korrelieren direkt
mit der Aktivierung von neutrophilen Granulozyten nach Chemotaxinbindung.
Das interzelluläre ICAM-1 ist das bisher am besten untersuchte Adhäsionsmo-
lekül. ICAM-1 kann im Bereich von Entzündungen auf den Endothelzellen
nachgewiesen werden.
1.7.5 Chemotaxis Die Chemotaxis ist der einleitende Schritt eines mehrschrittigen multifaktoriellen
Prozesses der Phagozytose. Die quantitative Analyse der neutrophilen Granu-
lozyten, die entlang eines Konzentrationsgradienten des konditionierten Medi-
ums wandern, sowie die Änderung der Expressionsdichte eines Adhäsionsmo-
leküls, sind immunologische Funktionsuntersuchungen, die eine Analyse der
biologischen Aktivität von löslichen Faktoren ermöglichen. Eine weitere Mög-
lichkeit die Biofunktionalität von Biomaterialien zu analysieren, ist die Bewer-
tung des Einflusses von löslichen Faktoren auf die Apoptose von Zellen.
24
Einleitung
1.7.6 Apoptose
In der Entwicklung des Körpers und z.B. während der kontinuierlichen
Epithelbildung (z.B. Darmepithel), werden nicht nur Zellen neu gebildet, son-
dern sie gehen aufgrund des genetischen Bauplans auch gezielt zugrunde. Im
erwachsenen Organismus besteht ein Gleichgewicht zwischen Neubildung von
Zellen und kontrolliertem Verlust. Dies lässt sich besonders gut bei den Zellen
des Immunsystems beobachten. Hier entstehen ständig mehr Zellen als benö-
tigt, so dass die überschüssigen Zellen reguliert abgebaut werden. Dieser Vor-
gang folgt einem genetisch kontrollierten Programm, weshalb man auch vom
programmierten Zelltod oder auch von der Apoptose spricht. Dabei führen Ab-
schnürungen der Plasmamembran zu einer Verkleinerung des Zellvolumens,
und durch endonukleolytische Spaltung des Chromatins entstehen nukleoso-
male Fragmente. Die Apoptose erfolgt auch bei polymorphkernigen neutro-
philen Leukozyten (PMN), auch bei denen die mit Biomaterialien interagieren.
Physiologisch ist aus der inflammatorischen Sicht, die Apoptose ein Schlüssel-
prozess bei der Eliminierung der neutrophilen Leukozyten. Eine Änderung der
Zu- bzw. Abnahme der Apoptose beeinflusst die Funktionalität der PMN, wie
z.B. die Abwehr- oder Gewebsreaktionen.
1.8 Fragestellung
Formgedächtnislegierungen (FGL) auf der Basis von Nickel und Titan
(NiTi) zeigen für den klinischen Einsatz ungewöhnliche Eigenschaften (Form-
gedächtniseffekt und Pseudoelastizität). NiTi-FGL finden bereits als ortho-
dontische Drähte oder Klammern in der Fußchirurgie Verwendung. Jedoch sind
die medizinischen Anwendungen mit den bisherigen Entwicklungen als medizi-
nisches Implantat oder Instrument noch nicht ausgeschöpft. Die potentiellen
neuen Einsatzgebiete und Weiterentwicklungen der NiTi-FGL verlangen eine
prinzipielle und zielgerichtete Analyse der Biokompatibilität dieser Legierung.
Ziel dieser Arbeit war es, die Biokompatibilität und Biofunktionalität von Calci-
umphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-FGL zu analysieren.
Dazu wurden in vitro Assays etabliert, die es ermöglichen, eine genauere Pro-
gnose einer in vivo Implantat-Gewebe-Reaktion zu geben, als bisherige Ver-
25
Einleitung
fahren (Cytotoxizität, Proliferation) das erlauben. Bei der Interaktion von unter-
schiedlichen Zellpopulationen mit den verschiedenen NiTi-Oberflächen sollten
diverse Parameter gemessen werden: die Zelladhärenz und die Zellprolifera-
tion. Weitergehend wurde die Zellaktivierung und Freisetzung löslicher Faktoren
(Cytokine) analysiert. Die biologische Gesamtaktivität der freigesetzten Fak-
toren, wurde als konditioniertes Medium in Funktionsassays analysiert. In der
Zellkultur wurden primäre humane Osteoblasten, humane osteoblastenartige
Osteosarkoma-Zelllinien, isolierte polymorphkernige neutrophile Granulozyten
(PMN), periphere mononukleäre Blutzellen (PBMC) und Thrombozyten mit den
Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten Probekörpern kokultiviert.
Als weitere Kontrolle dienten Zellen, die keinen Kontakt mit dem Implantatma-
terial hatten.
Neben der Zellkultur wurden folgende Methoden eingesetzt: Durchlicht-, Fluo-
reszenz- und Rasterelektronenmikroskopie, quantitative Bildanalyse, Cytotoxi-
zitätstest, Durchflußcytometrie (FACS), Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay
(ELISA), Protein-Array (Dot-Blot), mRNA Microarray, Chemotaxis- und Phago-
zytose-Bioassay, die Analyse der Expression von Adhäsionsmolekülen und der
Apoptose (DNA-Fragmentierung, FACS).
Diese Dissertation wurde im Rahmen des Sonderforschungsbereiches (SFB)
459 Formgedächtnistechnik (Grundlagen, Konstruktion, Fertigung) erstellt. Im
SFB 459 arbeitet eine interdisziplinäre Gruppe aus Ingenieurwissenschaftlern,
Naturwissenschaftlern und Medizinern.
26
Material und Methoden
2 Material und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Reagenzien/Puffer
Reagenzien/Puffer Firma
Calcein-AM Calbiochem, Schwalbach
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
DNAse I Roche Diagnostics GmbH, Mannheim
EDTA Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium)-DMSO Invitrogen, Karlsruhe
FACS™ Lyselösung (Lysing Solution) BD-Biosciences, Heidelberg
fötales Kälberserum (FCS) Invitrogen, Karlsruhe
Glutaraldehyd Sigma-Aldrich, Taufkirchen
HEPES, 20 mM Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Histopaque (1077, 1119) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Hyperfilm ECL, 18 x2 4 cm Amersham Biosciences, Freiburg
Natriumchlorid Lösung, 0,9% Delta Select GmbH, Pfullingen
Nickel(II)-Chlorid Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Phosphatpuffer (Phosphate Buffered Saline, PBS) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Propidiumjodid Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA
Phosphorsäure, 1M Sigma-Aldrich, Taufkirchen
27
Material und Methoden
Streptavidin, Meerettich-Peroxidase-gekoppelt Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Rinderserumalbumin (BSA) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tetramethylbenzidin Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Tris-Puffer (Trizma®) Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Triton® X-100 Promega GmbH, Mannheim
Trypan-Blau Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Türksche Lösung Fluka BioChemika, Taufkirchen
Tween®-20 Sigma-Aldrich, Taufkirchen
Zellkulturmedium RPMI1640 Invitrogen, Karlsruhe 2.1.2 Verbrauchsmaterial
Material Firma
96 Mikrotiterplatte, MaxiSorp® Nunc, Roskilde, Dänemark
S-Monovette® K3E, 9 ml Sarstedt, Nümbrecht
S-Monovette® LH, 3,5 ml Sarstedt, Nümbrecht
Polystyrol Rundbodenröhrchen (Falcon) BD Biosciences, Heidelberg
Serologische Einmalpipetten Omnilab, Münster
Zellkulturplatten, 6- und 24-Well (Falcon) BD Biosciences, Heidelberg
28
Material und Methoden
2.1.3 Cytokine (Standards)
Für den ELISA wurden für die Erstellung der Standardkurven rekombinante
humane Cytokine der Firma R & D Systems, Wiesbaden, eingesetzt: IL-1ra
(280-RA-010) , IL-2 (202-IL-010), IL-6 (206-IL-010), IL-8 (208-IL), IL-10 (217-IL),
TNF-α (210-TA), IFN-γ (285-IF).
2.1.4 Antikörper
Für den ELISA wurden monoklonale und biotinylierte Antikörper gegen
IL-1ra, IL-2, IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α und IFN-γ der Firma R & D Systems,
Wiesbaden, eingesetzt. In der Durchflußcytometrie wurden Antikörper gegen
CD11b, Cd62, CD62L und ICAM-1 der Firma BD-Biosciences, Heidelberg,
verwendet.
2.1.5 Assays
Name Firma
Cytokine Array III Firma RayBiotech Inc., Norcross, USA
Cytotoxizitäts-Assay (CytoTox 96 non- radioactive Cytotoxicity Assay) Promega GmbH, Mannheim
EZ4U (Easy for you) Biomedica Gesellschaft mbH, Wien
Fluorescein-FragELTM Oncogene Research Products, Boston, MA, USA
MIGRATEST™ Chemotaxis-Bioassay Orpegen Pharma, Heidelberg
29
Material und Methoden
2.1.6 Zelllinien
Zellen Firma
Fibroblasten, murine (Swiss 3T3), ATCC: CCL-92
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig
MG-63 (osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen) ECACC, Salisbury, England
SAOS-2 (osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen)
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Braunschweig
2.1.7 Metalle
Metall Firma
Nickel Goodfellow, Bad Nauheim
NiTi Memory Metalle GmbH, Weil am Rhein
Titan-Aluminium-Vanadium (Ti6AL4V) Goodfellow, Bad Nauheim
Titan Goodfellow, Bad Nauheim 2.1.8 Software
Programm Firma
Bildanalyseprogramm analySIS® 3.1 und 3.2 Soft Imaging System, Münster
CELLQuestTM 1.2.2 BD-Biosciences, Heidelberg
Photoshop 5.0 Adobe, Unterschleißheim
30
Material und Methoden
2.1.9 Geräte
Gerät Firma
Biofuge-Pico Eppendorf, Hamburg
Color View II Soft Imaging System, Münster
Curix 160, Röntgenfilmentwickler Agfa, Köln
Digitalkamera Camedia C3030 Olympus, Hamburg
Digitalkamera D1x Nikon, Düsseldorf
Durchflußcytometer, FACSCalibur™ BD-Biosciences, Heidelberg
Fluoreszenzmikroskop BX61 Olympus, Hamburg
Inversionsmikroskop CK2 Olympus, Hamburg
Labortiefkühltruhe 6383 GFL, Burgwedel
LEO Gemini 1530 LEO, Oberkochen
Lichtmikroskop Olympus CK2 Olympus, Hamburg
Megafuge 1.0R Kendro-Heraeus, Hanau
Mikroplatten-Reader (MRX Revelation) Dynex Technologies, Denkendorf
Mikroplatten-Wascher AM-60 Dynex Technologies, Denkendorf
Rotationsplattform VSR23 Grant Instruments, Cambridge, Großbritannien
Schüttler IKA KS 260 basic IKA-Werke, Staufen
Sicherheitswerkbank HeraSafe, HS15 Kendro-Heraeus, Hanau
Kathodenzerstäubungsanlage, Edwards Sputter Coater S150B Edwards, West Sussex, England
31
Material und Methoden
2.2 Gradientenwerkstoff
Der gradierte Probekörper (Abb. 5) wurde über pulvermetallurgische Ver-
fahren aus gemischten Element-Pulvern vom Lehrstuhl Werkstoffsynthese und -
herstellungsverfahren des Forschungszentrums Jülich (Prof. Stöver) hergestellt.
Insgesamt wurden zehn unterschiedliche Pulvermischungen verwendet, dabei
wurde der Bereich Ni:Ti-Verhältnis von 90:10 (at%) über Abstufungen von 10 at%
bis zu reinem Titan abgedeckt (Tab. 7). Jede Mischung wurde in einem Taumel-
mischer Typ TC2 (WAB, Basel, Schweiz) für 24 h homogenisiert. Die Verdichtung
erfolgte über heißisostatisches Pressen (HIP). Dazu wurden die Pulver in einem
ersten Schritt uniaxial vorverdichtet. Die entstandenen Pellets erreichten eine
Dichte von etwa 65 % der theoretischen Dichte. Zehn dieser Pellets, jedes mit ei-
nem anderen Mischungsverhältnis für Nickel und Titan, wurden in zylindrische
Stahlkapseln gefüllt, die anschließend unter Vakuum verschweißt wurden. Nach
dem HIP-Prozess (1065 °C, 195 Mpa, 5 h) wurde das Kapselmaterial durch Ab-
drehen entfernt und die Proben mittels Funkenerosion in Stücke von 32 x 10 x 1,5
mm geteilt. Das Vorhandensein verschiedener intermetallischer Phasen und der
quasi-kontinuierliche Übergang in der elementaren Zusammensetzung der Gra-
dientenabschnitte wurde durch kristallographische Analyse und energie-
dispersive Röntgenspektroskopie bestimmt. Die für Zellkulturtests vorgesehenen
Proben wurden einseitig poliert. Die Breite der Segmente mit unterschiedlichen
Ni:Ti-Verhältnissen betrugen etwa 3 mm.
Abb. 5. Ni-NiTi-Ti gradierter Probekörper (32 x 10 x 1.5 mm). Zusammensetzung der einzelnen
Segmente siehe Tab. 7.
32
Material und Methoden
Tab. 7. Gradierung des Probekörpers.
Segment at % A 90 Ni : 10 Ti
B 80 Ni : 20 Ti
C 70 Ni : 30 Ti
D 60 Ni : 40 Ti
E 50 Ni : 50 Ti
F 40 Ni : 60 Ti
G 30 Ni : 70 Ti
H 20 Ni : 80 Ti
I 10 Ni : 90 Ti
J 0 Ni : 100 Ti
Jeweils ein autoklavierter (Dampfsterilisation, 121°C, 20 Minuten) Ni-NiTi-Ti-gra-
dierter Probekörper wurde in ein Kompartiment (9,6 cm2) einer 6-Loch Zellkultur-
platte (Falcon, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankreich) gebracht. Anschlie-
ßend wurden 5 ml Zellsuspension (MG-63 oder SAOS-2 jeweils 4000 Zellen/ml
RPMI1640 Zellkulturmedium) zugefügt und für 3-4 Tage in Kultur genommen, da-
bei wurde täglich das Zellkulturmedium durch frisches vorgewärmtes (37°C)
RPMI1640 Zellkulturmedium ersetzt.
Nach Erreichen der Zellkonfluenz wurde die Zellproliferation in unmittelbarer
Nähe unterschiedlicher Probekörperbereiche mittels Inversionsmikroskop (CK2,
Olympus, Hamburg) und Digitalkamera (Camedia C3030, Olympus) dokumen-
tiert. Anschließend wurde der Probekörper vorsichtig entfernt und die Zellen
wurden zweifach mit Phosphatpuffer (Phosphate Buffered Saline, PBS, Sigma-
Aldrich, Taufkirchen) gewaschen und danach mit 1 ml Türkscher Lösung (Fluka
BioChemika, Taufkirchen) für 5 min bei Raumtemperatur gefärbt. Die Färbe-
lösung wurde dann durch zweifaches Waschen mit PBS entfernt und die ge-
färbten Zellen sowie die jeweiligen gradierten Probekörper wurden einzeln unter
gleichen optischen Bedingungen digital photographiert (Nikon D1x). Alle Auf-
nahmen wurden mit einem Bildananalyseprogramm (analySIS® 3.1, Soft Ima-
ging System, Münster) bearbeitet. Anschließend wurden die Bilder der Probe-
körper mit den Zellbildern in der jeweiligen ursprünglichen Lage digital zusam-
mengeführt (Photoshop 5.0 Software, Adobe, Unterschleißheim).
33
Material und Methoden
2.3 Metallprobekörper
Bleche aus superelastischem NiTi (Memory Metalle GmbH, Weil am
Rhein) wurden in kleine Quadrate (8 mm x 8 mm x 0.1 mm3) geschnitten. Als
Kontrollmaterialien wurden reines Titan (Goodfellow, Bad Nauheim) und Titan-
Aluminium-Vanadium-Legierung (Ti6Al4V, Goodfellow, Bad Nauheim) sog.
Chirurgenstahl mit den gleichen Abmessungen eingesetzt. Es handelt sich um
Metalle, die bereits als Implantatmaterialien etabliert sind, d.h. ihre Biokompati-
bilität wurde untersucht, und sie werden bereits in der Unfallchirurgie und Ortho-
pädie eingesetzt. Anschließend wurden die Probekörper für jeweils 10 min in
Aceton, Ethanol und fließendem destilliertem Wasser gewaschen.
2.4 Calciumphosphat-Beschichtung
Ein Teil der Metallplättchen wurde für die Beschichtung mit Calcium-
phosphat aus wässriger Lösung verwendet. Diese werden im weiteren Verlauf
dieser Arbeit auch als beschichtete Probekörper bezeichnet. Vor der Beschich-
tung mit Calciumphosphat ist eine Vorbehandlung der Metallprobekörper erforder-
lich. Dazu wurden die Metallplättchen für 60 min in 30% H2O2 gekocht und unter
fließendem destillierten Wasser gespült. Für eine bessere Anheftung und Kris-
tallisation wurden die Metalloberflächen angeätzt, dazu wurden sie bei 120 °C
für 30 min in 4 M KOH getaucht und anschließend in fließendem Wasser ge-
spült. Nach dem Ätzvorgang erfolgt die Kristallisation durch Immersion in über-
sättigter wässriger Calciumphosphatlösung bei 20°C. Für die Immersionslösung
wurden folgende Ionenkonzentrationen verwendet: 1,8 mM K+; 3,0 mM Ca2+;
1,8 mM H2PO-4; 6,0 mM NO-
3. Nach einer Immersion von 24h entsteht eine ca.
10 µm dicke Calciumphosphatschicht. Zur Erhöhung der Stabilität wird nach
dem Trocknen eine zweite Immersion durchgeführt. Die Oberfläche der NiTi-
Probekörper wurde vor und nach Immersion in Calciumphosphat-Lösung mittels
Rasterelektronenmikroskopie (REM) und energiedispersiver Röntgenspektro-
skopie (EDX), sowie Röntgenpulverdiffraktometer (XRD) analysiert (Choi et al.
2003). Bei der Calciumphosphatschicht handelt es sich um eine Mischphase
aus Octacalciumphosphat und Hydroxylapatit. Durch Kalzifizierung aus wäss-
riger Lösung ist eine Beschichtung mit einer ähnlichen Zusammensetzung wie
34
Material und Methoden
die mineralische Phase von Knochen entstanden, die sich für den Einsatz als
Knochenimplantat eignen könnte.
2.5 Zellkultur
Alle Schritte der Zellkultur fanden unter sterilen Bedingungen statt, d.h.
die Arbeiten wurden unter einer Sicherheitswerkbank (HeraSafe, HS15,
Kendro-Heraeus, Hanau) durchgeführt.
2.5.1 Kultivierung von Osteoblasten-Zelllinien und Fibroblasten
Humane osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen MG-63 wurden von der
Europäischen Sammlung von Zellkulturen (ECACC, Salisbury, Großbritannien)
bezogen. Humane osteoblastenartige Osteosarkoma-Zellen SAOS-2 und murine
Fibroblasten (Swiss 3T3) stammten aus der Deutschen Sammlung von Mikroorga-
nismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig). MG-63, SAOS-2 und 3T3 wurden
in 75 cm2 Zellkulturflaschen (Falcon, BD Biosciences) unter Zellkulturbedingungen
(37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) kultiviert. Als Zellkulturmedium
wurde RPMI1640 (Invitrogen, Karlsruhe) supplementiert mit L-Glutamin (4 mM),
Na-Bicarbonat (2.0 g l-1), 10% inaktiviertes fötales Kälberserum (FCS, Invitrogen)
und 20 mM HEPES (Sigma-Aldrich) eingesetzt. MG-63, SAOS-2 und 3T3 wurden entsprechend der Proliferationskinetik alle 4-7
Tage subkultiviert.
2.5.2 Subkultivierung und Ernte der Zellen
Die adhärent wachsenden Zellen wurden vor Erreichen der Konfluenz
von den Zellkulturflaschen abgelöst und in geringerer Dichte erneut ausgesät
(Passagieren). Hierzu wurde das Zellkulturmedium abgesaugt und nach zwei-
fachem Waschen mit PBS erfolgte eine 2 minütige Inkubation mit 0.2 ml/cm2
Trypsin-EDTA-Lösung (0.25% Trypsin; 0.1% EDTA, Sigma-Aldrich) bei 37°C. Die
Zellen wurden unter dem Durchlichtmikroskop betrachtet, nach dem Abrunden
der Zellen konnten diese durch leichtes Klopfen gegen die Zellkulturflasche,
sog. „Shake off“-Verfahren, von dem Zellkulturflaschen-Boden gelöst werden.
Die entstandene Zellsuspension wurde anschließend zweimal mit dem supple-
35
Material und Methoden
mentierten Zellkulturmedium gewaschen. Die Zellen wurden in frischem Zellkul-
turmedium resuspendiert und in der jeweils gewünschten Verdünnung auf neue
Flaschen verteilt. Für den Einsatz in den entsprechenden Experimenten wurde
die Zellzahl mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt und die erforderliche
Anzahl an Zellen ausgesät.
2.5.3 Einfrieren und Auftauen der Zellen
Konfluent wachsende Zellen wurden wie oben beschrieben von der Zell-
kulturflasche abgelöst und gewaschen. Das Pellet wurde nach dem Waschen
resuspendiert und in 1 ml Einfriermedium (Cell Culture Freezing Medium-
DMSO, Invitrogen, Karlsruhe) aufgenommen. Die Zellen wurden anschließend
für 3 Stunden in einer Labortiefkühltruhe (GFL, Burgwedel) auf -80 °C abgekühlt
und schließlich in flüssigem Stickstoff (-196°C) gelagert.
Das Auftauen der Zellen erfolgte bei Raumtemperatur. Die Zellen im Einfrier-
medium wurden im FCS-supplementierten Zellkulturmedium gewaschen. An-
schließend wurde das Pellet im FCS-supplementierten Zellkulturmedium aufge-
nommen und zur weiteren Kultivierung in Zellkulturflaschen gegeben.
2.6 Isolierung humaner Leukozyten
Die Isolierung der Leukozyten erfolgte aus EDTA-antikoaguliertem Blut
(9 ml Monovette® K3H, Sarstedt, Nümbrecht) von gesunden freiwilligen Spen-
dern. Polymorphkernige neutrophile Granulozyten (PMN) und periphere mono-
nukleäre Zellen (PBMC) wurden über einen diskontinuierlichen 2-Stufen Ficoll-
Gradienten gewonnen (Köller et al. 2001). Zunächst wurde das EDTA-antiko-
agulierte Blut zu gleichen Teilen mit 0,9% Natriumchloridlösung (Delta Select
GmbH, Pfullingen) verdünnt. In einem 50 ml Falcon-Röhrchen (BD-Biosciences,
Heidelberg) wurde 10 ml Polysaccharose/Natrium-Diatrizoat mit einer Dichte
von 1,077 g/ml (Histopaque 1077, Sigma-Aldrich) über 10 ml Histopaque mit
einer Dichte von 1,119 g/ml (Histopaque 1119, Sigma-Aldrich) geschichtet. Zwi-
schen den beiden Lösungen musste eine klare scharfe Abgrenzung zu erken-
nen sein. Auf das Histopaque 1077 wurde anschließend vorsichtig 20 ml des
verdünnten antikoagulierten Bluts pipettiert (Abb. 6). Die Röhrchen wurden bei
36
Material und Methoden
700g und bei Raumtemperatur für 30 min zentrifugiert (Megafuge 1.0R, Kendro-
Heraeus, Hanau). Nach der Zentrifugation war eine deutliche Auftrennung der
Blutbestandteile in drei Schichten zu erkennen (Abb. 6). Das obere zellfreie
Plasma wurde abpipettiert und verworfen, aufeinander folgend konnten im An-
schluss die PBMC und PMN abpipettiert werden. Die jeweiligen Histopaque-
Zwischenschichten wurden verworfen. Die Leukozytenfraktionen wurden jeweils
in neue 50 ml Falcon-Röhrchen überführt und mit PBS bis auf 40 ml aufgefüllt.
Die Röhrchen wurden anschließend bei 200g für 15 min und 4°C zentrifugiert.
Der zellfreie Überstand wurde verworfen und das Zellpellet vorsichtig re-
suspendiert. Die PBMC-Fraktion wurde mit 20 ml PBS aufgefüllt und bis zum
nächsten Waschschritt auf Eis gelagert. Die kontaminierenden Erythrozyten in
der PMN-Fraktion wurden durch hypotone Lyse entfernt. Dazu wurden die PMN
mit 5 ml 0,3% Natriumchloridlösung für 2 min bei Raumtemperatur inkubiert.
Der physiologische osmotische Druck wurde anschließend durch Zugabe von
5 ml 1,5% NaCl-Lösung wieder hergestellt, und die PMN-Suspension wurde mit
PBS auf 20 ml aufgefüllt. Die auf Eis gelagerten PBMC und PMN wurden bei
200g für 10 min bei 4 °C zentrifugiert. Der zellfreie Überstand wurde wieder
verworfen und das Zellpellet resuspendiert. Im Anschluss wurden die Zellen
nach Färbung mit Türkscher-Lösung (Fluka BioChemika) gezählt und die Viabi-
lität durch den Trypan-Blau (Sigma-Aldrich) Ausschluss-Test gemessen. Die
Zellen wurden mit RPMI1640 Zellkulturmedium auf 1x106 Zellen/ml eingestellt.
Diese Zellseparierung führt zu ≥ 95% reinen und vitalen PMN bzw. PBMC.
20 ml
10 ml
10 ml
700 xg RT30 min
VenösesBlut
1:1 inNaCl
Histopaque1077
Histopaque1119
Abb. 6. Leukozytenisolierung aus EDTA-antikoaguliertem Blut (modifiziert nach Köller).
37
Material und Methoden
2.7 Isolierung humaner Thrombozyten
Die Isolierung der Thrombozyten erfolgte aus EDTA-antikoaguliertem
Blut von gesunden Freiwilligen über die Herstellung eines Thrombozyten-
reichen Plasmas (Platelet-rich Plasma, PRP). Das EDTA-antikoagulierte Blut
wurde zu gleichen Teilen mit PBS (versetzt mit 1,5% EDTA) verdünnt und bei
200g für 30 Minuten bei 24°C zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand
(PRP) abgenommen und nochmals bei 1285g für 20 Minuten bei 24°C zentrifu-
giert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet wurde mit 2 ml PBS/EDTA
vorsichtig resuspendiert und ein weiteres Mal bei 1285g für 20 Minuten bei
24°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und um das noch enthaltene
EDTA heraus zu waschen, wurde das Pellet mit 5 ml supplementiertem
RPMI1640 gewaschen. Anschließend wurde das Pellet vorsichtig mit supple-
mentiertem RPMI1640 resuspendiert und zu einer Zellkonzentration von 2 x 108
Zellen/ml supplementierten RPMI1640 verdünnt.
2.8 Zelladhärenz-Analysen 2.8.1 Inkubation von Osteoblasten mit Metallprobekörpern
Nach dem Ernten der Zellen (MG-63, SAOS-2) (s. Abs. 2.5.2) wurde die
Zellzahl auf 4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt. Je 1 ml der
Zellsuspension wurde zu einem Metallprobekörper (NiTi Calciumphosphat-be-
schichtet oder unbeschichtet und Titan unbeschichtet) in einer 24-Well-Zellkul-
turplatte gegeben. Als Kontrolle wurden Zellen ohne Metallprobekörper inkubiert
und zusätzlich wurde bei jedem Versuch als Kontrollmaterial Titan eingesetzt.
Die Zellen wurden mit dem Metallprobekörper für 3-4 Tage kultiviert. Die adhä-
renten Zellen auf den Probekörpern wurden fluoreszenz- und rasterelektronen-
mikroskopisch weiteruntersucht (s. Abs. 2.13.2 und 2.13.3).
2.8.2 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf Calciumphosphat-
beschichteten und unbeschichteten Probekörpern
Beschichtete und unbeschichtete NiTi-Probekörper wurden mit je 1 ml
heparinisiertem peripherem Blut von gesunden Freiwilligen in 24-Well-Zellkul-
38
Material und Methoden
turplatten auf einer Rotationsplattform (VSR23, Grant Instruments, Cambridge,
Großbritannien) unter Zellkulturbedingungen (37°C, wassergesättigter Atmos-
phäre, 5% CO2) kokultiviert. Nach 2 Stunden Inkubation wurden die adhärenten
Zellen auf den Probekörper für die fluoreszenzmikroskopische Analyse mit
Calcein-AM und Propidiumjodid (s. Abs. 2.8.4) gefärbt. Zusätzlich wurden Pro-
ben für die rasterelektronenmikroskopischen Analysen vorbereitet (s. Abs.
2.13.3).
2.8.3 Leukozytenadhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und
unbeschichteten Metallprobekörpern
Wie im Abs. 2.6 und 2.7. beschrieben wurden die isolierten PMN oder
PBMC auf 1x106 Zellen/ml und Thrombozyten auf 2 x 108 Zellen/ml supple-
mentiertes RPMI1640 eingestellt. Anschließend wurde 1ml der jeweiligen Zell-
suspension auf einen Metallprobekörper (NiTi beschichtet oder unbeschichtet)
in eine Kavität einer 24-Well-Zellkulturplatte gegeben. Als Kontrolle wurden
Zellen in Kavitäten ohne Metallprobekörper pipettiert. Die Zellen wurden mit den
Probekörpern für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen kokultiviert und im
Anschluß erfolgte die Analyse der Zelladhärenz mittels der Calcein-AM-Färbung
(s. Abs. 2.8.4) und der Fluoreszenzmikroskopie (s. Abs. 2.13.3).
2.8.4 Fluoreszenzmikroskopische Vital-Färbung mit Calcein-AM und Propidiumjodid
Das Prinzip der Calcein-AM-(Calcein-Acetoxymethylester)-Färbung ist, dass
spezifisch nur die vitalen Zellen durch Calcein-AM (Calbiochem, Schwalbach)
angefärbt werden, während sich avitale Zellen mit Propidiumjodid (50 µg/ml,
Molecular Probes Inc., Eugene, OR, USA) anfärben lassen. 1 mg Calcein-AM
wurde in 100 µl DMSO (Dimethyl-Sulfoxide, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gelöst
und anschließend 1,1 ml FCS hinzugegeben. Diese Lösung wurde in 40 µl portio-
niert und bei –80°C gelagert. Nach dem Auftauen wurden je 40 µl der Calcein-
AM Lösung mit 2 ml RPMI1640 versetzt. Das Calcein-AM liegt in einer nicht
fluoreszierenden Ester-gebunden Form vor. Nach der Aufnahme des Calcein-
AM über die Zellmembran wird es von cytoplasmatischen Esterasen hydro-
39
Material und Methoden
lysiert. In diesem Zustand fluoresziert Calcein bei einer Anregung von 494 nm
mit einem Emissionsmaximum von 517 nm, so dass die Fluoreszenz nur mit
lebenden Zellen einhergeht. Durch die Hydrolyse wird das Calcein-AM Zell-
membran-impermeabel, eine Elution des Farbstoffes ist somit ausgeschlossen.
Das Propidiumjodid hingegen kann nur die Zellmembran passieren, wenn diese
Defekte aufweist. Es interkaliert in die DNA und fluoresziert bei einer Anregung
von 493 nm mit einem Emissionsmaximum von 630 nm.
Zur Analyse der Zelladhärenz wurden die Zellen (Leukozyten, Thrombozyten,
Osteoblasten) mit den Probekörpern kokultiviert (s. Abs. 2.8). Die Probekörper
wurden vorsichtig in neue Kavitäten einer 24-Well-Zellkulturplatte überführt. An-
schließend wurde dreimal kurz mit RPMI1640 gewaschen, um unspezifische
Esterasen aus dem FCS zu entfernen. Das RPMI1640 wurde abgesaugt und
die Zellen wurden mit 14 µg/ml Calcein-AM in RPMI1640 für 30 min unter Zell-
kultur-Bedingungen (37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) gefärbt. Die
Calcein-AM Lösung wurde im Anschluss abgesaugt, und die Probekörper wurden
zweimal kurz mit RPMI1640 gewaschen. Danach wurde mit Propidiumjodid in
RPMI1640 gelöst für 15 min im Dunkeln bei Raumtemperatur gefärbt. Nach der
Propidiumjodid-Färbung wurden die Probekörper noch zweimal kurz mit
RPMI1640 gewaschen und anschließend in frisches RPMI1640 bis zur Analyse
gelagert. Im Anschluss wurden die adhärenten Zellen auf den Probekörpern mit
dem Fluoreszenzmikroskop BX61 von Olympus (Hamburg) analysiert (s. Abs.
2.9.2).
2.9 Mikroskopie 2.9.1 Durchlichtmikroskopie
Lichtmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Olympus CK2
(Olympus, Hamburg) gemacht. Die digitale Weiterbearbeitung erfolgte mit der
Software analySIS® 3.2 (Soft imaging System, Münster).
40
Material und Methoden
2.9.2 Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen wurden mit einem Olympus
BX61 und einer digitalen Kamera Color View II (Soft Imaging System, Münster)
erstellt. Digitale Bilder wurden mit der Software analySIS® 3.2 bearbeitet.
2.9.3 Rasterelektronenmikroskopie
Die rasterelektronenmikroskopischen Aufnahmen wurden an der Fakultät
für Maschinenbau (Institut für Werkstoffe) der Ruhr-Universität Bochum, mit
einem LEO Gemini 1530 der Firma LEO in Oberkochen erstellt. Für die Ras-
terelektronenmikroskopie wurden die Calciumphosphat-beschichteten und un-
beschichteten NiTi-Probekörper im Anschluss an die Kokultivierung z.B. mit
Leukozyten (s. Abs. 2.8.3) vorsichtig in eine neue Kavität einer 24-Well-Zellkul-
turplatte überführt. Danach wurden sie zweimal für je 5 Minuten bei
Raumtemperatur mit PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Fixierung der
Zellen mit 3,7% Glutaraldehyd (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) in PBS für 15 Mi-
nuten. Nach zweifachem Waschen mit PBS für jeweils 5 Minuten, wurden die
Zellen mittels einer aufsteigenden Ethanolreihe (40%, 60%, 80%, 96-98%, je 5
Minuten) entwässert. Das 96-98% Ethanol wurde im Anschluss abpipettiert und
die Zellen wurden für 24 Stunden bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Bei Ana-
lysen von biologischen Proben im Hochvakuum-Rasterelektronenmikroskop
stellt sich das Problem, dass Zellen elektrische Isolatoren sind und daher den
Probenstrom, den der Elektronenstrahl erzeugt, nicht ableiten können. Das Er-
gebnis sind elektrische Aufladungen auf der zu analysierenden Probe, die sich
als ein Wechsel dunkler und überblendenderer Bildartefakte auswirken. Des-
halb müssen nicht leitende Proben künstlich leitfähig gemacht werden. In einer
Kathodenzerstäubungsanlage (Edwards Sputter Coater S150B) wurden die
Probekörper und Zellen mit einer dünnen elektrischen Leitschicht aus Gold
überzogen.
41
Material und Methoden
2.10 Quantitative Bildanalytik
Für die Quantifizierung der Zelladhärenz auf den verschiedenen Probe-
körpern wurde das Programm analySIS® 3.2 (Soft Imaging System, Münster)
eingesetzt. Die Zellen wurden wie oben beschrieben mit den Probekörpern ko-
kultiviert und mit Calcein-AM und Propidiumjodid angefärbt. Anschließend er-
folgte als Grundlage für die quantitative digitale Bildanalytik der Zelladhärenz
die Fotografie der Probekörperoberflächen. Die Aufnahmen erfolgten an drei
definierten Punkten der Probekörperoberfläche. Die Punkte befanden sich auf
einer festgelegten Diagonale, die durch kontrollierte Mikrometerschrauben-Be-
tätigung angesteuert wurden. Dieses Schema wurde für alle Probekörper ver-
wendet. Die quantitative Bildanalytik ist eine Flächenauswertung von einzelnen
Grauwertbereichen. Dazu werden die Fluoreszenzbilder (Abb. 7 A) der Probe-
körperoberflächen in Schwarzweißbilder (Abb. 7 B) umgewandelt. Für die fluo-
reszierenden Zellen, deren Fläche summiert werden soll, wird ein Grauwertbe-
reich definiert (Abb. 7 C), in dem alle Flächen gemessen werden sollen. Dazu
wurde ein Schwellenwert bestimmt, oberhalb dessen alle Grauwerte gemessen
wurden. Dieser Schwellenwert wurde für alle Flächenmessungen beibehalten.
Anschließend erfolgte die Flächenmessung der adhärenten Zellen, dabei wurde
der prozentuale Flächenanteil der gefärbten Zellen am Gesamtbild berechnet.
2.11 Zell-Proliferationsanalyse durch Fluoreszenzmarkierung
Die Proliferationsanalyse über Fluoreszenzmarkierung wurde jeweils mit
den Zelllinien MG-63 und SAOS-2 durchgeführt. Die Osteoblasten wurden aus
den Zellkulturflaschen geerntet (s. Abs. 2.5.2) und die Zellzahl wurde auf
4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt. In eine 24-Well-Zell-
kulturplatte wurden im Siebenfach-Ansatz Calciumphosphat-beschichtete und
unbeschichtete NiTi- sowie Titanprobekörper gegeben. Anschließend wurde
vorsichtig je 1 ml der Osteoblastensuspension zu den Probekörpern gegeben.
An den folgenden sieben Tagen wurde jeweils pro Tag ein Probekörper (NiTi
beschichtet und unbeschichtet, Titan) entnommen und anschließend die adhä-
renten Osteoblasten mit Calcein-AM (s. Abs. 2.8.4) markiert. Die mit Osteo-
42
Material und Methoden
blasten bewachsenen Probekörperoberflächen wurden mit der digitalen
Bildanalytik quantifiziert.
digitale Aufnahme von Calein-AM markierten MG-63 auf NiTi
Umwandlung in ein Schwarzweißbild
Festsetzung des Grauwertbereiches für die Flächenmessung
Berechnung des prozentualen Flächenanteils (gelb) der adhärenten Zellen am Gesamtbild
C)
A)
B)
Abb. 7. Schema der quantitativen Bildanalytik mit analySIS® 3.2.
2.12 Zell-Proliferationsanalyse durch ein colorimetrisches Verfahren
Die Zellproliferation wurde mit einem colorimetrischen Assay (EZ4U, Bio-
medica, Gesellschaft mbH, Wien) gemessen. Die Methode beruht auf der Fä-
higkeit lebender Zellen, farblose Tetrazoliumsalze in intensiv gefärbte Forma-
zanderivate umwandeln zu können. Diese Reduktionsreaktion erfordert intakte
Mitochondrien, die bereits innerhalb weniger Minuten nach dem Absterben der
Zelle inaktiv werden.
43
Material und Methoden
Die Zellproliferation von MG-63 und SAOS-2 wurde jeweils im Dreifachansatz in
Zellkulturplatten (24-Well) nach 4 Tagen Kokultur mit Calciumphosphat-be-
schichtetem und unbeschichtetem NiTi und Titan analysiert. Als Kontrolle wurde
die Osteoblastenproliferation ohne Probekörper gemessen. Die Osteoblasten
wurden aus den Zellkulturflaschen geerntet (s. Abs. 2.5.2) und die Zellzahl
wurde auf 4000 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640 eingestellt und anschlie-
ßend je 1 ml der Osteoblastensuspension auf jeden Probekörper gegeben.
Nach vier Tagen Kokultur wurde der Zellüberstand abgenommen und um Zellen
und Partikel zu entfernen, bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtemperatur zentri-
fugiert und anschließend für weitere Analysen (z.B. Cytokinfreisetzung) bei
–80°C eingefroren. Zu den Ansätzen wurde 400 µl frisches RPMI1640 und 40 µl
der Farbstofflösung hinzugefügt und anschließend wurde für drei Stunden bei
37°C inkubiert. Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde das Zellkulturmedium
durch leichtes Klopfen an den Seiten der 24-Well-Zellkulturplatte gut gemischt.
Anschließend wurden je 100 µl des angefärbten Zellkulturmediums als 5-fach
Ansatz auf eine 96-Well Mikrotiterplatte überführt und die Absorption im Mikro-
platten-Reader (MRX Revelation, Dynex Technologies, Denkendorf) bei 450 nm
gemessen.
2.13 Cytotoxizitäts-Analyse
Ein möglicher cytotoxischer Einfluss der Calciumphosphat-beschichteten
und unbeschichteten NiTi-Probekörper auf Leukozyten wurde anhand eines
Cytotoxizitäts-Assay (CytoTox 96, Non-radioactive Cytotoxicity Assay, Promega
GmbH, Mannheim) bestimmt. Es handelt sich um einen colorimetrischen Test
zur Quantifizierung von Zelltod und Zelllyse basierend auf der Messung der
Lactat-Dehydrogenase-(LDH)-Aktivität. LDH ist ein cytoplasmatisches Enzym,
das von geschädigten Zellen in den Zellkulturüberstand freigesetzt wird. Ein
Anstieg der LDH-Aktivität im Zellkulturüberstand korreliert mit der Zunahme von
avitalen Zellen während der Inkubation. Das Prinzip des Assays beruht im
ersten Schritt auf der Umwandlung von Lactat zu Pyruvat, dabei wird NAD+ zu
NADH/H+ reduziert. Im zweiten Schritt wird durch die Diaphorase H/H+ von
NADH/H+ auf das Tetrazoliumsalz (gelb) transferiert und es entsteht Formazan
(rot). Formazan wird colorimetrisch bestimmt, die Anzahl avitaler Zellen ist dann
44
Material und Methoden
direkt proportional zur gebildeten Formazanmenge. Die Leukozyten wurden wie
im Abs. 2.8.3 beschrieben mit den Metallprobekörpern kokultiviert, anschlie-
ßend wurde der Zellüberstand für die Cytotoxizitäts-Analyse gewonnen. Die
maximale LDH Freisetzung aus den eingesetzten Zellen wurde durch die Zu-
gabe von 0,9 % Triton® X-100 (Promega GmbH, Mannheim) erreicht. Dieser
Wert wurde als 100% LDH-Freisetzung festgesetzt. Je 50 µl des Zell-
überstandes wurden im Dreifachansatz auf eine 96-Well Mikrotiterplatte über-
führt und mit 50 µl der Substrat-Lösung (Laktat) vermengt. Nach 30 Minuten
Inkubation bei Raumtemperatur wurde die Reaktion mit 50 µl/Kavität 1M Essig-
säure gestoppt. Die Lichtabsorption wurde bei 490 nm im 96-Well Mikro-
titerplatten Reader (MRX Revelation) gemessen.
2.14 Gewinnung konditionierter Medien von Leukozyten
Konditionierte Überstände (KM) wurden durch Kokultivierung von isolierten
PMN oder PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes RPMI1640) mit beschich-
teten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gewonnen. Die Zellen wurden
wie im Abs. 2.6 beschrieben isoliert und mit den Probekörpern für 24 Stunden
unter Zellkulturbedingungen (37°C, 5% CO2, wassergesättigte Atmosphäre) in
24-Well-Zellkulturplatten kokultiviert. Innerhalb einer Zellkulturperiode von 24
Stunden werden die meisten der jeweiligen zellspezifischen Cytokine von den
aktivierten Leukozyten gebildet. Nach der Kokultivierung wurden die konditio-
nierten Medien abgenommen. Um Zellen und Partikel zu entfernen wurden die
konditionierten Medien anschließend bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtempe-
ratur zentrifugiert (Biofuge-Pico, Eppendorf, Hamburg) und unmittelbar in den
Funktionsassay (Apoptose-Assay, Chemotaxis-Bioassay) eingesetzt. In den
Assays wurden jeweils 500 µl konditioniertes Medium mit 500 µl PMN (2x106
Zellen in supplementiertem RPMI1640) kokultiviert. Zusätzlich wurde in den
konditionierten Medien der Gehalt an pro- und anti-inflammatorischen Media-
toren mittels ELISA bestimmt (s. Abs. 2.16.1).
45
Material und Methoden
2.15 Durchflußcytometrie
Die Expression von Adhäsionsmolekülen, DNA-Fragmentierung und
Chemotaxis von Leukozyten wurden in der vorliegenden Arbeit anhand durch-
flußcytometrischer Analysen untersucht. Die Messungen erfolgten an einem
FACSCalibur™ Durchflußcytometer (BD-Biosciences, Heidelberg). Einerseits
ermöglicht die Durchflußcytometrie die Analyse und Charakterisierung einzelner
Zellen aufgrund ihrer lichtstreuenden Eigenschaften und andererseits durch
Fluoreszenzmarkierung. Im Durchflußcytometer sind die Zellen in Suspension
in einem dünnen Flüssigkeitsstrahl wie Perlen einer Perlenkette aneinanderge-
reiht („hydrodynamische Fokussierung“). Dadurch ist es möglich, dass einzelne
Zellen hintereinander einen Laserstrahl passieren. Physikalische Zelleigen-
schaften wie Größe und Granularität bestimmen dann die charakteristische
Streuung des Laserlichtes. Die Streuung entlang des Laserlichtstrahls in Vor-
wärtsrichtung (forward scatter, FSC) gibt Auskunft über die Größe der Zelle,
d.h. je größer die Zelle, desto größer ist die Streuung im FSC. Desweiteren er-
folgt eine von der Granularität abhängige Streuung im rechten Winkel zum ein-
fallenden Licht. Diese Seitwärtsstreuung (sideward scatter, SSC) ist umso hö-
her, je größer die Granularität einer Zelle ist.
In der Durchflußcytometrie kann die Expression von zellulären Oberflächenanti-
genen durch Immunfluoreszenz analysiert werden. Hierzu werden Zellen mit
Fluorochrom-markierten monoklonalen Antikörpern gegen bestimmte Oberflä-
chenantigene (cluster of differentiation, CD) eingesetzt. Die Fluorochrome wer-
den vom monochromatischen Laserlicht angeregt, d.h. ihre Elektronen werden
auf ein höheres Energieniveau gehoben. Beim verwendeten Durchflußcytome-
ter diente als Lichtquelle ein Argonlaser mit einer Emissionslinie von 488nm.
Beim Zurückfallen der Elektronen auf ihr ursprüngliches Energieniveau emittie-
ren sie Lichtenergie, die als Fluoreszenz sichtbar wird. Durch den Energiever-
lust während des Strahlungsüberganges besitzt das energieärmere emittierte
Licht stets eine größere Wellenlänge als das energiereichere absorbierte Licht.
Die Absorption des Lichts ist abhängig vom Laser, der Licht einer bestimmten
Wellenlänge emittiert und vom Fluorochrom, dessen Absorptionsspektrum im
selben Wellenlängenbereich liegen muss. Die Antikörper gekoppelten Fluoro-
chrome wie z.B. Fluoreszeinisothiozyanat (FITC) oder Phycoerythrin (PE)
46
Material und Methoden
werden bei der gleichen Wellenlänge (488 nm) vom Argon-Laser zur Emission
von Lichtimpulsen angeregt. Der Emissionsbereich von FITC (Grünfluoreszenz)
liegt zwischen 500 - 570 nm und der von PE (Rotfluoreszenz) reicht von 570 -
600 nm. Die gewonnenen Streulicht- und Fluoreszenzeigenschaften werden
von speziellen Detektoren erfasst und verstärkt (sog. „Photomultiplier“, PMT).
Die Vorteile der Durchflußcytometrie liegen in der Möglichkeit mehrere ver-
schiedene Parameter einer Zelle simultan zu erfassen. So lassen sich Zellen
mit genau definierten Eigenschaften von anderen Zellen abgrenzen und identifi-
zieren. Zusätzlich können innerhalb von sehr kurzen Analysezeiträumen (Mi-
nuten) mehrere Tausend Zellen erfasst werden.
Die Antikörper wurden in den Konzentrationen nach Herstellerangaben einge-
setzt. Es wurden nur direkt-markierte monoklonale Antikörper der Firma Becton-
Dickison GmbH (Heidelberg) verwendet. Als Isotypenkontrollen wurden direkt-
markierte monoklonale Antikörper des gleichen Isotypes eingesetzt, die gegen
ein nicht humanes Antigen gerichtet waren. Die Isotypenkontrollen und Antikör-
per wurden immer in den gleichen Konzentrationen verwendet. Trotz unter-
schiedlicher Emissionsmaxima und Einsatz von selektiven Emissionsfiltern
überschneiden sich die Emissionsspektren der Fluorochrome teilweise. Durch
eine elektronische Kompensation wurden die Überschneidungs-Bereiche von
FITC und PE bzw. PE und PerCP (Peridin Chlorophyll) in den jeweiligen Meß-
bereichen der Einzelfluoreszenzen vom Messsignal abgezogen. Die Kompen-
sation wurde durch eine automatische Kompensationsroutine (FACSCompTM
2.0, Becton-Dickinsion) durchgeführt. Die Fluoreszenz-Daten wurden mit der
Software CELLQuestTM 1.2.2 (BD-Biosciences) analysiert. Für jede Analyse
wurden i.a. 10000 Zellen gemessen und die angegebenen Fluoreszenzwerte
sind als mittlere Fluoreszenz-Intensitäten (MFI) dargestellt. Die Eigenschaften
der Zelle konnten anschließend graphisch dargestellt werden. Alle Lösungen für
die Durchflußcytometrie wurden von BD-Biosciences bezogen.
47
Material und Methoden
2.16 Funktionsassays
2.16.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array
Die Analyse der freigesetzten Cytokine von PBMC, die mit unbeschich-
teten und beschichteten NiTi-Probekörper kokultiviert wurden (konditionierte
Medien), wurde zusätzlich mit einem Cytokin-Array (Human Cytokine Array III)
der Firma RayBiotech Inc. (Norcross, USA) durchgeführt.
Der Vorteil dieses Arrays liegt in der schnellen Analyse des jeweiligen Cyto-
kinprofils eingesetzter Zellen. Durch eine parallele punktförmige Anordnung der
spezifischen Antikörper auf einer Nitrozellulosemembran konnten gleichzeitig
42 Cytokine gemessen werden (Abb. 8).
Bis zur Verwendung wurden die Membranen bei 4°C gelagert. Alle Inkubationen
wurden unter vorsichtigem Schütteln (Drehzahl 100/min; IKA KS 260 basic,
IKA-Werke, Staufen) und bei Raumtemperatur durchgeführt. Für die Cytokin-
analyse wurden die Membranen mit der Antiköper-beschichteten Seite nach
oben in speziell dafür vorgesehene 8-Well Multischalen gegeben. Anschließend
wurden die Membranen mit 2 ml des Blockierungs-Puffers benetzt und für 30
Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Nach der Inkubationszeit wurde der
Blockierungs-Puffer abgesaugt, 1 ml des konditionierten Überstandes wurde auf
die Membran gegeben und für 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die
konditionierten Überstände der PBMC wurden wie im Abs. 2.14 beschrieben
gewonnen. Anschließend folgten drei Waschschritte für je 5 Minuten mit je 2 ml
des Waschpuffers I bei Raumtemperatur, gefolgt von zwei Waschschritten für je
5 Minuten mit 2 ml des Waschpuffers II bei Raumtemperatur. Der Waschpuffer
wurde anschließend vorsichtig abgesaugt und die Membran mit dem bio-
tinylierten Antikörper für 2 Stunden unter vorsichtigem Schütteln inkubiert. Da-
nach folgte, wie oben beschrieben, das Waschen der Membran. Der Waschpuf-
fer wurde abgesaugt und die Membran wurde mit 2 ml des HRP konjugierten
Streptavidin für 60 Minuten inkubiert. Vor der Detektion wurde die Membran wie
oben beschrieben gewaschen. 1 ml des Detektionspuffers (Luminol und Was-
serstoffperoxid) wurde auf die Membran gegeben und für 5 Minuten inkubiert.
Anschließend konnte die Membran vorsichtig aus der Kavität entnommen wer-
den und für einige Sekunden von beiden Seiten mit einem fusselfreien Papier-
48
Material und Methoden
tuch angetrocknet. Die Membran wurde dann in eine durchsichtige Folie (han-
delsübliche Frischhaltefolie) gepackt, so dass keine Luftblasen zwischen der
Folie und der Membran entstanden. Die HRP katalysiert unter alkalischen Be-
dingungen die Oxidation von Luminol, dadurch erreicht Luminol einen ange-
regten Zustand und emittiert Licht. Diese unter enzymatischer Umsetzung des
Luminol auftretende verstärkte Chemolumineszenz (ECL, Enhanced Chemi-
luminescence) im Bereich der gebundenen Immunkomplexe wurde durch Ex-
position von ECL-Filmen (Hyperfilm ECL, Code RPN 2103K, Amersham
Biosciences, Freiburg) in einer Autoradiographiekassette bei Raumtemperatur
für 15 Minuten detektiert. Anschließend wurden die ECL-Filme mit einem Rönt-
genfilmentwickler (Curix 160, Agfa, Köln) entwickelt. Die Röntgenfilme wurden
anschließend eingescannt und digital bearbeitet.
Pos Pos Neg Neg ENA-78 GCSF GM-CSF GRO GRO-α I-309 IL-1α IL-1b
Pos Pos Neg Neg ENA-78 GCSF GM-CSF GRO GRO-α I-309 IL-1α IL-1b
IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IFN-γ
IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 IL-12 IL-13 IL-15 IFN-γ
MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCSF MDC MIG MIP-1δ RANTES SCF SDF-1 TARC TGF-ß1
MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCSF MDC MIG MIP-1δ RANTES SCF SDF-1 TARC TGF-ß1
TNF-α TNF-β EGF IGF-I Ang OSM Tpo VEGF PDGF-β Leptin Neg Pos
TNF-α TNF-β EGF IGF-I Ang OSM Tpo VEGF PDGF-β Leptin Neg Pos
Abb. 8. Schematische Anordnung der Kontrollen und der Antikörper gegen die verschiedenen
Mediatoren auf der Membran. (ENA-78: Epithelial Neutrophil-Activating Protein-78; GCSF:
Granulocyte Colony Stimulating Factor; GM-CSF: Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating
Factor; GRO: Growth Regulated Oncogene; GRO-α: Growth Regulated Oncogene-alpha; I-309:
T-Lymphocyte secreted protein; IL: Interleukin; IFN-γ: Interferon-gamma; MCP: Monocyte
Chemotactic Proteins; MCSF: Macrophage Colony Stimulating Factor; MDC: Macrophage De-
rived Chemokin; MIG: Monokine Induced by gamma Interferon; MIP-1δ: Makrophage Inflam-
matory Protein; RANTES: Regulated on Activation Normal T-Cell Expressed and Secreted ;
SCF: Stem Cell Factor; SDF-1: Stromacell Derived Factor; TARC: Thymus and Activation
Regulated Chemokin; TGF-β1: Transforming Growth Factor; TNF-α: Tumor Necrosis Factor;
EGF: Epidermal Growth Factor; IGF-I: Insulin Like Growth Factor; Ang: Angiopoietin, OSM:
Oncostatin M; Tpo: Thrombopoietin; VEGF: Vascular Endothelial Cell Growth Factor; PDGF-β:
Platelet Derived Growth Factor)
49
Material und Methoden
2.16.2 Quantifizierung freigesetzter Cytokine
Die Cytokinfreisetzung von Leukozyten wurde mittels „Sandwich“ ELISA
(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) gemessen. Die Zellkulturüberstände
wurden wie im Abs. 2.14 beschrieben gewonnen und bis zur Messung bei
–80°C gelagert. Beim ELISA-Verfahren wird aus einem Proteingemisch (z.B.
Zellkulturüberstand) ein Protein spezifisch detektiert und quantifiziert. Dazu
wurden Antikörper eingesetzt, die gegen verschiedene Epitope des gleichen
Proteins gerichtet waren. Beim sogenannten „Capture“ Antikörper oder auch
primären Antikörper handelt es sich im Allgemeinen um einen monoklonalen
Maus-Antikörper der an die Oberfläche der Kavitäten einer 96-Mikrotiterplatte
(MaxiSorp™, Nunc, Roskilde, Dänemark) gebunden wurde. Als zweiter oder
auch „Detektion“-Antikörper wurden polyklonale biotinylierte Ziegen-Antikörper
eingesetzt. Als Standard wurde das jeweilige rekombinante humane Cytokin
verwendet. Die Antikörper und die Standards wurden bei der Firma R & D Sys-
tems (Wiesbaden) bezogen (Tab. 8). Im gesamten Verfahren wurden stets Vo-
lumina von 100 µl eingesetzt. Ausnahmen bildeten der Blockierungs-Puffer
(PBS mit 1% Rinderserumalbumin-(BSA), Sigma-Adrich) und der Waschpuffer
(PBS Tween 0,05%, Sigma-Adrich); hier wurden 200µl eingesetzt. Die primären
Antikörper wurden mit PBS, die polyklonalen Antikörper mit Tris-Puffer (20 mM
Trizma® basisch; 150 mM NaCl; 0,1 % BSA, Sigma-Aldrich, Taufkirchen) und
die rekombinanten Cytokine (Standards) mit 0,1 % BSA in PBS verdünnt (Tab.
8). Der primäre Antikörper wurde auf die Mikrotiterplatte aufgetragen und bei
Raumtemperatur über Nacht inkubiert. Anschließend wurde dreimal mit Wasch-
puffer gewaschen (AM-60 Platten Wascher, Dynex Technologies, Denkendorf).
Der Blockierungs-Puffer wurde aufgetragen und für 30 Minuten bei Raumtem-
peratur unter ständigem Schütteln bei 200 U/min (Schüttler, IKA KS 260 basic,
IKA Werke, Staufen) inkubiert. Nach erneutem dreimaligem Waschen folgte das
Auftragen der Zellkulturüberstände, der Standards und die Inkubation für
2 Stunden unter permanentem Schütteln bei Raumtemperatur. Danach wurde
dreimal gewaschen und der zweite biotinylierte Antikörper pipettiert (2 Stunden,
Schüttler). Anschließend erfolgte nach dreifachem Waschen die Inkubation mit
Meerrettich-Peroxidase (Horse radish peroxidase, HRP) konjugiertem Strept-
avidin (25 µg/ml PBS) für 20 Minuten auf dem Schüttler. Es folgte dreimaliges
50
Material und Methoden
Waschen und die Entwicklung der Mikrotiterplatte mit 3,3´; 5,5´-Tetramethyl-
benzidin (TMB, Sigma-Aldrich). Die Reaktion wurde durch Zusatz von 1 M
Phosphorsäure (Sigma-Aldrich, Taufkirchen) gestoppt. Anschließend erfolgt die
photometrische Messung mit einem ELISA-Reader bei 450 nm. Sensitivität der
Immunoassays siehe Tab. 8.
Tab. 8. Konzentrationen der eingesetzten Antikörper.
Antikörper Konzentration ELISA-Sensitivität
Monoklonaler Anti-human IL-1ra Antikörper,
MAB 280 (Capture) 10 µg/ml 25 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IL-1ra Antikörper,
BAF 280 (Detection) 100 ng/ml
Monoklonaler Anti-human IL-2 Antikörper,
MAB 602 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IL-2 Antikörper,
BAF 202 (Detection) 12,5 ng/ml
Monoklonaler Anti-human IL-6 Antikörper,
MAB 206 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IL-6 Antikörper,
BAF 206 (Detection) 25 ng/ml
Monoklonaler Anti-human IL-8/CXCL8 Antikörper,
MAB 208 (Capture) 4µg/ml 10 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IL-8/CXCL8 Antikörper,
BAF 208 (Detection)
20 ng/ml
Monoklonaler Anti-human IL-10 Antikörper,
MAB 217 (Capture) 4 µg/ml 6,3 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IL-10 Antikörper,
BAF 217 (Detection) 500 ng/ml
Monoklonaler Anti-human TNF-α Antikörper,
MAB 610 (Capture) 4 µg/ml 10 pg/ml
Biotinylierter Anti-human TNF-α Antikörper,
BAF 210 (Detection) 200 ng/ml
Monoklonaler Anti-human IFN-γ Antikörper,
MAB 285 (Capture) 3 µg/ml 10 pg/ml
Biotinylierter Anti-human IFN-γ Antikörper,
BAF 285 (Detection) 150 ng/ml
51
Material und Methoden
2.16.3 Chemotaxis-Bioassay
Die Phagozytose von Mikroorganismen durch Granulozyten und Mono-
zyten ist einer der wichtigsten Mechanismen der unspezifischen Infektabwehr.
Der Phagozytoseprozess kann in mehrere Hauptphasen eingeteilt werden: ein
erster Schritt stellt die Chemotaxis dar. Dabei handelt es sich um die Migration
der Phagozyten entlang eines Konzentrationsgradienten chemotaktisch aktiver
Stoffe. Weitere Phasen sind die Adhäsion, Phagozytose und intrazelluläre
Bakterizidie.
Durch einen Bioassay (Migratest®, Orpegen Pharma, Heidelberg) erfolgte die
quantitative Bestimmung der Chemotaxis von neutrophilen Granulozyten mittels
Durchflußcytometrie. Der Test ermöglichte eine quantitative Bestimmung durch
eine Membran gewanderter neutrophiler Granulozyten, sowie die Änderung der
Expressionsdichte des Zelladhäsionsmoleküls LECAM-1 (L-Selektin, CD62L).
Die Leukozyten wurden durch Spontansedimentation über ein Leukozyten-
Trennmedium (Dextransedimentation) aus heparinisiertem Vollblut isoliert.
Dazu wurde das Blut (1 ml) vorsichtig über 1 ml Trennmedium gegeben und für
40 Minuten bei Raumtemperatur belassen. Die Leukozyten befanden sich nach
der Trennung in der oberen Phase des Gradienten. Diese wurde vorsichtig ab-
pipettiert und anschließend davon 100 µl pro Ansatz in die obere Kammer eines
Zwei-Kammer-Systems (24-Well-Zellkulturplatten mit Zellkultureinsätze, Orpe-
gen Pharma, Heidelberg) gegeben. Die obere Kammer war durch eine Nylon-
membran mit 3 µm Poren von der unteren Kammer getrennt. Konditioniertes
Medium (s. Abs. 2.14), in dem die chemotaktische Aktivität enthalten war,
wurde in die untere Kammer gegeben. Das Volumen (350 µl) des konditionier-
ten Mediums wurde so gewählt, dass der Zellkultureinsatz mit der Membran in
das konditionierte Medium eintauchte. Als Positiv-Kontrolle wurde Interleukin-8
(IL-8), ein chemotaktisch-aktives Cytokin eingesetzt. Als Negativ-Kontrolle
wurde Phosphatpuffer verwendet. Die Zellmigration erfolgte im Wasserbad bei
37°C für 30 Minuten. Nach dieser Inkubation wurden die gewanderten Zellen
aus der unteren Kammer in 5 ml Probenröhrchen (Polystyrol Rundbodenröhr-
chen, Falcon, Becton Dickinson, Heidelberg) überführt und auf Eis gelagert.
Anschließend erfolgte die Markierung mit dem anti-LECAM-1-FITC Antikörper.
Dazu wurden 20 µl des Antikörper-/Zählreagens (enthielt Antikörper und Zähl-
52
Material und Methoden
partikel) zu jeder Probe gegeben, gut gemischt und für 10 Minuten auf Eis im
Dunkeln inkubiert. Kurz vor der durchflußzytometrischen Messung wird ein spe-
zieller DNA-Farbstoff („Vital DNA STAINING SOLUTION“) zur Vitalfärbung der
Zellen zugegeben. Anschließend erfolgte die durchflußcytometrische Analyse.
In der Durchflußcytometrie wurden folgende Parameter analysiert: Erstens
wurde die Anzahl der neutrophilen Granulozyten gemessen, die durch die
Membran gewandert waren. Zweitens wurde die Expressionsintensität von
LECAM-1 auf den migrierten Zellen gemessen. Die Erniedrigung der Expres-
sion dieses Zelladhäsionsmoleküls korreliert direkt mit der Aktivierung von
neutrophilen Granulozyten nach Bindung von chemotaktisch-aktiven Substan-
zen. Als LECAM-1-Kontrolle wurden unstimulierte Leukozyten verwendet. Bei
der Auswertung der LECAM-1-Expression wurde anhand der LECAM-1-Kon-
trolle im FL1-Histogramm ein Marker so gesetzt, daß weniger als ca. 15% der
Zellen positiv waren. Anschließend wurde im Testansatz der Prozentsatz an
aktivierten Granulozyten mit verminderter LECAM-1 Expression bestimmt.
2.16.4 Expression von Adhäsionsmolekülen
Zur Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen wurden konditio-
nierte Medien (s. Abs. 2.14) eingesetzt. PMN und PBMC wurden wie im Abs.
2.6 beschrieben frisch isoliert, die Zellen wurden auf 2x106 Zellen/ml supple-
mentiertes RPMI1640 verdünnt. Zu 500 µl PMN- bzw. PBMC-Suspension
wurde 500 µl konditioniertes Medium in eine Kavität einer 24-Well-Zellkultur-
platte gegeben und anschließend für 2 Stunden (PMN) bzw. 24 Stunden
(PBMC) unter Zellkulturbedingungen inkubiert. Die Expression von Adhäsions-
molekülen (CD11b und CD62 auf PMN, ICAM-1 auf PBMC) wurde mittels
Durchflußcytometrie (FACScan™) bestimmt.
Im Anschluß an die Koinkubation von Leukozyten und konditionierten Medien
wurden die Zellen vorsichtig vom Boden der Kavitäten gelöst und anschließend
wurde die Zellsuspension bei 200g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 10 µl des fluoreszenzmar-
kierten Antikörpers (BD-Biosciences, Heidelberg) resuspendiert und für 30 Mi-
nuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Zur Fixierung der Zellen wurde
1,5% Formaldehyd, enthalten in der FACS™-Lyselösung (FACS™-Lysing So-
53
Material und Methoden
lution BD-Biosciences, Heidelberg), verwendet. Zu jedem Ansatz wurden 1 ml
dieser FACS™-Lyselösung gegeben. Im Anschluss erfolgte erneut eine Zentri-
fugation bei 200g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Der Überstand wurde
verworfen und das Pellet mit 2 ml PBS resuspendiert und erneut bei 200g für 5
Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und
das Pellet in 500 µl PBS resuspendiert und im direkten Anschluss wurde die
Zellsuspension im Durchflußcytometer (FACS™Calibur, BD-Biosciences,
Heidelberg) analysiert.
2.16.5 DNA-Fragmentierung (Apoptose)
Die gewonnenen konditionierten Medien (Abs. 2.14) wurden im DNA-
Fragmentierungs-Assay eingesetzt. Zu 500 µl PMN-Suspension (2 x 106 Zel-
len/ml supplementiertes RPMI1640) wurde 500 µl konditionierter Überstand
gegeben und für 24 Stunden kokultiviert. In diesem Zeitraum erfolgt bei nicht
aktivierten PMN die Apoptose.
Die Apoptose wurde zellmorphologisch mittels Durchlichtmikroskopie und Ras-
terelektronenmikroskopie betrachtet. Auf der molekularen Ebene wurde sie über
die DNA-Fragmentierung mittels Durchflußcytometrie analysiert.
Im DNA-Fragmentation Assay (Fluorescein-FragELTM, Oncogene Research
Products, Boston, MA, USA) katalysiert die terminale Desoxyadenylat-
transferase (TdT) die Bindung von Fluorescein-markierten Desoxynukleotiden
an freie 3´-OH Enden. Diese DNA-Einzelstrangbrüche entstehen während der
Apoptose. Anhand der Strangbrüche lassen sich apoptotische Zellen identifizie-
ren. Diese Methode wird auch als TUNEL-Test (Terminale Desoxyribosyl-
Transferase mediated dUTP Nick End Labeling) bezeichnet. Die Sensitivität
dieser Methode ist hoch: prinzipiell kann damit jede einzelne apoptotische Zelle
identifiziert werden.
Als Negativ-Kontrolle wurde eine frisch isolierte PMN-Fraktion verwendet. Als
Positiv-Kontrolle wurden PMNs mit 1 µg/ml DNAse I (Roche Diagnostics GmbH,
Mannheim) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert, um DNA-Strangbrüche zu
induzieren (Köller et al. 1997). Die Fluoreszenzintensität, die proportional zur
Apoptose ist, wurde in der Durchflußcytometrie (FACSCalibur™, BD-
54
Material und Methoden
Biosciences, Heidelberg) gemessen. Die Fluoreszenz-Daten wurden mit der
Software CELLQuestTM 1.2.2 (BD-Biosciences) analysiert.
2.17 Analyse der Nickelfreisetzung
Die Freisetzung von Nickel aus NiTi ist proportional zur Nickelkonzentra-
tion an der Oberfläche, die Nickelkonzentration wiederum ist stark abhängig von
der Oberflächenbehandlung (z.B. Polieren, Ätzen).
Die Nickelfreisetzung von Calciumphosphat-beschichtetem, unbeschichtetem
und angeätztem NiTi in PBS wurde in einem Zeitraum von einer bis zu acht
Wochen analysiert. Die Metallprobekörper wurden jeweils in eine Kavität einer
24-Well-Zellkulturplatte gegeben und anschließend wurden 2 ml Phosphatpuffer
pH 7,4 hinzugegeben. Die Zellkulturplatte wurde auf einer Rotationsplattform
(Grant Instruments) bei 200 U/min im Wärmeschrank (37°C, 5% CO2, wasser-
gesättigte Atmosphäre) vorsichtig geschüttelt. Im Abstand von 7 Tagen wurden
je Metallprobekörper 75 µl Phosphatpuffer entnommen und bis zur Analyse bei
–20°C gelagert. Zusätzlich wurde die Nickelfreisetzung in Blutplasma, gewon-
nen aus humanem Vollblut analysiert. 300 µl Blutplasma wurde jeweils mit dem
Calciumphosphat-beschichteten, unbeschichteten oder angeätzten NiTi für drei
Tage kokultiviert (s.o). Die Probenabnahme (75 µl) erfolgte nach 1, 2 und 3
Tagen. Die Nickelmessung wurde in der Abteilung für Hygiene, Sozial- und
Umweltmedizin (Prof. Wilhelm) der Ruhr-Universität Bochum mit der Graphit-
rohr-Atomabsorptions-Spektroskopie durchgeführt.
2.18 Einfluß von NiCl2 auf Zellaktivierung
Welchen möglichen Einfluss die Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern auf
die Cytokinfreisetzung von PBMC hat, wurde durch die Zugabe von NiCl2 (Ni-
ckel(II)-Chlorid, Sigma-Aldrich) in verschiedenen Konzentrationen analysiert.
Wie im Abs. 2.6 beschrieben wurden PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes
RPMI1640) isoliert. Je 1 ml der Zellsuspension wurde in eine Kavität einer 24-
Well-Zellkulturplatte gegeben und NiCl2 (gelöst in PBS) in folgenden Endkon-
zentrationen hinzugegeben: 24 mg/ml, 2,4 mg/ml, 240 µg/ml, 24 µg/ml und
2,4 µg/ml. Im Kontrollansatz wurden nur PBMC ohne NiCl2 eingesetzt.
55
Material und Methoden
Zusätzlich wurden diese Analysen mit stimulierten PBMC durchgeführt. Da-
durch wurden inflammatorische Bedingungen experimentell durch Stimulation
der Zellen simuliert. Zu den PBMC (1x106 Zellen/ml supplementiertes
RPMI1640) und den verschiedenen NiCl2-Konzentrationen wurden Lipopoly-
saccharid (1 µg/ml), Concanavalin A (ConA, 4 µg/ml) oder Toxic Shock Syn-
drome Toxin-1 (TSST-1; 0,01 µg/ml) hinzugegeben. Nach 24 Stunden wurden
die Zellüberstände abgenommen. Um Zellen und Partikel zu entfernen, wurden
die Zellüberstände anschließend bei 2000g für 2 Minuten bei Raumtemperatur
zentrifugiert und bis zur Analyse der Cytokinfreisetzung bei –80°C gelagert.
2.19 Statistik
Von allen Zellkulturexperimenten wurden mindestens drei unabhängige
Analysereihen durchgeführt. Als Ergebnis wurde der arithmetische Mittelwert
sowie die Standardabweichung der gesamten Stichprobe (auf der Grundlage
aller Ergebnisse aus allen Experimentreihen) bestimmt.
Die Stichproben wurden mit dem Kolmogorov-Smirnow-Test auf Normalver-
teilung getestet. Bei den Vergleichen zwischen zwei Stichproben wurde der
zweiseitige Student-T-Test angewendet. Der Unterschied wurde als signifikant
bewertet, wenn die berechnete Irrtumswahrscheinlichkeit p<0,05 war. Die Be-
rechnung der Mittelwerte, Standardabweichung und die T-Tests wurden mit
Microsoft Excel durchgeführt.
56
Ergebnisse
3 Ergebnisse
Die Analyse der biologischen Verträglichkeit von Implantatmaterialien
erfordert einen hohen Aufwand in zellbiologischen in vitro-Untersuchungen und
tierexperimentellen Studien. Der Einsatz von Screening-Methoden zu Beginn
der Biokompatibilitätsanalysen haben den Vorteil eines schnellen Überblicks
über eine große Probenanzahl. So können bereits in einem frühen Stadium der
Analysen nach vergleichbaren geringen Aufwendungen, ungeeignete Materi-
alien von weiterführenden kosten- und zeitaufwändigen Untersuchungen aus-
geschlossen werden.
3.1 Gradientenwerkstoff
Die Verwendung von Werkstoffen in der Zellkultur mit einer stufenweisen
Reduzierung der Nickelkonzentration von 0 at% (reines Titan) zu 90 at% Nickel
und 10 at% Titan erlaubt eine schnelle und parallele Analyse von zellbiolo-
gischen Reaktionen auf unterschiedliche Legierungen. Aus diesen Gründen
wurde in Zusammenarbeit mit dem Lehrstuhl Werkstoffsynthese und -herstel-
lungsverfahren des Forschungszentrums Jülich ein Gradientenwerkstoff konzi-
piert und pulvermetallurgisch hergestellt. Dieser Gradient wies folgende
Charakteristika auf: Graduierung von 100 at% Titan in 10 at% Schritten nach
90 at% Nickel und 10 at% Titan (Tab. 7), mit den Dimensionen 32x10x1.5 mm.
Dieser NiTi-Werkstoff wurde zur Analyse der Biokompatibilität der einzelnen
Komponenten mit verschiedenen Zelllinien (MG-63, SAOS-2, Swiss 3T3) kokul-
tiviert.
B) A)
Abb. 9. Gradientenwerkstoff in Kokultur mit A) MG-63 und B) SAOS-2. Zusammensetzungen
der einzelnen Segmente (A-J) siehe Tab. 7. (Zellfärbung: Türksche-Lösung).
57
Ergebnisse
Die Untersuchungen zeigten für alle eingesetzten Zelllinien hinsichtlich Zellpro-
liferation und -adhäsion eine gute Biokompatibilität des Gradientenwerkstoffes
von der reinen Titanseite (Abb. 9 und 10 C, Segment J), bis zu einem Titanan-
teil von 50 at% (Abb. 9 und 10 B, Segment E).
A)
B)
C)
Abb. 10. Lichtmikroskopische Aufnahmen vom Gradientenwerkstoff in Kokultur mit MG-63. Zell-
morphologien an den verschiedenen Segmenten. Schwarze Pfeile zeigen MG-63-Morpholo-
gien, heller Pfeil zeigt unbewachsenen Bereich am Werkstoff.
58
Ergebnisse
Dort konnten zelltypische Monolayer mit direktem Kontakt zur Werkstoffoberflä-
che ohne Anzeichen einer Zellschädigung beobachtet werden. Der zuneh-
mende Nickelanteil in den Segmenten D-A führte zu cytotoxischen Effekten.
Diese zeigten sich als Abrunden der Zellen einschließlich der Ablösung des
Zellmonolayers bis hin zu zellfreien Zonen am Ni-terminalen Ende des Probe-
körpers. Dieser cytotoxische Effekt konnte ab einem Nickelanteil von 60% fest-
gestellt werden (Abb. 10 B, Segment D). Die bereits klinisch eingesetzte NiTi-
Formgedächtnislegierung, bestehend aus 50 at% Nickel und 50 at% Titan, be-
findet sich in der Mitte des Gradientenwerkstoffes (Abb. 9, Segment E). Dort
konnte weder eine Abnahme der Zelladhäsion an die NiTi-Oberfläche noch eine
Hemmung der Zellproliferation analysiert werden (Abb. 10 B).
Bei dem in Abb. 9 B deutlich erkennbaren zellfreien Bereich unter den Seg-
menten E-J des Gradientenwerkstoffes handelt es sich um ein Artefakt. Dieses
entstand beim Entfernen des Gradientenwerkstoffes aus der Kavität vor dem
Anfärben der Zellen. Dabei wurden vom Gradientenwerkstoff die Zellen nach
unten geschoben. Dies ist auch deutlich an dem verdickten Zellrasen in diesem
Bereich zu erkennen.
3.2 Analyse der Osteoblastenproliferation durch quantitative digitale Bildanalytik
Die Untersuchung der Zellproliferation ermöglicht die Analyse eines
möglichen cytotoxischen Einflusses des Implantatmaterials und die Betrachtung
der Zell-Implantatinteraktion. Durch den Einsatz von Osteoblasten werden auch
Rückschlüsse auf die Biokompatibilität im Knochenbereich möglich.
Die Osteoblasten (MG63, SAOS-2) wurden 7 Tage auf den Probekörpern (NiTi
beschichtet und unbeschichtet, Titan) kultiviert. Anschließend wurden die Zellen
mit Calcein-AM markiert und die Proliferation mittels digitaler Flächenauswer-
tung quantifiziert. Wie die Abb. 11 und 12 zeigen, erfolgte auf den unbeschich-
teten NiTi-Probekörpern sowie auf Titan eine deutliche Proliferation ab dem
3. Tag Zellkultur von MG-63 und SAOS-2. Im Gegensatz dazu konnte keine
Proliferation der Zellen auf den Calciumphosphat-beschichteten NiTi-
Probekörpern beobachtet werden.
59
Ergebnisse
Abb. 11. Fluoreszenzanalyse der SAOS-2-Proliferation auf A) Calciumphosphat-beschichtetes
NiTi, B) unbeschichtetes NiTi, C) Titan.
Abb. 12. Fluoreszenzanalyse der MG-63-Proliferation auf A) Calciumphosphat-beschichtetes
NiTi, B) unbeschichtetes NiTi, C) Titan.
60
Ergebnisse
Die Abbildungen 13 und 14 fassen die Daten der Proliferationsexperimente zu-
sammen. Im Vergleich zu unbeschichteten Probekörpern konnte eine signifikant
verminderte (p≤ 0.05) SAOS-2-Proliferation auf der Calciumphosphatschicht ab
Tag 3 Zellkultur gemessen werden (Abb. 11 und 14 A).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2
Fläc
he (%
) bed
eckt
mit
SAO
S-2A)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2
Fläc
he (%
) bed
eckt
mit
SAO
S-2B)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
1 2
Fläc
he (%
) bed
eckt
mit
SAO
S-2C)
Abb. 13. Digitale Flächenauswertung der S
beschichtet, B) unbeschichtetes NiTi, C) Ti
NiTi unbeschichtet und Titan).
*
3T
3
3
AOS-2
tan (n=
*
4age
4Tage
4Tage
-Prolife
3), * p
*
5
5
5
ration
≤ 0,05
*
6
6
6
auf A)
NiTi b
*
7
7
7
NiTi-Calciumphosphat-
eschichtet im Vergleich zu
61
Ergebnisse
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
1 2
Fläc
he (%
) bew
achs
en m
it M
G-6
3A)
05
101520253035404550
1 2
Fläc
he (%
) bew
achs
en m
it M
G-6
3B)
05
101520253035404550
1 2
Fläc
he (%
) bew
achs
en m
it M
G-6
3C)
Abb. 14. Digitale Flächenauswertung der M
beschichtet, B) unbeschichtetes NiTi, C) T
NiTi unbeschichtet und Titan).
*
3
3
3
G-63-
itan (n
*
4Tage
4
Tage
4
Tage
Prolife
=3), * p
*
5
5
5
ration a
≤ 0,05
*
66
6
uf A) N
NiTi be
*
77
7
iTi-Calciumphosphat-
schichtet im Vergleich zu
62
Ergebnisse
Die Osteoblasten auf den unbeschichteten Probekörpern hatten bereits nach
7 Tagen von der Gesamtfläche bis zu 65 ± 3,6% (n=3) bewachsen, wohingegen
auf den beschichteten Probekörpern am 7 Tag nur 3,7 ± 1,1 % (n=3) der Ge-
samtfläche bewachsen war. Ein ähnliches Proliferationsverhalten konnte auch
mit der MG-63 Zelllinie gezeigt werden (Abb. 12 und 14 A). Im Gegensatz zu
den unbeschichteten Probekörpern zeigte sich ab dem dritten Tag der Zellkultur
eine verminderte Zellproliferation auf beschichtetem NiTi. Nach 7 Tagen Zell-
kultur auf den beschichteten Probekörpern wurde von den Zellen lediglich
1,3 ± 0,2 % (n=3) der Gesamtfläche bewachsen. Auf den unbeschichteten
Probekörpern hingegen zeigten die Osteoblasten nach 7 Tagen Zellkultur eine
bewachsene Fläche von 41,1 ± 0,4 % (n=3.).
3.3 Quantifizierung der Osteoblastenproliferation durch ein colorimetrisches Verfahren
Zusätzlich wurde die Zellproliferation mit einem colorimetrischen Verfah-
ren quantifiziert (s. Abs. 2.12). Osteoblasten (SAOS-2, MG-63) wurden wie be-
schrieben (s. Abs. 2.8.1) mit den Probekörpern (NiTi beschichtet, unbeschich-
tet; Ti6Al4V beschichtet, unbeschichtet; Titan beschichtet, unbeschichtet; Ni-
ckel) für 4 Tage in Kultur genommen. Als Kontrolle dienten Osteoblasten, die
ohne Probekörper nur mit Medium allein inkubiert wurden. Anschließend er-
folgte die Analyse der Zellproliferation. Die Ergebnisse der photometrischen
Osteoblasten-Proliferationsanalyse zeigten keinen Unterschied sowohl zwi-
schen den eingesetzten Metallen (NiTi, Ti6AL4V, Titan) als auch zwischen Cal-
ciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten Probekörpern. Eine signifi-
kant verminderte Proliferation konnte auf den Nickel-Probekörpern festgestellt
werden (Abb. 15).
63
Ergebnisse
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
Kontrolle NiTi+CaP NiTi Ti6AL4V +CaP
Ti6AL4V Titan +CaP Titan N
Abs
orpt
ion
(OD
450
nm
) in
%
A)
0
20
40
60
80
100
120
Kontrolle NiTi+CaP NiTi Ti6AL4V +CaP
Ti6AL4V Titan +CaP Titan N
Abs
orpt
ion
(OD
450
nm
) in
%
B)
Abb. 15. Zellproliferationstest von A) MG-63 und B) SAOS-2 nach 4 Tagen K
verschiedenen Probekörpern (n=4, * p ≤ 0,05 zur Kontrolle und Calciumphosp
tetem und unbeschichtetem NiTi, Ti6Al4V und Titan). Als Kontrollen dienten A
Probekörper.
3.4 Bestimmung der Cytotoxizität durch Quantifizierung dAktivität
Als Maß für cytotoxische Einflüsse der Metallprobekö
LDH-Freisetzung von PBMC und PMN in Kokultur mit Calciu
schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gemessen.
Nach 24 Stunden Kokultur der PBMC und PMN mit bes
unbeschichteten NiTi-Probekörpern konnte zwischen den Zellen
der Kontrollansätze ohne Metallprobekörper und den Z
Metallprobekörpern (beschichtet, unbeschichtet) kein signifikan
in der LDH-Freisetzung gemessen werden (Abb. 16; n=4). E
*
ickel
*
ickel
okultur auf den
hat-beschich-
nsätze ohne
er LDH-
rper wurde die
mphosphat-be-
chichteten und
(PBMC, PMN)
ellen auf den
ter Unterschied
benfalls konnte
64
Ergebnisse
kein Unterschied in der LDH-Freisetzung der Zellen (PMN und PBMC) auf den
beschichteten und unbeschichteten Probekörpern festgestellt werden (Abb. 16).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
PBMC Kontro
lle
PBMC NiTi u
nbes
chich
tet
PBMC NiTi b
esch
ichtet
PMN Kontro
lle
PMN NiTi u
nbes
chich
tet
PMN NiTi b
esch
ichtet
Lich
tabs
orpt
ion
(OD
490
nm
)
Abb. 16. LDH Freisetzung in Kontrollansätzen ohne NiTi-Probekörper und nach Kokultur von
PBMC oder PMN mit Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern
(n=4).
3.5 Apoptose
Die Apoptose ist ein physiologischer Prozess während der Zellentwick-
lung, der Regulation der Zelldifferenzierung und Zellzahl, der zum Zelltod führt.
Auch bei der Eliminierung der PMN aus Entzündungsherden spielt die Apop-
tose eine Schlüsselrolle. Die Regulation der PMN-Apoptose erfolgt u.a. durch
extrazelluläre Signale (z.B. Cytokine). Veränderungen im apoptotischen Ver-
halten von PMN in Kokultur mit Biomaterialien wie z.B. beschichtetem und un-
beschichtetem NiTi zeigen, welchen Einfluss diese Materialien auf die Funktio-
nalität der PMN haben. Dadurch können auch Rückschlüsse auf ein mögliches
Implantatversagen geschlossen werden. Das Apotoseverhalten von PMN wurde
nach der Adhärenz an Calciumphosphat-beschichteten und unbeschichteten
NiTi-Probekörpern analysiert. Zusätzlich wurde die Freisetzung von apoptose-
regulierenden Signalen nach der Zell-Implantat-Interaktion gemessen.
65
Ergebnisse
Die rasterelektronmikroskopischen Analysen zeigten, dass die Zellmorpholo-
gien von adhärenten PMN auf beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probe-
körpern sich deutlich unterschieden (Abb. 17). Während bei der Mehrzahl der
Zellen auf der unbeschichteten NiTi-Oberfläche die typische runde Morphologie
apoptotischer PMN festgestellt werden konnte (Abb. 17 A), bildeten die Mehr-
zahl der Zellen auf der Calciumphosphat-beschichteten Oberfläche Pseudopo-
dien, typisch für aktive, nicht apoptotische PMN (Abb. 17 B). Offensichtlich
führte die Aktivierung der PMN auf den beschichteten Probekörpern zu einer
Inhibition der Apoptose.
Abb. 17. Rasterelektronmikroskopische Aufnahmen von PMN kokultiviert mit A) unbeschich-
tetem NiTi und B) beschichtetem NiTi.
Eine mit diesen Zellmorphologien übereinstimmende Beobachtung konnte auch
lichtmikroskopisch an Zellen gemacht werden, die sich neben den jeweiligen
Probekörpern am Boden der Zellkulturplatte befanden (Abb. 18). Anhand dieser
66
Ergebnisse
Beobachtungen wurde folgende Hypothese aufgestellt: Bei der Vermittlung der
Apoptoseinhibition der Zellen auf beschichteten Probekörpern spielen lösliche
Mediatoren eine Rolle. Die Synthese und Freisetzung der Mediatoren wird
durch die Zell-Oberflächen-Interaktion induziert.
Abb. 18. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von PMN im direkten Kontakt mit A)
unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Schwarzer Pfeil Erythrozyt, weiße Pfeile
PMN, * unbeschichteter NiTi-Probekörper, ** Calciumphosphat-beschichteter NiTi-Probekörper.
Um diese Schlussfolgerung experimentell zu belegen, wurden sogenannte kon-
ditionierte Medien (KM) eingesetzt. Diese wurden durch die Kokultivierung von
PMN mit unbeschichteten (KM-PMN) und beschichteten (KM+PMN) Probekör-
pern gewonnen. Es wurden zusätzlich KM aus der Kokultur von PBMC mit den
entsprechenden NiTi-Probekörpern eingesetzt (KM-PBMC, KM+PBMC), da
67
Ergebnisse
auch Faktoren von PBMC zur Modulation der PMN auf Implantatoberflächen
beitragen können.
Die Anwesenheit von KM-PMN und KM-PBMC führten zur Apoptose von frisch
isolierten PMN. Dies ist deutlich an der typischen abgerundeten Morphologie
der Zellen zu erkennen (Abb. 19 A). Eine abgerundete Zellmorphologie konnte
auch bei Zellen beobachtet werden, die mit KM von Kontrollen d.h. Zellen, die
ohne NiTi-Probekörper nur mit Medium allein inkubiert wurden. Im Gegensatz
dazu induzierten beide KM+PMN und KM+PBMC eine Inhibition der Apoptose,
was deutlich an den abgeflachten ausgebreiteten Zellen zu erkennen ist (Abb.
19 B).
Abb. 19. Repräsentative lichtmikroskopische Aufnahmen von PMN ohne Probekörperkontakt,
kokultiviert mit konditioniertem Medium von A) PBMC und unbeschichtetem NiTi (weißer Pfeil:
Erythrozyt, schwarzer Pfeil: Granulozyt) und B) PBMC mit beschichtetem NiTi (schwarzer Pfeil:
Granulozyt).
68
Ergebnisse
Die Fragmentierung der DNA während der Apoptose ist ein charakteristisches
biochemisches Merkmal für apoptotische Prozesse und führt sowohl zu dop-
pelsträngigen DNA-Fragmenten mit geringem Molekulargewicht, als auch zu
Einzelstrangbrüchen (Nicks). Im TUNEL-Test (Terminale Desoxyribosyl-Trans-
ferase mediated dUTP Nick End Labeling) wurden freie 3´OH-Enden an DNA-
Strangbrüchen durch Bindung mit FITC-dUTP mit Hilfe der terminalen Desoxy-
adenylattransferase (TdT) markiert. Der TUNEL-Test zeigte mit den
morphologischen Beobachtungen übereinstimmende Ergebnisse.
Abb. 20 zeigt beispielhaft die DNA-Fragmentierung von PMN direkt nach der
Zellisolation und nach 24 Stunden Inkubation im Zellkulturmedium. Direkt nach
der Isolation der PMN konnten keine DNA-Strangbrüche gemessen werden. Im
Gegensatz dazu stieg die Anzahl der DNA-Strangbrüche der PMN nach 24
Stunden Zellkultur.
DNA-Strang Brüche
Zellz
ahl
Abb. 20. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. Direkt nach
Iso-lation (grün) und nach 24-stündiger Inkubation in RPMI1640 Zellmedium (rot).
Das Apoptoseverhalten nach 24 Stunden Kokultur von PMN mit beschichteten
und unbeschichteten NiTi-Probekörpern ist in Abb. 21 dargestellt. Die Kokultur
mit unbeschichteten NiTi-Probekörpern führte zur Apoptose der PMN. Im Ge-
gensatz dazu ergab die Kokultur von PMN mit Calciumphosphat-beschichteten
NiTi-Probekörpern keine Apoptose.
69
Ergebnisse
Zellz
ahl
DNA-Strang Brüche
Abb. 21. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. Nach 24-stün-
diger Kokultur mit beschichtetem NiTi (orange) und unbeschichtetem NiTi (blau).
PMN, die mit KM-PMN kokultiviert wurden, zeigten ausgeprägte DNA-Strang-
brüche (Abb. 22). In unabhängigen Versuchen (n=3) mit Zellen von verschie-
denen Spendern konnte bei 74,4 ± 3,2 % der eingesetzten PMN DNA-Strang-
brüche festgestellt werden. Im Vergleich dazu wurden weniger PMN (34,7 ±
13,1 %, p<0,05) mit DNA-Strangbrüchen gemessen, nachdem die Zellen in Ge-
genwart von KM+PMN kultiviert wurden (Abb. 22).
Zellz
ahl
DNA-Strang Brüche
Abb. 22. Repräsentative FACS-Analyse des Apoptoseverhaltens isolierter PMN. PMN nach 24
stündiger Kokultur mit KM-PMN (grün) und KM+PMN (rot).
70
Ergebnisse
3.6 Zelladhäsion
3.6.1 Zelladhäsions-Assays mit Vollblut auf beschichteten und unbeschichteten Probekörpern
Die Analyse der Adhäsion von Leukozyten an Biomaterialien erlaubt
Rückschlüsse über Interaktion der Zellen mit dem jeweiligen Material. Die Ad-
häsion von Zellen spielt bei zahlreichen physiologischen Prozessen (z.B. Diffe-
renzierung) eine wichtige Rolle. Die Interaktion von Leukozyten mit unbe-
schichteten und beschichteten NiTi-Probekörpern wurde zusätzlich auch in
Zelladhäsions-Assays unter Verwendung von Vollblut untersucht. Calcium-
phosphat-beschichtete und unbeschichtete NiTi-Probekörper wurden für 2 Stun-
den mit heparinisiertem Vollblut inkubiert. Nach vorsichtigem Waschen in
RPMI1640 wurden die adhärenten Zellen fluoreszenz- und rasterelektronenmi-
kroskopisch analysiert (s. Abs. 2.13.2 und 2.13.3).
Durch die sehr hohe Anzahl von Erythrozyten im Vollblut konnte auf den be-
schichteten und unbeschichteten Probekörpern mittels Rasterelektronenmikro-
skopie keine eindeutige Aussage zur Zelladhäsion der Leukozyten auf den ver-
schiedenen Probekörpern gemacht werden. Wie in Abb. 23 zu sehen ist, über-
decken die Erythrozyten die adhärenten Leukozyten.
Abb. 23. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von Vollblut nach 2 h Ko-
kultur mit A) unbeschichtetem und B) beschichtetem NiTi.
71
Ergebnisse
Aus diesem Grund wurden die Leukozyten zusätzlich mit Calcein-AM markiert.
Bei der Fluoreszenzfärbung wurden die Erythrozyten unter den angegebenen
Versuchsbedingungen nicht mit Calcein-AM oder Propidiumjodid markiert, so
dass hier ein Vergleich der Leukozytenadhärenz auf den verschiedenen Probe-
körpern möglich war. Wie in Abb. 24 zu erkennen ist, ergab sich kein signifi-
kanter Unterschied in der Vollblut-Leukozyten-Adhärenz zwischen den unter-
suchten Probekörpern. Allerdings ist ein deutlicher Unterschied in der Aggre-
gatbildung zu erkennen. In der Abb. 24 B des Calciumphosphat-beschichteten
NiTi-Probekörpers befinden sich deutlich mehr Aggregate als auf dem unbe-
schichteten NiTi-Probekörper (Abb. 24 A). Die Differenzierung zwischen vitalen
und avitalen Zellen durch die Kombination von Calcein-AM und Propidiumjodid
zeigte eine kleine nicht signifikante Zunahme der avitalen Zellen auf den Calci-
umphosphat-beschichteten Oberflächen (Abb. 25 A). Die Flächenauswertung
für die mit Propidiumjodid markierten Leukozyten auf den Probekörpern ergab
eine signifikante (p<0,05) Zunahme von 0,03 ± 0,01 % für unbeschichtete Pro-
bekörper (n=3), auf 0,47 ± 0,27 % für beschichtete Probekörper (n=3) (Abb. 25).
Abb. 24. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von Vollblut nach 2 h Kokultur
mit A) unbeschichtetem und B) beschichtetem NiTi. Vitale Zellen sind grün (Calcein-AM-Fär-
bung), avitale Zellen sind rot dargestellt (Propidiumjodid-Färbung).
72
Ergebnisse
0
5
10
15
20
25
30
35
40
NiTi beschichtet NiTi unbeschichtet
Fläc
he (%
) adh
ären
tes
Zelle
n
A)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
NiTi beschichtet NiTi unbeschichtet
Fläc
he (%
) adh
ären
tes
Zelle
n
B) *
Abb. 25. Quantitative Bildanalytik von Vollblut nach 2 h Kokultur mit beschichtetem und unbe-
schichtetem NiTi. A) vitale Zellen (Calcein-AM-Färbung), B) avitale Zellen (Propidiumjodid-Fär-
bung). * p< 0,05 zur Kontrolle unbeschichtetem NiTi).
3.6.2 Adhärenz von Granulozyten auf beschichteten und unbeschichteten Probekörpern
Blutzellen gehören zu den ersten Zellen, die mit einem Implantat in Kon-
takt kommen. Aufgrund der Zell-Implantat-Interaktion kommt es zu einer Frei-
setzung von vielen Mediatoren. Die Zellen können nach der Interaktion mit
Fremdmaterial mit einem breiten Spektrum an Antworten reagieren. Diese kön-
nen auch zu einer Entzündung führen und damit ein Implantatversagen verur-
sachen. Durch die Zell-Implantat-interaktion findet unter anderem eine ver-
73
Ergebnisse
stärkte Rekrutierung von Leukozyten aus den umgebenden Gefäßen statt. Gra-
nulozyten wandern entlang eines Konzentrationsgradienten einer chemischen
Substanz wie z.B. IL-8 (Diapedese) durch Endothelwände zum Ort der Verlet-
zung bzw. Infektion. Der Einsatz von isolierten Leukozyten, als Modell für die
Diapedese, ermöglicht die Bestimmung der Leukozytenreaktion in der Implan-
tatumgebung.
Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Vollblut-Assays, konnte eine signifikante
Zunahme (p<0.01) der Granulozyten-Adhärenz auf den Calciumphosphat-be-
schichteten NiTi-Probekörpern im Vergleich zu den unbeschichteten NiTi-Pro-
bekörpern gemessen werden (Abb. 26). In Übereinstimmung mit dem Vollblut-
Assay konnte ebenfalls eine Zunahme der avitalen Zellen auf den Calcium-
phosphat-beschichteten Probekörpern analysiert werden (Abb. 26). Darüber
hinaus konnte konform zu den Apoptose-Assays (s. Abs. 3.6) eine veränderte
Zellmorphologie der Granulozyten auf den beschichteten Probekörpern festge-
stellt werden. Die Granulozyten auf den unbeschichteten Probekörpern zeigten
die typische abgerundete Morphologie von apoptotischen Zellen (Abb. 26 A,
Kästchen oben rechts). Auf den beschichteten Probeköpern waren vorwiegend
ausgebreitete, abgeflachte, Pseudopodien-bildende PMN (Abb. 26 B, Kästchen
oben rechts) zu erkennen.
Abb. 26. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PMN kokultiviert mit A)
unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Kästchen oben rechts stellen Vergröße-
rungen einzelner Zellen dar. Calcein-AM- (grün) und Propidiumjodid- (rot) Färbung
Diese Ergebnisse wurden auch in den rasterelektronenmikroskopischen Ana-
lysen bestätigt (Abb. 27). Hier ist deutlich zu erkennen, dass auf unbeschich-
teten NiTi-Probekörpern die abgerundeten Zellen dominieren (Abb. 27 A,
74
Ergebnisse
schwarzer Pfeil), während auf den beschichteten NiTi-Probekörpern mehrheit-
lich die ausgebreiteten, abgeflachten Zellen zu beobachten sind (Abb. 27 B,
weißer Pfeil).
Abb. 27. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PMN kokultiviert mit A)
unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi. Pfeile stellen die unterschiedlichen Zellmor-
phologien dar; schwarz: apoptotische Zelle,; weiß: aktivierter Leukozyt.
3.6.3 Adhärenz von Lymphozyten/Monozyten auf beschichteten und
unbeschichteten Probekörpern
Neben der Granulozyten-Adhärenz findet eine Adhärenz von Lympho-
zyten/Monozyten statt. Im Gegensatz zu den Ergebnissen der Granulozyten-
Adhärenz, konnte kein eindeutiger Unterschied zwischen der Lympho-
zyten/Monozyten-Adhärenz auf den Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Pro-
bekörpern und unbeschichteten NiTi-Probekörpern festgestellt werden (Abb.
28). Neben Lymphozyten und Monozyten befinden sich auch Thrombozyten in
der Lymphozyten/Monozyten-Fraktion. Die Zunahme Thrombozyten-Adhärenz
auf den beschichteten Probekörpern dominierte die jeweilige Adhärenz der
Lymphozyten/Monozyten Die rasterelektronenmikroskopischen Analysen der
Lymphozyten/Monozyten-Fraktion zeigten eine deutlich unterschiedliche Zell-
morphologie auf den beschichteten im Vergleich zu den unbeschichteten NiTi-
Probekörpern (Abb. 29). Die Zellen auf den unbeschichteten Probekörpern wa-
ren abgerundet, im Gegensatz dazu konnte auf den beschichteten Probekör-
pern eine vorwiegend ausgebreitete und abgeflachte Zellmorphologie festge-
stellt werden.
75
Ergebnisse
Abb. 28. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von PBMC kokultiviert mit A)
unbeschichtetem NiTi, Pfeil: Thrombozytenring um Lymphozyten bzw Monozyten und B) be-
schichtetem NiTi, großer Pfeil: Lymphozyt, kleiner Pfeil: Thrombozyten. Calcein-AM- (grün) und
Propidiumjodid- (rot) Färbung
Abb. 29. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme von PBMC kokultiviert mit
A) unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi, vergrößerte PBMC im Kästchen oben
rechts.
3.6.4 Adhärenz von Thrombozyten auf beschichteten und unbeschich-teten Probekörpern
In Übereinstimmung mit den Beobachtungen bei der PBMC-Adhärenz
konnte im Vergleich zu unbeschichteten NiTi-Probekörpern eine deutliche Zu-
nahme der Thrombozyten-Adhärenz auf den beschichteten NiTi-Probekörpern
beobachtet werden (Abb. 30).
76
Ergebnisse
Abb. 30. Repräsentative fluoreszenzmikroskopische Aufnahme von Thrombozyten kokultiviert
mit A) unbeschichtetem NiTi und B) beschichtetem NiTi, kleine Pfeile: kontaminierender Leuko-
zyt, große Pfeile: Thrombozyten. Calcein-AM- (grün) und Propidiumjodid- (rot) Färbung
3.7 Funktionsassays
3.7.1 Expression von Adhäsionsmolekülen
Die Migration von Leukozyten aus den Blutgefäßen in das Gewebe ist
ein wichtiger physiologischer Vorgang. Er spielt eine entscheidende Rolle bei
der Bekämpfung von Krankheitserregern, sowie bei der Wundheilung und Ge-
websregeneration. Die Prozesse der Zellmigration sind komplex reguliert. Die
Zellmigration wird u.a. von löslichen Faktoren und Adhäsionsmolekülen, die auf
dem Endothel und auf der Zelloberfläche der Leukozyten exprimiert werden,
gesteuert. Schon unter normalen physiologischen Bedingungen verlässt ein
kleiner Teil der Leukozyten das Gefäßsystem und wandert ins Gewebe aus. Bei
inflammatorischen Signalen im Gewebe kann die Migration der Leukozyten um
ein Vielfaches verstärkt werden. Eine Aktivierung der Leukozyten führt dazu,
dass die Expression von Adhäsionsmolekülen moduliert i.a. erhöht wird. Auf-
grund der wichtigen Rolle, die Adhäsionsmoleküle bei der Leukozyten-Migration
einnehmen, sind die Adhäsionsmoleküle auch dazu geeignet, Rückschlüsse auf
den Aktivierungszustand der Zelle zu schließen. Dabei wurden als Modell für
die Migration konditionierte Medien, gewonnen aus der Kokultur von PMN mit
beschichteten (KM+PMN) und unbeschichteten Medien (KM-PMN), zur Modu-
lation der Adhäsionsmoleküle eingesetzt. Der Einsatz von konditionierten Me-
dien simuliert den in vivo-Prozess der Zellaktivierung und der nachfolgenden
Rekrutierung von Leukozyten zum Entzündungsherd.
77
Ergebnisse
L-Selektin (CD62L, LECAM-1) ist ein charakteristisches Adhäsionsmolekül auf
Leukozyten. Während der Migration wird das Leukozytenrolling (langsames
Vorbeirollen am Gefäßendothel) und der erste lockere Kontakt mit dem Ge-
fäßendothel durch Selektine vermittelt. L-Selektin wird von den meisten Leuko-
zyten konstitutionell exprimiert. Eine verminderte Expression des L-Selektins
korreliert direkt mit der Aktivierung der PMN, so dass auf eine mögliche Aktivie-
rung der PMN durch die Probekörper (beschichtet, unbeschichtet) geschlossen
werden kann. Aufgrund der sehr kostenintensiven Analyse der Expression von
Adhäsionsmolekülen konnten hier keine große Anzahl von Versuchs-
durchführungen erfolgen. Jedoch wurden die durchgeführten Analysen als rele-
vant für die Beurteilung der Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Formge-
dächtnislegierung betrachtet, so dass auch die Ergebnisse in diese Arbeit in-
tegriert wurden.
Die Kokultivierung von PMN mit KM+PMN (mittlere Fluoreszenzintensität,
Meanfluorescence: MFL 631 ± 408, n=2) führte im Vergleich zur Kontrolle (MFL
1470 ± 390, n=2), zu einer (bis zu 5-fach) verminderten L-Selektin-Expression
(Abb. 31). Zwischen dem KM der Kontrolle (MFL 1470 ± 390, n=2) und KM-
PMN (MFL 1364 ± 50, n=2) konnte kein Unterschied in der L-Selektin-Expres-
sion festgestellt werden.
Zellz
ahl
101
102 103
104101
0Fluoreszenzintensität
020
4080
100
6012
0Ze
llzah
l
Abb. 31. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der L-Selektin-Expression von PMN
nach Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 342), KM-PMN (grüner Graph; MFL: 1399) und
KM vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 1746).
78
Ergebnisse
Das Zelladhäsionsmolekül CD11b (Mac-1) gehört zur Integrin-Familie und wird
insbesondere auf Monozyten und neutrophilen Granulozyten exprimiert. CD11b
bestimmt im wesentlichen die Zelladhäsion und ist bei der Rekrutierung von
Leukozyten aus den Blutgefäßen zum Ort der Verletzung bzw. Infektion rele-
vant. Da die Expression von CD11b durch Aktivierung der Leukozyten gestei-
gert werden kann, wird es auch als Granulozyten-Aktivitätsmarker verwendet
(Mickelson et. al 1996).
Die Analysen von PMN, die für 2 Stunden mit KM+PMN kokultiviert wurden,
zeigten im Vergleich zur Kontrolle eine um das 4-fache erhöhte Expression von
CD11b (Abb. 32). Wurden PMN mit KM von Kontrollansätzen inkubiert, konnte
nur eine CD11b-Spontanfreisetzung beobachtet werden.
101102 10
31041010
Fluoreszenzintensität
020
4080
100
6012
0Ze
llzah
l
Abb. 32. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der CD11b-Expression von PMN nach
Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 1755), KM-PMN (grüner Graph; MFL: 703) und KM
vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 432).
Das Zelladhäsionsmolekül ICAM-1 (intercellular adhesion molecule-1; CD54)
gehört zur Familie der Immunglobulin-Superfamilie.
Die Expression des ICAM-1 wird u.a. bei aktivierten PBMC hochreguliert, so
dass bei einer erhöhten Expression auf einen aktivierenden Einfluss des kondi-
tionierten Mediums geschlossen werden kann. Im Vergleich zur Kontrolle
(PBMC, die mit KM von Kontrollansätzen inkubiert wurden), konnte eine 4-fach
erhöhte Expression bei PBMC, die mit KM+PMN inkubiert wurden gemessen
79
Ergebnisse
werden (Abb. 33). Die durchschnittliche Fluoreszenzintensität (MFL) erhöhte
sich z.B. von 360 bei PMN, die mit KM-PMN inkubiert wurden, auf 1425 bei
PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 33). Zwischen dem KM der
Kontrolle (MFL 337) und KM-PMN (MFL 360) konnte kein Unterschied in der
ICAM-1-Expression festgestellt werden.
101
102 10
310
4101
0
05
1020
2515
30
Fluoreszenzintensität
Zellz
ahl
Abb. 33. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der ICAM-1-Expression von PBMC in
Kokultur mit KM+PMN (roter Graph; MFL: 1425), mit KM-PMN (grüner Graph; MFL: 360) und
KM vom Kontrollansatz (schwarzer Graph; MFL: 337).
3.7.2 Chemotaxis-Bioassay
Die Chemotaxis ist die Wanderung von Zellen entlang eines Konzentra-
tionsgradienten von chemotaktisch-aktiven Stoffen. Sie ist der initiale Schritt
beim Phagozytoseprozess, der in mehrere Hauptphasen eingeteilt werden
kann: Chemotaxis, Adhärenz von opsonisierten Fremdpartikeln (z.B. Mikro-
organismen) an die Phagozytenoberfläche, Phagozytose und intrazelluläre Eli-
minierung durch sauerstoffabhängige und sauerstoffunabhängige Mechanis-
men. Die Phagozytose wird von den PMN und Monozyten durchgeführt und ist
einer der wichtigsten Abwehrmechanismen des Körpers gegen eine Vielzahl
von bakteriellen Infektionen. Die Analyse des chemotaktischen Potentials kon-
ditionierter Medien unterschiedlicher Herkunft (beschichtet, unbeschichtet), er-
möglicht eine Beurteilung der Gewebsmodulation durch die eingesetzten Pro-
80
Ergebnisse
bekörper auch hinsichtlich des PMN-Aktivierungspotentials. Die durchflußcyto-
metrischen Analysen zeigten eine signifikant (p<0,05) erhöhte Chemotaxis der
PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 34). KM+PMN induzierte z.B. die
Migration von 1658 PMN durch die Membran. Auf der anderen Seite konnte das
KM-PMN lediglich die Migration von 632 PMN induzieren. Zusätzlich zur gestei-
gerten Migration konnte eine veränderte Zellgröße gemessen werden. PMN, die
mit KM+PMN inkubiert wurden, zeigten eine erhöhte Streuung im Vorwärts-
Streulicht (FSC). Der FSC ist das Maß für die Zellgröße, d.h. die PMN, die mit
KM+PMN inkubiert wurden, sind vergleichsweise zu den PMN, die mit KM-PMN
inkubiert wurden, größer. Dies lässt sich auf den Aktivitätszustand der PMN
zurückführen. Aufgrund der erhöhten Durchwanderungsrate der PMN, die mit
KM+PMN inkubiert wurden, kann davon ausgegangen werden, dass die Zellen
durch das KM+PMN chemotaktisch aktiviert wurden. Aufgrund des erhöhten
Aktivitätszustandes hat sich die Zellmorphologie verändert d.h. die Zellen sind
vergrößert.
200 400 600 800 1000
200
400
600
800
1000
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Vorw
ärts
stre
ulic
ht (F
CS
)
200 400 600 800 1000
Seitwärtsstreulicht (SSC)
200
400
600
800
1000
Vorw
ärts
stre
ulic
ht (F
CS)
B) A)
Abb. 34. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der PMN-Migration gegen konditio-
nierte Medien. A) KM+PMN (1658 migrierte PMN), B) KM-PMN (662 migrierte PMN). Grüne
Punkte stellen einzelne gewanderte PMN und rote Punkte die Zählpartikel (s. Abs. 2.16.2) dar.
Parallel zur Analyse des chemotaktischen Potentials (Anzahl migrierter Zellen)
der konditionierten Medien (KM-PMN und KM+PMN), wurde die Expression des
Zelladhäsionsmoleküls L-Selektin bei den migrierten PMN gemessen. Die Ver-
minderung der L-Selektin (CD62L)-Expression korreliert mit der Aktivierung der
PMN. Die Analyse der L-Selektin (CD62L)-Expression zeigte eine verminderte
Expression bei den PMN, die mit KM+PMN inkubiert wurden. Die durchschnitt-
81
Ergebnisse
liche Fluoreszenzintensität (Meanfluorescence, MFI) verringerte sich z.B. von
244 bei PMN, die mit KM-PMN inkubiert wurden, auf 171 bei PMN, die mit
KM+PMN inkubiert wurden (Abb. 35). Da L-Selektin konstitutiv auf PMN expri-
miert wird, korreliert eine Verminderung der L-Selektin-Expression mit der Akti-
vierung der PMN.
05
1015
20C
ount
s
0 101 102 103 104FL1-HeightFluoreszenzintensität
Zellz
ahl
0
510
1520
Cou
nts
0 101 102 103 104FL1-HeightFluoreszenzintensität
Zellz
ahl
A) B)
Abb. 35. Repräsentative durchflußcytometrische Analyse der L-Selektin-Expression von PMN
nach Kokultur mit A) KM+PMN (MFI: 171) und B) KM-PMN (MFI: 244).
3.8 Analyse der Cytokinfreisetzung
3.8.1 Cytokinnachweis mittels Protein-Array
Neben der Zelladhäsion und der Expression von Adhäsionsmolekülen ist
die Freisetzung von löslichen Mediatoren ein weiterer wichtiger Parameter für
die Zellaktivierung. Es gibt eine Vielzahl an löslichen Mediatoren, die für eine
Zellaktivierung verantwortlich sein können. Deswegen wurde zuerst die Analyse
des Cytokinprofils durchgeführt. Der Einsatz eines Protein-Arrays erlaubt dabei
eine schnelle Analyse des Cytokinprofils in den Zellkulturüberständen aus der
Kokultur von Leukozyten mit Probekörpern. Im Zellüberstand der PBMC, die mit
unbeschichteten NiTi-Probekörpern kokultiviert wurden, dominierte ein
deutliches Signal für IL-8 (Abb. 36 A). Ein weniger intensives Signal konnte für
MCP-1 (Monocyte chemoattractant protein-1) detektiert werden. Im Gegensatz
zu den Zellüberständen der unbeschichteten Proben wurde ein zusätzliches
Signal bei IL-6 in Zellüberständen der beschichteten Proben gemessen (Abb.
82
Ergebnisse
36 B). Dies deutet auf eine aktivierende Wirkung der Calciumphosphat-
beschichteten NiTi-Probekörper auf die PBMC-Fraktion hin.
Abb. 36. Entwickelter Röntgenfilm nach der Inkubation der Array-Membran mit konditionierten
Überständen. A) KM-PBMC, B) KM+PBMC.
3.8.2 Cytokinquantifizierung von Leukozyten durch ELISA
Die Ergebnisse des Cytokinnachweises mittels Protein-Array haben ein
unterschiedliches Cytokinprofil in den Zellkulturüberständen von Calciumphos-
phat-beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern gezeigt. Aus die-
sem Grund wurden die Cytokine zusätzlich über ELISA analysiert und quantifi-
ziert.
Bei der Analyse der Cytokine in konditionierten Medien bzw. Zellüberständen
von PBMC ohne Probekörperkontakt (Kontrollen) konnten keine erhöhte Frei-
setzung von IL-1ra (92,2 ± 72,8 pg/ml), IL-6 (67,2 ± 3,0 pg/ml), IL-8 (12,3 ± 1,1
pg/ml), TNF-α (4,4 ± 1,3 pg/ml), GM-CSF (0,7 ± 0,9 pg/ml) oder IFN-γ (11,6 ±
4,6 pg/ml) nachgewiesen werden (Abb. 37 A). PBMC, die mit unbeschichteten
Probekörpern für 24 Stunden kokultiviert wurden, zeigten im Vergleich zur Kon-
trolle eine signifikant (p < 0,05) gesteigerte IL-1ra (652,6 ± 518,6 pg/ml), IL-6
(2441,9 ± 73,7 pg/ml) und IL-8 (317,2 ± 197,1 pg/ml) Freisetzung. Die Analyse
der Zellüberstände von beschichteten Probekörpern ergab dann einen weiteren
signifikanten (p < 0,05) Anstieg in der Freisetzung von IL-1ra (1584,3 ± 961,5
pg/ml), IL-6 (7892,6 ± 140,3 pg/ml), IL-8 (867,0 ± 82,1pg/ml), TNF-α (638,8 ±
26,0 pg/ml), GM-CSF (713,3 ± 260,2 pg/ml) und IFN-γ (10,8 ± 2,0 pg/ml) im
Vergleich zu unbeschichteten Proben (Abb. 37 A).
83
Ergebnisse
Die Cytokinfreisetzung der PMN in den Kontrollansätzen zeigten keine signifi-
kant erhöhten Werte für IL-6 (12,9 ± 7,7 pg/ml), IL-8 (149,1 ± 69,4 pg/ml), TNF-
α (1,7 ± 0,6 pg/ml) und GM-CSF (0,7 ± 0,8 pg/ml). Allerdings konnte eine
erhöhte Freisetzung von IL-8 (260,9 ± 127,5 pg/ml) der PMN auf
unbeschichteten Probekörpern gemessen werden. Die Konzentrationen von IL-
6 (15,2 ± 7,8 pg/ml), TNF-α (1,6 ± 0,4 pg/ml) und GM-CSF (0,1 ± 0,1 pg/ml)
blieben im Bereich der Kontrollen. In den Zellkulturüberständen der
beschichteten Probekörper wurden im Vergleich zur Kontrolle signifikant
(p < 0,05) erhöhte Cytokinkonzentrationen festgestellt. Folgende Konzen-
trationen wurden gemessen: IL-6 (262,2 ± 151,5 pg/ml), IL-8 (2736,9 ± 556,1
pg/ml), TNF-α (89,0 ± 9,9 pg/ml) und GM-CSF (50,6 ± 6,7 pg/ml) (Abb. 37 B).
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
Kontrolle NiTi unbeschichtet NiTi Calciumphosphat-beschichtet
pg/m
l
IL-1raIL-2IL-6IL-8IL-10TNF-α GM-CSFIFN-γ
* A)
* *
* * * * *
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Kontrolle NiTi unbeschichtet NiTi Calciumphosphat-beschichtet
pg/m
l
IL-8IL-6TNF-α GM-CSF
*
B)
* * *
Abb. 37. Cytokinfreisetzung durch Leukozyten nach der Kokultur mit Calciumphosphat-
beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern und Kontrollen (=spontane Cytokin-
freisetzung) . A) PBMC (n=16), B) PMN (n=16). * p < 0,05 zur Kontrolle.
84
Ergebnisse
3.9 Analyse der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern
Eine mögliche Freisetzung von Nickel aus NiTi könnte einen negativen
Effekt auf die Funktionalität der das Implantatlager umgebenden Zellen haben.
Die Nickelfreisetzung ist abhängig von der Oberflächenbehandlung des NiTi-
Materials sowie vom umgebenden Medium. Die freigesetzte Nickelmenge aus
Calciumphosphat-beschichteten, unbeschichteten und geätzten NiTi-Probekör-
pern wurde in Pufferlösung pH 7,4 in einem Zeitraum von 1 bis 56 Tage ana-
lysiert. Da für eine bessere Anheftung und Kristallisation der Calciumphosphat-
schicht die NiTi-Oberflächen angeätzt wurden (s. Abs. 2.4) und dies Auswir-
kungen auf eine mögliche Nickelfreisetzung haben kann (Shabalovskaya 2002),
wurde zusätzlich die Nickelfreisetzung aus angeätzten, unbeschichteten NiTi-
Probekörpern analysiert. Zusätzlich wurde die Nickelfreisetzung im Blutplasma
innerhalb von 3 Tagen gemessen.
Die Fragestellung dieser Arbeit lag nicht im Bereich der Nickelallergieinduzie-
rung durch nickelhaltige Implantate. Aus diesen Gründen wurden die Analysen
der Nickelfreisetzung nur beispielhaft durchgeführt. Dennoch tragen die Ergeb-
nisse zur Feststellung der Biokompatibilität von NiTi-Formgedächtnislegie-
rungen bei und können als Pilotexperiment für weitere Arbeiten hinsichtlich der
Nickelallergie durch NiTi-Implantate dienen.
Wie anhand der Abb. 38 und 39 deutlich wird, konnte eine erhöhte Nickelfrei-
setzung der Probekörper (beschichtet, unbeschichtet, geätzt) im Plasma im
Vergleich zur Phosphat-Pufferlösung gemessen werden. Im Plasma wurde z.B.
am dritten Tag aus geätztem NiTi 14,1 µg/ml Nickel freigesetzt, im Gegensatz
dazu wurde im Puffer am dritten Tag 4,7 µg/ml Nickel freigesetzt.
Desweiteren zeigt die Abb. 38 einen deutlichen Unterschied in der Nickelfrei-
setzung der eingesetzten Metallprobekörper im Plasma. Im Vergleich zum be-
schichteten (1. Tag: 8,4 µg/ml, 2. Tag 7,8 µg/ml, 3. Tag 7,3 µg/ml) und geätzten
(1. Tag: 16 µg/ml, 2. Tag 14 µg/ml, 3. Tag 14,1 µg/ml) NiTi, konnte beim unbe-
schichten NiTi (1. Tag: 0,2 µg/ml, 2. Tag 0,2 µg/ml, 3. Tag 0,1 µg/ml) nur eine
geringe Nickelfreisetzung gemessen werden.
Auch die Nickelfreisetzung im Puffer zeigte, dass aus geätztem und beschich-
tetem NiTi mehr Nickel freigesetzt wird, als aus unbeschichtetem NiTi (Abb. 39).
Die freigesetzte Nickelmenge aus geätztem NiTi lag zwischen 4,7 µg/ml (3.
85
Ergebnisse
Tag) und 8,1 µg/ml (6. Woche) und aus beschichtetem NiTi zwischen 1,2 µg/ml
(3. Tag) und 2,9 µg/ml (8. Woche). Im Vergleich dazu konnte bei unbe-
schichtetem NiTi eine Nickelfreisetzung zwischen 0,04 µg/ml (1. Woche) und
0,06 µg/ml (7. Woche) gemessen werden.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
1 2 3
Tage
Nic
kel m
g/L
Abb. 38. Nickelfreisetzung aus Metallprobekörpern im Plasma. Blaue Balken geätztes NiTi, rote
Balken Calciumphosphat-beschichtetes NiTi, grüne Balken unbeschichtetes NiTi.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
3 .Tag 1 .Woche
2 .Woche
3 .Woche
4 .Woche
5 .Woche
6 .Woche
7 .Woche
8 .Woche
Nic
kel m
g/L
Abb. 39. Nickelfreisetzung aus Metallprobekörpern im Phosphatpuffer pH 7,4. Blaue Balken
geätztes NiTi, rote Balken Calciumphosphat-beschichtetes NiTi, grüne Balken unbeschichtetes
NiTi.
86
Ergebnisse
3.10 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid
Die Nickel-Freisetzungsanalysen haben gezeigt, dass im Vergleich zum
unbeschichteten NiTi aus Calciumphosphat-beschichtetem und geätztem NiTi
mehr Nickelionen freigesetzt werden, das könnte einen möglichen Einfluss auf
die Cytokinsynthese haben.
Welchen Einfluss die Nickelfreisetzung aus den Calciumphosphat-be-
schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern auf die Cytokinfreisetzung
von PBMC hat, wurde durch die Zugabe von Nickel(II)-Chlorid (NiCl2) in ver-
schiedenen Konzentrationen analysiert. Die entsprechenden NiCl2-Konzentra-
tionen wurden anhand der Ergebnisse der NickelfreisetzungsAnalysen (s. Abs.
3.10) gewählt. 1x106 PBMC/ml wurden mit 0 mg/L, 24 mg/L, 2,4 mg/L, 240
µg/L, 24 µg/L und 2,4 µg/L NiCl2 für 24 Stunden unter Zellkulturbedingungen
kokultiviert. Anschließend wurde die Cytokinfreisetzung im Zellkulturüberstand
mittels ELISA analysiert und quantifiziert. Im Vergleich zur Kontrolle (100%)
zeigte sich ein signifikanter Unterschied in der Freisetzung von IL-1ra (359,1 ±
186,8 %) und IL-6 (246,2 ± 99,3 %) bei 24 mg/ml NiCl2. Bei der Analyse der IL-
8-Freisetzung (102,8 ± 25,6 %) konnte kein Unterschied zwischen den ver-
schiedenen NiCl2-Konzentrationen gemessen werden (Abb. 40).
0
100
200
300
400
500
600
0 mg/L 24 mg/L 2,4 mg/L 240 µg/L 24 µg/L 2,4 µg/L
Nickel-Chlorid
% F
reis
etzu
ng
IL-1raIL-6IL-8
Abb. 40. PBMC Cytokinfreisetzung nach 24 Stunden in Anwesenheit von NiCl2 (n=3). * p < 0,05.
Die Cytokinkonzentration (IL-1ra, IL-6, IL-8) in der Kontrolle wurde als 100% angesetzt.
*
*
87
Ergebnisse
3.11 Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel(II)-Chlorid nach Zellstimulation
Da eine Modulation der Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von Nickel-
Chlorid beobachtet werden konnte (Wataha et al. 2004), wurde zusätzlich der
Einfluss der Nickelfreisetzung aus NiTi-Probekörpern auf die Cytokinfreisetzung
von stimulierten PBMC analysiert. Als Zell-stimulierende Faktoren wurden Lipo-
polysaccharid (LPS), Concanavalin A (ConA) und Toxic-shock-syndrome To-
xin 1 (TSST-1) eingesetzt. Die NiCl2-Konzentrationen wurden nach den Ergeb-
nissen der Nickelfreisetzungs-Analysen (s. Abs. 3.10) gewählt. Die höchste Ni-
ckelkonzentration (24 mg/l NiCl2) und die TSST-1 oder ConA Stimulation führte
im Vergleich zur Kontrolle zu einer signifikant erhöhten IL-1ra-Freisetzung bei
PBMC (Abb. 41). Eine LPS-Stimulation bei der gleichen NiCl2-Konzentration
zeigte keine erhöhte IL-1ra-Freisetzung. Die Analysen der IL-6, IL-8 und TNF-α
Freisetzungen der PBMC in Kokultur mit den niedrigeren NiCl2-Konzentrationen
und zusätzlicher Stimulation führten im Vergleich zu den Kontrollansätzen zu
keiner signifikant veränderten Cytokinfreisetzung (Abb. 42-44).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l
Nickel-Chlorid
% F
reis
etzu
ng IL
-1ra
IL-1ra LPS
IL-1ra ConA
IL-1ra TSST
*
*
Abb. 41. Freisetzung von IL-1ra aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkon-
zentrationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-1ra-Konzentration in der
Kontrolle wurde als 100% angesetzt. (n=3). * p < 0,05.
88
Ergebnisse
0
50
100
150
200
250
300
Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/lNickel-Chlorid
% F
reis
etzu
ng IL
-6IL-6 LPS
IL-6 ConA
IL-6 TSST
Abb. 42. Freisetzung von IL-6 aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkonzen-
trationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-6-Konzentration in der Kon-
trolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).
0
50
100
150
200
250
300
Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l
Nickel-Chlorid
% F
reis
etzu
ng IL
-8
IL-8 LPS
IL-8 ConA
IL-8 TSST
Abb. 43. Freisetzung von IL-8 aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkonzen-
trationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die IL-8-Konzentration in der Kon-
trolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).
89
Ergebnisse
0
50
100
150
200
250
300
Kontrolle 24 mg/l 2,4 mg/l 240 µg/l 24 µg/l 2,4 µg/l
Nickel-Chlorid
% F
reis
etzu
ng T
NF-α
TNF-α LPS
TNF-α ConA
TNF-α TSST
Abb. 44. Freisetzung von TNF-α aus PBMC in Anwesenheit von unterschiedlichen Nickelkon-
zentrationen nach Zellstimulation mit LPS, ConA und TSST-1. Die TNF-α -Konzentration in der
Kontrolle wurde als 100% angesetzt. (n=3).
90
Diskussion
4 Diskussion
Anhand der NiTi-Formgedächtnislegierung wurden in dieser Arbeit in
vitro Biokompatibilitäts-Assays etabliert, die im Vergleich zu den Richtlinien der
DIN EN ISO 10993 eine verbesserte Prognose einer in vivo Implantat-Zell-Re-
aktion ermöglichen. Es konnten durch Analyse der Mediatorfreisetzung Aus-
sagen über eine selektive Aktivierung von Leukozyten an NiTi-Oberflächen ge-
macht werden. Neben der Mediatoranalyse wurden Zellkulturüberstände in
speziellen Funktionsassays (Chemotaxis, Expression von Adhäsionsmolekülen)
eingesetzt. Dabei konnte die biologische Gesamtaktivität der freigesetzten
Faktoren genutzt werden und so ein genaueres Bild über mögliche Implantat-
Zell-Reaktion in vivo gewonnen werden.
4.1 Bewertung der Biokompatibilität
Die Biokompatibilität von Implantatmaterialien wird von vielen verschie-
denen Parametern beeinflusst. Nach Implantation eines Biomaterials in den
Körper spielen bei der Gewebe-Implantat-Reaktion zelluläre und humorale
Faktoren wie Chemotaxine, Wachstumsfaktoren, Komplement, Cytokine, Hor-
mone, Enzyme, Adhäsionsmoleküle neben vielen anderen Faktoren eine wich-
tige Rolle.
Die Biokompatibilität eines Materials ist die Fähigkeit, bei einem speziellen Ein-
satz eine angemessene Reaktion des umgebenden Gewebes hervorzurufen
(European Society for Biomaterials, 1986). Für Knochenimplantat-Materialien
bedeutet dies z.B. eine gute Zelladhäsion, -proliferation sowie die Induktion von
Faktoren, die die Knochenbildung fördern. Eine vergleichende Analyse der Bio-
kompatibilität von Biomaterialien erfordern einheitliche standardisierte Metho-
den, wie sie in der DIN EN ISO 10993 beschrieben sind. Obwohl diese Richtli-
nien immer wieder an die neuen wissenschaftlichen Erkenntnisse angepasst
werden, findet eine biologische Beurteilung von Biomaterialien für den medizi-
nischen Einsatz oft nach cytotoxischen Gesichtspunkten statt. Folgende Prüf-
verfahren werden empfohlen: Cytotoxizität, Sensibilisierung, Gentoxizität und
lokale pathogene Effekte im lebendem Gewebe durch das Einbringen des Bio-
materials im Tiermodell, wodurch eine zusätzliche Beurteilung der chronischen
Toxizität und Kanzerogenität ermöglicht wird. Die Analyse der Cytotoxizität und
91
Diskussion
Gentoxizität erfolgt in vitro durch den Einsatz von Zellkulturtechniken. Bei der
Untersuchung des Sensibilisierungspotentials handelt es sich im wesentlichen
um dermatologische Prüfverfahren mittels Tierversuche (Haut, Schleimhaut,
Augen) zur Einschätzung möglicher Schäden durch den Kontakt mit dem Mate-
rial selbst oder aus dem Material austretende Substanzen. Auch die lokalen
pathogenen Effekte im Gewebe, chronische Toxizität und Kanzerogenität wer-
den durch tierexperimentelle Reihenversuche ermittelt.
Die Biokompatibilität eines Biomaterials bedeutet nicht nur das Ausbleiben einer
zelltoxischen Reaktion, sondern schließt auch die Biofunktionalität eines Mate-
rials ein.
Die in dieser Arbeit entwickelten Testsysteme sollen jedoch weiterführende in
vitro Analysen ermöglichen, um Vorhersagen über eine in vivo Zell-Implantat-
Reaktion zu ermöglichen. Dabei wurden nicht nur konditionierte Medien aus der
Immersion vom Biomaterial in Lösung (z.B. Zellkulturmedium ohne Serum), wie
es die DIN EN ISO 10993 empfiehlt, eingesetzt, sondern in vivo nahe konditio-
nierte Medien aus der Kokultur von Leukozyten mit NiTi-Probekörpern verwen-
det.
In der Literatur finden sich eine Anzahl von Publikationen zur Biokompatibilität
von NiTi. Die Biokompatibilität von NiTi wurde dabei durch Zellkultur mit
Fibroblasten, Endothelzellen oder Osteoblasten analysiert. In den meisten chir-
urgischen Situationen sind jedoch Leukozyten die ersten Zellen, die in Kontakt
mit einem Implantat kommen (Eriksson et al. 2001). Aus diesem Grund ist es
sinnvoll, Leukozyten zur Analyse der Biokompatibilität einzusetzen. Wenn Bio-
materialien Anwendung im Knochen finden, sollten humane Osteoblasten in die
Analysen einbezogen werden. Deshalb wurden in dieser Arbeit Leukozytenfrak-
tionen und humane Osteoblasten zur Analyse der Biokompatibilität von NiTi als
Knochenimplantatmaterial verwendet.
4.2 Gradientenwerkstoffe zur ersten schnellen Analyse der
Biokompatibilität
Mit Hilfe des für diese Arbeit entwickelten Gradienten-Werkstoffes konnte
gezeigt werden, dass die NiTi-Formgedächtnislegierung mit einem Nickelanteil
bis zu 50 at% unter den vorhandenen experimentellen Bedingungen keinen
cytotoxischen Effekt auf humane Osteoblasten hatte. Weiterhin zeigten die Zell-
92
Diskussion
kulturexperimente auch für die Kompartimente 100 at% - 50 at% Titan eine gute
Zelladhärenz und Proliferation. Die fehlende Biokompatibilität im Bereich der
nickelreichen Legierung lässt sich wahrscheinlich auf die gesteigerte Freiset-
zung von Nickelionen zurückführen. Es ist möglich, dass die titanarmen Legie-
rungen keine oder nur langsam eine Titandioxid-Schicht an der Oberfläche bil-
den (Passivierung), so dass hier unter dem Einfluss des Zellkulturmediums lo-
kale Korrosion und somit eine vermehrte Nickelionen-Freisetzung stattfinden
kann. Wenn auch NiTi-Formgedächtnis-Implantate viel länger im Gewebe ver-
weilen und die Diffusionskinetik von Nickel im Gewebe wahrscheinlich eine an-
dere ist, kann das entwickelte Experimentalmodell in frühen Entwicklungspha-
sen von Implantat-Materialien von großem Nutzen sein. Damit können bereits
frühzeitig bestimmte Materialien von weiterführenden Biokompatibilitätsuntersu-
chungen z.B. über Tierversuche ausgeschlossen werden. Die Verwendung
eines Gradientwerkstoffes macht es möglich, parallel verschiedene Legie-
rungen oder Komposite mit unterschiedlicher Zusammensetzung zu ana-
lysieren. Sie erlaubt damit eine Beurteilung der Biokompatibilität in vitro und
prinzipiell auch in vivo. Der experimentelle Einsatz eines Gradientenwerkstoffes
im Tiermodell wurde bereits von Watari et al. (2000) berichtet. Die Ergebnisse
sind mit denen dieser Arbeit vergleichbar. Die in vivo Analysen von Watari et al.
(2000) mit einem Gradientenwerkstoff mit den Abstufungen von reinem Titan zu
reinem Kobalt im subkutanen Weichgewebe von Ratten haben gezeigt, dass
mit ansteigender Kobaltkonzentration sich um das Implantat eine immer stärker
ausgeprägte bindegewebige Schicht bildete. Elementanalysen zeigten eine ver-
stärkte Kobaltionen-Freisetzung in den kobaltreichen Kompartimenten, eine
Titan Freisetzung konnte nicht gemessen werden.
Mit Hilfe eines Gradientenwerkstoffes und zellbiologischen Cytotoxizitäts-Ana-
lysemethoden kann relativ schnell zwischen biokompatiblen und nicht biokom-
patiblen Werkstoffen unterschieden werden. Es handelt sich also um ein Aus-
schluss- und Screeningverfahren, das erste Aussagen über ein Material ermög-
licht. Schwieriger wird es jedoch, in einem Gradientenwerkstoff verschiedene
biokompatible Materialien zu vergleichen. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen,
dass sich NiTi, reines Titan und die graduellen Abstufungen dazwischen sich
von der zellbiologischen Reaktion nicht unterscheiden. Bei der Fragestellung,
93
Diskussion
ob reines Titan oder NiTi biokompatibler bzw. erwünschte zellbiologische Reak-
tionen hervorruft, kann keine eindeutige Antwort gegeben werden.
Allerdings stehen dem hier entwickelten Experimentalmodell die Analyse wei-
terer Parameter offen, z.B. ist es möglich, die zellbiologischen Reaktion auf ver-
schiedene Material-Rauhigkeiten zu analysieren. Durch die Verwendung von
einem Material mit einem Rauhigkeitsgradienten könnten zellbiologische Reak-
tionen direkt an der Oberfläche analysiert werden.
4.3 Zelladhäsion als ein Parameter der Biokompatibilität
Die Zelladhäsion ist ein früher und zentraler Vorgang der Zellinteraktion
mit einem Biomaterial. Bei zahlreichen physiologischen Prozessen (z.B. Prolife-
ration und Differenzierung) spielt sie eine wichtige Rolle und ist somit eine we-
sentliche Voraussetzung für die Gewebeintegration z.B. bei Knochenim-
plantaten. Durch Zelladhäsionsanalysen lassen sich u.a. toxische Zell-Implan-
tat-Reaktion analysieren, die einen wesentlichen Aspekt von Biokompatibilitäts-
analysen bilden. Die Betrachtung der Zelladhäsion und damit auch die Beurtei-
lung der Biokompatibilität eines Materials ist abhängig vom Einsatzort bzw. von
der Anwendung eines Implantates. Die Zelladhärenz an ein Biomaterial bedeu-
tet für einen vaskulären Stent auf Dauer das Versagen des Implantates. In die-
ser Arbeit stand die Biokompatibilität hinsichtlich orthopädischer Implantate im
Vordergrund und dabei stellt die Zelladhäsion eine unerlässliche Voraussetzung
für eine Gewebsintegration des Implantates dar.
In der Literatur finden sich zur Adhäsion von Zellen an NiTi nur wenige Unter-
suchungen. Analysen mit osteoblasten-ähnlichen Osteosarkoma-Zellen (ROS-
17) von Ratten auf NiTi zeigten eine gute Adhäsion dieser Zellen an NiTi
(Kapanen et al. 2002). Übereinstimmend mit diesen Resultaten zeigten die Er-
gebnisse dieser Arbeit sowohl mit humanen osteoblasten-ähnlichen Osteosar-
komazellen (MG-63, SAOS-2) als auch mit frisch isolierten humanen Leuko-
zyten (Lymphozyten, Granulozyten, Thrombozyten) ebenfalls gute Adhärenz
auf NiTi-Oberflächen. Waren die NiTi-Probekörper zusätzlich mit Calciumphos-
phat-beschichtet konnte eine erhöhte Leukozytenadhärenz im Vergleich zu un-
beschichtetem NiTi festgestellt werden. Wie die rasterelektronenmikrosko-
pischen Analysen dann klar demonstrierten (Abb. 45), lagen die PMN und
94
Diskussion
PBMC auf der Calciumphosphatschicht und damit kann die gemessene erhöhte
Adhärenz aufgrund einer Oberflächenvergrößerung durch Calciumphosphat-
kristalle ausgeschlossen werden.
Abb. 45. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme eines Granulozyten auf der
Calciumphosphatschicht in Aufsicht.
Dennoch hat die Oberflächentopographie der Calciumphosphatschicht offen-
sichtlich einen wesentlichen Effekt auf die Leukozytenadhärenz. Makrophagen
zeigen eine erhöhte Zelladhäsion auf rauheren Titanoberflächen (Takebe et al.
2003). Sogar die Nanostruktur der Oberfläche hat einen Einfluss auf die Zellak-
tivität. Karlsson et al. (2004) berichteten, dass sich in Abhängigkeit von der Po-
rengröße im Nanobereich eines Aluminium-Substrates der Aktivitätszustand
und die damit verbundene Morphologie von PMN verändert. Neben der Ober-
flächentopographie bzw. Rauhigkeit scheinen Materialeigenschaften wie die
Benetzbarkeit eine signifikante Rolle zu spielen. Dabei zeigten hydrophobe
Materialien wie z.B. Polyethylen eine im Vergleich zu hydrophilen Materialien
z.B. Polystyrol erhöhte Adhäsion der PMN (Otto et al. 2003). Auch in vivo Ana-
lysen von hydrophoben und hydrophilen Biomaterialien zeigten z.B. nach 14
Tagen Implantation in Rattenrückenhaut eine erhöhte Makrophagenadhäsion
am hydrophoben Biomaterial (Brodbeck et al. 2002). Dabei scheint die Präab-
sorption von Proteinen (z.B. Fibrinogen) an die Oberflächen eine wesentliche
Rolle zu spielen. Die Proteine dienen als Liganden für proteinspezifische Re-
95
Diskussion
zeptoren an der Monozytenoberfläche. Weiterhin zeigten die Zelladhäsions-
analysen dieser Arbeit keinen toxischen Effekt der NiTi-Probeköper auf Leuko-
zyten und osteoblasten-ähnliche Zellen. Bei der Zell-Implantat-Interaktion
kommt es zu einer Freisetzung von vielen Faktoren. Dadurch findet unter
anderem eine verstärkte Zellproliferation statt. Der Einsatz von osteoblasten-
ähnlichen Zellen, als Modell für das Knochenwachstum, ermöglicht eine Ana-
lyse der Langzeit-Zell-Implantat-Interaktion.
4.4 Zellproliferation als Kriterium für Biokompatibilität
Die Analyse der Zellproliferation dient wesentlich zur Beurteilung von
Langzeit-Effekten des NiTi auf z.B. osteoblastenähnliche Zellen. Sie stellt somit
ein geeignetes Modell der Osteointegration und Toxizität eines Biomaterials
dar.
In der Literatur finden sich zahlreiche Publikationen zur Zellproliferation auf
NiTi. Bei der Kultivierung von humanen Lymphozyten auf NiTi konnte nach 72
Stunden und unter Stimulation mit Concanavalin A kein Unterschied zu Titan
und Kontrollen ohne Metallprobekörper in der Zellproliferation festgestellt wer-
den (Shabalovskaya 2002). Auch die Kultivierung über einen gleichen Zeitraum
mit anderen Zellen wie humanen embryonalen Zelllinien (L132, HEPM) auf NiTi,
Titan und Ti6AL4V ergaben keinen Unterschied in der Zellproliferation auf den
verschiedenen Metallen (Rocher et al. 2004). Trepanier et al. (1999) wiesen
nach, dass auch nach unterschiedlicher Oberflächenbehandlung (elektrolytisch-
poliert, hitze-behandelt, passiviert) von NiTi-Stents und anschließender Kultivie-
rung mit humanen Fibroblasten kein Unterschied in der Zellproliferation nach 10
Tagen festgestellt werden konnte. Ebenfalls eine gute Proliferation von huma-
nen Fibroblasten und Osteoblasten auf NiTi im Vergleich zu Kontrollen ohne
Metall, Titan und Edelstahl wurden von Ryhänen et al. (1997) beschrieben. Die
in der vorliegenden Arbeit beschriebene Zellproliferation von humanen osteo-
blasten-ähnlichen Zellen (MG-63, SAOS-2) auf NiTi-Probekörper im Vergleich
zu Titan korrelieren zu den in der Literatur beschriebenen Analysen. Im Gegen-
satz dazu zeigten die osteoblasten-ähnlichen Zellen eine verminderte Zellproli-
feration auf Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern im Vergleich zu
unbeschichtetem NiTi und Titan. Alliot-Licht et al. (1991) berichteten, dass
Osteoblasten in der Gegenwart von Hydroxylapatit Calciumphosphatpartikel
96
Diskussion
phagozytieren. Die damit verbundene veränderte intrazelluläre Calciumhomö-
ostase führt dann zur Hemmung der DNA-Synthese und zur reduzierten
Zellproliferation. Desweiteren werden Osteoblastenproliferation, Differenzie-
rung, Matrixsynthese und Wachstumsfaktorenbildung von der Oberflächenmor-
phologie beeinflusst (Bächle et al. 2004, Kieswetter et al. 1996). Auch Dunn et
al. (1982) und Desai et al. (2000) haben festgestellt, dass die Substrat-Topo-
graphie die Zellmorphologie und das Zellverhalten beeinflussen kann. Dabei
haben die jeweilige Gestalt wie z.B. Grate, Riefen, Spitzen, Löcher, Spiralen
und deren Dimension sowie die jeweilige Verteilung einen signifikanten Einfluss
auf das Zellverhalten (Tan et al. 2000, Flemming et al. 1999, Curtis et al. 1998,
Clark et al. 1987). So ist es möglich, dass neben der Calciumphosphatpartikel-
Aufnahme die Oberflächenmorphologie aufgrund der scharfkantigen Calcium-
phosphat-Plättchen (Abb. 46) im Vergleich zum glatten unbeschichteten NiTi
eine Osteoblastenproliferation verhinderte.
Abb. 46. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Calciumphosphat-
schicht aus Lösung in Aufsicht.
Im Vergleich zum klassischen colorimetrischen Verfahren (s. Abs. 3.4) hat sich
die Zell-Proliferationsanalyse über Fluoreszenzmarkierung und anschließender
Quantifizierung mit der digitalen Bildanalytik (s.Abs.3.3) als eine sensitivere
Methode herausgestellt. Im Gegensatz zur Fluoreszenzmarkierung konnte unter
gleichen Versuchsbedingungen mit dem colorimetrischen Verfahren kein Unter-
97
Diskussion
schied in der Osteoblastenproliferation (MG-63, SAOS-2) auf den verschie-
denen Metallprobekörpern (NiTi beschichtet und unbeschichtet, Titan be-
schichtet und unbeschichtet, Ti6AL4V beschichtet und unbeschichtet) festge-
stellt werden. Lediglich auf den als cytotoxisch eingestuften Nickelprobekörpern
konnte eine signifikant verminderte Zellproliferation gemessen werden. Es ist
anzunehmen, dass die Umsetzungskapazität der vitalen Osteoblasten von
Tetrazoliumsalze in Formazanderivate den Anteil an avitalen Osteoblasten auf
den verschiedenen Metallprobekörpern überlagerte und so kein Unterschied der
Zellproliferation festgestellt werden konnte.
Ein ähnliches Ergebnis zeigte sich auch bei der Beurteilung des cytotoxischen
Effektes von beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörper auf Leuko-
zyten. Im Vergleich zur klassischen Methode der Analyse der Cytotoxizität
durch LDH-Quantifizierung (s. Abs. 3.5) stellten sich die Fluoreszenzmarkierung
(vitale vs. avital Markierung) und die Analyse des Apoptoseverhaltens als sen-
sitiver heraus. Die LDH-Quantifizierung im Zellkulturüberstand aus der Kokultur
von Leukozyten mit beschichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörpern
zeigten keinen Unterschied im cytotoxischen Einfluss von beschichteten und
unbeschichteten NiTi-Probekörpern auf Leukozytenfraktionen (PBMC, PMN).
Im Gegensatz dazu konnte unter gleichen Versuchsbedingungen durch Fluo-
reszenzmarkierung (s. Abs. 3.7.1) und Analyse der Apoptose (s. Abs. 3.6) eine
erhöhte Anzahl von apoptotischen und avitalen Leukozyten auf beschichteten
NiTi-Probekörpern festgestellt werden. Die Untersuchungen der Apoptose und
die Fluoreszenzmarkierung stellen eine direkte Analysemethode dar, d.h. die
Analyse findet auf der Ebene der Zelle statt, während es sich bei der LDH-
Quantifizierung um eine indirekte Methode handelt. Dort wird die LDH-Aktivität
im Zellkulturüberstand gemessen, die dann proportional zu den avitalen Zellen
ist. Dabei hat das im RPMI1640 enthaltene Phenolrot (OD490: 0,04 ± 0,001) ei-
nen geringen Einfluss auf die Messungen. Jedoch zeigte sich, dass die LDH-
Aktivität des FCS (OD490: 0,54 ± 0,01) einen entscheidenen Einfluss auf die
Messungen hatte. Die LDH-Aktivität des FCS überlagerte die LDH-Freisetzung
aus avitalen Zellen, so dass kein Unterschied im cytotoxischen Einfluss der be-
schichteten und unbeschichteten NiTi-Probekörper gemessen werden konnte.
Durch die Fluoreszenzmarkierung der Zellen wird nicht nur eine Quantifizierung
der Zellen auf dem Biomaterial ermöglicht, sondern auch deren morphologische
98
Diskussion
Betrachtung. Dies ist mit der Durchlichtmikroskopie aufgrund der Lichtundurch-
lässigkeit des Materials nicht möglich. Die Auflichtmikroskopie würde hier eine
Möglichkeit bieten, allerdings ist die klare Abgrenzung der Zellen gegenein-
ander aufgrund ihrer Transparenz sehr aufwendig. Dennoch zeigen sich
Schwächen der Methode bei der Analyse der Proliferation auf Biomaterialien,
die große Unebenheiten wie z.B. bei porösen Materialien aufweisen. Dort kön-
nen die in unterschiedlichen Fokusebenen liegenden Zellen nicht vollständig
erfasst werden und eine Auswertung wird ungenau.
Die Beurteilung der Biokompatibilität durch die Zellproliferation stellt ein geeig-
netes Modell der Gewebsintegration dar. Die Bedeutung liegt vor allem in der
Analyse der Langzeit-Cytotoxizität des Implantatmaterials. Um ein vollständiges
Bild der Langzeit-Zell-Implantat-Interaktion zu erhalten, kommen weiterführende
Analysen der Zelldifferenzierung auf NiTi in Betracht. Dazu kommen immun-
histochemische Untersuchungen von geeigneten Markern der Knochendifferen-
zierung wie z.B. Osteopontin in Betracht.
Die Zellproliferation und Cytotoxizität sind wichtige jedoch nur die ersten
Schritte in der Biokompatibilitätsanalyse. Die Biomaterial-Zell-Interaktion erfolgt
u.a. über biochemische Faktoren z.B. Cytokine oder Chemokine. Welchen
Einfluss das Biomaterial auf die Mediatorenfreisetzung hat, stellt dann einen
weiteren Schritt in der Beurteilung der Biokompatibilität dar.
4.5 Die Bedeutung einer Cytokinfreisetzung für die Beurteilung von Biokompatibilität
Ein wesentlicher Aspekt dieser Arbeit war die Analyse von freigesetzten
Cytokinen in der Interaktion von Leukozyten und NiTi. Die Bedeutung dieser
Analysen liegt vor allem in einer Beurteilung von lokalen Reaktionen in unmit-
telbarer Implantatnähe. Nach einer Zelladhärenz (s. Abs. 3.7) kommt es zu
mehr oder weniger starken Zellaktivierungen. Ein messbares Korrelat derartiger
Zellaktivierungen ist die Freisetzung von Cytokinen. Hierbei können neben der
Quantität einzelner Cytokine ebenfalls zelltypische Cytokinmuster erfasst wer-
den. Diese ermöglichen eine Aussage zu spezifischen Aktivierungen der jewei-
ligen Leukozytensubpopulationen. So setzen etwa die lymphoiden Zellen IL-2
und die myeloiden Leukozyten im wesentlichen IL-8 oder IL-1ra (Thomson
99
Diskussion
1998) frei. Die Auswertung der Cytokinmuster ergab für die Interaktionen mit
Metallprobekörpern im wesentlichen eine Aktivierung der myeloiden Zellen, d.h.
von neutrophilen Granulozyten und Monozyten. Diese Zellen setzen offensicht-
lich als erste Zelltypen regulatorische Signalmoleküle frei, deren Art und Aus-
maß dann für weitere Gewebsreaktionen relevant sind.
Die Daten dieser Arbeit zeigten, dass die Anwesenheit von unbeschichtetem
NiTi bereits zu einer erhöhten Freisetzung von IL-1ra, IL-6 und IL-8 bei PBMC
und IL-6 bei PMN führte (Abb. 37). Dieses ist wahrscheinlich durch spezifische
Oberflächenreaktionen mit dem Metall zu erklären wie, z.B. Aktivierung der
Zellen an Ecken und Kanten bzw. an im Vergleich zur Plastikoberfläche der
Zellkulturplatte rauheren Strukturen (Kapanen et al. 2002). Die Steigerung der
Cytokinsynthese induziert durch NiTi war signifikant gegenüber der Kontrolle
aber nicht signifikant anders im Vergleich zu Titan oder Ti6Al4V. Diese Ergeb-
nisse sprechen eher für unspezifische, nicht von der Metalllegierung abhängige
Zellaktivierungen. Im Gegensatz dazu führte die Interaktion von Leukozyten mit
Calciumphosphat-beschichteten Proben zu einer signifikanten Steigerung der
Freisetzung von IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF-α und GM-CSF (s. Abs. 3.9.2). Dafür
sind im wesentlichen zwei Faktoren verantwortlich: erstens eine erhöhte Zellad-
härenz (Abb. 26-30) und zweitens eine verstärkte Zellaktivierung (Abb. 31-37).
Einer der Gründe für eine intensivere Zellaktivierung ist die extrem rauhe Ober-
fläche der Calciumphosphatbeschichtung (Abb. 46). Brodbeck et al. (2003) be-
richteten ebenfalls, dass die Rauhigkeit einer Biomaterialoberfläche zur Cyto-
kinfreisetzung korreliert.
Die biologischen Prozesse, die zu einer starken Aktivierung von Myeloiden führt
sind u.a. einer sog. „frustrierten Phagozytose“ zuzuordnen (Cordier et al 1981).
Neben einer hohen Freisetzung von Cytokinen kommt es dabei auch zur Frei-
setzung lysosomaler Enzyme und reaktiven Sauerstoffradikalen (Cadroy et al.
2000).
Die Bedeutung einer moderaten (NiTi) versus einer hohen (NiTi Calciumphos-
phat-beschichtet) Cytokinfreisetzung in vitro für eine in vivo Situation ist nur ab-
schätzbar und muss anhand von in vivo-Modellen überprüft werden. Es ist aber
beschrieben, dass eine Vielzahl von Cytokinen (z.B. IL-6, IL-8 etc.) für Wund-
heilungsprozesse und Gewebsumbau eine wichtige regulatorische Rolle haben
(Horowitz et al. 1998). Ausmaß und auch der zeitliche Verlauf von Mediatoren-
100
Diskussion
generierung bestimmt dann weiterhin das Schicksal von Implantateinheilungen.
Die in vitro Ergebnisse dieser Arbeit fordern dringend eine in vivo Biokompatibi-
litätsüberprüfung der Calciumphosphatschicht, wobei dann sogar mit profunden
Entzündungsreaktionen gerechnet werden kann.
Auch diese Schlussfolgerungen unterstreichen nochmals die Ausweitung von
Biokompatibilitätstestungen über die Vorgaben der DIN EN ISO 10993 hinaus.
In diesem Zusammenhang ist es wenig überraschend, dass es kaum Daten in
der Literatur zur Cytokinfreisetzung in Anwesenheit von NiTi gibt. Wataha et al.
(1997) zeigten, dass die Kokultur einer Monozyten-Zellinie (THP-1) mit NiTi für
72 Stunden im Vergleich zu Edelstahl und Titan eine gesteigerte Sekretion von
IL-1β verursachte. Die Analyse von TNF-α zeigte keinen Unterschied in der Ex-
pression bei der Kokultur von NiTi im Vergleich zu Edelstahl und Titan.
Im Gegensatz zu Wataha et al. (1997) wurde in dieser Arbeit ein umfas-
senderes Cytokinspektrum erfasst, dass allerdings auch noch kein vollständiges
Bild geben kann, da hauptsächlich Leitcytokine für Leukozytenpopulationen
ausgewählt wurden und andere Faktoren wie z.B. der TGF-β-Familie oder an-
giogenetische Wachstumsfaktoren wie VEGF nicht eingeschlossen waren.
Prinzipiell ist es sinnvoll in Zukunft Screening-Analysen für das Cytokinmonito-
ring zuerst einzusetzen. Auch in dieser Arbeit wurde ein Protein-Array zum
Screening verwendet, wobei sich aber zeigte, dass zumindest der verwendete
Array in seiner Sensitivität den herkömmlichen ELISA-Systemen unterlegen
war. Insbesondere zeigte sich auch in der Quantifizierbarkeit deutliche Mängel,
so dass auch weiterhin eine Quantifizierung von Cytokinen auf Proteinebene im
Rahmen von Biokompatibilitätsstudien auch durch ELISA durchgeführt werden
sollte. Natürlich ist auch das Erfassen selektiver Cytokinmuster nur ein Mosaik-
stein im Bild Biokompatibilität. Die Bedeutung derartiger Analysen für Biokom-
patibilitätsanalysen zeigten aber auch die erzielten Ergebnisse zu den „konditi-
onierten Medien“.
4.6 Der Einsatz konditionierter Medien zur Beurteilung der
Biokompatibilität
Ein relevanter Ansatz in dieser Arbeit war die Bewertung der Biokompa-
tibilität eines Materials bzw. Implantates durch den Einsatz konditionierter Me-
dien in Funktionsassays. Für die Biokompatibilitätsanalysen ist ein Funktions-
101
Diskussion
assay im Sinne einer biologischen Aktivitätsmessung die Methode der Wahl,
zumal diese nicht nur die Konzentration eines Faktors bestimmt, sondern die
Gesamtwirkung der gebildeten löslichen Faktoren einschließlich eventueller
synergistischer oder supprimierender Effekte wiederspiegelt. Auch in der DIN
EN ISO 10993 wird der Einsatz konditionierter Medien empfohlen, allerdings
werden diese lediglich durch die Immersion bei 37°C vom Biomaterial in Lösung
(z.B. Zellkulturmedium ohne Serum) hergestellt. Bei den konditionierten Medien
in dieser Arbeit handelt es sich um Zellkulturüberstände aus der Kokultur von
Leukozyten und beschichtetem bzw. unbeschichtetem NiTi. Als Kontrollansätze
wurden konditionierte Medien aus der Kultur von Leukozyten ohne NiTi-
Probekörper verwendet. Die Überführung frisch isolierter Leukozyten in
konditionierte Medien bedeutet für die Beurteilung der Biokompatibilität eine
gewisse Simulation einer in vivo Situation, die ein implantatnahes Mikromilieu
nachstellt. Im Gegensatz zur Analyse der Cytokinfreisetzung kann hier neben
der Zellaktivierung aufgrund der Anwesenheit aller gebildeten löslichen bioak-
tiven Faktoren eine bessere Beurteilung der biologischen Gesamtaktivität statt-
finden. Beim Zusammenspiel der parallel vorhandenen verschiedenen löslichen
Faktoren wird dann die biologische Nettowirkung sichtbar. Dies bedeutet, dass
ggf. die Produktion einzelner löslicher Mediatoren stimuliert wird, die Produktion
anderer herunterreguliert, oder die biologische Aktivitäten verschiedener Medi-
atoren durch Antagonisten oder Rezeptorregulation moduliert wird. In der Lite-
ratur finden sich zum Einsatz derartiger konditionierter Medien zur Biokompati-
bilitätsanalyse von NiTi noch keine Untersuchungen.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass konditionierte Medien von NiTi im
Vergleich zu konditionierten Medien aus Kontrollinkubationen zu keiner verän-
derten Apoptose, Expression von Adhäsionsmolekülen oder Chemotaxis bei
Leukozyten führte. Im Vergleich dazu induzierten konditionierte Medien aus der
Kokultur von Leukozyten und Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekör-
pern eine Verringerung der Apoptose, Veränderung der Expression von Adhä-
sionsmolekülen und Erhöhung der Chemotaxis von Leukozyten. Dies zeigt die
zellaktivierende Wirkung der Mediatoren in den konditionierten Medien, die von
PMN und PBMC gebildet wurden. Diese Ergebnisse unterstreichen nicht nur die
Ergebnisse der Cytokinfreisetzung sondern demonstrieren deutlich die Netto-
wirkung der löslichen Mediatoren. Die Bedeutung einer verzögerten Apoptose,
102
Diskussion
veränderten Expression von Adhäsionsmolekülen und einer erhöhten Chemo-
taxis für die Biokompatibilität eines Implantates kann abschließend nur in in vivo
Untersuchungen beantwortet werden. Allerdings wird die PMN-Akkumulation
als eine Hauptkomponente in der Pathogenese der inflammatorischen Gewe-
beverletzung angesehen (Kirkpatrick et al. 1997).
4.6.1 Die Induktion der Expression von Adhäsionsmolekülen durch konditionierte Medien
Als eine Reaktion auf inflammatorische Reize gehen Endothelzellen und Leu-
kozyten Bindungen ein, die durch die Expression von Adhäsionsmolekülen an
ihren Zelloberflächen vermittelt werden. Die Aktivierung von Leukozyten führt
dazu, dass die Expression von bestimmten Adhäsionsmolekülen wie z.B. ICAM-
1 und CD11b erhöht und von anderen LECAM-1 herunterreguliert wird. Die Än-
derung der Expression von LECAM-1 korreliert direkt mit der Aktivierung von
neutrophilen Granulozyten nach Chemotaxinbindung. Die Monozytenaktivierung
durch die Kokultur mit einem löslichen Mediator (IL-1β) konnte von Wataha et
al. (1997) gezeigt werden. Dabei induzierte IL-1β eine erhöhte ICAM-1-Expres-
sion der Monozyten. Im Vergleich zu dieser Arbeit wurde allerdings ein anderes
Versuchsmodell von Wataha et al. (1997) verwendet. Sie analysierten die di-
rekte Induzierung der Adhäsionsmolekülexpression durch lediglich einen ein-
zigen löslichen Mediator.
In physiologischen Situationen erfolgt, nach Stimulierung der Expression von
Adhäsionsmolekülen, die PMN-Akkumulation im Entzündungsherd. Die Zellre-
krutierung ist ein Resultat der Aktivierung bestimmter Zelltypen. Dabei handelt
es sich um einen Amplifizierungsmechanismus, der auch adverse Konse-
quenzen auf die Biomaterialintegration haben kann. PMN und PBMC können
durch die Interaktion mit einem Implantatmaterial aktiviert werden, dies führt zur
Freisetzung von Chemokinen wie z.B. Interleukin-8. Der entstandene chemo-
taktische Gradient wird von anderen Zellen registriert und verursacht eine Wan-
derung der Zellen entlang des Gradienten. Obwohl dieser Vorgang eine phy-
siologische Reaktion auf eine Verletzung ist, kann dieser Prozess auch durch
eine permanente Leukozytenaktivierung z.B. an der Implantatoberfläche auf-
recht gehalten werden. Wie durch Analyse der Cytokinfreisetzung gezeigt wer-
103
Diskussion
den konnte, findet eine gesteigerte Interleukin-8 Freisetzung der Leukozyten auf
Calciumphosphat-beschichtetem NiTi statt. Im Chemotaxisassay werden die
frisch isolierten PMN z.B. durch IL-8 in konditionierten Medien chemotaktisch-
aktiviert. Bei den durchgewanderten PMN, die mit konditionierten Medien aus
der Kokultur von NiTi oder Kontrollansätzen inkubiert wurden, handelt es sich
nicht um chemotaktisch-aktivierte Zellen. Aufgrund der LECAM-Expression und
Zellgröße kann davon ausgegangen werden, dass es sich um eine spontane
und zufällige Migration der Zellen handelt.
4.6.2 Konditionierte Medien und Apoptose
Desweiteren konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass konditionierte Medien
von Leukozyten und Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern Apop-
tose-supprimierende Aktivitäten auf frisch isolierte PMN übertrugen. Unter den
löslichen Mediatoren sind einige bereits bekannt dafür, dass sie die Apoptose
unterdrücken können. Unter ihnen sind das GM-CSF, IL-6 und das IL-8 (Lee et
al. 1993, Chello et al. 2002, Leuenroth et al. 1998). Im Gegensatz dazu gehört
TNF-α zu den Mediatoren, die eine Apoptose bei PMN induzieren (Maianski et
al. 2003). Neben den zellulären Faktoren wie z.B. die Signaltransduktion aus-
gelöst durch Adhäsionsmoleküle wird der Zeitrahmen der PMN-Apoptose vom
jeweiligen Zusammenspiel von pro- und antiapoptotischen Faktoren im Mikro-
milieu der Zellen bestimmt. Offensichtlich spielt die Apoptose durch die Redu-
zierung der PMN-Aktivität eine wesentliche Rolle bei der Behebung von akuten
Entzündungen. Von Kobayashi et al. 2003 wurde beschrieben, dass PMN die
proinflammatorischen Signale auf der Ebene der Genexpression während der
Apoptose herabregulieren. Eine verzögerte Apoptose der PMN, wie auf den
calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern, stellt nicht nur einen wich-
tigen Abwehrmechanismus dar, der die lokale Phagozytenaktivität aufrecht hält,
sondern kann auch die Freisetzung der für eine Wundheilung essentiellen
PMN-Signale verlängern. Die Rolle einer Prolongation der PMN-Lebensdauer
für die Gewebsintegration eines Implantates ist noch nicht vollständig geklärt.
Eine anhaltende PMN-Aktivität sorgt zum einen für eine erhöhte lokale Infekt-
abwehr und zum anderen zu anhaltenden Entzündungssignalen.
104
Diskussion
Durch die Fokussierung auf Analysen mit Leukozyten, können die hier ge-
zeigten Ergebnisse sicherlich kein vollständiges Bild der Biokompatibilität von
NiTi geben. Weitere Untersuchungen mit Zellpopulationen, die Knochenim-
plantate umgeben wie z.B. Muskelzellen und Fibroblasten, sollten bei Biokom-
patibilitätsstudien zusätzlich in Betracht gezogen werden. Trotzdem zeigen ge-
rade die Ergebnisse in dieser Arbeit hinsichtlich der biomimetischen Calcium-
phosphatschicht die Notwenigkeit einer Erweiterung der Biokompatibilitäts-
Analysen der DIN EN ISO 10993 auf Funktionsassays.
Zusammenfassend zeigt sich die Beschichtung mit Calciumphosphat aus Lö-
sung unter den hier dargestellten Versuchsbedingungen als ungeeignet für den
Einsatz als Biomaterial. Die Analyse der Biokompatibilität und Funktionalität
durch die Parameter Zelladhäsion, -proliferation, Mediatorfreisetzung und Funk-
tionalität zeigten deutlich eine verstärkte Zellaktivierung im Vergleich zu unbe-
schichtetem NiTi. Das endgültige Ausmaß einer Entzündungsreaktion im Orga-
nismus kann allerdings nur durch tierexperimentelle Analysen in einem geeig-
neten Tiermodell beurteilt werden. Im Gegensatz dazu zeigen die Ergebnisse
dieser Arbeit übereinstimmend mit den Daten aus anderen Publikationen auch
bei Verwendung von unterschiedlichen Zelltypen und verschiedenen Analyse-
methoden eine gute in vitro Biokompatibilität der unbeschichteten NiTi-Legie-
rung. Das medizinisch relevante Problem von nickelhaltigen Implantaten wie
NiTi, ist jedoch die mögliche Nickelallergie. In der Literatur ist die Sensibilisie-
rung gegen Nickel aus Implantaten beschrieben (Hayashi et al. 1999, Kanerva
et al 2001). Die Analyse der Nickelfreisetzung ist somit ein weiterer Schritt der
Biokompatibilitätsanalytik von NiTi.
4.7 Nickel-Freisetzung aus NiTi
Nickel gehört zu den Spurenelementen und ein Mangel an Nickel kann
zur Reduktion der Aktivität von verschiedenen Enzymen, Muskeldegeneration,
Gewichtsreduktion und Wachstumshemmung führen. Auf der anderen Seite
können hohe Nickelmengen toxische Effekte, kanzerogene und allergische Re-
aktionen hervorrufen (Ryhänen 2000). Durch Korrosion im Organismus können
Ionen aus Metallimplantaten herausgelöst werden. Die Korrosionsresistenz ei-
nes Metalls und die Toxizität der Metallkomponenten gehören zu den Haupt-
105
Diskussion
faktoren, die die Biokompatibilität eines Metallimplantates bestimmen. Die lo-
kale Akkumulation von Metallionen am Implantationsort führt zu adversen Ef-
fekten bei zellulären Mechanismen (Wataha et al. 1994). Davon sind auch in-
flammatorische Zellen betroffen, was zu einer veränderten inflammatorischen
Reaktion führen kann (Haynes et al. 1993). Zunehmende inflammatorische Sig-
nale am Implantat können zu einer lokalen Gewebsdegeneration, eine mögliche
Knochenresorption und somit zum Versagen des Implantates führen (Lewis et
al. 2003).
Die Nickel-Titan-Struktur der NiTi-Legierung besteht aus einem festen Kristall-
gitter mit hohen Bindungskräften zwischen den einzelnen Atomen, d.h. für die
Atome ist es äußerst schwierig, diesen Verbund zu verlassen (Es-Souni et al.
2005). Die Oberflächeneigenschaften von NiTi sind charakterisiert durch die
Tatsache, dass Titan schneller oxidiert als Nickel und somit eine korrosionsre-
sistente Titandioxidschicht gebildet wird und nur im geringen Umfang Nickeloxid
in der Oberfläche enthalten ist. Die Biokompatibilität wird somit hauptsächlich
von der NiTi-Oberfläche beeinflusst.
In der Literatur finden sich zahlreiche Publikationen zur Nickelfreisetzung aus
NiTi, sie ist unter statischen Bedingungen äußerst gering (Rocher et al. 2004,
Jia et al. 1999). Ryhänen et al. (1997) haben im Zellkulturmedium aus der Ko-
kultur mit humanen Fibroblasten und Osteoblasten bei NiTi in den ersten beiden
Tagen eine erhöhte Freisetzung von Nickel im Vergleich zu Edelstahl und Titan
beschrieben. Allerdings verminderte sich die Nickelfreisetzung von NiTi und
zeigte dann ab dem 3. Tag Zellkultur eine ähnliche Nickelfreisetzung wie Edel-
stahl und Titan. Auch elektrolytisch polierte NiTi-Stents zeigten nach einigen
Tagen in künstlicher Körperflüssigkeit (Hanks Solution) keinen Unterschied in
der Nickelfreisetzung im Vergleich zu Edelstahl-Stents (Thierry et al. 2000).
Wever et al. (1998) konnten zeigen, dass eine Immersion von NiTi in Hanks
Solution eine Reduzierung der Nickel-Freisetzung nach 10 Tagen unter die
Nachweisgrenze verursachte. Verantwortlich dafür ist ihrer Meinung nach die
Bildung einer Hydroxylapatit-Schicht an der NiTi-Oberfläche durch die Hanks
Solution.
Die Nickelfreisetzung aus NiTi ist proportional zum Nickelanteil in der Oberflä-
che, und dieser ist abhängig von der Oberflächenbehandlung (Shabalovskaya
2002). Wird NiTi durch Wasserdampf autoklaviert, enthält es an der Oberfläche
106
Diskussion
nur 0-2 at% Nickel. Da die Passivierung der Oberfläche von NiTi durch die Oxi-
dierung im Wasserdampf gefördert wird. Wird dahingegen NiTi chemisch geätzt
mit 30% Wasserstoffperoxid, befindet sich 27 at% Nickel an der Oberfläche.
Das Wasserstoffperoxid verursacht eine Abtragung von Oberflächenmaterial
wie z.B. Titiandioxid, so das die schützende Passivierung verloren geht. Im
Vergleich zu NiTi, dass chemisch geätzt wurde, konnte eine Reduzierung der
Nickelfreisetzung aus Wasserdampf behandeltem NiTi festgestellt werden
(Shabalovskaya 2002).
Die in dieser Arbeit analysierten Nickelfreisetzungen zeigten bei unbeschich-
tetem NiTi eine im Vergleich zu Calciumphosphat-beschichteten und geätzten
NiTi-Probekörpern deutlich niedrigere Nickelmengen. Im Gegensatz zu den
Analysen von Ryhänen et al. (1997) war die Nickelfreisetzung über den Analy-
senzeitraum (8 Wochen) konstant. Dieser Unterschied könnte auf unterschied-
liche Oberflächenparameter der eingesetzten NiTi-Probekörper zurückgeführt
werden. Desweiteren wurde in dieser Arbeit ein anderes Experimentalmodell
verwendet. Die Nickelfreisetzungen wurde im Puffer oder Blutplasma unter Zell-
kulturbedingungen, allerdings ohne Kokultivierung von Zellen analysiert. Von
Ryhänen et al. (1997) wurden die Nickelfreisetzungen in Proben aus der Ko-
kultur der Metalle mit Zellen gewonnen. Aus der Literatur ist bekannt, dass Zel-
len Nickelionen anreichern (Wataha et al. 2000). Es ist möglich, dass die Zellen
den Zellkulturüberständen das Nickel entziehen, so dass in den Überständen
immer weniger Nickel gemessen werden konnte. Die erhöhte Nickelfreisetzung
der Calciumphosphat-beschichteten Probekörper lässt sich mit großer Wahr-
scheinlichkeit auf das Ätzverfahren während der Beschichtung zurückführen.
Dies zeigte die erhöhte Nickelfreisetzung der geätzten unbeschichteten NiTi-
Probekörper. Durch das Ätzverfahren wird die Titandioxidschicht der NiTi-Pro-
bekörper zerstört, so dass sich zum einen mehr Nickel an der Oberfläche befin-
det und zum anderen eine verstärkte Korrosion möglich ist. Zusätzlich entsteht
durch das Ätzverfahren eine vergrößerte Oberfläche (Abb. 47) (Shabalovskaya
1996, Es-Souni et al. 2005).
107
Diskussion
Abb. 47. Repräsentative rasterelektronenmikroskopische Aufnahme einer geätzten NiTi-Ober-
fläche.
Neben der Beschaffenheit der Materialoberfläche wird die Nickelfreisetzung von
weiteren Faktoren bestimmt. Das umgebende Medium, dass durch den pH-
Wert, die Temperatur und die chemische Zusammensetzung charakterisiert
wird, trägt wesentlich zur Menge an freigesetztem Nickel bei (Es-Souni et al
2005).
Dies zeigten auch die in dieser Arbeit durchgeführten Nickelfreisetzungsanaly-
sen in unterschiedlichen flüssigen Medien (Puffer, Blutplasma). Im Vergleich
zum Puffer mit pH 7,4 konnte im Plasma nach 3 Tagen Inkubationszeit bei 37°C
eine höhere Nickelfreisetzung analysiert werden. Diese Ergebnisse stimmen mit
dem Abschlussbericht der LGC (Laboratory of the Government Chemist,
London, England) vom 31. März 2003 überein. Dort wurden die Risiken der
Nickel-Sensibilisierung beim Menschen durch Ohrstecker beschrieben. Die
Nickelfreisetzungs-Analysen von Ohrsteckermaterialien im Blutplasma und
künstlichem Schweiß zeigten, dass im Vergleich zum künstlichen Schweiß im
Plasma die doppelte Menge an Nickelionen freigesetzt wurden.
Die erhöhte Nickelfreisetzung von NiTi im Blutplasma kann auf eine erhöhte
Konzentration an chemischen Komponenten (z.B. Chorid-, Fluorid- und Sau-
erstoffionen) zurückgeführt werden, da diese zu einer verstärkten Korrosion füh-
ren (Es-Souni et al 2005). Fluoridionen sind aggressive Ionen, die die schüt-
zende Titandioxidschicht von Titan und Titanlegierungen durch die Bildung von
108
Diskussion
Titanfluorid-Molekülen zerstören können (Shim et al. 2005). Dies bedeutet je
nach Oberflächenbeschaffenheit und umgebendem Medium eines NiTi-Im-
plantates ein erhöhtes Risiko der Nickelfreisetzung am Implantationsort. Die
Langzeit-Einwirkung von Nickelionen in geringen nicht toxischen Konzentra-
tionen wurde von Wataha et al. (2000) untersucht. 1-10% der bekannten cyto-
toxischen Nickelkonzentration (subletale Konzentration, definiert als 50%
mitrochondriale SDH Aktivität) wurden über einen Zeitraum von 4 Wochen mit
einer humanen Monozyten-Zelllinie kokultiviert. In Abhängigkeit der subletalen
Nickelkonzentrationen konnte eine Reduzierung der Zellproliferation analysiert
werden. Der Effekt von Nickel in geringen Dosen über die Zeit ist kumulativ, d.h.
die Anzahl der avitalen Zellen bei gleicher Nickelkonzentration wird im Laufe
der Zeit immer größer. Für andere Metallionen wie z.B. Kupfer konnte dies nicht
gezeigt werden. Im Gegensatz zu anderen Metallionen wird Nickel mit der
Expositionszeit im Zellkern akkumuliert und führt sehr wahrscheinlich aus
diesem Grund zu einer kumulativen Reduktion der Zellproliferation und
Zellviabilität.
In weiteren Untersuchungen konnten Wataha et al. (2004) zeigen, dass
sublethale Nickelkonzentrationen (10, 30, 50, 90 µM) bei Monozyten nach 66
Stunden Kokultur und anschließender 6-stündiger Zellstimulation (LPS) eine
vermehrte Freisetzung von Cytokinen (IL-1β, TNF-α, IL-6) verursachen. Die
eingesetzte Nickelionenkonzentration korrelierte mit der Cytokinfreisetzung. Im
Vergleich zu Wataha et al. (2004) konnte in dieser Arbeit eine signifikant er-
höhte IL-1ra und IL-6 und Freisetzung nach Nickelchlorid-Zugabe (100 µM) bei
unstimulierten PBMC gemessen werden. Die Stimulation mit LPS, ConA und
TSST-1 führte zu keiner erhöhten Freisetzung. Eine gesteigerte TNF-α Bildung
konnte im Gegensatz zu den Ergebnissen von Wataha et al. (2004) bei keiner
Nickelkonzentration und auch nicht durch Zellstimulation analysiert werden. Die
voneinander abweichenden Ergebnisse lassen sich möglicherweise auf die un-
terschiedlichen Versuchsmodelle zurückführen. Bei Wataha et al. (2004) wur-
den humane Zelllinien für 72 Stunden mit dem Nickel kokultiviert und die Zell-
stimulation fand erst in den letzten 6 Stunden statt. Da eine Zellstimulation erst
nach 24 Stunden zu einer messbaren veränderten Cytokinsynthese führt, wur-
den in dieser Arbeit humane PBMC parallel zur Nickel-Kokultur für 24 Stunden
stimuliert.
109
Diskussion
Zusammenfassend bedeutet die Nickelfreisetzung aus NiTi unter den darge-
stellten Versuchsbedingungen (mechanisch unbeansprucht, definierte Oberflä-
chenparameter) kein Risikofaktor. Auch Es-Souni et al. 2005 beschreibt nach
dem Vergleich der Literatur eine gute Biokompatibilität für NiTi mit definierten
Oberflächenparametern für Normal-Proband. Allerdings zeigen Analysen an
mechanisch belasteten orthodontischen NiTi-Drähten, dass im Vergleich zu un-
belasteten NiTi-Drähten eine erhöhte Nickelfreisetzung stattfindet (Jia et
al.1999). Auch Es-Souni et al. (2005) räumen eine mögliche Gefahr für nickel-
sensitive Allergiker ein. Weitere Untersuchungen zeigen, dass durch das Anle-
gung einer elektrischen Spannung an NiTi-Proben, als Modell für die Korrosion
im Organismus, im Vergleich zu unbelasteten NiTi-Proben vermehrt Nickel frei-
gesetzt wird (Shih et al. 2000). Die Überstände aus den Nickelfreisetzungsana-
lysen zeigten nach der Kokultur mit Rattenmuskelzellen eine Inhibition der
Zellproliferation. Diese Nickelfreisetzung ist neben der cytotoxischen Reaktion
besonders von Bedeutung bei einer potentiellen Induktion von allergischen Re-
aktionen. Das allergische Potential der Nickelfreisetzung aus NiTi wird zusätz-
lich durch die natürliche Affinität von Nickel zu im Blutplasma enthaltenen Al-
bumin verstärkt. Nickel-gesättigtes Serumalbumin induziert und aktiviert stärker
Nickel-spezfische T-Zellen als Nickelsalze in gleicher Konzentration (Thierse et
al. 2004).
4.8 Nickelallergie
Der hohe Nickelgehalt von NiTi ist unter korrosiven Bedingungen und
unter mechanischer Belastung ein entscheidender Ausgangspunkt für eine po-
tentielle Nickelfreisetzung. Bereits sehr geringe Nickelkonzentrationen
(0,5 mg/L) reichen aus, um bei hoch sensitiven Individuen allergisch-bedingte
Reaktionen zu induzieren (Menne 1994). Die Schwellenwerte für cytotoxische
Reaktionen, hervorgerufen durch Nickelionen, liegen um ein Vielfaches höher
(über 10 mg/L) (Shih et al. 2000).
Nickel ist weltweit das häufigste Kontaktallergen, 12% der Bevölkerung zeigen
positive Reaktionen auf Nickel (Thomas 2003), wobei Frauen häufiger (20-30%)
betroffen sind als Männer (3-5%) (Artik et al. 2004, Mathelier-Fusade et al.
2001). Bei der Sensibilisierung wird vor allem dem in Modeschmuck enthal-
110
Diskussion
tenen Nickel eine bedeutsame Rolle zugeschrieben. Häufig werden Individuen
erst durch das Stechen von Ohrlöchern auf Nickel sensibilisiert. Nielsen et al.
(1993) konnte in einer Studie zeigen, dass eine Prävalenz eines allergischen
Kontaktekzems bei Individuen mit gestochen Ohrlöchern bei 14,8% und bei
Kontrollpersonen ohne Ohrlöcher bei 1,8% lag.
Im Hinblick auf allergische Reaktionen gegenüber Metallimplantaten stehen
Spättyp (Typ IV) Reaktionen im Vordergrund. Im Gegensatz zu Hypersensibili-
tätsreaktionen vom Soforttyp, die durch Antikörper verursacht werden, liegt bei
den Typ IV Reaktionen die Aktivierung antigenspezifischer T-Lymphozyten
zugrunde.
Wever et al. (1997) konnten anhand von Sensibilisierungs-Analysen (Epikutan-
test) nach DIN EN ISO 10993 an Meerschweinchen mit NiTi-Extrakten, keine
Induktion einer allergischer Reaktionen feststellen. Untersuchungen zur Entste-
hung der Nickelallergie an Mäusen zeigen jedoch, dass um eine Sensibilisie-
rung zu induzieren, bestimmte Voraussetzungen wie Gewebsverletzungen vor-
liegen müssen. Dabei werden durch Phagozyten reaktive Sauerstoffradikale
gebildet, die als Alarm-Signale dienen (Artik et al. 1999). Diese Vorausset-
zungen sind nach dem Einbringen von Implantaten durch das Operations-
trauma gegeben.
111
Zusammenfassung
5 Zusammenfassung
Ziel dieser Arbeit war es, zellbiologische Testsysteme zu entwickeln, die
eine verbesserte und in vivo-nahe Beurteilung von Biokompatibilität und Bio-
funktionalität neu entwickelter Implantatmaterialien ermöglichen. Dies wurde am
praktischen Beispiel einer sogenannten Formgedächtnislegierung auf der Basis
von Nickel und Titan (NiTi) durchgeführt. NiTi zeigt für den klinischen Einsatz
ungewöhnliche Eigenschaften und eröffnet damit viele neue Perspektiven auch
in der Chirurgie. Zu diesen Eigenschaften gehört der Formgedächtniseffekt, d.h.
die Fähigkeit zur "Erinnerung" an eine ursprüngliche Geometrie durch
kurzzeitiges Erwärmen und die Pseudoelastizität, eine für ein Metall extreme
Biegsamkeit. Diese Effekte werden bereits klinisch bei Zahnspangen, für
Klammern in der Fußchirurgie, für endovaskuläre Stents und für Katheter in der
minimalinvasiven Chirurgie genutzt. Problematisch ist jedoch der im Vergleich
zu chirurgischen Edelstählen hohe Nickelanteil von 50 at%, der möglicherweise
adverse Gewebereaktionen sowie allergische Sensibilisierungen hervorrufen
kann.
Zur Beurteilung der Biokompatibilität wurde in dieser Arbeit mit isolierten Leu-
kozytenfraktionen (Granulo-, Lympho-, Thrombozyten) gearbeitet, da Leuko-
zyten zu den ersten Zellen zählen, die in unmittelbaren Kontakt mit Implantat-
oberflächen kommen. Zusätzlich wurde die Zell-Implantat-Interaktion von osteo-
blastenartigen Osteosarkoma-Zelllinien (MG-63, SAOS-2) untersucht, da
Osteoblasten besonders als Modellzellen für Knochenwachstum geeignet sind.
In dieser Arbeit konnte ein Screeningverfahren etabliert werden, mit dem es
möglich ist, schnell und parallel die Biokompatibilität von Materialeigenschaften
wie z.B. unterschiedliche Nickel-Titan-Legierungen zu analysieren. Dazu wur-
den Osteoblasten und ein Gradientenwerkstoff mit einer stufenweisen Reduzie-
rung der Nickelkonzentration von 0 at% (reines Titan) über 50 at% (NiTi) zu
90 at% Nickel und 10 at% Titan zur Analyse der zellbiologischen Reaktion ein-
gesetzt. Die Ergebnisse zeigten, dass sich NiTi, reines Titan und die graduellen
Abstufungen dazwischen sich von der zellbiologischen Reaktion nicht unter-
scheiden. Es konnte eine gute Zelladhärenz und kein zytotoxischer Effekt für
NiTi festgestellt werden.
112
Zusammenfassung
Um die Biokompatibilität und Biofunktionalität der NiTi-Formgedächtnislegierung
zu erhöhen, wurde sie mit einer Calciumphosphatschicht aus wässriger Lösung
beschichtet. Dieses biomimetische Implantat-Interface sollte das An- und Ein-
wachsverhalten als Knochenimplantate verbessern und als Barriere für diffun-
dierende Nickelionen dienen.
In zellbiologischen Analysen wurden die Zell-Implantat-Interaktion von Osteo-
blasten und Leukozyten in Kokultur mit Calciumphosphat-beschichteten oder
unbeschichteten NiTi-Probekörpern bestimmt. Als Kontrolle dienten Zellen, die
keinen Kontakt mit dem Implantatmaterial hatten. Während der Interaktion der
verschiedenen Zellpopulationen mit den beschichteten und unbeschichteten
NiTi-Probekörpern wurde unterschiedliche Parameter analysiert: Zelladhärenz,
Zellproliferation, Zellaktivierung und Freisetzung biochemischer Mediatoren.
Beim letzten spielen Cytokine eine wesentliche Rolle, sie haben bei einer Viel-
zahl von immunologischen Reaktionen regulatorische Funktionen. Für die Be-
urteilung der biologischen Gesamtaktivität und damit einer in vivo-nahen Situa-
tion wurden konditionierte Medien (Zellkulturmedium aus der Kokultur von Leu-
kozyten und beschichtetem oder unbeschichtetem NiTi) als ein Implantat-nahes
Mikromilieu, in speziellen Bioassays (Chemotaxis, Expression von Adhä-
sionsmolekülen) eingesetzt.
Im Vergleich zu Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern konnte auf
unbeschichtetem NiTi eine erhöhte Osteoblastenproliferation (MG-63, SAOS-2)
festgestellt werden. Die Analyse der Leukozytenadhärenz ergab eine im Ver-
gleich zum unbeschichteten NiTi vermehrte Adhärenz an der Calciumphosphat-
schicht. In immunologisch-biochemischen Untersuchungen konnten erstmals
durch die Analyse eines zelltypischen Cytokinmusters Aussagen über eine se-
lektive Aktivierung von Leukozyten an NiTi-Oberflächen gemacht werden. Die
Ergebnisse zeigten eine signifikant höhere Cytokinfreisetzung (IL-1ra, IL-6, IL-8,
TNF-α, GM-CSF) an Calciumphosphat-beschichteten NiTi-Probekörpern. Die
Analyse der Gesamtwirkung der gebildeten löslichen Faktoren durch den Ein-
satz konditionierter Medien in Bioassays ergab für unbeschichtetes NiTi keine
signifikanten Unterschiede im Vergleich zu Kontrollansätzen. Im Gegensatz
dazu führten konditionierte Medien von Leuko-zyten und Calciumphosphat-be-
schichtetem NiTi bei frisch isolierten Granulozyten zu einer Inhibition der
Apoptose und zu einer erhöhten Chemotaxis. Die Analyse des Potentials kondi-
113
Zusammenfassung
tionierter Medien der Calciumphosphatschicht die Expression von Adhäsions-
molekülen bei frisch isolierten Leukozyten zu beeinflussen, zeigte eine Induk-
tion der erhöhten Expression von ICAM-1 und CD11b sowie die Reduzierung
der L-Selektin-Expression. Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse in dieser
Arbeit eine höhere Aktivierung der Leukozyten durch die Calciumphosphat-
schicht im Gegensatz zu unbeschichtetem NiTi.
Die in dieser Arbeit etablierten in vitro Biokompatibilitäts-Assays ermöglichen
ggf. eine verbesserte Prognose einer in vivo Implantat-Zell-Reaktion als es die
Richtlinien der DIN EN ISO 10993 bisher vorschreiben. Neben der Mediator-
analyse konnte die biologische Gesamtaktivität (d.h. Nettowirkung synergisti-
scher oder supprimierender Effekte) löslicher Faktoren analysiert werden. Diese
Bioassay-Analysen können als Reporter-Systeme einer in vivo-nahen Situation
z.B. für die Entwicklung von neuen biomimetischen Implantaten genutzt wer-
den. Auch wenn Zellkulturversuche nicht direkt die in vivo-Zellreaktion und eine
Implantat-Gewebe-Umgebung simulieren, können jedoch die Effekte von Bio-
materialien auf Leukozyten und Osteoblasten mit den in dieser Arbeit
etablierten Methoden komplexer analysiert werden.
114
Summary
6. Summary
The goal of this work was the development of cell based test systems
that allow a more complete evaluation of biocompatibility and biofunctionality
new implant materials in an in vivo-like environment. The research was
conducted with shape-memory alloys (SMA) made from nickel and titanium
(NiTi-SMA). NiTi exhibits properties that open up a whole variety of new
perspectives for it´s clinical use especially for applications in surgery. The ability
of NiTi to return to a predictable previously memorised shape after external
changes in temperature and it´s pseudoelasticity, i. e. an unusal range of
deformability, are the most remarkable properties. NiTi-SMA where already
utilized for clinical applications like braces, clamps in foot-surgery, endovascular
stents and for catheters in minimal-invasive surgery. Yet the high nickel content
of 50 at% remains problematic, since the nickel release may lead to adverse
effects such as tissue-reactions and allergic sensibilization.
To evaluate biocompatibility of NiTi-SMA isolated leukocyte-fractions (PBMC,
-peripheral blood mononuclear cells, PMN, -polymorphonuclear neutrophil
granulocytes, platelets) where used, because these are often the first cells to
get into close contact with an implant surface. Additionally osteoblast-like
osteosarcoma cells (MG-63, SAOS-2) where employed to study cell implant
interactions, since these cells are commonly used as cell models for bone
ingrowth.
As part of this work a biocompatibility screening method was developed, which
allowed a fast and parallel screening of material properties such as different
nickel-titanium-alloys. For that purpose osteoblasts and a graded metal sample
with a stepwise reduction of the nickel content from 0 at% (pure titanium) over
50 at% (NiTi) to 90 at% nickel and 10 at% titanium were used to evaluate the
cell biological reaction. The results show, that NiTi, pure titanium and the
graduations between these two alloys do not differ regarding the potential to
cause cell biological reactions. In these cases good cell adhesion and no
cytotoxic effects could be observed for NiTi.
To enhance biocompatibility and biofunctionality of the NiTi-SMA test samples
were coated with calcium phosphate by dipping in oversaturated calcium
phosphate aqueous solution. The resulting biomimetic implant interface is
115
Summary
meant to improve the adhesion and the incorporation in bone implants and to
provide a barrier for possible nickel ions release.
Cell implant interactions were investigated with osteoblasts and leukocytes
cocultured with calcium phosphate coated and non coated NiTi samples. Cells
that did not have any contact with the implant material were used as control.
The focus of these tests was on the following parameters: cell adhesion, cell
proliferation, cell activation and release of biochemical mediators. For the latter,
cytokines were of major interest, since these are involved in the regulation of a
variety of immunological responses. In order to evaluate the overall biological
activity and to create an in vivo like situation conditioned media (cell culture
media from cocultures of leukocytes with coated and non coated NiTi), which
represent an implant-related microenvironment, were used in specific bioassays
(i.e. phagocytosis, chemotaxis and expression of adhesion molecules).
MG-63 and SAOS-2 showed an increased proliferation on non coated NiTi
samples compared to the calcium phosphate coated NiTi. Leukocyte adhesion
was increased when NiTi samples were coated with calcium phosphate
(compared to non coated NiTi). By analyzing the cell specific cytokine pattern
conclusions about the selective activation of leukocytes on NiTi surfaces could
be drawn. A significant increased cytokine secretion (IL-1ra, IL-6, IL-8, TNF-α,
GM-CSF) was observed for calcium phosphate coated NiTi sample. Analysis of
the overall effects of soluble factors using conditioned media in bioassays did
not show any significant differences for non coated NiTi compared to controls.
In contrast, inhibition of apoptosis and enhanced chemotaxis could be observed
when freshly isolated granulocytes were treated with conditioned media
obtained by interaction of leukocytes with coated NiTi. An increased expression
of ICAM-1 and CD11b along with a decrease of L-Selektin expression could be
observed when freshly isolated leukocytes were treated with conditioned media
of coated NiTi. The results show that the calcium phosphate coating of NiTi
leads to an increased activation of leukocytes.
The biocompatibility assays presented in this work could provide better tools for
an improved prognosis of in vivo implant/cell reactions than those required by
the guidelines of the DIN EN ISO 10993. Apart from the mediator-analysis the
biological overall activity of soluble factors (i.e. the net-effect of synergistic and
suppressing factors) could be analyzed as well. These bioassays can be
116
Summary
employed as reporter systems that mimic an in vivo-like environment, thus
aiding in the development of new biomimetic implants.
Even though cell culture experiments may not be able to mimic an in vivo cell
reaction to the full extend, the results demonstrate that the methods established
in this work give a more complex overview of the effects of biomaterials on
leukocytes and osteoblasts.
117
Literaturverzeichnis
7 Literaturverzeichnis
Abschlussbericht LGC (Laboratory of the Government Chemist), 31. März 2003,
http://europa.eu.int/comm/enterprise/chemicals/legislation/markrestr/stu-
dies/nickel.pdf
Alliot-Licht B., Gregoire M., Orly I., Menanteau J., Cellular activity of osteoblasts
in the presence of hydroxyapatite: an in vitro experiment. Biomaterials,
1991;12:752-6.
Armitage D.A., Parker T.L., Grant D.M., Biocompatibility and hemocompatibility
of surface-modified NiTi alloys. J Biomed Mater Res A., 2003; 66:129-37.
Artik S., von Vultée, C., Gleichmann E., Schwarz T., Griem P., Nickel Allergy in
Mice: Enhanced Sensitization Capacity of Nickel at Higher Oxidation
States. J Immunol., 1999;163:1143-52.
Artik S., Gleichmann E., Ruzicka T., Tolerance induction towards nickel. From
animal model to humans. Hautarzt, 2004; 55:1052-9.
Bachle M., Kohal R.J., A systematic review of the influence of different titanium
surfaces on proliferation, differentiation and protein synthesis of osteo-
blast-like MG63 cells. Clin Oral Implants Res., 2004; 6:683-92.
Bogdanski D., Köller M., Müller D., Muhr G., Brahm M., Buchkremer A., Stöver
D., Choi J., Epple M., Easy assessment of the biocompatibility of nitinol
by in-vitro cell culture experiments on a functionally graded Ni-NiTi-Ti
material. Biomaterials, 2002; 23:4549-55.
Brodbeck W.G., Patel J., Voskerician G., Christenson E., Shive M.S.,
Nakayama Y., Matsuda T., Ziats N.P., Anderson J.M., Biomaterial ad-
herent macrophage apoptosis is increased by hydrophilic and anionic
substrates in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A., 2002; 99(16):10287-92.
Epub.
118
Literaturverzeichnis
Brodbeck W.G., Voskerician G., Ziats N.P., Nakayama Y., Matsuda T.,
Anderson J.M., In vivo leukocyte cytokine mRNA responses to bio-
materials are dependent on surface chemistry. J Biomed Mater Res A.,
2003; 64:320-9.
Cadroy Y, Dupouy D, Boneu B, Plaisancie H., Polymorphonuclear leukocytes
modulate tissue factor production by mononuclear cells: role of reactive
oxygen species. J Immunol., 2000; 164(7):3822-8.
Chello M., Mastroroberto P., Quirino A., Cuda G., Perticone F., Cirillo F., Covino
E., Inhibition of neutrophil apoptosis after coronary bypass operation with
cardiopulmonary bypass. Ann Thorac Surg., 2002; 73:123–9.
Choi J., Bogdanski D., Köller M., Müller D., Esenwein S.A., Muhr G., Epple M.,
Calcium phosphate coating on nickel-titanium shape memory alloys.
Coating procedure and adherence of leukocytes and platelets. Bio-
materials, 2003; 24: 3689–96.
Clark P., Connolly P., Curtis A.S.G., Dow J.A.T., Wilkinson C.D.W.,
Topographical control of cell behaviour, I. Simple step cues. Develop-
ment, 1987; 99:439-48.
Cordier G., Samarut C., Revillard JP. Distinct functions of surface receptors in
the induction of neutrophil-mediated cytotoxicity. Ann Immunol., 1981;
132D:3–14.
Curtis A., Wilkinson C., Topographical control of cells. Biomaterials, 1998;
18:1573-83.
DIN EN ISO 10993: Biologische Beurteilung von Medizinprodukten, Deutsches
Institut für Normung, 2003.
Dorozhkin S.V., Epple M., Biological and medical significance of calcium phos-
phates. Angew Chem Int Ed Engl., 2002; 41:3130–46.
119
Literaturverzeichnis
Desai T.A., Micro- and nanoscale structures for tissue engineering constructs.
Medical Engineering and Physics, 2000; 22: 595-606.
Dunn G.A., Contact guidance of cultured tissue cells: a survey of potentially
relevant properties of the substratum, in Cell behaviour, Bellairs R.,
Curtis A., Dunn G., Editor, Cambridge university press: London. 1982;
247-81.
Eriksson C., Lausmaa J., Nygren H., Interactions between human whole blood
and modified TiO2-surfaces: influence of surface topography and oxide
thickness on leukocyte adhesion and activation. Biomaterials, 2001;
22:1987-96.
Flemming R.G., Murphy C.J., Abrams G.A., Goodman S.L., Nealey P.F., Effects
of synthetic micro- and nano-structured surfaces on cell behaviour. Bio-
materials, 1999; 20:573-88.
Es-Souni M., Es-Souni M., Fischer-Brandies H., Assessing the biocompatibility
of NiTi shape memory alloys used for medical applications, Anal Bioanal
Chem., 2005; 381:557-67. Epub.
Hayashi K., Kaneko H., Kawachi S., Saida T., Allergic contact dermatitis and
osteomyelitis due to sternal stainless steel wire. Contact Dermatitis,
1999; 41:115-6.
Haynes D.R., Rogers S.D., Hay S., Pearcy M.J., Howie D.W., The differences in
toxicity and release of bone-resorbing mediators induced by titanium and
cobalt-chromium-alloy wear particles. J Bone Joint Surg Am., 1993;
75:825-34.
Horowitz M.C.,The role of cytokines in bone remodeling. J Clin Dens., 1998;
1:187–98.
120
Literaturverzeichnis
Janeway, C.A., Travers P., Walport M., Shlomichik M., 2002, Immunologie,
5 Auflage.
Jia W., Beatty M.W., Reinhardt R.A., Petro T.M., Cohen D.M., Maze C.R.,
Strom E. A., Hoffman M., Nickel Release from Orthodontic Arch Wires
and Cellular Immune Response to Various Nickel Concentrations. J Bio-
med Mater Res (Appl Biomater), 1999; 48:488–95.
Kanerva L., Forstrom L., Allergic nickel and chromate hand dermatitis induced
by orthopaedic metal implant. Contact Dermatitis, 2001; 44:103-104.
Kapanen A., Danilov A., Lehenkari P., Ryhänen J., Jämsä T., Tuukkanen J.,
Effect of metal alloy surface stresses on the viability of ROS-17/2.8
osteoblastic cells. Biomaterials, 2002; 23:3733–40.
Kapanen A., Biocompatibility of orthopaedic implants on bone forming cells,
Dissertation, Oulun Yliopista, Oulu, 2002.
Karlsson M., Johansson A., Tang L., Boman M., Nanoporous aluminium oxide
affects neutrophil bahaviour. Microscopy research and techniques, 2004;
63:259-65.
Kieswetter K., Schwartz Z., Hummert T.W., Cochran D.L., Simpson J., Dean
D.D., Boyan B.D., Surface roughness modulates the local production of
growth factors and cytokines by osteoblast-like MG-63 cells. J Biomed
Mater Res., 1996; 32:55-63.
Kieswetter K., Schwartz Z., Dean D.D., Boyan B.D., The role of implant surface
characteristics in the healing of bone. Crit Rev Oral Biol Med., 1996;
7:329-45.
Kirkpatrick C.J., Wagner M., Kohler H., Bittinger F., Otto M., Klein .CL., The cell
and molecular biological approach to biomaterial research: a perspective,
J Mater Sci Mater Med., 1997; 8(3):131-41.
121
Literaturverzeichnis
Kobayashi S.D., Voyich J.M., Braughton K.R., DeLeo F.R., Down-regulation of
proinflammatory capacity during apoptosis in human polymorphonuclear
leukocytes. J Immunol., 2003; 170: 3357-68.
Köller M., Wachtler P., David A., Muhr G., König W., Arachidonic acid induces
DNA-fragmentation in human polymorphonuclear neutrophil granulo-
cytes. Infammation, 1997; 21:463–74.
Köller M., Kutscha-Lissberg F., Brom J., Weidinger G., Muhr G., Influence of
low molecular weight heparin (certoparin) and unfractionated heparin on
the release of cytokines from human leukocytes. Inflammation, 2001; 25:
331-8.
Lee A., Whyte M.K.S., Haslett C., Inhibition of apoptosis and prolongation of
neutrophil functional longevity by inflammatory mediators. J Leuko Biol.,
1993; 54:283–8.
Leuenroth S., Lee C., Grutkoski P., Keeping H., Simms H,H., Interleukin-8-in-
duced suppression of polymorphonuclear leukocyte apoptosis is medi-
ated by suppressing CD95 (Fas/Apo-1) Fas-1 interactions. Surgery,
1998; 124:409–17.
Lewis J.B., Randol T.M., Lockwood P.E., Wataha J.C., Effect of subtoxic con-
centrations of metal ions on NFkappaB activation in THP-1 human
monocytes. J Biomed Mater Res A., 2003; 64:217-24.
Lipscomb I.P., Nokes L.D.M., The Application of Shape Memory Metals in Medi-
cine, Paston Press, Norfolk, 1996; 153.
Maianski N.A., Roos D., Kuijpers T.W., Tumor necrosis factor alpha induces a
caspase-independent death pathway in human neutrophils. Blood, 2003;
101:1987–95.
122
Literaturverzeichnis
Mathelier-Fusade P., Vermeulen C., Leynadier F., Allergy in women. Allerg Im-
munol, 2001; 33:395-8.
Menne T., Quantitative aspects of nickel dermatitis. Sensitization and eliciting
threshold concentrations. Sci Total Environ., 1994; 148:275-81.
Mickelson J.K., Lakkis N.M., Villareal-Levy G., Hughes J., Smith C.W., Leuko-
cyte Activation With Platelet Adhesion After Coronary Angioplasty: A
Mechansim for Recurrent Disease? J Am Coll Cardiol, 1996; 28: 345-53
Nattrass C., Ireland A.J., Sherriff M., The effect of environmental factors on
elastomeric chain and nickel titanium coil springs. Eur. J. Orthodont.,
1998; 20:169.
Nielsen N.H., Menne T., Nickel sensitization and ear piercing in an unselected
Danish population. Glostrup Allergy Study. Contact Dermatitis, 1993;
29:16-21.
Otto M., Wahn B., Kirkpatrick C.J., Modification of human polymorphonuclear
neutrophilic cell (PMN)-adhesion on biomaterial surfaces by protein
preadsorption under static and flow conditions. J Mater Sci Mater Med.,
2003; 14:263-70.
Plant S.D., Grant D.M., Leach L., Behaviour of human endothelial cells on sur-
faces modified NiTi alloy. Biomaterial, 2005; 26:5359:67
Riepe G., Heintz C., Kaiser E., Chakfe N., Morlock M., Delling G., Imig H., What
can we learn from explanted endovascular devices? Eur J Endovasc
Surg., 2002; 24:117-22.
Rocher P., El Medawar L., Hornez J.C., Traisnel M., Breme J., Hildebrand H.F.,
Biocorrosion and cytocompatibility assessment of NiTi shape memory
alloys. Scripta Materialia, 2004; 50:255–60.
123
Literaturverzeichnis
Ryhänen J., Niemi E., Serlo W., Niemela E., Sandvik P., Pernu H., Salo T., Bio-
compatibility of nickel-titanium shape memory metal and its corrosion be-
havior in human cell cultures. J Biomed Mater Res., 1997; 35:451-7.
Ryhänen J., Kallioinen M., Tuukkanen J., Junila J., Niemelä E., Sandvik P.,
Serlo W., In vivo biocompatibility evaluation of nickel-titanium shape
memory metal alloy: Muscle and perineural tissue responses and encap-
sule membrane thickness. J Biomed Mater Res., 1998; 41:481-88.
Ryhänen J., Biocompatibility evaluation of nickel-titanium shape memory metal
alloy. Dissertation, Oulun Yliopista, Oulu, 1999.
Ryhänen J., Biocompatibility of Nitinol. Min Invas Ther & Allied Technol., 2000;
9:99-106.
Schneevoigt R., Haase A., Eckardt V.L., Harzer W., Bourauel C., Laboratory
analysis of superelastic NiTi compression springs. Med. Eng. Phys.,
1999; 21:119.
Shabalovskaya S.A., On the nature of the biocompatibility and on medical ap-
plications of NiTi shape memory and superelastic alloys. Biomed Mater
Eng., 1996; 6:267-89.
Shabalovskaya S.A., Surface, corrosion and biocompatibility aspects of Nitinol
as an implant material. Bio-Medical Materials and Engineering, 2002;
12:69–109.
Shih C.C., Lin S.J., Chen Y.L., Su Y.Y., Lai S.T., Wu G.J., Kwok C.F., Chung
K.H., The cytotoxicity of corrosion products of nitinol stent wire on cul-
tured smooth muscle cells. J Biomed Mater Res., 2000; 5:395-403.
Shim H.M., Oh K.T., Woo J.Y., Hwang C.J., Kim K.N., Corrosion resistance of
titanium-silver alloys in an artificial saliva containing fluoride ions. J Bio-
med Mater Res B Appl Biomater., 2005; 73B:252-59.
124
Literaturverzeichnis
Takebe J., Champagne C.M., Offenbacher S., Ishibashi K., Cooper L.F., Ti-
tanium surface topography alters cell shape and modulates bone
morphogenetic protein 2 expression in the J774A.1 macrophage cell line.
J Biomed Mater Res., 2003; 64A:207-16.
Tan J., Shen H., Carter K.L., Saltzman W.M., Controlling human poly-
morphonuclear leukocytes motility using microfabrication technology. J
Biomed Mater Res., 2000; 51:694-702.
Thierry B., Tabrizian M., Trepanier C., Savadogo O., Yahia L., Effect of surface
treatment and sterilization processes on the corrosion behavior of NiTi
shape memory alloy. J Biomed Mater Res., 2000; 51:685-93.
Thierse H.J., Moulon C., Allespach Y., Zimmermann B., Doetze A., Kuppig S.,
Wild D., Herberg F., Weltzien H.U., Metal-protein complex-mediated
transport and delivery of Ni2+ to TCR/MHC contact sites in nickel-spe-
cific human T cell activation. J Immunol., 2004; 172:1926-34.
Thomas P., Allergie durch Implantatwerkstoffe. Orthopäde, 2003; 32:60–4.
Thomson A. (Ed.), The Cytokine Handbook, third ed., 1998, Academic Press,
San Diego.
Trepanier C., Tabrizian M., Yahia LH., Bilodeau L., Piron DL., Effect of modifi-
cation of oxide layer on NiTi stent corrosion resistance. J Biomed Mater
Res., 1998; 43:433-40.
Wataha J.C., Hanks C.T., Craig R.G., In vitro effects of metal ions on cellular
metabolism and the correlation between these effects and the uptake of
the ions. J Biomed Mater Res., 1994; 28:427-33.
125
Literaturverzeichnis
Wataha C.J., Lockwood P.E., Marek M., Ghazi M., Ability of Ni-containing bio-
medical alloys to acitvate monocytes and endothelial cells in vitro. J Bio-
med Mater Res., 1997; 35:451-57.
Wataha J.C., Lockwood P.E., Schedle A., Effect of silver, copper, mercury, and
nickel ions on cellular proliferation during extended, low-dose exposures.
J Biomed Mater Res., 2000; 52:360-4.
Wataha J.C., Lewis J.B., Volkmann K.R., Lockwood P.E., Messer R.L.,
Bouillaguet S., Sublethal concentrations of Au (III), Pd (II), and Ni(II) dif-
ferentially alter inflammatory cytokine secretion from activated mono-
cytes. J Biomed Mater Res B Appl Biomater., 2004; 69:11-7.
Watari F., Yokoyama A., Kawasaki T., Ohmori M., Hirai T., Gradient tissue re-
action induced by functionallygraded material. Sixth international Sympo-
sium on Functionally Graded Materials, Estes Park, CO, USA 2000.
Wever D.J., Veldhuizen A.G., de Vries J., Busscher H.J., Uges D.R., van Horn
J.R., Electrochemical and surface characterization of a nickel-titanium
alloy. Biomaterials, 1998; 19:761-9.
Wever D.J., Veldhuizen A.G., Sanders M.M., Schakenraad J.M., van Horn J.R.,
Cytotoxic, allergic and genotoxic activity of a nickel-titanium alloy. Bio-
materials, 1997; 18:1115-20.
Williams D., Revisiting the definition of biocompatibility. Med Device Technol.,
2003; 14:10-3
Willmann G., Coating of implants with hydroxapatite-material connections be-
tween bone and metal. Adv Eng Mater., 1999; 1:95–105.
Wintermantel E., Mayer J., Ruffieux K., Bruinink A., Eckert KL., Biomaterialien -
humane Toleranz und Integration. Chirurg., 1999; 70:847-57
126
Literaturverzeichnis
Yahia L., Shape Memory Implants. Springer, Berlin, 2000; 349.
127
Erklärung
ERKLÄRUNG
Hiermit erkläre ich, dass ich die Arbeit selbständig verfasst und bei keiner
anderen Fakultät eingereicht und dass ich keine anderen als die angegebenen
Hilfsmittel verwendet habe. Es handelt sich bei der heute von mir eingereichten
Dissertation um fünf in Wort und Bild völlig übereinstimmende Exemplare.
Weiterhin erkläre ich, dass digitale Abbildungen nur die originalen Daten
enthalten und in keinem Fall inhaltsverändernde Bildbearbeitung vorgenommen
wurde.
Bochum, den
___________________________________
128
Curriculum Vitae
Curriculum Vitae
Denise Bogdanski, geboren 20.09.1974 in Gelsenkirchen, unverheiratet, keine Kinder seit August 2001 Promotion in der Chirurgischen Forschung der BG-
Kliniken Bergmannsheil Bochum, im Rahmen des Sonderforschungsbereich Formgedächtnislegierungen (459) der Ruhr-Universität Bochum
02.2001-07.2001 Wissenschaftliche Mitarbeiterin in der Tierphysiologie
an der Ruhr-Universität Bochum
Hochschulbildung/ Qualifizierung 10.1994 − 01.2001 Studium der Biologie Abschluß: Diplom
Thema der Diplomarbeit: Die Mineralisierung des Achsenskeletts bei Xiphophorus helleri
Schulausbildung
08.1981− 05.1994 Grundschule und Gesamtschule in Gelsenkirchen Abschluß: Allgemeine Hochschulreife
Arbeitstätigkeiten/ Praktika 07.1994 − 09.1994 Praktikum bei herbert dahm datensysteme im Bereich
Rechnungswesen, Personalwesen, Elektronische Datenverarbeitung
10.1997− 01.2001 Studentische Hilfskraft am Lehrstuhl für Tierphysiologie
in der Arbeitsgruppe für Vergleichende Endokrinologie (u.a. Tätigkeiten in der Zucht von X. helleri)
02.1998 − 06.1999 Mitarbeit an der Entwicklung und Erstellung einer CD-
Rom über die mikroskopische Anatomie der Wirbeltiere bei der Firma bioscop
129
Eigene Publikationen
Eigene Publikationen Bogdanski D., Köller M., Müller D., Muhr G., Brahm M., Buchkremer A., Stöver
D., Choi J., Epple M., Easy assessment of the biocompatibility of nitinol
by in-vitro cell culture experiments on a functionally graded Ni-NiTi-Ti
material. Biomaterials 23 (2002) 4549-4555.
Bogdanski D., Köller M., Bram M., Stöver D., Buchkremer H.P., Choi J., Epple
M., Muhr G., Schnelle Analyse der Biokompatibilität mittels gradierter
Probekörper am Beispiel von Ni-NiTi-Ti, Biomedizinische Technik 47
Suppl.1 (2002) 500-502.
Choi J., Bogdanski D., Köller M, Müller D, Esenwein SA, Muhr G, Epple M.,
Calcium phosphate coating on nickel-titanium shape memory alloys.
Coating procedure and adherence of leukocytes and platelets.
Biomaterials 24 (2003) 3689-3696.
Bogdanski D., Epple M., Esenwein SA., Muhr G., Petzoldt V., Prymak O.,
Weinert K., Köller M., Biocompatibility of calcium phosphate-coated and
of geometrically structured Nickel-Titanium (NiTi) by in-vitro testing
methods. Materials Science and Engineering A 378 (2004) 527–531
Bogdanski D., Esenwein SA., Prymak O., Epple M., Muhr G., Köller M.,
Inhibition of PMN apoptosis after adherence to dip-coated calcium
phosphate surfaces of a shape memory alloy, Biomaterials 25 (2004)
4627-4632.
Prymak O., Bogdanski D., Esenwein SA., Köller M., Epple M., NiTi shape
memory alloys coated with calcium phosphate by plasma-spraying.
Chemical and biological properties, Materialwissenschaften und
Werkstofftechnik 35 (2004) 346-351.
Bogdanski D., Esenwein SA., Prymak O., Epple M., Muhr G., Köller M.,
"Release of leucocyte mediators after contact to coated and non-coated
NiTi-SMA", Biomedizinische Technik 49 (2004) Suppl. 2 (2004) 562-563.
130
Danksagung
Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. M. Köller für die Themenstellung und
für die wissenschaftliche Unterstützung sowie für die Möglichkeit, meine Arbei-
ten zu publizieren und auf Fachkongressen zu präsentieren.
Ebenfalls herzlichen Dank an Herrn Prof. Dr. Hoffmann für seine freundliche
Bereitschaft zur Übernahme des Zweitgutachtens.
Herzlichen Dank gilt Herrn Prof. M. Epple, Institut für anorganische Chemie der
Universität Duisburg-Essen, für die Bereitstellung der beschichteten NiTi-
Probekörper.
Herzlicher Dank gilt den Mitarbeiterinnen der Chirurgischen Forschung Frau
Peter, Frau Zimmermann, Simone Höhler-Wefers und Vanessa Kroll die stets
bereit waren Hilfestellung zu leisten und nicht zuletzt zu einem sehr ange-
nehmen Arbeitsklima beitrugen.
Tanja Schlüter, sie stand mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite und hatte im-
mer ein offenes Ohr für mich, herzlichen Dank!
Schließlich gilt mein besonderer Dank meinen Eltern, Sandra, Silke und Dirk,
die mich ständig motivierten und unterstützten.
131