VIRUSOLOĢIJA(VĪRUSI UN ĀRPUSHROMOSOMU ĢENĒTISKIE ELEMENTI)
VĪRUSU UN ĀRPUSHROMOSOMU ELEMENTU GRUPAS
Transpozoni un plazmīdas
• Vispārējs raksturojums - rekombinācijas veidi
• DNS transpozoni
• Retrotranspozoni
• Retropozoni
Transpozoni
Transpozonu vispārējs raksturojums Rekombinācijas veidi:
Vispārējā jeb homoloģiskā rekombinācija (meijoze, garas homologas DNA secības)
Sait-specifiskā (starp divām noteiktām “specifiskām” DNA secībām, piem., un E.coli)
Transpozīcija jeb nelikumīgā rekombinācija illegitimate (viena DNS secība tiek iestarpināta citā bez kādas homoloģijas prasībām, DNS pavedieni tiek pārrauti un atkal savienoti)
Transpozoni
2x103 - 4x104 b.p. garas NS molekulas, spēj pārvietoties no viens integrācijas vietas uz citu viena replikona robežās vai starp replikoniem šūnā, nes gan pārvietošanās funkcijai nepieciešamos gēnus, gan arī papildus funkciju, piem., pretantibiotiku rezistences gēnus.
Transpozonu atklāšana
• 1949.g. - Nestabilās graudu krāsas mutācijas kukurūzai; B. McClintock
• 1963. - 1965. g.g. transpozīcijas baktēriju gal operonā, P. Starlinger, S. Cohen
Struktūra Gēni Pārvietošanāsveids
Piemēri
Ī si, invertēti DNAatkārtojumi galos
Transpozāze(tnpA)Rezolvāze(tnpR)
DNS formā;+/- replikācija
P-elementi (Drosophila)Ac-Ds (Zea mais)Tn3; IS1 (Escherichiacoli)
DNS transpozoni
60.-tie gadi: Shapiro (ASV), Satrlinger (Vācija) transpozīcija baktērijās
IS1 - 768 bp; IS2 - 1442 bp; IS5 - 1195 bp;
Tn 1000 - 9.5 kbp
Baktēriju vienkāršie DNS transpozoni:
Inserciju (IS) elementi
750 - 1x104 b.p. garas DNS molekulas, spēj pārvietoties no viens integrācijas vietas uz citu viena replikona robežās vai starp replikoniem šūnā, nes tikai pārvietošanās funkcijai nepieciešamos gēnus.
Baktēriju vienkāršie DNS transpozoni:
Tn3 (ampicilīna rezistences) grupa
Saliktie transpozoni (baktērijas):
• Tn 5 (KmR)invertēti flankējošo IS elementu atkārtojumi;
• Tn 9 (Cm R)tieši flankējošo IS elementu atkārtojumi;
• Tn 10 (TcR)
Saliktu transpozonu veidošanās
Transpozīcijas veidi:
• Replikatīvā transpozīcija - transpozons pārvieto savu kopiju citā DNA rajonā, saglabājot arī veco lokalizāciju (kointegrāts, resolvāze Tn 3; IS1);
• Konservatīvā transpozīcija - transpozons pārvietojas no vienas vietas genomā uz citu, neatstājot mutācijas donora saitā (Tn 5; IS1?).
Transpozonu vispārējs raksturojums
Saimnieka genoma secību atkārtojumu veidošanās transpozīcijas procesā
Nature Rev. Genetics, May, 2002
Augu transpozoni
Nature Rev. Genetics, May, 2002
Autonomie un atkarīgie replikatīvie transpozoni
Miniature Inverted-repeats Transposable Elements; MITE
Augu vienkāršie DNS transpozoni:
Ripojošā gredzena tipa ssDNS transpozoni – helitroni (2001)
Vladimir V. Kapitonov and Jerzy Jurka, TRENDS in Genetics Vol.23 No.10
The RepHel protein composed of the Rep and SF1 DNA Hel domains is shown in red, and the ssDNA-binding RPA is shown inblue. In some species, the RepHel protein contains additional domains: apurinic EN (in black); cysteine protease (CPR, in green); and different types of zinc fingers (ZF, inbrown).
Ripojošā gredzena tipa ssDNS transpozoni – helitroni
Saliktu transpozonu veidošanās ar
helitronu līdzdalību
synthesis-dependent strand annealing
Bernard La Scola et al.
The virophage as a unique parasite of the giant mimivirus Nature 455, 100-104 (September 4, 2008)
Yutin et al. Virology Journal 2013, 10:158http://www.virologyj.com/content/10/1/158
Virofāgi, polintoni, transpovironi: vīrusveida DNS transpozoni
Virofāgi, polintoni, transpovironi
tektivīrusi
N. Yutin, S. Shevchenko, V. Kapitonov, M. Krupovic, E. KooninA novel group of diverse Polinton-like viruses discovered by metagenome analysis
Yutin et al. BMC Biology (2015) 13:95 DOI 10.1186/s12915-015-0207-4
Adenovīruss kā transpozons:integrācija genomā veido >5000 bp garus IR
N.Hochstein, I.Muiznieks, L.Mangel, H. Brondke, W. DoerflerJOURNAL OF VIROLOGY, May 2007, p. 5349–5361
Adenovīruss kā transpozons:integrēta vīrusa DNS veido līdz > 400 kbp garu cilpu
Transpozīciju pašierobežošanas spēja un imunitāte
Hibrīdu disģenēze / sugu veidošanās modelis.
Drozofīlas. P+ līnija nes P-
elementu; P- līnija - bez P-elementa.
Hibrīdudisģenēze
Hibrīdu disģenēze
Hibrīdu disģenēzes fenotipu veido P elementu transpozīcija P līnijas tēviņu un M līnijas mātīšu krustošanā iegūtajās embrionālajās šūnās. Transpozīcija nenotiek somātiskajās šūnās, jo tikai embrionālajās šūnās veidojas transpozāzes mRNS specifiskais splaisings.Hibrīdu disģenēze novērojama P līnijas tēviņu un M līnijas mātīšu krustošanā, bet ne M līnijas tēviņu un P līnijas mātīšu (mušas ar autonomu P elementu) krustošanā, jo P līnijas mātīšu olas satur daudz represora proteīna, kas nepieļauj transpozāzes transkripciju. M līnijas mātīšu olās šī represora nav dod iespēju P līnijas tēviņu spermas transpozonu kustībai.
Garie RNS transpozoni
Struktūra Gēni Pārvietošanās veids Piemēri
Gari, tiešie DNA atkārtojumi galos
Revertāze, LTR, retrovīrusiem līdzīgi, bez env.
Ar RNA starpfor-mu, no promotera LTR sastāvā
Copia (Drosophila) Ty (Saccharomyces) Bs1 (Zea mais); THE-1
Retrotranspozoni
Transpozoni, kuru replikācijai nepieciešamas DNS-RNS-DNS stadijas, lai pārvietotos pa genomu, kodē šajā procesā piedalošos fermentu - atgriezenisko (reverso) transkriptāzi - revertāzi.
Īsie RNS transpozoni
Struktūra Gēni Pārvietošanās veids Piemēri
Revertāze Ar RNA starpfor-mu, no promotera ārpus Tn
F-elementi (Drosophila) Lines (Homo sapiens) Cin4 (Zea mais)
Retrovīrusiem līdzīgie transpozoni
Migrējošie gēni, vīrusu pēdas cilvēka genomā. Iespējamā vīrusu loma evolūcijas tempa paātrināšanā.
Saskaņotā (concerted) evolūcija. Transpozīciju sprādzieni
PLAZMĪDAS
• Vispārīgais raksturojums• Klasifikācija:
• funkcijas• replikācijas regulācija• nesavietojamība• transmisibilitāte
Plazmīdu vispārīgais raksturojums
Gredzenveida, retos gadījumos lineāri ekstrahromosomālās dsDNS elementi, 3x103 - 1x106 b.p., kas
baktēriju šūnās replicējas fiziski nesaistīti ar nukleoīdu; kodē šūnai nosacīti noderīgas ģenētiskās īpašības; dažreiz kodē proteīnus, kas veido specifiskas morfoloģiskas struktūras (pilus, piocīni) dažreiz spēj integrēties saimniekšūnas genomā (episomas)
Dabā sastopamo plazmīdu garums ~ 3 - ~ 300 kbp.
F faktors atklāts 1946. g. (Lederberg&Tatum); termins “plazmīda” 1952. g. (J.Lederberg)
Plazmīdu atklāšana
Plazmīda - vīruss
Lizogēns fāgs P2 spēj ieģērbt savu olbaltumvielu apvalkā plazmīdu P4, pārvēršot to par vīrusu; Epšteina-Barra vīruss vai -fāgs, kas zaudējis integrācijai nepieciešamos gēnus, spēj eksistēt šūnā autonomā formā.
Lizogēns fāgs
Baktēriju vīruss, kurš spēj eksistēt kā autonomā, tā arī hromosomā integrētā veidā.
Plazmīdu DNS topoloģija
Plazmīdu DNS topoloģija
Plazmīdu DNS topoloģija
Superspiralizācijas blīvums
Superspiralizācija un gēnu ekspresija
vektorplazmīdās
Funkcijas
• Fertilitāte [ F, Hfr; F’]• Rezistence [ R, rtf, modulārā struktūra]• Kolicinogenitāte [ColE, B, V, I, K, Clo]
• Enteropatogenitāte [K88; K98]• Biodegradācija [TOL; XYL]• Kriptiskās plazmīdas• Rekombinantās vektorplazmīdas
Plazmīdu klasifikācija
Fertilitāte [ F, Hfr; F’]
Konjugācijas procesā no šūnas uz šūnu tiek pārnests viens plazmīdas DNS pavediens
Rezistence [ R, rtf, modulārā struktūra]
Rezistence, pret antibiotikām rezistento celmu izplatība klīnikās
Kolicinogenitāte [ColE, B, V, I, K, Clo]
Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana
Replikācija
Stingrā kontrole [saskaņoti ar nukleoīdu, neliels kopiju skaits]
Atslābinātā kontrole[nesaskaņoti ar nukleoīdu, liels kopiju skaits]
Plazmīdu klasifikācija
Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru
Replikācijas iniciācija ar RNS praimeru
Replikācijas aktivitātes negatīva regulācija ar anti-sens RNS palīdzību
Rekombinantās plazmīdas un vektorplazmīdas – gēnu pārnese un klonēšana
Savienojamība: nejaušs sadalījums pie fiksēta kopējā skaita
Plazmīdu replikācijas stabilitāte:Varbūtība veidoties bezplazmīdu šūnām, ja nav aktīva plazmīdu sadalījuma mehānisma šūnās, kas satur n plazmīdu kopijas
Plazmīdu replikācijas stabilitāti raksturo augšanas ciklu skaits barotnē bez selektīva spiediena, pēc kura vēl 50%
baktēriju šūnu populācijā ir saglabājuši plazmīdu
Plasmid Maintenance Stability
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
1 3 6 10 20 40
Passages in non-selective media
% o
f A
b r
ezis
tan
t cells
R 6-5 pSC101 pBR322 pBR329
26
40
>40
Plazmīdu replikācijas stabilitāte:Rekombinācijas sitēmu, multimerizācijas efekts
Plazmīdu klasifikācija
SavienojamībaSavienojamības grupas –
vairāku plazmīdu spēja vienlaikus atrasties vienā šūnā
C, FI – FIII, H, I1, I2, J, L – P, S, T, W
Nesavienojamības grupa Plazmīdas FI F, R386 FII R1 FIII Col B-K99, Col B-K166 FIV R124 I R62, R64, R483 (vismaz 5 apakšgrupas) J R391 N R46 O R724 P RP4, RK2 Q RSF1010 T R401 W R388, S-a
Savienojamība:Replikācijas faktori,Piestiprināšanās vietas pie šūnas membrānas
Plazmīdu klasifikācija
Transmisibilitāte
Transmisiblas [ tra – gēni, operons]
Mobilizējamas [ mob saits]
Nemobilizējamas