Análise Instrumental
Capítulo 9 – Desenvolvimento e Validação de Métodos
Quantitativos
Prof. Luiz Antonio Mazzini Fontoura
Prof. Carlos Rodolfo Wolf
Análise Instrumental
Capítulo 9 – Desenvolvimento e Validação de Métodos Quantitativos
9.1 Desenvolvimento do método
9.2 Métodos quantitativos
9.2.1 Normalização de áreas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
9.2.3 Superposição da matriz
9.2.4 Adição-padrão
9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
9.3 Validação
9.3.1
Bibliografia:
1. Holler, F. J.; Skoog, D. A.; Crouch, S. R. ; Princípios de Análise Instrumental, 6ª
ed.; Bookman: Porto Alegre, 2009, cap. 26 a 28.
2. Skoog, D. A.; West, D. M; Holler, F. J.; Crouch, S. R. ; Fundamentos de Química
Analítica, Thomson: São Paulo, 2006, cap. 30 a 32.
3. Aquino Neto, F. R.; Nunes, D.; S. S.; Cromatografia, Princípios básicos e
técnicas afins, Interciência, Rio de Janeiro: 2003.
4. Collins, C. H.; Braga, G. L.; Bonato, P. S.; Fundamentos de Cromatografia,
UNICAMP, Campinas: 2006.
5. Valente, A. L. P.; Riedo, C. R. F.; Augusto, F.; Análise Quantitativa por
cromatografia, ChemKeys; http://chemkeys.com/br/2003/10/17/analise-
quantitativa-por-cromatografia/, acessado em novembro de 2011.
6. Ribeiro, F. A. L.; Ferreira, M. M. C.; Morano, S. C.; da Silva, L. R.; Schneider, R.
P.; Quim. Nova, 2008, 31, 164.
7. Ribani, M.; Bottoli, C. B. G.; Collins, C. H.; Jardim, I. C. S. F.; Melo, L. F. C.
Quim. Nova 2004, 27, 771
8. Snyder,L.R. et al Practical HPLC Method Development, 2 ed., Wiley: Nova
Iorque, 1997.
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.1 Desenvolvimento do Método
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
Desenvolvimento do método: qual é o objetivo?
1. Análise de mistura ou um componente?
2. A resolução de todos os componentes é necessária?
3. Precisão, LD e LQ?
4. Quais matrizes?
5. Quantas amostras por análise?
9.1 Desenvolvimento do Método
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
Que tipo de amostra?
1. Soluções prontas para injeção?
2. Diluição, tamponamento, adição de padrão interno?
3. Matriz sólida? Dissolução? Extração?
4. Pré-tratamento? Interferentes? Concentração?
9.1 Desenvolvimento do Método
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
Informações importantes
1. Número de componentes da mistura
2. Estrutura Química
3. Massa molar
4. polaridade
5. volatilidade
9.1 Desenvolvimento do Método
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
CG - Por onde começar?
Variável Valores típicos
T (oC) isoterma inicial gradiente (10 oC min-1),
isoterma final
L (m) 10 - 25
dcoluna (mm) 0,2 -0,3
dfilme (mm) 0,15 – 0,3
Vazão (mL min-1) 1 - 2
Gás de arraste H2 ou He
Vinjeção (mL) 1
Volume de amostra 20 mL
9.1 Desenvolvimento do Método
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
CLAE - Por onde começar?
Variável Sugestão
Dimensão da coluna 15 x 0,46 cm
Tamanho de partícula 5 mm
Fase estacionária C18 ou C8
Fase móvel acetonitrila (100 a 80 %) – tampão
Tipo de tampão fosfato de potássio 25 mM
Vazão 1,4 a 2 mL.min-1
Temperatura 35 a 45 OC
Volume de amostra 20 mL
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação da composição de uma mistura
Todos os componentes devem ser eluídos e detectados
Resposta depende da concentração e da natureza do analito
Fator de resposta: relação entre as respostas dos diversos analitos
Fator de resposta depende do detector
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Mistura padrão: concentrações conhecidas
Relação área/concentração
Área normalizada: percentual
Injeções: três
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação do fator de resposta
álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 3023
i-butílico 0,1964 3074 s-butílico 0,1514 3112
t-butílico 0,1826 3004
S 0,7035 12213
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação do fator de resposta
álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023
i-butílico 0,1964 27,92 3074 s-butílico 0,1514 21,52 3112
t-butílico 0,1826 25,96 3004
S 0,7035 100,00 12213
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação do fator de resposta
álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023 122,8585
i-butílico 0,1964 27,92 3074 110,1099 s-butílico 0,1514 21,52 3112 144,6032
t-butílico 0,1826 25,96 3004 115,7346
S 0,7035 100,00 12213
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação do fator de resposta: mistura de álcoois (CG)
álcool m (g) C (%) A (u.a.) A/C FR n-butílico 0,1731 24,61 3023 122,8585 1,116
i-butílico 0,1964 27,92 3074 110,1099 1,000 s-butílico 0,1514 21,52 3112 144,6032 1,313
t-butílico 0,1826 25,96 3004 115,7346 1,051
S 0,7035 100,00 12213
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)
álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)
n-butílico 1731 i-butílico 3753
s-butílico 2845 t-butílico 1117
S
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)
álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)
n-butílico 1731 1,116 i-butílico 3753 1,000
s-butílico 2845 1,313 t-butílico 1117 1,051
S
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)
álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)
n-butílico 1731 1,116 1551 i-butílico 3753 1,000 3753
s-butílico 2845 1,313 2166 t-butílico 1117 1,051 1063
S 8533
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.1 Normalização de áreas
Determinação da composição de uma mistura de álcoois (CG)
álcool A (u.a.) FR A/FR C (%)
n-butílico 1731 1,116 1551 18,18 i-butílico 3753 1,000 3753 43,98
s-butílico 2845 1,313 2166 25,39 t-butílico 1117 1,051 1063 12,45
S 8533 100,00
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
resposta a concentração
padrão analítico: pureza conhecida
nº pontos ≥ 5 (excluída a origem)
faixa linear dinâmica
fontes de erro: preparo da amostra, preparo de soluções, medidas de
áreas
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Preparo das soluções
solução estoque: matriz
soluções de trabalho: diluições
estabilidade do padrão e das soluções
armazenamento
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Preparo das soluções
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Preparo das soluções: uma solução estoque
soluções de trabalho: diluições da solução estoque
soluções de trabalho: diluições sucessivas
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Preparo das soluções: duas soluções estoque
solução estoque 1: soluções de trabalho ímpares
solução estoque 2: soluções de trabalho pares
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho
expectativa de resposta, limites permitidos
cinco ou mais pontos
três injeções
espaçamento dos pontos
faixa de trabalho
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho
expectativa de resposta é conhecida?
há limites definidos na legislação?
cinco ou mais níveis de concentração
três injeções
espaçamento dos pontos
faixa de trabalho: 50 a 150 % do valor esperado (IUPAC)
faixa de trabalho: 80 a 120 % do valor esperado (ANVISA)
RSD área das injeções < 5 %
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Obtenção da curva: escolha da faixa linear de trabalho
exemplo
c (mg mL-1) Amédia (ua)
1,05 319
1,98 601,2 2,97 896,5
4,01 1211 5,00 1508,8
5,99 1815,9
y = 302,35x + 0,5048 R² = 1
0
500
1000
1500
2000
0 2 4 6 8
A (
u.a
.)
c (mg mL-1)
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Uma amostra problema: três replicatas, três injeções
replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3
Amédia (u.a.) c (mg mL-1)
c (mg mL-1) s IC
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Uma amostra problema: três replicatas, três injeções
replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3
Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1)
c (mg mL-1) s IC
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Uma amostra problema: três replicatas, três injeções
replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3
Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1) 3,28 3,34 3,25
c (mg mL-1) s IC
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.2 Padronização externa com calibração por curva analítica
Uma amostra problema: três replicatas, três injeções
replicata 1 2 3 injeção 1 2 3 1 2 3 1 2 3 A (u.a.) 999,1 990,7 990,5 1001 1020,6 1005,7 972,3 985,4 988,3
Amédia (u.a.) 993,4 1009,1 982,0 c (mg mL-1) 3,28 3,34 3,25
c (mg mL-1) 3,29 s 0,04 IC 0,11
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.3 Superposição da matriz
avalia efeito de interferentes presentes na matriz
matriz isenta do analito semelhante à amostra analítica
soluções de trabalho: matriz fortificada com o analito
adição do padrão à matriz em diversas concentrações
preparação das soluções: procedimento aplicado à matriz
construção da curva analítica
presença de interferentes: erro nos coeficientes angular e linear
análise da amostra analítica
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.4 Adição-padrão
avalia efeito de interferentes presentes na matriz
matriz isenta não disponível
soluções de trabalho: amostra analítica fortificada com o analito
adição do padrão à amostra em diversas concentrações
preparação das soluções: procedimento aplicado à amostra analítica
construção da curva analítica
presença do analito: erro nos coeficientes linear
determinação quantitativa: extrapolação
C na amostra A = 0
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.4 Adição-padrão
exemplo: qual é a concentração do analito na amostra?
expressão do resultado
c (mg mL-1) Amédia (ua)
1,05 974,0
1,98 1256,2 2,97 1551,5
4,01 1866,0 5,00 2163,8
5,99 2470,9 y = 302,35x + 655,5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 2 4 6 8
A (
u.a
.)
c (mg mL-1)
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.4 Adição-padrão
exemplo: qual é a concentração do analito na amostra?
expressão do resultado: 2,16 mg mL1
c (mg mL-1) Amédia (ua)
1,05 974,0
1,98 1256,2 2,97 1551,5
4,01 1866,0 5,00 2163,8
5,99 2470,9 y = 302,35x + 655,5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
0 2 4 6 8
A (
u.a
.)
c (mg mL-1)
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto
Características do padrão interno
ausente na amostra
estruturalmente semelhante ao analito
quimicamente estável
tempo de retenção semelhante ao do analito
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto
Características do padrão interno
ausente na amostra
estruturalmente semelhante ao analito
quimicamente estável
tempo de retenção semelhante ao do analito
bem resolvido
comportamento semelhante ao do analito nas etapas de
preparação da amostra
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto
Vantagens
elimina erros de preparação da amostra
elimina o erro do volume injetado
elimina o erro da oscilação do sinal
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.5 Padronização interna com calibração por um ponto
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante
do padrão interno
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante
do padrão interno
curva analítica: Aanalito / API versus Canalito
solução da amostra contém padrão interno
bCaA
Aanalito
PI
analito
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
soluções de trabalho contém uma quantidade conhecida e constante
do padrão interno
curva analítica: Aanalito / API versus Canalito
solução da amostra contém padrão interno
bCaA
Aanalito
PI
analito
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
exemplo
Can (mg mL-1) CPI (mg mL-1) Aan API A/A 1,01 2,45 2087 4512 0,462622 1,99 2,45 4081 4540 0,899042 3,02 2,45 6177 4523 1,365841 4,00 2,45 8172 4522 1,807165 5,02 2,45 10247 4528 2,263185
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
exemplo
y = 0,4496x + 0,0072
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0
Aa
na
lito/A
PI
c (mg mL-1)
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
exemplo: uma amostra foi preparada contendo a mesma
concentração de padrão interno adicionado às soluções de trabalho
com o qual a curva analítica foi construída. Qual é a concentração do
analito na solução, se a razão entra as áreas do seu pico e o do padrão
interno no cromatograma foi igual a 1,71?
9.2 Métodos Quantitativos
Análise Instrumental Capítulo 8 – Introdução às separações cromatográficas
9.2.6 Padronização interna com calibração por curva analítica
exemplo: uma amostra foi preparada contendo a mesma
concentração de padrão interno adicionado às soluções de trabalho
com o qual a curva analítica foi construída. Qual é a concentração do
analito na solução, se a razão entra as áreas do seu pico e o do padrão
interno no cromatograma foi igual a 1,71? Can = 3,79 mg mL-1.