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UNIDAD III.- NUTRICIÓN, METABOLISMO, CRECIMIENTO Y CONTROL DE LOS MICROORGANISMOS

Tema 8.- Control de microorganismos: Definiciones. Cinética de muerte microbiana. Técnicas físicas (calor, bajas temperaturas, filtración y radiación) químicas (fenoles, alcoholes, halógenos,metales pesados, amonio cuaternario, aldehídos, gases esterilizantes,) y evaluación de su eficacia . Antibióticos, evaluación de su eficacia y mecanismos de acción. Antifúngicos y antivirales.

• Esterilización– Destrucción o eliminación de todas las células vivas y/o esporas viables y/o virus

y/o viroides y/o priones de un objeto o hábitat• Desinfección

– Destrucción inhibición o eliminación de organismos patógenos– desinfectante

• Agente, habitualmente químico, usado para desinfectar• Generalmente sobre objetos inanimados

• Saneamiento– Reducción de la población microbiana hasta niveles que se consideran seguros

para la salud pública• Antisepsia

– Prevención de una infección o sepsis de tejidos vivos– antisépticos

• Agentes químicos aplicados sobre tejidos vivos para la prevención e inhibición del crecimiento de agentes patógenos

Agentes antimicrobianos• Agentes que eliminan a los microorganismos o que inhiben su crecimiento• El sufijo –cida se emplea para agentes que matan: i.e. germicida (alimina patógenos

y algunos no patógenos pero no necesariamente endosporas). Incluye bactericidas, fungicidas, algicidas y viricidas.

• El sufijo –estatíco se emplea para agentes que inhiben el crecimiento i.e. Bacteriostático, fungistático

Definición de términos frecuentesDefiniciones

Cinética de muerte microbiana• La población microbiana no se destruye instantáneamente• En general su destrucción ocurre exponencialmente• Se considera que los microorganismos están muertos cuando son incapaces de

reproducirse en condiciones que normalmente permiten su crecimiento

Condiciones que afectan la efectividad de los agentes antimicrobianos• Tamaño de la población (a mayor Tamaño mayor tiempo necesario)• Composición de la población microbiana• Concentración e intensidad de los agentes empleados (a [], rapidez, no es lineal)• Duración de la exposición• Temperatura • Ambiente local (pH, viscosidad, compuestos orgánicos)

Cinética de muerte microbiana

Control y evaluación de la eficacia de técnicas físicas y químicas antimicrobianas

Técnicas Físicas:•Calor•Temperaturas bajas•Filtración•Radiación.

Agentes Químicos:•Fenoles•Alcoholes• Compuestos Halogenados•Compuestos clorados•Metales pesados•Sales de amonio cuaternario•Aldehidos•Gases•Antibióticos

Control microbiano por técnicas químicas y físicas

Empleo de técnicas Físicas: Calor

• Calor húmedo: Efectivo contra todo tipo de microorganismos. Degrada ácidos nucleicos, desnaturaliza proteínas y disgrega membranas

• Esterilización con calor seco: Es menos efectivo, requiere mayores temperaturas y mayores tiempos de exposición. Oxida componentes celulares y desnaturaliza proteínas

Evaluación de la eficacia: Calor• Tiempo de muerte térmica (TMT ó

TDT en inglés): Tiempo mínimo necesario para destruir todos los microorganismos a una temperatura específica y condiciones definidas

• Tiempo de reducción decimal (D o valor D): tiempo necesario para destruir el 90 % de los microorganismos o esporas en una muestra a una temperatura específica

Técnicas físicas (Calor)

Evaluación de la eficacia: Calor

• Valor Z: Aumento de temperatura necesario para reducir D a 1/10

• Valor F: tiempo, en minutos, necesario para destruir una población de células o esporas a un a temperatura determinada (en general 121,1 ºC)

Técnicas físicas (Calor)

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Calor húmedo

autoclaves – se emplean para destruir microorganismos, incluidas las esporas, eficientemente

– en su interior, una atmosfera de vapor a presión permite alcanzar temperaturas superiores a 100º C

Técnicas físicas (Calor)

Levaduras

Mohos

Bacterias

Virus

Calor húmedo• pasteurización

– Calentamiento controlado a temperaturas muy por debajo del punto de ebullición– Reduce la población microbiana total y como consecuencia aumenta el tiempo

de conservación del material tratado (reduce la putrefacción)Pasteurización de la leche

• Pasteurización rápida (High Temperature Short-Term – HTST)– 72°C durante 15 segundos después se enfría rápidamente

• Esterilización a temperatura ultraelevada (UltraHigh-Temperature, UHT)– de 140 a 150° C durante 1 a 3 segundos

Bajas temperaturas• Congelación

– detiene la reproducción microbiana debido a la ausencia de agua líquida– algunos microorganismos mueren como consecuencia de la rotura de la

membrana provocada por los cristales de hielo• Refrigeración

– reduce el crecimiento microbiano y la reproducción

Técnicas físicas (Calor y bajas temperaturas)

Filtración

Filtrado de líquidos• Filtros de profundidad

– filtros granulares o de fibras gruesas que elimina microorganismos por adsorción, o por tamizado o ambos

• Filtros de membrana– membranas porosas con un tamaño de poro

definido que elimina los microorganismos principalmente por tamizado

Membranas de nylon con bacterias retenidas (poro de 0.2 µm)

polycarbonate membranewith 0.4 µm pores

Técnicas físicas (Filtración)

• Disminuye la población microbiana o esteriliza disoluciones que contienen compuestos termosensibles a través de la eliminación de todos los microorganismos

Membranas de policarbonato con bacterias retenidas (poro de 0.4 µm)

Sistema de filtración con bombaperistáltica

Filtrado de aire• mascarillas• tapones de algodón• Filtros HEPA (high-efficiency particulate air)

– empleadas en las cabinas de seguridad (cámaras) de flujo laminar de flujo laminar

Técnicas físicas (Filtración)

Radiación• radiación ultravioleta (UV)

– uso limitado para esterilización de superficies ya que la radiación UV no penetra el vidrio, superficies sucias agua o otras sustancias

• radiación ionizante– penetra profundamente en los objetos– destruye endosporas bacterianas (o es siempre efectiva contra virus)– empleado para la esterilización y pasterurización de antibióticos, hormonas,

suturas, plásticos desechables y alimentos

Objetos que se esterilizan frecuentemente con radiación

Técnicas físicas (Radiación)Agentes químicos de control microbiano

Técnicas químicas

Desinfectante: Agente, habitualmente químico, usado para desinfectar (destrucción inhibición o eliminación de organismos patógenos, generalmente sobre objetos inanimados. Antisépticos: Agentes químicos aplicados sobre tejidos vivos para la prevención e inhibición del crecimiento de agentes patógenos

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Fenoles

• comúnmente empleados en la desinfección de laboratorios y hospitales• desnaturaliza porteínas y disgrega membranas• tubercolicida, efectivo en presencia de materia orgánica y duraderos sobre las

superficies que se aplican• olor desagradable y pueden irritar la piel

Alcoholes• bactericida, fungicida pero no esporicida• inactiva algunos virus• desnaturaliza proteínas, precipita el ADN y,

posiblemente, disgrega membranas

Técnicas químicasHalógenos (Fluor, cloro, bromo y iodo)

• Iodo– se emplea sobre la piel como antiséptico– oxida componentes celulares y ioda proteínas– a altas concentraciones mata esporas– puede dañar la piel, la colorea y puede

ocasionar problema alérgicos– iodoforo

• iodo formando complejos con transportadores orgánicos

•Cloro

- oxida componentes celulares- importante en la desinfección de suministros de agua y

piscinas, se emplea en industrias lácteas y alimentariasy como desinfectante en los productos de limpieza

- destruye células vegetativas de bacterias y hongos, pero no esporas

- puede reaccionar con compuestos orgánicos para dar lugar compuestos cancerígenos

Técnicas químicas

Metales pesados• ej. iones de mercurio, plata, arsénico, zinc y cobre• efectivos pero, en general, tóxicos• se combina con las proteínas y las inactiva; también pueden precipitar proteínas

Compuestos de amonio cuaternario

• detergentes– moléculas orgánicas anfipáticas (tienen un extremo hidrófilo y otro hidrófobo)– actúan como humectantes y emulsionantes

• los detergentes catiónicos son efectivos desinfectantes– matan la mayoría de las bacterias pero no Mycobacterium tuberculosis o las

endosporas– seguro y fácil de usar, pero se inactivan con agua dura o jabón

Técnicas químicas

Aldehídos • moléculas muy reactivas• esporicida, y puede

emplearse como esterilizante químico

• se combina con ácidos nucleicos y proteínas y las inactiva

• empleado para esterilizar materiales termosensibles

• microbicida y esporicidad• se combina con las proteínas y las

inactiva

Gases esterilizantes

Técnicas químicas

Evaluación de la efectividad de los agentes antimicrobianos

• Proceso complejo regulado por agencias gubernamentales– En USA es la EPA (Environmental Protection Agency) y la FDA (Food and Drug

Administration)– En la UE es la Agencia Europea para la Evaluación de Medicamentos (EMEA)

Prueba del coeficiente de fenol

• la potencia de un desinfectante es comparada con la de el fenol

• Un valor superior a 1 indica que el desinfectante es mejor que el fenol

• ej.: un valor de 2.7 para el mercuriocromo indica que cuando se diluye 2.7 veces más que el fenol es igual de efectivo que este

Evaluación de la efectividad Evaluación de la efectividad

Niveles de actividad de germicidas seleccionados

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AGENTES QUÍMIOTERAPEÚTICOS• Agentes químicos empleados en el tratamiento de enfermedades• Destruyen los microorganismos patógenos o inhibe su crecimiento en el

huésped• La mayoría son antibióticos

– Productos microbianos o sus derivados, elimina a microorganismossusceptibles o elimina su crecimiento

Antibióticos

EL DESARROLLO DE LA QUIMIOTERAPIA• Paul Ehrlich (1904)

– desarrolla el concepto de toxicidad selectiva– identifica colorante que tratan de forma efectiva la

enfermedad del sueño• Sahachiro Hato (1910)

– trabajando con Ehrlich, identifica compuestos de arsénico para el tratamiento efectivo de la sífilis

• Gerhard Domagk, and Jacques and Therese Trefouel (1935)– descubrió las sulfamidas y derivados

Penicilina• fue descubierta por Ernest Duchesne

(1896) pero su trabajo fue olvidado• fue accidentalmente redescubierta por

Alexander Fleming (1928)– observó la actividad de la penicilina en

placas Petri contaminadas– abandonó las investigaciones

• su efectividad fue demostrada por Florey, Chain, y Heatley (1939). Purificaron y caracterizaron clínicamente la penicilina

Descubrimientos posteriores

• La streptomicina fue descubierta por Selman Waksman (1944)• en 1953 ya se disponía además de cloranfenicol, terramicina, neomicina y

tetraciclina

Antibióticos

Una colonia del moho Penicillium próxima bacterias Staphylococcus

Características generales de los fármacos antimicrobianos• toxicidad selectiva

– capacidad de un fármaco de matar o inhibir patógenos al tiempo que daña mínimamente al huésped

• dosis terapéutica– nivel del fármaco requerida para un tratamiento clínico

• dosis tóxica– nivel del fármaco al cual resulta demasiado tóxico para el paciente (ej., produce

efectos secundarios)• índice terapéutico

– relación entre la dosis tóxica y la terapéutica

Antibióticos

Fármacos de amplio espectro – atacan diferentes tipos de patógenos

Fármacos de corto espectro – atacan unos pocos tipos de patógenos

Propiedades de algunos fármacos antibacterianos comunes

El sufijo –cida (cidal) se emplea para agentes que matan: i.e. germicida (alimina patógenos y algunosno patógenos pero no necesariamente endosporas). Incluye bactericidas, fungicidas, algicidas y viricidas.El sufijo –estatíco (static)se emplea para agentes que inhiben el crecimiento i.e. Bacteriostático, fungistático

Antibióticos

Antibióticos

Fuentes microbianas de algunos antibióticos

• Algunos antibióticos son de origen sintético (químico)– sulfamidas, cloranfencol

• otros son de origen natural y provienen en general de hongos y bacterias– Streptomicina, penicilina

• la efectividad se expresa de dos formas– la concentración mínima inhibitoria (minimal inhibitory concentration, MIC)

concentración más baja de un fármaco que inhibe el crecimiento de un patógeno

– Concentración letal mínima (minimal lethal concentration, MLC): concentración más baja de un fármaco que mata a un patógeno

• dos técnicas son empleadas rutinariamente para determinar la MIC y la MLC– Pruebas de sensibilidad por dilución– Pruebas de sensibilidad por difusión en agar

Determinación del nivel de actividad antimicrobianaAntibióticos (evaluación de efectividad)

Pruebas de sensibilidad por dilución• se inoculan medios de cultivo con diferentes concentraciones de fármaco

– la menor concentración de fármaco en el caldo o el agar que no muestre crecimiento es la MIC

– si se emplean caldos de cultivo, los tubos en los que no se observa crecimiento pueden ser subcultivados (transferidos) a un medio sin fármaco

• la menor concentración de fármaco en el caldo de cultivo a la que no se observa recuperación de los microorganismos es la MLC

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Pruebas de sensibilidad por difusión en agar• discos impregnados de concentraciones

conocidas de fármaco se sitúan sobre medios de cultivo con agar inoculados con el microorganismos con el que se va aprobar

• el fármaco difunde del disco hacia el agarformando un gradiente de concentración

• tras la incubación, las zonas claras al rededor del disco indican que no ha habido crecimiento

Antibióticos (evaluación de efectividad)

Método de Kirby-Bauer method• método estandarizado para llevar a cabo la

prueba de difusión• la sensibilidad y la resistencia se determinan

empleando tablas que relacionan el diámetro del halo con la resistencia microbiana

• los valores de la tabla se emplean para determinar si la concentración de fármaco que se alcanza en el cuerpo es efectiva

Empíricamente se ha observado que hay una relación entre la MIC de un antibiótico y el diámetro del halo de inhibición (ver figura). Los organismos sensibles a un fármaco tienen una MIC baja y muestran halos grandes.

Antibióticos (evaluación de efectividad)

Si la concentración de un fármaco en el cuerpo oscila entre 7 y 28 µg/ml, desde la gráfica podemos estimar que son sensibles los microorganismos que muestren un halo superior a 17 mm con una concentración de fármaco de 7 µg/ml y, son resistentes, los que muestren halos menores de 12 mm.

La sensibilidad o resistencia de una bacteria a un fármaco se determina a partir de tablas– Ej.: si un disco con 30 µg de tetraciclina crea un halo de más de 19 mm, la

bacteria es sensible

Antibióticos (evaluación de efectividad) Dispositivo estándar para la prueba de Kirby-BauerDeterminación de la concentración de un fármaco en sangre• para que sea efectiva, la concentración del fármaco en el lugar de la

infección debe ser superior a la MIC• para determinar la concentración del fármaco en sangre se pueden emplear

técnicas – microbiológicas– químicas– inmunológicas– enzimáticas– cromatográficas

Antibióticos (evaluación de efectividad)

Mecanismo de acción de los agentes antimicrobianos• afectan al patógeno alterando alguna función necesaria para su

reproducción y supervivencia• la función alterada es muy específica del patógeno → alto índice terapéutico

(relación entre la dosis tóxica y la terapéutica)

Antibióticos (mecanismo de acción)

Factores que afectan la efectividad de los fármacos antimicrobianos• capacidad del fármaco de alcanzar la infección

– depende del modo de administración• oral (algunos fármacos son destruidos por el ácido en el estómago)• tópica• ruta parenteral (rutas de administración no oral)

– los fármacos pueden tener problemas para alcanzar tejidos necróticos o coágulos• sensibilidad del patógeno al fármaco

– resistencia al fármaco• el fármaco puede ser alterado o bombeado al exterior• el organismo puede modificar la diana a la que va dirigido• se previene: i) administrando altas concentraciones de fármacos, ii) dando varios

simultaneamente, iii) empleándolos solo cuando es necesario, iv) desarrolandonuevos fármacos o terapias (fagos, por ejemplo)

– una vez que se origina en una población puede ser transmitida a otras bacterias• a través de plásmidos• Superinfeción: desarrollo y dispersión de un patógeno resistente a un fármaco trás la

administración de un fármaco. Ej.: Enterocolitis pseudomembranosa causada por Clostridium difficile trás eliminar la flora bacteriana con antibióticos

• capacidad del fármaco de alcanzar una concentración superior a la MIC del patógeno

• cantidad administrada• ruta de administración• velocidad de toma• velocidad de eliminacion del cuerpo

Antibióticos (mecanismo de acción)

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Antifúngicos• menor número de fármacos efectivos debido a la similitud entre las células

humanas y las de los hongos• son más fáciles de tratar las infecciones (micosis) superficiales que las

sistémicas

Antifúngicos

alteran la permeabilidad de la membrana e inhibe la síntesis de esteroles

altera el uso mitótico;puede inhibir la síntesis de proteínas y ADN

antibiótico polieno obtenido de StreptomycesTratamiento superficial

Tratamiento de micosis sistémicas

se une a los esteroles de la membrana altera la función del RNA

Antifúngicos

Fármacos antiviralesrelativamente pocos debido a la dificultad de alterar específicamente la

replicación del virus

se emplea para prevenir la infección de la gripe

bloquea la penetración y la liberación de la cápsula del virus de la gripe

inhibe las enzimas del virus del herpes implicadas en las síntesis y función del ADN y el ARN

inhibe la DNA polimerasa del herpes

inhibe la DNA polimerasa del herpes y el citomegalovirus

Antivirales

Fármacos anti-ADN vírico de amplio espectro

inhibe la ADN polimerasaviral

papovavirus,adenovirus,herpesvirusiridovirus,y poxvirus

Antivirales

Fármacos Anti-HIV• dos dianas principales

– Transcriptasa inversa del HIV

– Proteasa del HIV