CULTIVO IN VITRO

CASERO OBJETIVOS

- Utilizar métodos básicos de cultivo in vitro y sus características.

FUNDAMENTO TEÓRICO

El cultivo in vitro el desarrollo y crecimiento de plantas o partes de

plantas en condiciones especiales, dentro de recipiente de vidrio. En estas condiciones se le debe

sumisnistra a la planta todo lo que necesita para su desarrollo: agua, nutriente, luz y agua. El agua y

los nutrientes se aportan con el medio y la luz la reciben a través de las paredes de vidrio.

Es vital importancia que el medio, los frascos, los aparatos y las semillas se mantengan

desinfectadas desde el principio del proceso de germinación. Cualquier bacteria u hongo que se

introduzca en los frascos crecerá más rápido que las semillas y pronto ocupará su espacio hasta

matarlas.

MATERIAL

Material de

Laboratorio

FRASCOS DE CRISTAL (4 por grupo).

Olla a presión.

Guantes.

Mascarilla de papel.

Espátula.

Bisturí.

Mechero de alcohol.

Soporte y rejilla.

Varilla de vidrio.

Pinzas metálicas.

Trapo.

Papel de aluminio (o papel film).

Gasa estéril.

Cinta adhesiva(o film de parafina) y etiquetas.

Reactivos

Lejía.

Ácido clorhídrico.

Hidróxido sódico.

Lavajillas.

MEDIO DE CULTIVO: FÓRMULA DEL PLÁTANO (para 1

litro)

100g de plátano maduro hecho puré o licuado

10 g de agar-agar.

15 g de azúcar.

900 ml de agua destilada.

1,2 g Tiamina *

Material biológico Cápsula semillas orquídea u otra semilla.

*4 comprimidos de algún remedio compuesto de Tiamina (vitamina B1) de 300 mg. Puede ser

substituido por complejos polivitamínicos (Teragram M o Supradyn).

MÉTODO

a) Preparación de los frascos.

Se lavan bien los frascos y tapas con jabón y lejía. Se le quitan todos los restos

de etiquetas.

b) Preparación y esterilización del medio de cultivo.

1. Poner en una olla los 180 ml de agua destilada, 20g de plátano maduro hecho puré o licuado, 1 g

de azúcar y 0.24 g Tiamina. Una vez disuelto se añaden 2 g de agar agar y se hierve el medio. (lo

ideal es hacerlo en el microondas o en un hornillo con agitación continua para que el agar no se

estropee). Si se hace en una olla, usar una cuchara de madera o de plástico hasta disolver todos

los componentes.

2. Mide el pH y ajústalo (usa HCL para disminuirlo y NaOH para incrementarlo). Debe de quedar

entre 5.5 y 6.

3. Distribuye el medio de cultivo en los tubos de ensayo y frascos, para ello utiliza un embudo de

vidrio. Ten especial cuidado en que el medio de cultivo no entre en contacto con la apertura de

los frascos, ya que esto puede ayudar a la contaminación por hongos y bacterias.

4. Vierte en cada frasco en el fondo una cantidad de preparado de más o menos 1 centímetro (45 a

50 ml). Por cada litro de preparado podemos llenar más o menos 20 frascos.

c) Esterilización del medio de cultivo

Los frascos se esterilizan en una olla a presión, la cual se puede considerar como un pequeño

autoclave. Nos sirve para esterilizar medios o material sometiéndolos a temperatura y presión

elevadas. Los pasos para la esterilización son los siguientes:

Se pone un pedazo de tela en el fondo de la olla (un trapo cualquiera) para impedir así que los

frascos toquen el fondo de la olla y se revienten con el calor.

Se añaden dos o tres centímetros de agua.

Colocamos los frascos (con el medio) tapados, pero sin cerrar del todo, la tapadera debe

quedar suelta o de lo contrario los botes acumularán presión y estallarán.

Cerrar y calentar en un fogón a fuego fuerte hasta que la pesa comience a moverse y liberar

vapor o el medidor marque 15 PSI.

Dejar a 15 PSI unos 20 o 30 minutos a fuego suave.

Apagar una vez trascurrido el tiempo y esperar a que la olla baje y esté totalmente enfriada.

No se debe abrir la olla antes porque la diferencia de presión o temperatura hará que entre

aire “no estéril” a los frascos, creando un peligro de contaminación.

Se dejan enfriar hasta que el medio gelifique (se solidifique) por acción del agar. Con guantes

desinfectados con alcohol, se terminan de cerrar los botes para evitar la entrada de aire no estéril.

Los frascos se pueden guardar por varios días y meses en la nevera o congelados.

d) Preparación de las semillas.

Si las cápsulas de orquídeas están abiertas quiere decir que llegó a su

totalidad de madurez. Las semillas se esterilizan de la siguiente

forma:

-Prepara dos recipientes con agua (a la mitad de su capacidad) y uno vacío y se cubren con

tapas dobles de aluminio. Los botes se esterilizan en el autoclave o una olla a presión. Dejar

enfriar todo el material. La esterilización se puede hacer en el microondas (5-10 min) pero en

este caso los frascos se tapan con papel film. Dejar enfriar antes de usarlo para la

esterilización de las semillas.

-Las semillas se envuelven en una gasa y se sumergen en una solución 50% lejía con unas

gotas de lavavajillas. El tiempo que deben estar en lejía es variable, puede ser de 10 a 30 min

según el tipo de semilla. Como termino medio se tienen 15 min y después comprobar (si nos

pasamos no germinan y si las tenemos poco tiempo se contaminan).

- Pasa las semillas por los dos botes de agua estéril, 5 minutos mínimo en cada bote, para

eliminar la lejía de su superficie. Este paso debe hacerse en condiciones de esterilidad

ambiental, trabajando cerca de la llama del mechero para evitar la caída de esporas en las

semillas o en el medio y lo contamine. Las pinzas metálicas deben ser flameadas antes de su

uso.

Si las cápsulas están cerradas, se esterilizan la cápsula entera en lejía, se esterilizan el bisturí y la

espátula en el mechero de alcohol y se corta la cápsula con el bisturí cerca de la llama, antes de

introducirlas en los frascos.

e) Cultivo del material vegetal en condiciones asépticas.

- Limpia la superficie de trabajo con lejía. Sí tienes el pelo largo recógelo y, si es posible, ponte una

mascarilla para que este todo prefecto. Hay que trabajar con mucho cuidado y muchísima limpieza.

Los frascos muy fácilmente se contaminan con hongos.

- En todo momento trabajaremos cerca del mechero. Las semillas se pasan del recipiente con agua a

los botes con el medio con una pinza que previamente hemos flameado con etanol para esterilizarla.

Abre cuidadosamente un poco el bote, sin destapar el bote del todo, y coloca las semillas sobre el

medio de cultivo. Este paso debe hacerse cerca de la llama del mechero. Cierra rápidamente la tapa

para que no entre ningún microrganismo.

-Una vez se han puesto de 4 o 5 semillas por bote. Se cierran los frascos herméticamente cerca del

mechero y se sellan con cinta adhesiva o film de parafina. Etiqueta los botes con la fecha y tipo de

semilla cultivado, también puedes anotar los nombres de los componentes del grupo.

-Estos botes se mantienen en oscuridad hasta que se observe la germinación de la semilla, que puede

tardar de uno a diez días.

- En ese momento, se colocan los frascos en un sitio con bastante luz, pero sin sol directo a

temperatura constante (de unos 22-24 ºC) evitando una exposición directa al sol, sin embargo son

necesarias de 16 a 18 horas de luz al día, así pues, será preciso prever una iluminación de apoyo

como un fosforescente.

Se debe esperar aproximadamente entre 5 y 6 semanas (dependiendo de la especie) hasta que

se vea la primera “alfombra verde” sobre el medio de cultivo. Si germinan demasiadas plantas en una

botella o frasco hay que trasplantar las plantitas a otros frascos. También hay que decir que muchas

no sobreviven. El trasplante debe hacerse con las mismas medidas de higiene que el procedimiento

anterior y dividiéndolas en varios frascos con las mismas condiciones. Hay que tener mucha

paciencia y calma y no tocar mucho los botes de

cultivo.

Después de un año o año y medio se pueden

retirar las plantitas de los frascos y sembrarlas en

macetas. Como sustrato se recomienda usar musgo

serrano, con arena de río y fina. Es conveniente

esterilizar este nuevo medio con agua hirviendo y

dejar enfriar. El momento de sacar las plantitas de los

frascos es el más peligroso ya que fácilmente pueden

contaminarse con hongos del ambiente. Conviene

bañar las plantitas con un funguicida antes de

sembrarlas.

La espera y la paciencia te dará una gran satisfacción de conseguir germinar la semilla de la

orquídea, después para ver su flor tardarás varios años en verla. Una catleya tarda entre 6 y 8 años

en dar flor desde que se sembraron sus semillas. Una Phalaenopsis 4 años pero es un sueño llegar a

tener tantas orquídeas y saber que el tiempo que le has dedicado ha valido la pena.