Unidad 3. Nutrición, metabolismo, crecimiento y control de microorganismos

Objetivos• Conocer

-Las características de los principales grupos nutricionales de microorganismos, su crecimiento y control

-Las diferentes aplicaciones de la microbiología

-Las peculiaridades metabólicas de los microorganismos y su diversidad

-Las pautas del crecimiento microbiano y los factores que lo influyen

-Los agentes antimicrobianos más comunes y sus mecanismos de acción• Asimilar

-El mantenimiento adecuado de cultivos puros de microorganismos solo es posible con la práctica de técnicas asépticas

-El metabolismo microbiano es enormemente versátil y plástico• Capacidad

-Prepara cultivos y manejar varias técnicas de esterilización

-Realizar técnicas básicas de recuento de bacterias

-Aislar microorganismos

-Actualizar su formación y necesidades en microbiología a través del manejo herramientas bioinformáticas

Unidad 3. Nutrición, metabolismo, crecimiento y control de microorganismos

Capítulo 5. Nutrición: Requerimientos, toma de nutrientes, medios de cultivo, aislamiento de cultivos puros

•Requerimientos de carbono, hidrógeno y oxígeno-Normalmente se satisfacen simultáneamente -Autótrofos (emplean dióxido de carbono como única o principal

fuente de carbono) Heterótrofos (emplean moléculas orgánicas como fuente de carbono)

Requerimientos

•Requerimientos nutritivos esencialesmacroelementos (macronutrientes)

-C, O, H, N, S, P, K, Ca, Mg, y Fe-son requeridos en cantidades relativamente altas

micronutrientes (elementos traza o oligoelementos)-Mn, Zn, Co, Mo, Ni, y Cu-son requeridos en cantidades trazafrecuentemente suministrado entre las impurezas del agua o los componentes del medio de cultivo

Tipos nutricionales de microorganismosRequerimientos

mixotrofos: combinan diferentes procesos metabólicos, por ej. quimiolitoautotróficos y heterotróficos

•fuente de energía química inorgánica•fuente de H/e- inorgánica•fuente orgánica de carbono

Requerimientos

Requerimientos de nitrógeno, fósforo y azufre• necesario para la síntesis de importantes moléculas (ej.,

aminoácidos, ácidos nucleicos)• el nitrógeno se puede suministrar de muchas formas• el fósforo se suministra en general en forma de fósforo

inorgánico• el azufre se suministra en general en forma de sulfato y

se adquiere a través de la vía asimilatoria de reducción de sulfato

Fuentes de nitrógeno

• moléculas orgánicas• amonio • nitrato y nitrito a través de sus vías de asimilación• nitrógeno gas a través de la fijación de nitrógeno

Requerimientos

Factores de crecimiento• compuestos orgánicos• componentes esenciales (o sus precursores) que la célula no puede

sintetizar• deben ser suministrados por el ambiente en el que crece la célula para

que la célula sobreviva y se reproduzca

Importancia práctica de los factores de crecimiento• desarrollo de ensayos cuantitativos crecimiento-respuesta para

determinar la concentración de factores de crecimiento en preparaciones• producción industrial de factores de crecimiento por microorganismos

Requerimientos

Requerimientos Clases de factores de crecimiento • aminoácidos, necesarios para la síntesis de proteínas• purinas y pirimidinas, necesarios para la síntesis de ácidos nucleicos• vitaminas, funcionan como cofactores enzimáticos

Captación celular de nutrientes Los mecanismos más comunes son 3: • difusión facilitada• transporte activo• translocación de grupos

Difusión facilitada• similar a la difusión pasiva

– el movimiento de moléculas no esdependiente de energía

– el movimiento de las moléculas es desde la alta concentración a la baja concentración

– la diferencia de concentración (el gradiente) determina la velocidad de toma

• difiere de la difusión pasiva – emplea moléculas transportadoras

(poros y canales)– una pequeña concentración de

gradiente es necesaria para que haya una toma significativa de moléculas

– transporta efectivamente glicerol, azucares y aminoácidos

• más común en células eucariotas que en procariotas

•la velocidad de difusión facilitada aumenta más rápidamente y a menores concentraciones

•la difusión facilitada alcanza un máximo cuando el transportador se satura

Efecto de saturación del transportador

Toma de nutrientes

Transporte activo

ABC transportadores

• el proceso es dependiente de energía– ATP o fuerza protomotriz

• movilizan las moléculas en contra del gradiente• concentra las moléculas en el interior celular• requiere proteínas transportadoras (transportadores y

translocadores)– se observa un efecto de saturación del transportador

• contienen una proteína a la que se une el ATP

• se observa en bacterias, arqueas y eucariotas

• algunos confieren resistencia a antibióticos

Toma de nutrientes

Mediado por ATP

Toma de nutrientes

Mediado por gradiente de protones y sodio

El transporte de electrones se emplea para bombear protones al exterior de la membrana

El gradiente de protones dirige la expulsión de sodio mediante un mecanismo de antiporte

El sodio se une al complejo proteico transportador

La unión del sodio provoca un cambio conformacional hace posible la unión de otra molécula a transportar

Esto hace que se liberen ambas moléculas en el interior (mecanismo de simporte)

• Simporte – se transportan dos

sustancias en la misma dirección

• Antiporte– se transportan dos

sustancias en direcciones opuestas

Sistema fosfotransferasa de Escherichia coli

Traslocación de grupo

• las moléculas son modificadas a medida que se transportan a través de la membrana

• es un proceso dependiente de energía• ej. el sistema fosfotrasferasa de E. coli

Toma de nutrientes

Captación de hierro

• el ión férrico es muy insoluble y su captación en difícil

• los microorganismos emplean sideróforos para poder captarlo más eficazmente

• los sideróforos forman complejos con el ión férrico

• el complejo es posteriormente transportado al interior celular

• algunos patógenos animales pueden captar grupos hemo

Toma de nutrientes

1. Poros y canales1.A Canales α-Helicoidales1.B Porinas de hojas plegadas β 1.C Toxinas formadoras de poros1.D Canales de síntesis no ribosómica1.E Holinas

2. Transportadores dependientes del potencial electroquímico2.A Transportadores (uniporters, simporters y antiporters) 2.B Transportadores de síntesis no ribosómica

3. Transportadores primarios3.A Dependientes de un grupo fosfato (ABC) 3.B Dependientes de descarboxilaciones 3.C Dependientes de la transferencia de grupos metilo3.D Dependientes de oxidoreducción3.E Dependientes de luz

4. Traslocadores de grupos 5. Transportadores de electrones

Clasificación de las proteínas transportadoras de la membrana

International Union of Biochemistry and Molecular Biology (NC-IUBMB) 2002

Toma de nutrientes

Medios de cultivo

• preparación líquida (caldo) o sólida (agar) utilizada para el crecimiento, transporte o mantenimiento de microorganismos– los medios sólidos se solidifican generalmente con agar

• fundamentales para el estudio de los microorganismos

Medios sintéticos o definidos

• se conocen todos sus componentes y su concentración

Medios de cultivo

Medios complejos

• contiene algunos componentes de composición y/o concentración desconocida

Medios de cultivo

Algunos componentes de los medios de cultivo• peptonas

– hidrolizados de proteínas obtenidos tras la digestión parcial de varias fuentes de proteínas (carne, caseína, harina de soja, gelatina)

• Peptona ácida de caseína: Digestión ácida de la caseína (proteína mayoritaria de la leche) a aminoácidos, a excepción de triptófano que prácticamente desaparece. También desaparecen las vitaminas durante su obtención

• Peptona de carne: Digestión parcial con la proteasa pepsina.• Peptona de gelatina: Digestión pancreática de gelatina. Tiene bajo contenido en

cisteína y triptófano y ausencia total de azúcares fermentables. Poder nutritivo bajo. Se utiliza con microorganismos poco exigentes.

• Peptona pancreática de caseína: Digestión de caseína con extractos pancreáticos. Es el más utilizado en procesos de fermentación industrial.

• Peptona de soja: Digestión con la proteasa papaina de la harina de soja. Por su alto contenido en azucares no es recomendable en estudios de fermentación.

• Peptona trípsica de caseína: Digestión con la proteasa trípsina de la caseina • extractos

– extractos acuosos frecuentemente de carne o levadura• agar

– polímero sulfatado normalmente extraído de algas rojas empleado para solidificar medios líquidos. Funde a 80-90 ºC y solidifica a 40-42 ºC. No es degradado por la mayor parte de los microorganismos

Medios de cultivo

Tipos de medios• Medios para fines generales

– pueden mantener el crecimiento de numerosos microorganismos– ej. : caldo de triptona y soja

• medios enriquecidos– medios para fines generales suplementados con sangre o otros nutrientes

especiles– ej.: agar sangre

• medios selectivos– favorecen el crecimiento de algunos microorganismos e inhiben el crecimiento

de otros– ej.: agar MacConkey

• selecciona bacteria gram negativas por contener cristal violeta

• medios diferenciales

– diferencian entre grupos distintos de bacterias e incluso permiten una identificación tentativa

– ej., agar sangre: diferencia bacterias hemolíticas de no hemolíticas– muchos estreptococos y estafilococos aislados de la garganta producen

zonas claras alrededor de sus colonias debido a la lisis de los eritrocitos– ej., Agar MacConkey: diferencia fermentadores de lactosa de no fermentadores

Medios de cultivo

Aislamiento de cultivos puros

• cultivo puro– población de células que proviene de una sola célula

• Para aislar cultivos puros se emplean frecuentemente la siembra en profundidad, la siembra por extensión y la siembra en estría

Aislamiento de cultivos puros

Siembra en profundidad•La muestra original se diluye varias veces para reducir la concentración bacteriana, se mezcla con agar templado y se vierte

Aislamiento de cultivos puros

Siembra por extensión•La muestra original se diluye varias veces para reducir la concentración bacteriana, se vierte sobre una superficie de agar y se extiende con un asa de Digralski de forma que las colonias resultantes estén bien separadas

Siembra en estría•La muestra original (sólida o líquida) se recoge con un asa de siembra y se aplica secuencialmente en estrías esterilizando el asa entre estría y estría

Aislamiento de cultivos puros

•En cada estría se va diluyendo la muestra original de forma que en la última estría se obtienen bacterias que darán lugar a colonias aisladas

Morfología de la colonialas especies de microorganismos forman colonias de aspecto característico

Aislamiento de cultivos puros

Forma

Elevación

Margen

Puntiforme Circular Filamentoso Irregular Rizoide Fusiforme

Plana Elevada Convexa Pulvinada Umbonada

Entero Ondulado Lobulado Erosionado Filamentoso Rizado

Crecimiento de colonias• la colonia crece más

rápidamente en la periferia– hay más disponibilidad de

oxígeno y nutrientes en la periferia

• el crecimiento es más lento en el centro de la colonia, hay mayor mortalidad

• en la naturaleza muchos microorganismos se agrupan formando biofilms

Aislamiento de cultivos puros

la morfología de la colonia puede variar según el medio en el que crezca.Ej, Bacillus subtilis creciendo en un medio pobre en nutrientes

¿Dónde encuentro la composición de los medios de cultivo o los medios preparados?

• En las páginas web de los suministradores de organismos. Por ejemplo: La ATCC (http://www.atcc.org, la colección americana de cultivos tipo) indica la composición del medio de cultivo junto a los organismos que suministra. Lo mismo sucede con la CECT (www.cect.org, colección española de cultivos tipo)

• La composición detallada de cada medio se encuentra en las páginas de los proveedores de medios de cultivo. El más detallado es el manual DIFCO (http://www.maplica.com)

• En España los suministradores más comunes son Microkit (http://www.laboratoriosmicrokit.com/) , Sigma Aldrich http://www.sigmaaldrich.com/Area_of_Interest/Analytical__Chromatography/Microbiology.html y biomerieux (http://www.biomerieux.com)

Medios de cultivo