Utilizzo di sistemi LC/MS e
LC/MS-MS nell'ambito del
TDM dei farmaci anti-infettivi
Lorena Baietto (MSc, PhD)
Laboratorio di Farmacologia Clinica e Farmacogenetica
Università degli Studi di Torino
Facoltà di Medicina e Chirurgia, Dipartimento di Scienze Mediche
Ospedale Amedeo di Savoia (Torino)
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
IL THERAPEUTIC DRUG MONITORING
DEFINIZIONE: Il monitoraggio terapeutico dei farmaci è un processo che consiste nell'utilizzare le concentrazioni dei farmaci nei liquidi biologici, i principi della farmacocinetica e i criteri della farmacodinamica per ottimizzare la terapia farmacologica del singolo individuo
ridurre i rischi di effetti collaterali, o tossici, ed aumentare, quindi, i benefici dati dal farmaco al paziente .
MIGLIORARE L’EFFICACIA E RIDURRE LA COMPARSA DI RESISTENZA
TDM e TERAPIA
ANTINFETTIVA:
Correlare l’efficacia e la tossicità di un farmaco con le
concentrazioni plasmatiche
Studiare le interazioni con altri farmaci co-somministrati
Valutare l’efficacia e la tossicità in pazienti con alterazioni
fisiopatologiche ( epatopatia, insufficienza renale,
gravidanza, ecc.)
Valutare l’efficacia e tossicità in popolazioni speciali
(anziani, neonati)
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi validati in laboratorio per il dosaggio dei farmaci
antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
HPLC (Waters) Binary pump model
1525 717
Micromass ZQ mass detector
Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)
valori di accuratezza e precisione < 15%
Procedura di estrazione
50 µl di IS Campioni vortexati per 10 sec
Campioni sonicati (cycle 0.75;
amplitude 80%)
Campioni centrifugati
(7000 x g, 10 min a 4°C
Surnatante trasferito in
provette di vetro Surnatante asciugato a
60°C e ricostituito
Iniezione in HPLC-MS
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
HPLC (Waters) Binary pump model
1525 717
Micromass ZQ mass detector
Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)
ARGOMENTI TRATTATI:
Utilità del TDM dei farmaci anti-infettivi in campo clinico
Metodi che abbiamo validato in laboratorio per il
dosaggio dei farmaci antinfettivi nella pratica clinica
Esempi di utilizzo dei sistemi LC-MS e LC-MS-MS nel
dosaggio di alcuni farmaci:
- HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci antifungini in
plasma ed in plasma spottato su supporto Dried Plasma
Spots
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della colistina in plasma
- UPLC-MS-MS nel dosaggio della daptomicina in
plasma e liquor
HPLC-MS nel dosaggio plasmatico
dei farmaci antifungini
Antifungini triazoli
Prevenzione e terapia delle infezioni fungine invasive
Farmacocinetica non lineare
Alta variabilità tra i pazienti
Hope WW et al. Curr Opin Infect Dis. 2008;21:580-586.
Efficacy cut-off in prophylaxis
Itraconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Posaconazole: Ctrough > 0.5 mg/L
Efficacy cut-off in therapy
Itraconazole: Ctrough > 1 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 2 mg/L
Posaconazole: Ctrough > 1 mg/L
Toxicity cut-off in therapy
Itraconazole: Ctrough > 17.1 mg/L
Voriconazole: Ctrough > 5.5 mg/L
Posaconazole: not defined
Andes D et al. Antimicrob Agents Chemother 2009;53(1):24-34; Lestner JM et al. Clin Infect Dis. 2009;49:928-930.
INEFFICACY
TOXICITY
Pla
sma
con
cen
trat
ion
s narrow
therapeutic window
Ctrough
Time
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
HPLC (Waters) Binary pump model
1525 717
Micromass ZQ mass detector
Empower Pro software Atlantis dC-18 3µ column (150mm×2.1mm id)
Procedura di estrazione: 50 µl di IS 200 µl di acetonitrile 200 µl di campione •Vortex per 10 sec •Cetrifug. per 10 min a 15000 rpm •Diluire SN 1:1 con acqua •Iniezione in HPLC-MS
Parametri valutati secondo le linee guida FDA1 Accuratezza Precisione Selettività Sensibilità Valori di accuratezza
e precisione < 15% ACCURATEZZA e PRECISIONE
Drugs Nominal value
(mg/L) Accuracy
(%) Precision (R.S.D.%)
Intra-day Inter-day
ITC
0.10 6.23 9.12 6.34
1.50 2.30 4.30 8.70
3.00 0.14 5.72 12.01
5.00 4.60 7.86 12.64
PSC
0.10 8.08 4.89 8.70
1.50 1.30 3.70 7.10
3.00 3.83 4.20 6.61
5.00 4.99 5.77 6.96
VRC
0.12 1.50 5.81 13.30
1.50 1.70 3.60 9.10
4.00 5.78 4.09 8.09
6.00 9.55 5.90 6.09
1 FDA. Guidance for Industry Bioanalytical Method Validation; 2001.
SELETTIVITA’ e SENSIBILITA’
Assenza di picchi interferenti in plasma bianco
Buon limite di quantificazione (LOQ) che permette di quantificare anche le basse concentrazioni in modo preciso e accurato.
LOQ
Blank plasma
HPLC system
Detector Extraction procedure
Dry Step LLOQ
(mg/L)
Time of analysis
(min) References
HPLC UV SPE Yes 0.05-0.15 19 Gordien et al. 2009
HPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.010 nr Chahbouni et al. 2010
HPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.100 15 Verdier et al. 2010
HPLC MS Protein precipitation
No 0.030 15 Baietto et al. 2010
UPLC MS-MS Protein precipitation
No 0.020 5.1 Decosterd et al. 2010
UPLC UV Protein precipitation
Yes 0.050 6 Wissen et al. 2012
HPLC MS-MS SPE Yes 0.001 3 Beste et al. 2012
Gordien JB et al. J Pharm Biomed Anal 2009;50(5):932-8; Chahbouni A at al. Ther Drug Monit 2010;32(4):453-7; Verdier MC et al. Clin Chem Lab Med 2010;48(10):1515-22; Baietto L et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(8):3408-13; Decosterd LA et al. Antimicrob Agents Chemother 2010;54(12):5303-15; Wissen at al. Beste KY et al. Clin Chim Acta 2012;413(1-2):240-5.
• Facile e rapida procedura di estrazione (turn around time = 1 day) • Piccolo volume di plasma necessario • Utilizzo della Quinoxaline come IS • Curva di calibrazione adatta alle concentrazione attese nella pratica
clinica • Ad oggi abbiamo analizzato circa 700 campioni provenienti dal Regina
Margherita e Molinette
MS vs UV
• MS permette di avere migliore sensibilità e
specificità rispetto a UV.
• Procedura di estrazione su MS è più
rapida e non richiede asciugatura (curva, qc e 2
campioni estratti in 30 min con metodo HPLC-MS).
• Metodo su MS richiede minor volume di
plasma (200 µl vs 300 µl).
• Corsa su MS più rapida (15 min vs 18
min).
• Possibilità di fare più iniezioni dello stesso
campione (5 vs 1).
Certificato relativo all’Interlaboratory Quality Control Program for TDM of antifungal drugs.
HPLC-MS nel dosaggio dei farmaci
antifungini in plasma spottato su supporto
Dried Plasma Spots
Dried blood spots (DBS) o dried plasma spots (DPS)?
DPS
DBS
• Nuovo metodo di raccolta dei campioni
• Campioni di sangue e di plasma possono essere conservati e inviati a temperatura ambiente (solo per farmaci stabili a R.T.)
• DPS migliori di DBS (studi clinici si riferiscono a livelli plasmatici; per DPS non è necessario correggere la concentrazione plasmatica per l’ematocrito).
1. 50 uL di plasma sono spottati su DSSD 2. Filtri vengono asciugati a r.t. per 30 min 3. Filtri vengono arrotolati e trasferiti in una provetta 4. Aggiunta di soluzione estraente e IS 5. Effettuato il tumbling per 15 min at 40 rpm 6. Fase organica è evaporata a 50°C 7. Campioni ricostituiti e iniettati in HPLC-MS
PROCEDURA DI ESTRAZIONE
Stabilità a temperatura ambiente dei triazoli su DPS
dopo 2 settimane degradazione <17%.
Baietto L et al. J. Antimicrob. Chemother. 2012;67:2645-2649
75
80
85
90
95
100
105
110
0 5 10 15 20 25 30
Pe
rce
nta
ge
re
ma
inin
g (
%)
Time (day)
ITC
PSC
VRC
Correlazione tra “metodo DPS” e “metodo non-DPS”
r2=0.994
r2=0.959
r2=0.991
Alta correlazione tra i due metodi di estrazione. Linear regression statistically significant (P<0.0001)
UPLC-MS-MS e dosaggio plasmatico
della colistina
COLISTINA
Antibiotico lipopeptidico usato come ultima “chance” di difesa
contro Psudomonas e Acinetobacter in pazienti critici
Formata da 30 polimixine, le principali sono la colistina A e la
colistina B
Formulazione orale → COLISTINA SULFATO
Formulazione endovena → COLISTIMETATO (pro-farmaco)
COLISTINA
Idrolisi
in vivo Idrolisi tempo, matrice e
temperatura dipendente
UPLC-MS-MS
Alta selettività dell’analisi
(molti farmaci concomitanti)
Alta sensibilità (volume di plasma piccolo e
basse concentrazioni plasmatiche attese,
precipitazione e iniezione diretta)
Tempi di analisi in UPLC più rapidi
Riduzione consumo di
solvente
Procedura di estrazione
Colistina libera
• Soluzione precipitante + IS
(polimixina)
• 200 µl di plasma
• Vortex
• Centrifug a 14000 rpm x 10
min a 4°C
• Surnatante trasferito in vials e
diluito 1:1 con acqua
• Iniezione in UPLC
Colistina totale
• IS (polimixina)
• 200 µl di plasma
• Acido solforico 0.5 M
• Aspettare 30 min
• NaOH 1M
• Soluzione precipitante
• Vortex
• Centrifug a 14000 rpm x 10
min a 4°C
• Surnatante trasferito in vials e
diluito 1:1 con acqua
• Iniezione in UPLC
Instrument Pump model Autosampler model Detector Software Column
UPLC (Waters) ACQUITY Binary Solvent
Manager ACQUITY Sample
Manager TQ Detector MassLynx Acquity UPLC HSS C18 1.8µm (2.1x150mm)
Colistimetato
min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80
%
18
F1:MRM of 1 channel,ES+
578.80>101.20
111025 Mix CMS NO idro 1
Mix Mix
6.100e+0013.30
2.33
2.20
2.122.31
2.23
2.83
2.472.35
2.732.60
2.55
2.48
2.69 2.77
3.173.00
2.99
2.86
2.94
2.93
3.02
3.11
3.21
3.27
3.85
3.60
3.543.48
3.333.35
3.36
3.43
3.69
3.63
3.79
3.87
min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80
%
0
F2:MRM of 1 channel,ES+
585.7>101.2
111026 CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2)
autosampler stability stabilita' 24 h idro
8.733e+004Colistina A
3.25
4006.17
86653
3.06
Colistimetato idro → Colistina A totale Colistimetato idro → Colistina B totale
min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80
%
0
F1:MRM of 1 channel,ES+
578.80>101.20
111026 CMS idro 24h 1 Smooth(Mn,2x2)
autosampler stability stabilita' 24 h idro
5.094e+003Colistina B
2.71
242.66
4929*
2.82
2.89
3.33
Colistimetato no idro → Colistina A Colistimetato no idro → Colistina B
min2.20 2.30 2.40 2.50 2.60 2.70 2.80 2.90 3.00 3.10 3.20 3.30 3.40 3.50 3.60 3.70 3.80
%
26
F2:MRM of 1 channel,ES+
585.7>101.2
111025 Mix CMS NO idro 1
Mix Mix
4.600e+0013.40
2.27
2.26
2.132.24
2.15
2.21
3.372.582.51
2.47
2.322.45
2.35
2.38
3.00
2.922.812.80
2.60
2.68
2.73
2.90
2.85
2.99
Colistina A
3.26
0.37
14
3.03
3.193.10
3.16
3.34
3.31
3.64
3.46
3.55
3.51
3.73
3.65
3.69
3.77
3.87
3.82
[10 µg/ml]
0
2,000
4,000
6,000
8,000
10,000
12,000
14,000
16,000
18,000
20,000
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3
Co
ncen
trazio
ne p
lasm
ati
ca C
olisit
ina (
ng
/mL
)
Timing (hour)
Concentrazioni plasmatiche colistina
Colistina Totale
Colistina libera
Colistimetato
HPLC system Detector Extraction procedure
Dry Step Time of analysis
(min) References
HPLC FL (derivatizzazione) SPE No 18 Li et al. 2002 (in rat plasma)
HPLC MS-MS Protein precipitation
No 10 Jansson et al. 2009
HPLC MS-MS SPE Yes 3.8 Gobin et al. 2010
UPLC MS-MS Protein precipitation
No 6 Baietto
Li J et al. AAC 2002;46(10):3304-3307; Jansson B et al. J.Pharm.Biomed.Analys. 2009(49):760-767; Gobin P et al. AAC 2010;54(5):1941-1948.
Effetto matrice
• Alterazione dell’efficienza della ionizzazione dovuto alla
presenza di sostanze coeluenti che può compromettere
l’affidabilità dei risultati.
• Matrici biologiche sono miscele molto complesse
• Interferenza più frequente nel caso si utilizzi
spettrometro a singolo quadrupolo piuttosto che a triplo
quadrupolo.
• Rimedi:
→ ottimizzare processo estrazione
→ ottimizzare separazione cromatografica
• Tempi di ritenzione
diversi
• Recupero >90%
• Effetto matrice <15%
UPLC-MS-MS e dosaggio della daptomicina
in plasma e liquor
• Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a
carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi
del cuore destro sostenuti da MRSA.
• Valida opzione terapeutica nel trattamento delle
infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale
come le meningiti sostenute da MRSA.
Daptomicina
Daptomycin TDM
Efficacy cut-off: Cmax > 60 mg/L
Toxicity cut-off: Cmin > 24.3 mg/L
Cmax
Cmin
Pea et al. 2011. The Annals of Pharmacotherapy. July/August, Volume 45,e37;
Bhavnani SM, Rubino CM, Ambrose PG, Drusano GL. 2010. Clin Infect Dis ;50:1568-74)
Daptomicina
• Antibiotico lipopeptidico usato nelle infezioni a
carico di cute e tessuti molli e nelle endocarditi
del cuore destro sostenuti da MRSA.
• Valida opzione terapeutica nel trattamento delle
infezioni a carico del Sistema Nervoso Centrale
come le meningiti sostenute da MRSA.
valutare la farmacocinetica liquorale della daptomicina in pazienti
portatori di Derivazione Ventricolare Esterna (DVE) con sospetto di
SIRS-Sepsi o Shock settico di qualsiasi origine, richiedente una terapia
empirica per cui la somministrazione di Daptomicina è indicata
Compound name: Daptomicina
Coefficient of Determination: R^2 = 0.998984
Calibration curve: -2.729e-005 * x̂ 2 + 0.0168139 * x
Response type: Internal Std ( Ref 2 ), Height * ( IS Conc. / IS Height )
Curve type: 2nd Order, Origin: Force, Weighting: 1/x, Axis trans: None
ng/ml-0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
Re
sp
on
se
-0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
ng/ml
Re
sid
ua
l
9.693
min2.25 2.50 2.75 3.00 3.25 3.50 3.75 4.00 4.25 4.50 4.75
%
0
F2:MRM of 2 channels,ES+
313.0926>246.4657
121120 QC H 1 plasma Smooth(Mn,6x6)
qc qc
1.202e+005QX (IS)
2.88
10537.46
119923
min
%
0
F1:MRM of 4 channels,ES+
811.2>802.5
121120 QC H 1 plasma Smooth(Mn,5x5)
qc qc
1.996e+005Daptomicina
2.51
12849.00
199370
Sample Name Std. Conc RT IS Area %Dev ng/ml
121120 QC H 1 130 2.51 10537.46 -4.8 123.718
121120 QC M 1 60 2.51 11374.86 -5 56.991
121120 QC L 1 6.5 2.51 11198.31 0.3 6.519
121120 QC H 2 130 2.51 10862.58 2.3 133.015
121120 QC M 2 60 2.51 11170.5 1.7 60.991
121120 QC L 2 6.5 2.51 10382.87 9.2 7.1
121120 QC H 3 130 2.51 10859.4 2 132.557
121120 QC M 3 60 2.51 10939.91 8.9 65.356
121120 QC L 3 6.5 2.51 10790.83 4.7 6.806
121120 QC H 4 130 2.51 11202.6 8.4 140.974
121120 QC M 4 60 2.51 11077.87 9.1 65.455
121120 QC L 4 6.5 2.51 11251.9 4.2 6.775
121120 QC H 5 130 2.51 10939.09 5.5 137.158
121120 QC M 5 60 2.51 10783.08 9.7 65.815
121120 QC L 5 6.5 2.51 11119.61 -1.5 6.401
121120 QC H 6 130 2.51 11334.69 5.1 136.656
121120 QC M 6 60 2.51 11487.65 3.6 62.175
121120 QC L 6 6.5 2.51 10456.14 -8.5 5.95
Analisi daptomicina in plasma
r2 = 0.998
Cromatogrammi relativi a LOQ e bianco estratti da liquor
Daptomicina [0.078 µg/ml]
Vantaggi metodo sviluppato
• Rapida procedura di estrazione
• Ampio range di calibrazione per plasma e
liquor
• Buona accuratezza e precisione del
metodo
• Buona sensibilita’ del metodo
Conclusioni
• Rilevatore massa e massa-massa sono adatti
sia alle analisi di routine, sia alla ricerca perchè
permettono di avere risultati accurati, precisi e
altamente selettivi.
• L’alta sensibilità e specificità permettono di
utilizzare metodi di estrazione rapidi (es.
precipitazione proteica) riducendo i tempi
necessari alla preparazione del campione.
• Prof. Di Perri
• Dr. Antonio D’Avolio
• Dr. Andrea Calcagno
• Prof. Francesco Giuseppe De Rosa
• Prof. Stefano Bonora
• Dott.ssa Jessica Cusato
• Dott. Marco Simiele
• Dott.ssa Alessandra Ariaudo
• Dott. Amedeo De Nicolò
• Dott.ssa Cristina Marra
• Agnese Sofia De Nigris
• Mauro Sciandra
Ringraziamenti