Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp (EIBE) taotleb biotehnoloogiaalase hariduse edendamist Euroopa Liidu liikmesriikide üldhariduskoolides ja kolledžites. Sellega suurendatakse inimeste biotehnoloogiaalaseid oskusi, süvendatakse arusaamist ning juhitakse neid sisulistele mõttevahetustele. EIBE kontaktisikud AUSTRIA I Rainhart Berner, Höhere Bundeslehr- und Versuchsanstalt für Chemische Industrie Wien, Abt. für Biochemie, Biotechnologie und Gentechnik, Rosensteingasse 79, A-1170 WIEN. BELGIA I Vic Damen / Marleen Van Strydonck, R&D Groep VEO, Afdeling Didactiek en Kritiek, Universiteit Antwerpen, Universiteitsplein 1, B-2610 WILRIJK. g_ BULGAARIA I Raytcho Dimkov, Faculty of Biology, University of Sofia "St. Kliment Ohridski", Dr. Tzankov blvd. No.8, 1421 SOFIA. ^g TŠEHHI I Hana Noväkovä, Pedagprogram, Faculty of Education UK, Pedagogical Centre, Prague, Konevova 241, CZ-13000 PRAGUE 3. TAANI I Dorte Hammelev, Frederiksberg HF kursus, Sonderjyllands alle 2, DK-2000 FREDERIKSBERG. I Lisbet Marcussen, Nyborg Gymnasium og HF kursus, Skolebakken 13,DK-5800NYBORG. IIRI I Catherine Adley / Cecily Leonard, University of Limerick, LIMERICK. EESTI I Tago Sarapuu, Science Dldactics Dept., Instltute of Molecular and Cell Biology, University of Tartu, Vanemuise 46,51014 TAJRTU. PRANTSUSMAA I Gerard Coutouly, LEGTP Jean Rostand, 18 Bouievard de la Victoire, F-67084 STRASBOURG Cedex. I Laurence Simonneaux / Jean-Baptiste Puel, Ecole Nationale de Formation Agronomique, Toulouse-Auzeville, Boite Postale 87, F-31326 CASTANET TOLOSAN Cedex. SAKSAMAA I Horst Bayrhuber / Eckhard R. Lucius / Ute Harms / Angela KroB, Institut fur die Pädagogik der Naturwissenschaften an der Üniversität Kiel, OlshausensttaBe 62, D-24098 KIEL. I Michael Schallies, Paedagogische Hochschule Heidleberg, Im Neuenheimer Feld 561, D-69120 HEIDELBERG. I Ognian Serafimov, UNESCO-INCS, c/o Jörg-Zürn- Gewerbeschule, Rauensteinstrafie 17, D- 88662 ÜBERLINGEN. I Eberhard Todt, Fachbereich Psychologie, Üniversität Giefien, Otto- Behaghel-StraBe 10, D-35394 GIEGEN. KREEKA I Vasilis Koulaidis / Vasiliko Zogza- Dimitriadi, Dept. of Education, Unit of Science, University of Patras, Rion, GR-26500 PATRAS II II
1. Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp (EIBE)
taotleb biotehnoloogiaalase hariduse edendamist Euroopa Liidu
liikmesriikide ldhariduskoolides ja kolledites. Sellega
suurendatakse inimeste biotehnoloogiaalaseid oskusi, svendatakse
arusaamist ning juhitakse neid sisulistele mttevahetustele.
EIBE kontaktisikud
AUSTRIA
I Rainhart Berner, Hhere Bundeslehr- und Versuchsanstalt fr
Chemische Industrie Wien, Abt. fr Biochemie, Biotechnologie und
Gentechnik, Rosensteingasse 79, A-1170 WIEN.
BELGIA
I Vic Damen / Marleen Van Strydonck, R&D Groep VEO, Afdeling
Didactiek en Kritiek, Universiteit Antwerpen, Universiteitsplein 1,
B-2610 WILRIJK.
g_BULGAARIA
I Raytcho Dimkov, Faculty of Biology, University of Sofia " St.
Kliment Ohridski" , Dr. Tzankov blvd. No.8, 1421 SOFIA.
^gTEHHI
I Hana Novkov, Pedagprogram, Faculty of Education UK, Pedagogical
Centre, Prague, Konevova 241, CZ-13000 PRAGUE 3.
TAANI
I Dorte Hammelev, Frederiksberg HF kursus, Sonderjyllands alle
2,
DK-2000 FREDERIKSBERG.
I Lisbet Marcussen, Nyborg Gymnasium og HF kursus,
Skolebakken
13,DK-5800NYBORG.
II
IIRI
I Catherine Adley / Cecily Leonard, University of Limerick,
LIMERICK.
EESTI
I Tago Sarapuu, Science Dldactics Dept., Instltute of Molecular and
Cell Biology, University of Tartu, Vanemuise 46,51014 TAJRTU.
II
PRANTSUSMAA
I Gerard Coutouly, LEGTP Jean Rostand, 18 Bouievard de la Victoire,
F-67084 STRASBOURG Cedex.
I Laurence Simonneaux / Jean-Baptiste Puel, Ecole Nationale de
Formation Agronomique, Toulouse-Auzeville, Boite Postale 87,
F-31326 CASTANET TOLOSAN Cedex.
SAKSAMAA
I Horst Bayrhuber / Eckhard R. Lucius / Ute Harms / Angela
KroB, Institut fur die Pdagogik der Naturwissenschaften an
der
niversitt Kiel, OlshausensttaBe 62, D-24098 KIEL.
I Michael Schallies, Paedagogische Hochschule Heidleberg, Im
Neuenheimer Feld 561, D-69120 HEIDELBERG.
IOgnian Serafimov, UNESCO-INCS, c/oJrg-Zrn-
Gewerbeschule, Rauensteinstrafie 17, D-88662 BERLINGEN.
I Eberhard Todt, Fachbereich Psychologie, niversitt Giefien,
Otto-
Behaghel-StraBe 10, D-35394 GIEGEN.
KREEKA
I Vasilis Koulaidis / Vasiliko Zogza-Dimitriadi, Dept. of
Education, Unit of Science, University of Patras, Rion, GR-26500
PATRAS
li
ITAALIA
I Antonio Bargellesi-Severi /Alessandra Corda Mannino/ Stefania
Uccelli , Centro di Biotecnologie Avanzate, Largo Rosanna Benzi
10,1-16132 GENOVA.
LUKSEMBURG
I John Watson / Laurent Kieffer, Ecole Europeenne de Luxembourg,
Departement de Biologie, 23 Bouievard Konrad Adenauer, L-1115
LUXEMBOURG.
HOLLAND
I David Bennett / Ana-Maria Bravo-Angel, Cambridge Biomedical
Consultants, Schuytstraat 12, NL-2517 XE DEN HAAG.
I Fred Brinkman, Hogeschool Holland, Dept. of International
Re-
lanons, PO Box 261, NL-1112 XB DIEMEN.
I Liesbeth van de Grint / Jan Frings, Hogeschool van Utrecht,
Educatie Centrum voor Biotechnologie, FEO, Afdeling Exacte
Vakken, Biologie, Postbus 14007, NL-3508 SB UTRECHT.
POOLA
I Anna Stemicka, Department of Biology, University of Gdansk,
Bazynskiego 1, GDANSK.
&
HISPAANIA
I Maria Sez Brezmes / Angela Gmez-Nirio / Rosa M. Villamarin,
Facultad de Educacin, Universidad de Valladolid, Geologo Hernandez
Pacheco 1, ES-47014 VALLADOLTD.
ROOTSI
I Margareta Johansson, Freningen Gensyn, PO Box 37, S-26881
SVALV
I Elisabeth Strmberg, Ostrabo Gymnasiet, Kaempegatan 36, S-
45117 UDDEVALLA.
VEITS
I Kirsten Schlueter, Instutut fuer Verhaltenswissenschaft,
Eidgenoessische Technische Hochschule IfV/ETH, ETH Zentrum TUR,
Turnerstr. 1, CH-8092 ZUERICH
[S SUURBRITANNIA li
I Wilbert Garvin / jill Turner, Northern Ireland Centre for School
Biosciences, NIESU, School of Education, The Queen's University of
Belfast, BELFAST, BT7 1HL.
I John Grainger / John Schollar / Caroline Shearer, National Centre
for Biotechnology Education, The University of Reading, PO Box 228,
Whiteknights, READING, RG6 6AJ. I Jenny Lewis, Centre for Studies
in Science and Mathematics Education, University of Leeds, LEEDS,
LS2 9JT Queen's University of Belfast, BELFAST, BT7 1LQ. I Paul
Wymer, Society for General Microbiology, Marlborough House,
Basingstoke Road, READING, RG7 1EA.
EIBE koordinaator
Horst Bayrhuber, Institut fr die Pdagogik der Naturwissenschaften
an der niversitt Kiel, OlshausensttaBe 62, D-24098 KIEL, Germany.
Telefon: + 49 431 880 3129/8803151 (EIBE sekretr: Ute Harms). Faks:
+ 49 431 880 3132.
2 ;1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Mikroorganismid ja molekulid
D Q O
o
1
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Sisukord
Veebilehekljed
*-*-****--*
I Ohutusnuded, autoriigused, mooduli koostajad ja tnu4
I Kesolevast moodulist
Sissejuhatus5
I Mudelite valmistamine
DNA mudeli valmistamine6
Mikroorganismide mudelid8
I DNA eraldamine
Bakteriaalse DNA eraldamine10
DNA eraldamine sibulast12
I Tootlikud mikroorganismid
Amlaasi tootmine mulla
bakterite poolt14
Tsellulaasi tootmine16
Antibiootikumi tootmine18
I Mikroorganismide elutegevuse jlgimine
Leivataigna valmistamine20
Seotud prmirakud22
Mikrobioloogiline ktteelement 25
I Geenilekanne
Geenilekanne bakterite
konjugatsioonil27
Looduslik geenilekanne
Agrobacterium tumefaciens abil31
I Lisa 1
Mikrobioloogilised
stmed34
I Lisa 2
Mikrobioloogiaalased
tvtted35
I Lisa 3
Loflliseeritud kultuurigaampulli avamine40
Vhesed teadusharud arenevad sama kiiresti, kui biotehnoloogia.
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupi (EIBE)
ppematerjale levitatakse elektrooniliselt. See vimaldab neid
parandada, kaasajastada ja seejrel minimaalsete kulutustega
levitada.
Kesolev ja ka jrgnevad EIBE moodulid on ktte saadavad kogu Euroopas
ning mujal maailmas interneti aadressil:
ht tp://www.rdg.ae.uk/EIBE
Kik EIBE moodulid on veebis postskript-failidena (PDF). See tagab
illustratsioonide hea kvaliteedi ja hesuguse kujunduse sltumata
arvutitbist (Macintosh, kaasaarvatud Power PC, Windows, DOS vi
Unix).
PDF failid on viksemad, kui need, milles nad esialgselt koostati -
see aga vimaldab neid kiiremini internetist ktte saada. EIBE
moodulitega tutvumiseks vajate programmi Adobe Acrobaf Reader, mis
on tasuta levitatav mitmetes keeltes (hollandi, inglise, prantsuse,
saksa ja itaalia keeles). Programmi saate kas EIBE vi Adobe'
kodulehekljelt:
http://www.adobe.com/
Nimetatud tarkvaraga saate EIBE mooduleid nii vaadata kui vlja
trkkida. Seejuures on dokumentide otsimine ja nendes orienteerumine
suhteliselt lihtne.
Mrkus: Adobe ja Acrobat on firma Adobe Systems Incorporated
registreeritud kaubamrgid. Macintosh on firma Apple Computer
Incorporated registreeritud kaubamrk.
EIBE Biotehnoloogilase Hariduse Huroopa Initsiatiivgrupp 1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid
A Ohutusnuded
EIBE moodulites on ptud vlja tuua kik teadaolevad ohud ja
soovitatud vastavaid ettevaatusabinusid.
Vimaluse korral on praktilistes tdes kasutatud kige tavalisemaid
meetodeid, mille puhul kehtivad ldised ohutusnuded. Krgendatud
ohtlikkusega katsete puhul on sellele alati thelepanu juhitud.
Kesoleva ppematerjali lisas 2 jagatakse ohutusalastid tiendavaid
juhiseid.
Vaatamata sellele peavad kasutajad olema valmis selleks, et
esitatud ohutusnuetes vivad esineda ksikud eksitused ja puudujgid.
Lisaks sellele on ka ohutusnuded erinevates riikides mnevrra
erinevad. Seetttu peavad kik praktiliste tde korraldajad alati
iseseisvalt hindama riske ja jrgima kohalikke ohutusnudeid ja
kehtivaid seadusi, sltumata EIBE materjalides esitatud
soovitustest.
Juhul, kui ei ole eraldi mrgitud, eeldatakse, et:
praktilisi tid viiakse lbi vastavalt sisustatud laborites;
tvahendeid kasutatakse vastavalt nende kasutuseeskirjadele;
tavaliste praktiliste tde lbiviimisel, niteks kuumutamisel,
jrgitakse ettevaatusabinusid; jrgitakse nudeid kemikaalide ja
elusorganismide kasutamisel;
kui on vhegi vajalik, kantakse kaitseprille; pilased on omandanud
ldised ohutusnuded, niteks kemikaalide ning mikroorganismidega
ttamisel.
Autoriigused
EIBE ppematerjalid on autorikaitse all. Moodulite koostajatele
laienevad kik autoriigused (" Designs, Patents and Copyright Act" ,
UK 1988, lige 77).
ppe-eesmrkidel kasutamine. piotstarbel on lubatud EIBE materjale
kasutada ja paljundada kas elektrooniliselt vi trkitud kujul.
Seejuures peab materjalide levitamine olema tasuta vi katma ksnes
paljunduskulud. Kigil juhtudel tuleb ra
mrkida mooduli koostajad ja tunnistada nende autoriigusi.
Teised kasutusvimalused. Materjale vib levitada isikult isikule
mittekommertslikel eesmrkidel. Keelatud on moodulite elektrooniline
levitamine listide, huvigruppide, postiaadresside, tellimuste,
veebi vi teiste analoogsete masslevivahenditega, mis kahjustavad
autorite huve.
Kommertslikel eesmrkidel ilma autorite eelneva nusolekuta on
moodulite kasutamine rangelt keelatud. Materjalide osaliseks vi
terviklikuks kasutamiseks ja nende mistahes kujul paljundamiseks
palume kontakteeruda:
Ute Harms
Institut fr die Pdagogik der
Naturwissenschaften an der Universitt Kiel
Olshausenstr. 62
D-24098 KIEL
Germany
Telefon: + 49 431 880 3151
Faks: + 49 431 880 3132
E-mail: [email protected]
Mooduli koostajad
Catherine Adley
The University of Limerick, Eire.
Jan Frings
Hogeschool van Gelderland, The Netherlands.
Cecily Leonard
The University of Limerick, Eire. 9 Eckhard R. Lucius
(koordinaator) IPN an
der Universitt Kiel, Germany. 9 Marleen van Strydonck
The University of Antwerp, Belgium.
Paul E.O. Wymer
The Wellcome Trust for Medical Science London, The United
Kingdom.
Kujundus, illustratsioonid, trkikiri, tiendavad
tekstid ja toimetamine: Dean Madden, Caroline
Shearer, NCBE, The University of Reading, The
United Kingdom.
Illustratsioonide ja tpograafia autoriigused
Dean Madden, 1997
Eestikeelne tlge Tago Sarapuu, 1999
Tnu
EIBE on eriti tnulik alljrgnevatele isikutele, kes aitasid kaasa
kesolevate materjalide valmimisele. Liesbeth van de Grint
(Hogeschool van Utrecht, Holland) ja John Schollar (National Centre
for Biotechnology Education, The University of Reading,
Suurbritannia) korraldasid rahvusvahelise seminari, kus katsetati
selle mooduli materjale. Jrgnevad petajad vtsid seminarist osa ja
tegid esialgsesse materjali palju kasulikke mrkusi: E. Vergauts, L.
Daniels, L. Neels (Belgia), Dorte Hammelev (Taani), Lucienne
Diemer, Gerald Coutouly (Prantsusmaa), Thomas JeB, Dr. U. Schnack,
Dr. E. Lipkow (Saksamaa), A. de Graaf, Guus Smid, J. Gradener
(Holland), Rebecca Weston, Jane Gent, Derek Mackle, Sarah
Whitethread, Maggie Parson (Suurbritannia).
4 ' 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Kesolevast moodulist
Kesolev moodul sisaldab valiku tjuhendeid, mida vib petamisel
kasutada kas ksikult vi komplektina. Mitmete Euroopa riikide
tegevpetajad ja haridusspetsialistid on andnud oma panuse nende
materjalide koostamisse, mis on teoks saanud Euroopa Komisjoni
DGXII toetusel EIBE (Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupi) egiidi all.
Kiki tjuhendeid on Euroopa mitmete koolide petajate poolt
ulatuslikult katsetatud.
Tjuhendid hlmavad jrgmisi teemasid:
DNA molekuli ja erinevate mikroorganismide lihtsad mudelid. Need
nitavad nimetatud biossteemide philisi omadusi ning vimaldavad
pilastel tajuda mikroorganismide suurust.
DNA eraldamise lihtsad, ohutud ja odavad meetodid. Sellega
omandavad pilased geneetilise materjaliga ttamise phi-vtted.
Autorid on pdnud pakkuda nii lihtsamaid kui keerukamaid lesandeid
lootes, et iga bioloogiapetaja leiab nende hulgast just endale
sobiva. Kolm lisa sisaldavad philist informatsiooni koolilaborites
rakendatavatest mikrobioloogia-alastest tvtetest.
Lhitulevikus on vimalik saada tiendavaid lisamaterjale, mis
ksitlevad mooduli seost Euroopa Liidu liikmesriikide erinevate
ppekavadega, ohutusnudeid ja tvahendite kttesaadavust.
Kik kommentaarid, mis puudutavad kesolevat moodulit, on vga
teretulnud. Eriti oodatakse aga petajate thelepanekuid. Kik mrkused
ja ksimused palume saata aadressil:
Dr. Eckhard R. Lucius
Institut fr die Pdagogik der
Naturwissenschaften an der Universitt
Kiel
Olshausenstr. 62
D-24098 KIEL
Germany
Telefon: + 49 431 880 3137
Faks: + 49 431 880 3132
E-mail:[email protected]
3.Rida katseid, mis nitavad:
mikroorganismide olemasolu keskkonnas ja kasulikke tvesid;
mningaid mikrobioloogilisi produkte (ensmid ja
antibiootikumid).
Kaks katset on kvalitatiivsed, ks uurib kvantitatiivselt ensmide
moodustumist.
Mitmed katsed mikroorganismide elutegevuse tagajrgedest - lihtsast
leivataignast ja krimisprotsessi uurimisest kuni prm-seente
ainevahetuse aktiivsuse mtmiseni. Kiki katseid on vimalik edasi
arendada laiaulatuslikeks uurimistdeks. pilaste motiveerimiseks on
suurem rhk asetatud biotehnoloogia rakenduslikule tasandile, mitte
ksnes teoreetilisele kljele.
Kaks loodusliku geenilekande esitust, milles tutvustatakse
geenitehnoloogia phimtteid.
Et kaks praktilist td sisaldavad antibiootikumide tootmist, toimet
ja resistentsuse lekannet, siis on vastavate teemade kohta esitatud
ka lisainformatsioon.
EIBE Biotehnoloogiaalasc Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid S
DNA mudeli valmistamine
Eesmrk
Nidata DNA (desoksribonukleiinhappe)ehituse peamisi omadusi.
T planeerimine
Mudeli valmistamiseks kulub umbes 30 minutit. Varuge rohkem aega,
kui vljaliked tuleb ka vrvida.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
krid;
tugev paberiliim, kleeplint vi vike klammerdaja {kahepoolne
kleeplint on sobiv, kuigi mne aja mdudes vib see lahti
tulla);
niit (valmis mudeli lesriputamiseks ja sildi kinnitamiseks).
Mrkus: selleks, et mudel oleks tugevam, vib kahe desoksriboosidest
ja fosfaatrhmadest " selgroo "' omavahel kokku .
Tkik
Ligake vlja desoksriboosidest ja fosfaatrhmadest moodustunud "
selgrood"A ja B.
Ligake vlja paardunud lmmastikaluste ribad.
Murdke ribad otstest tagasi, nagu nidatud krvaloleval
joonisel.
Liimige iga riba ks tagasimurtud ots " selgroo"A nummerdatud
kastikesse. Ribade jrjekord ei ole oluline.
Liimige ribade teised otsad " selgroo"B vastavalt nummerdatud
kastikestesse.
Kinnitage niidiga valminud DNA biheelik-si klge silt. Soovi korral
vib mudelile kinnitada ka joonisel toodud sildi.
Tnu
Kesoleva mudeli koostamisel on aluseks vetud mudel, mille tegi
Austraalia riikliku uurimisorganisatsiooni CSIRO teadusklubi "
Double Helix" . EIBE on tnulik CSIRO-le alguprase idee ja loa eest
nende mudelit kasutada.
Esimene positsioon
Teine positsioon
Kolmas positsioon
PHE SERTYRCYS
PHE SERTYRCYSLEU SER
LEU SERTRP
LEU PROHISARG
LEU PROHISARG
LEU PROGLNARG
LEU PROGLNARG
ILETHRASNSER
ILETHRASNSER
ILETHRLYSARG
MET THRLYSARG
VAL ALAASPGLY
VAL ALAASPGLY
VAL ALAGLUGLY
VAL ALAGLUGLY
Geneetiline kood
DNA molekuli kolm jrjestikust nukleotiidi mravad ra he kahekmnest
aminohappest, mis on esitatud tabeli keskosas kolmetheliste
lhenditena.
DNA struktuur
Desoksribooside ja fosfaatrhmade omavahelisel hinemisel on
moodustunud DNA molekuli kaks " selgroogu" . Nende vahel on neli
erinevat lmmastikalust: tmiin (T); tsutosiin (C); adeniin (A) ja
guaniin (G), mis on omavahel paarikaupa hendatud
vesiniksidemetega.
61. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotelmoloogiaatese Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
CD
Faardunud lmmastikaluste ribad
41846503267710IPS
pV
tps
Biotehnoloogiaalase
Hariduse
Euroopa Initsiatiivgrupp
DNA MUDEL |
(F) Fosfaatrhm (S) Desoksriboos
Adeniin
2505710186055ps
ps
Tstosiin
Guaniin
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid * 7
Mikroorganismide mudelid
jr jr
kieit-kiririeiriririr
Mikroorganismide mtmete hindamisel esineb pilastel tihti raskusi.
Ka on mikroskoobi kahemtmelise vaate alusel keeruline mista nende
organismide ruumilist ehitust.
Mudelite tegemine annab ettekujutuse nii mikroorganismide ehitusest
kui suurusest.
Tulemused on paremad, kui pilased peavad tegema oma mudelid, mitte
jrgima detailset valmistamise juhendit. Seetttu on see lesanne
sobilik kodutks (rohkem aega ja materjale).
Mrkus: Neile, kes arvavad, et mudelite valmistamine on liiga lihtne
tegevus, viks elda, et molekulaarbioloogias on mudelitel pikk ja
vljapaistev ajalugu - kuigi tnapeval tehakse neid peamiselt
arvutitega.
Eesmrgid
Nidata lambdafaagi ehituse olulisi jooni ja bakterite
mitmekesisust.
Aidata pilastel mista viiruste ja bakterite suhtelist
suurust.
T planeerimine
Bakteriofaagi mudeli tegemiseks kulub aega umbes 30 minutit, kuid
kui tuleb ka vrvida, vtab t rohkem aega. Sltuvalt tegijast kulub
aega kas tund vi pisut rohkem. Mrkus: See t sobib hsti
kodutks.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
pikud, milles on kirjeldatud viiruste ja bakterite ehitust;
materjalid mudeli valmistamiseks, nt. lmikukile, paksem paber,
pakkematerjalide jgid, lauatennise pallid, helmed jne;
krid;
liim, kleeplint vi vike klammerdaja;
vrvid.
Tkik
Viirused
Kasutage lambdafaagi mudeli tegemiseks nidist. Kopeerige pise
kontuurid lmikukile-le ja ligake see vlja. Voltige pise mudel kokku
ja kleepige kiiresti kuivava liimiga. DNA biheeliksi kujutamiseks
kasutage paksu niiti vi traati. Sabandi tegemiseks kasutage
joogikrt (realistlikuma mudeli saamiseks kasutage painduvat
soonilist krt, mida saab pikemaks venitada).
Bakterid
Bakterite (kepikeste ja kokkide) mudelite
tegemiseks kasutage olemasolevaid materjale.
Iga mudeli juures:
mratlege philised struktuurid, mis on eksponeeritud, nt.
rakumembraan, geneetiline materjal;
mrake organismi suurus, mida mudel kujutab;
melge, kuidas teistele lihtsalt seletada suhtelisi suurusi, niteks:
kui bakterid oleksid selle mudeli suurused, siis vrreldes nendega
peaksime meie olema majasuurused.
Tiendavalt
pilastel vib lasta teha ka taime- vi looma-raku mudeleid, mida
saaks kasutada prokaroo-tide ja eukarootide vaheliste erinevuste ja
endosmbioosi (eukarootide arvatava evolutsioonilise prinemise)
teooria selgitamisel.
Lisakirjandus
Mudelite valmistamist ksitletakse ka jrgmises ajakirjas:
Nicholl, L. and Nicholl, D. (1987) Modelling the eukaryotic
chromosome: a stepped ap-proach. Journal of BiologicalEducation 21
(2) 99 -104.
81. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
-3075305109855Nidis lambdafaagi mudeli valmistamiseks
Kopeerige lambdafaagi pise kontuurid lmikukilele.
Ligake see piirjooni mda vlja, voltige kokku ja liimige servadest
kiiresti kuivava liimiga.
Rakumembraan
Bakteriaalse DNA eraldamine
:ft * * jf'
k **** ~k ~k
Kesolevas ts kasutatakse bakterite rakukestade lhkumiseks lsosmi
(ensmi) ja rakumembraanide purustamiseks ning nukleiinhapete (DNA
ja RNA) vabastamiseks kodus tarvitatavat pesuvahendit.
Eesmrk
Eraldada Escherichia coli bakteri tvest K-12nukleiinhapped.
Ettevalmistused
Vhemalt 4 peva varem tuleb bakterikultuurid stmele kasvama panna
(vaid kllaldaselt kasvanud kultuurid annavad piisava koguse
nukleiinhapet).
T planeerimine
Kogu katse jaoks tuleb arvestada umbes 50 minutit. See sisaldab ka
30 minutit ooteaega, mille jooksul baktereid tdeldakse
ensmiga.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
Escherichia coli K-12 tiskasvanud kultuur;
lsosmi pulber - vajatakse vikseimat kogust, mida on vimalik spaatli
otsaga vtta;
6 ml klma etanooli (tstuslik metlalkohol on ka sobiv);
0,5 ml kodus kasutatavat vedelat pesuvahendit, nt. PrzV (Henkel),
Woolite (Reckitt & Colman);
klviaas;
3 ml destilleeritud vett;
2 katseklaasi;
pipett vi 1 ml plastmassist sstal lsosmi lahuse lisamiseks;
veevann 60 C;
termostaat vi veenu 37 C veega.
Tkik
Vhemalt neli peva varem pange Escbe-richia coli K-12 bakterikultuur
kasvama.
Lisage 5 ml bakterisegule vike kogus lsosmi ja segage hsti.
Hoidke segu 30 min. temperatuuril 37 C.
Lisage bakterisegule 0,5 ml kodus kasutatavat pesuvahendit.
Hoidke segu 2 min. veevannis temperatuuril 60 C.
Jahutage segu mne minuti jooksul klmas vees.
Valage klm etanool vga aeglaselt ja ettevaatlikult segu
pinnale.
Nukleiinhapped (DNA ja RNA) sadestuvad lemisse (etanooli)
kihti.
Tiendavalt
DNA-d vib vrvida, nt. metleensinise vi atsetoortseni
lahusega.
Ohutusnuded
Bakterikultuuridega ttamisel tuleb jrgida ohutusnudeid. Kuuma vee
kasutamisel (punkt 5) tuleb olla ettevaatlik.
Tnu
Kesolev t phineb katsel, mis viidi lbi Hertel et ai. ja Sbmuth et
ai. (1987) poolt, kes eraldasid DNA Bacillus subtiilsest. Tname
prof. Joseph Lengelerit (Osnabrckist), kes soovitas selles katses
kasutada pesuvahendit.
Joonisel on kujutatud bakterirakk, DNA ja rakustruktuurid (rakukest
ja rakumemb-raan), millesse toimivad lsosm ja pesuvahend.
Kromoeoom
Ribosoomid -^ valgusnteesi toimumise kobad
Rakukest
0,5 (im
511810198120Plasmiidid -vikesed DNA rngad
10 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotchnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
5 ml bakter segu
Klm vesi
Klm etanool
Pesuvahend
Loksutage katseklaasi, nii et sisu seguneb
DNA
ja RNA
Vhemalt neli peva varem pange stmesse kasvama Escherichia coli K-12
kultuur.
Lisage 5 ml bakterisegule vike kogus lsosmi ja segage hsti.
Hoidke segu
30 min. temperatuuril 37C.
Lisage bakterisegule 0,5 ml kodus kasutatavat vedelat
pesuvahendit.
Hoidke segu 2 min. 60 C veevannis.
Jahutage segu mni minut klmas vees.
Valage klm etanool vga aeglaselt ja ettevaatlikult segu
pinnale.
Nukleiinhapped (valged niidikesed) sadestuvad lemisse (etanooli)
kihti.
EIBE Biotehnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 11
DNA eraldamine sibulast
k-kit-kit-kjrifirir-k-kirir-k
Selles katses eraldatakse DNA ja RNA taimerakkudest. Kigepealt
purustatakse kude mehhaaniliselt. Koduses majapidamises kasutatava
nudepesuvahendiga lhutakse nii rakumembraan kui ka
tuuma-membraanid. Raku jnused eraldatakse filtreerimisega.
Lahusesse jvad nukleiin-happed ja lahustunud valgud. Valkude
lagundamiseks kasutatakse ensmi, seejrel sadestatakse
nukleiinhapped jklma etanooliga.
Eesmrk
Eraldada nukleiinhapped sibula kudedest. Mrkus: Katses esitatud
meetodil eraldatud nukleiinhape ei ole vga puhas. T peamiseks
eesmrgiks on kudedest DNA eraldamise ivtete tutvustamine.
Ettevalmistused
Etanool peab olema jklm. Selleks asetage etanool plastmassist
pudeliga klmkappi vhemalt 24 tundi enne katset.
T planeerimine
Katse kestab umbes 35 minutit, sealhulgas veevannis hoidmine 15
minutit.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
kgikombain vi mikser;
terav juurviljanuga ja likelaud;
suur plastmassist lehter;
veevann 60 C;
kann jga;
kaks 250 ml nud;
kohvifilter (mitte kasutada laboratoorset
filterpaberit);
keskmise suurusega sibul;
10 ml nudepesuvahendit (mitte kasutada
kontsentreeritud vahendit);
3 g keedusoola;
100 ml destilleeritud vett;
lOml plastpipett vedelike mtmiseks;
katseklaas;
klaasist segamispulk;
2-3 tilka proteaasi, nt. Neutrase (Novo
Nordisk);
umbes 6 ml jklma etanooli (tstuslik
metlalkohol on ka sobiv).
Tkik
Lisage keedusool nudepesuvahendile. Kallake juurde niipalju
destilleeritud vett, et kokku oleks lahust 100 ml.
Peenestage sibul, kuid mitte viksemateks kui 10 X 10 mm
tkkideks.
Valage peenestatud sibula tkkidele soola ja pesuvahendi segu.
Asetage nu 60 C veevanni tpselt 15 minutiks.
Jahutage segu 5 minutit jveevannis, segage pidevalt.
Kallake segu mikserisse ja kivitage see mitte kauemaks kui 5
sekundiks.
Filtreerige segu teise nusse. Jlgige, et vaht ei ummistaks
filtrit.
Lisage 2-3 tilka proteaasi katseklaasi, milles on umbes 6 ml saadud
segu. Loksutage seda veidi aega.
Valage jklm etanool ettevaatlikult mda katseklaasi seina nii, et
see moodustaks pealmise kihi sibula ekstrakti peal. Jtke katseklaas
mneks ajaks seisma.
Nukleiinhapped sadestuvad lemisse (etanooli) kihti.
Tiendavalt
DNA-d vib vrvida, nt. metleensinise vi atsetoortseiini
lahusega.
DNA-d saab eraldada ka mnest loomsest koest (nt. tursamarjast,
maksast, vasika harknrmest). Mikseri asemel lhutakse kude uhmris
uhmrinuiaga (koos kvarts-liivaga). Nii jvad DNA ahelad
terveks.
Ohutusnuded
Erilisi ohtusid selle katsega ei kaasne, kuid sibula peenestamisel
ja mikseri kasutamisel tuleb olla ettevaatlik.
Tnu
See meetod on adapteeritud Alison Rasmusseni ja Robert Mathesoni
raamatust " A Source-book of Biotechnology Activities"(1990),
National Association of Biology Teachers / North Carolina
Biotechnology Center. ISBN: 0941212092.
Raamatu saate tellida aadressil: NABT, 11250 Roger Bacon Drive #19,
Reston, Virginia 22090, USA.
12 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloq%iaaIase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
.;
10 ml noudepesuvahendit
3 g keedusoola
100 ml vett
1 keskmise suurusega sibul
Lisage sool pesuvahendile ning seejrel lisage niipalju vett, et
segu ruumala oleks 100 ml. Segage hoolikalt, et sool
lahustuks.
Lisage peenestatud sibul soola ja pesuvahendi segule.
Nudepesuvahend lhub rakumembraani ja tuumamembraanid vabastades
DNA.
Kuumutage segu 60 C veevannis 15 minutit.
Krge temperatuur kiirendab protsessi ...
... ja denatureerib DNaasid, mis lhustavad DNA-d.
Jahutage segu jnus mne minuti jooksul.
... aga selle toimel vib laguneda ka DNA ahel ..
seega on jahutamine jvannis vajalik.
kohvifilter
jklm etanool
proteaas
i j
hoolikalt segada
Kivitage mikser mitte kauemaks kui 5 sek.
Mikser aitab lhkuda sibula rakud, kuid liiga tugev segamine tkeldab
ka DNA.
Filtreerige segu.
Filtreerimisega saame DNA ja valkude lahuse.
Lisage 2-3 tilka prote-aasi umbes 10 ml sibula ekstraktile ja
segage hoolikalt.
Proteaas lagundab lahuses olevad valgud.
Lisage seguga vrdne kogus jklma etanooli, valades see
ettevaatlikult sibula ekstrakti pinnale.
Etanool peab olema JKLM - hoitud eelnevalt 24 tundi klmkapis.
DNA
eraldamine sibulast
DNA sadestub lemisse (etanooli) kihti.
DNA ei lahustu etanoolis, seetttu muutub selle sade lemises kihis
nhtavaks.
DNA RNA
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 13
Amlaasi tootmine mulla bakterite poolt
-tt iiA * ** '* * * *Jr~k it
Trkliseahel koosneb glkoosijkidest, mis on hendatud nii, et
moodustub kas lineaarne (amloos) vi hargnenud polmeer
(amlopektiin). Neid polmeere lagundavad ensmid amlaasid, mida
toodavad mitmed organismid, kaasaarvatud bakterid ja seened. On
avastatud, et paljud mikroorganismid on sobilikud nende ensmide
tootmiseks. Kesolevas katses vaadeldakse amlaaside saamist mulla
bakterite abil.
Eesmrk
Jlgida looduslikke mulla baktereid, kestoodavad amlaasi.
Vajalikud eelteadmised
pilased peavad valdama mikrobioloogiaalaseid ldisi tvtteid,
kaasaarvatud neid, mis tagavad steriilsuse. Kasuks tulevad ka
teadmised trklise ja joodi reaktsioonist.
Ettevalmistused
Joodilahus peab olema valmistatud vhemalt pev varem, sest
joodikristallide tielik lahustumine vtab aega.
Trkliseagar ja steriilse veega pudelid peavad olema valmis vahetult
enne katse algust. Mullaproovid tuleks enne kasutamist hu kes
kuivatada.
Steriilsed vatitampoonid. Poest ostetud vatitampoonide plastmassist
vars ei kannata autoklaavimist ja mnda tpi vatitupse vib olla
antiseptiliselt tdeldud. Seetttu tehke ise vatitampoonid ja
autoklaavige need kas McCartney pudelis vi alumiiniumfooliumis 15
minutit temperatuuril 121 C.
T planeerimine
Petri tasside ettevalmistamine: 45 min. Tulemuste vaatlemine 2-3
peva hiljem: 15 min.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
steriilne Petri tass 15-20 ml steriilse agar-stmega; valmistatud
tstuslikust stmeagarist 0,2% lahustuva trklise lisamisel;
lg kuiva mulda, mis on vetud 10 cm sgavuselt;
joodilahus, mis on saadud lg joodikristallide ja 2 g kaaliumjodiidi
lahustamisel 300 ml destilleeritud vees;
15 ml steriilset destilleeritud vett McCartney pudelis;
steriilsed omatehtud vatitampoonid;
viltpliiats Petri tasside mrgistamiseks.
14 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotchnoloqj>iaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Tkik
1. Pange 1 g kuiva mulda 15 ml destilleeritud vette ja segage
hoolikalt mulla peenestamiseks.
2.
3.
Kasutades steriilset vatitampooni katke trldiseagari pind mulla
seguga. Kirjutage Petri tassile oma initsiaalid, kuupev ja klvatud
materjali pritolu. Hoidke klvatud tassi mberpratuna 2-3 peva 30 C
juures. Kallake joodilahust ettevaatlikult inkubeeri-tud tassile
kattes selle umbes 1 mm kihiga. Kohad, kus on ikka veel trklist,
vrvuvad sinkjas-mustaks (joodi molekulid sisenevad glkoosijkidest
koosneva trklise helikaal-se ahela keskossa). Helepruunid alad
(joodilahuse vrv) mrgivad koloonia ri,
juhul kui mikroorganismid on lagundanud trklise.
Ohutusnuded
NB! Mnes riigis on keelatud avada tasse, milles on kasvatatud
tundmatuid mikroorganisme. Vajadusel vib kasutada mulla asemel
Bacillus subtiiis'e kultuuri. Katset lbi viies ja kultuuride
hvitamisel tuleb jrgida mikrobio-loogiaalaseid ldisi
ohutusreegleid. Klvatud tassidelt ei soovitata tundmatuid
mikroorganisme edasi klvata. Jood on toksiline ja seetttu tuleb
olla ettevaatlik.
(D
Valmistage ette Petri tass trkliseagariga.
Amulaasi tootmine mulla mikroorganismide poolt
1402080533400Kuiv muld
Destilleeritud vesi
Segage 1 g mulda 15 ml destilleeritud vees.
853440283210Klvake steriilse vatitampooniga mulla segu
stmele.
Hoidke tassi 2-3 peva 30 C juures.
Hoidke tassi mberpratuna
Hele ala mrgib trklise puudumist
Kasutage joodilahust, et nha, kus on trklis lagunenud.
Tsellulaasi tootmine
it *k **k k k- k kr k- ~k -kk
Tselluloosirikaste jtmete kasutamisel fermentatsiooni protsessi
lhteainena on suur thtsus. Sellega muudetakse kasutud lhteained
mitmeteks vrtuslikeks produktideks. Enamik tsellulaasi-dest
(ensmid) saadakse tstuslikult seene Trichoderma reesei
fermentat-sioonil. Kesolevas ts kasutatakse bakterit Cellulomonas.
See kasvab Petri tassil kiiremini ja moodustuvat tsellulaasi on
kergem mta.
Eesmrk
Korraldada katse bakteri Cellulomona/etsellulaasi koguse
hindamiseks.
Ettevalmistused
Ette valmistada Cellulomonas'e kultuurid toite -lahuses (nt.
McCartney pudelis) klassis kasutamiseks. Seda tuleks teha 2-3 peva
enne planeeritud katset. Kultuure peaks hoidma 25-30 C
juures.
Karboksmetltselluloosi sde koosneb 0,5 g karboksmetltselluloosist
(tselluloosi lahustuv vorm); 0,1 g NaNO,; 0,1 g K2HP04; 0,1 g KC1;
0,05 g MgS04; 0,05 g prmi ekstraktist ja 0,1 g glkoosist 100 ml
vees. Sde muudetakse tahkeks agari lisamisega 1,7%-ni.
T planeerimine
Petri tasside ettevalmistamine ja bakterikultuuri
klvamine 45 min.
Tulemuste vaademine 2-3 peva hiljem 15 min.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
Cellulomonas sp. kaldkultuur;
steriilne Petri tass, mis sisaldab 15 ml karboksmetltselluloosi
(vt. " Ettevalmistused" );
steriilne vesi (McCartney pudelis);
2 steriilset 1 ml pipetti vi filtriga pipett ja 2 steriilset
otsikut;
jtmenu, mis sisaldab 5% Chlorate I lahust, nt. Domestos
(Lever);
Kongo punase vesilahus (1 mg/ml);
IM naatriumkloriidi lahus;
etanool (korgipuud steriliseerimiseks);
5 mm lbimduga korgipuur;
termostaat 25-30 C;
viltpliiats Petri tasside mrgistamiseks.
Tkik
Kastke 5 mm lbimduga korgipuur korraks alkoholi ja viige seejrel
mneks sekundiks leegi kohale. NB! Hoidke korgi-puuri
horisontaalselt, et leegid ei leviks mda vart lespoole ega pletaks
ktt.
Kergitage tassi kaant hest servast pisut ja ligake agarist auk
vlja.
Kahe augu saamiseks korrake 1. ja 2.' punktis esitatut.
Mrgistage mlemad augud, nt. thtedega C [Cellulomonas) ja V
(steriilne vesi, kont-rollauk).
Viige hte auku bakterikul tuuri ja teise steriilset vett, kasutades
mlemal juhul steriilset pipetti. Kasutatud pipetid pange
desinfitseerivasse lahusesse.
Hoidke tasse kuni ndal aega temperatuuril 25-30 C. Kui tasse on 30
C juures hoitud 48 tundi tekivad bakteri Cellulomonas'e elutegevuse
tagajrjel kuni 16 mm lbimduga vrvusetud alad.
Prast inkubeerimist ...
7.Vrvige stme pind tassis Kongo punaselahusega 15 min., seejrel
vrvitustage seesoolalahusega 10-15 min. Vrvusetapiirkondades on
karboksmetltsellulooslagundatud (3-1,4-glkaanideks.
Viimasekoostises on kuni seitse glkoosijki.Vrvuseta alade
diameetrite mtmisegasaab vrrelda tselluloosi
lagundamiseaktiivssi.
Tiendavalt
2.
3.
1. Tassil olevatesse aukudesse vib pipeteeri-da mulla segu, et
jlgida tsellulaasi moodustamist mulla bakterite poolt. Sama vtet
vib katsetada tstuskku tsellulaasi valmistamiseks. Tselluloosi
lagundamist vib jlgida mitmel peval kasutades selleks rohkem
tasse.
16 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1.
Steriliseerige
korgipuur
kuumutades
seda koos
etanooliga
tuleleegis.
NB! Etanool on kergestisttiv!
Vatitups
Klvake hte auku Cellulomonas e kultuuri ja teise steriilset
vett.
Hoidke tasse 48 tundi temperatuuril 30 C.
Kinnitage tassi kaas kleeplindiga
5. Vrvige tass.
Mtke selle ala diameeter, kus tselluloos on lagunenud.
4.
Ligake agarist vlja ja eemaldage kaks ringi moodustades sellega
stmesse kaks auku.
Ohutusnuded
Katse tegemisel tuleb jrgida mikrobioloogia-alaseid ldisi
ohutusreegleid ja steriilsuse nudeid.
NB! Kui kasutatakse mullaproove (vt. " Tiendavalt" , 1.), vivad
kohalikud seadused keelata klvatud tasside hilisema avamise.
EM3E Biotehnoioogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 17
Antibiootikumi tootmine
Paljud mikroorganismid toodavad antibiootikume - aineid, mis
prsivad bakterite kasvu. Alates penitsilliini avastamisest
1940-ndatel aastatel (seenest Penicillium) on need ained vga
efektiivselt aidanud videlda haiguste vastu. Tnapeval toodetakse
kige thtsamad antibiootikumid bakterist Streptomyces.
Eesmrk
Vaadelda antibiootikumi streptomtsiini tekkimist
Streptomycesgriseufest ja selle mju mitmetele
mikroorganismidele.
Vajalikud eelteadmised
Antibiootikumide pritolu ja mju; resistentsuse tekkimine ja levik
(vt. jrgnevaid mrkusi).
Ettevalmistused
Vajatakse aktiivseid Streptomyces griseu/c kultuure. Neid tuleb 2-3
peva kasvatada 15-20 ml agarstmega tassil. Eelnevalt peab olema
ette valmistatud kultuur, mis neile tassidele klvatakse. Selleks
viige kaldkultuurilt klviaasatis Streptomyces^ 1 ml steriilsesse
stmesse.
Pildil: kolmepevane Streptomyces griseuse kultuur (vasakul).
Kontrollorganismid on (levalt): Candida utilis, Micrococcus luteus,
Pseudomonas fluorescens, BaciHus mycoides ja Escherichia
coli.
Seejrel pipeteerige see katseklaasi, milles on 5 ml steriilset
sdet. Hoidke klvi 24 tundi temperatuuril 30 C.
Klvake Petri tassidele peva seisnud Streptomyces griseuse kultuur
tmmates heainsa vertikaalse joone vasakule servale, nii et parem
pool jb steriilseks.
Hoidke tasse 3-4 peva temperatuuril 30 C.
Lisaks sellele valmistage ette kontrollorganismi-de klvid (nt.
BaciHus mycoides, Candida utilis, Escherichia coli K-12,
Micrococcus luteus, Pseudomonas fluorescens).
T planeerimine
Petri tasside ja kuivatava materjali ettevalmistamine: 60 min.
+
esialgse Streptomyces'e kultuuri kasvatamine: 24 tundi ning seejrel
veel 72-96 tundi. Tassidele klvamine: 20 min. Kasvatamine: 24-72
tundi.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu).
termostaat 30 C;
klviaas;
steriilne Petri tass, millel on 15-20 ml agarsdet. Sellele on
tmmatud triip bakteriga Streptomyces griseus ning lastud kasvada
48-72 tundi (vt. " Ettevalmistused" );
kontrollorganismidena valik jrgmistest bakteritest
kaldkultuuridena:
Candida utilis (prm), DSM 02361
Micrococcus luteus (bakter), DSM 20030
Pseudomonas fluorescens (bakter),
DSM 50090
Ballus mycoides (bakter), DSM 2048
Eschenclxa eolt K-12 (bakter), DSM 498.
NB! Jrgige kohalikke seadusi mikroorganismide kasutamise kohta
koolis. Sellele vib olla mnes riigis piiranguid.
18 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaaiase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Tkik
1.Igale ettevalmistatud tassile Streptomyces'tkultuuriga klvake
kontrollorganismidjrgnevalt:
Steriliseerige klviaas tmmates seda lbi Bunseni pleti leegi ja
laske aasal pisut jahtuda.
Kastke aas kontrollorganismi kultuuri ning tmmake sellega ks
horisontaalne triip tassi paremale poolele Streptomyces z
vertikaalse joone krvale. Jlgige, et vrreldes Streptomyces1 &
klviga oleksid jooned tmmatud tisnurga all ning algaksid selle
lhedalt.
NB! Klviaas ei tohi Streptomyces'e kultuuri puudutada!
c)Steriliseerige klviaas tuleleegis ja korrakepunkte a-c kigi
kontrollorganismidega.
Hoidke tasse 2 peva temperatuuril 30 C.
Vaadelge tasse.
Ohutusnuded
Katse tuleb lbi viia laboris jrgides mikrobio-loogiaalaseid ldisi
ohutusreegleid. Katse kigus saadud antibiootikumi kogus ei ole
ohtlik.
Mrkus
Streptomyces griseus toodab antibiootikumi streptomtsiini, mis
difundeerub mbritsevasse stmesse. Streptomtsiin ja teised sama rea
antibiootikumid prsivad valgusnteesi, inakti-veerides bakteri
ribosoomide viksema (30S) alamksuse. Mned organismid on sellele
antibiootikumile tundlikud (Bacillus mycoides, Escherichia coli,
Micrococcus luteus), teised mitte {Pseudomonas fluorescens).
Streptomtsiin ei mjuta prmseeni (Candida utilis), kuna nad on
eukaroodid, kelle ribosoomid on teistsugused.
5447030118745
2953385643255
ks tmm vasakule
Valmistage ette Petri tass Streptomyces griseus'e klviga 3-4 peva
enne katse tegemist.
Kontroll-kultuurid
Steriliseerige traadist klviaas
rge puudutage Streptomyces'^
Tmmake kontroll-orgnismiga joon kuni Streptomyces'e jooneni
Kirjutage tassi phjale
161290252730Kinnitage tassi kaas kleeplindi ga
Korrake seda teiste kontrollorganismidega ja rge unustage iga kord
klviaasa steriliseerimast.
Hoidke tassi mberpratuna 2-3 peva temperatuuril 30 C.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 19
iir*+ *
Leivataigna valmistamine
* ,Ki:- i i- >-
Biotehnoloogia rakendamise heks vanimaks niteks on leivategemine,
mida tendavad leiud Vana-Egiptusest (4000 eKr). Suurbritannias
tehakse leiba traditsiooniliselt nisujahust, veest ja soolast,
vahel lisatakse ka rasvainet. Taigna massisse " ptakse
lksu"prmseened. Amlaasid hakkavad niisutatud jahus muutma trklist
glkoosiks, millest toituvad seotud prmi-rakud.
Lisaks vajab prm lmmastikuallikat. Jahu valgu (gluteeni) osalisel
hdrol-sil tekivad peptiidid ja aminohapped. Prmi elutegevuse
tulemusena anaeroobses keskkonnas tekivad ssinikdi-oksd ja
alkohol.
Tnu gluteenile on taigen elastne ning ssinikdioksiid ei pse vlja,
vaid suurendab humulle taignas, mistttu see kerkib.
Eesmrk
Katsete abil uuritakse retsepti erinevate komponentide mju jahu
valkudele ja ensmidele.
T planeerimine
Sltuvalt tingimustest (temperatuurist jm.) kulub aega umbes 50
minutit.
Tvahendid ja materjalid
1 leiva kohta
1 g kuivatatud prmi; 75 g krgema sordi jahu; 50 ml vett;
lisaained vastavalt soovile, nt. askorbiinhape, OC-amlaas,
kaaliumbromaat (vt " Tiendavalt" );
nu taigna segamiseks; jmedad klaaspulgad segamiseks; kaks 100 ml
mtsilindrit; kell.
Tkik
Lahustage kuivatatud prm vees. Lisage jahu ja segage hsti.
Veeretage taignast vorstikujuline rull ja asetage see hte
mtsilindrisse.
Mrkige les taigna krgus silindris iga kmne minuti jrel. Tehke
vaadusi tunni aja jooksul.
Tiendavalt
Kuidas mjutavad taigna kerkimist erinevad prmseened (nt. tavaline
kuivatatud prm vrreldes vrske prmiga)?
Kuidas mjutavad taigna kerkimist erinevad jahusordid (nt. krgema
sordi jahu, milles on vrreldes esimese ja teise sordi jahuga palju
gluteeni, kuid vga vhe a-amlaasi)?
Missugune on taignaparandaja askorbiinhappe (vitamiin C) mju taigna
kerkimisele? Askorbiinhape reageerib ensmidega taignas piirates
S-S-sidemete moodustumist gluteeni aminohappejkide vahel. (Lisage
retseptile 1 g askorbiinhapet.)
Kuidas mjutab taigna kerkimist a-amlaasi lisamine? Kuidas neid
erinevusi seletada?
Taignaparandaja kaaliumbromaat soodustab S-S-sidemete tekkimist
gluteenis krvuti olevate aminohappejkide vahel, mille tulemusel
saadakse elastsem ning paremini kerkinud taigen. Muidugi nrgendab
liigne paisumine taignat. Vrrelge taignaid, mis on valmistatud
selle lisandiga ja ilma.
Sool pidurdab proteaaside tegevust ja ei lase gluteenil muutuda
kleepuvaks massiks, mis ei suuda siduda ssinikdioksiidi. Liigne
sool moodustab tugevaid ioonilisi sidemeid valgumolekulide
krvalahelatega, vhendades nende elastsust. Tulemusena saame kva
leiva. lemrane sool takistab ka prmseente kasvu. Proovige leida
taigna optimaalne soolasisaldus.
20 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Lisakirjandus
Onfood and cooking. The science and lore of the kitchen by Harold
McGee (1991) Harper Colns Publishers. ISBN: 0 00412657 2.
Pritchard, P.E. (1992) Studies on the bread-improving mechanism of
fungal alpha-amylase Journal of Biological Education 26, (1)
12-18
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp19991.
moodul: Mikroobid ja molekulid 21
Seotud parmirakud
r jr *k *# it j?
Harilik nn. pagariprmi Saccharomyces cerevisiae ei ole vimeline
kasutama laktoosi. Ensm |3-galaktosidaas lagundab laktoosi
glkoosiks ja galaktoosiks. Kui prmseened on seotud koos selle
ensmiga, siis on nad vimelised kasvama laktoosi sisaldavas
keskkonnas. Prmseened kasutavad moodustunud kahest suhkrust
(glkoosist ja galaktoosist) esmalt glkoosi. Kui glkoosivarud on
ammendatud, kohandub prmi ainevahetus laktoosi teise
lagunemisprodukti -galaktoosi - kasutamiseks. Prmi elutegevus on
kergesti jlgitav. Selleks mdetakse eralduva gaasi (ssinikdioksiidi)
mahtu, mis tekib krimisprotsessis.
Eesmrk
Uurida kvantitatiivselt krimisprotsessi.
Ettevalmistused
Naatriumalginaat on vees vhelahustuv. Seda tuleb lahustada segades
kuumas vees. Seetttu tuleb naatriumalginaadi lahus eelnevalt
valmistada. Kui on vaja naatriumalginaadi lahust silitada, siis on
soovitatav see kigepealt autoklaavid. NB! Kigi lahuste tegemiseks
kasutada destilleeritud vi deioniseeritud vett, sest kraanivees
olevad kaltsiumioonid phjustavad alginaadi sadestu-mist.
T planeerimine
Seotud prmirakkude valmistamiseks kulub 10-15 minutit ja
krimisprotsessiks kuni ndal.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
10-15 ml 4% naatriumalginaadi lahust;
100 ml 1,5% kaltsiumkloriidi lahust;
10 ml pipett;
teesel;
kaks 200 ml nud;
kaks 250 ml koonilist kolbi;
kaks vljalaskeavaga korki;
kaks suurt (nt. 500 ml) nud;
100 ml mtsilinder;
steriliseerimislahus, nt. naatriummetabisul-
fiidi lahus vi valmistoode, nt. Milton
(naatriumhpokloriidi lahus, Procter &
Gamble);
Kaltsiumalginaadis seotud parmirakud.
ca 1 liiter 13% naatriumkloriidi lahust
(sobib tavaline keedusool);
100 ml sdet, mis sisaldab 2 g glkoosi,
1 g prmi ekstrakti ja lg peptooni;
100 ml sdet, mis sisaldab 2 g laktoosi,
g prmiekstrakti jalg peptooni;
ml (3-galaktosidaasi, nt. YMcto^ym (Novo Nordisk); vrske vi
kuivatatud pagariprm.
Tkik
Valmistage seotud ensmi ja prmi graanulid jrgnevalt:
Segage vikeses nus kuivatatud prm 25 ml destilleeritud veega. Katke
nu ja jtke 10 minutiks toatemperatuuril seisma.
Teises vikeses nus segage naatriumalginaadi lahus ja
[3-galaktosidaas. Lisage sellele 10 ml prmisegu.
Vtke natuke prmi, ensmi ja alginaadi segu pipetti ja lisage seda
tilkhaaval teises suures nus olevale kaltsiumkloriidi
lahusesse.
Laske kaltsiumkloriidi lahusel, millesse on seotud ensm koos
prmirakkudega,
10 minuti jooksul kvastuda.
22 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
5. Eraldage teeselaga graanulid lahusest ja loputage neid kraanivee
all.
Klmkapis vib graanuleid silitada steriilses vees kuni kolm
peva.
Krimisprotsessi lbiviimine:
Steriseerige kolvid metabisulfaadi lahusega vi mne teise sarnase
kemikaaliga. Prast steriliseerimist loputage kolbe veega.
Valage kolbidesse steriilset sdet: hte kolbi glkoosi sisaldavat
sdet (kontroll-kolb) ja teise laktoosi sisaldavat sdet.
Pange vrdne kogus seotud prmi graanu-leid mlemasse kolbi.
Asetage kolbidele korgid.
Hoidke kolbe temperatuuril 21-25 C. Juhtige tekkiv gaas lbi 13%
naatriumklorii-
di lahuse (ssinikdioksiid ei lahustu selles lahuses). Kogunenud
gaasi maht registreerige sobiva ajavahemiku jrel. 6.Tehke graafik,
mille ks telg thistab eraldunud gaasi hulka ja teine aega.
Tiendavalt
Vib kasutada erineva pritoluga prmi, nt. veiniprmi vi
pagariprmi.
Muutke (3-galaktosidaasi kontsentratsiooni, temperatuuri ja teisi
muutujaid.
Ohutusnuded
Gaas vib klaasnudes olla ohtlik. Kontrollige, et krimisproduktil
(CO ) oleks piisavalt vaba vljaps. Keemilisel steriliseerimisel
tuleb olla hoolikas ja jrgida kemikaalide kasutusjuhised.
Rakkude sidumiseks kasutatakse kige laialdasemalt
kaltsiumalginaati. Meetod sobib ka elavate rakkude puhul, kuna see
toimub " pehmetes"tingimustes. Meetodi kasutusalad hlmavad elusate
vi surnud rakkude sidumist bioreaktorites ning taime protoplastide
ja taimeloodete sidumist koekultuuris paljundamiseks (ehk
mikropaljundamiseks). Samuti kasutatakse seda hbridoomi rakkude
sidumiseks monokloonsete antikehade tootmisel ja ensmide vi
ravimite kohale- kinnitamiseks (vt. tabel jrgmisel lehel).
Seotavad rakud vi ensmid segatakse kigepealt naatriumalginaadi
lahusega. Moodustunud segu tilgutatakse lahusesse, mis sisaldab
mitme-valentseid katioone (tavaliselt Ca2+). Niipea, kui tilgad
langevad lahusesse, moodustavad nad koheselt ruumilise struktuuri,
mis seob rakud alginaadi kolmemtmelisse vresse.
Lisakirjandus: Smidsrod, O. & Skjk-Brask, G. (1990) " Alginate
as an Immobilization Matrix for Cells."Trends in Biotechnology 8
(3) 71-78.
EIBE Biotehnoloogiaahise Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 23
Joonistage graafik, mille ks telg thistab eraldunud gaasi hulka ja
teine aega.*
Ssinikdioksiid
13%
naatriumkloriidi lahus
Laktoosi lahus, millele on lisatud peptoon ja prmiekstrakt
Prmirakud kasutavad ensmi poolt tekitatud suhkruid moodustades
ssinikdioksiidi ja etanooli.
PARM
Ensm lagundab laktoosi glkoosiks ja galaktoosiks
Prm, laktaas ja naatriumalginaadi lahus.
Nited alginaadiga seotud rakkude kasutusaladest (Smidsrod &
Skjak-Brsek, 1990)
RakudToode/eesmrkRakudToode/eesmrk
Bakterid
Erwinia rhapontici Pseudomonas denitrificans Zymomonas
mobilis
Tsanobakterid Anabena sp.
Seened Kluyveromyces bulgaricus Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces bajanus
Vetikad
Botryococcus braunii
Isomaltuloos Joogivee puhastamine Etanool
Ammoniaak
Laktoosi hdrols Etanool Sampanja tootmine
Ssivesinikud
Taimerakud
Chatharanthus roseus
Mitmed taimed Taime protoplastid
Imetajate rakud
Hbridoomid Langerhansi saarekesed Fibrobkstid vi lmfoomirakud
Alkaloidid vhktve raviks Kunstseemned Rakutehnoloogia,
mikroskoopia
Monokloonsed antikehad Insuln/implantatsioon Interferoonid (CX vi
(3)
24 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Mikrobioloogiline ktteelement
k-k-kit-kir-k-k-kirlr ir -k -k ie
Aastakmneid peeti elektrit tootvaid mikroorganisme bioloogilisteks
kurioosu-mideks. Tnapeval ennustavad teadlased nende organismide
kasutuselevttu kellades ja kaamerates, Kolmanda Maailma
energiaallikates ja tstusjtmeid elektriks muutvates bioreaktorites.
Kesolevas ts kirjeldatud ktteelement annab nrka elektrivoolu. Vool
tekib prmseente rakkude hingamisprotsessi elektrontransportahe-las
olevate elektronide energia arvelt. Ktteelementi saab kasutada
hingamis-reaktsioonide uurimiseks uudsel viisil. Lisainformatsiooni
leiate ajakirjast: " BIO/ technology Education" , kide 1, number 4,
lk. 163-168.
Eesmrgid
Tutvustada hingamisreaktsioonide uurimis-vimalusi.
Uurida mikroorganismide hingamist mjutavaid faktoreid.
Nidata, kuidas orgaanilisi jkaineid saab kasutada elektri
tootmiseks.
Ettevalmistused
Lahused tuleb eelnevalt valmistada. Leotage katioonvahetusmembraani
enne kasutamist destilleeritud vees 24 tundi. Kuivatatud prm-seeni
vib taaselustada siis, kui ktteelement on juba kokku pandud.
T planeerimine
Ktteelemendi kokkupanemiseks kulub umbes 30 minutit.
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
Perspex (ICI) ktteelement, ligatud 4 mm paksusest lehest;
kaks neopreenist tihendit;
sobiva suurusega katioonvahetusmemb-raan (membraani vib korduvalt
kasutada, kuid see sulab autoklaavimisel);
kaks sobiva suurusega ssinikfiibrist elektroodi;
kaks sobiva suurusega hukese klaasriide tkki;
kaks 10 ml plastmassist pipetti;
kamber ja tagasein liimitakse omavahel kokku akvaariumikiti
(silikooni) abil
-201295121920klaasriie isoleerib elektroodi membraanist
Mikrobioloogilise ktteelemendi kokkupanek (tpsed mtmed ei oma
thtsust - joonisel oleva ktteelemendi suurus on ca 55 X 55
mm)
Kttelemendi saate osta:
NCBE
The University of
Reading
POBox 228
Reading RG6 6AJ, UK
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 25
anood
katood
4:
O elektroni this
4
metleensinine (redutseeritud)
Ktteelemendi tphimte
glkoos
ssinikdioksiid
kaaliumheksa-tsanoferraat
Fe(CNV|-
r
Fe(CN)^
^'metleensinine (oksdeeritud) 4 H+
^
katioonvahetusmembraan
Kokkupandud ktteelement
Petri tassi kaas, millele asetada ktteelement;
kaks elektrijuhet koos kinnitusklambritega;
0-5 V voltmeeter vi multimeeter ja/vi madalpingemootor;
krid;
Kigi alljrgnevate lahuste valmistamisel tuleb vee asemel kasutada
0,1 M fosfaatpuhvri lahust pH 7,0.
kuivatatud prm, millele on lisatud 0,1 M fosfaatpuhvri lahust.
Tulemusena saadakse pudrutaoline mass (mitte lisada glkoosi-lahust
enne, kui prm on puhverlahuses elustatud);
5 ml 10 mM metleensinise lahust;
5 ml 1 M glkoosilahust;
10 ml 0,02 M kaaliumheksatsanoferraadi (III) lahus (nimetatakse ka
punaseks veresoolaks).
0,1 M fosfaatpuhvri lahuse (pH 7,0)
3,29
tegemiseks lahustage 4,08 g Na9HP04 j NaH2P04 500 ml destilleeritud
vees.
Tkik
Ligake ssinikfiibrist kaks elektroodi.
Ligake klaasriidest kaks tkki nii, et need sobiksid ktteelemendi
sisse.
Pange ktteelement kokku, nagu on nidatud joonisel.
Asetage kokkupandud ktteelement Petri tassi kaanele, et lekkida viv
vedelik maha ei lheks.
Segage kokku " prmipuder" , glkoosilahus ja metleensinise lahus.
Kandke segu pipetiga ktteelemendi hte kambrisse.
Teisele poole pipeteerige kaaliumheksatsanoferraadi (III)
lahust.
7.
hendage voltmeeter vi multimeeter klambritega elektroodide klge.
Sellist tpi ktteelemendid annavad 0,4-0,6 V pinge. Mrkus: Vool
peaks tekkima kohe. Kui nit on 0, kontrollige hendusi ja seda, et
ssinikfiibrist elektroodid ei puutuks kokku katioonvahetus-
Tiendavalt
1.Suurema pinge saamiseks vib hendadakokku mitu ktteelementi.
Ktteelemendisuuruse (vi elektroodide pindala) suurendamine annab
tugevama voolu, pinge eimuutu.
Vib kasutada erinevaid stmeid ja/vi prmisorte, nt. veiniprmi vi
pagariprmi. Mrkus: Turvalisuse mttes ei soovitata selles
ktteelemendis kasutada teisi mikroorganisme.
Uurida vib ka temperatuuri mju ktteele-mendile. (rge unustage
kontrollkatseid, mis on vajalikud sellist laadi vrdluste
tegemiseks).
Ohutusnuded
Kaaliumheksatsanoferraat (III) on mrgine ja selle kasutamisel on
kaitseprillide kandmine kohustuslik. Lahuse silma sattumisel
loputage neid rohke veega ja prduge arsti poole. Lahuse
allaneelamise korral anda kannatanule palju juua ja viia arsti
juurde. Kasutatud lahuste hvitamisel jrgida kohalikke
seadusi.
Tnu
Mikrobioloogilise ktteelemendi loojaks on Dr. Peter Bennetto
Londoni King's Kolledist.
26 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Geenilekanne
bakterite
*
konjugatsioonil
kA
* # * -
Looduses kanduvad geenid bakterite vahel le mitmel viisil. Ilmselt
on need mehhanismid tekkinud kiiresti muutuvate keskkonnatingimuste
tttu. Reeglina asuvad kige liikuvamad geenid plasmiidides.
Plasmiidid on vikesed ringikujulised DNA molekulid, mis
replitseeruvad iseseisvalt. Nad sisaldavad vikest arvu geene, mis
vimaldavad bakteril lagundada ohtlikke aineid keskkonnast, nt.
raskmetalhhendeid ja antibiootikume.
Looduses esineb kolm tpi geenilekan-net:
Trasformatsioon - vaba DNA levtmine rakku mbritsevast
keskkonnast;
Transduktsioon - DNA lkumine hest rakust teise bakteriofaagi
abil;
Konjugatsioon - spetsiaalsete F-plasmiidi-de lekanne lbi kitsa
kanalikese (sugufib-rilli), mis hendab kahte bakterirakku (joonis
1).
Geenitehnoloogid kasutavad kiki neid meetodeid (eriti
transformatsiooni) selleks, et sisestada bakteritesse teatud
geene.
Jrgnevas katses uuritakse konjugatsiooni kahe bakteritve
vahel.
NB! Kesolevas ts jlgitakse looduslikult toimuvaid protsesse,
baktereid ja plasmiide. Seetttu ei ole siinkohal tegu
geenitehnoloogia ega insenergeneetikaga.
Joonis 1: Konjugatsioon ja F-plasmiidide lekanne bakterirakkude
vahel.
1. Lahtikeerdumata ja
replitseerunud F-plasmiid
Plasmiid sisaldab sugufibrilli moodustavate valkude geene
F-plasmiid
sugu-fibrill
Doonor
bakteri-kromosoom
2. Uheahelaline DNA liigub lbi sugufibrilli retsipiendi rakku
i
3. Komplementaarne DNA on snteesitud ja on moodustunud uus
F-plasmiid
Retsipient
EIBE Biotchnoloogiaalasc Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 27
Doonor 'Escherichia coli
Lae* tviLac> 9een
plasmiidis
F-plasmiidid
Niinimetatud F-plasmiidid (F thendab fertiilsust, viljakust)
sisaldavad geene, mis vimaldavad plasmiidide lekannet doo-norrakust
retsipientrakku (bakterite konju-gatsioonil).
F-plasmiidid vivad kanda ka teisi geene. Niteks kesolevas uurimuses
sisaldavad doonorrakud plasmiidi, mida nimetatakse F Lae. See geen
vimaldab lagundada laktoosi (bakterit nimetatakse seetttu Lac+
tveks). Retsipient, millel see plas-miid puudub, ei suuda laktoosi
lagundada (nimetatakse Lae tveks).
MacConkey agariga tassidel saab neid kahte tve eristada vrvuse
jrgi: doonor moodustab punase koloonia, retsipient aga valge
(joonis 2).
Doonori ja retsipiendi rakkude kokkusegamisel kanduvad F Lae
plasmiidid le donoorilt retsipiendile. Sellisel viisil omandab
retsipient vime laktoosi lagundada ning teda nimetatakse
transkonjugandiks.
Geneetiline " trikk"vimaldab eristada doonorit, retsipienti ja
transkonjuganti.
Joonis 2:
Retsipient
Escherichia coli
Lae tvi
Doonor ja retsipient MacConkey agaril
Retsipiend on kromosomaalne geen, mille tttu antibiootikum
streptomtsiin talle ei mju. Doonortvel sellist geeni ei ole ja
streptomtsiin peatab ta kasvu. Retsipiendi ja transkonjugandi
mramiseks kasutatakse nende vimet kasvada streptomtsiini sisaldavas
keskonnas (joonis 3).
Retsipient " " " " " "Escherichia coli K-12CSH36'~~~
DoonorEscherichia eol K-12L17f*>v~AILae* geen
plasmiidisStreptomtsiini resi geen kromosotentsuse smis/rPr,
Vikesed valged i kolooniad/ " 'T ( J v" '' Kolooniad puuduvadJoonis
3: Doonori,Punasedkolooniad^/retsipiendi
jatranskonjugandieristamine(lx.Lae geen
/____^^^--"plasmiidis/MacConkey agaril, mis sisaldab
streptomtsiini~3TStreptomtsiini resistentsuse geen kromosoomis0
Transkonjugant
28 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotehnoloogiaalse Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Eesmrgid
Tutvuda bakterigeneetikaga.
Vimaldada pilastel arutleda geenitrans-formatsiooni teemadel, nt.
resistentsuse levik antibiootikumide suhtes ja riski anals
geenitehnoloogias.
Ettevalmistused
Valmistada ja steriliseerida jrgmised vahendid:
3 vikest koonilist kolbi (100 ml) 10 ml toitelahusega;
steriilne MacConkey agar, millele on lisatud streptomtsiinsulfaati
(200 mg/ml). 50 C jahutatud agar valatakse Petri tassidele (igale
tassile 15-20 ml).
Kasutatakse jrgnevaid kultuure: doonortvi: Escherichia coli K-12
CSH36 (DSM number 6253) retsipienttvi: Escherichia coli K-12 LI 7
(DSM number 6254)
Neid looduses esinevaid tvesid saab niteks Saksamaa rakukultuuride
ja mikroorganismide kogust (DSM). Mlemat kultuuri vljastatakse
klmutatult-kuivatatult dofiliseeritult) klaas-ampullides. Ampulle
peab avama igesti, et nende sisu ei saastuks ega ohustaks avajat
(Lisa 3). Doonorkultuuri on raske kaldagaril silitada, seega on
vaja vrskelt elustatud kultuuri.
Valmistage ette doonorkultuur ja retsipientkultuur:
Klvake hte kolbi doonortve (kleepige kolvile silt " Doonor" ) ja
teise retsipient-tve (sildiga " Retsipient" ).
Hoidke mlemat kolbi pev temperatuuril 37 C. Kui vimalik, kasutage
loksu-tiga veevanni.
Nende kahe kultuuri " paaritamine"toimub jrgnevalt:
Lisage steriilse pipetiga 0,8 ml doonorkultuuri kolmandasse kolbi,
mis sisaldab 10 ml steriilset toitelahust.
Samasse kolbi lisage teise steriilse pipetiga 0,2 ml
retsipientkultuuri.
3.Kleepige kolbidele sildid ja hoidke kolbe16-24 tundi
temperatuuril 30 C.
NB! Kolbe vib loksutada vaid VAGA. AEGLASELT, sest sugufibrillid
vivad geda loksutamise ajal katkeda.
Steriilsed vatikorgid valmistatakse vatitki mhkimisel mber puutiku.
Autoklaavige korke kas McCartney pudelis vi alumiiniumfooliumis 15
minutit temperatuuril 121 C.
T planeerimine
Stmete valmistamine:60 minutit
Eelnev inkubeerimine:48tundi
Klvamine:15 minutit
Kasvatamine:24tundi
Tulemuste registreerimine:20 minutit
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
termostaat 30 C;
steriilne Petri tass, millel on 15-20 ml streptomtsniga MacConkey
agarit;
jrgnevad eelkasvatatud kultuurid:
doonorkultuur
retsipientkultuur
doonori ja retsipiendi kultuuride
segu;
3 steriilset omatehtud vatitampooni;
vike nu desinfitseeriva vahendiga, nt. 3% Domestoie. (Lever)
lahusega, kuhu visata kasutatud vatitampoonid;
viltpliiats klaasnude thistamiseks.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 29
Tkik
Vtke ks tass, milles on streptomtsniga MacConkey agar. Tmmake
viltpliiatsiga tassi alakljele kolm joont, nii et moodustuks kolm
vrdset sektorit.
Iga sektori keskele joonistage umbes
10 mm lbimduga ring. Mrgistage ks neist thega " D"(doonorkultuur),
teine thega " R"(retsipient) ja kolmas thega " S"(eelneva kahe segu
- transkonjugantide moodustumiseks).
Klvake vastavaid kultuure steriilsete vatitampoonidega mrgitud
sektoritesse. Vtke iga kord uus vatitampoon, kasutatud vatitampoon
visake desinfitseerivasse lahusesse.
Laske vedelikul mne minuti jooksul agarisse imbuda. Katke tassid ja
hoidke neid mberpratuna temperatuuril 30 C ks kuni kaks peva.
Tiendavalt
Lhtudes sellest tst on vimalik teha mitmeid kvantitatiivseid
lisakatseid:
Mrata doonorkultuuri ja retsipientkultuu-ri optimaalne suhe
lahjendades doonorkul-tuuri ja retsipientkultuuri steriilses
Ringeri lahuses vi 10" 3 M MgSO lahuses.
Mrata optimaalne konjugatsiooni aeg.
Ohutusnuded
Katse tuleb lbi viia laboris jrgides mikrobio-loogiaalaseid ldisi
ohutusreegleid ja steriilsuse nudeid.
Tnu
See katse on lihtsustatud variant prof. Patricia Neversi poolt
korraldatust (Hamburgi likool), mis omakorda phines E. Hrle ja R.
Haus-manni tl (Freiburgi likool).
30 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Looduslik geenilekanne Agrobacterium tumefaciensi abil
^iff m - 'M -kk k -M ik #f * * *
Taimede kasvajad phjustavad palju probleeme pllumajanduses,
iluaianduses ja viinamarjakasvatuses. Tihti tekivad kasvajad
pisitillukeste vigastuste tagajrjel, mis vivad tuleneda
klmakahjustustest, mullaharimisest vi pookimisest.
Sajandivahetusel mrgati, et teatud kasvajate teke on seotud
bakteriaalse nakkusega. Baktereid hakati nimetama Agrobacterium
tumefaciens (ladina keeles: agar = maa; tumor = paisuma; facere =
tegema). Alles 1970-ndatel aastatel avastati keerukad suhted
taimede ja Agrobacterium tumefaciens'! vahel.
Kasvajaid tekitavad bakterid sisestavad vikese osa oma
geneetilisest infost (he plasmiidi) taimerakku, kus see llitub
peremeesraku kromosoomistikku. Tulemusena hakkavad nakatunud rakud
jrgima bakterite poolt pealesunnitud programmi. Taimerakud
jagunevad ja neist areneb kasvaja, millest saab bakterite elukoht.
Kasvajarakud toodavad bakterite elutegevuseks vajalikke
hendeid.
Taimearetajad kasutavad Agrobacterium'i osavtul toimuvat
geenitransformatsiooni soovitavate geenide lekandmiseks taimedele
aeganudvaid ristamiskatseid teostamata. Selle tulemusel on
Agrobacterium'i modifitseeritud vormidest saanud oluline
geenitehnoloogia vahend.
Agrobacterium on pulgakujuline ja sama pikk kui E.'coli (umbes 1-3
" jn). Agrobacterium tumefaciens silitab patogeensu-se elades mulla
lemises hukllases kihis. Agrobacterium rndab ainult
kaheidulehelisi. Ta suudab rakku siseneda ja seda nakatada vaid
vigastuste kaudu, sest bakterid ei suuda tungida lbi taimeraku
kesta. Kahjustunud rakkude mahl " meelitab ligi"bakterid ja
aktiveerib geenitransformatsiooni. Bakterid paljunevad
haavapiirkonnas ja tungivad rakuvaheruumi, kus nad kinnituvad
rakukestadele. Agrobacterium tumefaciens''! plasmiid kandub le ja
selle DNA luhtub taime kromosoomi. Bakteri geenilt toodab taim
opeiine (nt. guanido-amiinhapet), mida Agrobacterium kasutab
ssiniku- ja lmmastikuallikana.
Eesmrk
Kesolevas katses nakatatakse kalanhoe vi Bryophyllurtfi taimi
(mlemaid on kerge kasvatada ja paljundada) looduslikult esineva
Agrobacterium^igz erinevates tingimustes ning nelja ndala jooksul
jlgitakse kasvaja arengut. Katsetada vib jrgmisi variante:
A.Nakatamise viis:
tehke taime vastavasse piirkonda haav ja nakatage seda kohe
Agrobacteriunflgz; tehke haav, kuid. kandke Agrobacterium peale
jrgmisel peval;
tehke haav ja nakatage kohe Agrobacte-rium'iga. ning katke see
niiske pabersalvrti-
ga;
tehke haav, kuid rge nakatage seda bakteritega;
kandke Agrobacterium tervete taimede samasse piirkonda.
B.Nakatamise koht:
vars, lehe pind,
vrse tipp.
Ettevalmistused
1.Peremeestaimede paljundamine (pilasedsaavad seda iseseisvalt
teha, vimalusekorral isegi kodus);
2.Kasvukeskkonna ja Agrobacterium tume-facieni kultuuride
ettevalmistamine. Vrsked kultuurid tuleb vhemalt 2 ndalat
ennekasutamist ette valmistada.
T planeerimine
Taimede kasvatamine (vajadusel): 4 kuud Agrobacterium kultuuri
ettevalmistamine: 2 ndalat
Taimede nakatamine Agrobacteriumg2c. 20 min. Kasvaja jlgimine: 3-4
ndalat
EIBE Biotehnoloqgiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 31
Tvahendid ja materjalid
Igale pilasele vi trhmale
(Eeldatakse tavalise laboritehnika olemasolu)
destilleeritud vesi (McCartney pudelis);
klvinel;
klvi aas;
binokulaarne mikroskoop;
krid;
klgeseotavad sildid ja viltpliiats;
paberktertid;
kleeplint;
etanool instrumentide steriliseerimiseks
leegis;
bakteri Agrobacterium tumefaciens kultuur
(agaril);
3-4 kuu vanused kalanhoe vi Bryophyllum,
taimed.
Steriliseerige nelapea.
NB! Etanool on kergesti-sttiv!
0
Kandke bakterid
kriimustatud
piirkonnale.
15119351469390Kriimustage taime pinda nelaga.
Vtke baktereid Agrobacterium tumefaciens.
Kuumutage klviaasa leegis enne ja prast kasutamist.
Tkik
Selles katses nakatatakse taimi mitmel viisil (vt. sissejuhatavad
ligud ja instruktsioonid).
Mrgistage iga taim sildiga, millel on kuupev ja informatsioon, mida
taimega on tehtud. Kui vaja, eristage taime nakatatud osad
klgeriputatavate siltidega.
Asetage taimed hsti valgustatud kohta ja hoidke neid niiskena
(mitte le kasta).
Jlgige ja registreerige kasvajate arengut jrgmise 4-6 ndala
jooksul. Uurige kasvaja-koe tkikest binokulaarse mikroskoobi all ja
vrrelge seda kahjustamata lehe koega.
Taimede nakatamine Agrobacterium'iga.
Meetod 1 (vigastatud taimepind nakatatakse kohe)
Kastke klvinel alkoholi ja steriliseerige see leegis. Kriimustage
taime pinda kas ks vi mitu korda.
Nakatage vigastatud pind Agrobacteriun/ig^.. Selleks kuumutage
klviaasa ja laske sellel natuke aega jahtuda. Vtke aasaga veidi
valget bakterikultuuri ja mrige vigastatud aladele. Kuumutage
uuesti klviaasa.
Meetod 2 (taimed nakatatakse 24 tundi prast kriimustuste
tegemist)
Vigastage taimi (vt. meetod 1).
Katke haavad Agrobacteriun/igz. jrgmisel peval.
Meetod 3 (prast nakatamist kaetakse vigastatud ala niiske
pabersalvrtikuga)
Tehke kriimustused ja nakatage taime nagu lalpool kirjeldatud
(meetod 1).
Ligake paberktertist paberitkid ja niisutage neid steriilse veega.
Asetage paber vigastatud alale ning kinnitage kleeplindiga. Hoidke
paberkate niiskena 2 peva jooksul.
Meetod 4 (vigastatud ala ei nakatata)
1.Tehke taimele kriimustused samasse kohta, kuhu esimese meetodi
korral. Seejrel tehke kriimustused teise kohta ja katke need niiske
paberiga. rge kandke vigastatud alale Agrobacteriunfyt.
Meetod 5 (nakatamine ilma vigastamata)
rge kriimustage taimi.
Kasutage klviaasa, et kanda AgrobacteriunTxt taime hte vi mitmesse
piirkonda.
32 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBE Biotetmoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Ohutusnuded
Seda katset peab lbi viima laboris jrgides bakterikultuuridega
ttamise ldisi ohutusnudeid.
Tnu
Katse ttas vlja Uta Nellen Koolibioloogia ja Keskkonnahariduse
Keskusest (Hamburg). EIBE tnab teda loa eest seda katset
kasutada.
NB! Agrobacterium tumefaens on ohtlik taime-patogeen ning sellega
ttamiseks on mnedes riikides kehtestatud ranged nuded. Enne
Agrobacterium tumefaciens'! kasutamist veenduge, et see on koosklas
kohalike seadustega.
Restriktaas
DNA ligaas (ensm) hendab DNA osad
Restriktaas (ensm likab DNA katki kindlatest kohtadest
Soovitud geen eraldatakse doonori organismist
-1286510609600Mittevajalikud geenid eemaldatakse plasmiidist
Bakteri kromosoom
-374015069850Uus plasmiid viiakse bakterisse Agrobacterium
tumefaciens
Lehe tkke hoitakseLehe tkke kasvatatakseRakkudest
kasvatatakse
Agrobacterium' rakkeselektiivsel stmel, kus arenevad uusi geene
sisaldavad
sisaldavas stmesainult transformeerunud rakudtaimed
Agrobacterium tumefaciens'/' modifitseeritud vormide kasutamine
geenitehnoloogias
EIBE Biotehnoioogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 33
1
Z) Q O
o
Lisa 1
Mikrobioloogilisel! stmed
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Agar- ja vedelstmed valmistatakse tstuslikult toodetavatest
ainetest tootja instr-uktsioonide jrgi. Enne kasutamist tuleb
stmeid autoklaavida 15 minutit temperatuuril 121 C. Valmis stmeid
vib silitada kasutusklblikena temperatuuril ~4 C mitu kuud.
Trkliseagar
Agar Lahustuv trklis
20,7 g 2,0 g
Lisage niipalju destilleeritud vett, et segu ruumala oleks 1 1 ja
autoklaavige 15 minutit temperatuuril 121 C.
MacConkey agar streptomtsiiniga
MacConkey agar50,0 g
Destilleeritud vesi990 ml
Prast 15-minutilist autoklaavimist temperatuuril 121 C laske agaril
jahtuda 50 C-ni ja seejrel lisage
streptomtsiinsulfaadi lahus200 mg/10 ml
Selle stmega tasse vib silitada vaid mne peva klmkapis
temperatuuril ~4 C.
34'-. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1
3 D O O
Lisa 2
Mikrobioloogiaalased tvtted
Biotehnoloogilase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Aerosoolid
Aerosoolid on mikroorganisme sisaldavad vikesed piisakesed, mis on
juhuslikult hku sattunud. Need vivad seal psida pool tundi vi
kauemgi ning on potentsiaalsed saasteallikad. Aerosool, mis prineb
mahapillatud kultuuridelt, vib phjustada naha vi silmade nakkust.
Kui kultuure pipeteeritakse suuga, siis vib mikroorganisme ka
kogemata alla neelata.
Laboratoorsed td
Laboratoorsete tde lbiviimisel tuleb silmas pidada alljrgnevaid
ohutusnudeid.
Tuleb olla ettevaatlik, et midagi ei satuks ktelt suhu (nt.
pliiatsi nrimisel, siltide keelega letmbamisel vi suuga
pipeteerimisel). Laboris on keelatud sa, juua ja suitsetada.
pilased peavad laboris kandma kitieid. Enne praktiliste tde algust
tuleb ktel olevad nahavigastused katta veekindla plaastriga.
Enne ja prast iga praktikumi tuleb labori lauad le pesta
desinfitseeriva lahusega. Neid saate koolilaborite
varustajatelt.
petajad, laborandid ja pilased peavad prast praktikumi alati ksi
pesema.
Mahapillatud ja purunenud vahendid
Mikrobioloogiliste kultuuridega juhtunud nnetuste puhul tuleb
toimida jrgnevalt:
Soovitav on kanda hekordselt kasutatavaid kindaid. Mikroorganisme
sisaldav purunenud nu vi mahapillatud kultuur tuleb katta riidega,
mida on eelnevalt leotatud desinfitseerivas vahendis. 10 minuti
prast tuleb jgid paber-kterttide ja prgikhvliga ra koristada.
Saastunud materjal visatakse spetsiaalsesse prgikonteinerisse vi
prgikotid, mida enne raviskamist autoklaavitakse. Ka prgikhvel
tuleb autoklaavida vi asetada 24 tunniks desinfitseerivasse
vahendisse.
Riiete vi naha saastumine
Saastunud nahapiirkonda tuleb koheselt pesta. Tugevasti saastunud
riided pannakse enne pesemist desinfitseerivasse lahusesse.
Saastunud puhastuslapid tuleb autoklaavida vi panna
desinfitseerivasse lahusesse.
Mikroorganismide allikad
Kiki mikroorganisme tuleb ksitleda kui potentsiaalselt ohtlikke.
Kesolevas moodulis kasutatavad organismid on igete tvtete korral
vheohtlikud. Tellige neid ainult kindlatest allikatest.
tagavad tvtted
Steriilsust tagavate tvtete eesmrgiks on:
saada ja silitada puhtad kultuurid;
tagada ohutus mikroorganismidega ttamisel.
Puhas kultuur sisaldab ainult hte liiki, segatud kultuur aga kahte
vi enamat liiki mikroorganisme.
Alati esineb saastumise oht, sest mikroorganisme on kikjal: nahal,
hus ja esemetel. Selleks, et tagada kultuuride puhtus, on vaja
kasutada steriliseeritud tvahendeid ja stmeid ning vlistada
saastumine. Need on steriilsuse silitamise peamised phimtted.
et vikese srme ja peopesa vahel hoitakse veel korki vi kaant.
(Sellisel hoidmisel on oluline, et klviaasa lesvtmisel
ldvenda-takse pisut korgi hoidmise haaret.) Vajadusel vivad kaks
pilast sooritada vastavat katset koos.
t
Korki hoitakse
srme ja peopesa
vahel
On alusetu loota, et nooremad pilased valdaksid steriilsust
tagavaid tvtteid tiuslikult. Kesoleva mooduli mned katsed eeldavad
siiski tieliku steriilsuse tagamist. Nendel juhtudel kasutage
jrgmisi protseduure:
Steriliseerige stmed enne kasutamist autoklaavimisega. Kasutage
steriilseid nusid (kolbe, Petri tasse jne.) ja hoidke saastumise
vltimiseks neil kaaned peal.
Ttada tuleb Bunseni pleti krval, siis kannab leegi kohal esinev
tusev huvool stmeid ja puhtaid kultuure saastavad mikroorganismid
eemale.
rge eemaldage korke ja kaasi nudelt kauemaks kui vaja. Avades
mikrobioloogilist kultuuri sisaldava pudeli, rge korki kuhugi
asetage, vaid hoidke seda seni kes, kuni saate selle peale tagasi
panna. Sellega hoiate ra laua ja kultuuri saastumise. Pudeli
avamisel tuleb selle suuet kuumutada 1 -2 sekundit, sest nii
hvitatakse seal olevad mikroorganismid ja tekitatakse soe huvool,
mis aitab ra hoida kultuuri juhuslikku saastumist.
Klviaasa tuleb kuumutada, kuni kogu leegis olev osa hakkab hguma.
Seda tuleb teha nii enne kui prast kultuuride ksitsemist. Klviaasa
tuleb lhendada Bunseni pleti leegile aeglaselt, et vhendada
srise-mist ja aerosoolide teket.
Sel ajal kui pletit ei kasutata, on soovitav reguleerida leek
kollaseks, sest see on hsti mrgatav. Klviaasade, traatide ja
pudelikaelade steriliseerimiseks tuleks kasutada umbes 5 cm krgust
sinist leeki.
Vltige tlaua saastumist. Steriliseerige instrumendid kohe prast
kasutamist, pipetid asetage kohe vrske desinfitseeriva lahusega
nusse.
Harjutamise tulemusena on vimalik hoida pudelit hes kes ja klviaasa
teises kes nii,
36-1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotchnolooxiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Kultuuride kasvatamine
457201539240Kirjutage Petri tasside alumistele klgedele enne
klvamist nimi, kuupev ja kasutatud organismi nimi vi allikas.
Vajadusel kleepige Petri tassi alus ja kaas kleeplindiga kinni,
nagu on nidatud joonisel.
Kirjutage
tassi
phjale
Kinnitage tassi kaas kleeplindiga
Kinnikleepimine hoiab ra tassi juhusliku avanemise ja saastumise.
NB! rge tmmake kleeplinti horisontaalselt mber rte, sest selline
kinnitus vib luua tassi sees anaeroobsed tingimused.
Bakterid
Bakterikultuuri kasvatamisel Petri tassil pratakse see mber. Nii
langeb kondenseerunud vesi kaanele ega satu kolooniatele. (Kui
steriilsel Petri tassil on palju kondenseerunud vett, tuleb tass
enne kasutamist kuivatada.)
Bakterikolooniad ilmuvad nhtavale peale 2-3-pevast kasvatamist
temperatuuril 25-30 C.
Seened
Seeni sisaldavaid Petri tasse ei ole vaja tagurpidi keerata.
Seenekultuure kasvatatakse umbes 7 peva. Kuigi toatemperatuur (21
C) on kllaldane, vimaldab termostaat protsessi paremini
kontrollida.
Jtmete likvideerimine ja steriliseerimine
Kik praktikumis kasutatud materjalid tuleb likvideerida igel
viisil, et vltida labori ja inimeste saastumist. Nud, mida kasutati
kultuuride kasvatamiseks ja silitamiseks, tuleb enne jrgmist
kasutamist autoklaavida, pesta desinfitseeriva vahendiga ja
loputada.
Laborisse on vaja kahte autoklaavimiskotti: ks taaskasutatavate
klaasnude jaoks ja teine ravisatava materjali jaoks. Igas tkohas
peaks olema ks suur nu pipettide ja teine vike
-mikroskoobi'alusklaaside jaoks. Purunenud klaas visatakse
metallmbrisse.
se. Seejrel vib neid uuesti kasutada. Klaasist pipetid tuleks
asetada suuremasse nusse. rge vtke pumpa pipeti kljest ra enne, kui
pipeti ots on viidud desinfitseerivasse vedelikku, sest muidu vivad
tekkida aerosoolid. Pipetid tuleb enne uut kasutamist autoklaavida,
pesta ja loputada.
Saastunud paberrtid, lapid ja plastmassist Petri tassid tuleb panna
ravisatavate asjade autoklaavimiskotti. Saastunud klaasnud,
kaasaarvatud klaasist Petri tassid, asetatakse klaasist asjade
autoklaavimiskotti.
ravisatavad plastmassist pipetid, mikroskoobi alus- ja katteklaasid
ning kultuuridest vljaimbu-nud vedelik tuleb panna vikesesse
desinfitseeriva vedelikuga nusse. Plastmassist pipetid
autoklaavitakse ja visatakse seejrel ra. Mikroskoobi alus- ja
katteklaase leotatakse 24 tundi desinfitseerivas vedelikus,
pestakse ja loputatak-
Klaasnud, mis ei ole saastunud, pestakse tavaliselt. Purunenud
klaas visatakse spetsiaalselt selle jaoks meldud prgikasti. Kui
saastunud klaasnu puruneb, tuleb see enne raviska-mist
autoklaavida. Purunenud klaasi, mis pole mikroorganismidega
kokkupuutes olnud, vib kohe ra visata.
EIBE Biotehnoloqgiaalase Hariduse Euroopa
Initsiatiivgrupp1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 37
Autoklaavimine
Steriliseerimine on kigi mikroorganismide ja nende spooride tielik
hvitamine. Kogu varustus tuleb enne praktikumi steriliseerida.
Kultuurid ja saastunud materjal steriliseeritakse ka prast
kasutamist, et need seejrel ohutult likvideerida. Stmete,
vesilahuste ja kultuuride steriliseerimiseks sobib kige paremini
autoklaavimine. Selleks kasutatakse krgsurvel olevat auru,
tavaliselt temperatuuril 121 C. Niiske kuumus tapab mikroorganisme
paremini kui kuiv, sest aur denatureerib nende valke. Autoklaavida
saab ka koduse krkeetjaga, kuid kuna selle maht on vike, siis vib
tekkida raskusi kogu klassi jaoks materjali steriliseerimi-
Autoklaavimise phimtted
Alljrgnevalt on esitatud korrektse autoklaavi-mise kaks olulisemat
nuet:
Autoklaavist tuleb hk tielikult eemaldada. See garanteerib krgel
temperatuuril oleva auru kokkupuute steriliseeritavate pindadega.
hu juuresolekul on samal rhul oleva auru temperatuur madalam.
Steriliseerita-vad materjalid ei tohi olla tihedalt pakitud. hk
peab saama nende vahelt vljuda. Kinnikeeratavate kaantega pudelid
ja purgid ei tohi olla suletud, sest rhk vib nende sees ohtlikult
krgele tusta.
Autoklaavimine peab kestma piisavalt pikka aega, et kuumus saaks
tungida Petri tassis vi teistes nudes oleva stmeni. Jrgnev tabel
nitab, kui kaua tuleb mingil temperatuuril stmeid vi tvahendeid
autoklaavida.
Vike erinevus temperatuuris phjustab suuri erinevusi autoklaavimise
ajas. Temperatuur
Steriliseerimisaeg
Temperatuur (-C)
Steriliseerimisaeg (minutites)
peab mratud aja jooksul mjuma kigile steriliseeritavatele
materjalidele, nt. stmele fermenteri sisemuses.
Autoklaavimise koguaeg koosneb kolmest osast:
temperatuuri htlustumise aeg - aeg, mis kulub autoklaavi keskel
paiknevatel materjalidel nutud temperatuuri saavutamiseks;
hoidmise aeg - minimaalne aeg, mille kestel etteantud temperatuuril
kik elusorganismid surevad;
ohutuse tagamise aeg - tavaliselt moodustab see poole hoidmise
ajast.
Kodused kiirkeetjad ttavad temperatuuril 121 C. Seega
steriliseerimise aeg moodustub umbes 5-minutilisest hdustumise
ajast, 15-minutilisest hoidmise ajast ja umbes 5-minutilisest
ohutuse tagamise ajast, mis annab kokku 25 minutit.
NuMahtSteriliseerimisaegKatseklaas20 ml12-14 min.Kolb50 ml12-14
min.Kolb200 ml12-15 min.Fermenter1 120-25 min.
Karamellistumine
Spetsiaalsed autoklaavid ttavad ka krgemal temperatuuril kui 121 C.
Kuigi aja kokkuhoid vib nida kasulik, tuleb meeles pidada, et krgem
temperatuur mjub teatud stmetele lagundavalt. Niteks glkoosilahus
karamellistub krgel temperatuuril moodustades hendeid, mis vivad
olla mikroorganismidele mrgised. Seda reaktsiooni saab glkoosi
puhul vltida keskkonna reaktsiooni viimisega pH 4-ni. Vajadusel
saab prast steriliseerimist pH-d jlle muuta.
MaillarcTi reaktsioon
Stmete lmmastikhendid ja ssivesikud tekitavad krgel temperatuuril
pruunistumise reaktsiooni (Maillard'i reaktsiooni). Moodustuvad
hendid on mnedele mikroorganismidele mrgised. Teatud juhtudel vib
osutuda vajalikuks autoklaavida ssivesikud ja lejnud osa stmest
eraldi, nt. piimaagari ettevalmistamisel.
38 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnolooxiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
Autoklaavi kasutamine ja hooldamine
Kiirkeetja vi autoklaavi kasutamisel tuleb alati jrgida
tootjapoolseid instruktsioone. Eriti hoolikalt peab jlgima, et
autoklaavis oleks piisavalt vett. Koduses majapidamises
kasutatavatesse kiirkeetjatesse tuleb panna vhemalt 250 ml vett,
kuid suuremates autoklaavides kulub seda tunduvalt rohkem.
Destilleeritud vi deioniseeritud vee kasutamine hoiab ra kada-kivi
moodustumise. Prast kasutamist kuivata-takse autoklaav hoolikalt.
Kui seda ei tehta, siis vib autoklaavi phi kahjustuda, mille
tagajrjel see rhu all vljapoole kummub.
Prast autoklaavi kasutamist laske veeaurul ja hul umbes he minuti
jooksul vljuda, enne kui sulete vljalaskekraani. Kui autoklaavi
tskkel on lppenud, tuleb lasta selle sisul jahtuda ning siserhul
mbritseva atmosfri-rhuni langeda. Autoklaavi ega selle klappe ei
tohi avada, kui need on rhu all, sest see vib phjustada pletusi.
Kaane enneaegne allalaskmine ja seejrel rhu vhendamine vib
ajada
vedeliku autoklaavis keema. Agar vi toitelahus vivad keeda le nude
rte.
Keemiline steriliseerimine
Steriliseerida vib erinevate kemikaalidega. Laborikatsetes
kasutatakse kige sagedamini fenoolseid hendeid ja hpokloriteid.
Fenoolsed hendid on efektiivsed bakterite ja seente vastu, kuid ei
hvita eoseid ja kiki viirusi. Kokkupuude kummi, puu ja plastikuga
inakti-veerib neid hendeid teatud mral. Laborites kasutatakse
fenoolseid hendeid pindade desinfitseerimiseks ja ravisatava
materjali hoidmise nudes.
Hpokloritid (nt. valgendajad) ei ole kige sobivamad Petri tasside
steriliseerimiseks, sest valgud ja plastmassist materjalid vivad
neid inaktiveerida. 5% Domestos'e (Lever) vi Chlorate I lahust vib
kasutada ravisatava materjali nudes.
EIBE Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999
1. moodul: Mikroobid ja molekulid 39
1
z>
Q
o o
Lisa 3
Luofiliseeritud kultuuriga ampulli avamine
Biotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
Ampulli avamine
NB! Kaitseprillide kandmine on kohustuslik, sest ampulli avamisel
vib lennata klaasikilde.
Kuumutage veidi ampulli teravat otsa igast kljest Bunseni pleti
leegis (vt. joonist). Tilgutage pipetiga ks tilk klma vett ampulli
kuumutatud otsale, oaasile peaks tekkima mra.
3.
Murdke pintsettidega ampulli ots ra, nii et klaasikillud kukuksid
Petri tassile. Klaasikillud visake selleks ettenhtud nusse.
Eemaldage pintsettidega vatikork, mis hoiab sisemist katseklaasi
ampullis paigal. Kallake sisemine katseklaas ettevaadikult Petri
tassile. Katke tass kaanega.
Luofiliseeritud kultuuri elustamine
Eemaldage pintsettidega vatikork ja kuumutage sisemise katseklaasi
suuet.
Lisage sisemisse katseklaasi umbes 1 ml steriilset
toitelahust.
Kuumutage uuesti katseklaasi suuet ja asetage vatikork tagasi.
Kultuur elustub ligikaudu 20 minuti jooksul.
Segage steriilse klviaasaga katseklaasi sisu hsti lbi ja valage
sisu steriilsesse katseklaasi, mis sisaldab umbes 5 ml
toitelahust.
Hoidke kultuuri peva jooksul temperatuuril 30 C.
Jrgmisel peval ...
6.Viige steriilse klviaasaga tilk mikroorganismide segu agariga
tassile. Sellega kontrollime, kas kultuur pole saastunud: tassil
peaksidkasvama hakkama ainult hte tpi kolooniad.
Mi
0
Ampulli avamine
Jr
40 1. moodul: Mikroobid ja molekulid
EIBEBiotehnoloogiaalase Hariduse Euroopa Initsiatiivgrupp
1999