Základy interpretace MS spekter získaných
měkkými ioniza čními technikami
Příprava předmětu byla podpořenaprojektem OPPA č. CZ.2.17/3.1.00/33253
Pravidlo sudého po čtu elektron ův (kvazi)molekulárním iontu a fragmentech
EE →→→→ EE+ →→→→ EE+ + N
narozdíl od EI techniky dochází k následujícím procesůmv případě měkké ionizace jen výjimečně !
EE →→→→ OE+.
nebo
EE+ →→→→ OE+. +R.
EE →→→→ EE- →→→→ EE- + N
nebo
(poznámka 2: pro EE+ dostáváme neceločíselnéhodnoty)
poznámka 1: počet atomů kyslíku a síry ve výpočtu nefiguruje
z je počet dusík ů (přesněji a obecně trojvaznýchatomů, např. P)
y je počet vodík ů (přesněji a obecně jednovaznýchatomů,např. halogenů, tedy F, Cl, Br, I ),
kde x je počet uhlík ů (přesněji a obecně čtyřvaznýchatomů, např. Si),
Double bond equivalent (DBE) = Saturation index (R+ DB)
DBE = x - 1/2y +1/2z +1
Dusíkové pravidlo
pro ionty EE + (vznikající měkkou ionizací téměř výhradně)
platí, že pokud mají lichou hodnotu m /z obsahují sudý
počet atom ů dusíku (0, 2, 4, 6,…)
toto pravidlo platí pro běžné prvky v organických látkách
(C, H, N, O, S, P, Si, F, Cl, Br, I)
toto pravidlo je tedy obrácené ve srovnání s technikou EI !
Knihovny ESI/APCI spekter obdobné EI knihovnám neexi stují . Jen pro některé skupiny látek platí výjimky, např. v oblasti proteomiky(peptidy). Pro interpretaci fragmentů je třeba mít zkušenosti, využít literaturu nebo naměřit spektra většího počtu podobných látek se známou strukturou.
4.
Fragmentaci je možno vyvolat technikou CID (Collision InducedDissociation).
3.
Fragmentace bývá mén ě rozsáhlá než v případě EI techniky.
Poměrně často spektrum prvního stupně obsahuje pouze molekulárníadukty a/nebo (de)protonované molekuly, tj. fragmenty nemusí být přítomny prakticky vůbec.
2.
Téměř výhrad ě vznikají ionty se sudým po čtem elektron ů, EE+.Případný vznik iontů s lichým počtem elektronů není běžný a je třeba se
jej vždy pokusit zdůvodnit, může k němu docházet např. u organokovů
a polyaromátů; k záchytu elektronu a vzniku M-. může dojít u nitrolátek,
apod.
1.
Základní pravidla interpretace ESI/APCI spekter
Obecný postup interpretace ESI/APCI spekter
Při interpretaci spektra je vhodné začít určením kvazimolekulárního iontu a tedy (sekundárně) molekulové hmotnosti neznámé látky.
K tomu je třeba vyhledat ve spektru vzájemně související ionty, adukty, např. vedle iontu [M+H]+ (v pozitivním modu) i ionty typu, [M+Na]+,[M+K]+. Navíc ve spektru mohou být přítomny také adukty se solventem, např. [M+H+methanol]+ nebo zdvojené molekuly [2M+H]+, [2M+Na]+.
Často mají některé uvedené adukty malou až velmi malou intenzitu, ale pro zjištění molekulové hmotnosti je jejich přítomnost ve spektru velmi důležitá, protože tyto adukty většinou poskytuje jen molekula
a ne fragmenty. Adukt [M+Na]+ bývá nejintenzivnější.
Při měření v negativním modu mohou být vedle iontů [M-H]- přítomny také ionty [M+Cl]-, [M+HCOO]-, [M+CH3COO]-, apod.
Typ a relativní zastoupení jednotlivých aduktů je velmi silně závisléna složení solventu/mobilní fáze užité k měření MS spekter
(na poměru organické a vodné složky, na koncentraci solí, apod.).
1.
Měření CID spekter. Interpretace fragmentů na základě znalostí, zkušeností, případně využití pomocných interpretačních programů.
5.
Vyhodnocení všech získaných informací, včetně dat z jiných detektorůpři LC-MS měřeních, chování látky na koloně a včetně informacíod zadavatele analýzy. Pokus o návrh struktury neznámé látky.
6.
V ideálním případě porovnání retenčního chování a spekter identifikované látky s identickým standardem.
7.
Vždy je třeba uvážit, zda pozorované ionty nepocházejí z pozadí nebo paměťového efektu, to platí jak pro měření přímým vstupem, takpro techniku LC-MS. Při LC-MS je důležité ověřit, zda jednotlivé ionty ve spektru pochází z jedné látky či nikoliv, a sice extrahováním vybraných iontů z chromatogramu a porovnáním poloh maxim píků.
4.
Zjištění přítomnosti “M+2“ prvků, především Cl a Br, odhad jejich počtu v molekule, pak podobně odhad pro S a Si.
3.
Aplikace dusíkového pravidla s předpokladem výhradního vzniku iontůse sudým počtem elektronů, EE+.
2.
Obecný postup interpretace ESI/APCI spekter - pokračování
MS techniky a jejich aplikace p ři zjiš ťováníidentity nezn ámých látek
Ukázky skute čných řešených praktických p řípadů
Finding Substitute Active Pharmaceutical Ingredientsin Counterfeit Medicines
LCGC-Europe, 21, 2008, 84
� MS dnes v oblasti farmaceutického průmyslu patří k hlavním metodám
užívaným pro analýzu léčiv
� Nejdůležitějším úkolem MS je zde identifikace a charakterizace nových
chemických individuí
� MS má také své velmi důležité místo při odhalování falešných léčiv na trhu
The World Health Organization (WHO) defines counterfeit medicines as:
Those medicines that are deliberately and fraudulently mislabelled
with respect to identity and/or source. Counterfeiting can apply to both
branded and generic products. Counterfeit products may include products
with the correct ingredients or with the wrong ingredients, without active
ingredients, with insufficient active ingredient, or with fake packaging.
1. Případ, kdy je podvržena aktivní látka -konkrétní p řípad léku proti malárii
Obecně platí, že podvržená aktivní látka musí být relativně levná a komerčnědostupná, ale na druhou stranu nemusí být nutně obsažená v knihovnácha databázích
Obecně vhodné MS techniky:přímý vstup, GC, LC – následně s tím souvisí volba ionizační techniky,EI, CI, ESI, APCI, DESI atd.možnost využití MS-MS a měření přesné a správné hmotnosti-zjištění elementárního složení (FT-ICR, Q-Tof, Orbitrap)
Jako nejvhodn ější p řístup se ukazuje LC ve spojení s MS(-MS) poskytujícíinformaci o elementárním složení (a fragmentaci) podvr ženého analytu:
- separace složek od pomocných látek (excipients)- omezení problému s potlačením ionizace- možnost zapojení dalších detektorů v sérii s MS (např. DAD) - informace o chromatografických a tedy některých fyzikálních vlastnostech látky
1. Aplikace generické LC-MS-ES+ metody:kolona RP; krátký ~10min gradient; 1,8 um sorbent; 0,05mol/l octan amonnýve vodě a acetonitrilu
2. Aktivní složka měla mít [M+H]+ m/z nominální 500,ve skutečnosti [M+H]+ bylo 152 a je navíc přítomen adukt s acetonitrilem,m/z 193, ten svědčí pro molekulu 151.
3. v chromatogramu nebyl žádný další výrazný pík ani signál m/z 500
4. následovalo měření správné a přesné hmotnosti na Q-TOF ke zjištěníelementárního složení, zjištěná hmotnost byla m/z 152.0679
SW prost ředky a p řístup k vyhodnocení informace o nam ěřené hmotnostiPodstatné aspekty
- zastoupení prvků v neznámém analytu, možnost omezení na nejčastějšíprvky v léčivech: C, H, O, N, (Cl, Br, F, S,...)
- vyhodnocení iontového klastru->přítomnost/nepřítomnost některých prvků,např. Cl, Br, S, kov…
- úvaha o možnostech instrumentu, rozlišení a míře správnosti měření hmotnosti=>volba vhodných limitů; pro Q-TOF ~2-5ppm(10ppm), pro ICR-FR a Orbitrap ~1ppm;vhodné nastavení těchto parametrů má kritický význam!
Výchozí bod - předpoklad možné přítomnosti C, H, N, O, F(3), S(1), Cl, Br
⇒ kombinace zjištěné správné hmotnosti s tvarem klastru vedla k vyloučení Br a Cla za tolerance do 5 mDa bylo získáno 6 kombinací/možných elementárních složení;(rozšíření na 10 mDa by dalo 8 možností)
-0.5
-1.5
Mlčky se v prvním přiblížení počítá s tím, že vznikají ionty se sudým počtem elektronů,ale pozor např. fotoionizace může poskytovat i ionty s lichým počtem elektronů
Jak vybrat ze 6 kombinací jednu - tu správnou?
- hledání elementárních složení v Merck Index(u) a CAS (Chemical Abstracts) -> můževést k acetaminofenu (paracetamol), C8H9NO2, ale pro vyšší molekulové hmotnostije uvedený postup hledání v Merck Indexu a CAS málo efektivní
- obecně je vhodnější detailně prozkoumat tvar iontového klastru, odhad počtu C v iontu(1,1% 13C)
- zde je poměr iontu m/z 153 ku 152 ~10% (přitom nejistota ve velikosti klastruje přibližně 15% ), tedy v iontu [M+H]+ je 8 až 10 C, a to je v souladu s C8H9NO2,kromě toho iontový klastr není v souladu s případnou přítomností síry (32S:33S:34S, 100:1:4),ale zde pozor, pro vyšší molekulové hmotnosti je třeba uvažovat i přítomnost 2 13C.
- Nakonec je ideální provést porovnání chromatografického a MS chováníneznámé látky s chováním standardu, tj. porovnat retenční časy a MS spektravčetně fragmentace, viz dále
také je možno na MS-MS instrumentu fragmentovat [M+H]+ ion a měřit správné hmotnosti produktových iontů, fragmentů, to je zásadní hlavněpro látky s vyšší molekulární hmotností
opět se předpokládá vznik sudo-elektronových iontů, tedy neutrální ztráta, ale je nutno být připraven i na alternativu lichou
zde pro sudo-elektronové ionty za tolerance 10mDa existuje 5 kombinacípro fragment o nominální hodnotě m/z 110
Ale jen dvě kombinace jsou z chemického hlediska “rozumné”, a to C6H8NOa C3H9NO2F;
nicméně dále je třeba vzít v úvahu i DBE (změna DBE by měla být malávzhledem k prekurzorovému iontu, při fragmentaci byla pozorována jen maláztráta, 42), tuto podmínku dobře splňuje pouze C6H8NO;
-0.5
3.5
-0.5
-0.5
-0.5-90.0-9.9
44.54.9
-34.5-3.8
-24.5-2.7
11.81.3
kromě toho je také vidět rozumná souvislost s prekurzorovým iontem C8H10NO2,
který ztratil C2H2O, což je běžná ztráta
dále jsou jasné také minimální počty některých atomů v prekurzorovém iontu m/z 152,
musí v něm být nejméně jeden atom N a nejméně jeden atom O (pokud se jedná o dusík,
je tomu tak kvůli sudé hodnotě prekurzorového iontu 152 a současně sudému fragmentu110; pokud jde kyslík je tomu tak proto, že pokud je ve fragmentu 110 jeden atom kyslíku,
musel být nejméně jeden také v prekurzoru)
nakonec je možné provést také fragmentaci celého iontového klastru m/z 152, a pakanalýzu produktového klastru m/z 110
- H2O
Upozornění, obecně tedy platí:
a) uvažovat dusíkové pravidlo: pokud je protonovaná molekula lichá a MS-MSdává sudé i liché fragmenty, je pravděpodobné, že molekula obsahujenejméně 2 N (platí ale jen za předpokladu, že předpokládáme možnostjenom neutrálních ztrát)
b) Fragmentování celého iontového klastru může vést k fragmentovým
klastrům charakteristických tvarů, a tím usnadnit zjištění elementárního
složení fragmentového klastru
Chromatografie LC-MS zfalšovaného léčiva vedla ke složitějšímu chromatogramu:
2. Případ, kdy je k dispozici jen degrada ční produkt podvrženéaktivní látkykonkrétní p řípad jednoho antibiotika
Sled úvah:
- hlavní pík může být zbytek podvržené aktivní látky nebo její degradační produkt
- bylo změřeno, že nominální molekulová hmotnost látky hlavního píku je 308,hmotnost iontu [M+H]+ byla změřena na MS instrumentu poskytujícím přesnoua správnou hmotnost, výsledek měření byl 309,1282
- předpoklad složení: C, H, N, O, F(3), S, limit 5mDa
- výsledek => 33 kombinací elementárních složení (pro sudo-elektronová elem. složení)s nejlepší shodou ve smyslu rozdílu teor. a naměř. hmotnosti pro C4H18N8O7Fa DBE –0,5 => to je ale velmi nepravděpodobná struktura
- analýza izotopového klastru :a) [M+H+1]+ s intenzitou 18% (vztaženo k [M+H]+) vede k předpokladu
14-18 atomů C v molekuleb) [M+H+2]+ s intenzitou 7% (vztaženo k [M+H]+) vede k domněnce o přítomnosti
1 atomu S v molekule
34S
2 x 13C
experimetální data
simulováné spektrum
(upozornění: tato konkrétní výše uvedená data byla získaná pro jinou podobnoulátku podobné hodnoty m/z jako má měřená neznámá látka)
- potvrzení uvedéné doměnky o přítomnosti S v molekule lze také ověřit cestouHRMS, tedy třeba Orbitrap s rozlišením 60.000
- počet uhlíku omezen na 14-18, nutná přítomnost 1 S, 5mDa => jen 3 kombinace:
C15H21N2O3S, C17H22O2FS, C16H19N2F2S
- navíc, pokud by byl nastaven limit na 2mDa (snadno v praxi na Orbitrap dosažitelné),pak jen jedna možná kombinace
- žádná kombinace ale nebyla nalezena v Merck Indexu => asi nejde přímo o podvrženoulátku, ale už o její degradační produkt
- v CA ovšem nalezena pro C15H21N2O3S (protonovaná molekula) následující molekula:
Tato látka je známý degradační produkt penicilinového antibiotika, penicilinu G
C15H20N2O3S
další dva degradační produkty penicilinu G, potvrzeny i ve standardu
3. Případ, kdy je podvržena aktivní látka a kdy jen MS bez LC nesta čí k jednozna čné identifikaci
- při hledání potenciálních analytů podle zjištěného elementárního složeníje vždy třeba počítat s tím, že může existovat více izomerů
- proto je pak někdy nutné MS informaci kombinovat s chromatografickými daty
Příklad: jako podvržená aktivní složka byla identifikována látka s elementárním složenímC12H15N4O2S pro [M+H]+
v literatuře (Merck index) jsou ale uvedeny 2 možnosti (izomery):
- uvedené látky byly k dispozici ve formě standardů a byly podrobeny MS-MSfragmentaci se stejnou kolizní energií
- na základě MS-MS je neznámá látka asi sulfametazin, ale není to jednoznačné
- retence obou izomer ů na LC je ale zásadn ě odlišná a vede k jednozna čnémupotvrzení identity
4. Případ, kdy je podvržena aktivní látka a nejvhodn ější metodaanalýzy není LC-MS, ale GC-MS nebo dokonce p římý vstup EI
- měření správné hmotnosti na LC-MS vedlo ke zjištění elementárního složení falešnéaktivní látky -> C16H14O3, nominalní hmotnost m/z 254
- opět aplikace Merck Indexu -> návrh 2 látek -> ketoprofen nebo fenbufen- místo měření MS-MS spekter a retenčních časů na LC byl užit systém GC-MS:
NIST knihovní spektrumstandardu ketoprofenu
podvržená aktivní složka
- EI knihovní spektrum ketoprofenu poskytlo dobrou shodu s podvrženou aktivní složkou
- v uvedeném případě je i možné, že by pro identifikaci stačil EI s přímým vstupem
a nebyla by nezbytná znalost elementárního složení
- v každém případě cesta k identifikaci byla mnohonásobně snazší než s užitím
kombinace LC-MS-MS, ale takto nelze postupovat obecně, je to spíše výjimka,
protože látka musí být těkavá
Obecné závěry:
� Možnost měřit přesné a správné hodnoty m/z je velmi důležitá
� Protonovaný klastr prekurzoru, tedy [M+H]+, poskytuje mnoho podstatných
informací
� Kromě LC-MS ve spojení s ESI, je někdy vhodné užít techniku EI nebo GC-EI
Další p říklad tentokrát z naší praxe
O
O
OHOH
Analýza surového vzorku laktondiolu-B
C18H22O4Mw mono = 302,1518[M+H]+ 303,1596[M+Na]+ 325,1416[M+K]+ 341,1155
MS: 100-1000 m/z
UV-VIS: 210 nm
1
2
3
4 5
pík 1 a pík 2
1
2
[M+Na]+
[M+K]+
m/z 325.1
3
[M+Na]+pík 3m/z 359.1
4
m/z 403.0 pík 4[M+Na]+
5
m/z 451.0
pík 5
[M+Na]+
[X+Na]+
m/z 461.0
pík 3
3 5TIC 100-1000 m/z
pík 3: 359,1 m/z
pík 3: 361,1 m/z
pík 5: 451,0 m/z
pík 5: 461,1 m/z
1. Charakterizace surového desoktapeptidu lidského insulinu pomocí RP-HPLC-MS
2. Preparativní izolace a charakterizace jeho jednotlivých forem, -OH a –NH2
DOI primary structure
Další p říklad z naší praxe tentokrát vysokomolekulárníbiologicky významná látka
RP-HPLC-MS - surový DOI
MS: 100-2000 m/z
UV: 218 nm
1 2
pík 2-OH
pík 1-NH2
pík 1-NH2
pík 2-OH
MS spektrum po dekonvoluciOriginální MS spektrum
1622,74864,1
1217,6