Embed Size (px)
DESCRIPTION
Citation preview
Diplomado en Química AmbientalDiplomado en Química Ambiental II
Introducción a la Biología Celular y Introducción a la Biología Celular y Molecular Molecular
Jesús Olivero Verbel. Ph.DJesús Olivero Verbel. Ph.D
Universidad de CartagenaUniversidad de CartagenaFacultad de Ciencias Químicas y Facultad de Ciencias Químicas y
FarmacéuticasFarmacéuticasGrupo de Química Ambiental y Grupo de Química Ambiental y
ComputacionalComputacionalDepartamento de Postgrado y Educación Departamento de Postgrado y Educación
ContinuaContinua
Agosto 19 de 2002Agosto 19 de 2002
La Membrana Celular
El DNA: Blanco de tóxicos
Aminoácidos
y
Proteínas
Name (Residue) S.C. MW pK VdW vol. C, P, H
Alanine ALA A 71 67 HArginine ARG R 157 12.5 148 C+Asparagine ASN N 114 96 PAspartate ASP D 114 3.9 91 C-Cysteine CYS C 103 86 PGlutamate GLU E 128 4.3 109 C-Glutamine GLN Q 128 114 PGlycine GLY G 57 48 -Histidine HIS H 137 6.0 118 P,C+Isoleucine ILE I 113 124 HLeucine LEU L 113 124 HLysine LYS K 129 10.5 135 C+Methionine MET M 131 124 HPhenylalanine PHE F 147 135 HProline PRO P 97 90 HSerine SER S 87 73 PThreonine THR T 101 93 PTryptophan TRP W 186 163 PTyrosine TYR Y 163 10.1 141 PValine VAL V 99 105 H
AMINOACIDOS
Péptidos
La estructura es repetida cada 5.4 Å a lo largo del eje.3.6 AA por rotación.Separación entre residuos: 5.4/3.6 = 1.5 ÅCada grupo C=O y N-H de la cadena principal está unido por un puente de hidrógeno a un residuo distante 4 AA.
Los planos del péptido son más o menos paralelos a los ejesde las hélices y los dipolos dentro de la misma están alineados.
Las cadenas laterales son orientadas hacia fuera de la hélice,generalmente hacia el nitrógeno terminal.
-HélicesESTRUCTURA SECUNDARIA ESTRUCTURA SECUNDARIA
DE LAS PROTEINASDE LAS PROTEINAS
Hojas BetaHojas Beta
Formados entre dos cadenas beta antiparalelas.
Beta-Hairpin turnsBeta-Hairpin turns
ESTRUCTURA TERCIARIA ESTRUCTURA TERCIARIA
DE LAS PROTEINASDE LAS PROTEINAS
Elastase posee Ala, la entrada a la cavidad es bloqueada por
Val-216 y Thr-226 (estos residuos son Gly en chymotrypsin).
Estas tres proteasas son el resultado de Evolución Divergente
Difieren en Especificidad: Chymotrypsin tiene una cavidad en la
cual acomoda las cadenas hidrofóbicas de F, Y y W.
Trypsin tiene un AA Aspartate (189) en el fondo de la cavidad
en vez de Ser-189, como en Chymotrypsin. Este Asp forma un
puente salino con el grupo positivo de las cadenas de Lys y Arg
de los sustratos.
Serina ProteasasSerina Proteasas
LA TRIADA CATALITICALA TRIADA CATALITICA
Las Serina Proteases derivan su nombre por tener unaserina altamente reactiva, Ser-195, el cual atrae el grupo carboxylo del sustrato.
Esto resulta en un intermediario que es una Acylenzima,el cual consiste en el sustrato unido covalentemente a laenzima por la ser.
La reactividad depende de la conformación de la cadena lateral de la Ser con otras dos cadenas laterales polares.Aproximadamente en una línea recta.
La Ser-195 es posicionada al final de la línea. El otro origen es Asp-102 y en el centro la His-57.
The Chou-Fasman method of secondary structure prediction Name
P(a) P(b) P(turn) f(i) f(i+1) f(i+2) f(i+3)
Alanine 142 83 66 0.06 0.076 0.035 0.058
Arginine 98 93 95 0.070 0.106 0.099 0.085
Aspartic Acid 101 54 146 0.147 0.110 0.179 0.081
Asparagine 67 89 156 0.161 0.083 0.191 0.091
Cysteine 70 119 119 0.149 0.050 0.117 0.128
Glutamic Acid 151 037 74 0.056 0.060 0.077 0.064
Tyrosine 69 147 114 0.082 0.065 0.114 0.125
Valine 106 170 50 0.062 0.048 0.028 0.053
Serina ProteasasSerina Proteasas
Serina ProteasasSerina Proteasas
ProteínasProteínasde Membranade Membrana
http://bioinformatics.weizmann.ac.il/hydroph/
http://www.netaccess.on.ca/~dbc/cic_hamilton/protein.html
TK
PCB
AA
sPLA2
Annexin?
PKC
PKC
MAPK
cPLA2
P
Ca-ATPase
Ca2+
O2
.O2
Signal Transduction
Signal Transduction
Signal Transduction en la Signal Transduction en la Identificación de SaboresIdentificación de Sabores
ANALISIS DE PROTEINAS
CROMATOGRAFIA
CromatografíaLíquida
Intercambio Iónico
Cromatografía de Afinidad
Cromatografía de Filtración en Gel
El Ligando de Afpak-894 es STI, un inhibidor de Trypsin.
Afpak-AHR-894, Ligando: Heparina
Análisis de Lipoproteínas y componentes
coagulantes en la sangre
El ligando de Afpak AAB-894 es Aminobenzamidine
(Inhibidor de Serine Protease).
Análisis de Tripsina
DICROISMO DICROISMO CIRCULARCIRCULAR
RESONANCIA RESONANCIA
MAGNETICA MAGNETICA
NUCLEARNUCLEAR
En RMN, los espines nucleares desapareados son los de importancia.
ESPIN
Propiedad fundamental de la naturaleza como la carga o masa.
El Espín es expresado en múltiplos de 1/2 y puede ser (+) o (-).Protones, electrones y neutrones poseen Espín. Electrones individuales desapareados, protones y neutrones poseen un Espín de 1/2.
El Deuterio (2H) posee un electrón, un protón y un neutrón.Espín Electrónico = 1/2. Espín Total Nuclear = 1.
Dos o más partículas con Espín de signos opuestos pueden unirsey eliminar las manifestaciones observables del Espín. Ej. Helio.
ESPIN
En Presencia de un campo magnético de fuerza B, una partícula con un Espín neto puede absorver un fotón defrecuencia f.
La frecuencia “f” depende de la relación giromagnética dela partícula = B.
Para el Hidrógeno, B = 42.58 MHz/T.
Núcleo Protones Neutrones Espín
Desapareados Desapareados Neto (MHz/T) 1H 1 0 1/2 42.58 2H 1 1 1 6.54 31P 0 1 1/2 17.25 23Na 2 1 3/2 11.27 14N 1 1 1 3.08 13C 0 1 1/2 10.71 19F 0 1 1/2 40.08
Casi todos los elementos de la Tabla Periódica tienen unIsótopo con un espín nuclear diferente de cero. RMN sólo puede ser empleada en Isótopes cuya abundancia natural sea lo suficientemente alta para ser detectada.
Núcleos Con Espín
CROMATOGRAFIA DE GASESESPECTROMETRIA DE MASAS
Espectro de Masas
3-Phenyl-2-propenal C9H8O
MW = 132.16
3-Methylbutyramide C5H11NO
MW = 101.15
From Gas Phase Ions to Peaks on a Mass Spectrum
Degradación de Edman
Reacción empleada para determinar la secuencia de AA
El N-Terminal del péptido es tratado con FenilIsotiocianato,formando un complejo.
Luego de tratamiento ácido, el N-terminal es removido porrompimiento del primer enlace peptídico formando una
Feniltiohidantoina.
Existen 20 Fenilhidantoinas.
Identificación Requiere Separación
PROTEOMICS
2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCION
El punto isoeléctrico es el pH al cual el número de
cargas netas positivas y negativas es cero.
Permite la separación de proteínas en su forma nativa!!
ENFOQUE ISOELECTRICO
En la electroforesis de Enfoque Isoeléctrico, el gel de polyacrylamide is tratado con ampholines, los cualesson sustancias que mantienen un gradiente de pH a
través de la longitud del gel.
La proteína será enfocada en el sitio en el que el pH es
igual al punto isoeléctrico. Allí la proteína deja de moverse.
Resolución de péptidos mediante el desarrollo de dos pasos ortogonales de separación.
2-D PAGE2-D PAGE
2-D PAGE: Técnica de mayor alta RESOLUCION
Electroforesis bidimensional en gel de poliacrilamida
Separación por Enfoque isoeléctrico y por Masas
Número de Manchas es variable y depende de:�Tamaño y tipo de muestra�Procedimiento de tinción
En un gel pueden apreciarse en forma visible 1000 proteínas(Blomberg et al., 1995)
Klose y Kobalz (1995) logró separar 10.000 proteínas.
2-D PAGE2-D PAGE
La razón?Los “Ampholytes” usados para construír los gradientes de pH
Originalmente la Desventaja era la Falta de Reproducibilidad.
En la actualidad los Gradientes de pH son immobilizados (IPGs).
La estandarización de los procedimientos ha permitido elestablecimiento de bases de datos de Geles en 2-D.SWISS-2DPAGE y YEAST 2-D GEL DATABASES
El uso de IPGs las comparaciones cualitativas y cunatitativasen los patrones de expresión de proteínas.
IPGs permiten cargar hasta 15 mg de proteína.
2-D PAGE2-D PAGE
Identificación de candidatos a vacunas (Chakravarti et al., 2001).
Estudios de Patología y Toxicología (Lee and harrington, 1997)
Obtención de proteínas de absoluta pureza bioquímica
Análisis de Proteínas con modificaciones post-translacionalestales como fosforilación, geranilación, glycosilación
y desdoblamiento proteolítico, entre otros.
