2. Microscopia y tinción

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Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos

Objetivos

• Conocer

-La relación entre la estructura y función de los microorganismos

• Asimilar

-La estructura de los procariotas los hace enormemente interesantes en microbiología aplicada

• Capacidad

– Manejar las técnicas más frecuentes en un laboratorio de Microbiología y aprenda a plantear experimentos sencillos y a interpretar y discutir científicamente los resultados

– Manejar, ajustar y mantener los microscopios

– Teñir y observar microorganismos

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Unidad 2. Estructura y función de los microorganismos

Capítulo 2: El estudio de la estructura microbiana: Microscopía y preparación del

especimen

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Las lentes y el desvío de la luz

• La luz es refractada (desviada) cuando pasa de un medio a otro

• El índice de refracción– Es una medida del grado en el que una

sustancia reduce la velocidad de la luz• La dirección y la magnitud de la

desviación se determina por los índices de refracción de los dos medios que forman la interfase

Fundamentos y tipos de microscopios ópticos

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Lentes• Una lente convexa enfocará

los rayos luminosos en un punto concreto denominado punto focal (F)

• La distancia entre el centro de la lente y el punto focal es la distancia focal (f)

• Los aumentos que proporciona una lente están relacionados con la distancia focal– A menores distancias

focales más aumentos


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El microscopio óptico

• Tipos– Microscopio de campo claro– Microscopio de campo oscuro– Microscopio de contraste de fase– Microscopio de fluorescencia

• Son microscopios compuestos– La imagen se forma por la acción

de 2 lentes


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El microscopio de campo claro• Produce una imagen oscura sobre un fondo luminoso• En general de 3 a 5 objetivos con lentes diferentes (si la imagen

permanece enfocada a medida que se cambian los objetivos el microscopio se denomina parfocal)

• Aumento total (producto del aumento de las lentes del ocular y el objetivo)


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Resolución de un microscopio (d)• Capacidad de una lente de separar o distinguir entre objetos pequeños que están

próximos• La longitud de onda de la luz empleada es un factor fundamental en la resolución (filtro

azul en los microscopios del laboratorio)A menor longitud de onda mayor resolución

•Distancia de trabajo— distancia entre la superficie frontal


Tabla 2.2 Propiedades de los objetivos de un microscopio óptico

(n sen θ)

θ =Apertura angular

d= 0.5 λ/n sen θ n = índice de refracción

•Aceite de inmersión— aumenta el índice de refracción

Nagua= 1.33Naceite: 1.45

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Microscopio de campo oscuro

Treponema


Diafragma de campo oscuro

Condensador Abbé = produce un cono hueco de luz

• Produce una imagen iluminada del objeto sobre un fondo oscuro

• Se emplea para observar organismos vivos en preparaciones sin teñir

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Microscopio de contraste de fases• Aumenta el contraste entre las estructuras intracelulares que tienen

ligeras diferencias en el índice de refracción• Excelente para observar células vivas sin teñir


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Microscopia de contraste de interferancia diferencial o técnica Nomarski• Similar a la de contraste de fases

– Crea imágenes sobre la base de una detección de diferencias en el índice de refracción y el espesor de la muestra

– Excelente para observar células vivas

• Emplea luz polarizada– Esto mejora el contraste y da como resultado una imagen

tridimensional


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Brightfield microscopy image of cultured epithelial cells using a 20X objective

Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.

Differential Interference Contrast (DIC or Nomarski) image of cultured epithelial cells using a 20X objective.

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Microscopía de fluorescenciaFundamentos y tipos de microscopios ópticos

Protozoo flagelado Crithidia luciliae teñido con anticuerpos fluorescentes

Live/Dead stainig: Mezcla de Micrococcus luteus y Bacillus cereus (verdes vivas, rojas muertas)

• Expone un especimen a luz ultravioleta, violeta o azul

• En general, el especimen se tiñe con fluorocromos

• Se observa, en un fondo oscuro, una imagen brillante del objeto como resultado de la fluorescencia emitida por la muestra

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Preparación y tinción de la muestra

• Aumenta la resolución

• Acentúa las características morfológicas

• Conserva la muestra

Preparación y tinción de las muestras en microscopía óptica

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Preparación (Fijación)• Proceso mediante el cual se procesan y fijan en su posición las

estructuras internas y externas de la célua• Además se mata al microorganismo y se fija firmemente al porta

objetos (microscope slide)– Fijación por calor

• Preserva la morfología general pero no las estructuras internas– Fijación química

• Protege la subestructura fina y la morfología de los microorganismos delicados de mayor tamaño


Ej.: • aldehídicos (al formaldehído, el paraformaldehído, el glutaraldehído, la acroleína), • el ácido ósmico• el tetróxido de osmio• los compuestos mercúricos y crómicos, • los alcoholes, la acetona, el dietil-pirocarbonato.

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Colorantes y tinción simple

• Colorantes (dyes) – Hacen más visibles las estructuras internas y

externas aumentando el contraste con el fondo– Tienen dos características fundamentales

• Grupos cromóforos– Grupos químicos con dobles enlaces

conjugados– Dan al colorante su color

• Afinidad por los componentes celulares– se unen mediante enlaces iónicos (los

más comunes) , covalentes o hidrófobos


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Tipos de tinción• Tinción simple

– Se emplea un solo colorante. Se dividen en dos clases generales

– Colorantes básicos se emplean frecuentemente

• Tienen cargas positivas• Ej.: Cristal violeta, fucsina básica,

safranina, verde malaquita

– Colorantes ácidos se emplean menos frecuentemente

• Tienen cargas negativas• Ej.: Eosina, Fucsina ácida


Safranina

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Tipos de tinción• Tinción diferencial

– Se emplean dos o más colorantes– Divide a las bacterias en grupos diferentes según

sus propiedades de tinción:• Ej.: Tinción de Gram• Ej.: Tinción ácido alcohol resistente

• Tinción de Gram– Es la tinción diferencial más empleada– Divide a las bacterias en grupos diferentes

según diferencias en la pared celular


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Gram positiva

Gram negativa


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Tipos de tinción• Tinción Ácido-alcohol resistente (Acid-fast

staining) – Se tiñen calentando una mezcla de fucsina básica y

fenol (Método de Ziehl-Neelsen)

– Tras la tinción no se decoloran fácilmente debido al elevado contenido en lípidos de las paredes de estas células

• En particular ácidos micólicos (lípidos hidroxílicos de cadena ramificada)

Mycobacterium lepraeColorante de contraste: azul de metileno


– Particularmente útil en la tinción de miembros del género Mycobacterium

Ej., Mycobacterium tuberculosis – causente de la tuberculosis

Ej., Mycobacterium leprae – causante de la lepra

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Tinción de estructuras específicas

• Tinción negativa– Se emplea frecuentemente

para visualizar las capsulas difusas que rodean a algunas bacterias

– Se mezclan las bacterias con tinta china o colorante de nigrosina y se extienden sobre un porta

– Las capsulas se observan sin color sobre un fondo oscuro

Cryptococcus neoformans – tinción negativa con tinta china


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• Tinción de esporas (Método de Schaeffer-Fulton)

– Técnica de doble tinción

– Las esporas se tiñen primero calentando las bacterias con verde malaquita

– Después de desteñir se contratiñe con safranina quedando las células vegetativas y las endosporas con colores diferentes

– Son difíciles de teñir por eso se observan también en tinciones simples

• Tinción de flagelos

– Los flagelos deben ser recubiertos con suficiente colorante como para ser observados

– Se aplica mordiente (como ácido tánico y alumbre de potasio) para aumentar el grosor de los flagelos y se tiñen con pararosanilina (Método de Leifson) o fucsina básica (Método de Gray)

Bacillus cereus


Tinción de estructuras específicas

Vibrio cholerae O1

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• Métodos directos – el primer anticuerpo o anticuerpo primario se encuentra unido a algún tipo

de marcador fluorocromo (pierde fluorescencia con el tiempo)– Se pueden emplear varios anticuerpos diferentes Ej.: 3


Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Tinción de estructuras específicas

• Métodos indirectos – El anticuerpo primario aplicado sobre las células es reconocido por un

segundo anticuerpo, secundario, unido a un marcador– El anticuerpo secundario se aplica a una concentración en exceso.– Es más sensibles que los directos pues al anticuerpo primario se

pueden unir más de un anticuerpo secundario, incrementando la señal.

– basta con disponer de unos pocos secundarios marcados para poder reconocer un gran número de anticuerpos primarios diferentes

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• Métodos del anticuerpo no marcado o de puente – Un problema importante en el uso de anticuerpos (primarios o secundarios) marcados

• las técnicas químicas de formación de enlace covalente entre el anticuerpo y el marcador pueden destruir parcialmente la reactividad del anticuerpo.

– En el método de puente sencillos la primera capa está formada por el anticuerpo primario (por ej. obtenido en conejo). La segunda capa por un anti-anticuerpo, secundario (por ejemplo oveja anti conejo), la tercera por un anticuerpo anti-peroxidasa (por ejemplo conejo anti peroxidasa) producido en la misma especie que el primario y la cuarta por peroxidasa.


Sistemas de marcaje inmunocitoquímico Tinción de estructuras específicas

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Microscopio electrónico

• Se emplean haces de electrones para producir un imagen

• La longitud de onda de los haces de electrones es mucho menor que la de la luz, dando lugar a un gran aumento de la resolución

Fundamentos y tipos de microscopios electrónicos

Límites de resolución de un microscopio

0,2 µm

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Microscopio electrónico de transmisión

• Los electrones se dispersan cuando atraviesan una sección fina de la muestra

• Los electrones transmitidos (aquellos que no se dispersan) se emplean para producir una imagen

• Las regiones más densas de la muestra dispersan más electrones y aparecen más oscuras


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Microscopio electrónico de barrido


• Crea la imagen a partir de los electrones reflejados en la superficie de la muestra

• Produce imágenes en 3D de las características superficiales de la muestra

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Preparación de la muestraPreparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica

• También pueden fracturarse en frio (criofractura) con una cuchilla quedando expuesta la membrana interna

• Los procedimientos son similares a los empleados en microscopía óptica

• Para la microscopía electrónica de transmisión las muestras deben ser cortadas muy finas (de 1-2 µm a 60 nm) con un ultramicrotomo

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Preparación de la muestra

• La muestra se fija químicamente (Ej.: Glutaraldehido) y se tiñe con materiales electrodensos (Uranilo, platino y plomo)

• También puede emplearse inmunodetección si se marcan los anticuerpos con oro coloidal (esferas de 2-3 nm adsorbidas a los anticuerpos)

Preparación y tinción de las muestras en microscopía electrónica

29Ochoa de Alda et al. 2004 Immunolocalization of NblA, a protein involved in phycobilisome turnover, during heterocyst differentiation in cyanobacteria.Microbiology150:1377-84.

0,5 µm0,5 µm


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Otros métodos de preparación• Sombreado

– Recubrimiento de la muestra con una capa fina de un metal pesado

– La muestra se recubre desde un lado de forma que unas áreas se cubren más que otras

– La zona cubierta, más electrodensa se ve clara y la zona menos cubierta más oscura


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Nuevas técnicas de microscoíaNuevas técnicas de microscopía

Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)

• Se emplean haces de luz láser para iluminar la muestra

• Un ordenador recoge y agrupa las imágenes de cada punto para generar una imagen tridimensional

• Permite controlar la profundidad del campo que se observa eliminando o reduciendo la información fuera del plano

• Permite recolectar secciones ópticas seriadas de especímenes gruesos

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Nuevas técnicas de microscopía

Microscopía confocal de barrido por láser (MCBL)

Cultured epithelial cells triple stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired with a 20X objective (left) and a 100X objective (right).

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• Microscopio de efecto tunel (Scanning tunneling microscope, STM)– Permite ver átomos (sustancias

conductoras) en la superficie de un sólido– Un punta muy fina (terminada en un solo

átomo) se aproxima a la muestra – Una corriente constante (tunneling

current) se aplica entre la sonda y la muestra

– Para mantener la corriente constante a medida que se desplaza la sonda, ésta debe moverse alejándose y acercándose a la muestra

– Las variaciones de corriente son detectados y empleadas para crear una imagen

– Tiene una enorme resolución – Permite observar incluso átomos


Microscopía con sonda de Barrido

Los electrones que rodean los átomos de la superficie se proyectan desde el borde de la superficie a una corta distancia

http://www.iap.tuwien.ac.at/www/surface/STM_Gallery/stm_schematic.gif

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• Microscopio de fuerza atómica (Atomic force microscope, AFM)– Similar a la microscopia de efecto túnel

pero para materiales no conductores ya que no aplica un voltaje

– Un punta muy fina se mueve sobre la superficie de la muestra a una distancia constante

– A medida que la sonda se mueve a lo largo de la superficie de la muestra los electrones de la sonda de metal son repelidos por las nubes electrónicas de los átomos de la misma. La altura de la sonda se ajusta de modo automático para mantener constante la fuerza recibida.

– Los movimientos ascendentes y descendentes de la sonda son detectados y empleados para crear una imagen

– Se emplea para muestras poco conductoras



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Imagen AFM del virus del mosaico de nabo amarillo en el que se observa la estrutura de la cápsula Características

superficiales de una espora de Bacillus atrophaeus (a) Espora hidratada (b), Detalle de ésta mostrando estructuras de cilindros ordenados que se pliegan tras hidratarse (c). Imagenes AFM

a–e) Imagenes AFM de la compactación progresiva del ADN de levadura por el efecto de la proteína AbF2.



2 nm

Imagen STM del ADN

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