INTRODUCCION

La palabra cromatografía significa gráfica de colores y fue diseñada por Michael Tswett en el 1903.

Tswett llevó a cabo una extracción de una mezcla de pigmentos de hojas verdes y luego pasó este

extracto a través de un tubo de vidrio empacado con carbonato de calcio; de esta forma logró

separar los pigmentos presentes en las hojas.

Actualmente cromatografía es el nombre que se le da a un grupo de técnicas utilizadas en la

determinación de la identidad de sustancias, en la separación de componentes de las mezclas y en

la purificación de compuestos. Esta técnica es muy efectiva y por lo tanto se utiliza tanto a nivel de

investigación como a nivel industrial.

Este método puede variar de técnica en técnica, pero siempre se basa en el mismo principio:

Todos los sistemas de cromatografía contienen una fase estacionaria y una fase móvil.

CROMATOGRAFIA

El termino cromatografía hace referencia a la escritura en colores, los cuales provienen de

los diferentes elementos químicos que son estudiados.

La cromatografía es un método físico de separación para la caracterización

de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las ramas de la ciencia y la física. Es un

conjunto de técnicas basadas en el principio de retención selectiva, cuyo objetivo es separar los

distintos componentes de una mezcla, permitiendo identificar y determinar las cantidades de

dichos componentes.

Las técnicas cromatográficas son muy variadas, pero en todas ellas hay una fase móvil que

consiste en un fluido (gas, líquido o fluido supercrítico) que arrastra a la muestra a través de

una fase estacionaria que se trata de un sólido o un líquido fijado en un sólido. Los componentes

de la mezcla interaccionan en distinta forma con la fase estacionaria. De este modo, los

componentes atraviesan la fase estacionaria a distintas velocidades y se van separando. Después

de que los componentes hayan pasado por la fase estacionaria, separándose, pasan por

un detector que genera una señal que puede depender de laconcentración y del tipo

de compuesto.

Diferencias sutiles en el coeficiente de partición de los compuestos da como resultado una

retención diferencial sobre la fase estacionaria y por tanto una separación efectiva en función de

los tiempos de retención de cada componente de la mezcla.

La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:

Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados

posteriormente (etapa final de muchas síntesis).

Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las

cantidades de material empleadas son pequeñas.

Clasificación

Las distintas técnicas cromatográficas se pueden dividir según cómo esté dispuesta la fase

estacionaria:

Cromatografía plana. La fase estacionaria se sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las

principales técnicas son:

Cromatografía en papel

Cromatografía en capa fina

Cromatografía en columna. La fase estacionaria se sitúa dentro de una columna. Según el

fluido empleado como fase móvil se distinguen:

Cromatografía de líquidos

Cromatografía de gases

Cromatografía de fluidos supercríticos

La cromatografía de gases es útil para gases o para compuestos relativamente volátiles, lo

que incluye a numerosos compuestos orgánicos. En el caso de compuestos no volátiles se recurre

a procesos denominados de "derivatización", a fin de convertirlos en otros compuestos que se

volatilizen en las condiciones de análisis.

Dentro de la cromatografía líquida destaca la cromatografía líquida de alta resolución

(HPLC, del inglés High Performance LiquidChromatography), que es la técnica cromatográfica más

empleada en la actualidad, normalmente en su modalidad de fase reversa, en la que la fase

estacionaria tiene carácter no polar, y la fase móvil posee carácter polar (generalmente agua o

mezclas con elevada proporción de la misma, o de otros disolvente polares, como por ejemplo

metanol). El nombre de "reversa" viene dado porque tradicionalmente la fase estacionaria estaba

compuesta de sílice o alúmina, de carácter polar, y por tanto la fase móvil era un disolvente

orgánico poco polar. Una serie eluotrópica, es un rango de sustancias de diferentes polaridades

que actúan como fase móvil y que permiten observar un mejor desplazamiento sobre una fase

estacionaria.

Cromatografía en papel Líquido Líquido ( moléculas de agua contenidas en la celulosa del

papel )

Cromatografía en capa

fina

Líquido Sólido

Cromatografía de gases Gas Sólido o líquido

Cromatografía líquida Líquido Sólido o líquido

Términos empleados en cromatografía

Analito es la substancia que se va a separar durante la cromatografía.

Cromatografía analítica se emplea para determinar la existencia y posiblemente también la

concentración de un analito en una muestra.

Fase enlazada es una fase estacionaria que se une de forma covalente a las partículas de

soporte o a las paredes internas de la columa.

Cromatograma es el resultado gráfico de la cromatografía. En el caso de separación óptima,

los diferentes picos o manchas del cromatograma se corresponden a los componentes de la

mezcla separada.

En el eje X se representa el tiempo de retención, y en el eje Y una señal (obtenida, por

ejemplo, a partir de un espectrofotómetro, un espectrómetro de masas o cualquier otro

de los diversos detectores) correspondiente a la respuesta creada por los diferentes

analitos existentes en la muestra. En el caso de un sistema óptimo, la señal es

proporcional a la concentración del analito específico separado.

en fase inversa (polar) (menos polar)

Cromatografía líquida

en fase normal

Líquido

(menos polar)

Sólido o líquido

(polar)

Cromatografía líquida

de intercambio iónico

Líquido

(polar) Sólido

Cromatografía líquida

de exclusión

Líquido Sólido

Cromatografía líquida

de adsorción

Líquido Sólido

Cromatografía de

fluidos supercríticos

Líquido Sólido

Cromatógrafo es el equipo que permite una separación sofisticada. Por ejemplo, un

cromatógrafo de gases o un cromatógrafo de líquidos.

Cromatografía es el método físico de separación en el cual los componentes que se van a

separar se distribuyen entre dos fases, una de las cuales es estacionaria (fase estacionaria)

mientras la otra (la fase móvil) se mueve en una dirección definida.

Efluente es la fase móvil que atraviesa la columna.

Serie eluotrópica es una lista de disolventes clasificados según su poder de dilución.

Fase inmovilizada es una fase estacionaria que está inmovilizada sobre partículas de soporte,

o en la pared interior del tubo contenedor o columna.

Cromatograma correspondiente a una cromatografía liquida en fase reversa para

compuestos fenólicos

Fase móvil es la fase que se mueve en una dirección definida. Puede ser un líquido

(cromatografía de líquidos o CEC). un gas (cromatografía de gases) o un fluido supercrítico

(cromatografía de fluidos supercríticos). La fase móvil consiste en la muestra que está siendo

separada/analizada y el disolvente, que se mueven por el interior de la columna. En el caso de la

cromatografía líquida de alta resolución, HPLC, la fase móvil es un disolvente no-polar como

el hexano (fase normal) o bien algún disolvente polar (cromatografía de fase reversa) y la muestra

que va a ser separada.. La fase móvil se mueve a través de la columna de cromatografía (fase

estacionaria) de forma que la muestra interacciona con la fase estacionaria y se separa.

Cromatografía preparativa se usa para purificar suficiente cantidad de sustancia para un uso

posterior, más que para análisis.

Tiempo de retención es el tiempo característico que tarda un analito particular en pasar a

través del sistema (desde la columna de entrada hasta el detector) bajo las condiciones fijadas.

Véase también: Índice de retención de Kovats

Muestra es la materia que va a ser analizada en la cromatografía. Puede consistir en un

simple componente o una mezcla de varios. Cuando la mezcla es tratada en el curso del análisis, la

fase o fases que contienen los analitos de interés es llamada igualmente muestra mientras el resto

de sustancias cuya separación no resulta de interés es llamada residuo.

Soluto es cada uno de los componentes de la muestra que va a ser separado.

Disolvente es toda sustancia capaz de solubilizar a otra,y especialmente la fase líquidamóvil

en cromatografía de líquidos.

Fase estacionaria es la sustancia que está fija en una posición en el procedimiento de la

cromatografía. Un ejemplo es la capa de silica en la cromatografía en capa fina.

DETECTORES

Un detector es un dispositivo para revelar la presencia de las sustancias eluídas a la salida

de la columna cromatográfica. Podemos expresar que el detector son los "ojos" de un

cromatógrafo.

El Detector es un dispositivo capaz de convertir una propiedad física, no medible

directamente, en una señal elaborable y ofrecernos información sobre la naturaleza y magnitud de

la propiedad física.

En cromatografía un detector funciona comparando una propiedad física entre el gas

portador puro y el mismo gas portador llevando cada uno de los componentes que previamente se

han separado en la columna, esta acción se traduce en una señal tipo eléctrica, que

posteriormente se amplificará mediante un registrador gráfico ó integrador permitiendo indicar el

momento que salen de la columna los componentes.

Clasificación de los detectores

Detectores según su Grado de Selectividad :

Universales. Responde a la mayoría de los solutos que pasan por él.

Específicos ó Selectivos. Exhibe una gran respuesta a un grupo particular de substancias con

un mínimo de respuesta a otras.

Detectores Destructivos y No destructivos. Esta clasificación, obviamente, es en referencia a si la

muestra es destruida o no.

Detectores según su Modo de Respuesta:

Dependientes del Flujo Másico. Producen una señal que es proporcional a la cantidad de

soluto que pasa a través de él en la unidad de tiempo pero es independiente del volumen de

gas portador requerido para la elución.

Dependiente de la Concentración. Dan una señal proporcional a la cantidad de soluto por

unidad de volumen de gas portador que pasa a través de él.

Detectores según el proceso de detección: Ionización, Óptico-espectroscópico, Electroquímico,

etc.

Características de los Detectores:Los detectores pueden ser clasificados según:

Sensibilidad. Medida de la efectividad de un detector para convertir la muestra en una señal

eléctrica medible.

Linealidad. Rango de masa ó concentración de muestra sobre el cual el detector mantiene una

sensibilidad constante sin una desviación arbitraria. El significado práctico de la linealidad del

detector es el que le indica al analista la concentración para la cual el detector es confiable. Hay

dos límites en la curva de linealidad:

El límite de concentración inferior, que es dado por el límite de detección y,

El límite Superior, definido por un porcentaje de desviación arbitrario de la curva de linealidad,

normalmente se toma un 5% de desviación.

Rango Dinámico Lineal. Rango sobre el cual la sensibilidad del detector es constante.

Ruido. Es cuantificado por el promedio de la amplitud pico-pico de la señal. El significado de

conocer el nivel de ruido de un detector es un factor determinante en la determinación de la

cantidad mínima detectable y el límite inferior del rango lineal.

Límite de Detección. Está definido como la mínima cantidad de sustancia que puede producir una

señal que sea el doble del nivel de ruido.

Corriente de Fondo. Señal constante de salida generada por el proceso en el que un detector está

operativo sin que alguna sustancia pasa a través de él. Esta señal es muy importante, ya que

permite diagnosticar el buen o mal funcionamiento del detector.

Tipos de Detectores:Según el proceso de detección pueden ser:

Conductividad Térmica (TCD)

Ionización de Llama (FID)

Captura Electrónica (ECD)

Ionización de Llama Alcalina (NPD)

Fotométrico de Llama (FPD)

Emisión Atómica (AED)

Espectrómetro de Masas

Termoiónico (TID)

Detector de Fotoionización

Quimioluminiscencia de Azufre (SCD)

Espectroscopia infrarroja de transformada de Fourier

Conductividad Electrolítica (DELCD)

Combustión Catalítica (CCD)

Ionización del Helio (HID)

CROMATOGRAFIA DE GASES

La cromatografía de gases es una técnica cromatográfica en la que la muestra se volatiliza

y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una

fase móvil de gas inerte. A diferencia de los otros tipos de cromatografía, la fase móvil no

interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través

de la columna. Existen dos tipos de cromatografía de gases (GC): la cromatografía gas-sólido (GSC),

y la cromatografía gas-líquido (GLC), siendo esta última la que se utiliza más ampliamente, y que

se puede llamar simplemente cromatografía de gases (GC).

CROMATOGRAFIA DE GAS-SOLIDO: En la GSC la fase estacionaria es sólida y la retención de los

analitos en ella se produce mediante el proceso de adsorción.

CROMATOGRAFIA DE GAS-LIQUIDO:En la GLC, la fase estacionaria es líquida, y los analitos se

separan mediante reparto. En ambas técnicas, el desplazamiento de la fase móvil, se realiza

mediante presión constante gracias al Regulador de Presión.

La muestra se inyecta por medio de una jeringa en una cámara de vaporización, lugar

donde se vaporiza; para después ser arrastrada hacia la columna por medio de un gas inerte, para

prevenir su reacción con el analito o la columna. Una vez ocurrido este proceso, en donde la fase

móvil pasa por la fase estacionaria, los resultados llegan al detector, que se hacen visibles en el

ordenador.

En la cromatografía de gases se usa como fase estacionaria un compuesto orgánico

polimérico de baja volatilidad, estable térmicamente y con adecuadas características de

disolvente. Es preciso señalar que deben usarse fases estacionarias, similares funcionalmente al

compuesto a analizar.

Componentes básicos de un Cromatógrafo Gas - Líquido:De forma muy esquemática podemos

resumirlos en:

1.Gas portador

2. Sistema de Inyección de muestra

3. Columna

4. Detector

5. Registrador

1. Gas portador

El gas portador cumple básicamente dos propósitos: Transportar los componentes de la muestra, y

crear una matriz adecuada para el detector. Un gas portador debe reunir ciertas condiciones:

-Debe ser inerte para evitar interacciones (tanto con la muestra como con la fase

estacionaria)

-Debe ser capaz de minimizar la difusión gaseosa

-Fácilmente disponible y puro

-Económico

-Adecuado al detector a utilizar

El gas portador debe ser un gas inerte, para prevenir su reacción con el analito o la columna.

Generalmente se emplean gases como el helio, argón, nitrógeno, hidrógeno o dióxido de carbono,

y la elección de este gas en ocasiones depende del tipo de detector empleado. El almacenaje del

gas puede ser en balas normales o empleando un generador, especialmente en el caso del

nitrógeno y del hidrógeno. Luego tenemos un sistema de manómetros y reguladores de flujo para

garantizar un flujo estable y un sistema de deshidratación del gas, como puede ser un tamiz

molecular.

Generalmente la regulación de la presión se hace a dos niveles: un primer manómetro se sitúa a la

salida de la bala o generador del gas y el otro a la entrada del cromatógrafo, donde se regula el

flujo. Las presiones de entrada varían entre 10 y 25 psi, lo que da lugar a caudales de 25 a 150

mL/min en columnas de relleno y de 1 a 25 mL/min en columnas capilares. Para comprobar el

caudal se puede utilizar un rotámetro o un simple medidor de pompas de jabón, el cual da una

medida muy exacta del caudal volumétrico que entra a la columna.

La pureza de los gases es sumamente importante, se requieren niveles 4.5 o mayores es de cir

99.995 % de pureza. Sin embargo, debido al cuidado que se debe tener con la fase activa de la

columna, se hace completamente necesario la instalación de trampas a la entrada del Gas carrier,

estas trampas obviamente tienen una capacidad limitada, pero son importantísimas al momento

de usar el Cromatografo. Estas trampas evitan el ingreso de Hidrocarburos, agua, CO entre otros.

2. Sistema de inyección de muestra

La inyección de muestra es un apartado crítico, ya que se debe inyectar una cantidad adecuada, y

debe introducirse de tal forma (como un "tapón de vapor") que sea rápida para evitar el

ensanchamiento de las bandas de salida; este efecto se da con cantidades elevadas de analito. El

método más utilizado emplea una microjeringa (de capacidades de varios microlitros) para

introducir el analito en una cámara de vaporización instantánea. Esta cámara está a 50 °C por

encima del punto de ebullición del componente menos volátil, y está sellada por una junta de

goma de siliconasepta o septum.

Inyector de muestra para un GC

3. Columnas y sistemas de control de temperatura

En GC se emplean dos tipos de columnas: las empaquetadas o de relleno y las tubulares abiertas o

capilares. Estas últimas son más comunes en la actualidad (2005) debido a su mayor rapidez y

eficiencia. La longitud de estas columnas es variable, de 2 a 60 metros, y están construidas en

acero inoxidable, vidrio, sílice fundida o teflón. Debido a su longitud y a la necesidad de ser

introducidas en un horno, las columnas suelen enrollarse en una forma helicolidal con longitudes

de 10 a 30 cm, dependiendo del tamaño del horno.

La temperatura es una variable importante, ya que de ella va a depender el grado de separación

de los diferentes analitos. Para ello, debe ajustarse con una precisión de décimas de grado. Dicha

temperatura depende del punto de ebullición del analito o analitos, como también la máxima

temperatura de funcionamiento de la columna (fase estacionaria), y por lo general se ajusta a un

valor igual o ligeramente superior a él. Para estos valores, el tiempo de elución va a oscilar entre 2

y 30-40 minutos. Si tenemos varios componentes con diferentes puntos de ebullición, se ajusta la

llamada rampa de temperatura con lo cual ésta va aumentando ya sea de forma continua o por

etapas. En muchas ocasiones, el ajustar correctamente la rampa puede significar separar bien o no

los diferentes analitos. Es recomendable utilizar temperaturas bajas para la elución ya que aunque

a mayor temperatura la elución es más rápida, se corre el riesgo de descomponer el analito.

4. Detector

El detector es la parte del cromatógrafo que se encarga de determinar cuándo ha salido el analito

por el final de la columna. Las características de un detector ideal son:

Sensibilidad: Es necesario que pueda determinar con precisión cuándo sale analito y

cuando sale sólo el gas portador. Tienen sensibilidades entre 10-8 y 10-15 g/s de analito.

Respuesta lineal al analito con un rango de varios órdenes de magnitud.

Tiempo de respuesta corto, independiente del caudal de salida.

Intervalo de temperatura de trabajo amplio, por ejemplo desde temperatura ambiente

hasta unos 350-400 °C, temperaturas típicas trabajo.

Estabilidad y reproducibilidad, es decir, a cantidades iguales de analito debe dar salidas

de señal iguales.

Alta fiabilidad y manejo sencillo, o a prueba de operadores inexpertos.

Respuesta semejante para todos los analitos, o

Respuesta selectiva y altamente predecible para un reducido número de analitos.

Detector de ionización de llama (FID)

En cromatografía de gases, el detector de ionización de llama (FID) es uno de los detectores más extensamente utilizado y, por lo general, uno de los más aplicables. En un quemador, el efluente de la columna se mezcla con hidrógeno y con aire para luego encenderse eléctricamente. La mayoría de los compuestos orgánicos, cuando se pirolizan a la temperatura de una llama de hidrógeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a través de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios, y para la medición de la corriente que resulta (de unos 10-12A) se utiliza un amplificador operacional de alta impedancia. La ionización en la llama de los compuestos que contienen carbono no es un proceso bien establecido, aunque se observa que el número de iones que se produce es aproximadamente igual al de átomos de carbono transformados en la llama. El detector de ionización de llama debido a que es un detector que responde al número de átomos de carbono que entra en el detector por unidad de tiempo, es un detector sensible a la masa, más que un sistema sensible a la concentración. En consecuencia, este detector tiene la ventaja de que los cambios en el caudal de la fase móvil tienen poco efecto sobre la respuesta del detector. Grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halógeno y amina, originan en la llama pocos iones o prácticamente ninguno. Además, el detector es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2, SO2, y NOx. Esas propiedades hacen del detector de ionización de llama uno de los detectores generales más utilizado para el análisis de la mayoría de compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están contaminados con agua y con óxidos de nitrógeno y de azufre. El detector de ionización de llama posee una elevada sensibilidad (del orden de 10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (de 107), y un bajo ruido. Por lo general, es resistente y fácil de utilizar. Una desventaja del detector de ionización de llama es que se trata de un detector destructivo de la muestra.

Detector de conductividad térmica (TCD) Uno de los primeros detectores que se utilizaron en cromatografía de gases, y uno de los que todavía tiene una gran aplicación, se basa en los cambios en la conductividad térmica de la corriente de gas ocasionados por la presencia de las moléculas de analito. Este dispositivo se denomina a veces un catarómetro. El sensor de un catarómetro consiste en un elemento calentado eléctricamente cuya temperatura, a una potencia eléctrica constante, depende de la conductividad térmica del gas circundante. El elemento calentado puede ser un hilo fino de platino, oro o tungsteno, o también, un termistor semiconductor. La resistencia del hilo o del termistor da una medida de la conductividad térmica del gas. Para la configuración de los componentes del detector se emplean dos pares de elementos, uno de los pares se coloca en el flujo del efluente de la columna, y el otro en la corriente de gas previo a la cámara de inyección de la muestra. Alternativamente, la corriente de gas se puede dividir en dos corrientes una de las cuales atraviesa el inyector y la otra no. En cualquier caso, el efecto de la conductividad térmica del gas portador se compensa, y se minimizan los efectos de la variación de caudal, presión y potencia eléctrica. Las resistencias de los pares de detectores gemelos se comparan entre sí, incorporándolos en un circuito sencillo de puente de Wheatstone. Las conductividades térmicas del helio y del hidrógeno son aproximadamente de seis a diez veces mayores que las de la mayoría de los compuestos orgánicos, de modo que, incluso en presencia de pequeñas cantidades de materia orgánica, tiene lugar una disminución relativamente grande de la conductividad térmica del efluente de la columna y, en consecuencia, el detector experimenta un marcado aumento en la temperatura. Las conductividades de los otros gases portadores son más parecidas a las de los constituyentes orgánicos y por esta razón con un detector de conductividad térmica debe usarse hidrógeno o helio como gas portador. Las ventajas del detector de conductividad térmica son su simplicidad, su amplio rango dinámico lineal (aproximadamente 105), su respuesta universal tanto a especies orgánicas como a inorgánicas, y su carácter no destructivo, lo que permite recoger los solutos tras la detección. Una limitación del catarómetro es su sensibilidad relativamente baja (aproximadamente 10-8 g de soluto/mL de gas portador). Otros detectores son de 104 a 107 veces más sensibles. Debería subrayarse que la baja sensibilidad de los detectores de conductividad térmica, hace imposible con frecuencia su utilización con columnas capilares, debido al pequeño tamaño de muestra con el que estas columnas operan.

Detector termoiónico de llama (FTD) El detector termoiónico (FTD) es un detector selectivo de los compuestos orgánicos que contienen fósforo y nitrógeno. Su respuesta a un átomo de fósforo es aproximadamente 10 veces mayor que a un átomo de nitrógeno, y de 104 a 106 veces superior que a un átomo de carbono. En comparación con el detector de ionización de llama, el detector termoiónico es unas 500 veces más sensible para los compuestos que contienen fósforo y unas 50 veces más sensible a las especies nitrogenadas. Estas propiedades hacen de la detección termoiónica un sistema particularmente útil para la detección y determinación de muchos pesticidas que contienen fósforo. Un detector termoiónico tiene una configuración similar al detector de llama. El efluente de la columna se mezcla con hidrógeno, pasa a través de la llama, y se quema. El gas caliente fluye alrededor de una bola de sílicato de rubidio calentada eléctricamente, la cual se mantiene a unos 180 V con respecto al colector. La bola caliente forma un plasma que alcanza una temperatura de 600 a 800ºC. Lo que ocurre exactamente en el plasma, que hace que se produzcan insólitamente una gran cantidad de iones a partir de las moléculas que contienen fósforo o nitrógeno, realmente no está bien establecido, pero el resultado es una gran corriente de iones, la cual se utiliza para la determinación de compuestos que contienen esos dos elementos.

Detector de captura de electrones (ECD) El detector de captura de electrones (ECD) opera casi de la misma forma que un contador proporcional para la medida de radiación X. En este caso el efluente de la columna pasa sobre un emisor β, como níquel-63 o tritio (adsorbido sobre una lámina de platino o de titanio). Un electrón del emisor provoca la ionización del gas portador (con frecuencia se trata de nitrógeno) y la producción de una ráfaga de electrones. De este proceso de ionización, en ausencia de especies orgánicas, resulta una corriente constante entre un par de electrodos. Sin embargo, la corriente disminuye en presencia de moléculas orgánicas que tiendan a capturar los electrones. La respuesta es poco lineal, a no ser que el potencial a través del detector se aplique en forma de impulsos. El detector de captura de electrones es de respuesta selectiva, siendo muy sensible a las moléculas que contienen grupos funcionales electronegativos tales como halógenos, peróxidos, quinonas, y grupos nitro; en cambio, no es sensible a grupos funcionales como aminas, alcoholes e

hidrocarburos. Una aplicación importante del detector de captura de electrones es la detección y determinación de insecticidas clorados. Los detectores de captura de electrones son altamente sensibles y tienen la ventaja de no alterar la muestra de manera significativa (a diferencia del detector de llama). Por otra parte, su intervalo lineal de respuesta normalmente se limita a unos dos órdenes de magnitud.

Detector de emisión atómica (AED) El detector más reciente, y ya disponible en el comercio, para cromatografía de gases, se basa en la emisión atómica. En este dispositivo, el eluyente se introduce en un plasma de helio obtenido con microondas, que se acopla a un espectrómetro de emisión con series de diodos. El plasma es suficientemente energético como para atomizar todos los elementos de una muestra, excitarlos, y así obtener sus espectros de emisión característicos. Esos espectros son recogidos en un espectrómetro que utiliza una serie de diodos configurados en un plano móvil, que es capaz de detectar la radiación emitida desde 170 a 780 nm. La serie de diodos movible es capaz de controlar simultáneamente de dos a cuatro elementos en cada posición. Hasta el momento, el programa de tratamiento de datos suministrado con el detector permite medir la concentración de 15 elementos. Presumiblemente, un futuro software permitirá también la detección de otros elementos.

Otros tipos de detectores

Un espectrómetro de masas unido directamente al cromatógrafo es otro medio de llevar a cabo la detección de los compuestos separados cromatográficamente.

El espectrómetro de masas es un instrumento que permite analizar con una gran precisión la composición de diferentes elementos químicos e isótopos atómicos, separando los núcleos atómicos en función de su relación masa-carga (m/z). Puede utilizarse para identificar los diferentes elementos químicos que forman un compuesto o determinar el contenido isotópico de diferentes elementos en un mismo compuesto.

El espectrómetro de masas mide razones carga/masa de iones, calentando un haz de material del compuesto a analizar hasta vaporizarlo e ionizar los diferentes átomos. El haz de iones produce un patrón específico en el detector que permite analizar el compuesto químico.

En términos generales, moléculas diversas tienen masas diversas, hecho utilizado por un espectrómetro de masas para determinar qué moléculas están presentes en una muestra Se vaporiza una muestra obteniendo iones que poseen pesos moleculares específicos y una carga y debido a ella tendrán movimiento bajo influencia de un determinado campo eléctrico.

Los iones se envían al compartimiento de aceleración donde pasan a través de una lámina metálica. Después se aplica un campo magnético a un lado del compartimiento que atrae a cada uno de los iones con la misma fuerza (suponiendo que tengan carga idéntica) y se los desvía sobre el detector. Los iones más ligeros se desviarán más que los iones pesados porque la fuerza aplicada a cada ion es igual pero los iones ligeros tienen menos masa y se desviaran más. El detector mide exactamente cuánto de lejos se ha desviado cada ion y, a partir de ese, dato se calcula el "cociente masa por unidad de carga". Con esta información es posible determinar con un alto nivel de certeza cuál es la composición química de la muestra original.

El detector registra la carga inducida o la corriente producida cuando un ion pasa cerca o golpea una superficie. En un instrumento de exploración la señal es producida en el detector durante la trayectoria de la misma (en qué m/z) y producirá un espectro de masa, un expediente del m/z's en el cual los iones están presentes. Típicamente, se utiliza un cierto tipo de multiplicador de electrones (electromultiplicador).

Actualmente, el elemento de detección por excelencia es el ya nombrado electromultiplicador. Su funcionamiento se basa en el efecto cascada producido al impactar un determinado ion (o iones) en el mismo. Aplicando una diferencia de potencial entre sus extremos, se consigue el aumentar el factor de amplificación, que vendrá determinado por el número de subetapas amplificadoras que componen el detector. Normalmente es un componente sometido a desgaste que ha de reemplazarse con el tiempo al perder eficiencia de amplificación.

Detector fotométrico de llama Se ha utilizado extensamente para el análisis de contaminantes del aire y del agua como los pesticidas y los hidrocarburos. Se trata de un detector selectivo que sobre todo es sensible a los compuestos que contienen azufre y fósforo. En este detector, el eluyente se hace pasar a través de una llama hidrógeno/aire a baja temperatura, la cual convierte parte del fósforo a una especie HPO que emite bandas de radiación centradas alrededor de 510 y 526 nm. El azufre de la muestra se convierte simultáneamente en S2, el cual emite una banda centrada en 394 nm. Para aislar esas bandas se emplean los filtros adecuados, y sus intensidades se registran fotométricamente. Con la fotometría de llama se han detectado otros elementos entre los que se incluyen los halógenos, nitrógeno y diversos metales, como el estaño, cromo, selenio y germanio.

Detector de fotoionización El eluyente de la columna se irradia con un haz intenso de radiación ultravioleta de energía variable desde 8.3 a 11.7 eV (λ = 149 a 106 nm), la cual provoca la ionización de las moléculas. Al aplicar un potencial a través de una celda que contiene los iones producidos, se origina una corriente de iones, la cual es amplificada y registrada.

Detector de Quimioluminiscencia Recientemente se ha incorporado a la gama disponible de detectores para cromatografía de gases el detector de quimioluminiscencia. La quimioluminiscencia se define como la emisión de radiación lectromagnética (normalmente en le región del visible o del infrarrojo cercano) producida por una reacción química. Como la intensidad de emisión es función de la concentración de las especies químicas implicadas en la reacción quimioluminiscencia, las medidas de la intensidad de emisión pueden emplearse con fines analíticos. Algunas limitaciones en el análisis por quimioluminiscencia, como la dependencia de la emisión de varios factores ambientales que deben ser controlados, la falta de selectividad, ya que un reactivo quimioluminiscente no se limita a un único analito, y finalmente, como ocurre en otros sistemasde detección en flujo, la emisión quimioluminiscente no es constante sino que varía con el tiempo (el flash de luz está compuesto de una señal que se produce tras la mezcla de los reactivos, alcanzando un máximo y después cae hasta la línea base), y este perfil de emisión frente al tiempo puede variar ampliamente en diferentes sistemas quimioluminscentes, por lo que hay que extremar el cuidado para detectar la señal en sistemas en flujo, midiendo en periodos de tiempo bien definidos. En quimioluminiscencia, la emisión de luz es causada por los productos de una reacción específica química, se basa en la reacción entre ciertos compuestos azufrados y el ozono. La intensidad de fluorescencia resultante es proporcional a la concentración de azufre. Este detector ha

demostrado ser especialmente útil en la detección de contaminantes como los mercaptanos. En el detector de quimioluminiscencia del azufre el eluyente se mezcla con hidrógeno y aire y se produce la combustión como en el detector de ionización de llama. Los gases así obtenidos se mezclan con el ozono, y se mide la intensidad de emisión resultante. El analizador de azufre utiliza un quemador dual para lograr la combustión a alta temperatura de los compuestos que contienen azufre para formar monóxido de azufre (SO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reacción de quimioluminiscencia del SO con el ozono. Esto resulta en una respuesta lineal y equimolar sin interferencia de las matrices de muestra. El detector de quimioluminiscencia del azufre también se ha adaptado para la cromatografía de fluidos supercríticos. Por su parte el detector de quimioluminiscencia de nitrógeno, produce una respuesta lineal y equimolar a los compuestos de nitrógeno. Esto se logra por medio de un quemador de acero inoxidable que permite una alta temperatura de combustión para pasar compuestos que contienen nitrógeno a óxido nítrico (NO). Un tubo fotomultiplicador detecta la luz producida por la reacción subsecuente de quimioluminiscencia del NO con el ozono.

Aplicaciones de la cromatografía gas-líquido Para evaluar la importancia de la GLC, es necesario distinguir entre los dos papeles que desempeña la técnica. El primero como herramienta para realizar separaciones; en este sentido, resulta inmejorable cuando se aplica a muestras orgánicas complejas, a organometálicos y a sistemas bioquímicos. El segundo, una función claramente distinta, es el de proporcionar un medio para llevar a cabo un análisis. En este caso se emplean los tiempos o volúmenes de retención para la identificación cualitativa, mientras que las alturas de los picos o sus áreas dan información cuantitativa. Con fines cualitativos, la GLC es una técnica mucho más limitada que otros métodos. En consecuencia, una tendencia importante en este campo ha consistido en la combinación de las notables cualidades para el fraccionamiento que tiene la GLC con las mejores propiedades para la identificación que tienen algunos instrumentos como los espectrómetros de masas, infrarrojo y NMR

1. Análisis cualitativo: Los cromatogramas se utilizan a menudo como criterio de pureza de compuestos orgánicos. Los contaminantes, si están presentes, se manifiestan por la aparición de picos adicionales; las áreas de estos picos proporcionan una estimación aproximada del grado de contaminación. La técnica también es útil para evaluar la efectividad de los procedimientos de purificación. En teoría, los tiempos de retención deberían servir para la identificación de los componentes de una mezcla. Sin embargo, la aplicabilidad de tales datos está limitada por el número de variables que han de controlarse para obtener resultados reproducibles. No obstante, la cromatografla de gases es un medio excelente para confirmar la presencia o ausencia de un supuesto componente en una mezcla, siempre que se disponga de un patrón. Tras la adición del compuesto conocido a la muestra, el cromatograma no debe presentar ningún pico nuevo, y debe observarse el aumento de alguno de los picos existentes. La prueba es particularmente convincente si el resultado se repite con columnas diferentes y a distintas temperaturas. 1.1. Factores de selectividad Si se elige una sustancia patrón B, entonces el factor de selectividad puedeproporcionar un índice para la identificación del compuesto A, el cual es en gran parteindependiente de las variables de la columna excepto la temperatura; esto es, puedenobtenerse tablas numéricas de factores de selectividad para compuestos puros relativosa un estándar común, y entonces utilizarse para la caracterización de solutos. Desafortunadamente, no es posible encontrar un patrón universal que permita obtenerfactores de selectividad de una magnitud razonable para todos los tipos de analitos. Así,el conjunto de factores de selectividad disponibles actualmente en la literatura eslimitado. 1.2. Índice de retención El índice de retención I fue propuesto por primera vez por Kovats en 1958 comoun parámetro para identificar solutos a partir de los cromatogramas. El índice deretención para un soluto dado puede deducirse del cromatograma de una mezcla delsoluto y de al menos dos alcanos normales (de cadena lineal) que tengan unos tiemposde retención tales, que el del soluto considerado quede entre los mismos. Esto es, losalcanos normales son los patrones en los que se basa la escala de índices de retención. Por definición, el índice de retención para un alcano normal es igual a 100 veces elnúmero de carbonos del compuesto sin considerar el relleno de la columna, latemperatura u otras condiciones cromatográficas. El índice de retención para todosaquellos compuestos que no sean alcanos normales varía, a menudo varios cientos deunidades de índice de retención, con las variables de la columna. Es bien conocido que en una serie homóloga al representar el logaritmo deltiempo de retención ajustado frente al número de átomos de carbono se obtiene unagráfica lineal. Los índices de retención de un compuesto se deducen por interpolación apartir de un cromatograma de una mezcla del soluto de interés y dos o más alcanos patrón. Es importante subrayar que el índice de retención para un alcano normal esindependiente de la temperatura y del relleno de la columna. Así, I para el heptano, pordefinición, siempre es 700. Por el contrario, los índices de retención de los demássolutos con frecuencia pueden variar considerablemente de una columna a otra. Porejemplo, el índice de retención del acenafteno en una fase estacionaria depolidimetilsiloxano polimerizado, a 140 ºC es 1460. Con 5% fenilpolidimetilsiloxanocomo fase estacionaria, a la misma temperatura resulta ser 1500, mientras que conpolietilenglicol como fase estacionaria, el índice de retención es 2084.

El sistema de índices de retención tiene la ventaja de basarse en materiales dereferencia disponibles fácilmente que cubren un amplio intervalo de puntos de ebullición. Además, la dependencia de los índices de retención con la temperatura es relativamente pequeña. 2. Análisis cuantitativo La señal del detector de una columna cromatográfica gas-líquido se ha utilizado generalmente para análisis cuantitativos y semicuantitativos. En condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa) del 1 %. Como con la mayoría de los instrumentos analíticos, la fiabilidad se relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza de la muestra. La discusión general del análisis cuantitativo cromatográfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la cromatografia de gases como a otros tipos; por esta razón no se hacen aquí más consideraciones sobre este aspecto.

CROMATOGRAFIA DE LIQUIDOS

INSTRUMENTACIÓN PARA CROMATOGRAFÍA DE LÍQUIDOS

Con objeto de alcanzar un caudal de eluyente razonable con rellenos de tamaño de partícula entre

3 y 10 μm, que, por otra parte, son comunes en la moderna cromatografia de líquidos, se

requieren presiones de algunos cientos de kilos por centímetro cuadrado. Como consecuencia de

estas elevadas presiones, el equipo necesario para la HPLC tiende a ser más sofisticado y caro que

el que se utiliza en otros tipos de cromatografia. La Figura adjunta muestra un esquema de los

componentes fundamentales de un cromatógrafo de líquidos de alta resolución típico. Cada uno

de los componentes se trata en los párrafos que siguen a continuación.

Fig.1-Esquema de un aparato de HPLC

1. Recipientes para la fase móvil y sistemas para el tratamiento de los disolventes

Un aparato moderno de HPLC se equipa con uno o más recipientes de vidrio o de acero inoxidable,

cada uno de los cuales contiene unos 500 mL de un disolvente. Los recipientes a menudo se

equipan con un sistema para eliminar los gases disueltos –en general oxígeno y nitrógeno- que

interfieren formando burbujas en los sistemas de detección. Un desgasificador puede consistir en

un sistema de bombeo por vacío, un sistema de destilación, dispositivos para calentar y agitar los

disolventes o, como se muestra en la Figura 1, sistemas de difusión que permiten arrastrar los

gases disueltos fuera de la solución mediante finas burbujas de un gas inerte de baja solubilidad.

Con frecuencia estos sistemas también contienen un dispositivo para la filtración del polvo y de las

partículas sólidas en suspensión de los disolventes. No es necesario que los desgasificadores y los

filtros sean partes integrantes de los sistemas de HPLC como se muestra en la Figura 2. Por

ejemplo, una forma conveniente de tratar los disolventes antes de introducirlos en el recipiente,

consiste en filtrarlos mediante el vacío a través de un filtro de poro muy pequeño. Este

tratamiento elimina los gases además de la materia en suspensión.

Una separación que utiliza un solo disolvente de composición constante se denomina una elución

isocrática. Con frecuencia, la eficiencia de la separación se aumenta notablemente por una elución

con gradiente. En este caso se utilizan dos (y a veces más) disolventes con una polaridad

significativamente distinta. Una vez comienza la elución, se varía la relación de los disolventes de

forma programada, a veces continuamente y a veces mediante una serie de etapas escalonadas.

Los instrumentos en la moderna HPLC a menudo están equipados con unos dispositivos que

permiten introducir los disolventes desde dos o más recipientes en una cámara de mezcla a una

velocidad que varía continuamente y la relación de volumen de los disolventes se puede modificar

lineal o exponencialmente con el tiempo.

La Figura 2 ilustra la ventaja de una elución con gradiente en la separación de una mezcla de

clorobencenos. La curva (b) corresponde a la elución isocrática con metanol/agua 50:50 (v/v). La

curva (a) muestra la elución con gradiente, que se inicia con una mezcla 40:60 de los dos

disolventes y se va aumentando la concentración de metanol un 8%/min. Obsérvese que la elución

con gradiente acorta notablemente el tiempo de separación sin sacrificar la resolución de los

primeros picos. Nótese también que la elución con gradiente produce unos efectos similares a los

producidos por la programación de temperatura en cromatografía de gases.

2. Sistemas de bombeo

Los requisitos para un sistema de bombeo en HPLC son rigurosos e incluyen: (1) la generación de

presiones por encima de 400 kg/cm2, (2) un flujo libre de pulsaciones, (3) un intervalo de caudales

de 0.1 a 10 mL/min, (4) el control y reproducibilidad del caudal mejor del 0,5% relativo y (5)

componentes resistentes a la corrosión (juntas de acero inoxidable o teflón). Debe subrayarse que

las altas presiones que generan las bombas de HPLC no constituyen un riesgo de explosión, debido

a que los líquidos no son muy compresibles. De este modo, la rotura de un componente del

sistema sólo supone una pérdida de disolvente. Es evidente que esta pérdida puede suponer un

riesgo de incendio.

Fig.2-Mejora de la eficiencia de la

separación mediante la elución con

gradiente.

Columna de 1 m x 2.1 mm d.i. de acero

inoxidable, relleno 1% Permaphase

ODS.

Muestra: 5 μL de bencenos clorados

en isopropanol. Detector: fotómetro de

UV (254

nm). Condiciones: temperatura 60ºC,

presión 80 kg/cm2. (a) elución con

gradiente: metanol 40% / agua 60% e

incremento de la proporción de metanol

a una velocidad de un 8% / min (b)

Elución isocrática con metanol 50% /

agua 50%

2.1. Tipos de bombas

Se utilizan tres tipos de bombas, cada una con sus propias ventajas y desventajas: bombas

recíprocas, bombas de jeringa o de desplazamiento y bombas neumáticas o de presión constante.

Las bombas recíprocas, que se utilizan en aproximadamente el 90% de los sistemas de HPLC

comercializados, consisten, por lo general, en una pequeña cámara en la que el disolvente es

impelido por el movimiento de vaivén de un pistón accionado por un motor. Dos válvulas con

cierre de bola, que se abren y cierran alternativamente, controlan el flujo del disolvente hacia

dentro y hacia afuera de un cilindro. Las bombas recíprocas tienen la desventaja de que producen

un flujo con pulsaciones, las cuales se han de amortiguar dado que su presencia se manifiesta

como ruido en la línea base en el cromatograma. Entre las ventajas de las bombas recíprocas se

pueden citar su pequeño volumen interno (35 a 400 mL), sus altas presiones de salida (por encima

de los 500 kg/cm2), su fácil adaptación a la elución con gradiente, y sus caudales constantes, que

son prácticamente independientes de la contrapresión de la columna y de la viscosidad del

disolvente.

2.2. Amortiguadores de pulsos

Muchos de los detectores utilizados en HPLC son sensibles a variaciones deflujo. Un método

sencillo de amortiguación contiene un fuelle flexible o un gascompresible en la porción superior

cerrada de un tubo en T para absorber parte de laenergía de pulsación. Cuando la bomba se

rellena esta energía se libera para ayudar asuavizar la pulsación de presión. Los amortiguadores

electrónicos de pulsosproporcionan una carrera hacia delante corta y rápida del pistón, y

enseguida la carrerarápida de recarga de la bomba. El pequeño impulso hacia delante amortigua el

pulso deflujo llevando disolvente a la presión del sistema.

2.3. Control del caudal y sistemas de programación

Como una parte de sus sistemas de bombeo, muchos instrumentos comercialesse equipan con

dispositivos controlados por ordenador que permiten medir el caudalmediante la determinación

de la caída de presión a través de un restrictor colocado en lasalida de la bomba. Cualquier

diferencia entre la señal y un valor preestablecido seutiliza para aumentar o disminuir la velocidad

del motor de la bomba.

Por otro lado, la mayor parte de los instrumentos pueden variar la composicióndel disolvente bien

sea de una forma continua o bien de forma escalonada.

3. Sistemas de inyección de muestra

A menudo, el factor limitante en la precisión de las medidas en cromatografía delíquidos es la

reproducibilidad con que se puede introducir la muestra en la columna. Elproblema se agrava por

el ensanchamiento de banda que acompaña a la sobrecarga delas columnas. Por ello, los

volúmenes que se emplean han de ser muy pequeños, de unaspocas décimas de microlitro a tal

vez 500 μL. Además, se ha de poder introducir lamuestra sin despresurizar el sistema.

En cromatografía de líquidos el método más ampliamente utilizado para laintroducción de la

muestra utiliza bucles de muestra, como el que se muestra en la Figura 3. Estos dispositivos están

normalmente integrados en el equipocromatográfico y hay bucles intercambiables que permiten

la elección de tamaños demuestra desde 5 a 500 μL. Con bucles de este tipo se puede introducir la

muestra apresiones de hasta 500 kg/cm2 con una precisión relativa de unas décimas por ciento.

También existen válvulas de inyección de micromuestras, con bucles con volúmenes de0,5 a 5 μL.

Fig.3-Bucle de muestra para cromatografía de líquidos.

4. Columnas para cromatografía de líquidos

Las columnas para cromatografía de líquidos se construyen de ordinario contubo de acero

inoxidable de diámetro interno uniforme. Cientos de columnasempaquetadas que difieren en

tamaño y relleno se comercializan por distintosfabricantes y su coste oscila, por lo general, de 30

000 a 100 000 pesetas.

4.1. Columnas analíticas

La mayoría de las columnas para cromatografía de líquidos tienen una longitudentre 5 y 30 cm.

Por lo común, las columnas son rectas y se pueden alargar, si esnecesario, acoplando dos o más

columnas. El diámetro interno de las columnas es amenudo de 4 a 10 mm y los tamaños de las

partículas de los rellenos más comunes son3, 5 y 10 μm.

Tal vez la columna más frecuentemente utilizada es la de 25 cm de longitud y4.6 mm de diámetro

interno, y empaquetada con partículas de 5 μm. Estas columnastienen de 40 000 a 60 000

platos/metro.

También, se han empezado a fabricar columnas de alta resolución más rápidas,las cuales tienen

menores dimensiones que las anteriormente descritas. Estas columnaspueden tener diámetros

internos que oscilan entre 1 y 4.6 mm y se rellenan conpartículas de 3 o 5 μm. A menudo su

longitud es de 3 a 7.5 cm. Estas columnas tienenhasta 100 000 platos/metro y presentan la ventaja

de la rapidez y del mínimo consumode disolvente. La última propiedad es de considerable

importancia, puesto que los disolventesde alta pureza que se requieren en cromatografía de

líquidos son muy caros.

4.2. Precolumnas

En muchas ocasiones, para aumentar la vida de la columna analítica, se colocadelante una

precolumna que elimina la materia en suspensión y los contaminantes de losdisolventes. Además,

en cromatografía líquido-líquido, la precolumna sirve para saturarla fase móvil con la fase

estacionaria y así minimizar las pérdidas de ésta en la columnaanalítica. La composición del relleno

de la precolumna debe ser semejante al de lacolumna analítica; sin embargo, el tamaño de

partícula es por lo común mayor paraminimizar la caída de presión.

4.3. Termostatos

En muchas aplicaciones no se necesita un control estricto de la temperatura, ylas columnas

trabajan a temperatura ambiente. Sin embargo, muchas veces si secontrola la temperatura de la

columna en unas pocas décimas de grado centígrado, seobtienen mejorescromatogramas. La

mayoría de los instrumentos comerciales llevanactualmente hornos para las columnas que

controlan la temperatura de la columna a lasdécimas de grado, desde la temperatura ambiente

hasta 150 ºC. Para poder controlar conprecisión la temperatura, las columnas también se pueden

colocar en camisas con aguaque provenga de un baño a temperatura constante.

4.4. Tipos de rellenos de la columna

En cromatografía de líquidos se han utilizado dos tipos básicos de rellenos,pelicular y de partícula

porosa. El primero consiste en bolas de vidrio o de polímero,no porosas y esféricas con unos

diámetros característicos de 30 a 40 μm. En lasuperficie de estas bolas se deposita una capa

delgada y porosa de sílice, alúmina o deuna resina de intercambio iónico. Para algunas

aplicaciones se aplica un recubrimiento adicional, constituido por una fase estacionaria líquida que

se mantiene fija poradsorción. Las bolas también se pueden tratar químicamente para obtener

una capasuperficial orgánica. Por lo general, los rellenos peliculares se utilizan ampliamente enlas

precolumnas y no en las columnas analíticas.

Los típicos rellenos de partículas porosas de cromatografía de líquidos estánformados por

micropartículas porosas con diámetros entre 3 y 10 μm y con la menordispersión posible para un

tamaño determinado. Las partículas son de sílice, alúmina oresinas de intercambio iónico, aunque

la sílice es el material más común. Las partículasde sílice se sintetizan aglomerando partículas de

sílice de tamaños inferiores al micrónen unas condiciones tales que se forman partículas mayores

con diámetros muy uniformes.

Las partículas que resultan se recubren muchas veces con películas orgánicas, quese unen química

o físicamente a la superficie.

5. Detectores

A diferencia de la cromatografia de gases, en la cromatografía de líquidos no hay detectores tan

aplicables universalmente ni tan fiables como los detectores de ionización de llama y de

conductividad térmica. Uno de los mayores retos en el desarrollo de la cromatografía de líquidos

ha sido el perfeccionamiento de los detectores.

Un detector ideal para cromatografía de líquidos debería poseer todas las propiedades listadas en

relación con la cromatografía de gases, con la excepción de que un detector para cromatografía de

líquidos no es necesario que sea sensible en un intervalo tan grande de temperaturas. Además, un

detector de HPLC debe tener un volumen interno mínimo a fin de reducir el ensanchamiento de

banda.

Los detectores en cromatografia de líquidos son de dos tipos básicos. Los detectores basados en

una propiedad de la disolución responden a una propiedad de la fase móvil, tal como el índice de

refracción, la constante dieléctrica, o la densidad, que se modifica por la presencia de los analitos.

Por contraste, los detectores basados en una propiedad del soluto responden a alguna de las

propiedades del soluto, como la absorbancia UV, fluorescencia, o intensidad de difusión, que no

son propias de la fase móvil. En la Tabla adjunta se indican los detectores más comunes

empleados en HPLC y algunas de sus propiedades más importantes. Un informe de 1982 sobre 365

trabajos publicados en los que tenía un papel importante la cromatografia de líquidos, reveló que

el 71 % se utilizaban en la detección de la absorción UV, el 15% la fluorescencia, el 5,4% el índice

de refracción, el 4,3% empleaba medidas electroquímicas y el 4,3% restante otras medidas.

5.1. Detectores de absorbancia

La Figura 4 muestra el esquema de una cubeta de flujo en forma de Z para la medida de la

absorbancia de los efluentes de una columna cromatográfica. A fin de minimizar el

ensanchamiento de banda extracolumna, el volumen de estas cubetas ha de ser lo menor posible,

de modo que los volúmenes se limitan por lo común de 1 a 10 μL y las longitudes de la cubeta de 2

a 10 mm. La utilización de cubetas de este tipo está restringida a presiones no mayores de unos 50

kg/cm2.

Características de los detectores de HPLC

Figura 4-Celda de detector ultravioleta en HPLC

Muchos detectores de absorbancia son dispositivos de doble haz, en los que uno de los haces pasa

por la cubeta de flujo y el otro a través de un filtro que reduce su intensidad. Para comparar las

intensidades de los dos haces se utilizan detectores fotoeléctricos contrastados. También se

utilizan instrumentos de un solo haz. En este caso, las medidas de intensidad del disolvente se

almacenan en la memoria de un ordenador y al final se recuperan para el cálculo de la

absorbancia.

Detectores de absorbancia ultravioleta con filtros. Los detectores de absorción UV

más simples son los fotómetros de filtros con una lámpara de mercurio como fuente. Lomás

común en estos casos es aislar la línea intensa a 254 nm por medio de filtros; enalgunos equipos

también se pueden utilizar las líneas a 250, 313, 334 y 365 nmempleando otros filtros. Resulta

obvio que este tipo de detector se utiliza de formarestringida para aquellos solutos que absorben

a alguna de estas longitudes de onda.

Algunos grupos funcionales orgánicos y diversas especies inorgánicas exhiben unabanda ancha de

absorción a una o más de esas longitudes de onda.

Detectores de absorbancia ultravioleta con monocrornadores. La mayoría de los

fabricantes de instrumentos de HPLC ofrecen detectores que consisten en unespectrofotómetro

de barrido con óptica de red. Algunos se limitan a la radiaciónultravioleta; mientras que otros

abarcan la radiación ultravioleta y la visible. Se puedenelegir varios modos operacionales. Por

ejemplo, se puede obtener el cromatogramacompleto a una sola longitud de onda o

alternativamente, cuando los picos que eluyenestán suficientemente separados, se puede elegir

distinta longitud de onda para cadapico. En este caso, debe emplearse el control por ordenador

para elegir la mejorlongitud de onda en cada caso. Cuando se desean los espectros completos con

fines deidentificación, se puede parar el flujo del eluyente durante un tiempo suficiente

quepermita el barrido de la región de longitud de onda que interesa.

Los detectores espectrofotométricos de ultravioleta más potentes son losinstrumentos de series

de diodos. Algunos fabricantes ofrecen este tipo de instrumentos,que permiten recoger los datos

de un espectro completo en aproximadamente unsegundo. De esta forma, los datos espectrales

para cada pico cromatográfico se puedenrecoger y almacenar a medida que van saliendo de la

columna. Una de las formas depresentación de los datos espectrales, que resulta útil para la

identificación de lasespecies y para elegir las condiciones de la determinación cuantitativa,

consiste en ungráfico tridimensional tal como el que se muestra en la Figura 6. En este caso,

losespectros se obtuvieron a intervalos de cinco segundos. La aparición y desaparición decada uno

de los esteroides en el efluente de la columna resulta evidente.

Figura 5-Espectros de absorción del efluente de una columna de HPLC tomados a intervalos de 5 s para una mezcla de tres esteroides.

Detectores de absorbancia en el infrarrojo. Comercialmente se ofrecen dos tipos de

detectores de infrarrojo. El primero con barrido de longitud de onda que proporcionan tres

segmentos de filtro semicirculares. El segundo, mucho más sofisticado, es un tipo de detector

infrarrojo que se basa en los instrumentos de transformada de Fourier.

Las cubetas de los detectores de infrarrojo son semejantes a las de radiación ultravioleta excepto

en que las ventanas se construyen de cloruro de sodio o de fluoruro de calcio. Las longitudes de la

cubeta oscilan de 0.2 a 1.0 mm, y los volúmenes de 1.5 a 10 μL. Los instrumentos de infrarrojo más

sencillos pueden trabajar a una o más longitudes de onda; alternativamente, se pueden obtener

los espectros de los picos parando el flujo en su tiempo de elución. Los instrumentos con

transformada de Fourier se utilizan de manera análoga a los instrumentos de series de diodos para

las medidas de absorbancia ultravioleta que se han descrito en la sección anterior.

Una de las mayores limitaciones al uso de los detectores de infrarrojo se debe a la baja

transparencia de muchos de los disolventes que se utilizan. Por ejemplo, las bandas anchas de

absorción infrarroja del agua y de los alcoholes impiden prácticamente el uso de este detector

para muchas aplicaciones.

5.2. Detectores de fluorescencia

Los detectores de fluorescencia para HPLC son semejantes en diseño a los fluorímetros y

espectrofluorímetros. En la mayoría de ellos, la fluorescencia se detecta por medio de un detector

fotoeléctrico colocado perpendicularmente respecto al haz de excitación. Los detectores más

sencillos utilizan una fuente de excitación de mercurio, y uno o más filtros para aislar la radiación

fluorescente. Los futuros desarrollos en los detectores de fluorescencia probablemente se basarán

en el uso de fuentes de láser sintonizables, las cuales permiten una mayor sensibilidad y

selectividad.

Una ventaja inherente a los métodos de fluorescencia es su alta sensibilidad, que resulta ser más

de un orden de magnitud mayor que la de los sistemas de absorbancia.

En cromatografía de líquidos se ha aprovechado esta ventaja para la separación y determinación

de los componentes fluorescentes de las muestras.

5.3. Detectores de índice de refracción

Estos detectores miden la diferencia de índice de refracción, entre el disolvente que en su camino

hacia la columna pasa a través de una mitad de la cubeta y el efluente de la columna que pasa por

la otra mitad. Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un

ángulo de modo que si las dos disoluciones difieren en el índice de refracción se produce una

desviación de un haz de luz incidente. El desplazamiento del haz con respecto a la superficie

fotosensible del detector provoca una variación de la señal de salida, la cual, una vez amplificada y

registrada, proporciona el cromatograma.

Los detectores de índice de refracción tienen la ventaja de que responden a casi todos los solutos.

Es decir, son detectores universales análogos a los detectores de llama en cromatografia de gases.

Además, son fiables y no dependen del caudal. Sin embargo, son muy sensibles a los cambios de

temperatura, y se han de mantener a una temperatura constante en unas pocas milésimas de

grado centígrado. Por otra parte, no son tan sensibles como la mayoría de los otros detectores, y

por lo general no se pueden utilizar en la elución con gradiente.

5.4. Detector de dispersión de luz

Recientemente, se ha comercializado un nuevo tipo de detector general para la HPLC, el detector

de dispersión de luz (ELSD). En este detector, el efluente de la columna se pasa a un nebulizador

donde se convierte en una fina niebla mediante un flujo de nitrógeno o aire. Las finas gotitas se

llevan a través de un tubo de conducción a temperatura controlada donde tiene lugar la

evaporación de la fase móvil, lo que origina unas finas partículas de analito. La nube de partículas

de analito pasa a través de un haz láser. Mediante un fotodiodo de silicio se detecta la radiación

dispersada perpendicularmente al flujo.

Una de las mayores ventajas de este tipo de detector es que su respuesta resulta ser

aproximadamente la misma para todos los solutos no volátiles. Además es notablemente más

sensible que el detector de índice de refracción.

5.5. Detectores electroquímicos

Los fabricantes de instrumentos proporcionan en la actualidad varios tipos de detectores

electroquímicos. Estos dispositivos se basan en cuatro métodos electroanalíticos que incluyen la

amperometría, la voltamperometría, la coulombimetría y la conductimetría.